CN102166375B

CN102166375B - 一种组织工程人角膜上皮的重建方法

Info

Publication number: CN102166375B
Application number: CN 201110039099
Authority: CN
Inventors: 樊廷俊; 徐彬; 杨洪收; 孙爱; 王宝泉
Original assignee: QINGDAO ZHONGHAO BIOENGINEERING CO Ltd; Ocean University of China
Current assignee: QINGDAO ZHONGHAO BIOENGINEERING CO Ltd; Ocean University of China
Priority date: 2011-02-16
Filing date: 2011-02-16
Publication date: 2013-04-10
Anticipated expiration: 2031-02-16
Also published as: CN102166375A

Abstract

本发明涉及一种组织工程人角膜上皮的重建方法，是利用含20％小牛血清的DMEM/F12培养液将人角膜上皮细胞体外培养至对数生长期，采用胰蛋白酶和胰蛋白酶-EDTA消化法获得完全去除上皮层的消化羊膜载体支架，平铺在插入式培养皿中牢固干贴后，将悬浮于含有IV型胶原蛋白和10％小牛血清的DMEM/F12培养液的对数生长期人角膜上皮细胞，接种至平铺有去上皮层消化羊膜载体支架的插入式培养皿中采用气-液界面培养法进行组织工程人角膜上皮的体外重建。本发明工艺科学合理，所重建的组织工程人角膜上皮可用于批量生产，满足广大角膜上皮病盲患者临床角膜移植治疗对组织工程人角膜上皮的大量需求，且组织工程人角膜上皮体外重建和临床治疗的成本低。

Description

一种组织工程人角膜上皮的重建方法

技术领域

本发明属于角膜上皮构建技术领域，具体涉及一种组织工程人角膜上皮的重建方法，即利用人角膜上皮细胞和脱上皮层消化羊膜来重建组织工程人角膜上皮的方法。

背景技术

人角膜上皮层由多层上皮细胞组成，是角膜的第一道屏障，可以防止角膜水分的散失和外界病原体的入侵，并阻止泪液中液体和电解质进入基质层，使角膜处于透明状态；此外，角膜上皮细胞表面的微绒毛和泪膜相互作用，为透明角膜的前屈光面提供光学界面(谢立信，2000)。由于角膜上皮层直接与外界接触，故易受到损伤和感染而引起角膜上皮损伤或病变，导致视力下降，严重者会引起角膜上皮盲(樊廷俊等，2010)。角膜病是仅次于白内障的第二大致盲眼病，其中多数是由于角膜上皮结构和功能异常所引起的(Whitcher等，2001)。角膜上皮移植是目前角膜上皮病盲治愈的唯一途径，但由于捐献的供体角膜数量严重不足，致使绝大多数角膜上皮盲病患者无法通过角膜上皮移植而重见光明。近年来，角膜组织工程的兴起使体外重建出形态结构正常的组织工程角膜上皮成为可能，是目前解决供体角膜材料不足的一种新的可行途径，为角膜上皮病盲患者的临床治疗带来了新的希望，但如何利用角膜上皮细胞和适宜的载体支架在体外重建出组织工程人角膜上皮已经成为研究热点。

利用组织工程技术对人角膜上皮的体外重建研究开始于1993年，许多学者先后利用诱导分化的角膜缘干细胞、表皮干细胞、骨髓间充质干细胞、口腔黏膜上皮细胞和羊膜上皮细胞等作为种子细胞，以复合胶原、羊膜、脱细胞角膜基质、壳聚糖、纤维蛋白和聚异丙基丙烯酰胺凝胶等为载体支架开展了组织工程人角膜上皮的体外重建研究(Minami等，1993；Koizumi等，2001；Nakamura等，2003；Jin等，2004；Ma等，2006；樊廷俊等，2010)，且移植后可使角膜创伤兔或角膜损伤患者恢复一定的视力。这些研究结果为组织工程人角膜上皮的体外重建开辟了道路，但由于所用种子细胞均为诱导分化的细胞，因种子细胞来源有限，或因仍具有原有种类细胞的特点，故无法开展组织工程人角膜上皮的规模化体外重建，或体外重建的组织工程人角膜上皮因结构功能不稳定而无法临床应用，目前仍只限于实验研究。

2009年，樊廷俊等成功建立了非转染、无致瘤性的人角膜上皮细胞系，并从中筛选出核型正常且结构功能正常的角膜上皮细胞株，成功解决了人组织工程角膜上皮规模化重建所需大量种子细胞的来源问题。因此，尽早建立一种利用人角膜上皮细胞单克隆细胞株和去上皮层消化羊膜在体外重建组织工程人角膜上皮的方法，已成为各国学者的主攻目标，也是组织工程角膜上皮规模化生产及临床应用造福全世界角膜上皮病盲患者的关键。

发明内容

本发明的目的是提供一种组织工程人角膜上皮的重建方法，利用人角膜上皮细胞单克隆细胞株和去上皮层消化羊膜载体支架来体外重建人角膜上皮，从而满足患者对角膜上皮的移植需求，以弥补现有技术的不足。

本发明的重建方法包括如下步骤：

1)人角膜上皮种子细胞悬液的制备：

取人角膜上皮细胞系的细胞，用含20％小牛血清的DMEM/F12培养液在37℃扩增培养至对数生长期，经0.25％胰蛋白酶溶液消化和1000～1500转/分钟离心10～15分钟获得人角膜上皮细胞沉淀，再用含有10％小牛血清和0.005％～0.01％IV型胶原蛋白的DMEM/F12培养液将该细胞沉淀悬浮成人角膜上皮细胞悬液，经细胞计数后，调整细胞浓度至8×10⁶～3×10⁷个细胞/毫升；

其中人角膜上皮细胞系的构建方法是：将角膜取出后用含抗生素的消毒液消毒，再将角膜进行消化处理后，取下带有前弹力层的角膜上皮，剪成小的角膜上皮组织块后，将角膜上皮组织块向下贴于培养孔的底部，使前弹力层向上；然后加入培养液在二氧化碳培养箱中、37℃下进行贴板培养，培养期间换培养液，细胞长成单层后用胰酶消化法进行继代培养，传代至60代以上完成了人角膜上皮细胞系的构建；其中，培养液为含有20％胎牛血清、0.02‰～0.04‰的人表皮细胞生长因子、0.01‰～0.02‰的人碱性成纤维细胞生长因子、0.4‰～1.0‰羧甲基壳寡糖和0.25‰～1‰硫酸软骨素的DMEM/F12培养液。

上述的含抗生素的消毒液为用0.9％生理盐水配制的质量比浓度为20％～70％的庆大霉素溶液。

上述的角膜进行消化处理是用浓度为0.2～0.5％的胰蛋白酶溶液消化，消化时间为1～2min。

2)载体支架的制备

利用0.25％胰蛋白酶-0.1％EDTA溶液对冻干羊膜的上皮面进行倒置消化，以得到完全去除上皮层的羊膜，用D-hanks溶液漂洗2次后，用打孔器将去上皮层消化羊膜打成与6孔培养板插入式培养皿孔径相同的去上皮层消化羊膜圆片，使其上皮面朝上平铺于插入式培养皿的底部，放置于5％CO₂培养箱中在37℃条件下牢固干贴后制成载体支架备用；

3)组织工程人角膜上皮的构建

最后，在贴有去上皮层消化羊膜载体支架的插入式培养皿中，轻轻加入上述准备好的人角膜上皮细胞悬液0.1～0.2毫升，使细胞悬液均匀分散于插入式培养皿中，6孔培养板孔中不加培养液，置5％CO₂培养箱中37℃培养20～24小时待细胞完全贴附到载体支架上后，吸去插入式培养皿内的旧培养液，将插入式培养皿轻轻放入已加入0.8毫升含10％小牛血清的DMEM培养液的6孔培养板中，建立气-液界面培养环境，在5％CO₂培养箱中37℃培养启动组织工程人角膜上皮的体外重建，每隔12小时轻轻摇动6孔培养板，每隔24～36小时换液一次，待人角膜上皮细胞在载体支架上长成6～8层后即为重建的组织工程人角膜上皮。

本发明利用无致瘤性、非转染的人角膜上皮细胞，能通过连续传代为组织工程人角膜上皮的规模化体外重建提供出足量的种子细胞；利用商品化冻干羊膜所制备的去上皮层消化羊膜，可满足组织工程人角膜上皮批量重建所需要的大量载体支架材料；而且可直接应用于批量生产和临床角膜移植；且其生产和临床治疗的成本低。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的方法进行详细的描述

一、人角膜上皮细胞系的建立

1、角膜片贴板培养的启动：从眼库中取出2个完整的人角膜，放入100毫升玻璃烧杯中，加入10～30毫升浓度为0.9％的生理盐水，清洗5～9分钟；吸出生理盐水后，加入10～30毫升的浓度为20％～70％的庆大霉素，浸泡15～35分钟，于超净工作台中进行消毒，以下操作均在超净工作台中进行，所有用品均是无菌的；用眼科镊从庆大霉素液中取出角膜，将角膜的凹面朝上平放于玻璃培养皿中，玻璃培养皿中加入0.2～0.5％胰蛋白酶5～10毫升消化1～2分钟；去除胰蛋白酶液，用眼科镊撕下带前弹力层的角膜上皮，用眼科剪沿角膜中心点把带有前弹力层的角膜上皮平均剪成8片，用眼科镊将角膜上皮面朝下平贴入24孔培养板的孔底，向贴入角膜上皮片的培养孔中加入0.1～0.3毫升培养液，培养液的体积量即保证角膜上皮片能够很好的贴附在培养孔底，又保证组织片不会干燥。将培养板放入5％二氧化碳培养箱中，37℃进行培养；

2、组织块法进行人角膜上皮细胞培养：角膜上皮片贴板培养12-24小时后，向每个培养孔中补加角膜上皮细胞专用培养液至1毫升，于5％二氧化碳培养箱中、37℃培养；每间隔3～5天，更换人角膜上皮细胞专用培养液一次。

3、人角膜上皮细胞专用培养液的配制：取常规配制的DMEM/F12培养液3.0毫升，然后依次加入硫酸软骨素1～4毫克、羧甲基壳寡糖0.2～0.6毫克和IV型胶原0.08～0.4毫克，完全溶解后用0.22微米的微孔滤膜过滤除菌，加入0.8毫升胎牛血清，又添加了0.01‰～0.02‰的人表皮细胞生长因子和0.01‰～0.02‰的碱性成纤维细胞生长因子，补加常规配制的DMEM/F12培养液至4.0毫升，即为本发明的人角膜上皮细胞专用培养液。

4、人角膜上皮细胞的继代培养：待人角膜上皮细胞长成单层后，吸出培养孔中的培养液，向每个培养孔中加入0.5毫升浓度为0.25％的胰蛋白酶溶液，静置消化1～2分钟；吸去胰蛋白酶溶液，每培养孔中加入1毫升的上述专用培养液，用滴管吹打培养孔底3～5分钟制成人角膜上皮细胞悬液；从每培养孔中分别取出0.5毫升角膜上皮细胞悬液，分别加入到新的培养孔中，每个培养孔补加上述专用培养液0.5毫升，使之最终体积至1毫升；待人角膜上皮细胞再次长成单层后，仍以上述的相同方法进行继代培养。

实施例1

从眼库中取出2个完整的人角膜，放入100毫升玻璃烧杯中，加入10毫升浓度为0.9％的生理盐水，清洗5分钟；吸出生理盐水后，加入10毫升的浓度为20％的庆大霉素，浸泡35分钟，于超净工作台中进行消毒；以下操作均在超净工作台中进行，所有用品均是无菌的；用眼科镊从庆大霉素液中取出角膜，将角膜的凹面朝上平放于玻璃培养皿中，培养皿中加入0.2％胰蛋白酶5毫升消化2分钟后，去除胰蛋白酶液，用眼科镊撕下带有前弹力层的角膜上皮，用眼科剪沿角膜中心点把带有前弹力层的角膜上皮平均剪成8片，用眼科镊将角膜上皮面朝下平贴入24孔培养板的孔底，每个培养孔补加含有20％胎牛血清的DMEM/F12培养液0.1毫升；将培养板放入5％二氧化碳培养箱中，37℃进行培养。取常规配制的DMEM/F12培养液3.0毫升，完全溶解后用0.22微米的微孔滤膜过滤除菌，加入0.8毫升胎牛血清，又加入0.01‰～0.02‰的人表皮细胞生长因子和0.01‰～0.02‰的碱性成纤维细胞生长因子，补加常规配制的DMEM/F12培养液至4.0毫升，即为人角膜上皮细胞专用培养液。贴板培养12小时后，向每个培养孔中补加上述专用培养液至1毫升，于5％二氧化碳培养箱中、37℃培养；每间隔3天，更换人角膜上皮细胞专用培养液一次。待人角膜上皮细胞长成单层后，吸出培养孔中的培养液，向每个培养孔中加入0.5毫升浓度为0.25％的胰蛋白酶溶液，静置消化1分钟；吸去胰蛋白酶溶液，每培养孔中加入1毫升的上述专用培养液，用滴管吹打培养孔底3分钟制成人角膜上皮细胞悬液；从每个培养孔中分别取出0.5毫升角膜上皮细胞悬液，分别加入到新的培养孔中，每培养孔补加上述专用培养液0.5毫升，使之最终体积至1毫升；待人角膜上皮细胞再次长成单层后，仍以上述的相同方法进行继代培养。

二、组织工程人角膜上皮的重建

1、角膜上皮重建专用培养液的配制：取常规配制的DMEM/F12培养液80毫升，加入IV型胶原蛋白4～8毫克，完全溶解后用0.22微米的微孔滤膜过滤除菌，加入10毫升小牛血清，补加常规配制的DMEM/F12培养液至100毫升，即为本发明的角膜上皮重建专用培养液。

2、人角膜上皮种子细胞的制备：取人角膜上皮细胞，悬浮于20％小牛血清-DMEM/F12培养液中，接种至底面积为75平方厘米的培养瓶中，置37℃进行扩增培养，细胞增殖72～80小时至对数生长期后，用玻璃滴管吸出培养液，加入0.25％胰蛋白酶溶液消化1～2分钟，加入此前吸出的培养液终止消化，1000～1500转/分离心10～15分钟，细胞沉淀用3毫升上述专用培养液悬浮均匀制成人角膜上皮种子细胞悬液，利用Casy细胞计数仪或血球计数板进行细胞计数后，用角膜上皮重建专用培养液调整种子细胞浓度至8×10⁶～3×10⁷个细胞/毫升。

3、去上皮层消化羊膜载体支架的制备：利用0.25％胰蛋白酶-0.1％EDTA溶液(1∶1)对冻干羊膜的上皮面进行倒置消化15～30分钟，以得到完全去除上皮层的羊膜，用D-hanks溶液漂洗2次后，用打孔器将去上皮层消化羊膜打成直径2.5厘米的去上皮层消化羊膜圆片。

4、组织工程人角膜上皮的体外重建：去上皮层消化羊膜圆片按照上皮面朝上的方向平铺于6孔培养板插入式培养皿的底部，放置于37℃培养箱中干贴处理20～24小时后制成去上皮层消化羊膜载体支架。在载体支架的插入式培养皿中，轻轻加入0.1～0.2毫升上述准备好的种子细胞悬液，轻轻吹打使细胞悬液均匀分散于插入式培养皿中，置5％CO₂培养箱中37℃培养20～26小时待细胞完全贴附到载体支架上后，吸去插入式培养皿内的旧培养液，将插入式培养皿轻轻放入已加入0.8毫升10％小牛血清-DMEM/F12培养液的6孔培养板中，在5％CO₂培养箱中37℃进行组织工程人角膜上皮的体外重建，每隔12小时轻轻摇动6孔培养板，每隔24～36小时换液一次，待人角膜上皮细胞在载体支架上长成6～8层后即为重建的组织工程人角膜上皮。

实施例2

取人角膜上皮细胞，悬浮于20％小牛血清-DMEM/F12培养液中，接种至底面积为75平方厘米的培养瓶中，置37℃进行扩增培养80小时。取常规配制的DMEM/F12培养液80毫升，加入IV型胶原蛋白8毫克，完全溶解后用0.22微米的微孔滤膜过滤除菌，加入10毫升小牛血清，补加常规配制的DMEM/F12培养液至100毫升，即为本发明的角膜上皮重建专用培养液。对扩增培养后的培养瓶，用玻璃滴管吸出培养液，加入0.25％胰蛋白酶溶液消化1.5分钟，加入此前吸出的旧培养液终止消化，1500转/分离心10分钟，获得细胞沉淀，用3毫升上述专用培养液悬浮均匀制成人角膜上皮细胞悬液；利用Casy细胞计数仪或血球计数板进行细胞计数，用上述专用培养液调整细胞浓度至1.5×10⁷个细胞/毫升。

利用0.25％胰蛋白酶-0.1％EDTA溶液(1∶1)对冻干羊膜的上皮面进行倒置消化20分钟，以得到完全去除上皮层的羊膜，用D-hanks溶液漂洗2次后，用打孔器将去上皮层消化羊膜打成直径2.5厘米的去上皮层消化羊膜圆片，按照上皮面朝上的方向平铺于6孔培养板插入式培养皿的底部，放置于37℃培养箱中干贴处理24小时后制成去上皮层消化羊膜载体支架。在载体支架的插入式培养皿中，轻轻加入0.15毫升上述准备好的种子细胞悬液，轻轻吹打使细胞悬液均匀分散于插入式培养皿中，置5％CO₂培养箱中37℃培养24小时待细胞完全贴附到载体支架上后，吸去插入式培养皿孔内的旧培养液，将插入式培养皿轻轻放入已加入0.8毫升10％小牛血清-DMEM培养液的6孔培养板中，建立气-液界面培养环境，在5％CO₂培养箱中37℃进行组织工程人角膜上皮的体外重建，每隔12小时轻轻摇动6孔培养板，每隔30小时换液一次，待人角膜上皮细胞在载体支架上长成6～8层后即为重建的组织工程人角膜上皮。

实施例3

取人角膜上皮单克隆细胞株细胞，悬浮于20％小牛血清-DMEM/F12培养液中，接种至底面积为75平方厘米的培养瓶中，置37℃进行扩增培养72小时。取常规配制的DMEM/F12培养液80毫升，加入IV型胶原蛋白6毫克，完全溶解后用0.22微米的微孔滤膜过滤除菌，加入10毫升小牛血清，补加常规配制的DMEM/F12培养液至100毫升，即为本发明的角膜上皮重建专用培养液。对扩增培养后的培养瓶，用玻璃滴管吸出培养液，加入0.25％胰蛋白酶溶液消化1分钟，加入此前吸出的旧培养液终止消化，1000转/分离心15分钟，获得细胞沉淀，用3毫升上述专用培养液悬浮均匀制成人角膜上皮细胞悬液；利用Casy细胞计数仪或血球计数板进行细胞计数，用上述专用培养液调整细胞浓度至3×10⁷个细胞/毫升。

利用0.25％胰蛋白酶-0.1％EDTA溶液(1∶1)对冻干羊膜的上皮面进行倒置消化15分钟，以得到完全去除上皮层的羊膜，用D-hanks溶液漂洗2次后，用打孔器将去上皮层消化羊膜打成直径2.5厘米的去上皮层消化羊膜圆片，按照上皮面朝上的方向平铺于6孔培养板插入式培养皿的底部，放置于37℃培养箱中干贴处理20小时后制成去上皮层消化羊膜载体支架。在载体支架的插入式培养皿中，轻轻加入0.1毫升上述准备好的种子细胞悬液，轻轻吹打使细胞悬液均匀分散于插入式培养皿中，置5％CO₂培养箱中37℃培养26小时待细胞完全贴附到载体支架上后，吸去插入式培养皿内的旧培养液，将插入式培养皿轻轻放入已加入0.8毫升10％小牛血清-DMEM/F12培养液的6孔培养板中，在5％CO₂培养箱中37℃进行组织工程人角膜上皮的体外重建，每隔12小时轻轻摇动6孔培养板，每隔24小时换液一次，待人角膜上皮细胞在载体支架上长成6～8层后即为重建的组织工程人角膜上皮。

实施例4

取人角膜上皮单克隆细胞株细胞，悬浮于20％小牛血清-DMEM/F12培养液中，接种至底面积为75平方厘米的培养瓶中，置37℃进行扩增培养75小时。取常规配制的DMEM/F12培养液80毫升，加入IV型胶原蛋白4毫克，完全溶解后用0.22微米的微孔滤膜过滤除菌，加入10毫升小牛血清，补加常规配制的DMEM/F12培养液至100毫升，即为本发明的角膜上皮重建专用培养液。对扩增培养后的培养瓶，用玻璃滴管吸出培养液，加入0.25％胰蛋白酶溶液消化2分钟，加入此前吸出的旧培养液终止消化，1200转/分离心10分钟，获得细胞沉淀，用3毫升上述专用培养液悬浮均匀制成人角膜上皮细胞悬液；利用Casy细胞计数仪或血球计数板进行细胞计数，用上述专用培养液调整细胞浓度至8×10⁶个细胞/毫升。

利用0.25％胰蛋白酶-0.1％EDTA溶液(1∶1)溶液对冻干羊膜的上皮面进行倒置消化30分钟，以得到完全去除上皮层的羊膜，用D-hanks溶液漂洗2次后，用打孔器将去上皮层消化羊膜打成直径2.5厘米的去上皮层消化羊膜圆片，按照上皮面朝上的方向平铺于6孔培养板插入式培养皿的底部，放置于37℃培养箱中干贴处理22小时后制成去上皮层消化羊膜载体支架。在载体支架的插入式培养皿中，轻轻加入0.2毫升上述准备好的种子细胞悬液，轻轻吹打使细胞悬液均匀分散于插入式培养皿中，置5％CO₂培养箱中37℃培养20小时待细胞完全贴附到载体支架上后，吸去插入式培养皿内的旧培养液，将插入式培养皿轻轻放入已加入0.8毫升10％小牛血清-DMEM/F12培养液的6孔培养板中，在5％CO₂培养箱中37℃进行组织工程人角膜上皮的体外重建，每隔12小时轻轻摇动6孔培养板，每隔36小时换液一次，待人角膜上皮细胞在载体支架上长成6～8层后即为重建的组织工程人角膜上皮。

本发明的方法所重建出的组织工程人角膜上皮在形态结构和透明度上与正常角膜上皮相似并具有正常角膜上皮的功能。为了更好的验证本发明方法所获得的组织工程人角膜上皮具有生物学上的功能，将本发明所重建的组织工程人角膜上皮移植到去除角膜缘干细胞及刮除角膜上皮层的新西兰兔眼中，实验结果表明，移植的组织工程人角膜上皮可使兔眼角膜恢复透明长达180天以上，并且移植的上皮能够防御细菌的侵染。三次重复的结果都表明应用本发明方法构建的组织工程人角膜上皮具有替代自生角膜的前景。

Claims

1.一种组织工程人角膜上皮的重建方法，包括1)人角膜上皮种子细胞悬液的制备、2)羊膜载体支架的制备和3)组织工程人角膜上皮的培养步骤，其特征在于，上述步骤1)是用人角膜上皮细胞系的细胞来制备人角膜上皮种子细胞悬液，其中人角膜上皮细胞系的构建方法是：将角膜取出后用含抗生素的消毒液消毒，再将角膜进行消化处理后，取下带有前弹力层的角膜上皮，剪成小的角膜上皮组织块后，将角膜上皮组织块向下贴于培养孔的底部，使前弹力层向上；然后加入培养液在二氧化碳培养箱中、37℃下进行贴板培养，培养期间换培养液，细胞长成单层后用胰酶消化法进行继代培养，传代至60代以上完成了人角膜上皮细胞系的构建；所述的培养液为含有20％胎牛血清、0.02‰～0.04‰的人表皮细胞生长因子、0.01‰～0.02‰的人碱性成纤维细胞生长因子、0.4‰～1.0‰羧甲基壳寡糖和0.25‰～1‰硫酸软骨素的DMEM/F12培养液。

2.如权利要求1所述的重建方法，其特征在于上述的含抗生素的消毒液为用0.9％生理盐水配制的质量比浓度为20％～70％的庆大霉素溶液。

3.如权利要求1所述的重建方法，其特征在于上述的角膜进行消化处理是用浓度为0.2～0.5％的胰蛋白酶溶液消化，消化时间为1～2min。

4.如权利要求1所述的重建方法，其特征在于上述的步骤1)制备人角膜上皮种子细胞悬液是取人角膜上皮细胞，用含20％小牛血清的DMEM/F12培养液在37℃扩增培养至对数生长期，经0.25％胰蛋白酶溶液消化和1000～1500转/分钟离心10～15分钟获得人角膜上皮细胞沉淀，再用含有10％小牛血清和0.005％～0.01％IV型胶原蛋白的DMEM/F12培养液将该细胞沉淀悬浮成人角膜上皮细胞悬液，其中细胞浓度为8×10⁶～3×10⁷个/mL。

5.如权利要求1所述的重建方法，其特征在于上述的步骤2)羊膜载体支架的制备是用0.25％胰蛋白酶-0.1％EDTA溶液等体积混合对冻干羊膜的上皮面进行倒置消化，以彻底去除羊膜上皮细胞，用D-hanks溶液漂洗2次后，用打孔器将去上皮层消化羊膜打成与6孔培养板插入式培养皿孔径相同的去上皮层消化羊膜圆片，使其上皮面朝上平铺于6孔培养板插入式培养皿的底部，放置于5％CO₂培养箱中在37℃条件下牢固干贴后制成载体支架。

6.如权利要求1所述的重建方法，其特征在于上述的步骤3)组织工程人角膜上皮的培养是将在贴有去上皮层消化羊膜载体支架的插入式培养皿中，轻轻加入上述准备好的人角膜上皮细胞悬液0.1～0.2毫升，使细胞悬液均匀分散于插入式培养皿中，6孔培养板孔中不加培养液，置5％的CO₂培养箱中37℃培养20～24小时待细胞完全贴附到载体支架上后，吸去插入式培养皿内的旧培养液，将插入式培养皿轻轻放入已加入0.8毫升含10％小牛血清的DMEM培养液的6孔培养板中，建立气-液界面培养环境，在5％CO₂培养箱中37℃培养启动组织工程人角膜上皮的体外重建，每隔12小时轻轻摇动6孔培养板，每隔24～36小时换液一次，待人角膜上皮细胞在载体支架上长成6～8层后即为重建的组织工程人角膜上皮。