ES2270870T3 - Peptidos derivados de muc-1. - Google Patents

Abstract

Polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en las SEC ID Nos: 5, 7, 8, 10 a 19 y 22 a 33.

Description

Péptidos derivados de MUC-1.

La presente invención se refiere a epítopos y células T restringidas por MHC de clase I que se pueden utilizar para prevenir o tratar el cáncer o provocar la inmunosupresión; y a la utilización de los epítopos para el diagnóstico del cáncer.

En particular, la presente invención se refiere a polipéptidos antigénicos de la proteína de MUC-1 que son capaces de activar la respuesta de los Linfocitos T Citotóxicos (CTL) y a secuencias de nucleótidos que codifican dichos polipéptidos. Además, la presente invención se refiere a vectores que comprenden dichas secuencias de nucleótidos, células huésped que comprenden las mismas y su utilización en la producción de los polipéptidos antigénicos. Además, la presente invención se refiere a composiciones que comprenden los polipéptidos, secuencias de nucleótidos, vector o células huésped de la presente invención y a utilizaciones terapéuticas o de diagnóstico de dichas composiciones.

En general, existen dos tipos principales de respuesta inmune: la respuesta humoral que se caracteriza por la producción de anticuerpos por linfocitos B, y la respuesta inmune medida por células. Los anticuerpos son capaces de reconocer antígenos en su forma tridimensional, solubles o unidos a un soporte insoluble, tal como una célula, mientras que las células T reconocen fragmentos de antígeno procesados que están unidos y presentados por glicoproteínas codificadas por los genes del complejo principal de histocompatibilidad (MHC), principalmente MHC-I, que se expresan en la superficie celular de casi todas las células de vertebrados o genes de MHC-II que se expresan en células presentadoras de antígenos (APC).

Una respuesta inmune mediada por células necesita habitualmente la cooperación de linfocitos T cooperadores y células efectoras. Esta cooperación tiene lugar, en particular, como resultado de la interleucina-2 y/o varias otras citocinas que son secretadas por linfocitos T cooperadores después de su activación mediante fragmentos antigénicos presentados por APC en asociación con MHC-II. Los Linfocitos T citotóxicos (CTL) son activados, inducidos para proliferar y ejercer su función citotóxica específica de antígeno tras la exposición a polipéptidos antigénicos formando complejos con MHC-1 autólogos, moléculas coestimuladoras en la superficie de la APC y las citocinas, frecuentemente derivadas de las células T cooperadoras. Las citocinas derivadas de las células T también pueden desencadenar y conducir la proliferación y la capacidad de procesado para antígenos de APC, así como la activación y la inducción de la proliferación en otras células, incluyendo otras células T.

De este modo, los linfocitos T citotóxicos (CTL) reconocen epítopos unidos a moléculas de MHC de clase I en la superficie de las células. El reconocimiento de dichos epítopos en la superficie de las células diana por CTL conduce a la muerte de las células diana por los CTL. Los epítopos que se muestran en la célula son fragmentos de proteínas que han sido procesadas en el mecanismo de procesado de antígenos de la clase I. En este mecanismo, las proteínas (generalmente del citoplasma) se rompen en el citoplasma en péptidos pequeños. A continuación, los péptidos pequeños se transportan a través del retículo endoplasmático (donde se unen a moléculas de MHC) a la superficie de la célula.

Dicha presentación de antígeno por las moléculas de MHC-I ha sido caracterizada (véase, por ejemplo, Groettrup y otros 1996, Immunology Today 17, 429-435): un antígeno de proteína o glicoproteína de tamaño completo se digiere en polipéptidos antigénicos más cortos (de aproximadamente 7 a 13 aminoácidos de longitud).

Dichos polipéptidos se asocian con moléculas de MHC-I y \beta-2 microglobulina conduciendo a un complejo ternario que se presenta posteriormente en la superficie celular.

No es posible predecir qué proteínas entrarán en el mecanismo de procesado de antígenos, qué fragmentos se producirán, o qué fragmentos se unirán a moléculas de MHC y se presentarán en la superficie de la célula. Adicionalmente, no es posible predecir qué fragmentos de células T reconocerán y si las células T que reconocen los fragmentos serán protectoras. La especificidad de MHC-I hacia los antígenos puede variar ampliamente dependiendo de la molécula de MHC-I considerada (HLA-A, HLA-B,...) y del alelo (HLA-A2, HLA-A3, HLA-A11,...) ya que los genes que codifican las moléculas de MHC son ampliamente variables entre individuos de una especie (revisión en George y otros, 1995, Immunology Today, 16, 209-212).

La mayoría de células tumorales expresan antígenos en su superficie que difieren cualitativa o cuantitativamente de los antígenos presentes en la superficie de las correspondientes células normales. Estos antígenos son específicos cuando son expresados sólo por células tumorales. Cuando están presentes en células normales y células tumorales, se dice que estos antígenos se asocian con el tumor; en este caso, están presentes en mayores cantidades o en una forma diferente en las células tumorales.

Actualmente, se sabe bien que los pacientes que sufren de un cáncer pueden desarrollar una respuesta inmune a su tumor. Esto se ha descrito, en particular, demostrando que el suero de algunos pacientes contiene anticuerpos para antígeno antitumorales, y que su suero era capaz de inhibir el crecimiento de células cancerígenas in vitro. No obstante, dado que las regresiones espontáneas de tumores son extremadamente extrañas, parece ser que la respuesta inmune observada in vitro permanece ineficaz in vivo. Hellstrom y otros (1969, Adv. Cancer Res. 12, 167-223) han mostrado que los CTL específicos de antígeno pueden ser mediadores eficaces en una respuesta inmune específica de tumor. Sin embargo, esta respuesta inmune natural no es siempre suficientemente eficaz para limitar el crecimiento del tumor. Aunque se puede desarrollar una respuesta inmune contra un tumor, no se sabe si realmente es una ventaja para el paciente. Aparentemente, el crecimiento incontrolado de tumores sugeriría que un tumor evita los mecanismos del cuerpo de vigilancia inmune. Las moléculas derivadas de tumores se consideran que tienen una función importante en la modificación o desviación de la respuesta inmune a favor del tumor en lugar de a favor del
individuo.

A la luz de la complejidad de la respuesta inmune contra los tumores y el estado modesto de conocimiento actual en este campo, la utilización de una vacuna anticancerígena no es obvia. Los estudios en animales han mostrado que la inmunización utilizando células cancerígenas vivas o muertas podría conducir al rechazo de un posterior injerto del tumor, aunque los intentos de una inmunización utilizando productos acelulares, por ejemplo la administración de la proteína antigénica completa, con fragmentos de polipéptidos de dicho fragmento de ADN de la proteína que codifica todas o parte de las proteínas asociadas al tumor, han sido generalmente menos satisfactorios.

Recientemente, Toes y otros (1997, Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 14660-14665) han desarrollado un enfoque alternativo basado en la selección de fragmentos de polipéptidos antigénicos mínimos que podrían ser reconocidos específicamente por los CTL. Según dicho método, los fragmentos antigénicos mínimos se expresan en las células huésped en las que pueden asociarse con moléculas de MHC-I y, a continuación, ser presentados en la superficie celular, induciendo a una reacción inmune específica. Más específicamente, se ha observado que la expresión intracelular de "minigenes" que codifican epítopos muy cortos (de 7 a 13 aminoácidos de longitud) puede inducir una respuesta inmune celular. Además, Whitton y otros (1993, J. of Virology 67, 348-352) han propuesto la utilización de un vector, llamado construcción "string of beads", que coexpresa diversos minigenes y puede inducir una respuesta inmune sinergética de
los CTL.

Otra utilización reciente e importante para dichos polipéptidos está asociada con los complejos solubles de MHC-I, \beta-2 microglobulina y un reactivo fluorescente o en cualquier caso detectable visualmente. Éstos, denominados "Tetrámeros" (por ejemplo, tal como se describe en Altman y otros, 1996, Science, 274: 94-96), se pueden utilizar para detectar mediante citometría de flujo o histología, CTL específicos de antígeno ex vivo.

MUC-1 es un polipéptido mucina glicosilado hallado en la superficie apical de las células epiteliales secretoras de mucina en diversos tejidos, incluyendo mama, pulmón, páncreas, estómago, ovarios, trompas de Falopio e intestino (Peat y otros, 1992, Cancer Res. 52:1954-60 - Ho y otros, 1993, Cancer Res. 53:641-51). La transformación maligna de mama, ovario, páncreas y probablemente otros tejidos epiteliales, da lugar a la sobreexpresión de polipéptido MUC-I en células tumorales (Hareuveni y otros, 1990, Eur. Journ. Biochem. 189: 475-86; Layton y otros, 1990, Tumor Biol. 11: 274-86). Además, la glicosilación anormal de polipéptido MUC-1 en la mama, y probablemente otras células tumorales que expresan MUC-1 da lugar a la exposición de epítopos antigénicos asociados al tumor en el núcleo de la proteína de MUC-1 (Burchell y otros, 1987, Cancer Res. 47:5476-82; Devine y otros, 1990, J. Tumor Marker Oncol. 5: 11-26; Xing y otros, 1989, Immun. Cell. Biol. 67: 183-95) así como en las cadenas laterales de glicosilo (Samuel y otros, 1990, Cancer Res. 50:4801-8).

Se han descrito anticuerpos monoclonales específicos para estos epítopos que pueden identificar más del 90% de los tumores de mama y pancreáticos. No se ha descrito ninguna respuesta de célula T citotóxica restringida por el complejo de histocompatibilidad principal (MHC) al epítopo de proteína MUC-1 específico de tumor por las células T de pacientes de cáncer de mama y páncreas (Jerome y otros, 1991, Cancer Res. 51:2908-16), además de los CTL específicos de MUC-1, restringidos por MHC (Reddish y otros, 1995, Int. J. Cancer 10:817-823). Además, se ha observado la proliferación de células T a MUC-1 purificado (Keydar y otros, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1362-6). Estas diversas observaciones sugieren que MUC-1 puede ser un antígeno diana eficaz para inmunoterapia activa en la mama, así como en otros cánceres. Hareuveni y otros (1991, Vaccine 9:618-27) expresaron el antígeno de MUC-1 en virus vaccinia y mostraron que la rata inmunizada con VV-MUC-1 rechazaba las células tumorales que tenían MUC-1 a una velocidad del 60-80% (Hareuveni y otros, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:9498-502). El documento WO98/50527 describe, entre otros, un método para generar una mezcla de células T activadas mediante la combinación de un conjunto de linfocitos de sangre periférica con un liposoma cargado de antígeno para producir PBLS cargado con antígeno y la combinación de PBLS cargado de antígeno con una célula T "naive", anérgica o de memoria, para producir una célula T activada. Entre los péptidos descritos en WO98/50527 a cargar en los liposomas está un péptido derivado de MUC-1 que se dice que se une a HLA-A2. Los inventores han identificado epítopos que se pueden utilizar para inducir una respuesta restringida por MHC de clase I que es protectora contra una estimulación tumoral. Los epítopos son de la proteína MUC1. Dado que las células T activadas expresan MUC1, estos epítopos también se pueden utilizar para inducir una respuesta inmune contra dichas células T o se pueden utilizar para obtener productos que son capaces de dirigir células T activadas.

De este modo, la presente invención se refiere a polipéptidos inmunorreactivos identificados a partir de la secuencia del polipéptido MUC-1 y sus usos en la terapia y diagnosis del cáncer. La presente invención también se podría utilizar para seguir las respuestas inmunes específicas de MUC-1 en pacientes durante el transcurso de la enfermedad y/o tratamiento. La presente invención también se refiere a secuencias de nucleótidos que codifican estos polipéptidos, vectores útiles para la transferencia y expresión de dichas secuencias de nucleótidos en células diana, y los usos de dichas secuencias de nucleótidos en la diagnosis y vacunación en la terapia génica del cáncer.

Por consiguiente, la presente invención describe polipéptidos que consisten en, como mínimo, una secuencia de aminoácidos de, como máximo, 20 aminoácidos consecutivos definidos en la SEC ID No: 1, en la que dicho polipéptido es diferente de la SEC ID No: 2 y es capaz de unirse con, como mínimo, una molécula de MHC-I.

"Capaz de unirse con" significa que el polipéptido considerado es capaz de interaccionar y unirse con moléculas de MHC-I. En una realización preferente de la presente invención, estos resultados de unión dan lugar a una presentación en la superficie celular de estos polipéptidos por las moléculas de MHC clase I con el fin de conseguir una respuesta inmune específica o para la detección de una respuesta inmune específica, por ejemplo, mediante análisis del Tetrámero (tal y como se describe, por ejemplo, en Altman y otros, 1996, Science 274:94-96).

Según una realización preferente, dicha secuencia de aminoácidos se selecciona del grupo que consiste en la SEC ID No: 5, 7, 8, 10 a 19 y 22 a 33. Los datos que explican porqué se han seleccionado estas secuencias se muestran en las figuras 1 a 7.

Según otra realización de la invención, dicho polipéptido presenta, como mínimo, una de las siguientes propiedades:

(a) la secuencia de aminoácidos se selecciona del grupo que consiste en la SEC ID No: 5, y dicho polipéptido se une a la glicoproteína HLA-A2 de MHC-I;

(b) la secuencia de aminoácidos se selecciona del grupo que consiste en la SEC ID No: 7, SEC ID No: 8, SEC ID No: 10 a la SEC ID No: 15, y dicho polipéptido se une a la glicoproteína HLA-B7 de MHC-I;

(c) la secuencia de aminoácidos se selecciona del grupo que consiste en la SEC ID No: 16 a la SEC ID No: 19, y dicho polipéptido se une a la glicoproteína HLA-A3 de MHC-I;

(d) la secuencia de aminoácidos se selecciona del grupo que consiste en la SEC ID No: 19, y dicho polipéptido se une a la glicoproteína HLA-A11 de MHC-I;

(e) la secuencia de aminoácidos se selecciona del grupo que consiste en la SEC ID No: 22 a la SEC ID No: 25, y dicho polipéptido se une a la glicoproteína HLA-A24 de MHC-I;

(f) la secuencia de aminoácidos se selecciona del grupo que consiste en la SEC ID No: 26 a la SEC ID No: 29, y dicho polipéptido se une a la glicoproteína HLA-A1 de MHC-I; y

(g) la secuencia de aminoácidos se selecciona del grupo que consiste en la SEC ID No: 30 a la SEC ID No: 33, y dicho polipéptido se une a la glicoproteína HLA-B8 de MHC-I;

En una realización particular preferente, el polipéptido es un péptido que comprende un epítopo de célula T restringido por MHC de clase I, estando el epítopo contenido en o representado por cualquiera de las SEC ID Nos. mencionadas anteriormente, preferiblemente la SEC ID No: 5. Estos últimos epítopos están fuera de la región inmunogénica de repeticiones en tándem de número variable (VNTR).

Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos presente en el polipéptido de la invención puede ser una secuencia representada por cualquiera de las SEC ID Nos. descritas anteriormente en la presente invención o la secuencia de aminoácidos de un epítopo presente en el interior de estas secuencias (tales como los fragmentos de las secuencias mostradas entre paréntesis a continuación, por ejemplo, para la SEC ID No: 5):

SEC ID No: 5 - TLAPATEPA (LAPATEPA)

En una realización, el polipéptido de la presente invención tiene la misma secuencia que el "epítopo". El péptido habitualmente comprende 1, 2, 3 o más copias de cada uno de 1, 2 o más, o todos los "epítopos" definidos anteriormente.

Habitualmente en el polipéptido, una secuencia "enlazadora" puede separar o no los "epítopos" y/o pueden haber o no secuencias adicionales (no "epítopo") en el extremo N terminal o C terminal del polipéptido. Habitualmente, el péptido comprende 1, 2, 3 o más enlazadores. Los enlazadores tienen habitualmente 1, 2, 3, 4 o más aminoácidos de longitud y pueden comprender una secuencia de aminoácidos codificado por una secuencia de polinucleótidos que comprende sitios para enzimas de restricción o aminoácidos que constituyen sitios de división proteosomales. De este modo, en el polipéptido, 1, 2 o más, o todos los "epítopos" pueden estar juntos o separados entre sí. Las secuencias "epítopo" pueden solaparse entre sí. El polipéptido tiene habitualmente de 8 a 2000 aminoácidos de longitud, tal como de 9 a 1000, de 10 a 500, de 11 a 200, de 12 a 100 o de 15 a 50 amino-
ácidos.

El polipéptido puede comprender también una secuencia que ayuda a la estimulación de una respuesta de CTL dirigida al epítopo. Dicha secuencia puede actuar como adyuvante o puede dirigir el polipéptido a células presentadoras de antígenos (APCs) o a compartimentos en mecanismo de procesado del antígeno. La secuencia puede estimular una respuesta de cooperador T, tal como una respuesta de Th1 y, de este modo, puede comprender un epítopo de célula cooperadora T (por ejemplo Th1). El polipéptido puede comprender también la secuencia de cualquiera de las proteínas mencionadas en la presente invención.

El polipéptido puede estar libre de modificaciones. En una realización, el polipéptido se modifica, por ejemplo, mediante una modificación natural post-traduccional (por ejemplo, glicosilación) o una modificación artificial. De este modo, la secuencia en el polipéptido puede comprender o no la modificación o modificaciones que están presentes cuando la secuencia se expresa en una célula normal o cancerígena. El polipéptido puede comprender las modificaciones que tienen lugar cuando se expresa en una célula eucariota (por ejemplo, humana) o procariota (por ejemplo, E. coli). En una realización adicional, el polipéptido carece de glicosilación.

La modificación puede proporcionar un grupo químico (habitualmente, por sustitución de un hidrógeno, por ejemplo, el hidrógeno de un enlace C-H), tal como un grupo amino, acetilo, hidroxilo o halógeno (por ejemplo, flúor) o grupo carbohidrato. Habitualmente, la modificación está presente en el N o C terminal.

El término "procesado" se refiere a estar procesado por el mecanismo de presentación de antígeno de clase I (generalmente, esto será la hidrólisis, por ejemplo, proteólisis).

Los métodos para medir la homología de la proteína son conocidos en la técnica y se entenderá por los técnicos en la materia que en el presente contexto, la homología se calcula en base a la identidad de aminoácidos (algunas veces referida como "homología dura"). Por ejemplo, el Paquete UWGCG proporciona el programa BESTFIT que se puede utilizar (por ejemplo, en sus ajustes por defecto) para calcular la homología (Devereux y otros, Nucl. Acids. Res. 12 (1984), 387-395).

El péptido homólogo difiere habitualmente del epítopo presente en el polipéptido de la presente invención por la sustitución, inserción o eliminación de, por ejemplo, 1, 2, 3, 4 o más sustituciones y/o 1, 2, 3, 4 o más eliminaciones y/o 1, 2, 3, 4 o más inserciones a lo largo de su longitud. Las sustituciones son preferentemente "conservativas". Éstas se definen según la siguiente Tabla. Los aminoácidos en el mismo bloque en la segunda columna y preferentemente en la misma línea en la tercera columna se pueden sustituir entre sí.

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TABLA 1

Alifático	No polar	GAP
		ILV
	Polar-no cargado	CSTM
		NQ
	Polar-cargado	DE
		KR
Aromático		HFWY

La presente invención también se refiere a polinucleótidos que comprenden una secuencia de ácidos nucleicos que codifican, como mínimo, un polipéptido de la presente invención. Basándose en las secuencias de aminoácidos proporcionadas en la presente solicitud y mediante la utilización del código genético, los técnicos en la materia pueden identificar dichas secuencias de ácidos nucleicos. En una realización preferente, la secuencia de ácidos nucleicos de la presente invención se selecciona del grupo que consiste en SEC ID Nos: 34, 36, 38, 39, 41 a 50 y 53 a 64.

El término "polinucleótido", tal y como se utiliza en el ámbito de la presente invención, significa un fragmento de ADN y/o ARN, de cadena única o doble, lineal o circular, natural o sintético, modificado o no (véanse las Patentes US-A-5.525.711, US-A-4.711.955, US-A-5.792.608 o EP-A-0302175 para ejemplos de modificaciones) que define un fragmento o una parte de un ácido nucleico, sin limitación de tamaño. Puede ser, entre otros, una ADN genómico, un ADNc, un ARNm. "Polinucleótidos" y "ácidos nucleicos" son sinónimos con respecto a la presente invención. El ácido nucleico puede estar en forma de un polinucleótido lineal y, preferentemente, en forma de un plásmido. Existe un amplio rango de plásmidos disponibles comercialmente y son bien conocidos por un técnico en la materia. Estos plásmidos disponibles se modifican fácilmente mediante técnicas de biología molecular (Sambrook y otros, 1989, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York).

Los plásmidos derivados de pBR322 (Gibco BRL), pUC (Gibco BRL), pBluescript (Stratagene), pREP4, pCEP4 (Invitrogen) y también p Poly (Lathe y otros, 1987, Gene 57, 193-201) son ilustrativos de estas modificaciones. Según la presente invención, el ácido nucleico puede ser un polinucleótido desnudo (Wolff y otros, Science 247 (1990), 1465-1468) o se formula con, como mínimo, tal como un polipéptido, preferentemente polipéptidos virales, oligonucleótidos o lípidos catiónicos, o polímeros catiónicos que pueden participar en la captación del ácido nucleico en las células (véase Ledley, Human Gene Therapy 6 (1995), 1129-1144 para una revisión) o un compuesto polar prótico (a continuación se proporcionan ejemplos en el presente documento o en EP-A-0890362). "Polinucleótido" también designa un ácido nucleico de origen viral (vector viral) que codifica, como mínimo, el polipéptido de la presente invención. Dicho vector viral deriva preferentemente de un virus seleccionado de entre poxvirus (virus vaccinia, MVA, canarypox...), adenovirus, retrovirus, virus del herpes, alfa virus, virus espumosos, virus adeno-asociado. Dichos vectores virales y sus usos están descritos ampliamente en la literatura de terapia génica.

Preferentemente, dicho ácido nucleico incluye, como mínimo, una secuencia génica terapéuticamente útil que se puede transcribir y traducir para generar un polipéptido de interés y los elementos que permiten su expresión. La información genética necesaria para la expresión por una célula diana comprende todos los elementos requeridos para la transcripción de ADN en ARN y, si es necesario, para la traducción de ARNm en un polipéptido. Los promotores transcripcionales adecuados para la utilización en varios sistemas vertebrados son bien conocidos. Por ejemplo, entre los promotores adecuados se incluyen promotores virales, tales como RSV, MPSV, SV40, CMV o 7,5k, promotor de vaccinia, promotores inducibles, promotores específicos de tejido, promotores sintéticos, etc. o la combinación de los mismos. El ácido nucleico también puede incluir secuencias de intrón, secuencias marcadoras, secuencias de transporte, secuencias implicadas en la replicación o integración. Dichas secuencias están descritas en la literatura y se pueden obtener fácilmente por un técnico en la materia. El ácido nucleico también se puede modificar con el fin de estabilizarse con componentes específicos, tales como espermina.

El polinucleótido de la presente invención es capaz de expresar 1, 2, 3 o más compuestos (diferentes), cada uno de los cuales es un polipéptido de la presente invención. El polinucleótido es habitualmente ADN o ARN y es de cadena única o doble. El polinucleótido comprende generalmente 1, 2, 3 o más secuencias codificantes que pueden ser las mismas o diferentes. Como mínimo, una de las secuencias codificantes codifica un polipéptido de la presente invención. La secuencia codificante habitualmente está unida operativamente a una secuencia de control capaz de proporcionar la expresión del polinucleótido. De este modo, habitualmente, el polinucleótido comprende secuencias en 5’ y 3’ con respecto a las secuencias codificantes que ayudan a la expresión, tales como la transcripción y/o traducción de ayuda de la secuencia codificante. Habitualmente, el polinucleótido comprende un promotor, un potenciador, un terminador de la transcripción, una señal de poliadenilación, cola poliA, intrón, un codón de iniciación de traducción o codón de terminación de la traducción.

El polinucleótido en particular puede ser capaz de expresar un polipéptido de la presente invención en una célula de mamífero o aviaria, tal como en cualquiera de las células descritas en la presente invención. El polinucleótido además puede ser capaz de expresar el polinucleótido en el vector celular descrito a continuación.

El polinucleótido puede formar o ser parte de un vector, tal como un vector plásmido o cósmido. En una realización, el polinucleótido está presente en un vector de virus o de células, tal como un virus que es capaz de estimular la respuesta de células T restringidas por MHC de clase I (por ejemplo, virus de vaccinia).

El proceso de introducción o transferencia de una sustancia aniónica de interés en una célula es en sí mismo conocido. La "introducción o transferencia" significa que el polinucleótido se transfiere en la célula y se localiza, al final del proceso, en el interior de dicha célula o en el interior o sobre su membrana. También se denomina "transfección" o "infección" dependiendo de la naturaleza del vector.

Por lo tanto, la presente invención está además dirigido a un vector, por ejemplo, de origen viral o plásmido, que comprende, como mínimo, una secuencia de ácidos nucleicos de la presente invención.

Según una realización preferente, el vector de la presente invención comprende una o más secuencias de nucleótidos seleccionadas del grupo que consiste en:

- las secuencias que codifican un polipéptido según se define en (a) además de una o más secuencias que codifican un polipéptido según se define en (b), (c), (d), (e), (f) o (g),

- las secuencias que codifican un polipéptido según se define en (b) además de una o más secuencias que codifican un polipéptido según se define en (a), (c), (d), (e), (f) o (g),

- las secuencias que codifican un polipéptido según se define en (c) además de una o más secuencias que codifican un polipéptido según se define en (a), (b), (d), (e), (f) o (g),

- las secuencias que codifican un polipéptido según se define en (d) además de una o más secuencias que codifican un polipéptido según se define en (a), (b), (c), (e), (f) o (g),

- las secuencias que codifican un polipéptido según se define en (e) además de una o más secuencias que codifican un polipéptido según se define en (a), (b), (c), (d), (f) o (g),

- las secuencias que codifican un polipéptido según se define en (f) además de una o más secuencias que codifican un polipéptido según se define en (a), (b), (c), (d), (e) o (g), y

- las secuencias que codifican un polipéptido según se define en (g) además de una o más secuencias que codifican un polipéptido según se define en (a), (b), (c), (d), (e) o (f).

Además, la presente invención se refiere a células huésped que comprenden, como mínimo, un polinucleótido o, como mínimo, un vector según la presente invención. Preferentemente, dicha célula huésped es una célula procariota o una célula eucariota, tal como una célula de levadura, más preferentemente una célula animal, más preferentemente una célula de mamífero.

La presente invención también se refiere a una composición (iv) que comprende dos o más compuestos diferentes en la que cada uno de los compuestos es (i) un polipéptido o (ii) un polinucleótido de la presente invención tal y como se ha definido anteriormente.

En la composición, pueden estar presentes (iv) 1, 2, 3, 4, 5 o más compuestos diferentes, en la que cada uno de estos compuestos es (i) o (ii). De este modo, la composición puede comprender todos los epítopos de la presente invención. La composición puede comprender 1, 2, 3, 4, 5 o más polinucleótidos que juntos son capaces de ser expresados para proporcionar 1, 2, 3, 4, 5 o más epítopos o polipéptidos diferentes de la presente invención, o todos los epítopos de la presente invención.

En particular, (i), (ii) o (iv) se proporcionan para la utilización en forma de una composición farmacéutica para la vacunación contra el cáncer o para la utilización en la inmunosupresión. Se pueden utilizar 1, 2, 3, 4, 5 o más diferentes epítopos de la presente invención (o todos los epítopos de la presente invención). De manera similar, se pueden utilizar 1, 2, 3, 4, 5 o más polinucleótidos diferentes que juntos son capaces de ser expresados para proporcionar cualquiera de las combinaciones de epítopos, polipéptidos o composiciones mencionadas en la presente invención. Sin embargo, en una realización, cada epítopo o uno o más grupos de epítopos de la combinación son adecuados para ser administrados al huésped de forma separada o secuencial. Los epítopos en cada grupo están habitualmente juntos en forma de un péptido único de la presente invención o en forma de la composición de la presente invención. De manera similar, se pueden administrar diferentes polipéptidos o polinucleótidos de la presente invención de forma separada o secuencial, por ejemplo, polinucleótidos capaces de expresar epítopos y/o polipéptidos y/o análogos y/o composiciones individuales o grupos de los mismos.

De este modo, la presente invención proporciona una combinación de 1, 2, 3, 4, 5 o más epítopos y/o polipéptidos y/o composiciones y/o polinucleótidos diferentes de la presente invención para la utilización simultánea, separada o secuencial en la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia, por ejemplo, en la vacunación contra el cáncer o en la inmunosupresión.

La vacunación contra el cáncer o la inmunosupresión habitualmente conduce a una respuesta de células T restringidas por MHC de clase I, cuyas células T son específicas para un epítopo de la presente invención.

De este modo, (i), (ii) o (iv) se pueden utilizar en una forma o manera en la que estimulan dicha respuesta de células T restringidas por MHC de clase I. Dichos métodos son conocidos en la técnica. Generalmente, una respuesta de células T restringidas por MHC de clase I se pueden obtener mediante vacunación utilizando una dosis apropiada, ruta de administración, adyuvante o sistema de liberación. De este modo, la vacuna de la presente invención puede comprender uno o más componentes (por ejemplo, tal y como se ha descrito en la presente invención en relación con la vacuna de la presente invención) adicionalmente a (i), (ii) o (iv). Los componentes de la vacuna se pueden administrar de forma simultánea, separada o secuencial al huésped.

De este modo, la presente invención también da a conocer una vacuna que comprende (i), (ii) o (iv), cuya vacuna es capaz de estimular una respuesta de células T restringidas por MHC de clase I dirigidas a un epítopo (polipéptido) de la presente invención. Habitualmente, dicha vacuna comprende un adyuvante o sistema de liberación que estimula una respuesta de células T restringidas por MHC de clase I.

El adyuvante puede ser capaz de provocar o aumentar una respuesta de células T (habitualmente CD4) restringidos por MHC de clase II que es favorable para la producción de una respuesta de células T restringidas por MHC de clase I, tal como una respuesta de Th1. De este modo, el adyuvante puede comprender un epítopo de células T restringidas por MHC de clase II (o un precursor que se puede procesar in vivo para proporcionar dicho epítopo). El adyuvante puede ser una citocina, tal como una citosina que estimula una respuesta de células T restringidas por MHC de clase I o una respuesta de células T restringidas por MHC de clase II favorable (por ejemplo, IL-2, IL-7, IL-12 o IFN-\gamma). El adyuvante puede ser, por ejemplo, CFA (Golding y Scott, Ann. N.Y. Acad. Sci. 754 (1995), 126-137), un dipéptido muramilo (por ejemplo, de una pared celular micobacteriana), monofosforil lípido A, lipopolisacárido (por ejemplo, de B. abortus), liposomas, SAF-1 (Golding y Scott, Ann. N.Y. Acad. Sci. 754 (1995), 126-137), una saponina (por ejemplo, Quil A), hemocianina de lapa californiana, partícula TY de levadura, beta 2-microglobulina o manán (por ejemplo, manán oxidado).

El sistema de liberación habitualmente es capaz de proporcionar (i), (ii), (iv) o un epítopo expresado de (iv) a una APC, tal como una APC profesional.

Tal y como se ha mencionado anteriormente, la ruta particular de administración adecuada para la utilización puede ayudar en la estimulación de una respuesta de células T restringidas por MHC de clase I y, de este modo, se pueden proporcionar (i), (ii), (iv) o la vacuna de la invención en una forma adecuada para la administración mediante dicha ruta. Se prefieren las rutas intraperitoneal o intravenosa. En una realización, estas sustancias se liberan mediante medios biolísticos.

Generalmente, una dosis baja de antígeno favorece el desarrollo de una respuesta de células T restringidas por MHC de clase I. De este modo, en el método, se puede proporcionar una dosis baja adecuada de un compuesto de la presente invención. La vacuna puede proporcionarse en una cantidad y una concentración que es adecuada para la administración con el fin de proporcionar una dosis baja adecuada. En una realización se administra (iv) en forma de "ADN desnudo".

La presente invención también se refiere a una composición, preferentemente una composición farmacéutica, que es particularmente útil para la liberación de polinucleótidos de la presente invención a células o tejidos de un sujeto en el ámbito de un método terapéutico génico, especialmente en el caso del tratamiento del cáncer. El término "método terapéutico génico" se entiende preferentemente como un método para la introducción de un polinucleótido en células in vivo o mediante la introducción en células in vitro seguido de la reimplantación en un sujeto. La "terapia génica" en particular se refiere al caso en el que los polinucleótidos se expresan en un tejido diana, especialmente tejido que comprende células que expresan moléculas MHC-I.

Preferentemente, la composición, en particular la composición farmacéutica, comprende además un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. El portador o diluyente no es tóxico para los receptores en las dosis y concentraciones utilizadas. Entre los ejemplos representativos de portador o diluyente para soluciones inyectables se incluyen agua, soluciones salinas isotónicas que están preferentemente tamponadas a pH fisiológico (tales como soluciones salinas tamponadas con fosfato o Tris), manitol, dextrosa, glicerol y etanol, así como polipéptidos o proteínas tales como albúmina de suero humano. Este portador o diluyente es preferentemente isotónico, hipotónico o débilmente hipertónico y tiene una fuerza iónica relativamente baja. Además, puede contener cualquier disolvente pertinente, portadores líquidos acuosos o parcialmente acuosos que comprenden agua estéril libre de pirógeno, medios de dispersión, recubrimientos y equivalentes. El pH de la preparación farmacéutica se ajusta y se tampona de forma adecuada.

La presente invención se refiere más particularmente a una composición, en particular composición farmacéutica, que comprende, como mínimo, uno de los complejos descritos anteriormente y también incorpora, como mínimo, un adyuvante capaz de mejorar la capacidad de transfección de dicho complejo. Los adyuvantes se pueden seleccionar del grupo que consiste en una cloroquina, compuestos polares próticos, tales como propilen glicol, polietilen glicol, glicerol, EtOH, 1-metil L-2-pirrolidina o sus derivados, o compuestos polares apróticos, tales como dimetilsulfóxido (DMSO), dietilsulfóxido, di-n-propilsulfóxido, dimetilsulfona, sulfolano, dimetilformamida, dimetilacetamida, tetrametilurea, acetonitrilo y sus derivados.

En una realización preferente, el polinucleótido que está contenido en la composición es un ADN. Otras realizaciones particulares de la presente invención son composiciones, en particular composiciones farmacéuticas, en las que dicho polinucleótido está desnudo, asociado con polipéptidos virales o complejado con componentes catiónicos, más preferentemente con lípidos catiónicos. En general, la concentración de polinucleótido en dicha composición varía de aproximadamente 0,1 \mug/ml a aproximadamente 20 mg/ml.

La composición, en particular la composición farmacéutica, según la presente invención, es adecuada para administrarse en un tejido de vertebrado. Esta administración se puede realizar mediante inyección intradérmica, subdérmica, intravenosa, intramuscular, intranasal, intracerebral, intratraqueal, intraarterial, intraperitoneal, intravesical, intrapleural, intracoronaria o intratumoral, mediante una jeringa u otros dispositivos. También se considera la administración transdérmica, al igual que la inhalación, rutas con aerosol, instilación o aplicación tópica.

Según la presente invención, la composición, en particular la composición farmacéutica, es adecuada para administrarse en tejidos diana del cuerpo vertebrado, incluyendo el músculo, piel, cerebro, pulmón, hígado, bazo, médula espinal, timo, corazón, linfa, hueso, cartílago, páncreas, riñón, vesícula biliar, estómago, intestino, testículos, ovario, útero, recto, sistema nervioso, ojo, glándulas, tejido conectivo, sangre, etc. En una realización preferente, dicha composición se administrará en un tumor.

La administración de dicha composición a un paciente permite obtener una respuesta inmune basada en la activación de los linfocitos citotóxicos por los polipéptidos codificados por dichas secuencias de nucleótidos. La composición de la presente invención es particularmente adecuada para el tratamiento o prevención de cánceres que expresan MUC-1, tales como el cáncer de mama, el cáncer de ovario, el cáncer de páncreas o el cáncer de pulmón.

Según una realización especial, las composiciones de la presente invención, es decir, que contienen secuencias de polipéptidos o polinucleótidos de la presente invención (ver anteriormente), son adecuadas para el tratamiento o prevención del cáncer que expresa MUC-1, en la que dicho tratamiento o prevención comprende:

- una etapa a) que consiste en la administración a un paciente de una composición de la presente invención.

- una etapa b) que consiste en la administración al mismo paciente que necesita una segunda composición, en la que dicha composición es una composición de la presente invención, o una composición que contiene un polipéptido de MUC-1, o un polinucleótido que codifica dicho polipéptido de MUC-1, en la que dicho polipéptido de MUC-1 es el polipéptido de MUC-1 de longitud completa de SEC ID No: 2 o un polipéptido de MUC-1 tal y como se describe en las patentes US 4.963.848, US 5.053.489, WO 88 8805054 o US 5.861.381 correspondientes al polipéptido de MUC-1 que presenta secuencia de repeticiones en tándem de número variable.

Según esta realización especial, ambas etapas de administración a) y b) se pueden realizar independientemente entre sí o al mismo tiempo. Esta realización especial puede dar lugar a la estimulación del sistema inmune desarrollado por los pacientes tratados.

Según la presente invención, el término "células" incluye células procariotas y células eucariotas, células de levadura, células vegetales, células humanas o animales, en particular células de mamíferos. En particular, deberían mencionarse las células cancerígenas. La presente invención se puede aplicar in vivo al espacio instersticial o luminal de tejidos en los pulmones, la tráquea, la piel, los músculos, el cerebro, el hígado, el corazón, el bazo, la médula espinal, el timo, la vejiga, el sistema linfático, la sangre, el páncreas, el estómago, los riñones, los ovarios, los testículos, el recto, el sistema nervioso periférico o central, los ojos, los órganos linfoides, el cartílago, el endotelio. En realizaciones preferentes, la célula será una célula muscular, una célula madre del sistema hematopoyético o una célula de las vías respiratorias, una célula de traquea o pulmonar, o una célula tumoral.

La presente invención también se refiere a un proceso para transferir un ácido nucleico en células en las que dicho proceso comprende contactar dichas células con, como mínimo, un polinucleótido según la presente invención. Este proceso es adecuado para ser aplicado mediante administración directa de dicho polinucleótido a células del animal in vivo, o puede aplicarse mediante tratamiento in vitro de células que se recuperaron del animal y, a continuación, reintroducirlas en el cuerpo del animal (proceso ex vivo). En la aplicación in vitro, las células cultivadas en un medio apropiado se ponen en contacto con una suspensión que consiste en polinucleótido de la presente invención. Después de un tiempo de incubación, las células se lavan y se recuperan. La introducción del polinucleótido se puede comprobar (finalmente después de la lisis de las células) mediante cualquier método apropiado.

En el caso de tratamiento in vivo según la presente invención, con el fin de mejorar la velocidad de transfección, el paciente puede experimentar un tratamiento de depleción de macrófagos previamente a la administración de las preparaciones farmacéuticas descritas anteriormente. Dicha técnica se describe en la literatura (con referencia particularmente a Van Rooijen y otros, 1997, Tibtech 15, 178-184).

La presente invención se refiere además a la utilización de un polipéptido o un polinucleótido, un vector o una célula huésped según se ha definido anteriormente para la preparación de una composición dirigida al tratamiento diagnóstico, curativo, preventivo o de vacunación del hombre o animales, y más específicamente para el tratamiento del cáncer.

Además, la presente invención se refiere a una composición de diagnóstico que comprende, como mínimo, un polipéptido tal y como se ha definido anteriormente. La utilización de un polipéptido de la presente invención en una composición de diagnóstico se muestra mediante los siguientes procesos:

- un proceso que permite la detección y finalmente la cuantificación de un anticuerpo dirigido contra dicho polipéptido consiste en (i) contactar con dicho polipéptido una muestra biológica susceptible de contener dicho anticuerpo y (ii) detectar la formación de un complejo inmune entre dicho anticuerpo y dicho polipéptido.

- un proceso que permite la detección y finalmente la cuantificación de linfocitos T específicos de MUC-1 según la técnica de ELISPOT (Scheibenbogen y otros, 1997, Clinical Cancer Research 3, 221-226); el análisis de Tetrámeros (por ejemplo, tal y como se describe en Altman y otros, 1996, Science 274:94-96) u otras técnicas que permiten la identificación de células T específicas en virtud de la especificidad de su receptor de células T para los polipéptidos de la presente invención.

Las composiciones o utilizaciones de la presente invención son adecuadas para ser utilizadas para el tratamiento de todos los tipos de cáncer, estando el tratamiento y/o diagnóstico de los mismos relacionados o dependientes de las propiedades inmunes de los polipéptidos de la presente invención. Las composiciones y utilizaciones de la presente invención se pueden utilizar de forma deseable en humanos, aunque el tratamiento animal también se contempla mediante las utilizaciones descritas en la presente invención.

La molécula de MHC de (a) es generalmente una molécula de la clase I (por ejemplo, HLA-A*0201). Dichas moléculas comprenden una cadena \alpha y una cadena \beta. El fragmento puede comprender solamente el dominio extracelular de la molécula de MHC. El fragmento puede ser capaz o no de unirse a la membrana celular. (b) puede comprender una proteína que tiene homología con una cadena \alpha natural (o un fragmento de la misma) y/o una proteína que tiene homología con una cadena \beta natural (o un fragmento de la misma). Las cadenas \alpha y \beta naturales pueden ser de una molécula HLA-A (por ejemplo, HLA-A*0201). Cualquiera de las proteínas o fragmentos homólogos anteriores se pueden presentar como parte de proteínas de fusión. (b) es habitualmente un derivado de (a) y, de este modo, puede fabricarse modificando (a) mediante cualquiera de las modificaciones mencionadas en la presente invención. El producto se puede diseñar, fabricar o identificar utilizando métodos conocidos en la técnica. De este modo, la presente invención da a conocer la utilización de un polipéptido (epítopo o secuencia de epítopos) de la presente invención para diseñar o identificar el producto. El producto se puede diseñar mediante medios informáticos o se puede identificar de una biblioteca de compuestos.

De este modo, la presente invención también proporciona un método de identificación de un producto de la presente invención que comprende contactar una sustancia candidata con un receptor de célula T o fragmento de la presente invención y determinar si la sustancia candidata se une al receptor de célula T o fragmento, indicando la unión de la sustancia candidata al receptor de célula T o fragmento que la sustancia es dicho producto.

En el método, el producto puede estar presente en la superficie de una célula, tal como una APC profesional. La unión se puede medir mediante el contacto de la sustancia candidata con una célula T de la presente invención y determinar si la sustancia candidata provoca la actividad funcional específica de antígeno de la célula T (tal como mediante cualquier medio mencionado en la presente invención).

El producto puede estar unido a un agente citotóxico. En una realización, el producto es un anticuerpo. En una realización, 2, 3, 4 o más productos están unidos en un multímero y, de este modo, la presente invención proporciona un multímero que comprende 2 o más productos de la presente invención. Dicho multímero se puede utilizar de la misma manera que se utiliza el producto en los diferentes aspectos de la presente invención y, de esta manera, el término "producto" tal y como se utiliza en el contexto de otros aspectos de la presente invención incluye el multímero.

Los productos en el multímero pueden estar unidos mediante un enlace covalente o mediante medios no covalentes. En una realización preferente, los productos están unidos mediante una interacción estreptavidina - biotina y, de este modo, habitualmente los productos comprenden una parte de biotina (habitualmente, químicamente unida a o en una proteína de fusión con el producto) que permite que los productos estén unidos mediante estreptavidina.

El multímero tiene generalmente una afinidad de unión al receptor de célula T de la presente invención superior que el producto y, en una realización, es capaz de provocar más actividad funcional específica de antígeno que el producto. El multímero puede comprender también una marca detectable, tal como una marca radioactiva o una marca detectable con la luz (por ejemplo, fluorescente). La marca puede permitir que el multímero se pueda clasificar mediante citometría de flujo (por ejemplo, cuando el multímero está unido a un receptor de célula T que está presente en una célula T de la presente invención).

El multímero puede ser un multímero soluble o puede ser capaz de asociarse con una membrana celular. En una realización, el multímero está unido a un soporte sólido, tal como una placa de microtitulación.

La presente invención también proporciona una célula que comprende un producto de la presente invención. La célula puede ser de cualquier tipo de célula mencionada en la presente invención, tal como una APC profesional o célula T. La célula puede ser capaz de estimular la activación funcional específica de antígeno de una célula T de la presente invención. De este modo, la célula se puede utilizar para estimular una respuesta de células T restringidas por MHC de clase I in vitro o in vivo, cuya respuesta está dirigida a un polipéptido (epítopo) de la presente invención. Por lo tanto, la célula se puede utilizar para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia, particularmente en el tratamiento o prevención del cáncer.

En una realización, la célula se puede fabricar proporcionando un polipéptido, polinucleótido o composición de la presente invención a una célula que es capaz de procesar el polipéptido, polinucleótido o composición y presentarlos en su superficie (en condiciones en las que tiene lugar dicho proceso).

La presente invención describe además un método de provocar la replicación in vitro de células T restringidas por MHC de clase I que son específicas para un epítopo de cáncer que comprende contactar una población de células que comprende células T restringidas por MHC de clase I con un polipéptido de la presente invención en condiciones en las que el polipéptido o el análogo se presentan a las células T en la población, o con un producto o célula de la presente invención. La presente invención incluye la utilización de una célula T de la presente invención (incluyendo una célula T replicada por el método anterior) in vitro o que se puede utilizar adecuadamente in vivo para matar una célula que presenta el polinucleótido (epítopo) de la presente invención. Dicha célula es habitualmente una célula cancerígena, pero en una realización es una célula T (habitualmente una célula T activada que expresa MUC1). De este modo, la presente invención da a conocer una célula T de la presente invención, o una célula que ha sido replicada en el método de la presente invención para la utilización en un método de tratamiento del cuerpo animal o humano mediante terapia. En particular, para utilizar en la preparación de una composición farmacéutica para prevenir o tratar el cáncer o una enfermedad causada por una respuesta inmune, tal como un trastorno inflamatorio, enfermedad autoinmune, rechazo en el trasplante de órganos o injertos frente a la enfermedad huésped.

Tal y como se ha mencionado anteriormente, la presente invención también da a conocer un método de identificación de una respuesta de células T restringidas por MHC de clase I que se basa en la determinación de si las células T restringidas por MHC de clase I de un huésped reconocen un polipéptido o análogo de la presente invención (cualquiera de ellos puede estar proporcionado por un polinucleótido de la presente invención), o un producto o célula de la presente invención. En el método, el polipéptido o el análogo pueden estar en forma de la composición de la presente invención. En una realización, la determinación de si las células T reconocen el polipéptido o análogo se realiza detectando un cambio en el estado de las células T en presencia del polipéptido o análogo o determinando si las células T se unen al polipéptido o al análogo. El cambio en el estado está provocado generalmente por la actividad funcional específica de antígeno de la célula T después de que el receptor de célula T se una al polipéptido o al análogo. Generalmente, cuando se une el receptor de célula T, el polipéptido o el análogo está unido a una molécula de MHC de clase I, la cual está habitualmente presente en la superficie de una APC.

El cambio en el estado de la célula T puede ser el inicio de o el incremento en la expresión de una sustancia en las células T y/o la secreción de una sustancia de la célula T, tal como una citocina (por ejemplo, IFN-\gamma, IL-2 o TNF-\alpha). La determinación de la expresión o secreción de IFN-\gamma es particularmente preferente. La sustancia se puede detectar habitualmente permitiendo la unión a un agente de unión específica y, a continuación, midiendo la presencia del agente de unión específica/sustancia compleja. El agente de unión específica es habitualmente un anticuerpo, tal como anticuerpos policlonales o monoclonales. Los anticuerpos para citocinas están disponibles comercialmente, o se pueden fabricar utilizando técnicas estándar.

Habitualmente, el agente de unión específica está inmovilizado en un soporte sólido (y de este modo el método puede basarse en el ensayo ELISPOT para detectar la secreción de la sustancia). Después de dejar que la sustancia se una, el soporte sólido se puede lavar opcionalmente para eliminar el material que no está unido específicamente al agente. El agente/sustancia compleja se puede detectar utilizando un segundo agente de unión que se unirá al complejo. Habitualmente, el segundo agente se une a la sustancia en un sitio que es diferente del sitio en el que se une el primer agente. El segundo agente es preferentemente un anticuerpo y está marcado directa o indirectamente mediante una marca detectable.

De este modo, el segundo agente se puede detectar por un tercer agente que está habitualmente marcado directa o indirectamente por una marca detectable. Por ejemplo, el segundo agente puede comprender un grupo biotina, permitiendo la detección por un tercer agente que comprende un grupo estreptavidina y habitualmente fosfatasa alcalina como marca detectable.

Alternativamente, el cambio en el estado de la célula T que se puede medir puede ser el incremento en la captación de sustancias por la célula T, tal como la captación de timidina. El cambio en el estado puede ser un incremento en el tamaño de las células T, o la proliferación de las células T, o un cambio de los marcadores de la superficie celular en la célula T.

El cambio en el estado puede ser la eliminación (por la célula T) de una célula que presenta a la célula T el polipéptido, el análogo o el producto de la presente invención (por ejemplo, la eliminación de la célula de la presente invención). De este modo, la determinación de si las células T reconocen el péptido se puede llevar a cabo utilizando un ensayo con CTL.

En una realización, las células T que están en contacto en el método se obtienen del huésped en una muestra de sangre, aunque se pueden utilizar otros tipos de muestras que contienen células T. La muestra se puede añadir directamente al ensayo o se puede procesar primero. Habitualmente, el procesado puede comprender la dilución de la muestra, por ejemplo con agua o tampón. Habitualmente, la muestra se diluye de 1,5 a 100 veces, por ejemplo de 2 a 50 ó 5 a 10 veces.

El procesado puede comprender la separación de componentes de la muestra. Habitualmente, las células mononucleares (MCs) se separan de la muestra. Las MCs comprenderán las células T y APCs. De este modo, en el método, las APCs presentes en las MCs separadas pueden presentar el péptido a las células T. En otra realización, sólo las células T, (en una realización sólo células T CD8), se pueden purificar de la muestra. Las células PBMC, MC y T se pueden separar de la muestra utilizando técnicas conocidas en el sector.

Las células T utilizadas en el ensayo pueden estar en forma de muestras no procesadas o diluidas, o son células T recientemente aisladas (tales como en forma de MCs o PBMCs recientemente aisladas) que se utilizan directamente ex vivo, es decir, no se cultivan antes de ser utilizadas en el método. Sin embargo, más habitualmente, las células T se cultivan antes de la utilización, por ejemplo, en presencia del polipéptido o el análogo de la presente invención y, generalmente, también citoquinas que fomentan el crecimiento exógeno. Durante el cultivo, el polipéptido o el análogo están habitualmente presentes en la superficie de las APCs, tales como la APC utilizada en el método. El precultivo de las células T puede conducir a un incremento en la sensibilidad del método.

La APC que se utiliza habitualmente en el método es del mismo huésped que la célula T o de un huésped diferente. La APC puede ser una APC no profesional, pero habitualmente es una APC profesional, tal como cualquiera de las APCs mencionadas en la presente invención. La APC puede ser una APC artificial. La APC es una célula que es capaz de presentar el péptido a una célula T. Está habitualmente separada de la misma muestra que la célula T y está habitualmente copurificada con la célula T. De este modo, la APC puede estar presente en MCs o PBMCs. La APC es habitualmente una célula o un cultivo celular ex vivo recientemente aislado. Puede estar en forma de una línea celular, tal como una línea celular a corto plazo o inmortalizada. La APC puede expresar en su superficie moléculas de MHC de clase I vacías.

En una realización, el método identifica una respuesta de células T restringidas por MHC de clase I para cualquiera de las combinaciones de un polipéptido de la presente invención descrito anteriormente en relación con la composición de la presente invención. De este modo, en el método, las células T se pueden situar en un ensayo con la composición de la presente invención (que comprende la combinación del polipéptido o el análogo a analizar). Alternativamente, las células T se pueden dividir y situar en ensayos separados, cada uno de los cuales contiene un grupo de polipéptidos o análogos dentro de la combinación.

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En una realización, se añade un polipéptido per se directamente a un ensayo que comprende células T y APCs. Tal y como se ha descrito anteriormente, las células T y APCs en dicho ensayo podrían estar en forma de MCs. En una realización, el polipéptido se proporciona a APC en ausencia de la célula T. A continuación, la APC se proporciona a la célula T, habitualmente después de dejar presentar el polipéptido o el análogo en su superficie. El polipéptido se puede captar en el interior de la APC y presentarse o simplemente captarse en la superficie sin entrar en el interior de la APC.

La duración durante la que el polipéptido está en contacto con las células T variarán dependiendo del método utilizado para determinar el reconocimiento del péptido. Habitualmente, la concentración de las células T utilizadas es 10^{3}/ml a 10^{9}/ml, preferentemente 10^{5}/ml a 10^{7}/ml. En el caso en el que el péptido se añade directamente al ensayo, su concentración está habitualmente entre 0,1 y 1000 \mug/ml, preferentemente entre 10 y 100 \mug/ml.

Habitualmente, la longitud de tiempo durante el que las células T están incubadas con el polipéptido o el análogo está entre 4 y 24 horas, preferentemente entre 6 y 16 horas.

La determinación del reconocimiento del polipéptido por las células T se puede realizar midiendo la unión del polipéptido o el análogo a las células T. Habitualmente, las células que se unen al polipéptido se pueden clasificar en base a esta unión, por ejemplo, utilizando una máquina FACS. La presencia de células T que reconocen el polipéptido se estimará que tiene lugar si la frecuencia de células clasificadas utilizando el polipéptido está por encima de un valor "control" (es decir por encima de la frecuencia de las células T nativas antígeno que reconocen el polipéptido). La frecuencia de células T que actúan como antígeno durante el estado de una enfermedad puede ser de hasta un 2,5% del total de células T CD8.

El polipéptido, el polinucleótido, la composición, el producto o la célula de la presente invención se pueden utilizar para detectar una respuesta de células T restringidas por MHC de clase I a un polipéptido (epítopo) de la presente invención in vitro (tal como en una muestra de un huésped) o son adecuados para utilizarse in vivo. Esto puede realizarse, por ejemplo, mediante la utilización del método descrito anteriormente. La presencia de una respuesta indica generalmente la presencia de una célula que está expresando MUC1, tal como una célula cancerígena o una célula T activada. De este modo, la detección de la respuesta se puede utilizar para diagnosticar el cáncer. La medición del nivel de la respuesta se puede utilizar para monitorizar la gravedad del cáncer (es decir, el número de células cancerígenas presentes en el huésped), indicando una respuesta mayor un cáncer más grave.

En el método in vitro de diagnosis de la presente invención, la presencia o ausencia de la respuesta de células T restringidas por MHC de clase I se determina habitualmente mediante el método de identificación de una respuesta de células T restringidas por MHC de clase I descrita anteriormente.

Los anticuerpos mencionados en la presente invención se pueden producir mediante el desarrollo de anticuerpos en un animal huésped. Dichos anticuerpos serán específicos al péptido o a las sustancias mencionadas anteriormente que se unen a los anticuerpos. A continuación, al péptido o a las sustancias se les denomina "inmunógeno". Los métodos de producción de anticuerpos monoclonales y policlonales son bien conocidos. Un método para producir un anticuerpo policlonal comprende la inmunización de un animal huésped adecuado, por ejemplo un animal experimental, con el inmunógeno y el aislamiento de inmunoglobulinas del suero. Por lo tanto, se puede inocular el animal con el inmunógeno, extraer posteriormente la sangre del animal y la fracción IgG purificada. Un método para producir un anticuerpo monoclonal comprende la inmortalización de células que producen el anticuerpo deseado. Las células de hibridoma se pueden producir mediante la fusión de células del bazo de un animal experimental inoculado con células tumorales, por ejemplo tal como se describe en Köhler y Milstein (Nature 256 (1975), 495-497).

Una célula inmortalizada que produce el anticuerpo deseado se puede seleccionar mediante un procedimiento convencional. Los hibridomas pueden desarrollarse en un cultivo o inyectarse intraperitonealmente para la formación de fluido ascitis o en la corriente sanguínea de un huésped alogénico o un huésped inmunocomprometido. El anticuerpo humano se puede preparar mediante una inmunización in vitro de linfocitos humanos, seguido de la transformación de los linfocitos con virus Epstein-Barr.

Para la producción de anticuerpos policlonales y monoclonales, el animal experimental adecuado es una cabra, un conejo, una rata o un ratón. Si se desea, el inmunógeno se puede administrar como un conjugado en el que el inmunógeno se acopla, por ejemplo mediante una cadena lateral de uno de los residuos de aminoácidos, a un portador adecuado. La molécula portadora es habitualmente un portador fisiológicamente aceptable. El anticuerpo obtenido se puede aislar y, si se desea, purificar.

Administración

Cualquiera de los polipéptidos o polinucleótidos descritos anteriormente en cualquier forma o asociados con cualquier otro agente descrito anteriormente se incluye a continuación en el denominado "agente de vacuna". Una cantidad no tóxica eficaz de dicho agente de vacunación se puede administrar a un paciente humano o no humano en necesidad del mismo. La condición de un paciente que sufre de un cáncer se puede mejorar mediante la administración de dicho agente de vacunación. El agente de vacunación se puede administrar profilácticamente a un individuo que no tiene cáncer con el fin de evitar el desarrollo del cáncer en el individuo.

De este modo, la presente invención da a conocer usos para la preparación del agente de vacunación para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia. La presente invención da a conocer la utilización del agente de vacunación en la fabricación de un medicamento para la vacunación contra el cáncer. De este modo, la presente invención da a conocer usos para la preparación de una composición de vacuna para vacunar a un individuo.

El agente de vacunación se administra habitualmente mediante cualquier técnica estándar utilizada para la administración de vacunas, tales como mediante inyección.

Habitualmente, después de la administración inicial del agente de vacunación, se puede administrar un reforzador del mismo o un agente de vacunación diferente de la presente invención. En una realización, se realizan 1, 2, 3 o más administraciones separadas al sujeto, cada una de las cuales separadas por, como mínimo, 12 horas, 1 día, 2 días, 7 días, 14 días, 1 mes o más.

El agente de vacunación puede estar en forma de una composición farmacéutica que comprende el agente de vacunación y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. Entre los portadores y diluyentes adecuados se incluyen soluciones salinas isotónicas, por ejemplo solución salina tamponada de fosfato. Habitualmente, la composición se formula para administración parenteral, intravenosa, intramuscular, subcutánea, transdérmica, intradérmica, oral, intranasal, intravaginal o intrarrectal.

La dosis de vacunación se puede determinar según diversos parámetros, especialmente según la sustancia utilizada; la edad; el peso y la condición del paciente a tratar; la ruta de administración; y el régimen requerido. Un profesional sanitario será capaz de determinar la ruta de administración requerida y la dosis para cualquier paciente en particular. Sin embargo, una dosis adecuada puede ser de 10 \mug a 10 g, por ejemplo de 100 \mug a 1 g del agente de vacunación. Estos valores pueden representar la cantidad total administrada en el régimen de tratamiento completo o puede representar cada administración separada en el régimen.

En el caso de agentes de vacunación que son agentes de transfección de polinucleótidos también se pueden administrar para aumentar la captación de los polinucleótidos por las células. Entre los ejemplos de agentes de transfección adecuados se incluyen agentes catiónicos (por ejemplo, fosfato cálcico y DEAE-dextrano) y lipofectantes (por ejemplo, lipofectam^{TM} y transfectam^{TM}). Cuando el agente de vacunación es un polinucleótido que está en forma de un vector viral, la cantidad de virus administrada está en el intervalo de 10^{4} a 10^{12} pfu, preferentemente de 10^{7} a 10^{10} pfu (por ejemplo, para vectores adenovirales), más preferentemente aproximadamente 10^{8} pfu para vectores de herpes virales. También se puede utilizar un vector de virus pox (por ejemplo, virus vaccinia), habitualmente en cualquiera de las dosis anteriores. Cuando se inyecta, se administran habitualmente 1-2 ml de virus en un portador o diluyente adecuados farmacéuticamente aceptables.

Éstas y otras realizaciones se describen o son obvias por la descripción y los ejemplos de la presente invención y están comprendidas en los mismos. La información adicional referida a cualquiera de los métodos, usos y compuestos a utilizar según la presente invención se puede recuperar de las bibliotecas públicas, utilizando por ejemplo dispositivos electrónicos. Por ejemplo, se puede utilizar la base de datos pública "Medline" que está disponible en Internet, por ejemplo, en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html. Existen bases de datos y direcciones, tales como http://www.ncbi.nlm.nih.gov/, http://www.infobiogen/fr/, http://www.fmi.ch/biology/research_tools.html, http://www.tigr.org/ conocidas por los técnicos en la materia y que se pueden obtener también utilizando, por ejemplo, http://www.lycos.com. En Berks, TIBTECH 12 (1994), 352-364, se ofrece una visión general de información de patentes en biotecnología y de fuentes relevantes de la información de patentes útiles para la investigación retrospectiva y el conocimiento actual.

La presente invención se ha descrito de forma ilustrativa y debe entenderse que la terminología que se ha utilizado pretende estar en la naturaleza de las palabras de la descripción en lugar de ser una limitación. Obviamente, son posibles muchas modificaciones y variaciones de la presente invención a la luz de las enseñanzas anteriores. Por lo tanto, debe entenderse que dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas, la presente invención se puede realizar de manera distinta a la descrita específicamente. Por consiguiente, los técnicos en la materia reconocerán o serán capaces de establecer sin utilizar nada más que experimentación habitual, muchos equivalentes de las realizaciones específicas de la presente invención descritas específicamente en la presente invención. Se pretende que dichos equivalentes estén comprendidos en el alcance de las siguientes reivindicaciones.

Las figuras 1 a 7 muestran datos de unión por competición de polipéptidos cuyas secuencias están dentro de la secuencia de MUC-1 humano. Los experimentos se realizaron según el método descrito en van der Burg y otros (1995, Hum. Immunol. 44:189-198). Los polipéptidos descritos como "pp x" corresponden a la SEC ID No. Por ejemplo, pp 27 corresponde a la SEC ID No. 27. En algunas figuras, se muestran las curvas de unión por competición de algunas secuencias de polipéptidos negativas (por lo tanto no reivindicadas) para demostrar la especificidad del ensayo de unión por competición.

Las figuras 8, 9 y 10 muestran los datos de ELISpot de tres experimentos realizados con PBMC, de pacientes inmunizados con VV-MUC-1-IL2, expuestos a polipéptidos de la presente invención. Las manchas por cada 10^{6} de PBMC indican el número de linfocitos T (CTL) CD8+, por millón de PBMC, que son específicos para ese polipéptido. Los histogramas en negro representan las respuestas de ELISpot de PBMC dibujados del paciente, 1 semana después de la inyección de VV-MUC-1-IL2 (figura 8), 4 semanas después de la inyección (figura 9) o 4 semanas después de la segunda inyección (figura 10). Las barras en blanco corresponden a la respuesta de ELISpot de PBMC de paciente obtenida antes de la administración con VV-MUC-1 (figura 8) 5 meses después de la inyección (figura 9) o antes de la segunda inyección (figura 10).

La figura 11 muestra que los péptidos de unión HLA-A*0201 derivados de MUC1 inducen respuestas de CTL citotóxicos específicas de péptido. Se inmunizaron ratones A2K^{b} dos veces con 100 \mug de péptido de MUC 1 en IFA y 140 \mug de péptido Th en el día -28 y el día -14. En el día 0 se reestimularon in vitro suspensiones de esplenocitos de células individuales durante una semana con linfoblastos obtenidos de LPS singeneica cargados con péptido y se analizó la citotoxicidad de Jurkat-A*0201K^{b} cargada con péptido. Se inmunizaron grupos de ratones A2K^{b} con los péptidos de MUC-1, MUC1^{264-272} (FLSFHISNL), MUC1^{460-468} (SLSYTNPAV), MUC1^{13-21} (LLLTVLTVV), MUC1^{167-175} (ALGSTAPPV) o MUC1^{79-87} (TLAPATEPA). Los cultivos en volumen de CTL se analizaron contra células Jurkat-A*0201K^{b} cargadas con el péptido cognado (triángulos rellenos) o el péptido de control de la matriz del virus de la gripe irrelevante (círculos en blanco). Se muestran tres gráficos representativos para cada péptido. El eje vertical muestra el % de lisis específica.

La figura 12 muestra la secuencia de aminoácidos de una versión de la proteína de MUC-1.

Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar adicionalmente la presente invención.

Estos ejemplos muestran:

1) La identificación de polipéptidos de MUC-1 que se unen específicamente a moléculas del complejo principal de histocompatibilidad I humano (MHC-I); y

2) La utilidad de estos polipéptidos en un bioensayo funcional, conocido como ensayo ELISpot (Inmunospot unida a enzima).

Ejemplo 1 Ensayo de unión por competición

Introducción: Los fragmentos de polipéptido de 8-13 aminoácidos de longitud, de proteínas producidas en el interior de una célula nucleada de vertebrado se asocia con proteínas celulares recientemente formadas del complejo MHC-I. El complejo de proteína de MHC-I y el fragmento del polipéptido se asocian adicionalmente con una proteína conocida como microglobulina Beta-2. A continuación, este complejo trimolecular se transporta a la superficie celular, se ancla a la membrana celular y se expone al medio extracelular. Los linfocitos derivados del timo o linfocitos T de la categoría CD8 tienen receptores de "antígeno" específicos en su superficie celular, que reconocen el complejo MHC-I-Beta-2-microglobulina-péptido. Las células T CD8+ individuales o la progenie clonal de un precursor de célula T individual expresan en sus receptores de antígeno de la superficie celular que reconocen solamente uno (o muy pocos) de dichos polipéptidos en el contexto del complejo MHC-I-Beta-2-microglobulina-péptido. Esto es conocido como "Especificidad de Antígeno" de los linfocitos T. Si el polipéptido deriva de una proteína normal o autoproteína, los linfocitos T no se "estimulan" debido a la eliminación de las células T auto-específicas del repertorio inmune o debido a la regulación negativa de respuestas inmunes auto-específicas. Sin embargo, si el polipéptido es de un organismo patogénico, tal como un virus, entonces las células T específicas se activan para proliferar y volverse citotóxicas, de manera que las "células efectoras citotóxicas" CD8 o CTL reconocen específicamente la célula infectada y eliminan esa célula en un esfuerzo por contener la condición patogénica. Los tumores también pueden producir moléculas de proteínas "específicas de tumor" o modificaciones de proteínas celulares. En esos casos, las células T CD8 específicas pueden reconocer una célula tumoral como patogénica y eliminar estas células mediante el mismo mecanismo, tal como se utiliza para eliminar células infectadas de virus. Frecuentemente, la modificación específica de tumor de una proteína es meramente cuantitativa en la que se sobreproduce una proteína en células tumorales. Se ha observado que dichas proteínas también pueden ser reconocidas por Linfocitos T Citotóxicos (CTL). Por ejemplo, véase Disis y otros, Cancer Research, 54: 1071-1076 (1994); o Barnd y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. Usa, 86: 7159-7163 (1989).

Se ha observado en numerosas publicaciones que la unión de dichos polipéptidos a moléculas de MHC-I depende de ciertos "motivos" de aminoácidos en las posiciones definidas en los polipéptidos. Por ejemplo, los aminoácidos Leucina en la posición 2 y Valina en la posición 9 de un polipéptido de 9 aminoácidos darán lugar a la unión de ese polipéptido a HLA-A2. Para una revisión, véase Rammensee y otros, Immunogenetics, 41: 178-228 (1995). El conocimiento de las posiciones de aminoácidos requeridos se obtuvo mediante la extracción de polipéptidos de moléculas de MHC-I y su secuenciación. Además de los residuos de anclaje, existen varios otros aminoácidos flanqueantes "preferentes", de manera que se puede dar al polipéptido un ranking de posibilidades de unirse a una molécula de MHC-I particular, dependiendo de su secuencia. Dicho ranking de uniones de polipéptidos predichas se puede determinar mediante uno de los diferentes programas informáticos. Según la presente invención, se ha consultado el programa "BIMAS" (BioInformatics & Molecular Analysis Section), "HLA POLYPEPTIDE Binding Predictions" (http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/) para predicciones de qué polipéptidos de la secuencia de MUC-1 humana son probables que se unan a varios tipos de HLA. Esto, por supuesto, es sólo una predicción por ordenador y la unión debe establecerse con un ensayo bioquímico. A continuación, los polipéptidos seleccionados por el ensayo de unión se deben ensayar en un ensayo biológico.

Se produjeron (NeoSystem, Estrasburgo, Francia) aproximadamente 200 de los polipéptidos de MUC-1 del ranking principal, según se predice mediante el programa BIMAS, que se predijo que se unían a HLA-A1, A2, A3, A11, A24, B7 y B8, y se cribaron por la unión de HLA mediante un ensayo de unión competitivo. Este ensayo se describe en van der Burg y otros, Human Immunology, 44:189-198 (1995). Brevemente, las líneas celulares de linfocitos B transformados por EBV, de un tipo de HLA conocida, se exponen a un polipéptido conocido por unirse a la del tipo HLA. La unión del polipéptido se determina mediante citometría de flujo utilizando un Clasificador Celular Activado por Fluorescencia. La unión se puede prever con este aparato ya que el polipéptido conocido para unirse se marca con una molécula fluorescente. De este modo, las células que se unen al polipéptido se vuelven fluorescentes. Cada polipéptido a cribar por la unión se mezcla junto con el polipéptido fluorescente de referencia, que está a una concentración constante de 150 nM. El polipéptido de prueba se añade a varias concentraciones y la mezcla se expone a las mismas células. Un polipéptido de prueba se considera "positivo" si la unión del polipéptido de referencia se inhibe en un 50% a 20 \mug/ml o menos del polipéptido de prueba. En las figuras 1-7 se muestran datos para la unión competitiva de los polipéptidos estimados, mediante este ensayo, que son positivos para la unión a HLA- A2, B7, A3, A11, A24, A1 y B8, respectivamente. En cada caso, la unión se compara con un polipéptido de control negativo, conocido por no unirse a la de tipo HLA y un polipéptido de control positivo, conocido por unirse a la de tipo HLA. Por ejemplo, el control positivo "Flu" es un polipéptido con la secuencia GILGFVFTL de la proteína de matriz del virus de la gripe (Scheiben-bogen y otros, Internacional Journal of Cancer, 71: 932-936 (1997)).

Materiales

Las líneas de células EBV-B se derivaron mediante el cultivo de Células Mononucleares de Sangre Periférica (PBMC) en el sobrenadante de cultivo filtrado que se había utilizado para desarrollar células de la línea de mono tití B-958. Estas células producen el Virus Epstein Barr. Las PBMC se cultivan durante 2-3 días en presencia de 1 \mug/ml de Ciclosporina A (para inhibir la reactividad de las células T con el virus) en el sobrenadante de B-958, a continuación se cultiva en medio de cultivo nuevo. Se utilizaron líneas de células B humanas del tipo HLA transformadas con EBV para todos los tipos de HLA de las pruebas que se describen en la Tabla 2.

El medio de cultivo era Medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) + 5x10^{-5} M de BetaMercaptoetanol (con la adición de 25 mM de tampón HEPES para la etapa de separación del polipéptido y el lavado celular) más un 2% ó 10% de Suero Bovino Fetal. Todas las pruebas se realizaron en placas de microtitulación de 96 pocillos con base en V (microplaca PS). La \beta-2 microglobulina se adquirió de Sigma. El tampón para la separación del polipéptido utilizado fue:

13,76 g de ácido cítrico (MMUC-1 210,14 g/l)

5,43 g de Na_{2}HPO_{4}·2H_{2}O (MMUC-1 177,9 g/l)

en 500 ml de H_{2}O destilada.

El pH se ajustó inicialmente a pH 4,0, pero a continuación el pH se reajustó dependiendo de qué tipo de HLA se prueba (véase Tabla 2). La Solución Salina Tamponada de Fosfato de Dulbecco (PBS) se adquirió como polvo de Sigma. Los polipéptidos de referencia marcados con fluorescente en el residuo de cisteína (Tabla 2) se prepararon según Van de Burg y otros, 1995, Hum. Immunol., 44, 189-198. Los polipéptidos de prueba se adquirieron de NeoSystem, Estrasburgo o se prepararon según métodos estándar. Los polipéptidos de control positivo se adquirieron de NeoSystem (Estrasburgo, Francia). Los detalles de los polipéptidos utilizados se describen en la Tabla 2.

Los plásticos, a menos que se indique lo contrario, se adquirieron de Coming.

Métodos

Las células se cultivaron en matraces Coming T175 en 20 ml de medio de cultivo (10% de FBS). La noche previa al ensayo, las células se resuspendieron y se añadieron 10 ml de medio nuevo. El día de la prueba, las células se resuspendieron, se contaron, se agruparon mediante centrifugación y se resuspendieron en 5 ml de medio completo con 10% de FBS. Se distribuyeron las células en una placa de 6 pocillos, 10^{5} células por pocillo en 5 ml de medio de cultivo. A continuación, las células se cultivaron durante 4 horas a 37ºC, 5% de CO_{2}. Durante ese tiempo, los polipéptidos se prepararon mediante dilución en 600 \mug/ml en PBS. Las diluciones dobles en serie de 600-4,68 (para tener una dilución final de 100 a 0,78 \mug/ml en la placa de prueba) se prepararon en primer lugar en una placa separada de 96 pocillos para la "dilución de polipéptidos".

La placa de prueba (96 pocillos, base en V) se preparó según se indica:

- control negativo (sin polipéptido): 50 \mul de PBS

- control positivo (sólo polipéptido de referencia): 25 \mul de PBS + 25 \mul de Fl-polipéptido de referencia

- pruebas: 25 \mul de Fl-polipéptido de referencia a 150 nM (final), a continuación se añadieron 25 \mul de polipéptidos de prueba (incluyendo polipéptidos de control positivos y negativos) en sus varias diluciones. Las placas se colocaron a continuación en un frigorífico en la oscuridad.

Después de 4 horas de incubación de células, se preparó lo siguiente sobre hielo:

- Dos tubos de prueba de base cónica de 15 ml que contienen medio de cultivo con un 2% de FBS.

- Un tubo de prueba de base cónica de 15 ml que contiene 10 ml de medio de cultivo con un 2% de FBS y que incluye 1,5 \mug/ml de \beta-2 microglobulina.

- Un tubo de prueba de base cónica de 15 ml que contiene 2 ml de tampón ácido de "separación de péptido" al pH para el tipo de HLA particular según se indica en la Tabla 2.

Las células en los 5 ml de medio de cultivo en la placa de 6 pocillos se resuspendieron y se transfirieron a un tubo de prueba de base cónica de 15 ml y, a continuación, se centrifugaron durante 5 minutos a 1500 rpm (500 g). Se resuspendieron las células en PBS y se centrifugaron una segunda vez (500 g). El sobrenadante se extrajo y se separaron 2 ml de tampón mientras estaba en hielo. Las células se resuspendieron mediante pipeteo suave los primeros 30 segundos de este periodo de 2 minutos. Después de 2 minutos, se añadieron 14 ml de medio de cultivo con un 2% de FBS. Las células se mezclaron invirtiendo el tubo dos veces, a continuación se centrifugaron a 2000 rpm (800 g) durante 3 minutos a 4ºC. Se extrajo el sobrenadante y las células se resuspendieron en 14 ml de medio de cultivo frío con un 2% de FBS y la centrifugación se repitió (3 minutos a 800 g). El sobrenadante se extrajo y las células se resuspendieron suavemente en 14 ml de medio de cultivo, 2% de FBS y 1,5 \mug/ml de \beta-2 microglobulina. Se añadieron cien \mul de células de esta suspensión a cada pocillo de la placa de 96 pocillos, que ya contenía los polipéptidos. La placa se envolvió en Saran y se dejó 24 horas a 4ºC. El siguiente día, las placas se centrifugaron a 1000 rpm (200 g), se extrajo el sobrenadante y se resuspendieron las células en 100 \mul de PBS que contenía 0,1% de Albúmina de Suero Bovino (BSA) y un 0,02% de azida sódica y las células se agruparon mediante centrifugación a 200 g. Esta etapa se repitió una vez más, a continuación las células se resuspendieron en un 1% de paraformaldehído y se analizaron por fluorescencia mediante una FACScan (Becton Dickenson, Mountainview, California).

La intensidad de fluorescencia media (MFI) de células con el polipéptido de referencia fluorescente pero sin polipéptido competidor (control positivo) se tomó como un 0% de inhibición. De manera similar, la MFI de células sin el polipéptido de referencia fluorescente (control negativo) se tomó como igual a un 100% de inhibición. El porcentaje de inhibición se calculó como:

% de inhibición = (1 - \frac{\text{(MFI con polipéptido de prueba) - (MFI control negativo)}}{\text{(MFI con polipéptido de prueba) - (MFI control positivo)}} x 100

La unión de afinidad elevada se tomó como el 50% de inhibición a una concentración de polipéptido \leq 10 \muM (\sim10 \mug/ml).

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 2 Polipéptidos de referencia y de control positivo utilizados en el ensayo de unión por competición

1

Resultados

La competición por unirse a los tipos de HLA seleccionados entre diluciones en serie de péptidos seleccionados y los péptidos de referencia (tal como se describen en la Tabla 2) se muestra en las figuras 1-7. La unión de los polipéptidos, de la secuencia de MUC-1 humana, a HLA- A2, B7, A3, A11, A24, A1 y B8 se muestra en las figuras 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7, respectivamente. Las secuencias de unión de alta afinidad estaban frecuentemente, pero no siempre, entre las 20 secuencias principales de polipéptidos de unión previstas tal como se predijo mediante el programa BIMAS HLA Peptide Motif (tal como se ha descrito anteriormente).

Ejemplo 2 ELISpot

La ELISpot es una técnica que permite la identificación de reconocedores de células T específicos de antígeno (en este caso, específico de MUC-1) mediante la detección de la producción inducida por antígeno de citocinas (IFN\gamma, TNF\alpha, IL-4, etc...) tras una estimulación antigénica in vitro. Más particularmente, ELISpot permite la determinación del número de linfocitos T específicos de antígeno en una población de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) (Scheibenbogen y otros, 1997, Int. J. Cancer 71-1). En este caso, se examinó la producción de IFN\gamma producida por células T CD8+ (CTL) en respuestas a los polipéptidos según se presenta mediante moléculas de HLA autólogas.

Brevemente, en una ELISpot, las citocinas se capturan entre dos anticuerpos específicos. El primer anticuerpo, específico para IFN\gamma humana, se adsorbe sobre una membrana de nitrocelulosa. Los linfocitos de las muestras de sangre humana se añaden a los pocillos de microtitulación que contienen el anticuerpo unido. El antígeno, en forma de polipéptidos, también se añade a los pocillos. Lo principal es que los polipéptidos se unirán a las moléculas de HLA de la superficie celular (junto con \beta-2 microglobulina). Las células T específicas de polipéptido reconocerán el complejo del polipéptido:HLA:\beta-2 microglobulina. Tras el reconocimiento del antígeno, las células T se vuelven "activas" para producir citocinas, tales como IFN\gamma. A continuación, la IFN\gamma secretada es capturada por el anticuerpo que está unido a la nitrocelulosa. Las células se lavan dejando atrás las áreas de IFN\gamma secretada. Estas áreas son reveladas por el segundo anticuerpo (acoplado a biotina) y, a continuación, mediante un conjugado de estreptavidina-alcalina fosfatasa. La hidrólisis sustrato-enzima por parte de la enzima conduce a la aparición de una mancha. De este modo, cada mancha representa la "huella dactilar" de una célula que produce citocinas. Las pruebas descritas a continuación se realizaron utilizando un equipo disponible comercialmente (MABTECH, Nacka, Suecia).

Materiales Células mononucleares de sangre periférica

En las figuras 8 y 9 se obtuvieron PBMC (Células Mononucleares de Sangre Periférica) de paciente a partir de pacientes con cáncer de mama que habían participado en la Fase I de pruebas clínicas llevadas a cabo en Institut Curie, París. En la figura 10, las PBMC de paciente se obtuvieron de pacientes con cáncer de próstata que habían participado en una prueba similar en Fase I de inmunoterapia en Los Ángeles, Estados Unidos. En estas pruebas, los pacientes se inmunizaron con una construcción de virus Vaccinia que expresa, tras la infección, MUC1 e IL2. El objetivo era generar una respuesta inmune a MUC-1 que era un antígeno sobreexpresado en ambos tipos de cáncer. Las PBMC se aislaron de sangre periférica mediante centrifugación de densidad usando Hypaque-Ficol y las células mononucleares resultantes se congelaron en alícuotas de 2 a 4 x 10^{6} células en un volumen de 1 ml de medio de cultivo que contenía un 10% de DMSO y se almacenó en fase vapor de nitrógeno líquido hasta su utilización.

TABLA 3

2

Caracterización de tejido

A las PBMC de paciente con cáncer de mama se caracterizó la HLA mediante serología y la PCR en el Etablissement de Transfusion Sanguine, Estrasburgo. A las PBMC de paciente con cáncer de próstata se caracterizó la HLA mediante PCR en Transgene utilizando el equipo de caracterización de HLA "One Lambda" (One Lambda, Canoga Park, CA, Estados Unidos).

Polipéptidos

Los polipéptidos se produjeron en NeoSytem (Estrasburgo, Francia).

ELISPOT

El equipo de ELISPOT se obtuvo de y se utilizó según las instrucciones de MABTECH (Nacka, Suecia). La técnica se llevó a cabo según las instrucciones del fabricante. Brevemente, se cultivaron PBMC en placas de microtitulación de 96 pocillos durante 48 horas en presencia de polipéptidos de prueba o de control a 5 \mug/ml e IL-2 recombinante a 30 unidades/ml. Las manchas de IFN\gamma se revelaron con un reactivo segundo anticuerpo, también específico para la Interferón Gamma Humana, según las instrucciones del fabricante.

Resultados

Los resultados de los tres experimentos se muestran en las figuras 8, 9 y 10. Se recogieron PBMC de paciente a partir de nitrógeno líquido y se descongelaron el día anterior al ensayo ELISpot. Los controles y los polipéptidos (numerados según su SEC ID No.) se añadieron tal y como se ha descrito anteriormente. Se utilizaron pocillos por duplicado y triplicado que contenían 1-2 x 10^{5} PBMC. El número de manchas se determinó y se representa como el número de manchas por 10^{6} células.

Estos datos mostrados en la figura 8 muestran que las PBMC del paciente #4 (que es HLA-A2) son capaces de responder al polipéptido de SEC ID No: 4 de manera que las PBMC de este paciente se estimulan para producir IFN\gamma en respuesta a la presencia de este polipéptido, pero no en presencia del polipéptido de control negativo o polipéptido de SEC ID No. 3. La respuesta se observa después de la vacunación (histogramas negros), pero no antes (histogramas blancos). En la figura 9 se muestran los resultados de un experimento en los que las PBMC del paciente #5 (HLA-A2 y B7) se estimulan para producir ELISpots de IFN\gamma tras la exposición al polipéptido 4 (SEC ID No. 4) y el polipéptido 10 (SEC ID No. 10), pero no al control negativo o a los polipéptidos 3 ó 7. No habían PBMC disponibles antes de la vacunación, pero la respuesta de las células T de los pacientes, según se determina mediante un ensayo de proliferación de células T CD4+ in vitro, a un polipéptido MUC-1 más largo (24 aminoácidos) sólo era discernible en las semanas siguientes a la vacunación, pero era indetectable 5 meses después. La naturaleza transitoria de las respuestas de las células T se verifica en la figura 9 en que sólo las PBMC recogidas 28 días después de la vacunación (histogramas negros) eran capaces de producir ELISpots sobre el fondo, mientras que las PBMC recogidas 5 meses después de la inyección no produjeron respuesta de ELISpot a estos péptidos (histogramas blancos).

Estos ejemplos demuestran el valor de la presente invención en el diagnóstico de una respuesta inmune de células T CD8+ a MUC-1. La presente invención también se podría utilizar en otras aplicaciones de diagnóstico, tales como análisis de Tetrámeros en que el MHC-I, beta-2-microglobulina y polipéptidos solubles de la presente invención se complejan junto con un reactivo fluorescente. A continuación, el complejo se utiliza para marcar de manera fluorescente células T con receptor antígeno específico para ese polipéptido. La cuantificación de las células T específicas se realiza con un citómetro de flujo activado con fluorescencia y se puede llevar a cabo por un técnico en la materia. Los polipéptidos de la presente invención también se podrían utilizar en composiciones terapéuticas o de vacunación con el fin de prevenir o tratar los cánceres que expresan MUC-1. Los polipéptidos se podrían administrar solos o formando complejos con MHC-I y beta-2-microglobulina para estimular una respuesta inmune de células T (CTL) CD8+ específicas de MUC-1. La presente invención también se podría utilizar como un vector de base ADN en que las secuencias de oligonucleótidos que codifican los polipéptidos de la presente invención, incorporados en un vector viral o sintético, se utilizan para vacunar un paciente para el tratamiento o prevención de cánceres que expresan
MUC-1.

Ejemplo 3 Predicción de péptidos que se unen HLA-A*0201

Se utilizó un programa informático (D’Amaro y otros, Hum. Immunol. 43 (1995), 13-18) para examinar la secuencia de MUC1 con dos repeticiones en tándem para péptidos de nueve aminoácidos de longitud con los motivos de residuos de anclaje para HLA-A*0201. Se sintetizó un grupo completo de nueve mers con un solapamiento de ocho aminoácidos que cubren la repetición en tándem así como nueve mers en el 10% del máximo de los datos de puntuación para HLA-A*0201 (90 péptidos en total) mediante química fmoc con un rendimiento de 5-15 mg.

Ejemplo 4 Prueba de los péptidos sintetizados en un ensayo de unión

La unión del péptido a HLA-A*0201 se analizó utilizando células JY de linfoblastoide HLA-A*0201^{+} B en un ensayo de competición semicuantitativa (van der Burg y otros (J. Immunol. 156 (1996), 3308-3314)). El ensayo se basa en la unión competitiva de dos péptidos a moléculas MHC de clase I con eliminación de ácido en una línea de células B (JY). Un péptido de prueba compite con un péptido de referencia marcado de forma fluorescente para las moléculas de clase I vacías en la superficie celular. Las células JY tratadas suavemente con ácido se incubaron con 150 nM del péptido de referencia marcado con fluoresceína (FL) FLPSDC(-FL)FPSV y con diversas concentraciones de péptido competidor durante 24 horas a 37ºC en presencia de 1,0 \mug/ml de \beta2-microglobulina. Posteriormente, las células se lavaron, se fijaron con paraformaldehído y se analizaron mediante citometría de flujo. La fluorescencia media (MF) obtenida en ausencia de péptido competidor se consideró como la máxima unión y es igual a 0%; la MF obtenida sin péptido de referencia era igual a un 100% de inhibición. El porcentaje de inhibición se calculó utilizando la fórmula:

{1-(MF 150 nM péptido de referencia y competidor - MF sin péptido de referencia)/ (MF 150 nM péptido de referencia - MF sin péptido de referencia)} x 100%

La capacidad de unión de los péptidos competidores se expresa como la concentración necesaria para inhibir el 50% de unión del péptido de referencia marcada con FL (IC50). Todos los péptidos se probaron varias veces en diluciones dobles empezando con una concentración de 100 \muM. Los seis péptidos que mostraron cualquier unión significativa se analizaron posteriormente. Los valores de IC_{50} de estos péptidos se muestran en la tabla siguiente junto con el valor para el péptido flu.

Los péptidos se definen en términos de la numeración de aminoácidos utilizada en la figura 12. La repetición en tándem se puede definir utilizando el enzima de restricción Smal que corta en CCCGGG tres veces en la secuencia MUC1, una vez en cada lado de la repetición en tándem y una vez en el extremo C-terminal. Esto conduce a la repetición en tándem definida como los aminoácidos 129-148 en la figura 12. Los seis péptidos se analizaron adicionalmente tal como se describe a continuación.

3

Ejemplo 5 Prueba de los péptidos en un ensayo de linfocitos T citotóxicos (CTL) Resumen del ensayo

Para demostrar que los seis péptidos eran funcionales in vivo, los ratones transgénicos que expresaban la proteína quimérica A*0201K^{b} (Vitiello y otros (J. Exp. Med. 173 (1991), 1007-1015)) experimentaron un protocolo de inmunización con un péptido derivado de MUC-1 y un epítopo de cooperador T formulados con un adyuvante. A continuación, los ratones se sacrificaron y los esplenocitos se reestimularon mediante el cultivo con linfoblastos B cargados de péptido, irradiados, obtenidos de LPS. Las células reestimuladas se separaron de los linfoblastos y se utilizaron en una ensayo de CTL como células efectoras. Las células efectoras se incubaron con células diana cargadas con Na^{51}CrO_{4} a varias proporciones E:T y la citólisis se estimó mediante la medición de la cantidad de ^{51}Cr liberado en el sobrenadante celular utilizando un contador de radiación gamma.

Inmunización de ratones con péptidos derivados de MUC1

Los ratones transgénicos que expresaban la proteína quimérica A*0201K^{b} (Vitiello y otros, locución citada) se inmunizaron subcutáneamente en la base de la cola con 100 \mug de péptido derivado de MUC1 y 140 \mug de epítopo de cooperador T derivado de antígeno de núcleo HBV restringido por H-2-l-A^{b} (secuencia de aminoácidos; TPPAYRPPNAPIL) (Milich y otros, Proc. Natl Acad. Sci. Estados Unidos 85 (1988), 1610-1614) emulsionados en una proporción 1:1 con Adyuvante Incompleto de Freund (IFA) en un volumen total de 200 \mul. Después de un mínimo de dos semanas, los ratones se reforzaron utilizando el mismo protocolo.

Preparación de linfoblastos B obtenidos de LPS

Los esplenocitos de ratones transgénicos (no inmunizados) que expresaban la proteína quimérica A*0201K^{b} (Vitiello y otros, locución citada) se prepararon 72 horas antes de utilizarse como células estimuladoras. Las células de varios ratones se agruparon y se resuspendieron en medio IMDM N (IMDM (Biowhittaker) suplementado con 2 mM de L-glutamina, 8% (v/v) de suero de ternera fetal (FCS) inactivado por el calor, 20 \muM de 2-mercaptoetanol y 100 IU/ml de penicilina) que contenía 25 \mug/ml de LPS (Sigma) y 7 \mug/ml de sulfato de dextrano (Pharmacia). En un cultivo de 30 ml de concentración celular, se incubaron 1,5 x 10^{6} células por ml a 37ºC durante 72 horas.

A continuación, las células se recogieron, se resuspendieron en IMDM N, se separaron en un gradiente de Ficoll y se ajustaron a una concentración celular de 5 x 10^{6} células/ml. A continuación, las células se irradiaron durante 8 minutos (el equivalente de 2500 RAD). A continuación, las células se lavaron una vez y se resuspendieron en IMDM a una concentración celular de 40 x 10^{6} células/ml.

Cada péptido derivado de MUC1, a una concentración de 100 \mug/ml, se incubó durante 1 hora a 37ºC con 1 ml de linfoblastos B obtenidos de LPS. A continuación, las células se lavaron una vez y se resuspendieron en IMDM N a una concentración de 10 x 10^{6} células.

Reestimulación de esplenocitos de ratones inmunizados con péptidos

Dos semanas después de la inmunización final, los ratones se sacrificaron y se extrajeron los bazos. Los esplenocitos (30 x 10^{6} células en un volumen de 9 ml de medio IMDM N) se reestimularon mediante incubación en medio completo con volumen de 1 ml de linfoblastos singeneicos de células B obtenidas de LPS radiados (de manera que la proporción de esplenocitos con respecto a células "blast" es 3:1). En el día 7 del cultivo, las células se separaron en un gradiente de Ficoll, se resuspendieron en medio IMDM N y se contaron para generar una preparación de células efectoras de concentración conocida.

Preparación de células diana

Se utilizó la línea de células Jurkat-A*0201K^{b} que es un transfectante estable de una línea leucémica de células T humanas que expresan el producto de la construcción génica quimérica HLA-A*0201Kb como fuente de células diana.

Se recogieron células que crecían en fase log, se lavaron una vez, se contaron y se transfirieron 10^{6} células a un tubo "microfuge". Las células se agruparon y se resuspendieron en un volumen de 100 \mul de 1 mCi/ml de solución de Na^{51}CrO_{4} (Amersham) seguido inmediatamente de la adición de un volumen de 5 \mul de HEPES 1 M pH 7,0 y el mezclado suave de la suspensión de células mediante pipeteo. Los tubos se incubaron durante 1 hora a 37ºC. A continuación, las células se lavaron cuatro veces en medio IMDM N y se resuspendieron en un volumen de 25 ml de medio IMDM N que contenía el péptido pertinente. Después de una incubación de 20 minutos, las células se pusieron en pocillos que ya contenían los CTLs efectores. La concentración final de péptido en cada pocillo era de
2 \mug/ml.

Ensayo de liberación de ^{51}Cr

Las células efectoras, preparadas tal como se ha indicado anteriormente, se añadieron por triplicado a pocillos de una placa de 96 pocillos (pocillos de base redonda), de manera que la proporción resultante de células efectoras:células diana estaba en un intervalo desde 5:1 a 100:1. Para cada línea de células diana estudiada, se prepararon seis pocillos que contenían IMDM N o PBS con un 2% (v/v) de tritón X-100 como controles para medir la liberación espontánea y máxima de ^{51}Cr, respectivamente.

A continuación, se añadió un volumen de 50 \mul de la preparación de células diana (1000 ó 2000 células dependiendo de la preparación y el número de células efectoras) a cada pocillo y las placas de 96 pocillos se centrifugaron durante 2 minutos a 1200 rpm. A continuación, las placas se incubaron durante 6 horas a 37ºC. Los sobrenadantes del cultivo de cada pocillo se recogieron a continuación utilizando armazones de recogida Skaton según las instrucciones del fabricante y el ^{51}Cr en cada sobrenadante se midió utilizando un contador gamma Wallac. Los datos se presentaron como el porcentaje de liberación de ^{51}Cr específico que se define como 100 x ([cpm experimental - cpm espontáneo]/[cpm total - cpm espontáneo]), donde el valor experimental era el promedio de tres pocillos de prueba, el valor espontáneo, el promedio de seis pocillos que contenían IMDM N y células diana y el valor total era el promedio de seis pocillos que contenían un 2% (v/v) de tritón X-100 y células diana. Los datos se muestran para péptidos MUC1^{79-87}, MUC1^{167-175}, MUC1^{264-272}, MUC1^{460-468} y MUC1^{13-21} en la figura 11.

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Ejemplo 6 Ensayo de protección

Los ratones se inocularon subcutáneamente con 10^{5}, 5 x 10^{5} y 10^{6} células B16-MUC1-A2K^{b} (una línea de células de melanoma que expresa principalmente MUC1 y el producto génico quimérico HLA-A*0201K^{b}). El crecimiento tumoral se observó 20 días después de la inoculación y continuó hasta el sacrificio del animal. Una inoculación de
5 x 10^{5} B16-MUC1-A2K^{b} se definió como la dosis óptima para experimentos de estimulación tumoral.

Para estudiar si los péptidos de unión HLA-A*0201 que se identificaron previamente podían proteger ratones transgénicos A2K^{b} (Vitiello y otros, locución citada) contra la posterior estimulación de tumores con B16-MUC1-A2K^{b}, se inmunizaron grupos de 6-8 animales con 100 \mug de péptido en IFA en presencia de 140 \mug del epítopo de cooperador T derivado de antígeno del núcleo de HBV restringido por H-2-l-A^{b} (128-140; secuencia TPPAYRPPNAPIL) (Milich y otros, locución citada), en el día -28, se reforzaron el día -14 y se estimularon con 5 x 10^{5} células B16-MUC1-A2K^{b} en el día 0. A los ratones de control se les administró IFA o PBS. Un tumor medible se definió como que tenía un volumen superior a 36 mm^{3}.

Los resultados de estos experimentos se muestran en las tablas siguientes en forma de porcentaje de ratones que sobreviven en un día determinado. Para los experimentos 2 y 3, también se muestran los resultados utilizando una construcción de vaccinia que expresa MUC1 (VV-MUC-1). En otros experimentos, la inmunización con MUC1^{167-175} y el refuerzo con MUC1^{79-87} o la inmunización con MUC1^{79-87} y el refuerzo con MUC1^{167-175} dio un porcentaje de supervivencia de entre el 60 y el 70% en el día 30. El experimento 3 muestra los resultados de un experimento en el que los ratones se inocularon con 8 x 10^{5} células dendríticas A2K^{b} (DC) que se habían pulsado con los
péptidos.

Experimento 1

4

Experimento 2

5

Experimento 3

6

<110> TRANSGENE SA y otros

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<120> Péptidos derivados de MUC-1

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<130> D 2195 PCT

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<140>

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<141>

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<160> 67

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 1572

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<212> ADN

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<213> Homo Sapiens

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

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<222> (58)...(1542)

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

7

8

9

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<210> 2

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<210> 495

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<210> PRT

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<210> Homo Sapiens

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<400> 2

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10

11

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<210> 3

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo Sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (58)... (1542)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

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\sa{Ala Leu Gly Ser Thr Ala Pro Pro Val}

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

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<211> 9

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

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\sa{Phe Leu Ser Phe His Ile Ser Asn Leu}

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo Sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

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\sa{Thr Leu Ala Pro Ala Thr Glu Pro Ala}

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

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<211> 9

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

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\sa{Ser Leu Ser Tyr Thr Asn Pro Ala Val}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

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\sa{Ser Val Pro Val Thr Arg Pro Ala Leu}

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

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\sa{Gly Val Pro Gly Trp Gly Ile Ala Leu}

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

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\sa{Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

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\sa{Ala Val Ser Met Thr Ser Ser Val Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

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\sa{Ala Val Ala Ala Thr Ser Ala Asn Leu}

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Pro Gly Ser Val Val Val Gln Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

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\sa{Val Pro Gly Trp Gly Ile Ala Leu Leu}

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

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<211> 9

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

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\sa{Ser Ala Ser Gly Ser Ala Ser Thr Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

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\sa{Ser Ala Gly Asn Gly Gly Ser Ser Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

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\sa{Ala Leu Ala Val Cys Gln Cys Arg Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Gln Leu Asp Ile Phe Pro Ala Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Leu Val His Asn Gly Thr Ser Ala Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

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\sa{Thr Thr Leu Ala Ser His Ser Thr Lys}

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<210> 20

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<211> 9

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

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\sa{Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg}

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

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\sa{Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Asn Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

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\sa{Ile Tyr Lys Gln Gly Gly Phe Leu Gly Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

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<212> PRT

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<213> Homo Sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

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\sa{Phe Phe Leu Ser Phe His Ile Ser Asn Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

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<212> PRT

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<213> Homo Sapiens

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

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<222> (58)...(1542)

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

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\sa{Gly Phe Leu Gly Leu Ser Asn Ile Lys Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

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\sa{Tyr Tyr Gln Glu Leu Gln Arg Asp Ile Ser}

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo Sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

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\sa{Ile Ser Glu Met Phe Leu Gln Ile Tyr}

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo Sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

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\sa{Asp Val Glu Thr Gln Phe Asn Gln Tyr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

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<212> PRT

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<213> Homo Sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

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\sa{Ser Leu Glu Asp Pro Ser Thr Asp Tyr Tyr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

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<212> PRT

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<213> Homo Sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ile Ser Glu Met Phe Leu Gln Ile Tyr Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asn Ile Lys Phe Arg Pro Gly Ser Val}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Leu Ala Phe Arg Glu Gly Thr Ile}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Cys Arg Arg Lys Asn Tyr Gly Gln Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Ala Ala Ser Arg Tyr Asn Leu Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gccttgggct ccaccgcccc tccagtc

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttcctgtctt ttcacatttc aaacctc

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

actctggccc cggccacgga accagct

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agcctctctt acacaaaccc agcagtg

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcggtcccag tcaccaggcc agccctg

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggggtgccag gctggggcat cgcgctg

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gccccgggct ccaccgcccc cccggcc

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gctgtgagta tgaccagcag cgtactc

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcagtggcag ccacttctgc caacttg

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aggccaggat ctgtggtggt acaattg

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtgccaggct ggggcatcgc gctgctg

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tctgcatcag gctcagcttc tactctg

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tctgcaggta atggtggcag cagcctc

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gccttggctg tctgtcagtg ccgccga

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gggcagctgg acatctttcc agcccgg

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

actctggtgc acaacggcac ctctgccagg

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

accacccttg ccagccatag caccaag

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtgtcacct cggccccgga caccagg

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtgtcacct cggccccgga caacagg

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atttataaac aagggggttt tctgggcctc

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tttttcctgt cttttcacat ttcaaacctc

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggttttctgg gcctctccaa tattaagttc

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tactaccaag agctgcagag agacatttct

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atttctgaaa tgtttttgca gatttat

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atttctgaaa tgtttttgca gatttataaa

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tctctggaag atcccagcac cgactactac

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gacgtggaga cacagttcaa tcagtat

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aatattaagt tcaggccagg atctgtg

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

actctggcct tccgagaagg taccatc

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 63

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cagtgccgcc gaaagaacta cgggcagctg

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 64

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaagcagcct ctcgatataa cctgacg

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 65

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Leu Leu Thr Val Leu Thr Val Val}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 66

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Leu Gly Ser Thr Thr Pro Pro Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 475

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo Sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

12

13

Claims (27)

1. Polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en las SEC ID Nos: 5, 7, 8, 10 a 19 y 22 a 33.

2. Polinucleótido que codifica el polipéptido según la reivindicación 1.

3. Polinucleótido, según la reivindicación 2, que consiste en una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID Nos: 34, 36, 38, 39, 41 a 50 ó 53 a 64 y sus secuencias complementarias.

4. Polinucleótido, según la reivindicación 2 ó 3, que contiene además elementos que permiten la expresión del polipéptido en una célula huésped.

5. Polinucleótido, según la reivindicación 4, en el que dicho elemento para la expresión de una célula huésped es un promotor.

6. Polinucleótido, según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en el que dicho polinucleótido se asocia con uno o más compuestos seleccionados del grupo que consiste en agentes transfectantes, agentes estabilizantes y agentes marcadores.

7. Vector que comprende, como mínimo, un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6.

8. Vector, según la reivindicación 7, que comprende, como mínimo, dos secuencias de nucleótidos diferentes que codifican, como mínimo, dos polipéptidos según se definen en la reivindicación 1.

9. Vector, según la reivindicación 7 u 8, que es un plásmido.

10. Vector, según la reivindicación 7 u 8, que es un vector viral.

11. Célula huésped aislada que comprende un polinucleótido, según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, o un vector según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10.

12. Célula huésped, según la reivindicación 11, que es una célula procariota, una célula de levadura, o una célula animal, tal como una célula de mamífero.

13. Composición que comprende un polipéptido, según la reivindicación 1, un polinucleótido, según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, un vector, según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, o una célula huésped, según la reivindicación 11 ó 12, o una combinación de dos o más de estos compuestos.

14. Composición, según la reivindicación 13, que comprende además un portador farmacéutico.

15. Utilización de un polipéptido, según la reivindicación 1, de un polinucleótido, según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, de un vector, según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, o una célula huésped, según la reivindicación 11 ó 12, o de una composición, según la reivindicación 13, para la preparación de un medicamento destinado a realizar una respuesta de los CTL en un sujeto.

16. Composición de diagnóstico que comprende un polipéptido según la reivindicación 1.

17. Vacuna que comprende un polipéptido, según la reivindicación 1, un polinucleótido, según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, un vector, según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, o una célula huésped, según la reivindicación 11 ó 12, cuya vacuna es capaz de estimular una respuesta de células T restringidas por MHC de clase I dirigida a un epítopo según está contenido en un polipéptido según la reivindicación 1.

18. Producto que comprende una molécula de HLA o un fragmento de la misma, que comprende un polipéptido, según la reivindicación 1, en su surco de unión al péptido.

19. Célula aislada que comprende un producto según la reivindicación 18.

20. Método de identificación de una respuesta de células T restringidas por MHC de clase I, comprendiendo dicho método el contacto, in vitro, de una población de células que comprende células T restringidas por MHC de clase I con:

el polipéptido, según la reivindicación 1, en condiciones adecuadas para la presentación del polipéptido o un producto, según la reivindicación 18 o células, según la reivindicación 19, y

la determinación de si las células T CD8 reconocen el polipéptido o la célula, indicando el reconocimiento por las células T, la presencia de una respuesta de células T restringidas por MHC de clase I.

21. Método, según la reivindicación 20, en el que la determinación del reconocimiento por las células T se realiza detectando la expresión de una sustancia por las células T, indicando la expresión de la sustancia que las células T han reconocido el polipéptido o el producto o la célula.

22. Método, según la reivindicación 21, en el que la sustancia que se detecta es IFN-\gamma.

23. Método de diagnóstico del cáncer en un huésped, comprendiendo dicho método la determinación in vitro de la presencia o ausencia en el huésped de una respuesta de células T restringidas por MHC de clase I a un polipéptido, según la reivindicación 1, o la presencia de la respuesta de células T restringidas por MHC de clase I indicando que el huésped tiene cáncer.

24. Método, según la reivindicación 23, en el que la presencia o ausencia de la respuesta de células T restringidas por MHC de clase I se determina mediante el método según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22.

25. Método de provocación de la replicación de células T restringidas por MHC de clase I que reconocen un epítopo de una célula cancerígena o una célula T activada, comprendiendo dicho método el contacto in vitro de una población de células que comprende células T restringidas por MHC de clase I con el polipéptido, según la reivindicación 1, en condiciones en las que el polipéptido es presentado a células T en la población, o con un producto, según la reivindicación 18 o con una célula según la reivindicación 19.

26. Composición farmacéutica que comprende un producto, según la reivindicación 18, una célula, según la reivindicación 19, o una célula que ha sido replicada en el método según la reivindicación 25.

27. Equipo para llevar a cabo un método, según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 23, que comprende un polipéptido, según la reivindicación 1, un polinucleótido, según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, una composición, según la reivindicación 13 y/o un producto según la reivindicación 18.