ES2269047T3

ES2269047T3 - Procedimiento para la produccion de acido l-glutamico por fermentacion acompañada de precipitacion.

Info

Publication number: ES2269047T3
Application number: ES00117807T
Authority: ES
Inventors: Hiroshi c/o Ajinomoto Co. Inc. Izui; Mika c/o Ajinomoto Co. Inc. Moriya; Seiko c/o Ajinomoto Co. Inc. Hirano; Yoshihiko c/o Ajinomoto Co. Inc. Hara; Hisao c/o Ajinomoto Co. Inc. ITO; Kazuhiko c/o Zao Agri Matsui
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1999-08-20
Filing date: 2000-08-18
Publication date: 2007-04-01
Anticipated expiration: 2020-08-18
Also published as: JP4427878B2; MY129239A; EP1078989A2; USRE42350E1; KR20080083103A; CN1292421A; ID26915A; DE60029701T2; BR0003695A; RU2261272C2; ATE335081T1; US20050227334A1; EP1078989A3; BR0003695B1; EP1078989A8; JP2001333769A; KR20070106959A; DE60029701D1; DE60029701T8; CN101230366A

Abstract

Procedimiento para la producción de ácido L-glutámico por fermentación, que comprende cultivar un microorganismo en un medio líquido cuyo pH es ajustado a un pH en el que el ácido L-glutámico se precipite, para producir y acumular ácido L-glutámico y precipitar ácido L-glutámico en el medio que contiene una fuente de carbono, en el que el pH es de 3, 0 a 5, 0, en el que dicho microorganismo puede metabolizar una fuente de carbono a un pH de 3, 0 a 5, 0 en un medio líquido que contiene ácido L-glutámico a una concentración de saturación y la fuente de carbono, y presenta la capacidad de acumular ácido L-glutámico en una cantidad que exceda la cantidad que corresponde a la concentración de saturación en el medio líquido al pH.

Description

Procedimiento para la producción de ácido L-glutámico por fermentación acompañada de precipitación.

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento para la producción de ácido L-glutámico por fermentación acompañada de precipitación. El ácido L-glutámico se utiliza ampliamente como material de condimento, etcétera.

El ácido L-glutámico se produce generalmente mediante procedimientos de fermentación, utilizando las bacterias denominadas corineformes que producen ácido L-glutámico y que pertenecen al género Brevibacterium, Corynebacterium o Microbacterium, o sus dos cepas mutantes (Amino Acid Fermentation, págs 195-215, Gakkai Shuppan Center, 1986). Como procedimientos para la producción de ácido L-glutámico mediante fermentación utilizando otras cepas bacterianas se conoce un procedimiento que utiliza un microorganismo que pertenece al género Bacillus, Streptomyces, Penicillium o similar (patente US nº 3.220.929), un procedimiento que utiliza un microorganismo que pertenece al género Pseudomonas, Arthrobacter, Serratia, Candida, o similares (patente US nº 3.563.857), un procedimiento que utiliza un microorganismo que pertenece al género Bacillus, Pseudomonas, Serratia, Aerobacter aerogenes (al que se hace referencia habitualmente como Enterobacter aerogenes) o similar (Publicación de Patente Japonesa (Kokoku) nº 32-9393), un procedimiento que utiliza una cepa mutante de Escherichia coli (Solicitud de Patente Japonesa abierta al público (Kokai) nº 5-244970) y así sucesivamente. Además, los inventores de la presente invención han propuesto un procedimiento para la producción de ácido L-glutámico utilizando un microorganismo que pertenece al género Klebsiella, Erwinia o Pantoea (solicitud de patente japonesa abierta al público nº 2000-106869).

Además, se han dado a conocer varias técnicas para mejorar la capacidad para producir el ácido L-glutámico potenciando actividades de las enzimas biosintéticas del ácido L-glutámico utilizando las técnicas del ADN recombinante. Por ejemplo, se ha informado de que la introducción de un gen que codifica la citrato sintasa derivada de Escherichia coli o de Corynebacterium glutamicum fue efectiva para la potenciación de la capacidad de producción del ácido L-glutámico en las bacterias Corynebacterium o Brevibacterium (publicación de patente japonesa nº 7-121228). Además, la solicitud de patente japonesa abierta al público nº 61-268185 da a conocer una célula que aloja ADN recombinante que contiene un gen de la glutamato deshidrogenasa derivado de las bacterias Corynebacterium. Además, la solicitud de patente japonesa abierta la público nº 63-214189 da a conocer una técnica para mejorar la capacidad de producción del ácido L-glutámico amplificando un gen de la glutamato deshidrogenasa, un gen de la isocitrato deshidrogenasa, un gen de la aconitato hidratasa y un gen de la citrato sintasa.

Aunque la productividad del ácido L-glutámico ha aumentado considerablemente mediante la cría de los microorganismos mencionados anteriormente o la mejora de los procedimientos de producción, para responder a un aumento posterior de la demanda en el futuro, es necesario el desarrollo de procedimientos que produzcan ácido L-glutámico más eficientemente con un coste más bajo.

Se conoce un procedimiento en el que la fermentación se lleva a cabo cristalizando los L-aminoácidos que se acumulan en el cultivo (solicitud de patente japonesa abierta al público nº 62-288). En este procedimiento, la concentración de L-aminoácidos en el cultivo se mantiene por debajo de un cierto nivel precipitando los L-aminoácidos acumulados en el cultivo. Específicamente, el L-triptófano, la L-tirosina o la L-leucina se precipitan durante la fermentación, ajustando la temperatura o el pH del cultivo, o añadiendo un agente activo superficial al medio.

Aunque se conoce, tal como se ha descrito anteriormente, un procedimiento de fermentación con L-aminoácidos precipitantes, los aminoácidos apropiados para este procedimiento, son los de solubilidad acuosa relativamente baja, y no se conocen ejemplos de aplicación del procedimiento a aminoácidos altamente solubles en agua tal como el ácido L-glutámico. Además, el medio debe tener un pH bajo para precipitar el ácido L-glutámico. Sin embargo, las bacterias que producen ácido L-glutámico tales como las mencionadas anteriormente, no pueden desarrollarse bajo condiciones ácidas, y por tanto, la fermentación del ácido L-glutámico se lleva a cabo bajo condiciones de neutralidad (patentes US nº 3.220.929 y nº 3.032.474; Chao K.C. & Foster J.W., J. Bacteriol., 77, páginas 715-725 (1959)). Así, la producción del ácido L-glutámico por fermentación acompañada de precipitación no se conoce. Además, se sabe que el crecimiento de la mayoría de las bacterias acidófilas es inhibido por los ácidos orgánicos tales como el ácido acético, el ácido láctico y el ácido succínico (Yasuro Oshima Ed., "Extreme Environment Microorganism Handbook" p. 231, Science Forum; Borichewski R.M., J. Bacteriol., 93, pág 597-599 (1967), etc). Por tanto, se considera que muchos microorganismos son susceptibles al ácido L-glutámico, que es asimismo un ácido orgánico, bajo condiciones ácidas, y no han habido informaciones de que se intentara la investigación de microorganismos que mostraban capacidad productora del ácido L-glutámico bajo condiciones ácidas.

Sumario de la invención

En la situación habitual mencionada anteriormente, un objetivo de la presente invención consiste en investigar y criar un microorganismo que produzca ácido L-glutámico bajo condiciones de pH bajo y proporcionar un procedimiento para la producción de ácido L-glutámico utilizando un microorganismo obtenido mediante fermentación con precipitación del ácido L-glutámico.

\newpage

Los inventores de la presente invención consideraron durante el estudio para la mejora de la productividad del ácido L-glutámico mediante fermentación, que la inhibición de la producción por el ácido L-glutámico acumulado en un medio a una alta concentración, constituía una de las obstrucciones para la mejora de la productividad. Por ejemplo, las células tienen un sistema secretor y un sistema de toma para el ácido L-glutámico. Sin embargo, si el ácido L-glutámico, una vez secretado al medio, se incorpora otra vez a las células, no sólo falla eficientemente la producción, sino que, como resultado, se inhiben asimismo las reacciones biosintéticas del ácido L-glutámico. Para evitar la inhibición de la producción por dicha acumulación del ácido L-glutámico a alta concentración, los inventores de la presente invención rastrearon microorganismos que pueden proliferar bajo condiciones ácidas y en la presencia de una alta concentración de ácido L-glutámico. Como resultado, aislaron con éxito microorganismos que tenían dichas propiedades a partir del suelo, y por tanto, cumplieron con la presente invención.

Así, la presente invención proporciona lo siguiente:

(1): Un procedimiento para la producción de ácido L-glutámico mediante fermentación, que comprende cultivar un microorganismo en un medio líquido del cual se ajusta el pH a un pH en el que el ácido L-glutámico se precipite, para producir y acumular ácido L-glutámico y precipitar ácido L-glutámico en el medio que contiene una fuente de carbono, en el que el pH está entre 3,0 y 5,0,

: en el que dicho microorganismo puede metabolizar una fuente de carbono a un pH comprendido entre 0,3 a 0,5 en un medio líquido que contiene ácido L-glutámico a una concentración de saturación y la fuente de carbono y posee una capacidad para acumular ácido L-glutámico en una cantidad que exceda la cantidad que corresponde a la concentración de saturación en el medio líquido al pH.

(2): El procedimiento según (1), en el que dicho microorganismo posee por lo menos una de las siguientes características:

(a): el microorganismo potencia la actividad de una enzima que cataliza una reacción para la biosíntesis del ácido L-glutámico; y

(b): el microorganismo disminuye o es deficitario en la actividad de una enzima que cataliza una reacción que se ramifica a partir de una vía biosintética del ácido L-glutámico y que produce un compuesto distinto al ácido L-glutámico.

(3): El procedimiento según (2), en el que la enzima que cataliza la reacción para la biosíntesis del ácido L-glutámico, es por lo menos una seleccionada de entre citrato sintasa, fosfoenolpiruvato carboxilasa y glutamato deshidrogenasa.

(4): El procedimiento según cualquiera de los de (1) a (3), en el que la enzima que cataliza una reacción que se ramifica a partir de una vía biosintética del ácido L-glutámico y que produce un compuesto distinto al ácido L-glutámico, es la \alpha-cetoglutarato deshidrogenasa.

(5): El procedimiento según cualquiera de (1) a (4), en el que el microorganismo pertenece al género Enterobacter.

(6): El procedimiento según (5), en el que el microorganismo es Enterobacter Agglomerans.

(7): El procedimiento según (6), en el que el microorganismo es Enterobacter Agglomerans (AJ13601) FERM BP-7207.

(8): El procedimiento según (6), en el que el microorganismo posee una mutación que causa menos secreción extracelular de un material viscoso, comparado con una cepa tipo salvaje cuando se cultiva en un medio que contiene un sacárido.

(9): Procedimiento de cribado para un microorganismo, que comprende el cribado de un microorganismo apropiado para producir ácido L-glutámico mediante fermentación con ácido L-glutámico precipitante en un medio líquido de pH 3,0-5,0, que comprende inocular una muestra que contenga microorganismos, en un medio ácido que contiene ácido L-glutámico a una concentración de saturación y una fuente de carbono, y seleccionando una cepa que pueda metabolizar la fuente de carbono.

(10): El procedimiento según (9), en el que una cepa que puede crecer en el medio se selecciona como la cepa que puede matabolizar la fuente de carbono.

(11): Procedimiento para la producción de ácido L-glutámico mediante fermentación, que comprende el inicio del cultivo de un microorganismo en un medio líquido a un pH neutro y finalizando dicho cultivo a un pH al cual el ácido L-glutámico se precipita,

: en el que dicho microorganismo puede metabolizar una fuente de carbono a un pH de entre 3,0 y 5,0 en un medio líquido que contiene ácido L-glutámico a una concentración de saturación y de la fuente de carbono, y posee capacidad para acumular ácido L-glutámico en una cantidad que exceda la cantidad que corresponde a la concentración de saturación en el medio líquido al pH.

(12): El procedimiento según (11), en el que el pH del cultivo e controla introduciendo gas amoníaco en el medio.

(13): Microorganismo que tiene el número de registro FERM BP-7207.

Según el procedimiento de la presente invención, el ácido L-glutámico puede producirse mediante fermentación con precipitación de ácido L-glutámico. Como resultado, el ácido L-glutámico en el medio se mantiene por debajo de una cierta concentración, y el ácido L-glutámico puede obtenerse sin sufrir la inhibición del producto por el ácido L-glutámico a una alta concentración.

Breve descripción de los dibujos

La fig 1 muestra un mapa de restricción de un fragmento de ADN derivado de Enterobacter Agglomerans
pTWVEK101.

La fig 2 muestra la comparación de la secuencia aminoácida deducida a partir de la secuencia nucleótida del gen sucA derivado de Enterobacter Agglomerans y del derivado de Escherichia coli. Secuencia superior: Enterobacter Agglomerans, secuencia inferior: Escherichia coli (lo mismo se aplicará en adelante en la presente memoria).

La figura 3 muestra la comparación de la secuencia aminoácida deducida de la secuencia nucleótida del gen sucB derivado de Enterobacter Agglomerans y de la derivada de Escherichia coli.

La figura 4 muestra la comparación de la secuencia aminoácida deducida de la secuencia nucleótida del gen sucC derivado de Enterobacter Agglomerans y de la derivada de Escherichia coli.

La figura 5 muestra la comparación de la secuencia aminoácida deducida de la secuencia nucleótida del gen sdhB derivado de Enterobacter Agglomerans y de la derivada de Escherichia coli.

La fig 6 muestra la construcción del plásmido pMWCPG que tiene un gen gltA, un gen ppc y un gen gdhA.

La figura 7 muestra la construcción del plásmido RSF-Tet que posee el origen de replicación del plásmido RSF1010 de amplio espectro hospedador y un gen de resistencia a la tetraciclina.

La figura 8 muestra la construcción del plásmido RSFCPG que posee el origen de replicación del plásmido RSF1010 de amplio espectro hospedador, un gen de resistencia a la tetraciclina, un gen gltA, un gen ppc y un gen gltA.

La figura 9 muestra la construcción del plásmido pSTVCB que tiene un gen gltA.

Descripción detallada de la invención

En adelante, la presente invención se explicará detalladamente.

El microorganismo utilizado en el procedimiento de la presente invención es un microorganismo que (1) puede metabolizar una fuente de carbono a un pH de 3,0 a 5,0 en un medio líquido que contiene ácido L-glutámico a una concentración de saturación y la fuente de carbono y (2) posee la capacidad para acumular el ácido L-glutámico en una cantidad que excede la cantidad que corresponde a la concentración de saturación en el medio líquido al pH.

El término "concentración de saturación" significa una concentración del ácido L-glutámico disuelta en un medio líquido cuando éste está saturado con ácido L-glutámico.

A continuación, se describirá un procedimiento para el cribado de un microorganismo que puede metabolizar una fuente de carbón en un medio líquido que contiene ácido L-glutámico a una concentración de saturación y la fuente de carbono a un pH comprendido entre 3,0 y 5,0. Se inocula una muestra que contiene microorganismos en un medio líquido que contiene ácido L-glutámico a una concentración de saturación y una fuente de carbono a un pH de 3,0 a 5,0, seleccionándose una cepa que pueda metabolizar la fuente de carbono. El microorganismo se utiliza para producir ácido L-glutámico mediante fermentación con precipitación del ácido L-glutámico. Si el pH es demasiado alto, se convierte en difícil dejar que el microorganismo produzca suficiente ácido L-glutámico para precipitación. Por tanto, el pH está preferentemente en el intervalo mencionado anteriormente.

Si el pH de una solución acuosa que contiene ácido L-glutámico disminuye, la solubilidad del ácido L-glutámico disminuye significativamente aproximadamente el pKa del grupo \gamma-carboxilo (4,25, 25ºC). La solubilidad se convierte en la más baja en el punto isoeléctrico (pH 3,2) y el ácido L-glutámico que excede la cantidad correspondiente a la concentración de saturación, precipita. Aunque depende de la composición del medio, el ácido L-glutámico se disuelve habitualmente en una cantidad de 10 a 20 g/l a un pH de 3,2, de 30 a 40 g/l a un pH de 4,0 y de 50 a 60 g/l a un pH de 4,7, a aproximadamente 30ºC. El pH no se hace inferior a 3,0, porque el efecto de precipitación del ácido L-glutámico se estabiliza por debajo de un cierto valor.

Además, la expresión de que un microorganismo "puede metabolizar la fuente de carbono" significa que puede proliferar o puede consumir la fuente de carbono aunque incluso no pueda proliferar, es decir, indica que cataboliza las fuentes de carbono tales como sacáridos o ácidos orgánicos. Específicamente, por ejemplo, si un microorganismo prolifera cuando se cultiva en un medio líquido que contiene ácido L-glutámico con una concentración de saturación a un pH de 5,0 a 4,0, preferentemente a un pH de 4,5 a 4,0, más preferentemente a un pH de 4,3 a 4,0, más preferentemente todavía a un pH de 4,0, a una temperatura apropiada, por ejemplo, 28ºC, 37ºC o 50ºC durante 2 a 4 días, este microorganismo puede metabolizar la fuente de carbono en el medio. Además, por ejemplo, incluso si un microorganismo no prolifera cuando es cultivado en un medio líquido que contiene ácido L-glutámico a una concentración de saturación a un pH de 4,3 a 4,0, preferentemente pH de 4,5 a 4,0, más preferentemente de 4,3 a 4,0, aún más preferentemente pH de 4,0 a una temperatura adecuada, por ejemplo, 28ºC, 37ºC a 50ºC durante 2 a 4 días, el microorganismo que consume la fuente de carbono en el medio es el que puede metabolizar la fuente de carbono en el medio.

El microorganismo que puede metabolizar la fuente de carbono incluye un microorganismo que puede desarrollarse en el medio líquido.

La expresión de que un microorganismo "puede desarrollarse" significa que puede proliferar o puede producir ácido L-glutámico aunque incluso no pueda proliferar. Específicamente, por ejemplo, si un microorganismo prolifera cuando se cultiva en un medio líquido que contiene ácido L-glutámico con una concentración de saturación a un pH de 5,0 a 4,0, preferentemente a un pH de 4,5 a 4,0, más preferentemente a un pH de 4,3 a 4,0, más preferentemente todavía a un pH de 4,0, a una temperatura apropiada, por ejemplo, 28ºC, 37ºC o 50ºC durante 2 a 4 días, este microorganismo puede desarrollarse en el medio. Además, por ejemplo, incluso si un microorganismo no prolifera cuando se cultiva en un medio líquido sintético que contiene ácido L-glutámico con una concentración de saturación a un pH de 5,0 a 4,0, preferentemente a un pH de 4,5 a 4,0, más preferentemente a un pH de 4,3 a 4,0, más preferentemente todavía a un pH de 4,0, a una temperatura apropiada, por ejemplo, 28ºC, 37ºC o 50ºC durante 2 a 4 días, el microorganismo que aumenta la cantidad del ácido L-glutámico en el medio es que puede desarrollarse en el medio.

La selección descrita anteriormente puede repetirse dos o más veces bajo idénticas condiciones o cambiando el pH o la concentración del ácido L-glutámico. Puede llevarse a cabo una selección inicial en un medio que contenga ácido L-glutámico a una concentración menor que la concentración de saturación, y puede realizarse entonces una selección subsiguiente en un medio que contenga ácido L-glutámico con una concentración de saturación. Además, pueden seleccionarse cepas que muestren propiedades favorables tales como una tasa superior de proliferación.

Además de las propiedades descritas anteriormente, el microorganismo que se utiliza en el procedimiento de la presente invención posee capacidad para acumular el ácido L-glutámico en una cantidad que excede a la que corresponde a la concentración de saturación del ácido L-glutámico en un medio líquido. El pH del medio líquido mencionado anteriormente es preferentemente el mismo o es próximo al del medio que se utiliza para el cribado de un microorganismo que posee la propiedades mencionadas anteriormente (1). Habitualmente, un microorganismo se convierte en susceptible al ácido L-glutámico a una concentración alta, pues el pH se hace más bajo. Por tanto, es preferible que el pH no sea bajo desde el punto de vista de la resistencia al ácido L-glutámico, pero se prefiere que lo sea desde el punto de vista de la producción del ácido L-glutámico con su precipitación. Para satisfacer estas condiciones, el pH es del orden de 3 a 5, preferentemente de 4,0 a 5,0, más preferentemente de 4,0 a 4,7, más preferentemente todavía de 4,0 a 4,5, particularmente preferido de 4,0 a 4,3.

Como microorganismo que se utiliza en el procedimiento de la presente invención o por consiguiente sus materiales de cría, pueden mencionarse, por ejemplo, microorganismos que pertenecen al género Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Pantoea, Erwinia, Escherichia, Corynebacterium, Alicyclobacillus, Bacillus, Saccharomyces, o similares. Entre estos, se prefieren los microorganismos que pertenecen al género Enterobacter. De aquí en adelante, los microorganismos de la presente invención se explicarán principalmente respecto a los microorganismos que pertenecen al género Enterobacter, pero la presente invención puede aplicarse a microorganismos que pertenecen a otros géneros y que no están limitados al género Enterobacter.

Como microorganismos que pertenecen a Enterobacter, pueden mencionarse específicamente Enterobacter Agglomerans, preferentemente la cepa AJ13355 de Enterobacter Agglomerans. Esta cepa se aisló de un suelo en Iwata-shi, Shizuoka, Japón, como una cepa que puede proliferar en un medio que contiene ácido L-glutámico y una fuente de carbono a un pH bajo.

Las propiedades fisiológicas de AJ13355 son las siguientes:

(1): Tinción Gram: negativa

(2): Comportamiento respecto al oxígeno: anaeróbico facultativo

(3): Catalasa: positivo

(4): Oxidasa: negativa

(5): Capacidad reductora del nitrato: negativa

(6): Ensayo de Voges-Proskauer: positivo

(7): Ensayo del Rojo de metilo: negativo

(8): Ureasa: negativo

(9): Producción de indol: positiva

(10): Motilidad:móvil

(11): Producción de H_{2}S en medio TSI: débilmente activa

(12): \beta-galactosidasa: positiva

(13): Propiedad asimiladora de sacáridos:

: Arabinosa: positiva

: Sacarosa: positiva

: Lactosa: positiva

: Xilosa: positiva

: Sorbitol: positiva

: Inositol: positiva

: Trehalosa: positiva

: Maltosa: positiva

: Glucosa: positiva

: Adonitol: negativa

: Rafinosa: positiva

: Salicina: negativa

: Melibiosa: positiva

(14): Propiedad asimiladora del glicerol: positiva

(15): Propiedades asimiladoras de los ácidos orgánicos:

: Acido cítrico: positiva

: Acido tartárico: negativa

: Acido glucónico: positiva

: Acido acético: positiva

: Acido galónico: negativa

(16): Arginina deshidratasa: negativa

(17): Ornitina descarboxilasa: negativa

(18): Lisina descarboxilasa: negativa

(19): Fenilalanina desaminasa: negativa

(20): Formación de pigmento: amarillo

(21): Capacidad de licuefacción de la gelatina: positiva

(22): pH del Crecimiento: el desarrollo es posible a un pH de 4,0, con un buen crecimiento a un pH de entre 4,5 y 7.

(23): Temperatura de crecimiento: buen crecimiento a 25ºC, buen crecimiento a 30ºC, buen crecimiento a 37ºC. el crecimiento es posible a 42ºC, el crecimiento no es posible a 45ºC.

Basándose en estas propiedades bacteriológicas, se determinó AJ13355 como Enterobacter Agglomerans.

El Enterobacter Agglomerans AJ13355 se depositó en el National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International trade and Industry (código postal: 305-8566, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japón) el 19 de febrero de 1998, recibiendo un número de registro FERM P-16644. Se transfirió a continuación a un depósito internacional según lo que estipula el Tratado de Budapest de 11 de enero de 1999 y recibió un número de registro FERM-BP-6614.

El microorganismo que se utiliza en el procedimiento de la presente invención puede ser un microorganismo que posee originalmente una capacidad productora de ácido L-glutámico o uno que tiene capacidad productora de ácido L-glutámico que se imparte o potencia mediante cría, utilizando el tratamiento mutacional, las técnicas del ADN recombinante, o similares.

La capacidad productora de ácido L-glutámico puede ser impartida o potenciada aumentando, por ejemplo, la actividad de una enzima que cataliza una reacción para la biosíntesis del ácido L-glutámico. La actividad productora del ácido L-glutámico puede asimismo potenciarse disminuyendo la actividad de una enzima que cataliza una reacción que se ramifica a partir de la vía biosintética del ácido L-glutámico y que produce un compuesto distinto al ácido L-glutámico, o que hace que la actividad sea deficitaria.

Como enzimas que catalizan una reacción para la biosíntesis del ácido L-glutámico pueden mencionarse la glutamato deshidrogenasa (a la que en adelante se denominará también "GDH"), glutamina sintetasa, glutamato sintasa, isocitrato deshidrogenasa, aconitato hidratasa, citrato sintasa (a la que en adelante se llamará también "CS"), fosfoenolpiruvato carboxilasa (a la que en adelante de denominará asimismo "PEPC"), piruvato deshidrogenasa, piruvato quinasa, enolasa, fosfogliceromutasa, fosfoglicerato quinasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, triosafosfato isomerasa, fructosa bisfosfato aldolasa, fosfofructoquinasa, flicosa fosfato isomerasa y así sucesivamente. Entre estas enzimas, se prefieren uno, dos o tres de CS, PEPC y GDH enzimas. Además, se prefiere que las actividades de las tres enzimas, CS, PEPC y GDH, se potencien en el microorganismo. En particular, se prefiere CS de Brevibacterium lactofermentum porque no presenta inhibición por el ácido \alpha-cetoglutárico, el ácido L-glutámico y el NADH.

Para potenciar la actividad de CS, PEPC o GDH, por ejemplo, un gen que codifica CS, PEPC o GDH puede clonarse en un plásmido apropiado y un microorganismo huésped puede transformarse con el plásmido obtenido. El número de copias del gen que codifica CS, PEPC o GDH (en adelante, abreviado como "gen gltA", "gen ppc" y "gen gdhA" respectivamente) en la célula de la cepa transformada, aumenta, dando lugar a un aumento de la actividad de CS, PEPC o GDH.

Los genes gltA, gen ppc y gen gdhA clonados se introducen en la cepa parental inicial mencionada anteriormente, solos, o en una combinación arbitraria de dos o tres tipos de ellos. Cuando dos o tres tipos de los genes se introducen, dos o tres tipos de los genes pueden clonarse en un tipo de plásmido e introducirse en el huésped, o clonarse separadamente en dos o tres tipos de plásmidos que pueden coexistir e introducirse en el huésped.

Dos o más tipos de genes que codifican enzimas del mismo tipo, pero que provienen de distintos microorganismo, pueden introducirse en el mismo huésped.

Los plásmidos descritos anteriormente no están particularmente limitados, ya que son autónomamente replicables en las células de un microorganismo que pertenece a, por ejemplo, el género Enterobacter o similar, sino que, por ejemplo, pueden mencionarse pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pMW119, pMW118, pMW219, pMW218, pACYC177, pACYC184 y así sucesivamente. Además de estos, pueden utilizarse asimismo los vectores de ADN fágico.

La transformación puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante el procedimiento de D.M. Morrison (Methods in Enzymology, 68, 326 (1979)), el procedimiento en el que la permeabilidad del ADN aumenta tratando a las células de la bacteria receptora con cloruro de calcio (Mandel M. y Higa A., J.J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)), la electroporación (Miller J.H., "A short Course in Bacterial Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory Press, U.S.A: 1992), o similar.

La actividad de CS, PEPC o GDH puede aumentar asimismo dejando que copias múltiples de un gen gltA, de un gen ppc o de un gen gdhA se encuentren en el ADN cromosómico de la cepa parental inicial mencionada anteriormente gltA, que se convierte así en huésped. Para introducir copias múltiples del gen A, del gen ppc o del gen gdhA en el ADN cromosómico de un microorganismo que pertenece al género Enterobacter o similar, puede utilizarse una secuencia de la cual existen copias múltiples en el ADN cromosómico, tales como el ADN repetitivo y las repeticiones inversas que se encuentran en el extremo de un transposón. Alternativamente, pueden introducirse copias múltiples de los genes en el ADN cromosómico utilizando la transferencia de un transposón que contenga el gen gltA, el gen ppc o el gen gdhA. Como resultado, aumenta el número de copias del gen gltA, del gen ppc o del gen gdhA, en una célula de la cepa transformada, aumentando de este modo la actividad de CS, PEPC o GDH.

Como organismos para constituir una fuente del gen gltA, del gen ppc o del gen gdhA de los cuales aumenta el número de copias, puede utilizarse cualquier organismo siempre que posea actividad CS, PEPC o GDH. Entre otros, las bacterias, que son procariotas, por ejemplo, se prefieren las que pertenecen a los géneros Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Pantoea, Erwinia, Escherichia, Corynebacterium, Brevibacterium y Bacillus. Como ejemplos específicos, pueden mencionarse Escherichia coli, Brevibacterium lactofermentum y así sucesivamente. El gen gltA, el gen ppc o el gen gdhA pueden obtenerse a partir del ADN cromosómico de los microorganismos descritos anteriormente.

El gen gltA, el gen ppc y el gen gdhA pueden obtenerse utilizando una cepa mutante que es deficitaria en la actividad de CS, PEPC o GDH, para aislar un fragmento de ADN que complemente la auxotrofia del ADN cromosómico de los microorganismos mencionados anteriormente. Ya que las secuencias nucleótidas de estos genes de Escherichia coli y Corynebacterium se han dilucidado ya (Biochemistry, 22, págs 5243-5249 (1983); J. Biochem., 95, págs 909-916 (1984); Gene, 27, págs 193-199 (1984); Microbiology, 140, págs 1817-1828 (1994); Mol. Gen.Genet., 218, págs 330-339 (1989); Molecular Microbiology, 6, págs 317-326 (1992), pueden obtenerse también mediante PCR, utilizando cebadores sintetizados basados en cada secuencia nucleótida y con ADN cromosómico como matriz.

La actividad de CS, PEPC o GDH puede aumentarse asimismo potenciando la expresión del gen gltA, del gen ppc o del gen gdhA además de la amplificación génica anteriormente mencionada. Por ejemplo, la expresión puede potenciarse reemplazando un promotor para el gen gltA, el gen ppc o el gen gdhA con otros promotores más potentes. Por ejemplo, el promotor lac, el promotor trp, el promotor trc, el promotor tac, el promotor P_{R} y el promotor P_{L} del fago lambda se conocen como promotores más potentes. El gen gltA, el gen ppc y el gen gdhA, de los cuales se reemplaza el promotor, son clonados en un plásmido e introducidos en el microorganismo huésped, o introducidos en el ADN cromosómico del microorganismo huésped utilizando ADN repetitivo, repeticiones inversas, transposón o similares.

La actividad de CS, PEPC o GDH puede potenciarse asimismo reemplazando el promotor del gen gltA, del gen ppc o del gen gdhA en el cromosoma con otros promotores más potentes (véase WO 87/03006 y la solicitud de patente japonesa abierta al público nº 61-268183), o insertando un promotor más potente por encima de la secuencia codificante de cada gen (véase Gene, 29, págs 231-241 (1984)). Específicamente, puede realizarse la recombinación homóloga entre el ADN que contiene el gen gltA, el gen ppc y el gen gdhA de los cuales se reemplaza el promotor con uno más potente o una parte del mismo y el gen correspondiente en el cromosoma.

Ejemplos de la enzima que cataliza una reacción que se ramifica a partir de la vía biosintética del ácido L-glutámico y que produce un compuesto distinto al ácido L-glutámico, incluyen la \alpha-cetoglutarato deshidrogenasa (a la que en adelante se hará referencia como "\alphaKGDH"), isocitrato liasa, fosfato acetiltransferasa, acetato quinasa, acetohidroxiácido sintasa, aetolactato sintasa, formato acetiltransferasa, lactato deshidrogenasa, glutamato descarboxilasa, 1-pirrolin deshidrogenasa y así sucesivamente. Entre estas enzimas, la \alphaKGDH es la preferida.

Para obtener una disminución o un déficit en la actividad de las enzimas mencionadas anteriormente en un microorganismo que pertenece al género Enterobacter o similar, puede introducirse en los genes de la enzimas antes mencionadas, mediante un procedimiento habitual de mutagénesis o de ingeniería genética, una mutación que provoque la disminución o el déficit en la actividad intracelular de la enzima.

Ejemplos del procedimiento mutagenético incluyen, por ejemplo, procedimientos que utilicen la irradiación con rayos X o ultravioleta, procedimientos que utilicen el tratamiento con un agente mutagénico tal como la N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina, y así sucesivamente. El sitio en el que se introduce la mutación en el gen puede ser una región codificante que codifique una proteína enzimática, o una región que regule la expresión, tal como un promotor.

Ejemplos de los procedimientos de ingeniería genética incluyen, por ejemplo, procedimientos que utilicen la recombinación génica, la transducción, la fusión celular y así sucesivamente. Por ejemplo, un gen de resistencia a un medicamento se inserta en un gen diana clonado para preparar un gen que ha perdido su función (gen defectuoso). A continuación este gen defectivo se introduce en una célula de un microorganismo huésped, y el gen diana en el cromosoma es reemplazado con el gen defectuoso mencionado anteriormente utilizando la recombinación homóloga (perturbación génica).

La disminución o la deficiencia en la actividad intracelular de la enzima diana y el grado de disminución de la actividad puede determinarse midiendo la actividad enzimática de un extracto celular o de su fracción purificada obtenida a partir de una cepa candidata, y comparándola con la de una cepa salvaje. por ejemplo, la actividad \alphaKGDH puede medirse mediante el procedimiento de Reed et al (Reed L.J. y Mukherjee B.B., Methods in Enzymology, 13, págs 55-61 (1969)).

Dependiendo de la enzima diana, la cepa mutante diana puede seleccionarse basándose en el fenotipo de la cepa mutante. Por ejemplo, una cepa mutante que es deficitaria en la actividad \alphaKGDH o disminuye la actividad de LKGDH, no puede proliferar, o muestra una tasa de proliferación marcadamente disminuida en un medio mínimo que contiene glucosa o un medio mínimo que contiene ácido acético o ácido L-glutámico como una fuente exclusiva de carbono bajo condiciones aeróbicas. Sin embargo, la proliferación normal puede llevarse a cabo incluso bajo las mismas condiciones añadiendo ácido succínico o lisina, metionina y ácido diaminopimélico a un medio mínimo que contenga glucosa. Utilizando estos fenómenos como indicadores, pueden seleccionarse las cepas mutantes con una actividad \alphaKGDH disminuida o deficitaria.

En el documento WO 95/34672 se describe detalladamente un procedimiento para preparar la cepa deficitaria en el gen \alphaKGDH de Brevibacterium lactofermentum utilizando la recombinación homóloga. Procedimientos similares pueden aplicarse a otros microorganismos.

Además, técnicas tales como la clonación génica y la fragmentación y unión del ADN, la transformación y así sucesivamente, se describen detalladamente en Molecular Cloning, 2ª edición, Cold Spring Harbor Press, 1989 y así sucesivamente.

Como un ejemplo específico de una cepa mutante deficitaria en la actividad \alphaKGDH o con una actividad \alphaKGDH disminuida, obtenida tal como se ha descrito anteriormente, puede mencionarse la Enterobacter Agglomerans AJ13356. El Enterobacter Agglomerans AJ13355 se depositó en el National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (código postal: 305-8566, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japón) el 19 de febrero de 1998, recibiendo el número de registro FERM BP-6615. Se transfirió a continuación a un depósito internacional según lo estipulado por el Tratado de Budapest de 11 de enero de 1999 y recibió el número de registro BP-6615. El Enterobacter Agglomerans AJ13356 es deficitario en la actividad \alphaKGDH como resultado de la perturbación del gen de la subunidad \alphaKGDH-E1 (SucA).

Cuando Enterobacter Agglomerans, un ejemplo del microorganismo utilizado en la presente invención, se cultiva en un medio que contiene un sacárido, se secreta extracelularmente un material viscoso, que da lugar a una escasa eficiencia de la operación. Por tanto, cuando se utiliza Enterobacter Agglomerans que presenta dicha propiedad de secretar el material viscoso, es preferible utilizar una cepa mutante que secreta una cantidad menor de material viscoso que la cepa salvaje. Ejemplos de procedimientos de mutagénesis incluyen, por ejemplo, procedimientos que utilizan la irradiación con rayos X o rayos ultravioleta, procedimientos que utilizan el tratamiento con un agente mutagénico tal como la N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina y así sucesivamente. Puede seleccionarse una cepa mutante con una disminución de la secreción del material viscoso inoculando células bacterianas mutagenizadas en un medio que contiene un sacárido, por ejemplo, una placa con el medio LB que contiene 5 g/l de glucosa, cultivándola con una inclinación de 45 grados aproximadamente y seleccionando una colonia que no muestre deslizamiento del líquido.

En la presente invención, la transmisión o potenciación de la capacidad productora del ácido L-glutámico y la transmisión de otras propiedades favorables tales como la mutación para una menor secreción viscosa descrita anteriormente, puede llevarse a cabo en un orden arbitrario.

Cultivando el microorganismo utilizado en el procedimiento de la presente invención en un medio líquido del cual se ajusta el pH a un pH en el que el ácido L-glutámico precipita, puede producirse y acumularse el ácido L-glutámico en el medio, que se precipita en éste. El ácido L-glutámico puede precipitar asimismo iniciando el cultivo a un pH neutral y finalizándolo entonces a un pH en el que precipite el ácido L-glutámico.

El pH al cual precipita el ácido L-glutámico significa aquél en el que el ácido L-glutámico precipita cuando el microorganismo produce y acumula el ácido L-glutámico.

Como medio mencionado anteriormente puede utilizarse si se requiere un medio habitual de nutrientes que comprende una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, sales minerales y nutrientes traza orgánicos tales como aminoácidos y vitaminas, de manera que el pH se ajuste a un pH al que precipite el ácido L-glutámico. Puede utilizarse así mismo un medio sintético o un medio natural. La fuente de carbono y la fuente de nitrógeno utilizada en el medio puede ser cualesquiera de las utilizadas por la cepa cultivada.

Como fuentes de carbono, se utilizan sacáridos tales como glucosa, glicerol, fructosa, sacarosa, maltosa, manosa, galactosa, hidrolizado de almidón y molasas. Además, pueden utilizarse ácidos orgánicos tales como ácido acético y ácido cítrico, cada uno solo o en combinación con otra fuente de carbono.

Como fuente de nitrógeno, se utilizan amonio, sales amónicas tales como sulfato amónico, carbonato amónico, cloruro amónico, fosfato amónico, acetato amónico, nitratos y así sucesivamente.

Como nutrientes traza orgánicos, aminoácidos, vitaminas, ácidos grasos, ácidos nucleicos, se utilizan los que contienen estas sustancias como peptonas, casaminoácidos, extractos de levadura y productos de descomposición de las proteínas de soja. Cuando se utiliza una cepa mutante auxotrófica que requiere un aminoácido para la metabolización, debe añadirse el nutriente necesario.

Como sales minerales se utilizan fosfatos, sales de magnesio, sales de calcio, sales de hierro, sales de manganeso y y así sucesivamente.

Como procedimiento de cultivo, se lleva a cabo habitualmente el cultivo oxigenado, controlando que la temperatura de fermentación esté comprendida entre 20 y 42ºC y el pH esté comprendido entre 3 y 5, preferentemente entre 4 y 5, más preferentemente entre 4 y 4,7, particularmente, de manera preferente, entre 4 y 4,5. Así, después de entre aproximadamente 10 horas y 4 días de cultivo, se acumula en el cultivo una cantidad sustancial de ácido L-glutámico. El ácido L-glutámico acumulado que excede de la cantidad correspondiente a la concentración de saturación, precipita en el medio.

Después de que el cultivo ha finalizado, el ácido L-glutámico que ha precipitado en el cultivo, puede recuperarse mediante centrifugación, filtración o similares. El ácido L-glutámico disuelto en el medio puede recuperarse según procedimientos conocidos. Por ejemplo, el ácido L-glutámico puede aislarse concentrando el caldo de cultivo para cristalizarlo o aislarlo mediante cromatografía de intercambio iónico o procedimiento similar. El ácido L-glutámico que ha precipitado en el caldo de cultivo puede aislarse conjuntamente con el ácido L-glutámico que se ha disuelto en el medio después de que ha cristalizado.

Según el procedimiento de la presente invención, el ácido L-glutámico que excede de la cantidad que corresponde a la concentración de saturación, precipita, y la concentración del ácido L-glutámico disuelto en el medio se mantiene a un nivel constante. Por tanto, puede reducirse la influencia del ácido L-glutámico sobre el microorganismo, a una concentración alta. De acuerdo con esto, se hace posible criar un microorganismo que posee además la capacidad mejorada de producir el ácido L-glutámico. Además, ya que el ácido L-glutámico precipita como cristales, se suprime la acidificación del caldo de cultivo por acumulación de ácido L-glutámico, y por tanto, la cantidad de álcali utilizada para mantener el pH del cultivo, puede reducirse significativamente.

Ejemplos

En adelante, la presente invención se explicará más específicamente haciendo referencia a los ejemplos siguientes.

(1) Cribado de microorganismos que poseen resistencia al ácido L-glutámico en un entorno ácido

Se llevó a cabo el cribado de un microorganismo que posee resistencia al ácido L-glutámico en un entorno ácido de la manera siguiente: cada una de las 500 muestras obtenidas del entorno natural, incluyendo el suelo, frutas, plantas, aguas fluviales, en una cantidad de 1 g, se suspendió en 5 ml de agua esterilizada, de los cuales 200 \mul se aplicaron sobre 20 ml de medio sólido, ajustándose el pH a 4,0 con HCl. La composición del medio fue: 3 g/l de glucosa, 1 g/l de (NH_{4})_{2}SO_{4}, 0,2 g/l de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,5 g/l de KH_{2}PO_{4}, 0,2 g/l de NaCl, 0,1 g/l de CaCl_{2}\cdot7H_{2}O, 0,01 g/l de FeSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,01 g/l de MnSO_{4}\cdot4H_{2}O, 0,72 mg/l de ZnSO_{4}2H_{2}O, 0,64 mg/L de CuSO_{4}\cdot5H_{2}O, 0,72 mg/l de CoCl_{2}\cdot6H_{2}O, 0,4 mg/l de ácido bórico, 1,2 mg/l de Na_{2}MoO_{4}2H_{2}O, 50 \mug/l de biotina, 50 \mug/l de pantotenato de calcio, 50 \mug/l de ácido fólico, 50 \mug/l de inositol, 50 \mug/l de niacina, 50 \mug/l de ácido p-aminobenzoico, 50 \mug/l de clorhidrato de piridoxina, 50 \mug/l de riboflavina, 50 \mug/l de clorhidrato de tiamina, 50 ml de cicloheximida, 20 g/l de agar.

Los medios en placa sobre los cuales se sembraron las muestras mencionadas anteriormente se incubaron a 28º 37ºC, o 50ºC, durante 2 y 4 días, obteniéndose 378 cepas, cada una de las cuales formó una colonia.

A continuación, cada una de las cepas obtenidas tal como se ha descrito anteriormente, se inoculó en un tubo de ensayo de 16,5 cm de longitud y de 14 mm de diámetro, que contenía 3 ml de medio líquido (Ajustado al pH 4,0 con HCl), que contenía una concentración de saturación de ácido L-glutámico y se cultivó a 28º 37ºC, o 50ºC, entre 24 horas y 3 días con agitación. Entonces, se seleccionaron las cepas que se desarrollaron. La composición del medio mencionado fue la siguiente: 40 g/l de glucosa, 20 g/l de (NH_{4})_{2} SO_{4}, 0,5 g/l de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 2 g/l de KH_{2}PO_{4}, 0,5 g/l de NaCl, 0,25 g/l de CaCl_{2}\cdot7H_{2}O, 0,02 g/l de FeSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,02 g/l de MnSO_{4}4H_{2}O, 0,72 mg/l de ZnSO_{4}2H_{2}O, 0,64 mg/l de CuSO_{4}\cdot5H_{2}O, 0,72 mg/l de CoCl_{2}\cdot6H_{2}O, 0,4 mg/l de ácido bórico, 1,2 mg/l de Na_{2}MoO_{4}\cdot2H_{2}O, 2 g/l de extracto de levadura.

Así, se obtuvieron con éxito 78 cepas de microorganismos que presentaban resistencia al ácido L-glutámico en un medio ácido.

(2) Selección de cepas con una tasa superior de crecimiento en medio ácido a partir de los microorganismos que poseen resistencia al ácido L-glutámico

Los diversos microorganismos que poseen resistencia al ácido L-glutámico en un medio ácido, que se obtuvieron tal como se ha descrito anteriormente, se inocularon cada uno en un tubo de ensayo de 16,5 cm de largo y 14 mm de diámetro, que contenía 3 ml de medio (ajustado a un pH de 4,0 con HCl), que se obtuvo añadiendo 20 g/l de ácido glutámico y 2 g/l de glucosa a medio M9 (Sambrook, J., Fritsh, E.F. y Maniatis, T., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), midiéndose la turbidez del medio a lo largo del tiempo para seleccionar cepas que mostraran una tasa de crecimiento favorable. Como resultado, como cepa que mostraba un crecimiento favorable, se obtuvo la cepa AJ13355 de un suelo en Iwata-shi, Shizuoka, Japón. Esta cepa se determinó como Enterobacter Agglomerans basándose en sus propiedades bacteriológicas descritas anteriormente.

(3) Adquisición de cepas con una secreción de material menos viscoso a partir de la cepa AJ13355 de Enterobacter Agglomerans

Ya que la cepa AJ13355 de Enterobacter Agglomerans secreta extracelularmente un material viscoso cuando se cultiva en un medio que contiene un sacárido, la eficiencia operativa no es favorable. Por tanto, se obtuvo una cepa con una secreción de material menos viscoso mediante el procedimiento de irradiación ultravioleta (Miller, J.H. et al., "A Short Course in Bacterial Genetics; Laboratory Manual", pág 150, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992).

La cepa AJ13355 de Enterobacter Agglomerans se irradió con rayos ultravioleta durante 2 minutos a una distancia de 60 cm de una lámpara ultravioleta de 60 vatios, cultivándose en medio LB durante la noche para fijar la mutación. La cepa mutada se diluyó e inoculó en medio LB que contenía 5 g/l de glucosa y 20 g/l de agar, de forma que se desarrollaran aproximadamente 100 colonias por placa, cultivándose a 30ºC durante la noche e inclinando la placa aproximadamente 45 grados, seleccionándose entonces 20 colonias que no mostraran deslizamiento del material viscoso.

Como cepa que satisfacía las condiciones de que ninguna reversión al tipo original apareció incluso después de 5 veces de sulbcultivo en medio LB que contenía 5 g/l de glucosa y 20 g/l de agar, y de que pudiera observarse un crecimiento equivalente al de la cepa original en el medio LB, se seleccionó la cepa SC17 a partir de las cepas escogidas anteriormente, añadiendo medio LB que contenía 5 g/l de glucosa y medio M9 (Sambrook, J et al, "Molecular Cloning", 2ª edición, Cold Spring Harbor Press, 1989) más 20 g/l de ácido L-glutámico y 2 g/l de glucosa, de los cuales se ajustó el pH a 4,5 con HCl.

(4) Construcción de la bacteria productora de ácido glutámico a partir de la cepa SC17 de Enterobacter Agglomerans (1) Preparación de una cepa deficitaria en \alphaKGDH a partir de la cepa SC17 de Enterobacter Agglomerans

Se preparó, a partir de la cepa SC17 de Enterobacter Agglomerans, una cepa deficitaria en \alphaKGDH con un sistema biosintético potenciado de ácido L-glutámico.

(i) Clonación del gen \alphaKGDH (al que en adelante, se hará referencia como "sucAB") de la cepa AJ13355 de Enterobacter Agglomerans

El gen sucAB de la cepa AJ13355 de Enterobacter Agglomerans se clonó seleccionando un fragmento de ADN que complementaba la propiedad no asimiladora de ácido acético de la cepa de Escherichia coli deficitaria en el gen subunitario \alphaKGDH-E1 (al que en adelante se denominará "sucA") del ADN cromosómico de la cepa AJ13355 de Enterobacter Agglomerans.

El ADN cromosómico de la cepa AJ13355 de Enterobacter Agglomerans se aisló mediante un procedimiento utilizado habitualmente cuando el ADN cromosómico se extrae de Escherichia coli (Text for Bioengineering Experiments, editado por the Society for Biosciencie and Bioengineering, Japón, pág 97-98, Bifukan, 1992). pTWV228 (resistente a la ampicilina) utilizado como un vector, estuvo comercialmente disponible a partir de Takara Shuzo Co., Ltd.

Los ADN cromosómicos de la cepa AJ13355 digerido con EcoT221 y pTWV228 digerida con PstI se unieron utilizando la T4 ligasa y se utilizaron para transformar la cepa JRG465 de Escherichia coli deficitaria en sucA (Herbert, J. et al, Mol. Gen. Genetics, 105, 182 (1969)). A partir de las cepas transformantes obtenidas anteriormente, se seleccionó una cepa que se desarrollaba en un medio mínimo de acetato, extrayéndose de ella un plásmido que se denominó pTWVEK101. La cepa JRG465 de Escherichia coli que albergaba pTWVEK101 recuperó la auxotrofia para el ácido succínico o la L-lisina y la L-metionina, además de la propiedad asimiladora del ácido acético esto sugiere que pTWVEK101 contiene el gen sucA de Enterobacter Agglomerans.

La Fig 1 muestra el mapa de restricción de un fragmento de ADN derivado de Enterobacter Agglomerans en pTWVEK101. La secuencia nucleótida determinada de la porción sombreada en la Fig 1, se muestra como SEC ID nº: 1. En esta secuencia, se encontraron secuencias nucleótidas que se consideran son dos ORF de longitud completa y dos secuencias nucleótidas que se consideran secuencias parciales de los ORF. Las SEC ID nº 2 a nº 5 muestran secuencias aminoácidas que pueden ser codificadas por estos ORF o secuencias parciales en un orden a partir del extremo 5'. Como resultado de la investigación de homologías para éstas, se reveló que la porción de la que se determinaron las secuencias nucleótidas, contenía una secuencia parcial de extremo 3' del gen de la proteína succinato deshidrogenasa hierro-azufre (sdhB), sucA de longitud total y el gen subunitario \alphaKGDH-E2 (sucB), y la secuencia parcial del extremo 5' del gen de la subunidad \beta de la succinil CoA sintetasa (sucC). Los resultados de comparación de las secuencias aminoácidas deducidas a partir de estas secuencias nucleótidas con las derivadas de Escherichia coli (Eur. J. Biochem., 141, págs 351-359 (1984); Eur. J. Biochem., 141, págs 361-374 (1984); Biochemistry, 24, págs 6245-6252 (1985)) se muestran en las Figs 2 a 5. De este modo, cada una de las secuencias aminoácidas mostró una homología muy intensa. Además, se encontró que un conjunto de sdhB-sucA-sucB-sucC se constituyó en el cromosoma de Enterobacter Agglomerans así como en Escherichia coli (Eur. J. Biochem., 141, págs 351-359 (1984); Eur. J. Biochem., 141, págs 361-374 (1984); Biochemistry, 24, págs 6245-6252 (1985)).

(ii) Adquisición de la cepa deficitaria en \alphaKGDH derivada de la cepa SC17 de Enterobacter Agglomerans

La recombinación homóloga se llevó a cabo utilizando el gen sucAB de Enterobacter Agglomerans obtenido tal como se describió anteriormente para obtener una cepa deficitaria en \alphaKGDH de Enterobacter Agglomerans.

Después de que pTWVEK101 fue sometido a digestión con SphI para extirpar un fragmento que contenía sucA, el fragmento se redondeó en su extremo con el fragmento Klenow (Takara Shuzo Co., Ltd), y se unió con pBR322 digerido con EcoRI y redondeado en el extremo con el fragmento Klenow, utilizando la T4 ADN ligasa (Takara Shuzo Co., Ltd). El plásmido obtenido se sometió a digestión en el sitio de reconocimiento BglII enzimático de restricción, que se sitúa sustancialmente en el centro de sucA utilizando esta enzima, se redondeó en su extremo con el fragmento Klenow, y se unió entonces otra vez empleando T4 ADN ligasa. Se consideró que el gen sucA no funcionó debido a que se introdujo una mutación por cambio en el marco de lectura en el sucA del plásmido nuevamente construido mediante el procedimiento anteriormente mencionado.

El plásmido construido tal como se ha descrito anteriormente se sometió a digestión con una enzima de restricción ApaLI, y se sometió a electroforesis en gel de agarosa para recuperar un fragmento de ADN que contenía sucA en el que se introdujo la mutación por cambio en el marco de lectura y un gen de resistencia a la tetraciclina derivado de pBR322. El fragmento recuperado de ADN se unió otra vez utilizando la T4 ADN ligasa para construir un plásmido para interrumpir el gen \alphaKGDH.

El plásmido para interrumpir el gen \alphaKGDH obtenido tal como se describió anteriormente, se utilizó para transformar la cepa SC17 de Enterobacter Agglomerans mediante electroporación (Miller, J.H. et al., "A Short Course in Bacterial Genetics; Handbook", pág 279, Cold Spring Harbor Laboratory Press, U.S.A. 1992), y una cepa en la que sucA en el cromosoma se reemplazó con un mutante tipo 1 mediante recombinación homóloga del plásmido, se obtuvo utilizando la resistencia a la tetraciclina como un indicador. La cepa obtenida se denominó como SC17sucA.

Para confirmar que la cepa SC17sucA era deficitaria en la actividad \alphaKGDH, la actividad enzimática se midió mediante el procedimiento de Reed et al (Reed, L.J. y Mukherjee, B.B., Methods in Enzymology, 13, págs 55-61 (1969)), hasta la fase logarítmica de crecimiento. Como resultado, se detectó la actividad \alphaKGDH de 0,073 (\DeltaABS/min/mg proteína) a partir de la cepa SC17, mientras que no se detectó la actividad de \alphaKGDH a partir de la cepa SC17sucA, confirmándose de este modo que sucA era deficitaria tal como se había previsto.

(2) Potenciación del sistema biosintético del ácido L-glutámico de la cepa SC17sucA Enterobacter Agglomerans

A continuación, un gen de la citrato sintasa, un gen de la fosfoenolpiruvato carboxilasa y un gen de la glutamato deshidrogenasa derivados de Escherichia coli se introdujeron en la cepa SC17sucA.

(i) Preparación del plásmido que posee el gen gltA, el gen ppc y el gen gdhA derivados de Escherichia coli

Los procedimientos para preparar un plásmido que tenga un gen gltA, un gen ppc y un gen gdhA serán explicados haciendo referencia a las Figuras 6 y 7.

Un plásmido que tenga un gen gdhA derivado de Escherichia coli, pBRGDH (solicitud de patente japonesa abierta al público nº 7-203980), se sometió a digestión con HindIII y SphI, redondeándose ambos extremos mediante tratamiento con la T4 ADN polimerasa, purificándose y recuperándose entonces el fragmento de ADN que tiene gel gen gdhA. Separadamente, un plásmido que tenía un gen gltA y un gen ppc derivados de Escherichia coli, pMWCP (WO 97/08294), se digirió con XbaI, y entonces los dos extremos se redondearon utilizando la T4 ADN polimerasa. Éste se mezcló con el fragmento de ADN purificado mencionado anteriormente que poseía el gen gdhA y se unió utilizando la T4 ligasa para obtener un plásmido pMWCPG, que correspondió a pMWCP conteniendo además el gen gdhA
(Fig 6).

Al mismo tiempo, el plásmido pVIC40 (solicitud de patente japonesa abierta al público nº 8-047397) teniendo el origen de replicación del plásmido RSF1010 de amplio espectro de huésped, se sometió a digestión con NotI, tratado con T4 ADN polimerasa y digerido con PstI. pBR322 se digirió con EcoT14I, tratado con T4 ADN polimerasa y digerido con PstI. Ambos productos se mezclaron y se unieron utilizando la T4 ligasa para obtener un plásmido RSF-Tet que tenía el origen de replicación de RSF1010 y un gen de resistencia a la tetraciclina (Fig 7).

A continuación, pMWCPG se sometió a digestión con EcoRI y PstI y purificándose y recuperándose un fragmento de ADN que poseía el gen gltA, el gen ppc y el gen gdhA. RSF-Tet se sometió igualmente a digestión con EcoRI y PstI, purificándose y recuperándose un fragmento de ADN con el origen de replicación de RSF1010. Ambos productos se mezclaron y se unieron utilizando la T4 ligasa para obtener un plásmido RSFCPG, que correspondió a RSF-Tet conteniendo el gen gltA, el gen ppc y el gen gdhA. (Fig 8). Se confirmó que el plásmido RSFCPG obtenido expresaba el gen gltA, el gen ppc y el gen gdhA, mediante la complementación de la auxotrofia de la cepa deficitaria en los genes gltA, ppc y gdhA derivada de Escherichia coli y la medición de cada actividad enzimática.

(ii) Preparación del plásmido que tiene el gen gltA derivado de Brevibacterium lactofermentum

Un plásmido que tenía el gen gltA derivado de Brevibacterium lactofermentum se construyó de la forma siguiente: Se llevó a cabo la PCR utilizando los ADN cebadores que poseían las secuencias nucleótidas representadas por SEC ID nº 6 y nº 7, que se prepararon basándose en la secuencia nucleótida del gen gltA de Corynebacterium glutamicum (Microbiology, 140, págs 1817-1828 (1994)), y en el ADN cromosómico del Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 como matriz, para obtener un fragmento del gen gltA de aproximadamente 3 kb. Este fragmento se insertó en un plásmido pHSG399 (obtenido de Takara Shuzo Co., Ltd), fue digerido con SmaI para obtener un plásmido pHSGCB (Fig 9). A continuación, pHSGCB se digirió con HindIII, y el fragmento de cerca de 3 kb del gen gltA extirpado se insertó en un plásmido pSTV29 (obtenido a partir de Takara Shuzo Co., Ltd.), digiriéndose otra vez con HindIII para obtener un plásmido pSTVCB (Fig 9). Se confirmó que el plásmido pSTVCB obtenido expresaba el gen gltA, midiendo la actividad enzimática en la cepa AJ13355 de Enterobacter Agglomerans.

(iii) Introducción de RSFCPG y pSTVCB en la cepa SC17sucA

La cepa SC17sucA de Enterobacter Agglomerans se transformó con RSFCPG mediante electroporación para obtener una cepa transformante SC17sucA/RSFCPG que presenta resistencia a la tetraciclina. Además, la cepa SC17sucA/
RSFCPG se transformó con pSTVCB mediante electroporación para obtener una cepa transformante SC17sucA/
RSFCPG + pSTVCB que poseía resistencia alcloranfenicol. (4) Adquisición de la cepa con una mejoría de la resistencia al ácido L-glutámico en un entorno de pH bajo.

(4) Adquisición de cepa con resistencia mejorada al ácido L-glutámico en un entorno de pH bajo

Una cepa con una mejoría de la resistencia al ácido L-glutámico a alta concentración en un entorno de pH bajo (a la que, en adelante, se hará referencia como ``cepa resistente a una alta concentración de Glu a un pH bajo), se aisló a partir de la cepa sC17sucA/RSFCPG+pSTVCB de Enterobacter Agglomerans.

La cepa sC17sucA/RSFCPG+pSTVCB se cultivó por la noche a 30ºC en medio LBG (10 g/l de triptona, 5 g/l de extracto de levadura, 10 g/l de NaCl, 5g/l de glucosa) y las células lavadas con solución salina se diluyeron apropiadamente y sembradas en un medio M9-E (4 g/l de glucosa, 17 g/l de Na_{2}HPO_{4}\cdot12H_{2}O, 3 g/l de KH_{2}PO_{4}, 0,5 g/l de NaCl, 1 g/l de NH_{4}Cl, 10 mM de MgSO_{4}, 10 \muM de CaCl_{2}, 50 mg/l de L-lisina, 50 mg/l de L-metionina, 50 mg/l de ácido DL-diaminopimélico, 25 mg/l de tetraciclina, 25 mg/l de cloranfenicol, 30 g/l de ácido L-glutámico, ajustado a pH 4,5 con amoníaco acuoso). La colonia se apreció después de cultivo a 32ºC durante 2 días, obteniéndose como una cepa resistente a Glu a alta concentración a un pH bajo.

Para la cepa obtenida, se midió el nivel de crecimiento en el medio líquido M9-E y se ensayó la capacidad productora del ácido L-glutámico en un tubo de ensayo de gran volumen de 50 ml que contenía 5 ml de medio de ensayo productor de ácido L-glutámico (40 g/l de glucosa, 20 g/l de (NH_{4})SO_{4}, 0,5 g/l de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 2 g/l de KH_{2}PO_{4,} 0,5 g/l de NaCl, 0,25 g/l de CaCl_{2}\cdot7H_{2}O, 0,02 g/l de FeSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,02 g/l de MnSO_{4}4H_{2}O, 0,72 mg/l de ZnSO_{4}2H_{2}O, 0,64 mg/l de CuSO_{4}\cdot5H_{2}O, 0,72 mg/l de CoCl_{2}\cdot6H_{2}O, 0,4 mg/l de ácido bórico, 1,2 mg/l de Na_{2}MoO_{4}\cdot2H_{2}O, 2 g/l de extracto de levadura, 200 mg/l de clorhidrato de L-lisina, 200 mg/l de L-metionina, 200 mg/l de ácido DL-\alpha,\varepsilon-diaminopimélico, 25 mg/l de clorhidrato de tetraciclina y 25 mg/l de cloranfenicol. Una cepa que exhibía el mejor nivel de crecimiento y la misma capacidad productora de ácido L-glutámico que la de su cepa parental, la cepa SC17/RSFCPG+pSTVCB, se denominó como Enterobacter Agglomerans AJI3601. La cepa AJ13601 fue depositada en el National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (código postal: 305-8566, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japón) el 18 de agosto de 1999, recibiendo el número de registro FERM P-17516. Se transfirió entonces a un depósito internacional bajo las previsiones del Tratado de Budapest del 6 de julio de 2000 y recibió un número de registro FERM BP-7207.

(5) Cultivo de la cepa AJ13601 de Enterobacter Agglomerans para la producción de ácido L-glutámico (1)

La cepa AJ13601 de Enterobacter Agglomerans se inoculó en un recipiente de fermentación de 1 L que contenía 300 ml de medio que incluía (40 g/l de glucosa, 20 g/l de (NH_{4})_{2}SO_{4}, 0,5 g/l de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 2 g/l de KH_{2}PO_{4} 0,5 g/l de NaCl, 0,25 g/l de CaCl_{2}\cdot7H_{2}O, 0,02 g/l de FeSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,02 g/l de MnSO_{4}4H_{2}O, 0,72 mg/l de ZnSO_{4}2H_{2}O, 0,64mg/l de CuSO_{4}\cdot5H_{2}O, 0,72 mg/l de CoCl_{2}\cdot6H_{2}O, 0,4 mg/l de ácido bórico, 1,2 mg/l de Na_{2}MoO_{4}\cdot2H_{2}O, 2 g/l de extracto de levadura, 200 mg/l de clorhidrato de L-lisina, 200 mg/l de L-metionina, 200 mg/l de ácido DL-\alpha,\varepsilon-diaminopimélico, 25 mg/l de clorhidrato de tetraciclina y 25 mg/l de cloranfenicol, y se cultivó a 34ºC y a un pH de 6,0 durante 14 horas. El pH del cultivo se controló introduciendo gas amoníaco en el medio.

El cultivo obtenido tal como se ha descrito anteriormente se centrifugó a 5.000 rpm durante 10 minutos, y las células recuperadas se inocularon en un recipiente fermentador de 1l que contenía 300 ml de medio que contenía (40 g/l de glucosa, 5 g/l de (NH_{4})_{2}SO_{4}, 1,5 g/l de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 6 g/l de KH_{2}PO_{4}, 1,5 g/l de NaCl, 0,75 g/l de CaCl_{2}\cdot7H_{2}O, 0,06 g/l de FeSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,06 g/l de MnSO_{4}\dot4H_{2}O, 2,16 mg/l de ZnSO_{4}2H_{2}O, 1,92 mg/l de CuSO_{4}\cdot5H_{2}O, 2,16 mg/l de CoCl_{2}\cdot6H_{2}O, 1,2 mg/l de ácido bórico, 3,6 mg/l de Na_{2}MoO_{4}\cdot2H_{2}O, 6 g/l de extracto de levadura, 600 mg/l de clorhidrato de L-lisina, 600 mg/l de L-metionina, 600 mg/l de ácido DL-\alpha,\varepsilon-diaminopimélico, 25 mg/l de clorhidrato de tetraciclina y 25 mg/l de cloranfenicol, y se cultivó a 34ºC y a un pH de 4,5 durante 14 horas para producir el ácido L-glutámico. El pH del cultivo se controló introduciendo gas amoníaco en el medio. Como la glucosa que se había añadido inicialmente se había consumido, se añadieron continuamente 600 g/l de glucosa.

Como resultado del cultivo para la producción del ácido L-glutámico llevado a cabo durante 50 horas tal como se ha descrito anteriormente, se precipitaron en el recipiente de fermentación una cantidad sustancial de cristales de ácido L-glutámico. La Tabla 1 muestra la concentración del ácido L-glutámico disuelto en el líquido de cultivo en ese momento y la concentración de ácido L-glutámico medida disolviendo los cristales en 2 M de hidróxido potásico. Los cristales de ácido L-glutámico se recuperaron a partir del cultivo mediante decantación después de que el cultivo se dejara en posición vertical.

TABLA 1

Concentración del ácido L-glutámico disuelta en el líquido de cultivo	51 g/l
Cantidad del ácido L-glutámico que precipitó como cristales	67 g/l
Concentración del ácido L-glutámico medida disolviendo cristales	118 g/l

(6) Cultivo de la cepa AJ3601 de Enterobacter Agglomerans para la producción de ácido L-glutámico (2)

Se llevó a cabo el experimento siguiente para confirmar que la cepa AJ13601 de Enterobacter Agglomerans presentaba todavía una capacidad de producción del ácido L-glutámico, incluso bajo la condición de que los cristales del ácido L-glutámico estuvieran presentes.

La cepa AJ13601 de Enterobacter Agglomerans se inoculó en un recipiente de fermentación de 1 l que contenía 300ml de medio que incluía 40 g/l de glucosa, 20 g/l de (NH_{4})_{2}SO_{4}, 0,5 g/l de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 2 g/l de KH_{2}PO_{4,} 0,5 g/l de NaCl, 0,25 g/l de CaCl_{2}\cdot7H_{2}O, 0,02 g/l de FeSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,02 g/l de MnSO_{4}\cdot4H_{2}O, 0,72 mg/l de ZnSO_{4}2H_{2}O, 0,64 mg/l de CuSO_{4}\cdot5H_{2}O, 0,72 mg/l de CoCl_{2}\cdot6H_{2}O, 0,4 mg/l de ácido bórico, 1,2 mg/l de Na_{2}MoO_{4}\cdot2H_{2}O, 2 g/l de extracto de levadura, 200 mg/l de clorhidrato de L-lisina, 200 mg/l de L-metionina, 200 mg/l de ácido DL-\alpha,\varepsilon-diaminopimélico, 25 mg/l de clorhidrato de tetraciclina y 25 mg/l de cloranfenicol, y se cultivó a 34ºC y a un pH de 6,0 durante 14 horas. El pH del cultivo se controló introduciendo gas amoníaco en el medio. El cultivo obtenido tal como se ha descrito anteriormente se centrifugó a 5.000 rpm durante 10 minutos, y las células recuperadas se inocularon en un medio en el que el ácido L-glutámico estaba presente como cristales. El medio utilizado contenía 40 g/l de glucosa, 5 g/l de (NH_{4})_{2}SO_{4}, 1,5 g/l de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 6 g/l de KH_{2}PO_{4}, 1,5 g/l de NaCl, 0,75 g/l de CaCl_{2}\cdot7H_{2}O, 0,06 g/l de FeSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,06 g/l de MnSO_{4}\cdot4H_{2}, 2,16 mg/l de ZnSO_{4}2H_{2}O, 1,92 mg/l de CuSO_{4}\cdot5H_{2}O, 2,16 mg/l de CoCl_{2}\cdot6H_{2}O, 1,2 mg/l de ácido bórico, 3,6 mg/l de Na_{2}MoO_{4}\cdot2H_{2}O, 6 g/l de extracto de levadura, 600 mg/l de clorhidrato de L-lisina, 600 mg/l de L-metionina, 600 mg/l de ácido DL-\alpha,\varepsilon-diaminopimélico, 25 mg/l de clorhidrato de tetraciclina y 25 mg/l de cloranfenicol, añadiéndose cristales de ácido L-glutámico hasta 40 g/l. Las células se inocularon en un recipiente fermentador de 1l que contenía 300 ml de este medio y se cultivó a 34ºC y a un pH de 4,3 durante 14 horas para producir el ácido L-glutámico. El pH del cultivo se controló introduciendo gas amoníaco en el medio. Como la glucosa que se había añadido inicialmente se había consumido, se añadieron continuamente 600 g/l de glucosa. En este medio, sólo 39 g/l del ácido L-glutámico añadido se disolvieron a un pH de 4,3, encontrándose como cristales 1 g/l restante.

Como resultado del cultivo para la producción del ácido L-glutámico llevado a cabo durante 53 horas tal como se ha descrito anteriormente, se precipitaron en el recipiente de fermentación una cantidad sustancial de cristales de ácido L-glutámico. La Tabla 2 muestra la concentración del ácido L-glutámico disuelto en el líquido de cultivo, la cantidad de ácido L-glutámico presente como cristales en ese momento y la concentración del ácido L-glutámico medida disolviendo los cristales en una solución 2M KOH. Los cristales de ácido L-glutámico se recuperaron a partir del cultivo mediante decantación después de que el cultivo se dejara en posición vertical. Los resultados mostraron que la cepa AJ13601 de Enterobacter Agglomerans acumulaba ácido L-glutámico y precipitaba sus cristales incluso cuando los cristales de ácido L-glutámico se encontraban presentes.

TABLA 2

Concentración del ácido L-glutámico disuelta en el líquido de cultivo	39 g/l
Cantidad del ácido L-glutámico que precipitó como cristales	119 g/l
Concentración del ácido L-glutámico medida disolviendo cristales	158 g/l
Cantidad de cristales de ácido L-glutámico producida nuevamente por el cultivo principal	118 g/l

(7) Cultivo de la cepa AJ13601 de Enterobacter Agglomerans para la producción de ácido L-glutámico (3)

La cepa AJ13601 de Enterobacter Agglomerans puede crecer no sólo en un pH ácido, sino también en un pH neutro. Por tanto, se confirmó de la siguiente forma que los cristales de ácido L-glutámico podían asimismo precipitarse iniciando el cultivo a un pH neutro y permitiendo la producción de ácido L-glutámico durante el cultivo, de forma que el pH de éste disminuyera espontáneamente.

Células de una placa (de 8,5 cm de diámetro) de la cepa AJ13601 de Enterobacter Agglomerans, cultivadas en medio LBG agar (10 g/l de triptona, 5 g/l de extracto de levadura, 10 g/l de NaCl, 5 g/l de glucosa, 15 g/l de agar) que contenía 25 mg/l de clorhidrato de tetraciclina y 25 mg/l de cloranfenicol a 30ºC durante 14 horas, se inocularon en un recipiente fermentador de 1l que contenía 300 ml de medio que contenía 40 g/l de glucosa, 5 g/l de
(NH_{4})_{2}SO_{4}, 1,5 g/l de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 6 g/l de KH_{2}PO_{4}, 1,5 g/l de NaCl, 0,75 g/l de CaCl_{2}\cdot7H_{2}O, 0,06 g/l de
FeSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,06 g/l de MnSO_{4}4H_{2}O, 2,16 mg/l de ZnSO_{4}2H_{2}O, 1,92 mg/l de CuSO_{4}\cdot5H_{2}O, 2,16 mg/l de
CoCl_{2}\cdot6H_{2}O, 1,2 mg/l de ácido bórico, 3,6 mg/l de Na_{2}MoO_{4}\cdot2H_{2}O, 6 g/l de extracto de levadura, 600 mg/l de clorhidrato de L-lisina, 600 mg/l de L-metionina, 600 mg/l de ácido DL-\alpha,\varepsilon-diaminopimélico, 25 mg/l de clorhidrato de tetraciclina y 25 mg/l de cloranfenicol, iniciándose el cultivo a 34ºC y a un pH de 7,0. El pH del cultivo se controló introduciendo gas amoníaco en el medio. Como la glucosa que se había añadido inicialmente se había consumido, se añadieron continuamente 600 g/l de glucosa.

Como el ácido L-glutámico se acumula, el pH desciende espontáneamente. La cantidad del gas amoníaco que se introdujo se ajustó de manera que el pH pudiera descender gradualmente desde 7,0 a 4,5 durante el período entre 15 horas y 24 horas después del inicio del cultivo, convirtiéndose en 4,5 a las 24 horas después del inicio del cultivo. Después, el cultivo continuó durante 12 horas.

Como resultado del cultivo para la producción de ácido L-glutámico llevado a cabo durante 36 horas tal como se ha descrito anteriormente, una cantidad sustancial de los cristales del ácido L-glutámico se precipitaron en el recipiente fermentador. La Tabla 3 muestra el caldo de cultivo, la cantidad de ácido L-glutámico que se encontraba como cristales en ese momento y la concentración de ácido L-glutámico medida disolviendo los cristales en una solución 2 M KOH. Los cristales del ácido L-glutámico se recuperaron a partir del cultivo mediante decantación después de que el cultivo se dejara en posición vertical.

TABLA 3

Concentración del ácido L-glutámico disuelta en el líquido de cultivo	45 g/l
Cantidad del ácido L-glutámico que precipitó como cristales	31 g/l
Concentración del ácido L-glutámico medida disolviendo cristales	76 g/l

<110> Ajinomoto Co., Inc.

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\vskip0.400000\baselineskip

<120> Procedimiento para la producción de ácido L-glutámico por fermentación acompañada de precipitación

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<130>

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<150> JP 11-234806

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<151> 1999-08-20

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\vskip0.400000\baselineskip

<150> JP 2000-78771

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<151> 2000-03-21

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\vskip0.400000\baselineskip

<160> 7

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\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn Ver. 2.0

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<210> 1

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<211> 4556

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<212> ADN

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<213> Enterobacter Agglomerans

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<220>

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<221> CDS

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<222> (2)..(121)

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<220>

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<221> CDS

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<222> (322)..(3129)

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<220>

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<221> CDS

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<222> (3145)..(4368)

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<220>

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<221> CDS

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<222> (4437)..(4556)

\newpage

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<400> 1

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1

2

3

4

5

6

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<210> 2

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<211> 39

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<212> PRT

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<213> Enterobacter Agglomerans

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

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7

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<210> 3

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<211> 935

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<212> PRT

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<213> Enterobacter Agglomerans

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

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8

9

10

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

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<211> 407

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<212> PRT

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<213> Enterobacter Agglomerans

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<400> 4

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11

12

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<210> 5

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<211> 40

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<212> PRT

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<213> Enterobacter Agglomerans

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

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13

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

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<211> 30

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

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<400> 6

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtcgacaata gccygaatct gttctggtcg

\hfill

30

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

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<211> 30

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

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<400> 7

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aagcttatcg acgctcccct ccccaccgtt

\hfill

30

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Claims

1. Procedimiento para la producción de ácido L-glutámico por fermentación, que comprende cultivar un microorganismo en un medio líquido cuyo pH es ajustado a un pH en el que el ácido L-glutámico se precipite, para producir y acumular ácido L-glutámico y precipitar ácido L-glutámico en el medio que contiene una fuente de carbono,

en el que el pH es de 3,0 a 5,0,

en el que dicho microorganismo puede metabolizar una fuente de carbono a un pH de 3,0 a 5,0 en un medio líquido que contiene ácido L-glutámico a una concentración de saturación y la fuente de carbono, y presenta la capacidad de acumular ácido L-glutámico en una cantidad que exceda la cantidad que corresponde a la concentración de saturación en el medio líquido al pH.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho microorganismo presenta por lo menos una de las características siguientes:

(a): el microorganismo es potenciado en la actividad de una enzima que cataliza una reacción para la biosíntesis del ácido L-glutámico ; y

(b): el microorganismo es disminuido o es deficitario en la actividad de una enzima que cataliza una reacción que se ramifica a partir de una vía biosintética del ácido L-glutámico y que produce un compuesto distinto al ácido L-glutámico.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que la enzima que cataliza la reacción para la biosíntesis del ácido L-glutámico, es por lo menos una seleccionada de entre citrato sintasa, fosfoenolpiruvato carboxilasa y glutamato deshidrogenasa.

4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la enzima que cataliza la reacción que se ramifica a partir de la vía biosintética del ácido L-glutámico y que produce el compuesto distinto al ácido L-glutámico, es la \alpha-cetoglutarato deshidrogenasa.

5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el microorganismo pertenece al género Enterobacter.

6. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que el microorganismo es Enterobacter Agglomerans.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que el microorganismo es Enterobacter Agglomerans (AJ13601) FERM BP-7207.

8. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que el microorganismo presenta una mutación que causa menos secreción extracelular de un material viscoso comparado con una cepa de tipo salvaje cuando se cultiva en un medio que contiene un sacárido.

9. Procedimiento de cribado para un microorganismo, que comprende el cribado de un microorganismo apropiado para producir ácido L-glutámico mediante fermentación con ácido L-glutámico que precipita en un medio líquido de pH 3,0-5,0, que comprende inocular una muestra que contenga microorganismos en un medio ácido que contiene ácido L-glutámico a una concentración de saturación y una fuente de carbono, y seleccionar una cepa que pueda metabolizar la fuente de carbono.

10. Procedimiento según la reivindicación 9, en el que una cepa que puede crecer en el medio se selecciona como la cepa que puede metabolizar la fuente de carbono.

11. Procedimiento para la producción de ácido L-glutámico por fermentación, que comprende el inicio del cultivo de un microorganismo en un medio líquido a un pH neutro y la finalización de dicho cultivo a un pH al cual el ácido L-glutámico se precipita,

12. Procedimiento según la reivindicación 11, en el que el pH del cultivo se controla introduciendo gas amoníaco en el medio.

13. Microorganismo que tiene el número de registro FERM BP-7207.