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WO2005068632A1 - ＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性Ｅｐ−ＣＡＭ特異的ＣＴＬが認識するエピトープ・ペプチド及びその用途 - Google Patents

ＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性Ｅｐ−ＣＡＭ特異的ＣＴＬが認識するエピトープ・ペプチド及びその用途 Download PDF

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WO2005068632A1
WO2005068632A1 PCT/JP2005/000587 JP2005000587W WO2005068632A1 WO 2005068632 A1 WO2005068632 A1 WO 2005068632A1 JP 2005000587 W JP2005000587 W JP 2005000587W WO 2005068632 A1 WO2005068632 A1 WO 2005068632A1
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WO
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cancer
peptide
hla
antigen
lymphocytes
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Kiyotaka Kuzushima
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Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Aichi Prefecture
Original Assignee
Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Aichi Prefecture
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    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies

Definitions

  • HLA A2402 restricted Ep—Epitope peptides recognized by CAM-specific CTLs and their uses
  • the present invention relates to an epitope 'peptide recognized by HLA-A2402-restricted cytotoxic T lymphocytes, an antigen-presenting cell and a major histocompatibility antigen complex, and a cancer vaccine or cytotoxic agent containing these as active ingredients.
  • T lymphocyte inducer passive immunotherapeutic agent for epithelial cancer comprising this cytotoxic T lymphocyte inducer as an active ingredient, method for treating or improving cancer using these, and cancer-specific HLA-A2402
  • the present invention relates to a method for quantifying restricted cytotoxic T lymphocytes.
  • Cytotoxic T lymphocytes (hereinafter abbreviated as "CTL”) are considered to be one of the important factors in resistance to cancer.
  • Invasion of CTL showing a damaging activity against tumor cells is observed in the tumor site of cancer patients.
  • the tumor antigen which is a target molecule for this tumor-specific CTL, is degraded in the cell to form a peptide with 8-11 amino acid strength (tumor epitope 'peptide), and human leukocyte antigen (major histocompatibility antigen)
  • HLA human leukocyte antigen
  • “HLA” i) is bound to the molecule and presented on the surface of the tumor cell.
  • CTL recognizes a complex consisting of HLA and a tumor antigen peptide and damages tumor cells.
  • CTL recognizes tumor cells in an HLA-restricted manner.
  • HLA is a cell membrane antigen expressed on almost all cells, and is roughly classified into a class I antigen and a class IV antigen.
  • the HLA recognized by CTL along with the epitope 'peptide is a class I antigen.
  • HLA class I antigens are further classified into HLA-A, HLA-B, HLA-C, etc., and their genes have subtypes.
  • HLA-A has many types such as Al, A2, A24, and A26. The type exists. Therefore, the HLA type of each human individual is not necessarily the same.
  • CTL recognizes a complex of HLA class I antigen and tumor epitope peptide, it also recognizes the HLA type.
  • epitopes that can bind to HLA have a motif (regular arrangement) in the peptide sequence that can bind to each type of HLA. Column). Therefore, in order to induce and Z or activate CTL, it is necessary to select a peptide having a motif that can bind to each type of HLA, which is different for each patient.
  • Ep-CAM is a molecule that is widely expressed on the surface of cancer cells derived from epithelial cells and mediates calcium ion-independent cell-cell adhesion. Ep-CAM is also called EGP-2, 17-1A, GA733-2 or KSA. Ep-CAM is highly expressed in many tumors derived from various histological sources such as the large intestine, lung, head and neck, and mammary gland, and its expression is limited in normal epithelial cells. In addition, since the degree of tumor progression and the expression level of Ep-CAM are correlated, Ep-CAM expression detection is useful as a marker for diagnosis of tumor micrometastasis or survival prediction. .
  • Ep-CAM is widely expressed in cancer cells derived from epithelial cells, but its expression is limited in normal cells, so it is one of the main targets for immunotherapy and gene therapy using monoclonal antibodies. It has become.
  • Ep-CAM-specific mouse monoclonal antibody (named 17-1A) after surgery prevents distant metastasis and prolongs the survival effect by continuous administration for 7 years. It is reported that it was seen. In addition, it was reported that mortality and recurrence rates were reduced after treating colon cancer patients using a monoclonal antibody against Ep-CAM, named 17-1A! Speak.
  • Patent Document 1 reports that CTL specific for HLA-A0201-restricted Ep-CAM destroys epithelial tumor cells but does not affect normal cells.
  • Patent Document 1 discloses a peptide consisting of the sequence of YQLDPKFITSI described in SEQ ID NO: 12 as an Ep-CAM174-184 epitope 'peptide recognized by HLA-A0201-restricted CTL.
  • a T cell response to Ep-CAM has also been observed in colon colorectal cancer patients after receiving immunotherapy.
  • colon cancer patients When immunizing colon cancer patients with recombinant Nalyabox virus expressing Ep-CAM, anti-Ep-CA without causing an autoimmune response M CTL response was induced.
  • HLA-A of HLA class I antigens the most expressed in Japanese is HLA—
  • the HLA-A24-restricted Ep-CAM epitope 'peptide can be suitably used as a cancer vaccine.
  • epitope peptides are as follows.
  • Patent Document 2 discloses five epitopes 'peptides having 9 amino acid sequences for SART-2 tumor antigen protein as HLA-A2402-restricted CTL epitopes' peptides.
  • Patent Document 3 describes an HLA—A2402-restricted CTL epitope obtained from patients with lung adenocarcinoma • ART-6—six epitopes with 8-11 amino acid sequence ability against tumor antigen proteins. Peptides are disclosed.
  • Patent Document 4 discloses that HLA-A2402 constrained CTL epitope 'peptide, which has also been established in esophageal cancer patients, is abnormally expressed in colon cancer cells and small cell lung cancer cells. It discloses seven epitope peptides that have the ability to sequence 8-11 amino acids of the p561uk protein (tumor antigen protein encoded by luk gene).
  • Patent Document 5 discloses PI obtained from a cDNA library derived from the KE4 tumor cell line as an HLA-A2402 constrained CTL epitope peptide that has been established in esophageal cancer patients. — 9 peptides from 9 9 4 peptides with the ability to sequence 10 amino acids are disclosed.
  • Patent Document 6 discloses PI obtained from a cDNA library of an 11-18 lung adenocarcinoma cell line as an HLA-A2402-restricted CTL epitope 'peptide that has been obtained from lung cancer patients. — Nine peptides derived from nine nineteen peptides having 17 amino acid sequences are disclosed.
  • Patent Document 7 is an epitope 'peptide having an HLA-A24.1 (HLA-A2402) -binding motif, and has a first conserved residue of Y, F, and W at the N-terminal portion. And the C-terminal part has F, I, W, M second conserved residues, and the first and second conserved residues are separated by 6-7 residues.
  • a peptide having 10 amino acid residue strength is disclosed.
  • Ep-CAM's epitope 'peptide capable of binding to HLA-A2402 molecule has not yet been confirmed. Therefore, Ep-CAM specific for cancer cells that can bind to HLA-A2402 molecule It is desired to develop a new epitope 'peptide that can induce CTL.
  • Patent Document 1 W097 / 15597 International Publication
  • Patent Document 2 JP-A-11-318455
  • Patent Document 3 JP 2000-116383 A
  • Patent Document 4 WO2000-06595
  • Patent Document 5 JP-A-2001-245675
  • Patent Document 6 Japanese Patent Laid-Open No. 2003-270
  • Patent document 7 Special table hei 8-500103 (claim 11 etc.)
  • the present invention provides an Ep-CAM epitope peptide capable of inducing HLA-A2402-restricted cytotoxic T lymphocytes, an antigen-presenting cell and a major histocompatibility complex, a cancer vaccine comprising them as an effective component, or Cytotoxic T lymphocyte inducer, Ep-CAM-specific HLA-A 2402-restricted cytotoxic T lymphocyte, passive immunotherapeutic agent containing the active T lymphocyte, method of treating or improving cancer using these, Another object of the present invention is to provide a method for quantifying HLA-A2402 constrained cytotoxic T lymphocytes specific for epithelial cancer.
  • HLA-A2402 is the most common type of HLA-A in Japanese (over 60%) and is present in about 20% of Europeans.
  • HLA-A2402 the most common type of HLA-A in Japanese (over 60%) and is present in about 20% of Europeans.
  • a peptide capable of binding to a specific HLA molecule is predicted by a neuroinformatics approach. When measured, the cytotoxic T lymphocytes induced by this predicted peptide often do not actually recognize the antigen containing the peptide.
  • the present inventor confirmed that CTL clone power specific to two epitopes' peptides out of the seven predicted peptides was actually HLA- ⁇ 2402-positive ⁇ -CAM It was found that the cancer cells were cytotoxic against the expressed cancer cells but not cytotoxic to the HLA-A2402-negative cancer cells.
  • these epitope peptides were treated on the surface of HLA-A2402-positive Ep-CAM-positive cancer cells and presented as antigens.
  • these two epitopes' peptides can be used as cancer vaccines for persons carrying HLA-A2402.
  • the present invention has been completed based on the above findings, and provides the following epitope peptides and the like.
  • Item 1 The following peptide (1), (2), (3) or (4).
  • Item 3 A cancer vaccine comprising the peptide according to Item 1 or 2 as an active ingredient.
  • Item 4 The cancer vaccine according to Item 3, wherein the cancer is epithelial cancer.
  • Cancer is colon cancer, lung cancer, breast cancer, stomach cancer, oral cancer, knee cancer, esophageal cancer, nasopharyngeal cancer, uterine cancer, Item 5.
  • the cancer vaccine according to Item 3 or 4 which is a cancer selected from the group consisting of prostate cancer and gallbladder cancer.
  • Item 6 The cancer vaccine according to Item 3, 4 or 5 for a human having HLA-A2402 as a leukocyte antigen.
  • a cytotoxic T lymphocyte inducer comprising the peptide according to Item 1 or 2 as an active ingredient.
  • Item 8 The cytotoxic T lymphocyte inducer according to Item 7, for humans having HLA-A2402 as a leukocyte antigen.
  • a gene therapy agent for epithelial cancer comprising the polynucleotide according to Item 9 as an active ingredient.
  • a method for producing the peptide according to Item 1 or 2 comprising a step of culturing the transformant according to Item 12 and a step of recovering the peptide according to Item 1 or 2 with culture power.
  • Item 14 An antigen-presenting cell pulsed with the peptide according to Item 1 or 2.
  • a cancer vaccine comprising the antigen-presenting cell according to Item 14 as an active ingredient.
  • Item 16 The cancer vaccine according to Item 15, wherein the cancer is epithelial cancer.
  • Cancer is colon cancer, lung cancer, breast cancer, stomach cancer, oral cancer, knee cancer, esophageal cancer, nasopharyngeal cancer, uterine cancer, Item 15.
  • a cytotoxic T lymphocyte inducer comprising the antigen-presenting cell according to Item 14 as an active ingredient.
  • Item 20 The cytotoxic T lymphocyte inducer according to Item 19, for the treatment of a human having HLA-A2402 as a leukocyte antigen.
  • Item 21 A major tissue-matching antigen complex in which the peptide according to Item 1 or 2 or the tumor antigen epitope peptide presented on the antigen-presenting cell according to Item 14 and a major histocompatibility antigen are complexed.
  • Item 22 A complex of the peptide according to Item 1 or 2 or the tumor antigen epitope peptide presented on the antigen-presenting cell according to Item 14, an HLA-A2402 molecule, and ⁇ 2 microglobulin 22.
  • Item 23 A cancer vaccine comprising the major histocompatibility complex according to item 21 or 22 as an active ingredient.
  • Item 24 The cancer vaccine according to Item 23, wherein the cancer is epithelial cancer.
  • Item 25 The cancer according to Item 23 or 24, wherein the cancer is selected from the group consisting of colon cancer, lung cancer, breast cancer, stomach cancer, oral cancer, knee cancer, esophageal cancer, nasopharyngeal cancer, uterine cancer, prostate cancer, and gallbladder cancer.
  • Item 26 The cancer vaccine according to Item 23, 24 or 25 for the treatment of a human having HLA-2402 as a leukocyte antigen.
  • Item 27 An agent for inducing cytotoxic lymphocytes comprising the major histocompatibility complex according to item 21 or 22 as an active ingredient.
  • Item 28 The cytotoxic vaginal lymphocyte inducer according to Item 27 for treating a human having HLA-2402 as a leukocyte antigen.
  • Item 29 Major tissue suitable for the combination of the tumor antigen epitope peptide presented on the peptide according to Item 1 or 2 or the antigen-presenting cell according to Item 14 and a major histocompatibility antigen Tetramer of combined antigen complex.
  • Cytotoxic T lymphocytes obtained by stimulating peripheral blood lymphocytes using any one or more of the following (a) — (d):
  • Item 31 A major histocompatibility complex or a conjugate of Z and its tetramer with cytotoxic T lymphocytes by stimulating peripheral blood lymphocytes using any one or more of (a)-(d) above Item 32.
  • Item 32 A passive immunotherapeutic agent for cancer comprising the cytotoxic T lymphocyte according to Item 30 or 31 as an active ingredient.
  • Item 33 The passive immunotherapeutic agent according to Item 32, wherein the cancer is epithelial cancer.
  • Item 34 The cancer according to Item 32 or 33, wherein the cancer is selected from the group consisting of colon cancer, lung cancer, breast cancer, stomach cancer, oral cancer, knee cancer, esophageal cancer, nasopharyngeal cancer, uterine cancer, prostate cancer, and gallbladder cancer. Passive immunotherapy agent.
  • Item 35 The passive immunotherapeutic agent according to Item 32, 33 or 34 for a human having HLA-A2402 as a leukocyte antigen.
  • Item 36 A step of causing any of the following (a) — (d) to act on peripheral blood:
  • a method for quantifying HLA-A2402-restricted cytotoxic T lymphocytes in peripheral blood comprising the step of quantifying cytotoxic T cells in the peripheral blood or cytodynamic force produced by the cells.
  • Item 37 A method for treating or improving cancer, comprising administering one or more of the following (a) to (d) to a human having HLA-A2402 as a leukocyte antigen. (a) The peptide according to item 1 or 2
  • Item 38 Collecting a mononuclear cell fraction from human peripheral blood having HLA-A2402 as a leukocyte antigen
  • a method for treating or improving cancer comprising the steps of:
  • Item 39 A method for inducing cytotoxic T lymphocytes, wherein one or more of the following (a) — (d) is administered to a human having HLA-A2402 as a leukocyte antigen:
  • Item 40 A method for treating or improving cancer, comprising administering the cytotoxic T lymphocyte according to Item 30 or 31 to a human having HLA-A2402 as a leukocyte antigen.
  • Item 41 A tetramer of a complex of the peptide according to Item 1 or 2 or the tumor antigen epitope peptide presented on the antigen-presenting cell according to Item 14, an HLA-A2402 molecule, and ⁇ 2 microglobulin. 24. A tetramer of a major histocompatibility complex according to item 21.
  • Item 43 The cancer vaccine according to Item 42, wherein the cancer is epithelial cancer.
  • Item 44. The cancer according to Item 42 or 43, wherein the cancer is a cancer selected from the group consisting of colon cancer, lung cancer, breast cancer, stomach cancer, oral cancer, knee cancer, esophageal cancer, nasopharyngeal cancer, uterine cancer, prostate cancer, and gallbladder cancer.
  • Item 45. The cancer vaccine according to Item 42, 43 or 44 for treating a human having HLA-A2402 as a leukocyte antigen.
  • a cytotoxic T lymphocyte inducer comprising the tetramer of the major histocompatibility complex according to Item 41 as an active ingredient.
  • Item 47 The cytotoxic T lymphocyte inducer according to Item 46, for the treatment of human having HLA-A2402 as a leukocyte antigen.
  • an Ep-CAM molecule epitope 'peptide widely expressed in epithelial cancer cells which is frequently observed as a type of leukocyte antigen in Japanese, is HLA-A2402-restricted cytotoxicity. What was recognized by sex T lymphocytes was provided. Therefore, this epitope peptide can be used as a cancer vaccine against a wide range of human epithelial cancers with HLA-A2402.
  • FIG. 1 is a graph showing the results of evaluation of polyclonal peptide activity CTL cell lines by Elispot'Atsuy.
  • FIG. 2 shows the results of tetramer staining of Ep-CAM peptide-specific polyclonal (A) and clonal (B) CTLs.
  • Fig. 3 shows the results of characterization of Ep 173-specific CTL clones.
  • FIG. A is a drawing of a 51 Cr release assay showing the cytotoxicity results of C27, Ep 173 specific CTL clones against peptide Epl73 and control peptide EBV-LMP419 T2-A24 cells.
  • FIG. B shows the inhibitory effect of anti-HLA-A24 monoclonal antibody on cytotoxicity of HLA-A2402-positive cell line, Epl73-specific CTL clone against PC9, and C27.
  • Figure C shows C27 cells by Epl73 in cold target inhibition activity. It is drawing which shows injury property.
  • FIG. 4 is a drawing showing the results of Ep-CAM PCR analysis.
  • FIG. 5 is a drawing showing cytotoxicity of C27 and Epl73-specific CTL clones against various cancer cell lines.
  • the peptide of the present invention comprises 9 to 10 amino acid-powered epitope peptides having the binding motif of HLA-A2402 for the amino acid sequence of Ep-CAM protein that is widely expressed in cancer derived from epithelial cells.
  • a searchable collation medium the World Wide Web site.
  • Bioinformatics & Molecular Analysis Section (BIMAS) HLA Peptide Binding Predictions (BIMAS)
  • the peptide of the present invention is the following peptide (1), (2), (3) or (4).
  • the peptide means an amino acid molecular chain in which the ⁇ -amino group and carboxyl group of adjacent amino acid residues are bonded to each other by a peptide bond and has physiological activity.
  • the peptide includes a salt or derivative thereof as long as the physiological activity is not impaired. Derivatives include those that are glycosylated, amidated, phosphorylated, force-boxylated, phosphorylated, formylated, acylated, and the like.
  • an acid addition salt is preferable. Examples of the acid addition salt include salts with inorganic acids such as hydrochloric acid, phosphoric acid, and sulfuric acid, and salts with organic acids such as formic acid, acetic acid, propionic acid, and tartaric acid.
  • Each peptide of (4) is an Ep-CAM epitope peptide that is widely expressed in cancer cells derived from epithelial cells, and is recognized by or bound to HLA-A2402-restricted CTL. Or can further activate CTL. Therefore, it can be suitably used as a tumor antigen that induces or activates CTL, that is, as a cancer vaccine, for the treatment or amelioration of human cancer having HLA-A2402.
  • These peptides can also be used for the production of various peptides that specify tumor antigen epitopes. The use of the peptide of the present invention will be described in detail later.
  • the lower limit of the number of amino acids in the mutant peptides (3) and (4) is usually about 5, preferably about 7.
  • the upper limit of the number of amino acids is not particularly limited as long as it is recognized by HLA-A2402-restricted CTL, but is usually about 12. Among them, a variant peptide having about 9 to 11 amino acids is preferable.
  • mutant peptides were designed to match the HLA-A2402 binding motif by, for example, matching with the above-mentioned HLA Peptide Binding Prediction, and from that, HLA-A2402-restricted CTL was actually used. It can be obtained by selecting one that is recognized or induces it.
  • Whether or not it is an HLA-A2402-positive Ep-CAM epitope 'peptide can be determined, for example, by the following method.
  • Epitope candidate peptide stimulates epithelial cancer-specific CTL induced in this way Elispot Atssey (Kuzushima K et al., The Journal of Clinical
  • the candidate peptide is a peptide that is synthesized by synthesizing a peptide library consisting of about 20 amino acids covering the entire Ep-CAM protein, and performing the above-mentioned elicitation assay on the synthesized peptide and reacting with CTL.
  • the peptide having about 9 to 10 amino acids can be used as the epitopic peptide of the present invention.
  • the peptide of the present invention can be used in the form of a complex to which sugars, polyethylene glycol, lipids and the like are added, a derivative or a polymer by a radioisotope, and the like.
  • the polynucleotide of the present invention is a polynucleotide encoding the peptide of the present invention, and specifically, the following polynucleotide (5), (6), (7) or (8).
  • the polynucleotide of the present invention includes both DNA and RNA unless otherwise specified.
  • DNA includes cDNA, genomic DNA, and synthetic DNA.
  • RNA includes mRNA, rRNA and synthetic RNA are included.
  • a complementary polynucleotide and a double-stranded polynucleotide are also included.
  • the 11 nucleotide sequence polynucleotide is obtained from the human cancer-related antigen GA733-2 (Szala, S., et. Al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (9), 3542-3546 (1990).
  • Ep partial sequence of the CAM gene.
  • the mutant polynucleotide of (7) or (8) is usually 15 or more, preferably 21 or more, and usually 45 or less nucleotides corresponding to the region encoding the epitope peptide of the present invention. As long as it becomes. Among these, a polynucleotide having about 27 to 33 nucleotides is preferable.
  • a "DNA molecule that hybridizes under stringent conditions to a DNA molecule” is, for example, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook, et al., Edited by Cornoledo 'Spring'). (Norno 'Laboratory' Press, Cold 'Spring' Nober, New York, 1989).
  • the conditions of “noblate under stringent conditions” include, for example, heating at 42 ° C. in a solution of 6 X SSC, 0.5% SDS and 50% formamide, and then 0.1.
  • An example is the condition under which a positive hydride signal is observed when washed at 68 ° C in a solution of X SSC, 0.5% SDS.
  • mutant polynucleotide of (7) or (8) for example, a peptide expressed in cells having HLA-A2402 using a known protein expression system will be described later. It may be selected by confirming that it can be recognized by CTL or has the ability to induce CTL.
  • the mutant polynucleotide has a poly (A) structure at its end, and the number of poly (A) does not affect the coding site of the amino acid acting as a tumor antigen.
  • the number of poly (A) possessed by the nucleotide is not particularly limited! /.
  • the polynucleotide of the present invention provides gene information useful in producing the epitope peptide of the present invention using recombinant technology. Nucleic acid reagents or standards It can also be used as a product.
  • the recombinant vector of the present invention is a recombinant vector obtained by incorporating the polynucleotide of the present invention into an appropriate vector DNA.
  • the vector DNA may be appropriately selected depending on the type of host and intended use.
  • the vector DNA may be a naturally occurring DNA or a DNA lacking a part of the DNA other than the part necessary for propagation from the natural DNA.
  • Examples of the vector DNA include vectors derived from chromosomes, episomes or viruses.
  • bacterial plasmid, nocterophage, transposon, yeast episome, insertion element, yeast chromosomal element, virus for example, baculovirus, papovavirus, SV 40, vaccinia virus, adenovirus, fowlpox virus, Vectors derived from pseudorabies virus, retrovirus, etc.
  • virus for example, baculovirus, papovavirus, SV 40, vaccinia virus, adenovirus, fowlpox virus, Vectors derived from pseudorabies virus, retrovirus, etc.
  • vectors combining them for example, plasmids, and vectors derived from genetic elements of butteriophage (for example, cosmids and phagemids).
  • an expression vector or a cloning vector may be used.
  • a recombinant vector is composed of a target gene sequence and a gene sequence that bears information on replication and control, such as a promoter, a ribosome binding site, a terminator, a signal sequence, an enhancer, and the like. Produced by combining by methods c
  • the polynucleotide of the present invention may be inserted into the vector DNA by a known method.
  • DNA and vector DNA can be cleaved at a specific site using an appropriate restriction enzyme, mixed and religated by ligase.
  • a recombinant vector can also be obtained by ligating a suitable linker to the polynucleotide of the present invention and inserting it into a multicloning site of a vector DNA suitable for the purpose.
  • a recombinant vector in which the above polynucleotide is incorporated is used as a known host, for example, a bacterium such as E. coli (for example, ⁇ 12), a bacterium belonging to the genus Bacillus (for example, MI114), yeast (for example, AH22), insect cells (for example, SUB cells) or animal cells (for example, COS-7 cells, Vero cells, CHO cells, etc.) are obtained by known methods to obtain the transformant of the present invention.
  • a bacterium such as E. coli (for example, ⁇ 12), a bacterium belonging to the genus Bacillus (for example, MI114), yeast (for example, AH22), insect cells (for example, SUB cells) or animal cells (for example, COS-7 cells, Vero cells, CHO cells, etc.) are obtained by known methods to obtain the transformant of the present invention.
  • an integration method into a chromosome is preferable in consideration of gene stability.
  • an autonomous replication system using an extranuclear gene can be used.
  • Vector DNA can be introduced into host cells by, for example, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (edited by Sambrook, et al., Cornedo 'Spring' November 'Laboratory' Press, Cold Spring Nover, New York, 1989). This can be done by the standard methods described. Specifically, calcium phosphate transfection, DEAE-dextran mediated transfection, microinjection, cationic fat mediated transfection, electoral position, transduction, scrape loading, ballistic introduction ) And infection etc.
  • the peptide of the present invention can be synthesized by a known peptide synthesis method such as solid phase peptide synthesis.
  • a known peptide synthesis method such as solid phase peptide synthesis.
  • Examples of such peptide synthesis methods include the method described in “Peptide Synthesis” (Maruzen; published in 1975) or Peptide Synthesis, Interscience, New York, (1996).
  • it can also be produced using a known chemical synthesizer such as a peptide synthesizer manufactured by Applied Systems.
  • the peptide of the present invention can also be produced by a method comprising the step of culturing the transformant of the present invention described above and the step of recovering the culture strength of the peptide of the present invention.
  • Culture may be performed by subculture or batch culture using a medium suitable for the host.
  • an appropriate amount of the peptide of the present invention can be obtained by using as an index the amount of peptide produced inside or outside the transformant and the CTL inducing ability which is one of the actions of the peptide of the present invention produced by the transformant. Go up.
  • Purification includes molecular sieve chromatography, ion exchange chromatography, It may be carried out by a known method in combination with chromatography such as Phy, etc., or fractionation means based on solubility difference using ammonium sulfate or alcohol. Purification may be carried out using as an index the recognition of this peptide by CTL or the induction of CTL, specifically, for example, the amount of IFN- ⁇ produced by CTL.
  • the peptide of the present invention in the culture is specifically adsorbed and recovered. You can also
  • the antigen-presenting cell of the present invention is a cell obtained by pulsing the peptide of the present invention to an antigen-presenting cell such as a rod-shaped cell, macrophage, or sputum lymphocyte.
  • the antigen-presenting cell in the present invention is a cell capable of expressing on its surface an HLA that binds to the peptide of the present invention, and has a CTL stimulating ability.
  • Pulse includes, but is not limited to, for example, these antigen-presenting cells in a medium containing the peptide of the present invention at a concentration of about 10 gZml at a temperature of about 20-30 ° C for 30 minutes. It can be done by incubating for about 1 hour. This presents a tumor antigen peptide that can be recognized by HLA-A2402-restricted CTL on the surface of the antigen-presenting cell.
  • Tumor antigen means a protein, polypeptide or peptide that can be recognized by tumor-specific CTLs, or that can further induce CTLs or activate Z and CTLs, which are possessed by tumor cells.
  • a tumor antigen peptide is a peptide that is generated when this tumor antigen is degraded in tumor cells, and is recognized by CTL by binding to HLA molecules and presented on the cell surface, and induces CTL or Z And a peptide capable of activating CTL.
  • an amino acid sequence portion of a tumor antigen which is recognized by a tumor-specific CTL, or further an epitope sequence capable of inducing or activating CTL is a tumor antigen epitope (determining tumor antigen Group).
  • CTL recognizes tumor cells or tumor antigen epitopes as peptides. It means that CTL binds to sphere antigen (HLA) and tumor antigen peptide via T cell receptor.
  • HLA sphere antigen
  • CTL activate means to further enhance or actuate a substance having a certain activity or action or its state.
  • CTL is active means that CTL recognizes an epitope peptide presented by HLA, for example, produces an effector such as IFN- ⁇ , or a target recognized by CTL. It means to show cytotoxicity to cells.
  • inducing means that an activity or action is generated from something or a state that has little activity or action.
  • inducing antigen-specific CTL means differentiation, selection or proliferation of CTL that specifically recognizes an antigen in vitro or in vivo.
  • Antigen-presenting cells pulsed with the epitope peptide of the present invention can be used as a cancer vaccine. It can also be used for the production of epithelial cancer-specific CTL, the quantification of epithelial cancer-specific CTL in human peripheral blood, and the like.
  • the major histocompatibility antigen complex of the present invention is a complex of the major histocompatibility antigen and the tumor antigen epitope peptide displayed on the surface of the antigen-presenting cell pulsed with the peptide of the present invention or the peptide of the present invention.
  • the major histocompatibility antigen is a molecule that presents a peptide recognized by the lymphocyte to the lymphocyte antigen receptor, and is recognized by the CTL together with the epitope 'peptide.
  • Leukocyte antigen (HLA) Leukocyte antigen
  • MHC major histocompatibility complex
  • HLA human leukocyte antigen
  • the CTL epitope 'peptide specific to Ep-CAM is a peptide that occupies a specific site in Ep-CAM protein, and is recognized by CTL and is immunologically linked to CTL antigen receptor. Refers to an antigenic determinant that binds to Furthermore, CTL epitopes' peptides can eliminate cancer cells by directly damaging cells that express Ep-CAM molecules.
  • the MHC of the present invention is particularly a complex in which an HLA-A2402 molecule expressed on a target cell is bound to a specific epitope 'peptide in an Ep-CAM protein that can be recognized by CTL, or further It refers to a complex with ⁇ 2 microglobulin bound.
  • HLA- H2402 refers to the '24 polymorphism that is a sub-class of class I antigen among human leukocyte antigens
  • HLA- ⁇ 2402 molecule refers to the gene of HLA- ⁇ 2402. ⁇ ⁇ Expression products on the surface of antigen-presenting cells.
  • HLA- ⁇ 2402 molecule includes HLA- ⁇ 2402 molecule purified from E. coli culture for expression of HLA- ⁇ 2402, HLA- ⁇ 2402 molecule, target expressed by gene transfer into target cells Any of HLA— ⁇ 2402 molecule, etc. that are naturally expressed on the cells can be used.
  • the HLA-LA2402 molecule of the present invention also includes a fragment of HLA- ⁇ 2402 molecule and the heavy chain of HLA- ⁇ 2402 molecule.
  • the MHC of the present invention can be produced by various methods depending on its constituents.
  • the peptide of the present invention, HLA-—2402 molecule and j82 microglobulin are suspended in a buffer such as Tris, and the temperature is 4 It can be formed by incubating at about 10 ° C for about 24 to 72 hours.
  • MHC may be a tetramer! / ⁇ .
  • the MHC tetramer is a complex complex of an Ep-CAM epitope 'peptide that can be recognized by CTL and an HLA-A2402 molecule (usually an HLA-A2402 molecule bound with j82 microglobulin).
  • the MHC tetramer can be obtained by piotination of MHC and mixing 1: 4 with strepteptavidin and the piotinated complex.
  • a Piotin binding site was added to the C-terminus of the HLA molecule in advance, and after MHC formation, Piotin was bound to this site, and streptavidin and Pyotinylated MHC were mixed 1: 4. Can also be obtained.
  • an MHC tetramer can be prepared as follows.
  • MHC a large amount of HLA-A2402 heavy chain and j82 microglobulin are prepared and purified using a recombinant protein expression system using E. coli.
  • the amino acid sequence recognized by piotin ligase is added to the C-terminus of HLA A2402 heavy chain in advance. deep. Dissolve the purified HLA-A2402 heavy chain and
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in 200 ml of refolding buffer (pH 8.0; lOOmM Tris-HC1, 400 mM L-arginine—HC1, 2 mM EDTA, 0.5 mM oxidative glutathione, 5 mM reduced glutathione)
  • refolding buffer pH 8.0; lOOmM Tris-HC1, 400 mM L-arginine—HC1, 2 mM EDTA, 0.5 mM oxidative glutathione, 5 mM reduced glutathione
  • the refolding buffer containing MHC was kept at 4 ° C for 24 hours in 1.8 L of distilled water. Dialyze in the tank and concentrate the refolding buffer after dialysis to 2 ml using Centriprep 10 (MILLIPORE, Bedford, MA). Isolate the MHC that flows out at a molecular weight of about 45 KD by gel filtration chromatography using 7 hum of Superaex 200 HR (Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, 3 ⁇ 4weden). By force, the desired MHC tetramer can be produced.
  • piotin is bound to a specific site of the CLA terminal of the HLA-A2402 heavy chain using piotin ligase (AVIDITY, Denver, CO). Purify MHC with piotin by gel filtration chromatography using a Superdex 200 HR column.
  • PE-labeled streptavidin (Molecular Probe, Eugene, OR) and purified piotinylated MHC were mixed at a molar ratio of 1: 4, and the molecular weight was reduced to about 480 KD by gel filtration chromatography using a Superdex 200 HR column.
  • the MHC tetramer containing the amino acid sequence (R YQLDPKFI) represented by SEQ ID NO: 1 flowing out is isolated. Concentrate to approximately 3 mgZml using Centricon 10 (MILLIPORE) and store at 4 ° C. As preservatives, sodium azide, EDTA, leupeptin, and pepstatin may be added.
  • the MHC of the present invention can be used as a cancer vaccine. It can also be used for the production of CTL specific for epithelial cancer and the quantification of CTL specific for epithelial cancer in human peripheral blood.
  • Cancer vaccine 'CTL inducer The peptide of the present invention can be suitably used as an active ingredient of a cancer vaccine used for active immune vaccine therapy.
  • This cancer vaccine can be used for humans with HLA-A2402.
  • HLA-A2402-restricted CTL that specifically recognizes Ep-CAM is induced or activated.
  • epithelial cancer and the like can be treated or improved.
  • CTL in cancer patients is a population of cells that recognize multiple tumor antigens
  • one type of epitope 'peptide can be used as a cancer vaccine to combine more types of epitopes' peptides with cancer. A higher effect may be obtained when used as a vaccine. Therefore, the peptides of the present invention can be used singly or in combination of multiple types (plural types).
  • the mRNA of Ep-CAM containing the peptide of the present invention is expressed in lung cancer cell lines (QG56, LU99, LC99A, LCI sq, LC65A, and PC-9), colon cancer cell lines, gastric cancer cell lines (MKN28, MKN45). ), Oral cancer cell line (HSC-2), breast cancer cell line and leukemia cell line (K562).
  • lung cancer cell lines QG56, LU99, LC99A, LCI sq, LC65A, and PC-9
  • colon cancer cell lines gastric cancer cell lines (MKN28, MKN45).
  • breast cancer cell line and leukemia cell line K562
  • expression of Ep-CAM was also observed in various tissues derived from lung cancer, colon cancer, stomach cancer, breast cancer and oral cancer patients. Therefore, the peptide of the present invention is useful for the treatment or improvement of these cancers.
  • the peptide of the present invention can be formulated alone or together with various carriers.
  • the dosage form may be an oral administration agent or a parenteral administration agent.
  • parenteral agents are preferred. Examples of parenteral agents include subcutaneous injections, intramuscular injections, intravenous injections, and suppositories.
  • a preparation may be prepared together with excipients such as polymerized amino acid and albumin.
  • the peptides of the present invention can be used in neutral or salt form.
  • the pharmaceutically acceptable salt include salts of inorganic acids such as hydrochloric acid and phosphoric acid, and salts of organic acids such as acetic acid and tartaric acid.
  • the peptide of the present invention is formulated with a compound that interacts with itself or HLA-A2402 to enhance recognition of this peptide by CTL, or an antibody that immunologically recognizes this peptide.
  • the activity can be regulated.
  • Antigen-presenting cells and major histocompatibility antigen complexes pulsed with the peptide of the present invention can also be suitably used as cancer vaccines in the same manner.
  • the dosage form, administration target, applicable cancer type, effect, etc. are the same as those of the cancer vaccine having the peptide ability of the present invention.
  • the peptide of the present invention, antigen-presenting cell, and major histocompatibility antigen complex are each induced to induce Ep-CAM-specific HLA-A2402-restricted CTL by administration to a human having HLA-A2402 as a leukocyte antigen.
  • Epithelial cancer can be treated or improved through active activity.
  • the dose of the peptide of the present invention varies depending on the degree of recognition of this peptide by CTL, but for human adults, an active epitope 'peptide main body, for example, about 0. Olmg-lOOmgZ days, Preferably, it may be administered at about 0.1 mg to 30 mg Z days.
  • the administration interval may be appropriately determined according to the patient and the purpose of administration.
  • a mononuclear cell fraction is collected from the peripheral blood of a patient, cultured with the peptide of the present invention, and the mononuclear cell fraction in which CTL is induced and Z or activated is obtained from the patient's blood.
  • An effective cancer vaccine effect can also be obtained by returning to the inside.
  • Culture conditions such as the concentration of mononuclear cells at the time of culture and the concentration of the peptide of the present invention may be determined so that about 10 8 -10 1 G cells / day can be administered to human adults. These conditions can be easily determined by simple experiments.
  • a substance having lymphocyte proliferation ability such as interleukin 2 may be added during the culture.
  • the antigen-presenting cells are, for example, about 10 6 to 10 9 Z days, preferably about human adults. io 7 — io 8 doses should be administered for about Z days.
  • An effective cancer vaccine effect can also be obtained by co-culturing the mononuclear cell fraction collected from the patient's peripheral blood and the antigen-presenting cells of the present invention and returning them to the patient's blood.
  • the major histocompatibility antigen complex may be administered to a human adult, for example, about 1 lOOmgZ day, preferably about 5-50 mgZ day.
  • An effective cancer vaccine effect can also be obtained by co-culturing the mononuclear cell fraction collected from the patient's peripheral blood and the major histocompatibility antigen complex of the present invention and returning it to the patient's blood. .
  • polynucleotide-complement chain of the present invention is useful as a gene therapy agent for lung cancer, colon cancer, stomach cancer, breast cancer, oral cancer and the like.
  • the polynucleotide of the present invention may be carried on a vector and directly introduced into the body, or cells may be collected from a human and introduced into the body and then returned to the body.
  • a vector it is recommended to use a retrovirus that can be used without limitation for those known to be used for gene therapy such as retrovirus, adenovirus, and vaccinia virus. These viruses are replication-defective.
  • polynucleotide of the present invention can be introduced into cells by using a microindication that encapsulates the ribosome for delivery.
  • the gene therapy agent for cancer of the present invention includes a polynucleotide of the present invention alone, a recombinant vector containing the polynucleotide of the present invention, and a ribosome encapsulating the polynucleotide of the present invention. It may be in the form of
  • the dosage of the polynucleotide of the present invention varies depending on the degree of recognition of the peptide encoded by the polynucleotide by CTL.
  • the content of the polynucleotide moiety encoding the epitope 'peptide of the present invention is: For example, it may be about 0.1 ⁇ g—lOOmgZ days, preferably about 1 ⁇ g—50 mgZ days. This dose should be administered once every few days to several months.
  • the polynucleotide of the present invention can be used in combination with a site force-in such as IL2, or a substance that interacts with the polynucleotide of the present invention to enhance its expression.
  • a site force-in such as IL2
  • a substance that interacts with the polynucleotide of the present invention to enhance its expression IL2
  • the cytotoxic vaginal lymphocyte of the present invention is obtained by stimulating peripheral blood lymphocytes using any one or more of the following (a) to (d).
  • peripheral blood lymphocytes are cultured for about 7 to 14 days at a temperature of about 37 ° C in an RPMI1640 medium containing human serum, preferably with any one of the above (a) to (d). It is induced by this.
  • MHC major histocompatibility complex
  • CTLs are induced to bind to them. Therefore, CTL may be separated from MHC or its tetramer by an appropriate method.
  • CTL can be obtained, for example, by the following preparation method.
  • lymphocytes separated from peripheral blood are combined with the peptide of the present invention or antigen-presenting cells pulsed with this peptide at about 37 ° C in a carbon dioxide incubator. 7—Incubate for about 10 days. Subsequently, CTL is stimulated and proliferated by adding IL 2, PHA, anti-CD3 antibody, etc., and incubating for about 7 to 14 days.
  • the CTL specific for epithelial cancer thus obtained can be suspended in, for example, human albumin-containing PBS, and used as a passive immunotherapy for epithelial cancer.
  • the dosage form of the passive immunotherapeutic agent is usually an intramuscular injection, subcutaneous injection, intravenous injection or the like.
  • the stained CT L is isolated using a flow cytometer or a microscope.
  • lymphocytes that have also been separated from peripheral blood force in the flask and solid-phased MHC or its tetramer are mixed at a temperature of about 25 ° C. React for about a minute.
  • CTL specific for epithelial cancer remaining on the plate is suspended in a new culture medium.
  • CTL specific for epithelial cancer isolated in this way is necessary for use as a passive immunotherapeutic agent by stimulating with anti-CD3 antibodies, PHA, IL-2 and other T cell stimulating agents. Let it grow to the number of cells.
  • MHC-magnetic beads a conjugate
  • lymphocytes are separated from peripheral blood, etc., and MHC magnetic beads having an appropriate concentration are added thereto so that the lymphocyte: bead ratio is about 1: 5-20.
  • CTL specific for epithelial cancer isolated in this way is necessary for use as a passive immunotherapeutic agent by stimulating with T lymphocyte stimulating drugs such as anti-CD3 antibody, PHA, IL 2 etc. Let it grow to the number of cells.
  • the CTL of the present invention can treat or improve cancer by being administered as a passive immunotherapeutic agent to patients with epithelial cancer.
  • the dose varies depending patient and purpose of administration, to a human adult, for example, 10 7 - 10 1 1 / day, preferably about 10 8 - may be the io 1G pieces / day or so. This amount may be administered once every few days to several months.
  • CTL specific for epithelial cancer is a high-risk patient for cancer (such as those with reduced immune capacity due to some cause derived from cancer cells or tissue, patients with complications, elderly, young children, pregnant women, etc. ) Is important for cancer treatment management including proper use of anticancer drugs and chemotherapeutic agents. Quantification of HLA-A2402-restricted CTL specific for epithelial cancer can be performed by the following method.
  • the method comprises a step of causing any of the following (a) to (d) to act on peripheral blood, and a step of quantifying CTL in peripheral blood or the cytodynamic force produced by the peripheral blood.
  • the HLA-A2402-restricted CTL concentration in the test peripheral blood can be calculated by comparing the obtained value with the quantitative value obtained in the same manner using an HLA-A2402-restricted CTL solution with a known concentration. .
  • Examples of the method for quantifying HLA-A2402-restricted CTL induced by any of the above (a)-(d) or the site force-in produced by it include the following methods.
  • Stimulation of lymphocytes isolated from peripheral blood with the peptide of the present invention and the number of CTLs induced by the lymphocytes or the amount of site force-in (including chemokines) such as interferon ⁇ (lFN- ⁇ ) and interleukins produced by it Can be quantified.
  • site force-in including chemokines
  • IFN- ⁇ interferon ⁇
  • Peripheral blood force also the separated lymphocytes were suspended in RPMI1640 medium containing 10% human serum at a cell concentration of 2xl0 6 / ml, added CTL Epitopu 'peptides of the present invention at a concentration of 1 ⁇ gZml
  • CTL Epitopu 'peptides of the present invention at a concentration of 1 ⁇ gZml
  • Brefeldin A an intracellular protein transport inhibitor
  • the cells are fixed, subjected to membrane permeabilization, and reacted with a dye-labeled anti-IFN- ⁇ antibody. Quantify IFN- ⁇ positive cells in CD8 positive lymphocytes using a flow cytometer.
  • labeled CD8 positive cells can be quantified by using an anti-CD8 antibody instead of the dye-labeled anti-IFN- ⁇ antibody. Quantification of site power in (Eli Spot Atsey)>
  • a 96-well MultiScreen-- plate (Mil lipore) is coated with anti-IFN- ⁇ monoclonal antibody at 4 ° C, and each well is washed with PBS. Then, lymphocytes separated from peripheral blood are spread on each well. Epitope 'Peptide in each well 20% in a 37 ° C 5% CO incubator 20
  • Peripheral blood force also the separated lymphocytes were suspended in RPMI1640 medium containing 10% human serum at a cell concentration of 2xl0 6 / ml, Ru added CTL Epitopu 'peptides of the present invention at a concentration of 1 ⁇ gZml. Incubate for 24-48 hours at 37 ° C in a carbon dioxide oven. After incubation, the supernatant is collected, and the IFN-y concentration contained therein is quantified using a commercially available ELISA kit (for example, HUMAN IFN gamma ELISA from ENDOGEN).
  • a commercially available ELISA kit for example, HUMAN IFN gamma ELISA from ENDOGEN.
  • Lymphocytes are also separated from force such as peripheral blood, and reacted with MHC tetramer (streptavidin fluorescently labeled) with a concentration of about 100 / z gZml for 15 minutes at 37 ° C.
  • CTL that binds to MHC is stained by adding another fluorescently labeled antibody that binds to CTL that binds to MHC to the reaction solution.
  • Stained CTLs are flow cytometer or microscopic Count with a micro-mirror.
  • peripheral blood mononuclear cells PBMCs
  • Human lung cancer cell line large cell carcinoma LU990CRB0080) cell; human squamous cell carcinoma HSC-2QCRB0622) cell; human gastric cancer cell line squamous cell carcinoma MKN28 (JCRB0253) cell, M KN45QCRB0254) cell; and human colon
  • the cancer cell line squamous cell carcinoma COLO320DM OCRB0225 or ATCC: CCL-220) cells) was purchased from JCRB Cell Bank (Ministry of Health, Labor and Welfare: http://Cellbank.nihs.go.jp/).
  • Squamous cell carcinoma LC-1 / sq (RCB0455) a human lung cancer cell line, was purchased from RIKEN Cell Bank.
  • LCZsq cells were prepared by adding 45% RPMI1640 medium (Sigma) supplemented with a nutritional supplement containing 10% FCS, L-glutamine, penicillin, streptomycin, and strength namycin, and 45% Ham'sF12 (Sigma). ) Maintained in. COLO320DM cells and MKN28 were maintained in DMEM medium (Sigma). K562 cells were maintained in IMDM medium (Sigma) supplemented with nutritional supplements containing 10% FCS (Ushi Fetal Serum: Life Technologies), L-glutamine, penicillin, streptomycin, and kanamycin.
  • FCS Ushi Fetal Serum: Life Technologies
  • T2 (hereinafter referred to as “ ⁇ 2 cell”) was designated as HLA-A.
  • Cells expressing the HLA-A2402 binding peptide (hereinafter referred to as “T2-24 cells”) were obtained by introducing the 2402 gene.
  • T2-24 cells were cultured in IMDM medium (Iscove's modified Dulbecco's medium) supplemented with 10% fetal bovine serum, L-glutamine, penicillin, streptomycin, G418 (Gibconnet).
  • IMDM medium Iscove's modified Dulbecco's medium
  • HLA-A2402 coded retroviruses were isolated from QG56 HLA-A2402-negative cell line and A549 (JCRB0076) HLA. — Infected with A2402-negative cell line.
  • infected QG56 cells were maintained in complete medium containing a final concentration of 0.6 gZml of puromycin and designated QG56-A24.
  • infected A549 was maintained in complete medium containing a final concentration of 0.9 ⁇ g Zml puromycin and designated A549-A24.
  • HLA—A240 2-binding peptides within the Ep—CAM protein accession number: M33011
  • the World 'Wide' Website 'Bioinformatics & Molecular Analysis section BIMAS: BioInfomatics and molecular analysis section
  • Ep31 The seven peptides synthesized were named as Ep31, Epl73, Epl85, Ep250, Ep225, Ep296, and Ep304.
  • Ep31 The seven peptide sequence of the synthesized Ep-CAM is shown in Table 1.
  • HIV-l human immunodeficiency virus l envelope.
  • HLA—A2402 molecule Using HLA—A2402 monoclonal antibody (One Lambda, Inc.) and FITC-labeled anti-mouse IgG (a) fragment (Imnotech)
  • the indirect immunofluorescence antibody method was used.
  • the MHCZ peptide 'tetramer was produced according to the method described in the literature (Blood, 98: 1872-1881,2001, Science, 274: 94-96,1996).
  • CD8 positive T cell line or clone is Ep-CAM peptide, Epl73 (referred to as HLA-A2402 / E pl73 tetramer) or HIV-1 peptide, ENV584 (HLA-A2402 / EN V584 tetramer) was taken in! / And stained with phycoerythrin (PE) labeled HLA-A2402 tetramer.
  • Ep-CAM peptide Epl73
  • E pl73 tetramer HIV-1 peptide
  • ENV584 HLA-A2402 / EN V584 tetramer
  • T2- A24 cells (2xl0 5 cells) of 0. 1% FCS, 5x10- 5 M j8- 200 ⁇ L RPMI1640 medium containing mercaptoethanol and 10 mu concentration 26 ° to each peptide at C of ⁇ Incubated for 16 hours. The mixture was further incubated at 37 ° C for 3 hours. After incubation, cell surface HLA-A2402 molecules were stained with anti-HLA-A2402 monoclonal antibody and FITC-labeled antibody (3) above. Expression was measured by FACSCalibur and the mean fluorescence intensity (MFI) was recorded.
  • MFI mean fluorescence intensity
  • % MIF increase ⁇ (MIF in peptide-treated group-MIF in non-peptide-treated group) Z (MIF in non-peptide-treated group)
  • peptide ⁇ 173 (RYQLDPKFI) showed the highest degree of affinity with HLA- ⁇ 2402 molecule. Since Ep304 (EMGEMHREL) showed the lowest affinity, further experimental power was eliminated.
  • Peripheral blood monocyte-derived rod cells were produced according to the method of Dauer et al. (J. Immunono 70: 4069-4076). [0121] That is, cells adhering to plastic were isolated from peripheral blood mononuclear cells of HLA-A2402-positive healthy volunteers, 5% heat-inactivated human serum, ⁇ / z gZmL recombinant human 'interleukin 4 (hIL —4: manufactured by R & D Systems) and 50 ngZmL recombinant human “condylar granule macrophage” colony stimulating factor (hGM—CSF: manufactured by R & D Systems) were cultured in RPMI 1640 medium.
  • hIL —4 human 'interleukin 4
  • hGM—CSF human “condylar granule macrophage” colony stimulating factor
  • the cells produced appeared to express dendritic cell-associated antigens such as CDla, CD80, CD83, CD86, HLA class II molecules.
  • CD8 positive T lymphocytes were isolated from the same donor with the help of CD8 microbeads (Milteny Biotec).
  • rod-shaped cells ( 5 lxlO) were obtained from 10% human serum, 25 ng ZmL recombinant human IL-7 (R & D Systems), 5 ng / mL recombinant human IL-12 (R & D Systems).
  • rod-shaped cells ( 6 lxlO) in RPMI1640 medium supplemented with
  • T cells [0127] The specificity of T cells was tested by Elispot Atsey.
  • a flat bottom 96-well Multiscreen-HA plate (Millipore) with a nitrocellulose membrane was coated with 10 ⁇ gZmL of anti-IFN- ⁇ monoclonal antibody (R & D Systems), and the mixture was decanted at 4 ° C. After washing with PBS (phosphate buffered saline), the plate was blocked with culture medium at 37 ° C for 1 hour.
  • T2—A24 cells ( 4 x 5xl0) were placed in 100 L RPMI1640 medium with 0.1% FCS and 5xl0 5 M j8-mercaptoethanol in each well of the plate for 30 minutes at room temperature! The epitope candidate synthetic peptide was pulsed.
  • a total of 5 lxlO polyclonal CD8 positive T cells suspended in culture medium supplemented with concentrated FCS to a concentration of 20% was added to each well.
  • Figure 1 shows the results of Ellislot 'Athesi, the result of stimulating 5 HLA- ⁇ 2402-positive healthy donor CD8 positive ⁇ cells with autologous rod cells pulsed with each of the 6 peptides.
  • Polyclonal 'peptide activity ⁇ shows cytotoxic lymphocyte cell line evaluation.
  • IFN- ⁇ spots were specifically produced when incubated with Ep250-stimulated CTL strain Ep250 from donor number 3.
  • Fig. 2 shows the results of tetramer staining of ⁇ -CAM peptide-specific polyclonal and monoclonal CTL.
  • a in Figure 2 shows that the polyclonal CD8-positive T cells stimulated with Epl73 four times are loaded with FITC-labeled anti-CD8 antibody and Ep 173! /, PE-labeled HLA-A24 tetramer, or control . Stained with peptide ENV584 and analyzed by flow cytometry. The percentage of tetramer positive cells in all CD8 positive T cells is shown on the upper right.
  • the strength of tetramer positive cells was equal to and stronger than that of tetramer negative cells up to 2-3 log.
  • the present inventors established a T cell clone, C27, from the limiting dilution medium of the donor No. 4 Epl73-specific polyclonal CTL line.
  • Epl73-specific CTL clone power was established by vigorously.
  • CTL assembly CTL assembly
  • Chrominium-labeled cells were added to the total HLA class I, HLA- ⁇ 24, or HLA before adding C27.
  • Plates were incubated at 37 ° C for 4 hours and supernatants were counted in a ⁇ -counter.
  • the percent specific 51 Cr release was calculated as 100 x (experimental release-natural release) Z (maximum release-natural release).
  • FIG. 3 A shows the cytotoxicity of C27, Epl73-specific CTL clones against T2-A24 cells at the indicated concentrations of peptide Epl73 and the control peptide EBV—LMP419 at a single target ratio of 51. Specified by Cr free assembly.
  • Epl73-specific CTL clone, C27 showed cytotoxicity against T2—A24 cells pulsed with E p 173 at a low peptide concentration of ⁇ , but the control peptide EBV— Not shown for LMP419.
  • Fig. 5 and Table 2 show the results of cytotoxicity of C27 against various cancer cell lines.
  • a Average fluorescence intensity is HLA-A24mAb and FITC labeled anti-mouse l g G antibody
  • Table 2 shows the cytotoxicity results of C27, Ep 173-specific CTL clones against eight HLA-A24 positive cancer cell lines and HLA-A24 negative cancer cell lines as target cells.
  • the HLA-A2402 gene was retrovirally transformed into A549 and QG56, and transformants designated as A549-A24 and QG56-A24 were also used as target cells, respectively. Cytotoxicity is indicated for each indicated EF. Identified by 51 Cr free assembly at Kuta-to-target ratio (40: 1, 20: 1, 10, 1, 5: 1).
  • K562 is a representative cell line sensitive to natural killer cells.
  • C27 is a lung cancer cell line PC9, LU99, LC-lZ sq and LC99A, or oral squamous cell tumor cell line HSC-2, or HLA-A2
  • the gastric cancer cell line MKN45 expressing both 4 and Ep-CAM was efficiently damaged.
  • HLA-A24 positive Ep-CAM negative cell lines A549-A24 and COLO320DM
  • HLA-A24 negative and Ep-CAM positive cell lines or Ep-CAM negative cell lines OG56, A549, MNK28.
  • No killing effect was observed.
  • C27 killed the target cells. There was little damage to K562 cells.
  • Ep 173 specific CTL killed tumor cells expressing both HLA-A24 and Ep-CAM.
  • B in FIG. 3 shows the inhibitory effect of the anti-HLA-A24 monoclonal antibody on the cytotoxicity of H27-A2402-positive cell line, Epl73-specific CTL clone against PC9, and C27.
  • C27 is cytotoxic to PC9 cells of the lung cancer cell line (HLA-A24 positive Ep-CAM positive lung cancer cell line). Force blocked by specific monoclonal antibody S, force blocked by anti-HLA-A2 monoclonal antibody.
  • C shows the result of the cold target inhibition process.
  • the horizontal axis shows the number ratio between T2—A24 cells (cold) pulsed with Ep 173 ( ⁇ ) or control EBV—LMP419 (country) peptide and chrominium-labeled PC9 cells (hot).
  • the vertical axis shows the cytotoxicity of PC9 cells by C27 as a percentage. Open 'circles show cytotoxicity without cold targets.
  • RT-PCR was performed using a thermal cycler (Perkin Elmer), and PCR products were analyzed by 1.5% gel electrophoresis and ethidium bromide visualization.
  • PCR consists of 1 cycle at 94 ° C for 5 minutes, 30 seconds at 94 ° C, 30 seconds at 58 ° C, 30 cycles at 1 minute at 72 ° C, 7 minutes at 72 ° C It was performed under the condition of one cycle.
  • Proteins were visualized using an ECL Western 'plot detection system (Amersham's Biosciences).
  • Fig. 4 shows the results of testing Ep-CAM expression in cancer cell lines by RT-PCR and Western plot analysis.
  • A24 was tested by an indirect immunofluorescence test using anti-HLA-A24 monoclonal antibody. Of the 15 cancer cell lines tested, 10 were positive for HLA-A24 expression o
  • the present inventors obtained a novel HLA-A2402-restricted epitope derived from Ep-CAM. At least the epitope peptide, Epl73 (RY QLDPKFI; SEQ ID NO: 1) has the ability to induce CTL possessing a high affinity T cell receptor directed against the HLA A2402Z peptide complex. I can expect therapy.
  • the peptide of the present invention can be suitably used as a cancer vaccine against a wide range of human epithelial cancers having HLA-A2402.

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Abstract

　配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド；配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチド；又は配列番号１若しくは２において１若しくは２以上のアミノ酸が付加、欠失又は置換されたアミノ酸配列からなり、かつＨＬＡ−Ａ２４０２分子と複合してＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性細胞傷害性Ｔリンパ球に認識され得る又はこれを誘導し得る変異体ペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２４０２を有する上皮性癌患者に対する癌ワクチンとして有用である。

Description

HLA— A2402拘束性 Ep— CAM特異的 CTLが認識するェピトープ'ぺ プチド及びその用途
技術分野
[0001] 本発明は、 HLA— A2402拘束性細胞傷害性 Tリンパ球が認識するェピトープ'ぺ プチド、抗原提示細胞及び主要組織適合抗原複合体、これらを有効成分とする癌ヮ クチン又は細胞傷害性 Tリンパ球誘導剤、この細胞傷害性 Tリンパ球誘導剤を有効 成分とする上皮性癌に対する受動免疫療法剤、これらを用いた癌の治療又は改善 方法、及び、癌に特異的な HLA - A2402拘束性細胞傷害性 Tリンパ球の定量方法 に関する。
背景技術
[0002] 細胞傷害性 Tリンパ球（Cytotoxic T Lymphocyte：以下、「CTL」と略称する)は癌に 対する抵抗における重要な因子の一つと考えられて 、る。
[0003] 癌患者の腫瘍局所には腫瘍細胞に対して傷害活性を示す CTLの浸潤が認められ る。この腫瘍特異的な CTLの標的分子である腫瘍抗原は、細胞内で分解されて 8— 11個のアミノ酸力 なるペプチド (腫瘍ェピトープ'ペプチド）になり、主要組織適合 性抗原であるヒト白血球抗原 (以下、「HLA」 ヽぅ）分子と結合して腫瘍細胞表面上 に提示される。 CTLは HLAと腫瘍抗原ペプチドとからなる複合体を認識して腫瘍細 胞を傷害する。このように、 CTLは HLA拘束性に腫瘍細胞を認識する。
[0004] HLAは、ほとんど全ての細胞上に発現している細胞膜抗原であり、クラス I抗原とク ラス Π抗原に大別される。 CTLによりェピトープ'ペプチドと共に認識される HLAはク ラス I抗原である。 HLAクラス I抗原はさらに HLA— A、 HLA— B、 HLA— C等に分類 され、それらの遺伝子にはサブタイプがあり、例えば、 HLA— Aには Al、 A2、 A24、 および A26等の多型が存在している。そのため、それぞれのヒト個人が有する HLA の型は必ずしも同一ではなぐ CTLは HLAクラス I抗原と腫瘍ェピトープ 'ペプチドと の複合体を認識するとき、 HLAの型をも認識する。さらに、 HLAに結合可能なェピト ープ 'ペプチドには、 HLAの型毎に結合し得るペプチド配列にモチーフ（規則的配 列）があることが知られている。従って、 CTLを誘導及び Z又は活性ィ匕するためには 、患者毎に異なる各型の HLAに結合し得るモチーフ力 なるペプチドを選択する必 要がある。
[0005] Ep— CAMは、上皮細胞由来の癌細胞の表面に広く発現している分子であり、カル シゥムイオン非依存性の細胞-細胞間接着を媒介する。 Ep-CAMは、 EGP— 2、 17 — 1A、 GA733— 2又は KSAとも称されている。 Ep— CAMは、大腸、肺、頭頸部、乳 腺など、多様な組織学的起源に由来する多くの腫瘍において高発現しており、正常 上皮細胞においては発現が限局されている。また、腫瘍進展の程度と Ep— CAMの 発現量とが相関していることから、 Ep— CAMの発現検出は、腫瘍の微小転移の診断 又は生存予測のためのマーカーとして有用とされて 、る。
[0006] Ep— CAMは、上皮細胞由来の癌細胞に広く発現しているが正常細胞では発現が 限局されて ヽるため、モノクローナル抗体を使用する免疫療法や遺伝子治療の主要 な標的の一つになっている。
[0007] 例えば外科手術後に Ep— CAM特異的マウス ·モノクローナル抗体 (17-1Aと名づけ られているもの)を投与することにより、遠隔転移が予防されるとともに、 7年間連続投 与により延命効果が見られたことが報告されて 、る。また 17— 1Aと名づけられて 、る Ep— CAMに対するモノクローナル抗体を用いて大腸癌患者の治療を行ったところ、 死亡率と再発率が低下したことが報告されて！ヽる。
[0008] さらに近年、 HLA拘束性の Ep— CAMを標的とする CTLを用いる癌治療の可能性 を示す事実が幾つか報告されてきて ヽる。
[0009] 例えば特許文献 1には、 HLA— A0201拘束性 Ep— CAMに特異的な CTLが上皮 腫瘍細胞を破壊するが、正常細胞に影響を与えないことが報告されている。特許文 献 1は、 HLA— A0201拘束性 CTLが認識する Ep— CAM174— 184ェピトープ'ぺ プチドとして、配列番号 12に記載の YQLDPKFITSIの配列からなるペプチドを開示し ている。
[0010] また Ep-CAMに対する T細胞応答が、免疫治療を受けて 、な 、結腸大腸癌患者 において観察されている。カロえて、 Ep— CAMを発現する組み換え体力ナリヤボック スウィルスで大腸癌患者を免疫したところ、自己免疫応答を起こすことなく抗 Ep— CA Mの CTL応答が誘導された。
[0011] HLAクラス I抗原の HLA— Aの中で、 日本人に最も多く発現しているのは、 HLA—
A24である。従って、 HLA— A24拘束性の Ep— CAMェピトープ 'ペプチドは、癌ワク チンとして好適に使用できると考えられる。このようなェピトープペプチドとしては、例 えば以下のものが報告されて 、る。
[0012] 特許文献 2は、 HLA— A2402拘束性 CTLェピトープ'ペプチドとして SART— 2腫 瘍抗原蛋白質に対する 9個のアミノ酸配列力 なる 5種のェピトープ'ペプチドを開示 している。
[0013] また特許文献 3は、肺腺癌患者カゝら得られた HLA— A2402拘束性 CTLェピトープ •ペプチドとして ART— 4腫瘍抗原蛋白質に対する 8— 11個のアミノ酸配列力 なる 6 種のェピトープ'ペプチドを開示している。
[0014] また特許文献 4は、食道癌患者カも榭立した細胞株力も得られた HLA— A2402拘 束性 CTLェピトープ'ペプチドとして、大腸癌細胞と小細胞性肺癌細胞において異 常に発現して ヽる p561uk蛋白質 (luk遺伝子がコードする腫瘍抗原蛋白質)の 8— 11 個のアミノ酸配列力もなる 7種のェピトープ ·ペプチドを開示している。
[0015] また特許文献 5は、食道癌患者カも榭立した細胞株力も得られた HLA— A2402拘 束性 CTLェピトープ ·ペプチドとして、 KE4腫瘍細胞株由来の cDNAライブラリ一か ら得られた PI— 9由来ペプチドの 9一 10個のアミノ酸配列力もなる 4種のペプチドを開 示している。
[0016] また特許文献 6は、肺癌患者カも榭立した細胞株力も得られた HLA— A2402拘束 性 CTLェピトープ'ペプチドとして、 11—18肺腺癌細胞株の cDNAライブラリーから 得られた PI— 9由来ペプチドの 9一 10個のアミノ酸配列からなる 17種のェピトープ · ペプチドを開示している。
[0017] また特許文献 7は、 HLA-A24. 1 (HLA— A2402)結合性モチーフを有するェピ トープ 'ペプチドであって、 N末端部分に Y、 F、 Wの第 1保存残基を有し、 C末端部 分に F、 I、 W、 Mの第 2保存残基を有し、第 1保存残基と第 2保存残基とが 6— 7残基 隔てられて 、る、 9一 10アミノ酸残基力もなるペプチドを開示して 、る。
[0018] このように、腫瘍関連抗原の種々の HLA— A2402拘束性 CTLェピトープが同定さ れているが、腫瘍抗原の発現は、組織学的な起源間、癌患者間及び個々の病変間 で異なるため、さらに新しいェピトープを特定することが求められている。
[0019] また、 HLA— A2402分子に結合できる Ep— CAMのェピトープ'ペプチドによる CT L誘導は未だ確認されて 、な 、ことから、 HLA— A2402分子に結合できる癌細胞に 特異的な Ep— CAMェピトープ'ペプチドであって CTL誘導できるものを新たに開発 することが望まれている。
特許文献 1： W097/15597号国際公報
特許文献 2 :特開平 11-318455号
特許文献 3：特開 2000-116383号
特許文献 4： WO2000-06595号
特許文献 5：特開 2001-245675号
特許文献 6：特開 2003-270号
特許文献 7：特表平 8-500103号 (請求項 11など）
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0020] 本発明は、 HLA— A2402拘束性細胞傷害性 Tリンパ球を誘導できる Ep— CAMェ ピトープ'ペプチド、抗原提示細胞及び主要組織適合抗原複合体、それらを有効成 分とする癌ワクチン又は細胞傷害性 Tリンパ球誘導剤、 Ep— CAM特異的な HLA— A 2402拘束性細胞傷害性 Tリンパ球、それを有効成分とする受動免疫療法剤、これら を用いた癌の治療又は改善方法、並びに、上皮性癌に特異的な HLA - A2402拘 束性細胞傷害性 Tリンパ球の定量方法を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0021] 上記課題を達成するために本発明者らは、日本人において最も多い HLA— Aの型 であり (60%以上)、かつヨーロッパ人の約 20%にも存在する HLA— A2402分子に結 合することができるェピトープ ·ペプチド配列を見つけるため、先ずバイオインフォマ テイク'アプローチにより Ep— CAM中の 7個のペプチド配列を推測し、これらを合成し た。
[0022] ノィォインフォマテイク'アプローチにより特定 HLA分子に結合し得るペプチドを予 測した場合に、この予測されたペプチドが誘導する細胞傷害性 Tリンパ球が、実際に は、そのペプチドを含む抗原を認識しない場合も多い。
[0023] このような状況の下で、本発明者は、推測された 7個のペプチドのうちの 2個のェピ トープ 'ペプチドに特異的な CTLクローン力 実際に HLA— Α2402陽性 Ερ— CAM 発現癌細胞に対して細胞傷害性を示すが、 HLA - A2402陰性癌細胞に対しては 細胞傷害性を示さな 、ことを見出した。
[0024] また、コールドターゲットインヒピションアツセィによれば、これらのェピトープ 'ぺプ チドは、 HLA— A2402陽性 Ep— CAM陽性癌細胞の表面上において処理され、抗 原提示された。
[0025] これらの結果、この 2個のェピトープ 'ペプチドは、 HLA— A2402を保有する人に 対する癌ワクチンとして使用できる。
[0026] 本発明は、上記知見に基づき完成されたものであり、以下のェピトープ 'ペプチドな どを提供する。
項 1. 以下の (1)、（2)、（3)又は (4)のペプチド。
(1) 配列番号 1に記載のアミノ酸配列力 なるペプチド
(2) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列力 なるペプチド
(3) 配列番号 1において 1又は 2以上のアミノ酸が付加、欠失又は置換されたァミノ 酸配列からなり、かつ HLA— A2402分子と複合して HLA— A2402拘束性細胞傷害 性 Tリンパ球に認識され得る又はこれを誘導し得る変異体ペプチド
(4) 配列番号 2において 1又は 2以上のアミノ酸が付加、欠失又は置換されたァミノ 酸配列からなり、かつ HLA— A2402分子と複合して HLA— A2402拘束性細胞傷害 性 Tリンパ球に認識され得る又はこれを誘導し得る変異体ペプチド
項 2. 以下の (1)又は (2)のペプチド。
(1) 配列番号 1に記載のアミノ酸配列力 なるペプチド
(2) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列力 なるペプチド
項 3. 項 1又は 2に記載のペプチドを有効成分として含む癌ワクチン。
項 4. 癌が上皮性癌である項 3に記載の癌ワクチン。
項 5.癌が大腸癌、肺癌、乳癌、胃癌、口腔癌、膝癌、食道癌、上咽頭癌、子宮癌、 前立腺癌、胆嚢癌力 なる群より選ばれる癌である項 3又は 4に記載の癌ワクチン。 項 6. 白血球抗原として HLA— A2402を有するヒトのための項 3、 4又は 5に記載の 癌ワクチン。
項 7. 項 1又は 2に記載のペプチドを有効成分として含む細胞傷害性 Tリンパ球の 誘導剤。
項 8. 白血球抗原として HLA— A2402を有するヒトのための項 7に記載の細胞傷害 性 Tリンパ球の誘導剤。
項 9. 以下の (5)、（6)、（7)又は (8)のポリヌクレオチド。
(5) 配列番号 10に記載の塩基配列力もなるポリヌクレオチド
(6) 配列番号 11に記載の塩基配列力 なるポリヌクレオチド
(7) 配列番号 10に記載の塩基配列力もなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件 下でハイブリダィズし、かつ、 HLA— A2402分子と複合して HLA— A2402拘束性細 胞傷害性 Tリンパ球に認識され得る又はこれを誘導し得るペプチドをコードする変異 体ポリヌクレオチド
(8) 配列番号 11に記載の塩基配列力 なるポリヌクレオチドとストリンジ ントな条件 下でハイブリダィズし、かつ、 HLA— A2402分子と複合して HLA— A2402拘束性細 胞傷害性 Tリンパ球に認識され得る又はこれを誘導し得るペプチドをコードする変異 体ポリヌクレオチド
項 10. 項 9に記載のポリヌクレオチドを有効成分として含む上皮性癌の遺伝子治療 剤。
項 11. 項 9に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
項 12. 項 11に記載の組換えベクターが導入された形質転換体。
項 13. 項 12に記載の形質転換体を培養する工程と、培養物力も項 1又は 2に記載 のペプチドを回収する工程とを含む項 1又は 2に記載のペプチドの製造方法。
項 14. 項 1又は 2に記載のペプチドがパルスされた抗原提示細胞。
項 15. 項 14に記載の抗原提示細胞を有効成分として含む癌ワクチン。
項 16. 癌が上皮性癌である項 15に記載の癌ワクチン。
項 17.癌が大腸癌、肺癌、乳癌、胃癌、口腔癌、膝癌、食道癌、上咽頭癌、子宮癌、 前立腺癌、胆嚢癌力 なる群より選ばれる癌である項 15又は 16に記載の癌ワクチン 項 18. 白血球抗原として HLA— A2402を有するヒトのための項 15、 16又は 17に 記載の癌ワクチン。
項 19. 項 14に記載の抗原提示細胞を有効成分として含む細胞傷害性 Tリンパ球 の誘導剤。
項 20. 白血球抗原として HLA— A2402を有するヒトの治療のための項 19に記載 の細胞傷害性 Tリンパ球の誘導剤。
項 21. 項 1又は 2に記載のペプチド又は項 14に記載の抗原提示細胞上に提示さ れた腫瘍抗原ェピトープ ·ペプチドと、主要組織適合抗原とが複合した主要組織適 合抗原複合体。
項 22. 項 1又は 2に記載のペプチド又は項 14に記載の抗原提示細胞上に提示さ れた腫瘍抗原ェピトープ 'ペプチドと、 HLA— A2402分子と、 β 2ミクログロブリンとの 複合体である項 21に記載の主要組織適合抗原複合体。
項 23. 項 21又は 22に記載の主要組織適合抗原複合体を有効成分として含む癌 ワクチン。
項 24. 癌が上皮性癌である項 23に記載の癌ワクチン。
項 25.癌が大腸癌、肺癌、乳癌、胃癌、口腔癌、膝癌、食道癌、上咽頭癌、子宮癌、 前立腺癌、胆嚢癌力もなる群より選ばれる癌である項 23又は 24に記載の癌ワクチン 項 26. 白血球抗原として HLA— Α2402を有するヒトの治療のための項 23、 24又は 25に記載の癌ワクチン。
項 27. 項 21又は 22に記載の主要組織適合抗原複合体を有効成分として含む細 胞傷害性 Τリンパ球の誘導剤。
項 28. 白血球抗原として HLA— Α2402を有するヒトの治療のための項 27に記載 の細胞傷害性 Τリンパ球の誘導剤。
項 29. 項 1又は 2に記載のペプチド又は項 14に記載の抗原提示細胞上に提示さ れた腫瘍抗原ェピトープ ·ペプチドと、主要組織適合抗原とが複合した主要組織適 合抗原複合体のテトラマー。
項 30. 以下の (a)— (d)のいずれか 1以上を用いて末梢血リンパ球を刺激することに より得られる細胞傷害性 Tリンパ球。
(a) 項 1又は 2に記載のペプチド
(b) 項 14に記載の抗原提示細胞
(c) 項 21又は 22に記載の主要組織適合抗原複合体
(d) 項 29に記載の主要組織適合抗原複合体のテトラマー
項 31. 前記 (a)— (d)のいずれか 1以上を用いて末梢血リンパ球を刺激することにより 主要組織適合抗原複合体又は Z及びそのテトラマーと細胞傷害性 Tリンパ球との結 合体を形成し、この結合体から単離することにより得られるものである項 30に記載の 細胞傷害性 Tリンパ球。
項 32. 項 30又は 31に記載の細胞傷害性 Tリンパ球を有効成分として含む癌の受 動免疫療法剤。
項 33. 癌が上皮性癌である項 32に記載の受動免疫療法剤。
項 34.癌が大腸癌、肺癌、乳癌、胃癌、口腔癌、膝癌、食道癌、上咽頭癌、子宮癌、 前立腺癌、胆嚢癌力もなる群より選ばれる癌である項 32又は 33に記載の受動免疫 療法剤。
項 35 白血球抗原として HLA— A2402を有するヒトのための項 32、 33又は 34に記 載の受動免疫療法剤。
項 36. 末梢血に以下の (a)— (d)のいずれかを作用させる工程と、
(a) 項 1又は 2に記載のペプチド
(b) 項 14に記載の抗原提示細胞
(c) 項 21又は 22に記載の主要組織適合抗原複合体
(d) 項 29に記載の主要組織適合抗原複合体のテトラマー
末梢血中の細胞傷害性 T細胞又はそれが産生するサイト力インを定量する工程と を含む末梢血中の HLA - A2402拘束性細胞傷害性 Tリンパ球の定量方法。
項 37. 白血球抗原として HLA— A2402を有するヒトに、以下の (a)— (d)のいずれか 1以上を投与する癌の治療又は改善方法。 (a) 項 1又は 2に記載のペプチド
(b) 項 14に記載の抗原提示細胞
(c) 項 21又は 22に記載の主要組織適合抗原複合体
(d) 項 29に記載の主要組織適合抗原複合体のテトラマー
項 38. 白血球抗原として HLA— A2402を有するヒトの末梢血から単核細胞画分を 採取する工程と、
単核細胞画分を以下の (a)— (d)のいずれか 1以上と共に培養する工程と、
(a) 項 1又は 2に記載のペプチド
(b) 項 14に記載の抗原提示細胞
(c) 項 21又は 22に記載の主要組織適合抗原複合体
(d) 項 29に記載の主要組織適合抗原複合体のテトラマー
細胞傷害性 Tリンパ球が誘導及び Z又は活性化された単核細胞画分を患者の血 液中に戻す工程と
を含む癌の治療又は改善方法。
項 39. 白血球抗原として HLA— A2402を有するヒトに、以下の (a)— (d)のいずれか 1以上を投与する細胞傷害性 Tリンパ球の誘導方法。
(a) 項 1又は 2に記載のペプチド
(b) 項 14に記載の抗原提示細胞
(c) 項 21又は 22に記載の主要組織適合抗原複合体
(d) 項 29に記載の主要組織適合抗原複合体のテトラマー
項 40. 白血球抗原として HLA— A2402を有するヒトに、項 30又は 31に記載の細 胞傷害性 Tリンパ球を投与する癌の治療又は改善方法。
項 41. 項 1又は 2に記載のペプチド又は項 14に記載の抗原提示細胞上に提示さ れた腫瘍抗原ェピトープ 'ペプチドと、 HLA— A2402分子と、 β 2ミクログロブリンとの 複合体のテトラマーである項 21に記載の主要組織適合抗原複合体のテトラマー。 項 42. 項 41に記載の主要組織適合抗原複合体のテトラマーを有効成分として含 む癌ワクチン。
項 43. 癌が上皮性癌である項 42に記載の癌ワクチン。 項 44.癌が大腸癌、肺癌、乳癌、胃癌、口腔癌、膝癌、食道癌、上咽頭癌、子宮癌、 前立腺癌、胆嚢癌力 なる群より選ばれる癌である項 42又は 43に記載の癌ワクチン 項 45. 白血球抗原として HLA— A2402を有するヒトの治療のための項 42、 43又は 44に記載の癌ワクチン。
項 46. 項 41に記載の主要組織適合抗原複合体のテトラマーを有効成分として含 む細胞傷害性 Tリンパ球の誘導剤。
項 47. 白血球抗原として HLA— A2402を有するヒトの治療のための項 46に記載 の細胞傷害性 Tリンパ球の誘導剤。
発明の効果
[0027] 本発明によれば、上皮性癌細胞に広く発現している Ep— CAM分子のェピトープ' ペプチドであって、 日本人の白血球抗原の型として多く見られる HLA— A2402拘束 性の細胞傷害性 Tリンパ球に認識され得るものが提供された。従って、このェピトー プ 'ペプチドは、 HLA— A2402を有する広範囲のヒトの上皮性癌に対する癌ワクチン として使用できる。
図面の簡単な説明
[0028] [図 1]図 1は、エリスポット'アツセィによるポリクローナル ·ペプチド活性ィ匕 CTL細胞株 の評価の結果を示す図である。
[図 2]図 2は、 Ep— CAMペプチド特異的ポリクローナル (A)及びクローナル（B) CTL のテトラマー染色の結果を示す図である。
[図 3]図 3は、 Ep 173特異的 CTLクローンの特性結果を示す図である。
[0029] 図 Aは、ペプチド Epl73及びコントロール ·ペプチド EBV— LMP419の T2— A24細 胞に対する C27、 Ep 173特異的 CTLクローンの細胞傷害性の結果を示す51 Cr遊離 アツセィの図面である。
[0030] 図 Bは、 HLA— A2402陽性細胞株、 PC9に対する Epl73特異的 CTLクローン、 C 27の細胞傷害性に関する抗 HLA— A24モノクローナル抗体の抑制効果を示す図面 である。
[0031] 図 Cは、コールドターゲットインヒピションアツセィにおける Epl73による C27の細胞 傷害性を示す図面である。
[図 4]図 4は、 Ep— CAMの PCR分析の結果を示す図面である。
[図 5]図 5は、各種癌細胞株に対する C27、 Epl73特異的 CTLクローンの細胞傷害 性を示す図面である。
発明を実施するための最良の形態
[0032] 以下、本発明を詳細に説明する。
(I)ェピトープ*ペプチド
本発明のペプチドは、上皮性細胞由来の癌に広く発現している Ep— CAMタンパク 質のアミノ酸配列について、 HLA— A2402の結合モチーフを有する 9一 10個のアミ ノ酸力 なるェピトープ ·ペプチドを検索し得る照合媒体であるワールド ·ワイド ·ウェブ サイト.バイオインフォマティクス &分子分析セクション（Biolnformatics & Molecular Analysis Section (BIMAS)の HLA Peptide Binding Predictions (
http://Dimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/index.html.)〖こよって照合し、ェピト ~~プ' ペプチドとなり得るペプチドをスクリーニングした結果、細胞傷害性 Tリンパ球 (以下、 「CTL」と略称する）ェピトープ'ペプチドとして確認されたものである。
[0033] 即ち、本発明のペプチドは、以下の (1)、（2)、（3)又は (4)のペプチドである。
(1) 配列番号 1に記載のアミノ酸配列力 なるペプチド
(2) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列力 なるペプチド
(3) 配列番号 1において 1又は 2以上のアミノ酸が付加、欠失又は置換されたァミノ 酸配列からなり、かつ HLA— A2402分子と複合して HLA— A2402拘束性細胞傷害 性 Tリンパ球に認識され又はこれを誘導し得る変異体ペプチド
(4) 配列番号 2において 1又は 2以上のアミノ酸が付加、欠失又は置換されたァミノ 酸配列からなり、かつ HLA— A2402分子と複合して HLA— A2402拘束性細胞傷害 性 Tリンパ球に認識され又はこれを誘導し得る変異体ペプチド
本発明において、ペプチドとは、隣接するアミノ酸残基の α—アミノ基とカルボキシ ル基との間がペプチド結合により相互に結合したアミノ酸分子鎖であって生理活性を 有するものを意味する。 [0034] またペプチドには、当該ペプチドの他にその生理活性を損なわない範囲で、その 塩又は誘導体が含まれる。誘導体としては、グリコシル化、アミド化、ホスホリル化、力 ルボキシル化、リン酸化、ホルミル化、ァシル化などされたものが挙げられる。また、 塩としては酸付加塩が好ましい。酸付加塩としては、塩酸、リン酸、硫酸等の無機酸 との塩、蟻酸、酢酸、プロピオン酸、酒席酸等の有機酸との塩が挙げられる。
[0035] (1)一 (4)の各ペプチドは、上皮性細胞由来の癌細胞に広く発現している Ep— CAM のェピトープ.ペプチドであって、 HLA— A2402拘束性 CTLにより認識され若しくは これを誘導し、又はさらに CTLを活性ィ匕できるものである。従って、 CTLを誘導又は 活性ィ匕する腫瘍抗原、すなわち癌ワクチンとして、 HLA— A2402を有するヒトの癌の 治療又は改善に好適に使用できる。またこれらのペプチドは、腫瘍抗原ェピトープを 特定した各種ペプチドの作製のために使用できる。本発明のペプチドの用途につい ては、後に詳述する。
[0036] (3)及び (4)の変異体ペプチドのアミノ酸数の下限は、通常 5個程度、好ましくは 7個 程度である。またアミノ酸数の上限は、 HLA— A2402拘束性 CTLに認識される限り 特に限定されないが、通常 12個程度である。中でも、アミノ酸数 9一 11個程度の変 異体ペプチドが好ましい。
[0037] これらの変異体ペプチドは、例えば、上記の HLA Peptide Binding Predictionに照 合することにより HLA— A2402結合モチーフに適合するものを設計し、その中から、 実際に HLA— A2402拘束性 CTLに認識され又はこれを誘導するものを選択するこ とにより得ることができる。
[0038] HLA— A2402陽性 Ep— CAMェピトープ'ペプチドであるか否かは、例えば以下の 方法で判定できる。
[0039] 10%ヒト血清含有 RPMI1640培地に 2xl06/mlの細胞濃度で HLA— A2402陽 性の成人から分離したリンパ球を浮遊し、これにェピトープ候補ペプチドの中の任意 の 1種を 1 μ gZmlの濃度でカ卩える。これを炭酸ガス恒温槽にて 37°Cで 7日間培養 する。 7日目に IL-2を添加する。候補ペプチドによる刺激と IL-2による刺激とからな るサイクルを以後週に 1回繰り返すことにより、特異的な CTLを誘導する。
[0040] このようにして誘導した上皮性癌特異的な CTLをェピトープ候補ペプチドが刺激す るか否かをエリスポットアツセィ（Kuzushima K他著、 The Journal of Clinical
Investigation, 104卷: 163- 171頁, 1999年等）により判定する。
[0041] 上記候補ペプチドは、 Ep— CAMタンパク質全体を網羅する 20個前後のアミノ酸よ りなるペプチドライブラリーを合成し、合成したペプチドに対して上記エリスポットアツ セィを行い、 CTLが反応したペプチドについて順次短くし、最終的に 9一 10個程度 のアミノ酸力 なるペプチドを本発明のェピトープ'ペプチドとすればよい。
[0042] またアミノ酸の置換の場合には、タンパク質の構造保持の観点から、電荷、可溶性 、親水性 Z疎水性、極性等の点で、置換前のアミノ酸と類似した性質を有するァミノ 酸に置換することにより、同等の活性を有する変異体ペプチドを得易い。
[0043] 欠失、付加 (挿入を含む)又は置換の変異を導入する手法は周知であり、例えばゥ ルマーの技術（Science,219,666(1983》を利用できる。
[0044] 本発明のペプチドは、糖類、ポリエチレングリコール、脂質等が付加された複合体、 放射性同位元素等による誘導体又は重合体等の形態として用いることができる。
(Π)ポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドは、上記本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドで あり、具体的には、以下の (5)、（6)、（7)又は (8)のポリヌクレオチドである。
(5) 配列番号 10に記載の塩基配列力もなるポリヌクレオチド
(6) 配列番号 11に記載の塩基配列力 なるポリヌクレオチド
(7) 配列番号 10に記載の塩基配列力もなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件 下でハイブリダィズし、かつ、 HLA— A2402分子と複合して HLA— A2402拘束性細 胞傷害性 Tリンパ球に認識され得る又はこれを誘導できるペプチドをコードする変異 体ポリヌクレオチド
(8) 配列番号 11に記載の塩基配列力 なるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件 下でハイブリダィズし、かつ、 HLA— A2402分子と複合して HLA— A2402拘束性細 胞傷害性 Tリンパ球に認識され得る又はこれを誘導できるペプチドをコードする変異 体ポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドには、特に言及しない限り、 DNA及び RNAの双方が含ま れる。 DNAには、 cDNA、ゲノム DNA及び合成 DNAが含まれる。 RNAには、 mRNA、 rRNA及び合成 RNAが含まれる。また、その塩基配列を有するポリヌクレオチドの他、 それに相補的なポリヌクレオチド及び 2本鎖ポリヌクレオチドも含まれる。
[0045] 配列番号 1のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの一つである配列番号 10の 塩基配列からなるポリヌクレオチド、及び、配列番号 2のアミノ酸配列をコードするポリ ヌクレオチドの一つである配列番号 11の塩基配列力 なるポリヌクレオチドは、ヒト癌 関連抗原 GA733—2(Szala, S., et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87 (9), 3542-3546 (1990》により得られた Ep— CAM遺伝子の部分配列である。
[0046] (7)又は (8)の変異体ポリヌクレオチドは、本発明のェピトープ 'ペプチドをコードする 領域に対応して、通常 15個以上、好ましくは 21個以上、通常 45個以下のヌクレオチ ドカもなるものであればよい。中でも、ヌクレオチド数 27— 33個程度のポリヌクレオチ ドであることが好ましい。
[0047] ポリヌクレオチド分子として DNA分子を代表例にとると、「DNA分子にストリンジェ ントな条件下でハイブリダィズする DNA分子」は、例えば Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook,ら編、コーノレド 'スプリング'ノヽーノ ー 'ラボラトリー 'プ レス、コールド 'スプリング'ノヽーバー、ニューヨーク、 1989年)等に記載の方法によつ て得ることができる。本発明において、「ストリンジェントな条件下でノヽイブリタイズする 」条件としては、例えば、 6 X SSC、 0. 5%SDSおよび 50%ホルムアミドの溶液中で 42°Cで加温した後、 0. 1 X SSC、 0. 5%SDSの溶液中で 68°Cで洗浄した場合に、 陽性のハイプリタイズのシグナルが観察される条件が挙げられる。
[0048] (7)又は (8)の変異体ポリヌクレオチドについては、例えば公知の蛋白質発現系を利 用して HLA— A2402を有する細胞で発現させたペプチドにつ 、て、後述するように して CTLにより認識され得ること又は CTL誘導能を有することを確認することにより選 択すればよい。
[0049] また変異体ポリヌクレオチドは、その 末端にポリ（A)構造を有して 、るが、ポリ（ A)の数は腫瘍抗原として作用するアミノ酸のコード部位に影響するものではなぐ該 ポリヌクレオチドの有するポリ (A)の数は特に限定されるものではな!/、。
[0050] 本発明のポリヌクレオチドは、組み換え技術を利用して本発明のェピトープ'ぺプチ ドを製造する際に有用な遺伝子情報を提供するものである。また核酸試薬又は標準 品としても利用できる。
(III)組み換えベクター
本発明の組み換えベクターは、本発明のポリヌクレオチドを適当なベクター DNAに 組み込むことにより得られる組み換えベクターである。
[0051] ベクター DNAは、宿主の種類及び使用目的により適宜選択すればよい。ベクター DNAは、天然に存在する DNAであってもよぐ天然 DNAから増殖に必要な部分以 外の DNA部分が一部欠落しているものでもよい。ベクター DNAとしては、例えば、 染色体、ェピソ一ム又はウィルス等に由来するベクターが挙げられる。具体的には、 例えば細菌プラスミド、ノ クテリオファージ、トランスポゾン、酵母ェピソ一ム、挿入エレ メント、酵母染色体エレメント、ウィルス（例えばバキュロウィルス、パポバウィルス、 SV 40、ワクシニアウィルス、アデノウイルス、鶏痘ウィルス、仮性狂犬病ウィルスおよびレ トロウィルス等)等に由来するベクター及びそれらを組み合わせたベクター、プラスミド 及びバタテリオファージの遺伝学的エレメント由来のベクター（例えばコスミドおよびフ ァージミド等）が挙げられる。
[0052] また、本発明のペプチドの生合成のためには、発現ベクター又はクローニングべク ター等を用いればよい。
[0053] 組換えベクターは、 目的の遺伝子配列と複製及び制御に関する情報を担う遺伝子 配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、ターミネータ一、シグナル配列、ェ ンハンサ一等を構成要素としており、これらを公知の方法により組み合わせることによ り作製される c
[0054] 本発明のポリヌクレオチドは、公知の方法によりベクター DNAに挿入すればよい。
例えば、適当な制限酵素を用いて DNA及びベクター DNAを特定部位で切断し、混 合してリガーゼにより再結合することができる。また、本発明のポリヌクレオチドに適当 なリンカ一をライゲーシヨンし、これを目的に適したベクター DNAのマルチクローニン グサイトへ挿入することによつても組換えベクターを得ることができる。
ν)形皙転椽体
上記ポリヌクレオチドが組み込まれた組み換えベクターを、公知の宿主、例えば大 腸菌（例えば Κ12)、バチルス属細菌（例えば MI114)のような細菌、酵母 (例えば AH22)、昆虫細胞（例えば SUB胞）又は動物細胞（例えば COS-7細胞、 Vero細胞、 CHO細胞等)等に公知の方法で導入することにより本発明の形質転換体が得られる
[0055] 遺伝子導入方法としては、遺伝子の安定性を考慮すれば、染色体内へのインテグ レート法が好ましく挙げられる。簡便には核外遺伝子を利用した自律複製系を用いる ことができる。ベクター DNAの宿主細胞への導入は、例えば、 Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook,ら編、コーノレド 'スプリング'ノヽーノ ー 'ラボラトリー 'プ レス、コールド.スプリング.ノヽーバー、ニューヨーク、 1989)等に記載されている標準 的な方法により行うことができる。具体的には、リン酸カルシウムトランスフエクシヨン、 DEAE—デキストラン媒介トランスフエクシヨン、マイクロインジェクション、陽イオン脂 質媒介トランスフエクシヨン、エレクト口ポレーシヨン、形質導入、スクレープ負荷（ Scrape loading)、バリスティック導入（ballistic introduction)及び感染等を例示できる
(V)ヱピトープ ·ペプチドの ¾告方法
本発明のペプチドは公知のペプチド合成法、例えば固相ペプチド合成等により合 成することができる。このようなペプチド合成法としては、例えば「ペプチド合成」（丸 善； 1975年発行）又は Peptide Synthesis, Interscience, New York, (1996)に記載の 方法が例示される。また、例えばアプライドバイォシステムズ社のペプチド合成装置 のような公知の化学合成装置を用いて製造することもできる。
[0056] また本発明のペプチドは、上記説明した本発明の形質転換体を培養する工程と、 この培養物力 本発明のペプチドを回収する工程とを含む方法により製造することも できる。
[0057] 培養は、宿主に適した培地を用いて継代培養又はバッチ培養を行えばょ ヽ。培養 は、形質転換体の内外に生産されたペプチド量や、形質転換体が生産する本発明 のペプチドの作用の一つである CTL誘導能を指標にして、本発明のペプチドが適当 量得られるまで行えばょ 、。
[0058] 培養物力も本発明のペプチドを回収し、さらにこれを精製することが好ましい。精製 は、分子篩クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ァフィ-テイク口マトダラ フィ一等のクロマトグラフィーや、硫安又はアルコール等を用いた溶解度差に基づく 分画手段等を組み合わせた公知の方法により行えばよい。精製は、このペプチドの CTLによる認識又は CTLの誘導、具体的には例えば CTLによる IFN— γ産生量を 指標にして行えばよい。
[0059] また、本発明のペプチドのアミノ酸配列に基づき製造された、このアミノ酸配列に特 異的なポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を用いて、培養物中の本発明のぺ プチドを特異的に吸着回収することもできる。
(VI)杭原提示細朐
本発明の抗原提示細胞は、榭状細胞、マクロファージ又は Βリンパ球のような抗原 提示細胞に本発明のペプチドをパスルすることにより得られる細胞である。本発明に おける抗原提示細胞は、本発明のペプチドを結合する HLAを表面上に発現できる 細胞であって、 CTL刺激能を有する細胞である。
[0060] 「パルス」は、それには限定されないが、例えば、これらの抗原提示細胞を、濃度 1 一 10 gZml程度の本発明のペプチドを含む培地中、温度 20— 30°C程度で 30分 間一 1時間程度インキュベートすることにより行える。これにより、抗原提示細胞表面 に、 HLA— A2402拘束性 CTLにより認識され得る腫瘍抗原ペプチドが提示される。
[0061] 腫瘍抗原とは腫瘍特異的な CTLに認識され、又はさらに CTLを誘導し又は Z及び CTLを活性化し得る蛋白質、ポリペプチド又はペプチドであって腫瘍細胞が有する ものを意味する。また腫瘍抗原ペプチドとは、この腫瘍抗原が腫瘍細胞内で分解さ れて生じるペプチドであり、 HLA分子と結合して細胞表面上に提示されることにより CTLに認識され、 CTLを誘導し又は Z及び CTLを活性ィ匕し得るペプチドを意味す る。
[0062] また腫瘍抗原が有するアミノ酸配列部分であって、腫瘍特異的な CTLに認識され 、又はさらに CTLを誘導し又はこれを活性ィ匕し得るェピトープ配列を腫瘍抗原ェピト ープ (腫瘍抗原決定基)という。
[0063] 本明細書において、「認識される」とは、認識するもの力 認識される対象を他のも のと見分けて認知し、例えば認知した対象に結合することを意味する。本明細書にお いて、 CTLが腫瘍細胞又は腫瘍抗原ェピトープ 'ペプチドを認識するとは、ヒト白血 球抗原 (HLA)及び腫瘍抗原ペプチドに CTLが T細胞受容体を介して結合すること を意味する。
[0064] また「活性ィ匕する」とは、ある活性若しくは作用を有するもの又はその状態を、さらに 増強する又は作動させることを意味する。特に、「CTLが活性ィ匕する」とは、 CTLが H LAにより提示されたェピトープ 'ペプチドを認識することにより、例えば IFN— γのよう なエフェクターを産生すること、又は、 CTLが認識した標的細胞に対して細胞傷害性 を示すことを意味する。
[0065] また「誘導する」とは、ある活性又は作用を殆ど有さないもの又は状態から、その活 性又は作用を発生させることを意味する。特に、「抗原特異的な CTLを誘導する」と は、インビトロ又はインビボにおいて、ある抗原を特異的に認識する CTLを分化及び Ζ又は増殖させることを意味する。
[0066] 本発明のェピトープ'ペプチドがパルスされた抗原提示細胞は、癌ワクチンとして使 用できる。また、上皮性癌特異的な CTLの製造、ヒトの末梢血中の上皮性癌特異的 な CTLの定量等のために使用できる。
(νπ) 耍組織谪合杭原^!合体
本発明の主要組織適合抗原複合体は、本発明のペプチド又は本発明のペプチドが パルスされた抗原提示細胞表面に提示された腫瘍抗原ェピトープ 'ペプチドと、主要 組織適合抗原との複合体である。
[0067] 本発明にお ヽて、主要組織適合抗原とは、 Τリンパ球抗原受容体に Τリンパ球が認 識するペプチドを提示する分子であって、 CTLによってェピトープ'ペプチドと共に 認識されるヒト白血球抗原 (HLA)をいう。
[0068] また本発明の主要組織適合抗原複合体 (以下、「MHC」と略する）は、詳しくは、ェ ピトープ'ペプチドとともに CTLによって認識される、標的細胞表面に発現している M HCクラス I分子であるヒト白血球抗原 (HLA)と、 CTLに認識され又は CTLを誘導で きるェピトープ 'ペプチドとが結合した複合体である。この複合体には、 |8 2ミクログロ ブリンが結合して 、るものも含まれる。
[0069] Ep—CAMに特異的な CTLェピトープ'ペプチドとは、 Ep— CAMタンパク質中の特 定部位を占めるペプチドであって、 CTLに認識されて、 CTLの抗原受容体と免疫的 に結合する抗原決定基を指す。さらに CTLェピトープ 'ペプチドは、 Ep— CAM分子 を発現する細胞を直接に傷害することにより癌細胞を排除することができる。
[0070] 本発明の MHCは、特に、標的細胞上に発現している HLA— A2402分子と、 CTL に認識され得る Ep— CAMタンパク質中の特定のェピトープ'ペプチドとが結合した 複合体、又はさらに β 2ミクログロブリンが結合した複合体を指す。
[0071] また、本発明において、 HLA— Α2402とは、ヒト白血球抗原のうち、クラス I抗原の サブ'クラスである Α24多型をいい、 HLA— Α2402分子とは、 HLA— Α2402の遺伝 子の抗原提示細胞表面における発現産物を ヽぅ。
[0072] HLA— Α2402分子としては、 HLA— Α2402発現用の大腸菌の培養物から精製さ れた HLA - Α2402分子、標的細胞に遺伝子導入することにより強制的に発現させ た HLA— Α2402分子、標的細胞上に自然に発現して!/、る HLA— Α2402分子等の いずれを用いてもよい。また、本発明の HLA— Α2402分子には、 HLA— Α2402分 子の断片や HLA— Α2402分子の重鎖も含まれる。
[0073] 本発明の MHCは、その構成要素によって種々の方法で作製できる力 例えば本 発明のペプチド、 HLA— Α2402分子及び j8 2ミクログロブリンを、トリス等のバッファ 一中に懸濁し、温度 4一 10°C程度で 24— 72時間程度インキュベートすることにより 形成することができる。
[0074] MHCは、テトラマーであってもよ!/ヽ。 MHCテトラマーは、 CTLが認識し得る Ep—C AMェピトープ'ペプチドと、 HLA— A2402分子（通常は j8 2ミクログロブリンが結合し た HLA-A2402分子）との複合体力 個会合したものである。
[0075] MHCテトラマーは、 MHCをピオチン化し、ストレビプトアビジンとピオチン化複合 体とを 1 :4で混合することにより得られる。また、 HLA分子の C末端に予めピオチン 結合部位を付加しておき、 MHCの形成後に、この部位にピオチンを結合させ、さら に、ストレプトアビジンとピオチン化 MHCを 1 :4で混合することによつても得られる。
[0076] 具体的には、例えば以下のようにして MHCテトラマーを調製することができる。 M HCを調製するに当たっては、 MHCの調製大腸菌による組換蛋白発現系を用いて HLA— A2402重鎖および j8 2ミクログロブリンを大量に作成、精製する。なお、 HLA A2402重鎖 C末端には、ピオチンリガーゼが認識するアミノ酸配列を予め付加して おく。精製 HLA— A2402重鎖および |8 2ミクログロブリンをそれぞれ 8M尿素に溶解 する。 200mlのリフォールフイングバッファー（pH8.0； lOOmM Tris- HC1, 400 mM L- アルギニン— HC1, 2 mM EDTA, 0.5 mM oxidative glutathione, 5 mM reduced glutathione)内に、配列番号 1で示されるアミノ酸配列（RYQLDPKFI)を有する本発 明ペプチド 12mg、 HLA— A2402重鎖 18.6mg、 β 2ミクログロブリン 13.2mgのそれぞ れを 27ゲージ針の付!、た注射器を用いて加える。 10°Cの恒温槽にお 、て 48— 72時 間撹拌し、 MHCの形成を促した後、 MHCを含むリフォールフイングバッファーを 1.8Lの蒸留水に対して 24時間、 4°Cの恒温槽において透析し、透析後のリフォールフ イングバッファーをセントリプレップ 10 (MILLIPORE, Bedford, MA)を用いて 2mlに濃 縮する。 Superaex 200 HR (Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, ¾weden)7フ ムを用いたゲル濾過クロマトグラフィーにて分子量 45KDあたりに流出する MHCを単 離する。力べして所望の MHCテトラマーが製造できる。
[0077] 次いで、ピオチン化 MHCを調製するに当たっては、ピオチンリガーゼ（AVIDITY, Denver, CO)を用いて、 HLA— A2402重鎖 C末端の特異的部位にピオチンを結合 させる。 Superdex 200 HRカラムを用いたゲル濾過クロマトグラフィーにてピオチンを 付加した MHCを精製する。
[0078] さらに、 PE標識ストレプトアビジン（Molecular Probe, Eugene, OR)と精製ピオチン 化 MHCをモル比 1 :4で混合し、 Superdex 200 HRカラムを用いたゲル濾過クロマト グラフィ一にて分子量 480KDあたりに流出する配列番号 1で示されるアミノ酸配列 (R YQLDPKFI)を含む MHCテトラマーを単離する。セントリコン 10 (MILLIPORE)を用 いて約 3mgZmlに濃縮し、 4°Cに保存する。保存剤としては、ナトリウムアジド、 EDTA 、 ロイぺプチン、ぺプスタチンを添カ卩すればよい。
[0079] 上記の製造各工程では、ゲルろ過クロマトグラフィーなどの公知の方法で、使用す るタンパク質又はペプチドを精製することが望まし 、。
[0080] 本発明の MHCは、癌ワクチンとして使用できる。また上皮性癌特異的な CTLの製 造、ヒトの末梢血中の上皮性癌特異的な CTLの定量等のために使用できる。
(VIII)癌ワクチン · CTL誘導剤 ·遺伝子治療剤
癌ワクチン 'CTL誘導剤 本発明のペプチドは、能動免疫ワクチン療法に使用する癌ワクチンの有効成分とし て好適に使用できる。この癌ワクチンは、 HLA— A2402を有するヒトのために使用で きる。
[0081] 即ち、白血球抗原として HLA— A2402を有する癌患者に本発明のペプチドを投与 することにより、 Ep— CAMを特異的に認識する HLA— A2402拘束性 CTLを誘導又 は活性ィ匕することができ、これにより上皮性癌などを治療又は改善することができる。
[0082] 癌患者の CTLは複数の腫瘍抗原を認識する細胞の集団であるため、 1種類のェピ トープ'ペプチドを癌ワクチンとして使用するより多種類のェピトープ'ペプチドを^ aみ 合わせて癌ワクチンとして使用する方が、より高い効果が得られる場合がある。従って 、本発明のペプチドは、 1種を単独で又は多種類 (複数種類)を組み合わせて使用で きる。
[0083] 本発明のペプチドを含む Ep—CAMの mRNAは、肺癌細胞株（QG56、 LU99、 L C99A、 LCI sq、 LC65A、及び PC - 9)、大腸癌細胞株、胃癌細胞株（MKN28、 MKN45)、口腔癌細胞株 (HSC— 2)、乳癌細胞株及び白血病細胞株 (K562)等で 発現している。また、肺癌、大腸癌、胃癌、乳癌及び口腔癌の各患者由来の種々組 織においても Ep— CAMの発現が認められた。従って、本発明のペプチドはこれらの 癌の治療又は改善に有用である。
[0084] 本発明のペプチドは単独で又は各種担体とともに製剤にすることができる。剤形は 、経口投与剤又は非経口投与剤のいずれであってもよい。一般的には非経口投与 剤が好ましい。非経口投与剤としては、皮下注射剤、筋肉内注射剤、静脈内注射剤 、座剤などが挙げられる。
[0085] 経口投与剤とする場合は、薬学的に許容されており、かつ本発明のェピトープ'ぺ プチドの活性を妨げない賦形剤であるスターチ、マン-トール、ラタトース、ステアリン 酸マグネシウム、セルロース、重合アミノ酸、アルブミンなどの賦形剤とともに製剤とす ればよい。
[0086] 非経口投与剤とする場合は、薬学的に許容されており、かつ本発明のェピトープ' ペプチドの活性を妨げない担体である、水、食塩、デキストロース、エタノール、グリセ ロール、 DMSOなどとともに製剤にすればよい。その他、必要に応じてアルブミン、 湿潤剤、乳化剤などを含んでいてもよい。また、細胞性免疫の賦活ィ匕のために、ェピ トープ'ペプチドは適当なアジュバントとともに使用することが望ましい。
本発明のペプチドは、中性又は塩の形態で使用できる。薬学的に許容される塩とし ては、塩酸、リン酸のような無機酸の塩、酢酸、酒石酸のような有機酸の塩が挙げら れる。
[0087] また、本発明のペプチドは、それ自体又は HLA— A2402と相互作用して CTLによ るこのペプチドの認識を増強する化合物、又は、このペプチドを免疫学的に認識する 抗体などとともに製剤とすることにより、その活性を調節することができる。
[0088] 本発明のペプチドをパルスした抗原提示細胞及び主要組織適合抗原複合体も同 様にして癌ワクチンとして好適に使用できる。剤形、投与対象、適用可能な癌の種類 、効果などは本発明のペプチド力もなる癌ワクチンと同様である。 本発明のペプチド、抗原提示細胞及び主要組織適合抗原複合体は、それぞれ、白 血球抗原として HLA— A2402を有するヒトに投与することにより、 Ep— CAM特異的 な HLA— A2402拘束性 CTLの誘導又は活性ィ匕を介して、上皮性癌を治療又は改 善することができる。
[0089] 本発明のペプチドの投与量は、 CTLによるこのペプチドの認識の程度により変化 するが、ヒト成人に対して、活性を有するェピトープ 'ペプチド本体を、例えば 0. Olm g— lOOmgZ日程度、好ましくは 0. lmg— 30mgZ日程度投与すればよい。投与 間隔は、患者と投与目的に応じて適宜定めればよい。
[0090] 或 ヽは、患者の末梢血より単核細胞画分を採取し、本発明に係るペプチドと共に培 養し、 CTLが誘導及び Z又は活性化された単核細胞画分を患者の血液中に戻すこ とによっても、有効な癌ワクチン効果が得られる。ヒト成人に対して、 108— 101G個/ 日程度の CTLを投与できるように、培養時の単核細胞濃度、本発明のペプチドの濃 度等の培養条件を定めればよい。これらの条件は、簡単な実験により容易に決定で きる。さらに、培養時、インターロイキン 2等のリンパ球増殖能を有する物質を添加し てもよい。
[0091] また抗原提示細胞は、ヒト成人に対して、例えば 106— 109個 Z日程度、好ましくは io7— io8個 Z日程度投与すればよい。また、患者の末梢血より採取した単核細胞 画分と本発明の抗原提示細胞とを共培養し、患者の血液中に戻すことによつても、有 効な癌ワクチン効果が得られる。
[0092] また主要組織適合抗原複合体は、ヒト成人に対して、例えば 1一 lOOmgZ日程度 、好ましくは 5— 50mgZ日程度投与すればよい。また、患者の末梢血より採取した 単核細胞画分と本発明の主要組織適合抗原複合体とを共培養し、患者の血液中に 戻すことによつても、有効な癌ワクチン効果が得られる。
癌の遺伝子治療剤
また、本発明のポリヌクレオチド湘補鎖を含む）は、例えば肺癌、大腸癌、胃癌、乳 癌及び口腔癌等の遺伝子治療剤として有用である。
[0093] 癌の治療に当たっては、本発明のポリヌクレオチドをベクターに担持させ、直接体 内に導入してもよぐ又ヒトから細胞を採取してベクターを導入した後体内に戻すこと もできる。ベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウィルス等の遺 伝子治療に使用できることが知られているものを制限なく使用できる力 レトロウィル スが推奨される。なお、これらウィルスは複製欠陥性である。
[0094] また、本発明のポリヌクレオチドをリボソームに封入して送達するマイクロインジヱク シヨンなどを使用して細胞に導入することもできる。
[0095] このように、本発明の癌の遺伝子治療剤は、本発明のポリヌクレオチド単独、本発 明のポリヌクレオチドを含む組換えベクター、本発明のポリヌクレオチドが封入された リボソーム等の 、ずれの形態であってもよ 、。
[0096] 本発明のポリヌクレオチドの投与量は、 CTLによるこのポリヌクレオチドがコードする ペプチドの認識の程度により異なるが、ヒト成人では、本発明のェピトープ'ペプチド をコードするポリヌクレオチド部分の含量として、例えば 0. 1 μ g— lOOmgZ日間程 度、好ましくは 1 μ g— 50mgZ日間程度とすればよい。この量を数日から数ケ月に 1 回投与すればよい。
本発明のポリヌクレオチドは、例えば IL 2のようなサイト力イン、又は本発明のポリヌ クレオチドと相互作用してその発現を増強する物質と組み合わせて使用することがで きる。 (IX)細胞傷害件 Tリンパ球
本発明の細胞傷害性 Τリンパ球は、以下の (a)— (d)のいずれ力 1以上を用いて末梢 血リンパ球を刺激することにより得られるものである。
(a)本発明のペプチド
(b)本発明の抗原提示細胞
(c)本発明の主要組織適合抗原複合体
(d)本発明の主要組織適合抗原複合体のテトラマー
本発明の CTLは、末梢血リンパ球を上記 (a)— (d)のいずれ力 1以上とともに、好まし くはヒト血清を含む RPMI1640培地で温度 37°C程度で 7— 14日間程度培養するこ とにより誘導される。末梢血リンパ球を主要組織適合抗原複合体 (以下、「MHC」とい う）又はそのテトラマーを用いて刺激する場合は、 CTLは誘導されてこれらと結合す る。従って、 CTLを MHC又はそのテトラマーから適当な方法で分離すればよい。
[0097] 具体的には、 CTLは、例えば以下の調製方法によって得ることができる。
ヱピトープ，ぺプチ は杭原提示細胞 用いて刺激する場合 末梢血から分離したリンパ球を、本発明のペプチド又はこのペプチドをパルスした 抗原提示細胞とともに、炭酸ガス恒温槽にて 37°C程度で、 7— 10日間程度培養する 。次いで、好ましくは IL 2、 PHA、抗 CD3抗体等を添加して 7— 14日間程度インキ ュペートすることにより CTLを刺激及び増殖させる。
[0098] このペプチド又は抗原提示細胞による刺激と、必要に応じて IL 2等による刺激と 力 なるサイクルを 3サイクル程度繰り返すことにより、必要な細胞数の CTLを確保す る。
[0099] このようにして得られる上皮性癌に特異的な CTLは、例えばヒトアルブミン含有 PB S等に懸濁させて、上皮性癌に対する受動免疫療法剤等として使用できる。受動免 疫療法剤の剤形は、通常、筋肉内注射剤、皮下注射剤、静脈内注射剤などの注射 剤とすればよい。
MHC又はそのテトラマーにより刺激する場合
<染色により分離する方法 >
リンパ球を末梢血等力 分離し、例えば PBS中で適当な濃度の MHC又は MHC— テトラマーと 4一 25°C程度で、 30— 60分間程度反応させる。反応液に FITC又は PE のような標識色素を添加することにより、 MHC又は MHC—テトラマーと結合した CT Lを染色する。次いで、フローサイトメーター又は顕微鏡などを用いて染色された CT Lを単離する。
< MHCを岡相化するこ Wこより分離する方法 >
表面に MHC又は MHC—テトラマーを固相化した無菌プレートを用いて、フラスコ 中で末梢血力も分離したリンパ球と固相化 MHC又はそのテトラマーとを 4一 25°C程 度で、 30— 60分間程度反応させる。次いで、結合せずに浮遊している他の細胞を 洗い流した後に、プレート上に残った上皮性癌に特異的な CTLを新しい培養液に懸 濁する。このようにして単離された上皮性癌に特異的な CTLは、抗 CD3抗体、 PHA 、 IL - 2等の T細胞刺激薬剤で刺激することにより、受動免疫療法剤として使用する のに必要な細胞数まで増殖させればょ 、。
<磁気ビーズ 用いる方法 >
前述したようにして調製したピオチン化 MHCをストレプトアビジン標識磁気ビーズと 結合させ、結合体 (以下、「MHC-磁気ビーズ」と称する）を作製する。次いで、リンパ 球を末梢血等から分離し、これに適当な濃度の MHC 磁気ビーズをリンパ球:ビー ズ比が 1： 5— 20程度となるように添加して反応させる。
[0100] MHC 磁気ビーズと結合した上皮性癌に特異的な CTLの入った試験管を磁場に おくと、ビーズと結合した CTLは磁石側の試験管内壁に寄せられる。
[0101] このようにしてビーズと結合した CTLを試験管内壁に付着させた状態でそれ以外の 細胞を洗い流した後、試験管を磁場力 外して、試験管内に残った抗原特異的 CTL を新 ヽ培養液に懸濁する。
このようにして単離された上皮性癌に特異的な CTLは、抗 CD3抗体、 PHA、 IL 2 等の Tリンパ球刺激薬剤で刺激することにより、受動免疫療法剤として使用するのに 必要な細胞数まで増殖させればょ 、。
< の '治療又は B善方法 >
本発明の CTLは、受動免疫療法剤として、上皮性癌の患者に投与することにより、 癌を治療又は改善できる。 [0102] 投与量は、患者及び投与目的により異なるが、ヒト成人に対して、例えば 107— 101 1個/日程度、好ましくは 108— io1G個/日程度とすればよい。この量を数日ー数ケ 月に 1回の間隔で投与すればよい。
(X) CTLの定量方法
上皮性癌に特異的な CTLが、癌のハイリスクの患者 (癌細胞又は癌組織に由来す る何らかの原因により免疫能が低下した人、合併症を有する患者、高齢者、幼小児、 妊婦等)の末梢血に存在するか否かを知ることは、抗癌剤や化学療法剤の適正な使 用を含む癌治療管理の上で重要である。上皮性癌に特異的な HLA - A2402拘束 性 CTLの定量は、以下の方法により行える。
[0103] 即ち、末梢血に以下の (a)— (d)のいずれかを作用させる工程と、末梢血中の CTL 又はそれが産生するサイト力インを定量する工程とを含む方法である。
(a)本発明のペプチド
(b)本発明の抗原提示細胞
(c)本発明の MHC
(d)本発明の MHCのテトラマー
得られた値を、濃度既知の HLA— A2402拘束性 CTL溶液を用いて同様にして求 めた定量値と比較することにより、被験抹消血中の HLA— A2402拘束性 CTL濃度 を算出すればよい。
[0104] 上記 (a)— (d)の 、ずれかにより誘導された HLA— A2402拘束性 CTL又はそれが産 生するサイト力インの定量方法としては、例えば以下の方法が挙げられる。
ェピトープ 'ペプチドを用いる場合
末梢血から分離されたリンパ球を本発明のペプチドで刺激し、それにより誘導され る CTL数又はそれが産生するインターフェロン γ (lFN- γ )、インターロイキン等の サイト力イン (ケモカインを含む）量を定量すればよい。以下に IFN— γを例にとり具体 的に方法を示す。
<細朐内 IFN— y産牛.細胞の定量 >
末梢血力も分離したリンパ球を 10%ヒト血清含有 RPMI1640培地に 2xl06/mlの 細胞濃度で浮遊させ、本発明の CTLェピトープ'ペプチドを 1 μ gZmlの濃度で加え る。さらに細胞内蛋白輸送阻止剤である Brefeldin A等を加え、炭酸ガス恒温槽にて 3 7°Cで 5— 6時間培養する。培養後、細胞を固定、膜透過処理を行い、色素標識抗 I FN— γ抗体と反応させる。フローサイトメーター等を用いて、 CD8陽性リンパ球中の I FN - γ陽性細胞を定量する。
< CD8陽件細胞の定量 >
上記の細胞内 IFN— γ産生細胞の定量方法において、色素標識抗 IFN— γ抗体 に代えて抗 CD8抗体を用いることにより、標識された CD8陽性細胞を定量できる。 くサイト力インの定量（エリスポットアツセィ） >
96穴 MultiScreen- ΗΑプレート (Mil lipore)を抗 IFN—γモノクローナル抗体で一晚 、 4°Cでコーティングし各ゥエルを PBSで洗浄した後、末梢血から分離したリンパ球を 各ゥエルにまく。ェピトープ 'ペプチドを各ゥエルに入れ 37°Cの 5%CO培養器にて 20
2
時間培養する。翌日、 0. 05%ツイーンー 20添加 PBSでプレートを洗浄した後、抗 IF N— γゥサギ血清、ペルォキシダーゼ標識抗ゥサギ IgGャギ血清の順で各々 90分ず つ室温で反応させる。さらに 3—ァミノ 9ーェチルカルバゾール
(3- amino- 9- ethylcarbasole： Sigma社)と 0. 015%の過酸化水素水を含む 0. 1M酢 酸ナトリウム緩衝液 (pH 5.0)を各ゥエルに入れ、室温で 40分反応させる。 IFN— γス ポットを可視化し、実体顕微鏡でカウントする。
<焙着ト j胄巾に分泌されたサイト力イン ^^する
末梢血力も分離したリンパ球を 10%ヒト血清含有 RPMI1640培地に 2xl06/mlの 細胞濃度で浮遊させ、本発明の CTLェピトープ'ペプチドを 1 μ gZmlの濃度で加え る。炭酸ガス恒温槽にて 37°Cで、 24— 48時間培養する。培養後、上清を回収し、そ の中に含まれる IFN— y濃度を市販の ELISAキット（例えば ENDOGEN社の HUMAN IFN gamma ELISA)を使用して定量する。
MHCテトラマーを用いる場合
末梢血など力もリンパ球を分離し、濃度 1一 100 /z gZml程度の MHCテトラマー（ ストレプトアビジンを蛍光標識したもの）と 37°Cで 15分間反応させる。反応液に MHC と結合した CTLに結合する抗体であって別の蛍光で標識したものを添加することに より、 MHCと結合した CTLを染色する。染色した CTLをフローサイトメーター又は顕 微鏡等を用いてカウントすればょ 、。
実施例
以下に実施例を示し、本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定さ れるものではない。
実施例 1
[0105] ί)ド、ナー び糸田
愛知県がんセンターの倫理委員会によって許可された研究計画と目的は、全ドナ 一に充分説明された。試験用末梢血のサンプルをインフォームド 'コンセントの後に 5 名の HLA— A2402陽性健康ドナーカゝら得た。即ち、前記各ドナーから採取した末梢 血から、遠心分離により形成したフイコール密度勾配法により、末梢血単核細胞 (PBMC)を単離した。
[0106] ヒト肺癌細胞株である大細胞癌 LU990CRB0080)細胞；ヒトの扁平上皮癌 HSC— 2QCRB0622)細胞；ヒト胃癌細胞株である扁平上皮癌 MKN28(JCRB0253)細胞、 M KN45QCRB0254)細胞;及びヒト大腸癌細胞株である扁平上皮癌 COLO320DM OCRB0225又は ATCC： CCL- 220)細胞）は、 JCRB細胞バンク (厚生労働省 ： http〃Cellbank.nihs.go.jp/)より購入した。ヒト肺癌細胞株である扁平上皮癌 LC—1 /sq(RCB0455)は、理研細胞バンクより購入した。
[0107] LCZsq細胞は、 10%FCS、 L—グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン、及び力 ナマイシンを有する栄養補助液を添加した 45%RPMI1640培地 (シグマ社製)及び 、 45%Ham 'sF12(シグマ社製)中で維持した。 COLO320DM細胞及び MKN28 は DMEM培地 (シグマ社製)中で維持した。 K562細胞は 10%FCS (ゥシ胎児血清： ライフテクノロジ一社製)、 L グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン、及びカナマイ シンを有する栄養補助液を添加した IMDM培地 (シグマ社製)中で維持した。
[0108] その他の癌細胞株は、 10%FCS、 2x10— 3M L グルタミン、 lOOUZmlぺ -シリ ン、 100
Figure imgf000030_0001
100 /z gZmlカナマイシン及び 5x10— 5M j8—メ ルカプトエタノール (完全培地として)を含む補助液を添カ卩した RPMI 1640培地を用 いて培養した。
[0109] ペプチド提示用の細胞として 174CEM. T2(以下、「Τ2細胞」と称する)に HLA— A 2402遺伝子を導入し、 HLA— A2402結合ペプチドを提示する細胞 (以下、「T2— 2 4細胞」と称する)を得た。 Τ2-24細胞は 10%牛胎児血清、 L-グルタミン、ペニシリン 、ストレプトマイシン、 G418 (ギブコネ土製）を添カ卩した IMDM培地（Iscove's modified Dulbecco's medium：ギブコネ土製）を用いて培養した。
[0110] Tissue antigens, 59:502- 511 ,2002に記載された方法により、 HLA— A2402をコー ドして 、るレトロウイルスを、それぞれ QG56の HLA— A2402陰性細胞株及び A549 (JCRB0076)の HLA— A2402陰性細胞株に感染させた。感染した細胞を選択するた め、感染した QG56細胞を最終濃度 0. 6 gZmlのピューロマイシンを含む完全培 地中に維持し、 QG56— A24と命名した。同様に、感染した A549を最終濃度 0. 9 μ gZmlのピューロマイシンを含む完全培地中に維持し、 A549— A24と命名した。
2)ペプチド合成
Ep— CAM蛋白 (ァクセッション番号： M33011)の範囲内の潜在的な HLA— A240 2結合ペプチドを同定するために、ワールド'ワイド'ウェブサイト'バイオインフォマテ イクス &分子分析セクション (BIMAS:BioInfomatics and molecular analysis section)の HLAペプチド複合体の解離半減時間の評価に基づ ヽた、 HLAペプチド結合予測 プログラムを使用するコンピュータ予孭 ljを行った (
http://Dimas.dcrt.gov/molbio/hla_bmd/)。
[0111] Ep— CAMのェピトープ ·ペプチド予測結果の中力 選択した 7つのペプチドを Pep Set(Mimotope社製)で合成した。必要に応じて 100 μ Lのジメチル 'スルフォキシドに 溶解し、 40%ァセトニトリル、 0. 1M (ρΗ7.4)に更に希釈した。
[0112] 各ペプチドの産生量は 1 μ molであると推測された。
[0113] 合成された 7つのペプチドは、 Ep31、 Epl73、 Epl85、 Ep250、 Ep225、 Ep296、及 び Ep304として命名した。合成された Ep— CAMのペプチド配列を表 1に示す。
[0114] [表 1] ぺプチドの アミノ酸配列 アミノ酸の アミノ酸長 スコア a % MFI
名称 位置. 増加15
Ep3 i NYKLAVNCF 31-39 9 120 85
Epi73 RYQLDPKFI 173-181 9 150 102
Epi85 LYENNVITI 185-193 9 75 79
Ep225 LFHSKK DL 225-233 9 20 29
Ep250 YYVDEKAPEF 250-259 10 198 57
E 296 YEKAEIKEM 296-305 10 83 24
Ep304 EMGEMHREL 304-312 9 5 16
a World Wide Web site Biolniormatics and
Molecular Analysis Section(BIMAS)の HLAぺプチド結合予測により 推定された HLA-A24分子からの解離の半減期 （分） b 合成べプチドは、 MHC安定化測定法によりヒト HLA-A2402分子への 結合性を試験された。 ％MFIは％平均蛍光強度を示す。
[0115] なお、コントロールとして、ヒト免疫不全ウィルス l(HIV-l)エンベロープ.ペプチド R YLRDQQLLO.Immunol, 159:6242-6252, 1997： 584- 592残基、 ENV584として命名さ れて 、る)及び EBVlatent膜蛋白 2ペプチド (EBV latent
membrane)0.Immnol,158:3325- 3334, 1997 :419— 427残基、 EBV—LMP419として命 名されて 、る)を合成した (東レ ·リサーチセンター社)。
3)糸田 及びフローサイトメトリー分析
HLA— A2402分子の細胞表面発現 HLA— A2402モノクローナル抗体 (ワン'ラム ダ社製: One Lambda, Inc)と FITC標識抗マウス IgG(a ）断片 (ィムノテック社製)を用
2
いる間接免疫蛍光抗体法によって試験した。 MHCZペプチド 'テトラマーは文献記 載の方法 (Blood,98:1872-1881,2001、 Science,274:94-96,1996)に準じて製造した。
[0116] CD8陽性 T細胞株又はクローンを Ep— CAMペプチド、 Epl73(HLA-A2402/E pl73テトラマーとして呼んだ)又は HIV— 1ペプチド、 ENV584(HLA— A2402/EN V584テトラマーとして呼んだ)を取り込んで!/、るフィコエリスリン (phycoerythrin: PE)標 識された HLA— A2402テトラマーで染色した。
[0117] 染色された細胞のフローサイトメトリー分析は、 FACSCalibur (ベタトン 'デイツキン ソン社製)を用いて実施し、データは CellQuestソフトウェア (ベタトン'ディッキンソン 社製)を用いて分析した。
MHC安定化アツセィ
合成されたペプチドの HLA— A2402結合効率を試験するため、クズシマ (Kuzushima)らに記載の方法 (Blood,98:1872- 1881,2001)で T2— A24細胞（T2[174 x CEM.T2 :ATCCァクセッション番号： CRL-1992]に HLA— Α2402分子を発現するプ ラスミドをトランスフエタトされた細胞株）を用いる MHC安定ィ匕アツセィを行った。
[0118] 即ち、 T2— A24細胞 (2xl05個)を 0. 1%FCS, 5x10— 5M j8—メルカプトエタノール を含む 200 μ L RPMI1640培地及び 10 μ Μの濃度でペプチドの各々を 26°Cで 1 6時間インキュベーションした。さらに 37°Cで 3時間インキュベーションした。インキュ ベーシヨン後、細胞表面 HLA— A2402分子を抗 HLA— A2402モノクローナル抗体 及び上記（3)の FITC標識抗体で染色した。発現は、 FACSCaliburによって測定し 、平均蛍光強度（MFI : mean fluorescence intensity)を記録した。
[0119] %MIF上昇は以下の方法で計算した：
%MIF上昇 = ΙΟΟχ (ペプチド投与群の MIF -ペプチド非投与群の MIF) Z (ぺプ チド非投与群の MIF)
その結果を表 1に％MFI上昇として示す。表 1に示されるように多くのペプチドは、 これらのペプチドが細胞表面上に結合し、 MHCが安定ィ匕されることを示して 、る細 胞上の HLA— A2402分子発現が上昇した。
[0120] 中でもペプチド Έρ173 (RYQLDPKFI)が HLA— Α2402分子に対して最も高!、親 和性を示した。 Ep304 (EMGEMHREL)は最も低い親和性を示したので、以後の実 験力も排除した。
5) Er>— CAMペプチド特異的 CTL株及びクローンの産牛.
末梢血単球誘導された榭状細胞 (DCs)はダウァー (Dauer)らの方法に準じて産生 させた（J.ImmnoU 70:4069- 4076)。 [0121] 即ち、プラスチックに粘着する細胞を HLA— A2402陽性健康ボランティアの末梢 血単球細胞から単離し、 5%加熱不活性化ヒト血清、 ΙΟ /z gZmL組換え体ヒト 'イン ターロイキン 4 (hIL—4 :R&Dシステムズ社製）、及び 50ngZmL組換え体ヒト '顆 粒球 マクロファージ'コロニー刺激因子（hGM— CSF:R&Dシステムズ社製）を共 に添カ卩された RPMI 1640培地中において培養した。次いで 1日インキュベーション の後、 50ngZmLIL— 1 j8 (ぺプロ'テック社製）、 50ngZmL組換え体ヒト '腫瘍壊死 因子— α (hTNF- α：ぺプロ'テック社製）及び 1 μ Μプロスタグランディン Ε2 ( Cayman Chemical Company社製）を細胞の成熟のために添カ卩した。 2— 3日経過後、 細胞を取得し、抗原提示のために単球誘導榭状細胞として用いた。
[0122] 産生された細胞は、 CDla、 CD80、 CD83、 CD86、 HLAクラス II分子のような榭 状細胞関連抗原を発現して ヽるように思われた。
[0123] 別途、 CD8マイクロビーズ (Milteny Biotec社製）の助けを得て同じドナーから CD8 陽性 Tリンパ球を単離した。
[0124] 次いで自己由来の榭状細胞を室温にて 2— 4時間、 5x10— 5M j8 メルカプトエタノ ールを有する AIM— V培地 (ギブコネ土製)中で 10 μ Μ濃度の Ερ— CAM合成ペプチド の各々でパルスした後、（33Gy)で放射線照射した。
[0125] その後、榭状細胞（lxlO5個）は、 10%ヒト血清、 25ngZmL組換え体ヒト IL— 7 (R &Dシステムズ社製）、 5ng/mL組換え体ヒト IL— 12 (R&Dシステムズ社製）を添カロ した RPMI1640培地中において CD8陽性 Tリンパ球（lxlO6個）と共に培養チュー ブ中において共培養した。
[0126] 7日間培養後、細胞は前記したように調製された lxlO5個のペプチド 'パルスされた 自己由来榭状細胞を加えることによって刺激した。更に 7日間の間培養した後、細胞 を同様な方法で 3回刺激した。各再刺激後、ヒト組換え体 IL 2 (武田薬品工業社製） を 20単位 Zmlの最終濃度で加えた。必要であれば、活発に増殖している細胞を 2— 3のチューブに分けて、 20単位/ mlの IL 2を含む新鮮培養培地を与えた。
[0127] T細胞の特異性はエリスポットアツセィで試験した。
[0128] T細胞クローンを確立するために、ポリクローナル CTLの限界希釈を（
Blood,98:1872-1881,2001)に沿って実施した。即ち、ポリクローナル CD8陽性 T細胞 を抗 CD3モノクローナル抗体 (30ng/ml、オルソ 'ダイァグノステイク社製)、 IL 2 (50U /ml) , γ (33Gy)放射された lxlO5個の PBMCs及び γ (55Gy)放射された 2x10 4個の EBVでトランスフォームされた Bリンパ芽球細胞（ボランティアの末梢血 Bリンパ 球を 95.8細胞 (JCRB9123)上清でトランスフォームすることにより得られた細胞）と共に 培養培地 (0.2ml)を含んでいる 96穴丸底プレート中に細胞 1、 3、 10個/ゥエルで蒔 いた。
[0129] 2週間培養後、増殖している細胞の特異性をリー (Lee)らが記載した方法
(J.Immnol,158:3325- 3334,1997)と同様に、 CTL CTL致死 (CTL- CTL killing)アツセ ィで試験した。
[0130] 即ち、 CTLクローンを 100 μ 1の完全培地のみ、或いは最終濃度 2 μ Μで Ερ— CA Μまたはコントロール ·ペプチド ENV584から誘導された同一起源ペプチドを含んで いる 96穴丸底プレート (細胞 300個 Ζゥエル)上においてー晚インキュベーションした。
[0131] CTL細胞の細胞傷害能力は、倒立顕微鏡を用いて翌日測定した。 Ερ— CAMでパ ルスしたときだけ細胞傷害を示したクローンは、フラスコの中に移し、上記のように増 殖させた。
6) IFN /のエリスポットアツセィ
ニトロセルロース膜がある平底 96穴 Multiscreen- HAプレート（ミリポア社製）に 10 μ gZmLの抗 IFN— γモノクローナル抗体 (R&Dシステムズ社製）をコートし、 4°Cで一 晚ィキュペートした。 PBS (リン酸緩衝生理食塩水)で洗浄後、プレートを 37°Cで 1時間 、培養培地でブロッキングした。 T2— A24細胞（5xl04個）は、室温で 30分間プレー トの各ゥエル中に 0. 1%FCS及び 5xl05Mの j8—メルカプトエタノールと共に 100 Lの RPMI1640培地中にお!、てに各ェピトープ候補合成ペプチドをパルスした。 20 %の濃度まで付カ卩的 FCSで添加された培養培地中に懸濁した lxlO5個のポリクロー ナル CD8陽性 T細胞の全量を各ゥエル中に蒔!、た。
[0132] スポットがカウントするにはあまりに多い場合は、 lxlO4個の CD8陽性 T細胞を応答 細胞として用いた。そして全ての測定操作は 2度、実施した。
[0133] プレートを 37°Cで 20時間、 5%炭酸ガス'インキュベータ中で、インキュベートし、そ して 0. 05%ツイーン 20を含む PBSで広範囲に洗浄した。次いでポリクローナルゥサ ギ抗 IFN— γ抗体 (ジェンザィム社製)を個々のゥエルに添加し、室温で 90分間放置 し、続いて、さらに 90分間パーォキシダーゼ複合ヒッジ抗ゥサギ抗ィムノグロブリン G (ジェンザィム社製）に曝露させた。 IFN— γ特異的スポットの可視化のために、 3—ァ ミノー 9ーェチルカルバゾール（シグマ社製）及び 0. 015%過酸加水素水を含む 0. 1 Μ酢酸ナトリウム緩衝液 (ρΗ5. 0)を各ゥエルに加えた。 40分後、反応を水洗によつ て停止させ、プレートを乾燥させた。そして拡散した大きなスポットを顕微鏡下でカウ ントした。
[0134] その結果を図 1及び図 2に示す。
[0135] 図 1は、 5人の HLA— Α2402陽性健康人ドナーの CD8陽性 Τ細胞を 6つのべプチ ドの各々でパルスした自己由来の榭状細胞で刺激させた結果のエリスロット'アツセィ によるポリクローナル 'ペプチド活性ィ匕細胞傷害性リンパ球細胞株の評価を示す。
[0136] 図 1に示されるように 5人の HLA— Α2402陽性健康人ドナーの CD8陽性 Τ細胞を 6 つのペプチドの各々でパルスした自己由来の榭状細胞で刺激させた結果、 4人のド ナ一からの Τ細胞株が Ερ173でパルスした Τ2— Α24細胞でインキュベートした時に I FN- yスポットの優位な量を産生した。
[0137] また、ドナー番号 3からの Ep250刺激された CTL株力 Ep250でインキュベートした 時に特異的に IFN— γのスポットを産生した。
[0138] 図 2は、 Ερ— CAMペプチド特異的ポリクローナル及びモノクローナル CTLのテトラ マー染色の結果を示す。
[0139] 図 2の Aは、 Epl73で 4回刺激したポリクローナル CD8陽性 T細胞が FITC標識され た抗 CD8抗体及び Ep 173が取り込まれて!/、る PE標識された HLA— A24テトラマー、 又はコントロール.ペプチド ENV584で染色され、フローサイトメトリーによって分析さ れた。全 CD8陽性 T細胞におけるテトラマー陽性細胞のパーセントが上段右に示さ れている。
[0140] 図 2の Aに示されるようにコントロール 'ペプチド ENV584の多くでは、スポットの産 生はなかった。 4回の刺激の後、 4人のドナー力 確立した CTL株が HLA— A2402 ZEp 173テトラマーで特異的に染色したが、 HLA— A2402ZENV584テトラマーで は染色しなかった（全 CD8陽性 T細胞の 37.2% v. 0.06%、図 2A)。 [0141] また、図 2Bは、 Epl73特異的 CTLクローン、 C27が上記と同様の方法で染色され た。全 CD8陽性 T細胞におけるテトラマー陽性細胞のパーセントが上段右に示され ている。
[0142] 第 2図 Bに示されるようにテトラマー陽性細胞の強度は、 2— 3対数までテトラマー陰 性細胞のそれより同等で強力 た。本発明者らは、ドナー番号 4の Epl73特異的ポリ クローナル CTL株の限界希釈培地から T細胞クローン、 C27を確立した。
[0143] テトラマーでのこの研究は、ポリクローナル及びモノクローナル Epl73 特異的 CD8 陽性 T細胞の両者力 HLA— A2402ZEp 173複合体に指向する高親和性の細胞レ セプターを持って!/、たことを示した。
[0144] 力べして、 Epl73 特異的 CTLクローン力 この CTL細胞株カも榭立された。
実施例 2
[0145] ペプチド ΕΌ 173 特異的 CTLクローンの特件 1
7) CTLアツセィ（CTLアツセィ）
本発明者らは、 C27が HLA— Α24の前後関係において腫瘍細胞の表面上におい て自然に生じて、提示されたペプチドを認識するかどうかをさらに試験した。
[0146] クロミニゥム標識細胞を C27の添カ卩前に総 HLAクラス I、 HLA— Α24、或いは HLA
A2分子に特異的なモノクローナル抗体のいずれかで、インキュベートし、細胞傷害 性アツセィを 10のェフエクタ一-標的比で実施した。
[0147] 即ち、標的細胞（PC9細胞）を 37°Cで 1時間の間 100 1の培養培地中においてク 口ミゥム (51Cr)で標識した。幾つかの実験において、事前に特定した量のブロッキン グ抗体 W6Z32 (抗 HLAクラス I)、 MA2. 1 (抗 HLA— A2)、及び Al 1. 1 (抗 HLA
-A24)を HLA拘束の特定のためにエフェクター細胞をカ卩える 30分前にゥエルに加
[0148] プレートを 37°Cで 4時間インキュベーションし、そして上澄みを γ—カウンターでカウ ントした。
[0149] 特異的51 Cr遊離パーセントは、 100 x (実験的な遊離-自然の遊離) Z (最大遊 離 -自然の遊離)で計算した。
[0150] その結果を図 3及び図 5に示す。 [0151] 図 3中 Aは、ペプチド Epl73及びコントロール ·ペプチド EBV— LMP419の示された 濃度における T2— A24細胞に対する C27、 Epl73特異的 CTLクローンの細胞傷害 性を 1のェフエクタ一一標的比における51 Cr遊離アツセィによって特定されている。
[0152] その結果、 Epl73—特異的 CTLクローン、 C27は ΙΟΟρΜの低いペプチド濃度の E p 173でパルスした T2— A24細胞に対して細胞傷害性を示したが、コントロール ·ぺプ チドの EBV— LMP419では示さなかった。
[0153] また、種々の癌細胞株に対する C27の細胞傷害性の結果を第 5図及び表 2に示し た。
[0154] [表 2]
起源 Ep-CAM HLA-A24 (MFIa)
RT-PCR 肺癌
LU99 大細胞疲 + + (87.16)
PC9 腺瘙 ++ + (43.53)
11-18 腺 + (73.67)
LC99A 大細胞瘙 + + (96.71)
LC65A 小細胞癌 + - (3.67)
LC-l/sq 鱗状細胞癌 + + (70.56)
A549 mm - (3-21)
A549-A24 腺癌 N.D.1 + (109.73)
QG56 鱗状細胞癌 + - (2-65)
QG56-A24 鱗状細胞癌 N.D. + (84.12) 胃癌
MKN28 腺癒 + - (7.67)
MN 45 mm + (47.99) 大腸癌
C0LO320 DM mm + (35.35) その他
HSC-2 口鱗状細胞癌 + (34.40)
K562 白血病 + - (5.23)
T2-A24 BXTハイプリッド細胞 + Π97.75)
a 平均蛍光強度は HLA-A24mAb及び FITC標識抗マゥス lgG抗体
F(ab')2フラグメントを用いた免疫蛍光により評価した。
b 行わなかった。
[0155] 標的細胞として HLA— A24陽性の 8種の癌細胞株及び HLA— A24陰性の癌細胞 株に対する C27、 Ep 173—特異的 CTLクローンの細胞傷害性の結果を表 2に示す。
[0156] 肺腺癌細胞株 11—18、 COLO320DM及び A549を除く全ての細胞株は、 Ep— C AMを発現していた。 HLA— A2402遺伝子は、 A549及び QG56の中にレトロウイ ルス的に形質転換され、 A549— A24及び QG56— A24として名づけられた形質転 換体は、それぞれ標的細胞としても使用された。細胞傷害性は、指摘された各ェフ クタ一一標的比（40:1,20:1,10,1,5:1)で51 Cr遊離アツセィによって特定した。 K562は ナチュラルキラー細胞に対して感受性の代表的な細胞株である。
[0157] 該第 5図又は表 2に示されるように、 C27は、肺癌細胞株の PC9、 LU99、 LC—lZ sq及び LC99A、或いは口頭扁平上皮細胞腫瘍細胞株 HSC— 2、或いは HLA—A2 4及び Ep— CAMの両者を発現する胃癌細胞株 MKN45を効率的に傷害した。しか しながら、 HLA— A24陽性 Ep— CAM陰性細胞株（A549- A24及び COLO320DM)、 或いは HLA— A24陰性及び Ep— CAM陽性細胞株又は Ep— CAM陰性細胞株 ( OG56、 A549、 MNK28)のいずれかに対する殺傷効果は認められなかった。 HLA— A 2402遺伝子を HLA— A24陰性 QG56細胞 (QG56-A24)の中に導入したとき、 C27 は標的細胞を殺した。 K562細胞に対する傷害性はわずかであった。
[0158] これらのデータは Ep 173 特異的 CTLが HLA— A24及び Ep— CAMの両者を発現 する腫瘍細胞を殺すことを証明した。
[0159] また、第 3図中 Bは、 HLA— A2402陽性細胞株、 PC9に対する Epl73 特異的 CT Lクローン、 C27の細胞傷害性に関する抗 HLA— A24モノクローナル抗体の抑制効 果を示している。
[0160] 即ち、 C27は、肺癌細胞株の PC9細胞（HLA— A24陽性 Ep— CAM陽性肺癌細胞 株）に対する C27の細胞傷害性は、 HLA— A24又は汎クラス I分子 (W6Z32)に対す る特異的モノクローナル抗体によってブロックされた力 S、抗 HLA— A2モノクローナル 抗体によってはブロックされな力つた。
8)コーノレドターゲットインヒピションアツセィ（cold target inhibition assay)
コールドターゲットインヒピションアツセィは、ァライ（Arai)ら（
Blood,97:2903-2907,2001)に記載のように実施した。
[0161] 即ち、 T2— A24細胞を最終濃度 1x10— 5Mで 1時間ェピトープペプチド Epl73、又 は EBV— LMP419でインキュベートした。
[0162] 数回洗浄した後、ペプチド パルスされた T2— A24細胞と標的細胞との比が 40： 1
、 20 : 1、 10 : 1、 5 : 1になるように数を合わせて、 2xl04個のエフェクター細胞と 1時 間の間インキュベーションした。そして 2xl03個の51 Cr標識された PC9細胞を各ゥェ ノレ〖こカロ; tた。 細胞傷害性は、 7) CTLアツセィの項目に記載したようにして測定した。
[0163] 第 3図中 Cは、コールドターゲットインヒピションアツセィの結果を示す。図 3C中、 Ep 173 (參）又はコントロール EBV— LMP419 (國）ペプチドをパルスした T2— A24細胞（ コールド）と、クロミニゥム標識 PC9細胞 (ホット）との数比を横軸に示す。また C27によ る PC9細胞の傷害性を％として縦軸に示す。オープン 'サークルはコールド標的なし の細胞傷害性を示す。
[0164] その結果、 PC9細胞に対する C27介在細胞傷害性が、 Epl73をパルスされた T2— A24細胞の存在によって特異的に抑制された力 無関係なペプチドでは抑制されな かった。
[0165] このように、 C27介在 PC9細胞傷害性が抗 HLA— A24モノクローナル抗体又は Ep 173 パルスされたコールド標的細胞の!/、ずれかによつてブロックされたので、 CTLク ローンは、腫瘍細胞の表面上に自然に提示される Epl73に対する卓越した特異性を 疑う余地なく証明した。
実施例 3
[0166] ペプチド Er> 173 特異的 CTLクローンの特性 2
9) RT— PCR
全 RNAは GenElute mRNA Miniprepキット (シグマ社製)を使用し、培養された 細胞株力も抽出した。遺伝子特異的オリゴヌクレオチド 'プライマーは Proligo (プロリ ゴ 'ジャパン社製)で合成し、 Ep— CAMの mRNA発現を評価するために使用した。 R T PCRに用いたプライマーを以下の示した：
フォワード ·プライマー： ATGGCGCCCCCGCAGGTCCT (配列番号 8) リバース 'プライマー ： TTATGCATTGAGTTCCCTATGCATCTCACC (配列番号 9)
RT— PCRはサーマル ·サイクラ一 (パーキン'エルマ一社製)を用 、て実施し、 PCR 産物は 1. 5%ゲル電気泳動とェチジゥム ·ブロマイド視覚化によって分析した。
[0167] PCRは、 94°Cで 5分間を 1サイクル、 94°Cで 30秒間、 58°Cで 30秒間、 72°Cで 1分 間のセットを 30サイクル、 72°Cで 7分間を 1サイクルの条件で行った。
10)ウェスタン'プロット分析 ウェスタン'プロット分析は、シュワルツら (J.Immnol,165:768-778,2000)の方法を少し 修飾して実施した。即ち、細胞は、 4°Cで 30分間溶解緩衝液 (50mMトリス Z塩酸、 pH 7. 5、 5mM塩ィ匕マグネシウム、 ImM EDTA、 0. 5%トリトン X— 100、 ΙΟ ^ Μロイぺプ チトン： leupeptin、 2. 8 Mぺプスタイン： pepstain、 及び 0. 85mMフエ-ルメタンスル フォ-ルフロリド： phenylmethanesulfonyl fluoride)にお 、て溶解した。溶解された細胞 核上清は蛋白濃度を測定するために波長 280Z260nmで定量した。そして、さらに 130 gの蛋白部分を 12%SDS— PAGEに付した。蛋白は、 Immobilon— P膜 (ミリ ポア ·コーポレーション社製)上にプロットされ、 4°Cで一晩 100%低脂肪乾燥ミルク及 び 0. 1%ツイーン 20を含む PBSでブロックした。
[0168] さらに Ep— CAMに特異的なモノクローナル抗体 (LabVision社製)で探して、バーオ キシダーゼ複合ヒッジ抗マウス IgG(Zymed社製)で検出した。
[0169] 蛋白は ECLウェスタン'プロット検出システム (アマシャム'バイオサイェンシズ社製） を用いて視覚化した。
[0170] 癌細胞株の Ep— CAM発現を RT— PCR及びゥヱスタン.プロット分析によって試験 した結果を第 4図に示す。
[0171] 15種の癌細胞株の 12株（80%)が Ep— CAMを発現しているように思われた。 HLA
A24の発現は、抗 HLA— A24モノクローナル抗体を使用する間接免疫蛍光試験 によって試験した。試験した 15の癌細胞株のうち、 10株が HLA-A24発現陽性であ つた o
[0172] 上記実施例に示されたように、本発明者らは、 Ep— CAMから誘導された新規な H LA— A2402拘束性ェピトープを得た。少なくとも、ェピトープペプチド、 Epl73 (RY QLDPKFI；配列番号 1)は HLA A2402Zペプチド複合体に指向する高親和性 T 細胞レセプターを保有する CTLを誘導する能力を持っており、該ペプチドを用いた 免疫療法が期待できる。
産業上の利用可能性
[0173] 本発明のペプチドは、 HLA— A2402を有する広範囲のヒトの上皮性癌に対する癌 ワクチンとして好適に使用できる。

Claims

請求の範囲 [1] 以下の (1)、（2)、（3)又は (4)のペプチド。 (1) 配列番号 1に記載のアミノ酸配列力 なるペプチド (2) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列力 なるペプチド (3) 配列番号 1において 1又は 2以上のアミノ酸が付加、欠失又は置換されたァミノ 酸配列からなり、かつ HLA— A2402分子と複合して HLA— A2402拘束性細胞傷害 性 Tリンパ球に認識され得る又はこれを誘導し得る変異体ペプチド (4) 配列番号 2において 1又は 2以上のアミノ酸が付加、欠失又は置換されたァミノ 酸配列からなり、かつ HLA— A2402分子と複合して HLA— A2402拘束性細胞傷害 性 Tリンパ球に認識され得る又はこれを誘導し得る変異体ペプチド [2] 以下の (1)又は (2)のペプチド。
(1) 配列番号 1に記載のアミノ酸配列力 なるペプチド
(2) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列力 なるペプチド
[3] 請求項 1又は 2に記載のペプチドを有効成分として含む癌ワクチン。
[4] 癌が上皮性癌である請求項 3に記載の癌ワクチン。
[5] 癌が大腸癌、肺癌、乳癌、胃癌、口腔癌、膝癌、食道癌、上咽頭癌、子宮癌、前立腺 癌、胆嚢癌力 なる群より選ばれる癌である請求項 3又は 4に記載の癌ワクチン。
[6] 白血球抗原として HLA— A2402を有するヒトのための請求項 3、 4又は 5に記載の癌 ワクチン。
[7] 請求項 1又は 2に記載のペプチドを有効成分として含む細胞傷害性 Tリンパ球の誘 導剤。
[8] 白血球抗原として HLA— A2402を有するヒトのための請求項 7に記載の細胞傷害性
Tリンパ球の誘導剤。
[9] 以下の (5)、（6)、（7)又は (8)のポリヌクレオチド。
(5) 配列番号 10に記載の塩基配列力もなるポリヌクレオチド
(6) 配列番号 11に記載の塩基配列力 なるポリヌクレオチド
(7) 配列番号 10に記載の塩基配列力もなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件 下でハイブリダィズし、かつ、 HLA— A2402分子と複合して HLA— A2402拘束性細 胞傷害性 Tリンパ球に認識され得る又はこれを誘導し得るペプチドをコードする変異 体ポリヌクレオチド
(8) 配列番号 11に記載の塩基配列力 なるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件 下でハイブリダィズし、かつ、 HLA— Α2402分子と複合して HLA— Α2402拘束性細 胞傷害性 Τリンパ球に認識され得る又はこれを誘導し得るペプチドをコードする変異 体ポリヌクレオチド
[10] 請求項 9に記載のポリヌクレオチドを有効成分として含む上皮性癌の遺伝子治療剤。
[11] 請求項 9に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
[12] 請求項 11に記載の組換えベクターが導入された形質転換体。
[13] 請求項 12に記載の形質転換体を培養する工程と、培養物から請求項 1又は 2に記 載のペプチドを回収する工程とを含む請求項 1又は 2に記載のペプチドの製造方法
[14] 請求項 1又は 2に記載のペプチドがパルスされた抗原提示細胞。
[15] 請求項 14に記載の抗原提示細胞を有効成分として含む癌ワクチン。
[16] 癌が上皮性癌である請求項 15に記載の癌ワクチン。
[17] 癌が大腸癌、肺癌、乳癌、胃癌、口腔癌、膝癌、食道癌、上咽頭癌、子宮癌、前立腺 癌、胆嚢癌力もなる群より選ばれる癌である請求項 15又は 16に記載の癌ワクチン。
[18] 白血球抗原として HLA— Α2402を有するヒトのための請求項 15、 16又は 17に記載 の癌ワクチン。
[19] 請求項 14に記載の抗原提示細胞を有効成分として含む細胞傷害性 Τリンパ球の誘 導剤。
[20] 白血球抗原として HLA— Α2402を有するヒトの治療のための請求項 19に記載の細 胞傷害性 Τリンパ球の誘導剤。
[21] 請求項 1又は 2に記載のペプチド又は請求項 14に記載の抗原提示細胞上に提示さ れた腫瘍抗原ェピトープ ·ペプチドと、主要組織適合抗原とが複合した主要組織適 合抗原複合体。
[22] 請求項 1又は 2に記載のペプチド又は請求項 14に記載の抗原提示細胞上に提示さ れた腫瘍抗原ェピトープ 'ペプチドと、 HLA— Α2402分子と、 β 2ミクログロブリンとの 複合体である請求項 21に記載の主要組織適合抗原複合体。
[23] 請求項 21又は 22に記載の主要組織適合抗原複合体を有効成分として含む癌ワク チン。
[24] 癌が上皮性癌である請求項 23に記載の癌ワクチン。
[25] 癌が大腸癌、肺癌、乳癌、胃癌、口腔癌、膝癌、食道癌、上咽頭癌、子宮癌、前立腺 癌、胆嚢癌力もなる群より選ばれる癌である請求項 23又は 24に記載の癌ワクチン。
[26] 白血球抗原として HLA— A2402を有するヒトの治療のための請求項 23、 24又は 25 に記載の癌ワクチン。
[27] 請求項 21又は 22に記載の主要組織適合抗原複合体を有効成分として含む細胞傷 害性 Tリンパ球の誘導剤。
[28] 白血球抗原として HLA— A2402を有するヒトの治療のための請求項 27に記載の細 胞傷害性 Tリンパ球の誘導剤。
[29] 請求項 1又は 2に記載のペプチド又は請求項 14に記載の抗原提示細胞上に提示さ れた腫瘍抗原ェピトープ ·ペプチドと、主要組織適合抗原とが複合した主要組織適 合抗原複合体のテトラマー。
[30] 以下の (a)— (d)のいずれか 1以上を用いて末梢血リンパ球を刺激することにより得られ る細胞傷害性 Tリンパ球。
(a) 請求項 1又は 2に記載のペプチド
(b) 請求項 14に記載の抗原提示細胞
(c) 請求項 21又は 22に記載の主要組織適合抗原複合体
(d) 請求項 29に記載の主要組織適合抗原複合体のテトラマー
[31] 前記 (a)— (d)のいずれか 1以上を用いて末梢血リンパ球を刺激することにより主要組 織適合抗原複合体又は Z及びそのテトラマーと細胞傷害性 Tリンパ球との結合体を 形成し、この結合体力も単離することにより得られるものである請求項 30に記載の細 胞傷害性 Tリンパ球。
[32] 請求項 30又は 31に記載の細胞傷害性 Tリンパ球を有効成分として含む癌の受動免 疫療法剤。
[33] 癌が上皮性癌である請求項 32に記載の受動免疫療法剤。
[34] 癌が大腸癌、肺癌、乳癌、胃癌、口腔癌、膝癌、食道癌、上咽頭癌、子宮癌、前立腺 癌、胆嚢癌力もなる群より選ばれる癌である請求項 32又は 33に記載の受動免疫療 法剤。
[35] 白血球抗原として HLA— A2402を有するヒトのための請求項 32、 33又は 34に記載 の受動免疫療法剤。
[36] 末梢血に以下の (a)— (d)のいずれかを作用させる工程と、
(a) 請求項 1又は 2に記載のペプチド
(b) 請求項 14に記載の抗原提示細胞
(c) 請求項 21又は 22に記載の主要組織適合抗原複合体
(d) 請求項 29に記載の主要組織適合抗原複合体のテトラマー
末梢血中の細胞傷害性 T細胞又はそれが産生するサイト力インを定量する工程と を含む末梢血中の HLA - A2402拘束性細胞傷害性 Tリンパ球の定量方法。
[37] 白血球抗原として HLA— A2402を有するヒトに、以下の (a)— (d)のいずれ力 1以上を 投与する癌の治療又は改善方法。
(a) 請求項 1又は 2に記載のペプチド
(b) 請求項 14に記載の抗原提示細胞
(c) 請求項 21又は 22に記載の主要組織適合抗原複合体
(d) 請求項 29に記載の主要組織適合抗原複合体のテトラマー
[38] 白血球抗原として HLA— A2402を有するヒトの末梢血から単核細胞画分を採取する 工程と、
単核細胞画分を以下の (a)— (d)のいずれか 1以上と共に培養する工程と、
(a) 請求項 1又は 2に記載のペプチド
(b) 請求項 14に記載の抗原提示細胞
(c) 請求項 21又は 22に記載の主要組織適合抗原複合体
(d) 請求項 29に記載の主要組織適合抗原複合体のテトラマー
細胞傷害性 Tリンパ球が誘導及び Z又は活性化された単核細胞画分を患者の血 液中に戻す工程と
を含む癌の治療又は改善方法。
[39] 白血球抗原として HLA— A2402を有するヒトに、以下の (a)— (d)のいずれ力 1以上を 投与する細胞傷害性 Tリンパ球の誘導方法。
(a) 請求項 1又は 2に記載のペプチド
(b) 請求項 14に記載の抗原提示細胞
(c) 請求項 21又は 22に記載の主要組織適合抗原複合体
(d) 請求項 29に記載の主要組織適合抗原複合体のテトラマー
[40] 白血球抗原として HLA— A2402を有するヒトに、請求項 30又は 31に記載の細胞傷 害性 Tリンパ球を投与する癌の治療又は改善方法。
[41] 請求項 1又は 2に記載のペプチド又は請求項 14に記載の抗原提示細胞上に提示さ れた腫瘍抗原ェピトープ 'ペプチドと、 HLA— A2402分子と、 β 2ミクログロブリンとの 複合体のテトラマーである請求項 21に記載の主要組織適合抗原複合体のテトラマ
[42] 請求項 41に記載の主要組織適合抗原複合体のテトラマーを有効成分として含む癌 ワクチン。
[43] 癌が上皮性癌である請求項 42に記載の癌ワクチン。
[44] 癌が大腸癌、肺癌、乳癌、胃癌、口腔癌、脾癌、食道癌、上咽頭癌、子宮癌、前立腺 癌、胆嚢癌力もなる群より選ばれる癌である請求項 42又は 43に記載の癌ワクチン。
[45] 白血球抗原として HLA— Α2402を有するヒトの治療のための請求項 42、 43又は 44 に記載の癌ワクチン。
[46] 請求項 41に記載の主要組織適合抗原複合体のテトラマーを有効成分として含む細 胞傷害性 Τリンパ球の誘導剤。
[47] 白血球抗原として HLA— Α2402を有するヒトの治療のための請求項 46に記載の細 胞傷害性 Τリンパ球の誘導剤。
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