ES2269480T3

ES2269480T3 - Uso de una cepa de lactobacillus que reduce los factores de riesgo asociados al sindrome metabolico.

Info

Publication number: ES2269480T3
Application number: ES01983031T
Authority: ES
Inventors: Marie-Louise Johansson; Marek Naruszewicz
Original assignee: Probi AB
Current assignee: Probi AB
Priority date: 2000-11-10
Filing date: 2001-11-12
Publication date: 2007-04-01
Anticipated expiration: 2021-11-12
Also published as: DE60124131T2; NZ525657A; NO20032056L; KR20040018304A; CN1226039C; JP4200518B2; SE0004124D0; CA2434035C; CA2434035A1; KR20080047628A; ATE343392T1; AU2002214486B2; KR100886728B1; JP2004520276A; WO2002038165A1; DK1331938T3; NO330992B1; EP1331938A1; PL203824B1; AU1448602A

Abstract

El uso de una cepa de Lactobacillus plantarum para la preparación de un medicamento para reducir los factores de riesgo implicados en el síndrome meta- bólico, que incluyen tensión arterial incrementada, concentración de insulina elevada y concentración de leptina elevada.

Description

Uso de una cepa de Lactobacillus que reduce los factores de riesgo asociados al síndrome metabólico.

Antecedentes de la invención

El síndrome metabólico consiste en varios trastornos metabólicos, muchos de los cuales favorecen el desarrollo de ateroesclerosis e incrementan el riesgo de enfermedad cardiovascular. Los componentes principales del síndrome metabólico son dislipidemia aterogénica, tensión arterial incrementada, glucosa plasmática elevada y un estado protrombótico. La dislipidemia aterogénica se manifiesta en forma de triglicéridos elevados, colesterol de lipoproteínas de baja densidad (LDL) incrementado y colesterol de lipoproteínas de elevada densidad (HDL) disminuido. No se conocen totalmente los mecanismos subyacentes en el síndrome metabólico, pero la mayoría de los pacientes con el síndrome exhiben una concentración de insulina elevada y resistencia a la acción celular de la insulina.

Los pacientes que tienen obesidad abdominal manifiestan a menudo los múltiples factores de riesgo del síndrome metabólico. Cualquier paciente cuya concentración de triglicéridos excede de 150 mg/dl es sospechoso de síndrome metabólico. Una elevación suave de la glucosa en ayunas de 110-125 mg/dl es otra pista de la presencia de síndrome metabólico. La primera prioridad al tratar la dislipidemia del síndrome metabólico debería ser, sin embargo, disminuir las lipoproteínas aterogénicas, tales como LDL, lo que actualmente se realiza de forma muy eficaz con estatinas (Scott M. Grundy, Hypertriglyceridemia, insulin resistance, and the metabolic syndrome, Am J Cardiol 1999;
83:25F-29F).

Estado de la técnica

Se ha demostrado previamente que la complementación de la dieta con Lactobacillus reduce de forma eficaz la concentración de fibrinógeno así como la concentración de colesterol en sangre en pacientes hipercolesterolémicos, véase el documento WO 99/07827.

Se ha investigado el efecto de la leche fermentada que contiene proteínas del suero sobre los lípidos séricos, y se ha informado en J Dairy Sci, feb. de 2000; 83(2):255-63. Después de 8 semanas de consumo, la concentración de colesterol de lipoproteínas de elevada densidad mostró un aumento significativo. Además, el índice aterogénico, es decir (colesterol total - colesterol de lipoproteínas de elevada densidad)/colesterol de lipoproteínas de elevada densidad, y la tensión arterial sistólica se redujeron de forma significativa. Las cepas ensayadas fueron Lactobacillus casei y Streptococcus thermophilus.

El documento WO 96/29083 se refiere a cepas de Lactobacillus plantarum que tienen una adhesina específica de manosa, que pertenecen especialmente a un grupo con más de un 70% de similitud respecto de L. plantarum 299, DSM 6595 en cuanto a REA, para la preparación de una composición farmacéutica que inhibe la unión de bacterias patógenas que expresan adhesinas específicas de manosa a la superficie de las células epiteliales. Se describió L. plantarum 299v, DSM 9843 como una cepa preferida. Este grupo parece comprender todas las cepas de Lactobacillus plantarum que se han aislado de mucosa intestinal humana.

Descripción del dibujo

La figura es un dendrograma que muestra la similitud en % entre las diferentes cepas analizadas de Lactobacillus que se han caracterizado mediante el método REA, basado en el coeficiente de correlación producto-momento de Pearson y UPGMA.

Descripción de la invención

Se ha descubierto que en pacientes con concentraciones de colesterol moderadamente elevadas la complementación de la dieta con ProViva, un producto alimenticio funcional que contiene zumo de frutas, avena fermentada y Lactobacillus plantarum 299v (DSM 9843), disminuye significativamente la concentración de colesterol de LDL y la concentración de fibrinógeno, así como las concentraciones de insulina y leptina, y también la tensión arterial sistólica, e incrementa la concentración de colesterol de HDL. Esto significa que se influye de forma positiva en la mayor parte de los factores de riesgo implicados en el síndrome metabólico.

Se cree que este efecto se puede atribuir a la fermentación de las bacterias en el intestino, lo que da origen a los ácidos grasos de cadena corta (AGCC), ácidos acético y propiónico. Los ácidos acético y propiónico se absorben hacia la sangre, pasan al hígado y entran en las rutas metabólicas. Se ha postulado que los AGCC, principalmente ácido propiónico, mejoran la tolerancia a la glucosa e inhiben la síntesis de colesterol en el hígado, presumiblemente inhibiendo la elevación de las concentraciones de ácidos grasos libres en el suero y mejorando la sensibilidad a la insulina. Se ha descubierto que dichos AGCC también tienen efecto sobre la expresión de PPAR, y se ha demostrado que un aumento de PPAR incrementa la producción de ApoA1, el constituyente principal de HDL.

En un estudio previo en voluntarios adultos sanos, se demostró que la administración de una bebida de frutas que contiene Lactobacillus plantarum 299v (Johansson et al., Int J Food Microbiol 42 (1998) 29-38) incrementa significativamente la concentración fecal de ácidos grasos de cadena corta, y especialmente de ácido propiónico y ácido acético. Este efecto se podría explicar al estimular 299v la flora bacteriana en el colon para producir ácido acético y ácido propiónico. Sin embargo, no todas las cepas de Lactobacillus provocan este incremento de ácidos grasos de cadena corta. En un estudio posterior (Molin et al., en manuscrito) se ha demostrado que Lactobacillus rhamnosus 271 (DSM 6594), así como una cepa de Streptococcus thermophilus, no dan origen a este incremento de AGCC en heces. Tampoco lo hace una cepa ensayada de Lactobacillus acidophilus.

También se ha demostrado que el ácido propiónico tiene efecto sobre la concentración de colesterol (Zapolska-Downar et al., Eur J Clin Invest 2000; 30:1-3) en un ensayo clínico con ibuprofeno, un derivado de ácido propiónico. Además de la reducción de factores celulares de agresión oxidativa y de la inhibición de la adhesividad de los monocitos al endotelio, también se descubrió que se incrementaron las concentraciones de colesterol de HDL.

Así, la presente invención se refiere al uso de una cepa de Lactobacillus que da origen a cantidades incrementadas de ácido propiónico o ácido acético en el colon, para la preparación de un medicamento que reduce uno o más de los factores de riesgo implicados en el síndrome metabólico, que incluyen tensión arterial incrementada, HDL disminuido, LDL incrementado, concentración de insulina elevada y concentración de leptina elevada en la sangre.

La invención se refiere especialmente al uso de una cepa de Lactobacillus que tiene la capacidad de reducir la tensión arterial, incrementar HDL y reducir LDL, la concentración de insulina y la concentración de leptina en la sangre.

Una cepa preferida de Lactobacillus a ser usada según la invención es Lactobacillus plantarum.

Otra propiedad preferida de las cepas a ser usadas según la invención es la capacidad de unirse a la mucosa intestinal. Parecen ser cruciales dos factores para la realización de los efectos ecológicos de los lactobacilos. El primero es la capacidad de colonizar el intestino, es decir, sobrevivir en número elevado durante un periodo de tiempo después de la última administración de bacterias vivas. Esta propiedad puede ser importante para la capacidad de los lactobacilos de inhibir el crecimiento y la proliferación de bacterias patógenas, pero no es suficiente. El segundo factor es la capacidad para unirse directamente a las células epiteliales intestinales o a las mucinas. Este puede ser uno de los factores que favorecen la colonización, pero no es un prerrequisito para la colonización.

Se ha demostrado que las cepas de Lactobacillus incrementan la producción de mucinas intestinales, y se cree que dichas mucinas neutralizan patógenos y mejoran la propagación de las bacterias. En un aspecto preferido de la invención, la cepa de Lactobacillus a ser usada según la invención debería tener también la capacidad de incrementar la producción de mucina en el colon.

La invención también se refiere a una cepa de Lactobacillus plantarum que pertenece al grupo que tiene una similitud mediante análisis con endonucleasa de restricción de más del 55% respecto de la cepa Lactobacillus plantarum 299, número de depósito DSM 6595, mediante el uso del coeficiente de correlación producto-momento de Pearson y el algoritmo de agrupamiento de pares con la media aritmética no ponderada (UPGMA; GelCompare 3.0, Applied Maths, Kortrijk, Bélgica) para la preparación de un medicamento que reduce uno o más de los factores de riesgo implicados en el síndrome metabólico, que incluyen tensión arterial incrementada, HDL disminuido, LDL incrementado, concentración de insulina elevada y concentración de leptina elevada en sangre. En un aspecto preferido de la invención, dichas cepas tienen la capacidad de reducir la tensión arterial, incrementar HDL y reducir LDL, la concentración de insulina y la concentración de leptina en sangre. El límite entre una similitud del 55% y del 70% está poco definido. La mayoría de las cepas de la mucosa intestinal humana tienen una similitud dentro del 70%, pero, por ejemplo, Lactobacillus plantarum 386, con una similitud dentro del 55%, también se ha aislado de intestino humano y presenta los mismos mecanismos de unión que las otras cepas del grupo.

Los ejemplos de dichas cepas preferidas de Lactobacillus plantarum se muestran en la figura, es decir: Lactobacillus plantarum 299, Lactobacillus plantarum 299v, Lactobacillus plantarum 107, Lactobacillus plantarum 105, Lactobacillus plantarum 79, Lactobacillus plantarum 275 y Lactobacillus plantarum 386. ATCC 14917^{T} indica el tipo de cepa para Lactobacillus plantarum.

Las cepas Lactobacillus plantarum 299 y 299v, que se aislaron de mucosa intestinal humana sana, se han depositado en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH el 2 de julio de 1991 y el 16 de marzo de 1995, respectivamente, y se les han asignado los números de depósito DSM 6595 (299) y DSM 9843 (299v).

En un aspecto preferido, la invención se refiere al uso de la cepa Lactobacillus plantarum 299v, DSM 9843.

Las bacterias a ser usadas según la invención se pueden administrar en un vehículo convencional para administrar un medicamento o un producto alimenticio en el intestino, tal como un sustrato fisiológicamente aceptable que puede ser fermentado por la bacteria en cuestión, así como comestibles de tipos diversos, especialmente basados en almidón o leche, pero también sustancias sólidas o líquidas inertes, tales como solución salina o agua. Un sustrato adecuado debería contener fibras líquidas o sólidas que no se reabsorben en el tracto gastrointestinal, y que cuando fermentan con Lactobacillus forman ácidos carboxílicos. Como ejemplo de sustratos adecuados que contienen almidón se pueden mencionar los cereales tales como avena y trigo, maíz, tubérculos tales como patatas, y ciertos frutos tales como plátanos verdes. Un sustrato preferido para el uso según la invención, que también proporciona a la composición un valor nutritivo excelente, es una solución nutritiva basada en harina de avena, por ejemplo como se describe en el documento WO 89/08405. Los ensayos han demostrado que el efecto de las cepas de Lactobacillus mejora si se proporcionan fibras alimenticias, por ejemplo en forma de gachas de harina de avena o de glucanos.

La invención se refiere especialmente al uso de la cepa de Lactobacillus en combinación con fibras alimenticias.

Las bacterias a ser usadas según la invención se pueden administrar de cualquier forma adecuada, preferiblemente de forma oral o rectal, por ejemplo en forma de enema. También se pueden administrar de manera enteral a través de un catéter insertado en el intestino por el estómago o directamente en el intestino.

Las bacterias se deberían proporcionar en una dosis terapéuticamente eficaz, y dicha dosis podría ser de 10^{8}, preferiblemente no inferior a 1 x 10^{10} ufc/d.

Según la invención, las cepas descritas de Lactobacillus se pueden usar para la preparación de un medicamento que incrementa la concentración de colesterol de HDL en suero; o para la preparación de un medicamento que reduce la tensión arterial sistólica elevada; o para la preparación de un medicamento que disminuye la concentración de insulina en suero; o para la preparación de un medicamento que reduce la concentración de leptina en suero.

Ejemplos Ejemplo 1 Efecto del ácido propiónico sobre la expresión del gen de PPAR in vitro

Este experimento se hizo para investigar el efecto de los ácidos grasos de cadena corta sobre la producción de PPAR.

Se obtuvieron células endoteliales de vena umbilical humana, HUVEC, de cordones umbilicales mediante digestión con colagenasa como describió Jaffe et al. (Biology of Endothelial Cells, Boston, Martinus Nijhoff Publishers, 1984, págs. 1-13). Brevemente, las venas de los cordones umbilicales se perfundieron con PBS para eliminar las células sanguíneas, se llenaron con un 0,1% de colagenasa (tipo Ia) y se dejaron durante 10 minutos a 37ºC. Las HUVEC suspendidas se complementaron con PBS, se centrifugaron y se cultivaron a 37ºC en matraces de 25 ml y placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos revestidos con gelatina llenados con medio 199, en aire atmosférico humidificado y con un 5% de CO_{2}. Se añadió ácido propiónico al medio de cultivo en cantidades de 0,1, 1,0 y 10,0 mmol/l, y se determinó el efecto del ácido sobre la expresión de PPAR.

Se extrajo el ARN total de las células mediante el método de Chomczynski, con el uso de TRIZOL (Gibco BRL). Después del aislamiento se comprobó la integridad de las muestras de ARN mediante electroforesis en gel de agarosa del 1% teñido con bromuro de etidio. La concentración total de ARN se calculó después de medidas espectrofotométricas a una longitud de onda de 260 nm. Cada muestra de ARN (500 ng) se incubó con 1 U de ADNasa I (Boehringer Mannheim, Alemania) durante 15 minutos a 37ºC, y posteriormente la ADNasa I se inactivó calentando a 75ºC durante 3 minutos. Tal ARN tratado con ADNasa (500 ng) se disolvió en 20 \mul de una mezcla de reacción que contenía 2,5 mM de dATP, dTTP, dCTP y dGTP (Progmega, EE.UU.), 20 U de ARNsin (Promega, EE.UU.), 100 pM de hexámeros aleatorios (Boehringer Mannheim, Alemania) y 20 U de transcriptasa inversa de MMLV (Boehringer Mannheim). La incubación se llevó a cabo a 37ºC durante 60 minutos; la temperatura de la reacción se elevó después a 94ºC durante 5 minutos para inactivar la enzima y finalmente se redujo a 4ºC. Se disolvió una alícuota de cADN (5 \mul de mezcla RT, cADN resultante de la transcripción de 125 ng de ARN) en 40 \mul de una mezcla de reacción que contenía tampón de PCR 10x (concentración final de Mg^{+2} 1,5 mM, Boehringer Mannheim), 2,5 mM de dATP, dTTP, dCTP y dGTP, 10 pM de cebadores de 5' y de 3' (grupos para PPAR y GAPDH, respectivamente) y 1 U de Taq polimerasa (Boehringer Mannheim). El perfil de amplificación consistió en una desnaturalización inicial a 94ºC durante 3 minutos, seguido de una desnaturalización a 94ºC durante 30 segundos, hibridación a 57ºC durante 1 minuto (tanto para PPAR como para GAPDH) y extensión a 72ºC durante 1 minuto. Para el análisis semicuantitativo, se estableció la linealidad de la ampli-
ficación de los cADNs de PPAR y GAPDH dependiendo del número de ciclo de PCR en experimentos preliminares.

Se usaron los siguientes grupos de cebadores en la amplificación mediante PCR:

PPAR

Hebra codificante: 5'-GCCCCTCCTCGGTGACTTATC-3'

Hebra complementaria: 5'-ATGACCCGGGCTTTGACCTT-3'

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GAPDH

Hebra codificante: 5'-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3'

Hebra complementaria: 5'-GTTGTCATGGATGACCTTGG-3'

Los productos de amplificación obtenidos mediante PCR (cADN de PPAR de 454 pb de longitud y cADN de GAPDH de 482 pb de longitud) se separaron mediante electroforesis en un gel de agarosa del 3%. Las imágenes de las bandas teñidas con bromuro de etidio de los cADNs de PPAR y GAPDH se fotografiaron con una cámara Polaroid DS-34. La intensidad de las bandas se midió de forma densitométrica con la macroinstrucción de análisis de geles suministrada con NIH Image. Todas las señales de PPAR se normalizaron respecto de las concentraciones de ARNm del gen constitutivo GAPDH y se expresaron como una proporción.

Los resultados se proporcionan en la Tabla 1 a continuación.

TABLA 1 Efecto del ácido propiónico sobre la expresión de ARNm de PPAR en células endoteliales humanas

	Concentración de ácido propiónico, mmol/l
Incremento de ARNm, %	0,1	1,0	10,0
	29,3	47,2	89,7

Los datos se expresan como porcentaje respecto del ARNm de GAPDH (100%).

Si se intercambia el ácido propiónico por ácido acético en el Ejemplo 1 anterior, se obtienen resultados similares.

Ejemplo 2 Estudio de los factores de riesgo metabólicos en fumadores sanos

Se realizó un estudio para investigar el efecto de ProViva (Sk\ring{a}nemejerier, Malmö, Suecia), una bebida de escaramujo (que consiste en un 95:5 de bebida de fruta:sopa de harina de avena fermentada) que contiene Lactobacillus plantarum 299v en una cantidad de 5 x 10^{7} ufc/ml y fibra de avena en una cantidad de 0,08 g/100 ml, sobre las concentraciones de fibrinógeno, colesterol, leptina e insulina en suero. Se dividieron aleatoriamente 19 hombres y 19 mujeres, fumadores sanos de edades comprendidas entre 35 y 45 años con concentraciones de fibrinógeno y colesterol moderadamente elevadas, en dos grupos A (n=18) y B (n=20). Al grupo A se le dieron 400 ml de ProViva por día, 200 ml por la mañana y 200 ml por la noche, y al grupo B se le dio la misma cantidad de placebo, es decir, la bebida de escaramujo sin avena fermentada. El experimento duró 6 semanas sin cambios en el estilo de vida.

Se extrajo sangre y se midió la tensión arterial antes del inicio del experimento y después de 6 semanas.

Después de seis semanas de administración se observó una reducción significativa en la tensión arterial sistólica (p<0,001), véase la Tabla 2. Esta disminución fue muy evidente en pacientes con niveles iniciales superiores de tensión arterial sistólica, y no se pudo detectar en el grupo tratado con placebo. Los datos proporcionados en la tabla son valores medios \pm DE.

El IMC permaneció aproximadamente en el mismo nivel en ambos grupos durante el experimento.

TABLA 2 Características clínicas antes y después de la administración de ProViva

1

Se determinaron las concentraciones de colesterol y triglicéridos en el suero mediante el uso de equipos enzimáticos (CHOD-PAP, GPO-PAP). Se midió el colesterol de HDL después de la precipitación de las lipoproteínas que contienen ApoB con ácido fosfotúngstico en presencia de Mg^{+2}. Se determinó el colesterol de LDL después de la precipitación de LDL con poli(sulfato de vinilo). Los procedimientos de laboratorio se basaron en equipos de análisis de Boehringer Mannheim. La glucosa se midió mediante el uso de glucosa oxidasa y equipos de análisis de Analco (PAP), y las determinaciones de fibrinógeno plasmático siguieron el método de Clauss basado en el tiempo de trombina (equipos de análisis de bioMérieux). La insulina se midió mediante el ensayo Abbott Imx Insulin (Abbott Laboratories, Tokio, Japón) y la leptina se cuantificó en suero por medio del equipo Human Leptin Ria (de Linco Research Inc., Charles, MD, EE.UU.).

No se pudieron observar cambios en las concentraciones plasmáticas de colesterol total y triglicéridos. Los pacientes del grupo A, sin embargo, mostraron una disminución del 12% en el colesterol de LDL y un incremento del 10% en el colesterol de HDL, véase la Tabla 3.

La concentración de fibrinógeno se redujo alrededor de un 10%.

También se halló una reducción significativa en las concentraciones de insulina y una reducción del 37% en la concentración de leptina.

TABLA 3 Efecto de la administración de ProViva sobre los parámetros bioquímicos

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3

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Ejemplo 3 Estudio de factores de riesgo metabólicos en pacientes de psoriasis

En este estudio se investigó el efecto de la administración de gachas de harina de avena concentrada fermentada con Lactobacillus plantarum 299v, DSM 9843, a un grupo de 6 pacientes con psoriasis recurrente sobre diferentes factores. Los pacientes estaban sin tratar, es decir, sin medicación durante al menos 6 semanas antes del inicio de la administración de las gachas de harina de avena concentrada, que contenía 1 x 10^{9} ufc/ml de L. plantarum. A cada paciente se le dieron 50 ml/d durante 12 semanas.

Se determinaron las concentraciones de HDL y LDL antes de la administración y después de 6 semanas. Los resultados se proporcionan en la siguiente Tabla 4.

TABLA 4 Concentraciones de colesterol de LDL y de HDL después de la administración de L. plantarum 299v

4

Los pacientes de psoriasis tienen en general valores de HDL bajos, y por lo tanto tienen un riesgo mayor de padecer síndrome metabólico. Este estudio demuestra que este riesgo se puede reducir mediante la ingestión de la bacteria Lactobacillus plantarum 299v.

Claims

1. El uso de una cepa de Lactobacillus plantarum para la preparación de un medicamento para reducir los factores de riesgo implicados en el síndrome metabólico, que incluyen tensión arterial incrementada, concentración de insulina elevada y concentración de leptina elevada.

2. El uso según la reivindicación 1 de una cepa de Lactobacillus plantarum que tiene la capacidad de unirse a la mucosa intestinal.

3. El uso según la reivindicación 1 ó 2, en el que la cepa es Lactobacillus plantarum 299v, DSM 9843.

4. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que la cepa de Lactobacillus plantarum se usa en combinación con fibras alimenticias.