ES2277620T3

ES2277620T3 - Trifluoroacetato de calcio con actividad citotoxica.

Info

Publication number: ES2277620T3
Application number: ES02764607T
Authority: ES
Inventors: Alberto Bartorelli
Original assignee: Bionest Ltd
Current assignee: Bionest Ltd
Priority date: 2001-07-12
Filing date: 2002-07-01
Publication date: 2007-07-16
Anticipated expiration: 2022-07-01
Also published as: EP1423131A1; ITMI20011495A1; ATE345805T1; CA2455710A1; WO2003006031A1; IL159770A0; CA2455710C; DE60216292D1; IL159770A; US7423063B2; JP4395368B2; JP2004536120A; US20040180956A1; ITMI20011495A0; EP1423131B1; DE60216292T2

Abstract

Uso de trifluoroacetato de calcio para la preparación de medicamentos citotóxicos para el tratamiento de tumores.

Description

Trifluoroacetato de calcio con actividad citotóxica.

La presente invención se refiere al uso de trifluoroacetato de calcio, para preparar medicamentos con actividad citotóxica y antitumoral.

Las sales de calcio, en particular el gluconato de calcio, se han utilizado durante algún tiempo en la medicina de seres humanos para tratar la osteoporosis y todos los estados en los que está indicado un aumento en el nivel de calcio de la sangre. El uso de sales de calcio para tratar trastornos tumorales e hiperproliferativos no se ha descrito hasta la fecha; sin embargo, se han propuesto posibles efectos quimioprotectores para algunas sales de calcio, en particular para el glucarato de calcio (véase, por ejemplo, Webb T. et al., Biochem. Pharmacol, Vol. 47 (9), 1994. 1655-1660).

Ahora se ha encontrado que el trifluoroacetato de calcio, tiene una actividad citotóxica sorprendente que es selectiva para células tumorales. Esta actividad se ha demostrado en cultivos de líneas celulares de tumores humanos y murinos de diversos orígenes (colon, pulmón, páncreas, mama, próstata, hígado, estómago y ovarios), tales como las células HT 29, Kato, C-26, H G C 27 y PA-1.

El trifluoroacetato de calcio, preparado con procedimientos convencionales a partir de ácido trifluoroacético y óxido o hidróxido de calcio, y añadido a cada pocillo (- 10.000 células) en una disolución acuosa en cantidades que oscilan entre 0,001 y 1,5 mg, produce la muerte del 90 - 95% de las células tumorales o more. En las mismas condiciones, se ha demostrado que líneas celulares humanas normales son casi insensibles, o al menos considerablemente menos sensibles, al efecto citotóxico atribuible al trifluoroacetato de calcio. Se han obtenido efectos similares con otras sales de calcio de ácidos farmacéuticamente aceptables, tales como acetato, nitrato, cloruro y similares, aunque en un menor grado. Sin embargo, el trifluoroacetato parece ser preferible en vista de sus propiedades toxicológicas favorables.

Para el uso en el tratamiento de tumores, el trifluoroacetato de calcio se administrará preferiblemente por vía parenteral, por ejemplo mediante la vía intramuscular, intravenosa o subcutánea, a dosis que oscilan entre 0,1 y 10 mg/kg/día. Para este fin, la sal de calcio se formulará adecuadamente en la forma de suspensiones o disoluciones estériles, posiblemente con la ayuda de vehículos o disolventes convencionales. Sin embargo, también serían posibles otras vías de administración, tales como la vía oral o la infusión tópica en el sitio de la lesión tumoral. El trifluoroacetato de calcio, puede utilizarse en combinación con otros fármacos antitumorales que tienen actividad complementaria, sinérgica o en cualquier caso, útil.

Los resultados de los experimentos llevados a cabo con el trifluoroacetato de calcio se exponen a continuación.

Toxicidad en ratón y rata

El trifluoroacetato de calcio, administrado a la dosis única de 200 mg/kg a ratones Balb/c mediante la vía intraperitoneal, no produce ningún efecto tóxico de interés.

El tratamiento a corto plazo con dosis múltiples durante cuatro semanas a la dosis de 100 mg/kg, de nuevo mediante la vía intraperitoneal, no produjo ningún efecto patológico. Un tratamiento similar de 4 semanas mediante la vía subcutánea se toleró bien a la dosis de 10 mg/kg.

En ratas Sprague Dawley, no se observaron efectos tóxicos tras la administración única o a corto plazo con dosis múltiples de 200 mg/kg de trifluoroacetato de calcio mediante la vía intravenosa.

Citotoxicidad in vitro

La citotoxicidad del trifluoroacetato de calcio se ha determinado en 13 líneas celulares de tumores humanos malignos y en 4 líneas de tumores benignos.

Se añadieron 20 \mul de disoluciones de Ca(CF_{3}COO)_{2} a concentraciones de 100, 50, 37,5, 25, 15, 12,5, 10 y 6,25 mg/ml a placas de 96 pocillos, conteniendo cada una 10.000 células/pocillo en 100 \mul de medio de cultivo.

Se dejaron durante la noche a 37ºC, tras lo cual se añadieron 40 \mul de MTT (dimetiltiazol - 0,2 g/100 ml de PBS (solución salina tamponada con fosfato) y se dejaron durante 4 horas a 37ºC.

Tras la aspiración, se añadieron 100 \mul de SDS (dodecilsulfato sódico) y se dejaron a 37ºC durante 1 hora. La placa se leyó a 540 nm y 690 nm.

La toxicidad de la muestra se evalúa como la razón entre el valor de la absorbancia en el pocillo con las células tratadas y el valor de la absorbancia en el pocillo con las células control.

1 - \frac{\text{Absorbancia de las células + muestra}}{\text{Absorbancia de las células control}} \ x \ 100 = % \ de \ células \ muertas

La prueba de MTT es un procedimiento colorimétrico cuantitativo que sólo mide las células vivas, porque las enzimas mitocondriales de las células vivas pueden transformar las sales de MIT-tetrazolio en formazán insoluble.

Los resultados se resumen en la tabla 1.

TABLA 1

1

Tipo normal: líneas celulares malignas

Tipo en negrita y cursiva: líneas celulares benignas

Resultados

Líneas celulares humanas malignas de diferentes tipos y orígenes histológicos demuestran que la respuesta citotóxica al trifluoroacetato de calcio difiere entre las diversas líneas pero, dependiendo de la dosis, siempre alcanza niveles de muerte celular muy altos: 8/14 alcanzaron un 100% de mortalidad, y 6/14 alcanzaron valores que oscilaban entre el 80% y el 90%.

Estos resultados se obtuvieron tras una incubación de 24 horas. Las comprobaciones se realizaron tras 6 horas en vista del metabolismo posiblemente rápido de la sal debido a su peso molecular muy bajo.

Los datos recogidos demuestran que la actividad antitumoral tiene lugar en un tiempo corto a concentraciones bajas. Si la concentración se aumenta, se desarrolla una toxicidad no específica de la sal, lo que explica su baja toxicidad hacia las células normales a dosis altas.

Tumores murinos experimentales

Se inocularon ratones Balb/C con 25.000 células/ratón de C26 (adenocarcinoma de colon murino).

Cuatro días tras la inoculación, los animales se trataron subcutáneamente con 5 mg/kg de trifluoroacetato de calcio. El grupo control recibió únicamente solución salina. El tratamiento se administró cada día. El diámetro del tumor se midió con un instrumento de calibrado. En el día 20 tras la inoculación, los animales se sacrificaron y los tumores se extrajeron y se pesaron. Los resultados se exponen en la tabla 2. El peso medio y el tamaño medio de los tumores en los ratones control fue cuatro veces mayor que los del grupo tratado. Los datos relacionados con el comienzo de los tumores también fueron significativos: el 100% para los controles frente al 40% para los ratones tratados.

TABLA 2

2

Tratamiento de tumores caninos que se producen espontáneamente

Los experimentos llevados a cabo con tumores que se producen espontáneamente en animales domésticos, especialmente en perros, se consideran un modelo fidedigno que puede predecir la actividad en el hombre (D.M Vail et al., Spontaneously occurring tumors in companion animals as models for drug development. Anticancer drug development guide: preclinical screening, clinical trials and approval. Editado por B. Teicher Humana Press Inc., Totowa, NJ). Los tumores en mascotas son más similares que los tumores en roedores a los tumores humanos en lo que se refiere al tamaño, las cinéticas celulares y el comportamiento.

Se trataron seis perros que padecían tumores de mama y un pero con un linfoma maligno. El tratamiento se administró por vía intravenosa a dosis que oscilaban entre 100 y 10 mg/kg/día de trifluoroacetato de calcio. Pese a cierta variabilidad entre los animales, dependiendo del comienzo de los efectos secundarios, especialmente vómitos, la dosis superior (100 mg/kg) se administró inicialmente durante de uno a tres días, seguido por la dosis inferior (10 mg/kg) durante algunos días. La dosis superior se volvió a introducir entonces, pero sólo administrada dos veces a la semana. Algunos animales se trataron siempre con la dosis superior, pero a una frecuencia menor (9 - 10 administraciones en aproximadamente 20 días).

Aunque los resultados son de naturaleza preliminar y se obtuvieron en un número limitado de animales, demostraron la considerable eficacia antitumoral del trifluoroacetato de calcio. De hecho, los experimentos demostraron:

1.: Una reducción de la masa tumoral principal del 20% hasta más del 50% de su volumen inicial. Esta reducción fue evidente tras las primeras administraciones, y alcanzó su nivel más alto al final del ciclo de tratamiento utilizado hasta ahora (generalmente 3 semanas).

2.: El volumen reducido estaba acompañado generalmente por otros fenómenos que implicaban a la masa tumoral, tales como necrosis colicuativa, pérdida de contacto con los tejidos circundantes (adhesiones) y finalmente, encapsulación o ruptura de la pared, con fuga del material necrótico hacia el exterior.

3.: Desarrollo detenido de la metástasis y, en algunos casos, de la necrosis, y su desaparición (reabsorción o calcificación).

4.: El Ca(CF_{3}COO)_{2} demostró ser totalmente seguro incluso a dosis intravenosas diarias de 100 mg/kg; el único efecto secundario, observado en dos animales, fueron vómitos inmediatamente tras la administración del fármaco, y un ligero aumento de la temperatura (que no superó 1ºC).

Las pruebas de toxicidad, realizadas mediante la monitorización de los parámetros de la función del hígado y el riñón y, con especial atención a los tiempos de coagulación, no indicaron ninguna modificación patológica de estos parámetros en los animales tratados.

Casos clínicos

El trifluoroacetato de calcio se administró por vía subcutánea a dosis que oscilaban entre 10 y 200 mg al día a cinco pacientes con edades comprendidas entre los 56 y los 63 años que padecían de cáncer de mama (un caso), colon (tres casos) y útero (un caso), en un estado avanzado de la enfermedad y con metástasis difusa. Excepto por un caso de cáncer de colon que terminó con la muerte del paciente debido al estado sumamente avanzado de la enfermedad, (todos los casos se trataron partiendo de la base de un protocolo compasivo por razones éticas obvias), la respuesta terapéutica fue sorprendente, tanto en términos objetivos (una reducción de aproximadamente el 10 al 40% en la masa del tumor, reducción o desaparición de ascitis y nódulos metastáticos, y una reducción en los marcadores tumorales, tales como CA19.9 y alfa-fetoproteína) como en términos subjetivos (mejora del estado de ánimo, reducción y desaparición del dolor y vuelta a la vida laboral y social). Incluso en el caso del paciente que murió, se observó una reducción en la masa tumoral, pero el paciente murió debido a un empeoramiento de la caquexia neoplásica y a complicaciones cardiorrespiratorias.

Claims

1. Uso de trifluoroacetato de calcio para la preparación de medicamentos citotóxicos para el tratamiento de tumores.

2. Composiciones farmacéuticas que contienen trifluoroacetato de calcio como principio activo, mezclado con un vehículo adecuado.