ES2266193T3

ES2266193T3 - Metodo de expansion de celulas madre epiteliales.

Info

Publication number: ES2266193T3
Application number: ES01927340T
Authority: ES
Inventors: Ray Jui-Fang Tsai
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2000-04-27
Filing date: 2001-04-25
Publication date: 2007-03-01
Anticipated expiration: 2021-04-25
Also published as: PT1276431E; DE60120676D1; EP1276431B1; TW506827B; AU2001253802B2; CA2406282A1; EP1276431A4; DE60120676T2; JP2003532466A; HK1056989A1; CN1426289A; ATE329632T1; CA2406282C; AU5380201A; JP5612801B2; WO2001080760A1; EP1276431A1; CN1296102C; WO2001080760A8

Abstract

Injerto quirúrgico para aplicar en un sitio receptor, en donde dicho injerto se caracteriza porque el injerto comprende: una membrana amniótica que comprende células amnióticas y una matriz extracelular íntegra; y células madre epiteliales expandidas sobre dicha membrana amniótica.

Description

Método de expansión de células madre epiteliales.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La presente invención se refiere a una deficiencia de células madre epiteliales y células madre límbicas y, más específicamente, a un método e injerto para tratar este problema de deficiencia de células madre epiteliales en, por ejemplo, la reconstrucción de la superficie corneal.

Técnica anterior

En relación con el ojo, la superficie ocular normal está cubierta por los epitelios corneal, límbico y conjuntivo. Sus distintos fenotipos celulares, junto con una película lagrimal preocular estable, mantienen la integridad de la superficie ocular. Graves daños del epitelio límbico, debidos a: quemaduras químicas o térmicas, síndrome de Stevens-Johnson, penfigoide cicatricial ocular, múltiples cirugías y crioterapias en la región límbica, el uso de lentes de contacto y una grave infección microbiana, pueden dar origen a una deficiencia de células madre límbicas y epiteliales. La deficiencia de células madre epiteliales del limbo suele manifestarse con conjuntivalización, vascularización, inflamación crónica y crecimiento fibroso hacia la superficie corneal y opacificación de la córnea.

Cuando la deficiencia límbica es unilateral o bilateral con afectación asimétrica, está indicado el trasplante autólogo de tejido límbico. Un problema importante del trasplante límbico autólogo es que se deben retirar del ojo contralateral sano uno o dos injertos límbicos, que comprenden la zona del limbo entre las 2 y las 3 en el reloj. Ha habido un informe que describe la complicación potencial en los ojos donantes. Los experimentos con conejos también han demostrado que se puede producir una deficiencia límbica si, subsiguientemente, se elimina el epitelio corneal central del ojo donante que ha sido sometido a una retirada límbica previa. Pellegrini et al., Lancet 1997; 349:990-993, han informado sobre el trasplante de capas de células epiteliales de la córnea, expandida en una capa de nutrición de fibroblastos 3T3, para la reconstrucción de la superficie corneal en dos pacientes con deficiencia límbica total.

Recientemente, Kim y Tseng, Cornea 1995; 15:473-84, han demostrado que el trasplante de la membrana amniótica, como sustitución del sustrato, es efectivo en la reconstrucción de la superficie de la córnea en conejos con deficiencia total de células madre epiteliales del limbo.

Schwab et al. (Reunión anual de la Asociación de Investigación de la Visión y Oftalmología, vol 40(4), 9 a 14 de mayo de 1999, página 5578) describen un injerto compuesto de epitelio corneal consistente en membrana amniótica y células madre epiteliales de la córnea. Las células epiteliales se expanden in vitro y se siembran en placas sobre membrana amniótica exenta de células epiteliales.

Schwab I.R. (Transactions of the American Oph-thalmological Society, vol. 97, 1999, págs. 891-986) también describe células madre epiteliales de la córnea expandidas in vitro y aplicadas sobre una membrana amniótica denudada (es decir, eliminación del epitelio amniótico) para formar un injerto compuesto.

Resumen de la invención

En un ejemplo de esta invención, células madre límbicas y células epiteliales, procedentes de una pequeña biopsia límbica, tomada de un ojo sano, se expanden en cultivo sobre una membrana amniótica especialmente tratada. La utilización de una membrana de este tipo como sustrato ayuda a restaurar un estroma límbico no inflamado y a expandir las poblaciones de células madre límbicas y células madre epiteliales. El "producto" resultante se puede trasplantar, como injerto, sobre una superficie corneal denudada tras una queratectomía superficial para eliminar el crecimiento fibrovascular. Para zonas del cuerpo dañadas diferentes del ojo, la biopsia de células epiteliales sanas se lleva a cabo en una zona de tejido adyacente, que tiene las mismas o similares características biológicas/histológicas, es decir, es histocompatible con la zona dañada.

Descripción de una realización preferida

La biopsia límbica se lleva a cabo en un ojo sano, que puede ser el ojo contralateral de un paciente o de otro individuo vivo. Se esteriliza el párpado ocular con Betadine® (povidona yodada). Bajo condiciones de esterilidad, se separan del margen del limbo 1 a 2 mm^{2} de tejido límbico que contiene células epiteliales y parte del tejido estromático de la córnea, y se escinde del estroma corneal superficial por queratectomía laminar, con una hoja Beaver® Nº 66 (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). El tejido se deposita en una placa de 35 mm que contiene 1,5 ml de medio de cultivo, que tiene por ml: DMEM (medio de Eagle modificado por Dulbecco) y F12 de Ham (relación 1:1), suplementado con DMSO (dimetilsulfóxido) al 0,5%, 2 \mug de EGF (factor de crecimiento epidérmico) de ratón, 1 \mug de insulina bovina, 0,1 \mug de toxina del cólera, y 5% de suero bovino fetal, y se envía de inmediato al laboratorio para cultivo bajo una campana estéril de flujo laminar.

La membrana amniótica (adquirida de Bio Tissue, Miami, FL) se utiliza como sistema de cultivo, y se obtiene, procesa y conserva de la forma señalada por Tseng SCG en Am. J. Ophthalmol. 1997; 124:765-774, y Tseng, Patente de EE.UU. 6.452.142.

La membrana amniótica, con la cara de membrana basal hacia arriba, se fija uniformemente sobre una placa de cultivo, y se incuba a 37ºC bajo CO_{2} al 5% y aire al 95%, en un incubador humidificado durante la noche previa a su uso. Se lleva a cabo el cultivo del explante límbico de la forma anteriormente descrita (Tsai y Tsen, Invest Ophthalmol Vis Sci 1988; 29:97-108; y Tsai et al., Invest Ophthalmol Vis Sci 1994; 35:3865-2875), con algunas modificaciones. En lugar de la transferencia sobre un sustrato plástico, como se enseña en estas referencias bibliográficas, el explante límbico con las células madre epiteliales se planta/transfiere sobre la cara de membrana basal de la membrana amniótica en una placa de 35 mm que contiene 1 ml del medio de cultivo anteriormente descrito. El medio se cambia cada dos días, y el cultivo se mantiene durante 2 a 3 semanas, momento en el que las células madre han crecido y difundido para formar una capa celular que abarca una superficie de aproximadamente 2 a 3 cm de diámetro, para la reconstrucción de la superficie corneal. Para otros procedimientos de reparación tisular, se puede emplear mayor o menor superficie de capa de células madre epiteliales, en función de las necesidades.

Siguiendo con el ejemplo de la reparación corneal, tras la periotomía del limbo, se eliminan la cicatriz conjuntival y los tejidos inflamados hasta denudar la esclerótica. El tejido fibrovascular de la córnea se elimina por queratectomía laminar con hojas Beaver Nº 57 y 66, de manera similar a la descrita para el trasplante de aloinjerto límbico (Tsai y Tseng, Cornea 1994; 13:389-400). Para los pacientes con daño parcial a total del limbo corneal, pero con una córnea central normal, se utilizan las células madre epiteliales del limbo cultivadas con la membrana amniótica como injerto sectorial del limbo corneal, o un equivalente del limbo, diseñado de acuerdo con el tamaño del ojo del receptor, y que se trasplanta a la correspondiente zona del limbo del receptor (desde 90º hasta 360º). Para los pacientes con daño total de la superficie límbica y corneal, el nuevo injerto se utiliza como tejido corneal laminar completo, o un equivalente del limbo corneal, que se trasplanta como queratoplastia laminar para recubrir toda la zona.

Se fija una capa, de tamaño adecuado, de células madre epiteliales, cultivadas sobre el sustrato de membrana amniótica tratada, para recubrir la totalidad del defecto, con la cara epitelial hacia arriba, que se puede identificar fácilmente por tinción fluorescente o por la presencia del explante original, que está unido de forma libre. A continuación, se asegura el injerto sobre el sitio dañado. Para una córnea dañada, este aseguramiento se puede llevar a cabo mediante suturas interrumpidas de nailon 10-0 sobre la cara corneal, y suturas interrumpidas de Vicryl® 8-0 hacia el borde conjuntival que lo rodea, con anclaje epi-esclerótico. Durante todo el procedimiento, la capa de células madre epiteliales cultivadas se protege contra la exposición, secado y abrasión por medio de un recubrimiento de ácido hialurónico (hialuronato) sódico Healon® (Pharmacia & Upjohn AB, Uppsala, Suecia). El tejido del explante original se puede separar desde la membrana amniótica al final de la intervención quirúrgica. Si este injerto se encuentra sobre la córnea, se aplica sobre el ojo un parche de presión durante la noche, se coloca una lente de contacto terapéutica al día siguiente, durante una semana; y se administra una solución tópica de acetato de prednisolona al 1% cuatro veces al día durante la primera semana, y dos veces a la semana durante las dos semanas siguientes, seguida de fluorometolona al 0,1% dos veces al día, durante 2 a 3 meses, dependiendo de la gravedad de la inflamación conjuntival alrededor del área quirúrgica.

Como se ha señalado anteriormente, el explante se cultiva sobre la cara de membrana basal de la membrana amniótica especialmente tratada. Después de 2 a 3 semanas, las células madre epiteliales crecen hasta formar una capa de aproximadamente 2 a 3 cm^{2} de tamaño sobre la membrana amniótica. La preparación sobre soporte plano demuestra que la capa de células madre es negativa a la tinción con PAS y azul Alcian; y la membrana amniótica desnuda se tiñe de color púrpura. Exámenes histológicos demuestran que la capa epitelial está compuesta por 4 a 5 capas de células madre en el margen de la capa, y 1 a 4 capas celulares en la zona situada entre el margen y el tejido del explante original. Los exámenes ultraestructurales revelan la presencia de espacios intercelulares sueltos y amplios, y la estructura de la membrana basal, con condensación focal de una sustancia de base electrónicamente densa en el punto de unión de las células basales con la membrana amniótica.

Con respecto a una realización de la invención específica para el tratamiento oftalmológico, un período de seguimiento medio (\pm DE) de 14,8 \pm 1,9 meses muestra grados variables de mejoría visual, sobre la base de la escala de agudeza visual de Snellen. Todos los ojos exhiben una reepitelización completa en 2 a 4 días, con un período medio (\pm DE) de 2,7 \pm 0,8 días. Las superficies corneales reconstruidas muestran reducción de la inflamación y regresión de la vascularización en el plazo de 1 a 2 semanas. Un mes después de la operación, la claridad de la córnea ha mejorado y la superficie es suave y humectable.

Dependiendo de la zona de la lesión del limbo corneal, las células madre epiteliales cultivadas, expandidas sobre un sustrato especialmente preparado de membrana amniótica, se pueden usar como equivalente del limbo o un equivalente del limbo corneal.

En el conejo, se ha informado de la existencia de una deficiencia límbica del ojo donante, debida a la eliminación de una sección relativamente grande del limbo para trasplante. De esta forma, el nuevo método y el injerto resultante de esta invención reduce de forma sustancial las complicaciones potenciales del ojo donante, ya que sólo se separa una pequeña sección de limbo. Adicionalmente, este método se puede llevar a cabo también en ojos con deficiencia límbica bilateral con afectación asimétrica. La expansión ex vivo de células madre epiteliales autólogas, sobre una membrana amniótica especialmente pretratada, proporciona suficientes células madre epiteliales para trasplante en 2 a 3 semanas. Para pacientes con deficiencia límbica total y bilateral, se debe considerar el uso, según esta invención, de limbos de fuentes compatibles, por ejemplo, de otro individuo vivo relacionado.

El uso para trasplante de células madre epiteliales autólogas, basadas sobre una membrana amniótica pretratada de manera exclusiva, ofrece también todos los efectos beneficiosos inherentes al trasplante de membrana amniótica, incluidas la facilitación de epitelización, la reducción de la inflamación y de la formación de tejido cicatricial, y la sustitución de sustrato cuando el tejido estromático subyacente está destruido. De manera aún más importante, la membrana amniótica, pretratada de acuerdo con Tseng, proporciona un sustrato natural para la conservación y expansión de las células madre epiteliales, que forman la masa celular autóloga necesaria para la reconstrucción de la córnea. Adicionalmente, dado que se trasplantan solamente células autólogas, no se precisa inmunosupresión después del trasplante. Para células madre alogénicas trasplantas de esta forma, es posible reducir la incidencia de rechazos, gracias a que se trasplantan solamente células madre epiteliales, sin otros tipos de célula.

Tal como se ha indicado anteriormente, este injerto único, y el método para su desarrollo, mediante el empleo de una membrana amniótica especialmente pretratada, sobre la que se expanden las células madre epiteliales de un explante, tiene usos adicionales, más allá de la cirugía ocular, por ejemplo, en la reparación de zonas de piel quemada; sobre todo, cuando el sitio donante del explante debe ser pequeño. De la misma forma, la biopsia a partir de la cual se obtiene el pequeño explante, no necesita ser de tejido límbico. El explante debe contener tejido sano, células madre epiteliales y ser histocompatible con el sitio receptor del injerto. Si la biopsia no se puede realizar en la misma zona del cuerpo que el sitio del receptor, se puede seleccionar para el explante una zona similar del cuerpo; tal como en el ejemplo preferido de un ojo dañado, en el que éste es el sitio receptor, y el otro ojo, es decir, el ojo sano, proporciona el explante donante.

Se considera que se ha descrito de forma suficiente un injerto y método quirúrgico inventivo únicos para que los expertos en la técnica puedan llevar a la práctica la invención, sin necesidad de una experimentación importante.

Claims

1. Injerto quirúrgico para aplicar en un sitio receptor, en donde dicho injerto se caracteriza porque el injerto comprende:

: una membrana amniótica que comprende células amnióticas y una matriz extracelular íntegra; y

: células madre epiteliales expandidas sobre dicha membrana amniótica.

2. Injerto quirúrgico según la reivindicación 1, en el cual dicha membrana amniótica tiene una membrana basal, caracterizado porque dichas células madre epiteliales se expanden sobre dicha cara de membrana basal.

3. Injerto quirúrgico según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el tejido límbico, procedente de una biopsia practicada en el limbo de un ojo sano, es la fuente de dichas células madre epiteliales.

4. Injerto quirúrgico según la reivindicación 1, en el cual dicha membrana amniótica tiene una cara de membrana basal; caracterizado porque dichas células madre epiteliales se originan a partir de tejido tratado en un medio de cultivo que, a continuación, se transfiere a dicha membrana amniótica; y dichas células madre epiteliales se cultivan ex vivo sobre dicha cara de membrana basal de dicha membrana amniótica.

5. Injerto quirúrgico según cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque la fuente de dichas células madre epiteliales es tejido tomado de un sitio sano, biológicamente correspondiente, e histocompatible con el sitio receptor.

6. Método para crear un injerto quirúrgico para un sitio receptor dañado, en donde dicho método se
caracteriza por las etapas de:

a): colocar, como explante, una biopsia sobre una membrana amniótica; dicha membrana amniótica comprende células amnióticas y una matriz extracelular que conserva su integridad, y en donde dicha biopsia contiene células madre epiteliales; y

b): permitir la expansión de dichas células madre epiteliales sobre dicha membrana amniótica.

7. Método según la reivindicación 6, en el cual dicha membrana amniótica tiene una cara de membrana basal; caracterizado porque dicha etapa de colocación incluye situar dicho explante sobre dicha cara de membrana basal.

8. Método según la reivindicación 7, caracterizado porque el citado proceso determina que las células madre epiteliales se posicionen boca arriba con respecto al sitio receptor dañado.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, caracterizado porque dicha etapa de expansión incluye: cultivar dicho explante en un medio de cultivo, antes de la citada etapa de colocación.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, en el que dicha etapa de expansión se caracteriza por: cultivar dicha membrana amniótica, con su explante, durante un período de tiempo suficiente para que dichas células madre epiteliales se hayan expandido hasta una superficie de aproximadamente 2 a 3 cm de diámetro.

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, caracterizado porque se elimina dicho explante de dicha membrana amniótica, después de fijar quirúrgicamente dicho injerto al sitio receptor.