ES2263205T3

ES2263205T3 - Estirpes celulares citoliticas naturales y metodos de uso.

Info

Publication number: ES2263205T3
Application number: ES98920012T
Authority: ES
Inventors: Hans Klingemann
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1997-04-30
Filing date: 1998-04-30
Publication date: 2006-12-01
Anticipated expiration: 2018-04-30
Also published as: EP1007630A1; WO1998049268A9; US20040018182A1; DE69834257D1; EP1690927A1; EP1007630A4; US10138462B2; US20040022773A1; AU7267398A; US20020068044A1; US20040018183A1; WO1998049268A1; EP1007630B1; ATE323756T1; DE69834257T2; US20060110360A1

Abstract

Uso de un medio que comprende linfocitos NK-92 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un cáncer o de un tumor, en el que los linfocitos NK-92 destruyen las células que comprenden el cáncer o el tumor in vivo cuando se administran a un sujeto.

Description

Estirpes celulares citolíticas naturales y métodos de uso.

Campo de la invención

Esta invención se refiere al uso de un medio que comprende linfocitos citolíticos naturales para la preparación de un medicamento para el tratamiento de las enfermedades relacionadas con el cáncer o las infecciones víricas. Específicamente, se describen una estirpe celular determinada, NK-92, y modificaciones de la misma. Estos linfocitos se ha demostrado que son muy eficaces para el tratamiento de estas enfermedades.

Antecedentes de la invención

Determinadas células del sistema inmunitario tienen actividad citotóxica contra ciertas células diana. Los linfocitos T citotóxicos (LTC) se dirigen específicamente hacia sus dianas a través de péptidos derivados de antígenos unidos a marcadores específicos de la clase I del CMH. Los linfocitos citolíticos naturales (NK), sin embargo, no están tan restringidos. Los linfocitos NK, que generalmente representan aproximadamente el 10 o el 15% de los linfocitos en circulación, se unen a las células diana y las destruyen, incluidas las células infectadas por virus y muchas células neoplásicas, de forma inespecífica en relación al antígeno y sin una sensibilización inmunitaria previa (Herberman et al., Science 214: 24 (1981)). La destrucción de las células diana se produce mediante la inducción de la lisis celular. Asimismo, no intervienen la restricción por la clase del CMH. De este modo, la actividad de los linfocitos NK difiere de los linfocitos T específicos de la clase del CMH y específicos del antígeno, como los linfocitos T citotóxicos. Estas propiedades sugieren que los linfocitos NK se pueden usar en la inmunoterapia contra los tumores y las neoplasias malignas, ya que muchos tumores carecen del CMH de clase I y, por lo tanto, no atraen la actividad de los LCT. Las moléculas de adhesión también pueden intervenir en la especificidad de los linfocitos NK; por ejemplo, se ha observado que el receptor Fc\gamma (CD16) se expresa en los linfocitos NK. Los linfocitos NK son células granuladas grandes que carecen de CD3, y además de CD16, también pueden expresar Leu19 (Lanier et al., J. Immunol. 136; 4480 (1986)).

Los linfocitos NK se activan cuando se exponen a citocinas tales como las interleucina 2 (IL-2), IL-7, IL-12 y los interferones (Alderson et al., J. Exp. Med. 172: 577-587 (1990); Robertson et al., J. Exp. Med. 175: 779-788 (1992)). Las células resultantes se llaman linfocitos citolíticos activados por linfocinas (LCAL). El espectro de células diana está alterado en los linfocitos NK activados en comparación con los linfocitos inactivados, aunque el mecanismo de citólisis puede ser idéntico o similar (Philips et al., J. Exp. Med. 164: 814-825 (1986)).

Más generalmente, la actividad citolítica en las células del sistema inmunitario se puede inducir al tratar una población de células, tales como los linfocitos mononucleados de la sangre periférica (LMSP), con linfocinas. Tales preparaciones contienen LCAC. Los LCAC también se pueden generar a partir de muestras autólogas de linfocitos de la sangre periférica. Los LCAC tienen actividad citolítica antitumoral mientras que, esencialmente, no actúan sobre las células normales. Actúan purgando de la leucemia [Long et al., Transplantation 46: 433 (1988); Xhou et al., Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 34: 469 (1993; resumen)], linfoma [Schmidt-Wolf et al., J. Exp. Med. 174: 139 (1991); Gambacorti-Passerini et al., Br. J. Haematol. 18: 197 (1991)] y neuroblastoma [Adeset et al., Clin. Immunol Immunopathol. 46: 150 (1988)]. Los linfocitos NK, los linfocitos NK activados y los LCAC son distinguibles por los marcadores de su superficie celular y por el tipo de las células diana que destruyen.

Los linfocitos NK y los LCAC activados y expandidos (es decir, cultivados para que proliferen) se han usado tanto en el tratamiento ex vivo como en el tratamiento in vivo de pacientes con cáncer avanzado. Se ha observado cierto éxito con los tratamientos ex vivo de enfermedades relacionadas con la médula ósea, como la leucemia, el cáncer de mama y ciertos tipos de linfoma. El tratamiento in vivo se puede dirigir hacia estas formas de cáncer u otras, incluidos el melanoma maligno y el cáncer de riñón (Rosenberg et al., N. Engl. J. Med.316:889-897 (1987)). El tratamiento con los LCAC requiere que el paciente primero reciba IL-2, después una leucoforesis y, luego, una incubación y cultivo ex vivo de las células sanguíneas autólogas recogidas en presencia de la IL-2 durante unos pocos días. Los LCAC se deben reinfundir junto con dosis relativamente grandes de IL-2 para completar el tratamiento. Este tratamiento purgante es caro y puede causar unos efectos secundarios graves. Estos incluyen retención de líquidos, edema pulmonar, descenso de la tensión arterial y fiebre elevada. En algunos casos en los que se producen estos efectos secundarios, se requiere un tratamiento en la unidad de cuidados intensivos.

Las técnicas de purga también se han aplicado en otras circunstancias. Se pueden administrar fármacos citotóxicos o anticuerpos monoclonales combinados con el complemento, y toxinas, para causar la remisión. En tales casos, la médula ósea o los hemocitoblastos, purgados para reducir el número de células leucémicas residuales presentes, se han vuelto a infundir en el paciente después del tratamiento farmacológico [Uckun et al., Blood 79: 1094 (1992)]. Los estudios de marcación génica han demostrado que la médula ósea sin purgar puede contribuir a la recidiva en los pacientes que se supone que están en remisión [Brenner et al., Lancet 341: 85 (1993)]. Esto sugiere que se necesita alguna forma de purga de la médula autóloga o de la sangre antes del trasplante [Klingemann et al., Biol. Blood Marrow Transplant 2: 68-69 (1996)].

Recientemente, los estudios preclínicos también han demostrado una prometedora actividad antitumoral in vivo con un clon leucémico de linfocito T citotóxico sin restringir por el CMH e irradiado letalmente (TALL-104) [Cesano et al., Cancer Immunol. Immunother. 40: 139-151 (1995); Cesano et al., Blood 87: 393-403 (1996)]. Estas células se derivaron de estirpes de linfocitos T leucémicos obtenidas de pacientes que tienen leucemias linfoblásticas T agudas (LLA). Llevaban el marcador de superficie celular CD3, pero no el marcador CD56, a diferencia de los linfocitos NK que tienen el inmunofenotipo opuesto (CD3^{-} CD56^{+}). La transferencia adoptiva de estas células pudo eliminar las estirpes celulares leucémicas humanas en los ratones inmunodeficientes combinados graves (IDCG) xenotrasplantados e inducir remisiones de linfomas espontáneos en perros sin producir la leucemia de linfocitos T en los modelos de animales [Cesano et al. (1995); Cesano et al. (1996); Cesano et al., J. Clin. Invest. 94: 1076-1084 (1994); Cesano et al., Cancer Res. 56: 3021-3029 (1996)].

A pesar de las propiedades ventajosas de los linfocitos NK para destruir las células tumorales y las células infectadas con virus, sigue siendo difícil trabajar con ellos y aplicarlos en inmunoterapias. Es difícil expandir linfocitos NK ex vivo que mantengan su capacidades tumorotáctica, tumoricida y viricida in vivo. Esto sigue siendo el obstáculo principal para su uso clínico en la inmunoterapia celular adoptiva (Melder et al., Cancer Research 48: 3461-3469 (1988); Stephen et al., Leuk. Lymphoma 377-399 (1992); Rosenberg et al., New Engl. J. Med. 316: 889-897 (1987)]. Los estudios de los mecanismos mediante los cuales los linfocitos NK ejercen su efecto tumoricida y viricida también están limitados por las dificultades a la hora de enriquecer las fracciones en linfocitos NK sin comprometer sus funciones biológicas y a la hora de obtener linfocitos NK puros que no estén contaminados por linfocitos T u otras células efectoras inmunitarias. En un intento por solventar estos problemas, muchos investigadores han vuelto al uso de estirpes celulares establecidas de tipo NK para explorar los mecanismos mediante los cuales la células diana son susceptibles a los linfocitos citotóxicos [Hercend et al., Nature 301: 158-160 (1983); Yodoi et al., J. Immunol. 134: 1623-1630 (1985); Fernandez et al., Blood 67: 925-930 (1986); Robertson et al., Exp. Hematol. 24: 406-415 (1996). Gong et al., Leukemia 8: 652-658 (1994)]. Las estirpes celulares de NK descritas en trabajos anteriores llevan marcadores de superficie asociados a los linfocitos T, a pesar del hecho de que se desarrollaron a partir de células precursoras desprovistas de linfocitos T (Rosenberg, et al (1987); Hercend, et al., (1983)].

Así, se sigue necesitando un método para tratar una enfermedad relacionada con el cáncer o una infección vírica con una estirpe de linfocitos citolíticos naturales que mantenga la viabilidad y la eficacia terapéutica frente a una serie de clases de tumores. Esta necesidad abarca métodos terapéuticos en los que muestras de un mamífero se tratan ex vivo con linfocitos citolíticos naturales, así como métodos de tratamiento de estas enfermedades con linfocitos citolíticos naturales in vivo en un mamífero. También se necesita una estirpe de linfocitos citolíticos naturales que mantenga su propia propensión a la viabilidad y la actividad citolítica mediante la secreción de una citocina que potencie estas propiedades. También se necesita que tales estirpes de linfocitos citolíticos naturales que estén modificadas para que sean más eficaces, adecuadas y/o útiles para el tratamiento del cáncer y la infección vírica. El objetivo de esta invención es proporcionar los linfocitos NK y métodos que cubran estas necesidades.

Compendio de la invención

La estirpe de linfocitos descrita por Gong et al. (1994), denominada NK-92, prolifera en presencia de la IL-2 y tiene una gran actividad citolítica contra una serie de cánceres. La presente invención emplea la estirpe de linfocitos NK-92, así como estirpes de linfocitos NK-92 modificados, para proporcionar un medicamento para el tratamiento contra el cáncer. La memoria descriptiva describe vectores que transfectan los linfocitos NK-92, así como los NK-92 modificados. Para los propósitos de esta invención y, a menos que se indique de otro modo, la terminología "NK-92" pretende referirse a las estirpes celulares originales de la NK-92 así como a las estirpes celulares de la NK-92 modificadas descritas en la presente memoria.

Un aspecto de la memoria descriptiva describe un vector para transfectar los linfocitos NK-92, en la que el vector incluye una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína que es bien una citocina que promueve el crecimiento de los linfocitos NK-92, un componente celular que responde a un agente, una molécula receptora de las células del cáncer o cualquier combinación de estas proteínas. Cuando se transfectan con el vector, los linfocitos NK-92 expresan constitutivamente la proteína. La proteína puede ser la citocina interleucina 2. Los vectores pueden ser MFG-hIL-2 y pCEP4-LTR.hIL-2. La proteína puede ser un componente celular que responde a un agente, de tal forma que cuando el vector transfecta los linfocitos NK-92 y éstos captan el agente, los linfocitos se inactivan. El agente puede ser bien aciclovir o ganciclovir.

Una realización adicional de la invención se proporciona una población celular que contiene linfocitos NK-92 que se han modificado mediante un tratamiento físico o mediante la transfección con un vector. En realizaciones importantes de esta población, el tratamiento las convierte en no proliferativas, no disminuyendo significativamente, a pesar de todo, la citotoxicidad de las células y, en realizaciones particularmente importantes, el tratamiento es la irradiación. En realizaciones adicionales importantes, se han transfectado las células mediante un vector que codifica una citocina que promueve el crecimiento de las células. Una vez que se han introducido en un mamífero, las células secretan la citocina tanto si se han cultivado en condiciones que fomentan la secreción de citocina como in vivo. En realizaciones particularmente importantes de este aspecto de la invención, la citocina es la interleucina 2. En otras realizaciones más importantes, los linfocitos NK-92 son los linfocitos NK-92MI, modificados por la transfección con el vector que codifica la MFG-hIL-2, y los linfocitos NK-92CI modificados por la transfección con el vector pCEP4-LTR.hIL-2 que codifica la interleucina 2. Las estirpes de linfocitos NK-92MI y NK-92CI han estado en la American Type Culture Collection.

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En realizaciones importantes adicionales, los linfocitos NK-92 se han transfectado mediante un vector que incluye una secuencia que codifica un componente celular que responde a un agente de tal forma que, cuando el linfocito NK-92 así transfectado toma el agente, la célula se inactiva. En realizaciones particularmente importantes de la misma, el agente es aciclovir o ganciclovir. En otras realizaciones adicionales, la población celular se transfecta con un vector que codifica una molécula receptora de la célula del cáncer.

Además, la presente invención proporciona el uso de un medio que comprende linfocitos NK-92 para la preparación de un medicamento para tratar una enfermedad in vivo en un mamífero adecuado para administrar al mamífero un medio que comprende linfocitos citolíticos naturales, bien sean linfocitos NK-92 o linfocitos NK-92 que se han modificado mediante un tratamiento físico que los hace no proliferativos y que, a pesar de ello, no reduce su citotoxicidad, mediante un tratamiento que inhibe la expresión de los antígenos HLA en la superficie de los linfocitos NK-92 o mediante la transfección con un vector. El vector codifica una citocina que promueve el crecimiento de las células, o una proteína que responde a un agente, o una molécula receptora de una célula cancerosa, o se han tratado mediante cualquier combinación de estas modificaciones. En realizaciones importantes, la enfermedad es un cáncer, como leucemia, un linfoma o un mieloma múltiple. Alternativamente, en realizaciones importantes, la enfermedad es la infección mediante un virus patógeno como VIH, VEB, CMV o herpes. Realizaciones ventajosas de este método incluyen administrar las células por vía intravenosa a un humano y administrar una citocina que promueve el crecimiento de las células del mamífero, junto con la administración del medio que comprende el linfocito citolítico natural. Los presentes métodos están especialmente adaptados para el tratamiento de la leucemia, el linfoma o el mieloma múltiple.

En otra realización adicional del uso de un medio que comprende linfocitos NK-92 para la preparación de un medicamento para tratar el cáncer, la NK-92 se modifica mediante la transfección con un vector que comprende un elemento que responde a un agente de tal forma que cuando el agente es tomado por la célula, la célula se inactiva. De acuerdo con este uso, una cantidad del agente eficaz para inactivar la célula es adecuada para administrarla a un mamífero después de que haya pasado un tiempo suficiente como para que el linfocito citolítico natural trate el cáncer o un tiempo deseable para finalizar el tratamiento con eficacia. Un aspecto importante de esta realización es uno en el que el agente es aciclovir o ganciclovir. Tales células transfectadas pueden, en efecto, "apagarse" como se desee mediante la administración del agente.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Actividad citotóxica de los linfocitos NK-92 contra diferentes estirpes celulares leucémicas de diana comprobada en un análisis de liberación de ^{51}Cr de 4 horas. Los resultados representan la media \pm desviación estándar (DE) de tres experimentos replicados.

Figura 2. Citotoxicidad de NK-92 después de la retirada de la IL-2. Los linfocitos NK-92 se cultivaron en un medio alfa enriquecido (Myelocult™, StemCell Technologies, Vancouver, BC) sin IL-2. Se midió diariamente la citotoxicidad con el análisis de liberación de ^{51}Cr contra las células diana K562-neo^{r} o Daudi. La figura muestra los resultados de un experimento representativo a la proporción de efector:diana (E:D) de 10:1.

Figura 3. Efecto de varias dosis de radiación \gamma sobre el potencial citolítico de los linfocitos NK-92. Los linfocitos NK-92 se irradiaron con una fuente de ^{137}Cs utilizando dosis que oscilan de 200 a 1000 cGy. Para permitir la recuperación, se dejaron las células en un medio que contenía IL-2 durante 24 horas antes de medir la citotoxicidad en un análisis de liberación de ^{51}Cr de 4 horas contra la estirpe celular de diana K562.

Figura 4. Curvas de supervivencia de los linfocitos NK-92 después de la irradiación \gamma. Los linfocitos NK-92 se irradiaron con una fuente de rayos \gamma con dosis de 300, 500, 1000 y 3000 cGy. Se determinó la viabilidad de los linfocitos NK-92 mediante tinción de azul de tripano. La concentración máxima alcanzable de los linfocitos NK-92 sin irradiar en el cultivo fue de aproximadamente 1,5 x 10^{6} células/ml. Se tuvieron que alimentar las células para evitar el crecimiento excesivo.

Figura 5. Efecto de la irradiación \gamma sobre la formación de colonias de linfocitos NK-92 in vitro. Se cultivaron los linfocitos NK-92 en un medio a base de agar complementado con IL-2 humana recombinante (rhIL-2).

Figura 6. Efecto de varias dosis de irradiación sobre el potencial citolítico de los linfocitos NK-92. Se irradiaron con rayos \gamma los linfocitos NK-92 con dosis de 300, 500, 1000 y 3000 cGy. Se ensayó la susceptibilidad a la citólisis por linfocitos NK-92, irradiados y sin irradiar (SI) de las células diana leucémicas K562 marcadas con ^{51}Cr (panel A) y HL60 (panel B), así como las dos muestras leucémicas obtenidas de pacientes TA27 (panel C) y BA25 (panel D). Los resultados de análisis de liberación de cromo de 4 horas se expresan como el unidades líticas del 30%/10^{8} células efectoras.

Figura 7. Destrucción selectiva de las células leucémicas derivadas de pacientes mediante linfocitos NK-92. Se ensayó la susceptibilidad a la citólisis por linfocitos NK-92 en cuatro proporciones de E:D diferentes de células diana leucémicas marcadas con ^{51}Cr obtenidas de 40 pacientes [9 casos de leucemia mieloide aguda (LMA), 11 casos de leucemia mieloide crónica (LMC), 14 casos de leucemia linfoblástica aguda (LLA) de tipo B y 6 casos de LLA-T] y células de médula ósea normales desprovistas de linfocitos T de 14 donantes normales. Los resultados de un análisis de liberación de cromo de 4 horas se expresan como unidades líticas del 30%/10^{8} células efectoras a una proporción de E:D de...

Figura 8. Eficacia antileucémica in vitro (paneles A y B) e in vivo (paneles C y D) de los linfocitos NK-92 contra las leucemias K562 y HL60 en comparación con los LCAC humanos y otros efectores. Se comprobó la susceptibilidad a la citólisis por linfocitos NK-92 de las células K562 (panel A) y HL60 (panel B) marcadas con ^{51}Cr en comparación con varias células efectoras conocidas [LCAC, NK (CD3^{-} CD56^{+}), y linfocitos T (CD3^{+} CD56^{-})] a las proporciones de E:D indicadas en un análisis de CRA de 4 horas. Los resultados son las medias \pm DE de tres pruebas distintas para los linfocitos NK-92 y dos pruebas de diferentes de efectoras derivadas de donantes para los linfocitos LCAC, CD56^{+} y CD3^{-}. Se inocularon ratones IDCG por vía subcutánea con células K562 (panel C) o HL60 (panel D) (5 x 10^{6} células por ratón) solas o en combinación con linfocitos NK-92, LCAC o NK en una proporción de E:D de 4:1. Como una medida de los tamaños de los tumores, se midieron las áreas de sus superficies una vez a la semana después de la inoculación (n = 5).

Figura 9. Efecto antileucémico, determinado in vitro e in vivo, de los linfocitos NK-92, los linfocitos T citotóxicos (LTC) alógenos y otras células efectoras contra una leucemia linfoblástica T aguda (LLA-T) obtenida de pacientes. Panel A: la destrucción específica in vitro de las células diana de LLA-T (TA27) por los linfocitos NK-92, los LTC y otras células efectoras se determinó mediante un análisis de liberación de ^{51}Cr de 4 horas utilizando las proporciones de E:D indicadas. Los resultados son las medias \pm DE de dos o tres pruebas distintas. Panel B: se inocularon ratones IDCG por vía subcutánea con células TA27 (5 x 10^{6} cada ratón) solas o coinoculadas con linfocitos NK-92, LTC u otras células efectoras en una proporción de E:D de 4:1. Se administró IL-2 humana recombinante (rhIL-2) a los ratones por vía intraperitoneal durante 2 semanas a la dosis de 5 x 10^{4} U en días alternos. Se midieron las áreas del tumor leucémico una vez a la semana después de la inoculación (n = 5).

Figura 10. Supervivencia de los ratones IDCG que portan una leucemia LLA-T (TA27) coinoculada con linfocitos NK-92 en comparación con la coinoculación con LTC alógenos o células TALL-104 irradiadas.

Figura 11. Supervivencia de los ratones IDCG que portan LLA-T (TA27) después del tratamiento con linfocitos NK-92. Los ratones recibieron 5 x 10^{6} células TA27 por vía intraperitoneal (i. p.). Se inyectaron linfocitos NK-92 (2 x 10^{7}) por vía i. p. una vez, o cinco veces (en los días 1, 3, 5, 7 y 9), con o sin la adición de rhIL-2 en días alternos durante dos semanas.

Figura 12. Supervivencia de los ratones IDCG que llevan LLA pre-B (BA31) después del tratamiento con linfocitos NK-92. Los ratones recibieron 5 x 10^{6} células BA31 por vía i. p. Se inyectaron linfocitos NK-92 (2 x 10^{7}) por vía i. p. con 5 dosis en total, en los días 1, 3, 5, 7 y 9. Los ratones en los grupos indicados recibieron rhIL-2 en días alternos durante dos semanas.

Figura 13. Supervivencia de los ratones IDCG que llevan LMA humana (MA26) después del tratamiento con linfocitos NK-92. Los ratones recibieron 5 x 10^{6} células de leucemia MA26 por vía i. p. Se inyectaron linfocitos NK-92 (2 x 10^{7}) por vía i. p. en los días 1, 3, 5, 7 y 9 con cinco dosis en total. Los ratones de los grupos indicados recibieron rhIL-2 en días alternos durante dos semanas.

Figura 14. Mapa esquemático del plásmido MFG-hIL-2.

Figura 15. Mapa esquemático del plásmido pCEP4-LTR.hIL-2.

Figura 16. Análisis por PCR del ADNc de la IL-2 humana en los linfocitos NK-92, NK-92MI y NK-92CI. El ADN aislado de los NK-92 originales y de los transfectantes NK-92MI y NK-92CI se sometió a un análisis por PCR con los cebadores que flanquean el primer exón del gen de la IL-2 humana. Los productos de la PCR se resolvieron en un gel de agarosa al 2%, se tiñeron con bromuro de etidio y se visualizaron en un transiluminador de UV (panel A). El ADN se transfirió a una membrana de nilón y se analizó mediante el análisis por transferencia Southern con una sonda radiomarcada del gen de la IL-2 humana (panel B).

Figura 17. Análisis por transferencia Northern de la expresión de la citocina en NK-92, NK-92MI y NK-92CI. Las muestras de ARN aisladas de las estirpes celulares original y transfectadas se separaron por electroforesis en gel de agarosa transferido a membrana de nilón mediante transferencia capilar y se hibridaron con sondas de la IL-2 humana (panel A) y el TNF-\alpha (panel B).

Figura 18. Citotoxicidad de NK-92, NK-92MI y NK-92CI contra las células diana K562 y Raji. Las actividades citotóxicas de los transfectantes de la IL-2 se compararon con las de la estirpe celular original. Los linfocitos NK se mezclaron con células K562 (panel A) o Raji (panel B) marcadas con ^{51}Cr a unas proporciones de efector:diana de 1:1, 5:1, 10:1 y 20:1 durante un análisis de liberación de cromo de 4 horas. Se muestra la citotoxicidad de NK-92 (\medbullet), NK-92MI (\blacktriangle) y NK-92CI (\blacksquare).

Figura 19. Efecto de NK-92 MI y NK-92CI sobre los progenitores hematopoyéticos. Para analizar el efecto de los linfocitos NK-92 sobre los progenitores hematopoyéticos normales, se realizó un análisis clonogénico. Se incubaron los LMSP con NK-92MI o NK-92CI irradiados a varias proporciones de NK:LMSP que oscilan de 1:1 a 1:1000 durante 48 horas. Las células se sembraron sobre metilcelulosa a unas concentraciones que dan de 10 a 100 colonias por placa después de 14 días. El rendimiento clonogénico de los LMSP incubados con NK-92MI (barras blancas) y NK-92CI (barras grises) se expresa como el número total de colonias o se subclasifica sobre la base del tipo de colonia (UFR-E, UFC-GM y UFC-GEMM).

Figura 20. Efecto de la irradiación sobre la proliferación y la viabilidad de NK-92, NK-92MI y NK-92CI. Para evaluar el efecto de la irradiación sobre los linfocitos NK-92 original y transfectados, se expusieron las células a dosis de irradiación de 0, 500, 1000, 1500. y 2000 cGy, y se analizó la proliferación mediante un análisis estándar de incorporación de [^{3}H]-timidina. Panel A: la proliferación de NK-92 (\medbullet), NK-92MI (\blacktriangle) y NK-92CI (\blacksquare) se expresa como un porcentaje del control (células sin irradiar). Panel B: se expusieron las células a una irradiación de 0, 250, 500, 1000 y 2000 cGy y se evaluó su viabilidad mediante la exclusión con azul de tripano después de 24 (barras negras), 48 (barras grises) y 72 horas (barras blancas).

Figura 21. Efecto de la irradiación sobre la citotoxicidad de NK-92, NK-92MI y NK-92CI. Para evaluar el efecto de la irradiación sobre la citotoxicidad de los linfocitos NK, se irradiaron los linfocitos NK-92, NK-92MI y NK-92CI con 0, 1000 y 2000 cGy y se comprobó la citotoxicidad contra las células K562 (panel A) y las células Raji (panel B) después de tres días.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere al uso de un medio que comprende linfocitos NK-92 para la preparación de un medicamento para tratar una muestra biológica o un mamífero que se sospecha que tiene una enfermedad, como un cáncer. Se emplean determinados linfocitos citolíticos naturales que son citolíticos frente a las células afectadas por la enfermedad. El tratamiento da lugar a una disminución significativa del número o, en algunos casos, a la eliminación, de las células malignas o cancerosas, o de las células infectadas por virus, en la muestra o el mamífero. Los linfocitos citolíticos naturales de esta invención se citan como linfocitos NK-92 e incluyen determinados linfocitos NK-92 tratados o modificaciones por la transfección de los linfocitos NK-92. Estas células son muy eficaces para purgar de células cancerosas ex vivo y para destruir células cancerosas in vivo.

Tal y como se utiliza para describir la presente invención, "linfocitos T citotóxicos" (LTC) se refiere a las células inmunitarias que destruyen células diana específicas de antígeno. Los LTC están restringidos por el CMH de clase I. Tal y como se utiliza para describir la presente invención, los linfocitos citolíticos activados por las linfocinas (LCAC) se refieren a las células del sistema inmunitario que tienen una actividad destructora antitumoral. Se obtienen de una población de células, como los linfocitos mononucleados de la sangre periférica, tras la activación mediante el tratamiento con linfocinas. Los LCAC, esencialmente, no tienen ningún efecto sobre las células normales.

Tal y como se utiliza para describir la presente invención, "linfocitos citolíticos naturales (NK)" son células del sistema inmunitario que destruyen células diana en ausencia de un estímulo antigénico específico, y sin restricción en relación a la clase de CMH. Las células diana pueden ser células tumorales o células que albergan virus. Los linfocitos NK se caracterizan por la presencia del marcador de superficie CD56 y por la ausencia del CD3. La presente invención está basada en una estirpe de linfocitos NK inmortales, la NK-92, originalmente obtenida de un paciente que tenía el linfoma no de Hodgkin. Tal y como se utiliza para describir la presente invención, una célula NK-92 modificada es una célula NK-92 que además se ha tratado para dotarla con propiedades que no se encuentran en la célula original de la que deriva. Tales tratamientos incluyen, por ejemplo, tratamientos físicos, tratamientos químicos y/o biológicos y similares. Los tratamientos confieren propiedades a los linfocitos NK-92 modificados que los hacen más ventajosos para los propósitos de la invención.

Tal y como se utiliza para describir la presente invención, la terminología "citotóxica " y "citolítica", cuando se utiliza para describir la actividad de células efectoras como los NK, se debe considerar como sinónima. En general, la actividad citotóxica se refiere a la destrucción de las células diana mediante cualquiera de una serie de mecanismos biológicos, bioquímicos o biofísicos. La citólisis se refiere más específicamente a la actividad en la que el efector lisa la membrana plasmática de la célula diana, por lo que se destruye su integridad física. Esto da lugar a la destrucción de la célula diana. Sin desear estar comprometido por la teoría, se cree que el efecto citotóxico de los linfocitos NK se debe a la citólisis.

Tal y como se utiliza para describir la presente invención, "células diana" son las células que son destruidas por la actividad citotóxica de los linfocitos NK de la invención. Estas incluyen, en particular, las células que son malignas o de otro tipo derivadas de un cáncer, y células que están infectadas por virus patógenos como VIH, VEB, CMV o herpes.

Tal y como se utiliza para describir la presente invención, "purga" se refiere a la destrucción ex vivo de las células diana por células efectoras tales como los linfocitos NK. Las células diana pueden incluirse en una muestra biológica obtenida de un mamífero que se cree que padece una enfermedad relacionada con la presencia de la célula diana en la muestra. La enfermedad puede ser un cáncer o una neoplasia maligna debido a las células tumorales de la muestra, y se puede tratar purgando de la muestra las células tumorales y devolviendo la muestra al cuerpo del
mamífero.

Tal y como se utiliza para describir la presente invención, la "inactivación" de los linfocitos NK-92 los hace incapaces de desarrollarse y/o realizar su función normal, en particular, su actividad citotóxica. La inactivación también puede estar relacionada con la muerte de los linfocitos NK-92. Se contempla que los linfocitos NK-92 puedan inactivarse una vez que hayan purgado ex vivo y de manera eficaz una muestra de células relacionadas con una enfermedad en una aplicación terapéutica, o después de que hayan permanecido dentro del cuerpo de un mamífero durante un periodo de tiempo suficiente como para destruir eficazmente muchas o todas las células diana que permanecen en del cuerpo. Se puede inducir la inactivación, a modo de ejemplo no limitante, administrando un agente inactivador al que los linfocitos NK-92 son sensibles.

Tal y como se utiliza en esta memoria, un "vector" se refiere a un ácido nucleico cuya función es incorporar un segmento determinado de ácido nucleico, como una secuencia que codifica un gen determinado, en una célula. En la mayoría de las veces, la célula no contiene el gen de forma natural, por lo que el gen particular que se incorpora es un gen heterólogo. Un vector puede incluir elementos funcionales adicionales que dirigen y/o regulan la transcripción del gen o fragmento insertado. La secuencia reguladora está colocada operativamente en relación con la secuencia que codifica la proteína de tal forma que, cuando se introduce el vector en una célula hospedadora adecuada y la secuencia reguladora ejerce su efecto, se expresa la proteína. Las secuencias reguladoras pueden incluir, a modo de ejemplo no limitante, un promotor, regiones cadena arriba y cadena abajo del promotor, como los potenciadores, que pueden regular la actividad transcripcional del promotor, y un origen de replicación. Aún más, un vector puede incluir sitios de restricción adecuados, marcadores de resistencia a antibióticos y otros marcadores para seleccionar las células que contienen el vector, sitios de ayuste del ARN, una región de terminación de la transcripción y así sucesivamente.

Tal y como se utiliza para describir la presente invención, "cáncer", "tumor" y "neoplasia maligna" se refieren equivalentemente a una hiperplasia de un tejido u órgano. Si el tejido es una parte del sistema linfático o del inmunitario, las células malignas pueden incluir los tumores no sólidos de las células en circulación. Las neoplasias malignas de otros tejidos u órganos pueden producir tumores sólidos. En general, los métodos de la presente invención se pueden utilizar para el tratamiento de células linfáticas, células inmunitarias en circulación y tumores sólidos.

Linfocitos citolíticos naturales NK-92

La estirpe celular NK-92 ha sido descrita por Gong et al. (1994). Se ha encontrado que presenta los marcadores de superficie CD56^{bright}, CD2, CD7, CD11a, CD28, CD45, y CD54. Además, no muestra los marcadores CD1, CD3, CD4, CD5, CD8, CD10, CD14, CD16, CD19, CD20, CD23 y CD34. El crecimiento de los linfocitos NK-92 en cultivo depende de la presencia de la interleucina 2 recombinante (rIL-2), siendo suficiente una dosis tan baja como 10 UI/ml para mantener la proliferación. La IL-7 y la IL-12 no mantienen el crecimiento a largo plazo, ni lo hacen las otras citocinas probadas, incluidas la IL-1\alpha, la IL-6, el factor de necrosis tumoral \alpha, el interferón \alpha y el interferón \gamma. Los linfocitos NK-92 son muy eficaces a la hora de destruir determinadas células tumorales, como las células K562 (eritroleucemia) y Daudi (linfoma de Burkitt), gracias a su gran citotoxicidad incluso en una baja proporción efector:diana (E:D) de 1:1 [Gong et al. (1994)]. Además, los linfocitos NK-92 tienen una gran actividad citotóxica contra las células 8E5, que están infectadas con el VIH y producen viriones del VIH. Los linfocitos NK-92 están depositados en la American Type Culture Collection.

Los linfocitos NK-92 se mantienen fácilmente en un medio de cultivo, como el medio mínimo esencial alfa enriquecido (MEM; Sigma Chemical Co. St. Louis, MO, EE. UU.) complementado con suero de ternero fetal (por ejemplo, al 12,5%; Sigma Chemical Co., St. Louis. MO, EE. UU.). Inicialmente, se necesita hidrocortisona 10^{-6} M, pero en los siguientes pases, se encuentra que se puede omitir la hidrocortisona. Además, para el crecimiento a largo plazo, se necesita la IL-2, como la IL-2 humana recombinante (500 U/ml; Chiron, Emeryville, CA, EE. UU.). Cuando los cultivos en suspensión se mantienen de este modo con cambios semisemanales del medio, las células muestran un tiempo de generación de unas 24 horas.

Los linfocitos NK-92 muestran in vitro una actividad lítica contra un amplio espectro de células diana malignas. Estas incluyen estirpes celulares derivadas de las células diana en circulación tales como las leucemias linfoblástica aguda y crónica y la mielógena, el linfoma, el mieloma, el melanoma, así como las células derivadas de tumores sólidos tales como las estirpes celulares de cáncer de próstata, neuroblastoma y cáncer de mama. Se observa este efecto incluso en proporciones muy bajas de efector:diana. Esta lisis es superior a la citotoxicidad obtenida con los linfocitos mononucleados de la sangre periférica normal estimulados durante cuatro días con la IL-2.

Vector para transfectar células de mamíferos para producir una citocina

La presente invención proporciona linfocitos NK-92 que se han modificado por transfección con un vector que dirige la secreción de una citocina, como la IL-2. Para que los linfocitos NK-92 mantengan el crecimiento a largo plazo y la actividad citolítica, por lo general se les debe proporcionar IL-2. Por lo tanto, un vector que codifica el gen de la IL-2 humana, y que también contiene un elemento de control que dirige la síntesis del producto génico IL-2, es de gran utilidad en la invención. Los linfocitos NK-92 que portan tal vector secretan la IL-2 necesaria para la actividad citolítica en un contexto terapéutico: así, no se necesita IL-2 de una fuente exógena. El elemento de control es uno que dirige la síntesis de la IL-2 como un producto constitutivo, a saber, uno que no es dependiente en la inducción. Los métodos para construir y emplear vectores se describen en términos generales en "Current Protocols in Molecular Biology" de Ausubel et al., John Wiley and Sons, Nueva York (1987, actualizado trimestralmente) y en "Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2ª Ed.", de Sambrook, Fritsch y Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989).

NK-92 modificado por transfección para producir la citocina y método de transfección

Los linfocitos NK-92 modificados que secretan una citocina se pueden preparar introduciendo un vector que dirige la síntesis y la secreción de la citocina en las células. En aspectos importantes de la invención, la citocina es la IL-2. Los métodos para introducir un vector en una célula de mamífero los conocen bien los expertos en biología molecular e inmunología celular, y se describen en Ausubel et al. (1987, actualizado trimestralmente) y en Sambrook et al. (1989). Los vectores que codifican la citocina abarcan también elementos de control que conducen a la síntesis constitutiva de la citocina cuando se incorporan en las células NK-92.

Cuando se cultivan en unas condiciones adecuadas que promueven la secreción de la citocina, los linfocitos NK-92 transfectados secretan la IL-2 y otras citocinas. Dado que el vector dirige la síntesis constitutiva de la citocina, para que las células transfectadas secreten la citocina basta con cultivos de nutrientes en los que se sabe que los linfocitos NK-92 crecen y muestran su función citolítica normal. Por el mismo motivo, las células transfectadas secretan la citocina in vivo cuando se introducen dentro del cuerpo de un animal.

Los linfocitos NK-92 transfectados con un vector que dirige la secreción de una citocina como la IL-2 son útiles en el tratamiento ex vivo de una muestra biológica extraída de un mamífero del que se sospecha que contiene células malignas. Con el tratamiento de las células malignas con estos linfocitos NK-92 modificados, se obvia la necesidad de aplicar la IL-2 exógena u otra citocina. Estos linfocitos NK-92 son útiles, por las mismas razones, para el tratamiento in vivo de un mamífero que padece una neoplasia maligna. Los linfocitos NK-92 modificados ejercen su efecto citolítico contra las células malignas cuando se introducen en el cuerpo del mamífero. Ejemplos de tales linfocitos en la presente invención se citan como NK-92MI y NK-92CI.

Linfocitos NK-92 que son citolíticos pero incapaces proliferar

Un linfocito NK-92 modificado adicional de la invención es el que se ha tratado de tal manera que ya es incapaz de proliferar, aunque se conserve su actividad citotóxica. Un modo de lograr este estado es mediante la irradiación \gamma. Se pueden emplear formas adicionales de irradiación que incluyen, por ejemplo, la irradiación ultravioleta. Fuentes adecuadas para utilizar para este propósito incluyen, por ejemplo, una fuente de ^{137}Cs (Cis-US, Bedford, MA, Gammacell 40, Atomic Energy of Canada Ltd., Canadá). Aún más, se puede anular la actividad proliferativa mediante el tratamiento con agentes químicos que inhiben la síntesis del ADN. Un ejemplo de tal agente es la mitomicina C.

Vector para transfectar NK-92 con un elemento que responde a un agente inactivador

También se pueden modificar los linfocitos NK-92 mediante transfección con un vector de tal forma que, cuando el linfocito toma un agente específico, el linfocito se inactive. El vector incluye una secuencia que codifica un componente celular que responde al agente, de tal forma que cuando el vector transfecta un linfocito y el linfocito capta el agente, el linfocito se inactiva. En las realizaciones preferidas, el agente es aciclovir o ganciclovir. El vector también contiene un elemento de control que dirige la síntesis del componente celular como un producto constitutivo.

El linfocito NK-92 transfectado con el vector descrito en el párrafo anterior mantiene su crecimiento y actividad citolítica característicos en ausencia del agente. Se puede administrar el agente en un momento determinado, por ejemplo, cuando se ha purgado una muestra ex vivo de células malignas mediante la acción de los linfocitos NK-92, o cuando los linfocitos NK-92 administrados in vivo han ejercido con eficacia su actividad citolítica dentro del cuerpo de un mamífero, o cuando se desea detener el tratamiento por cualquier razón. El agente interacciona con el componente celular sensible al agente codificado en el vector. La interacción del agente con el componente celular induce la inactivación de los linfocitos NK-92. La inactivación puede oscilar desde la pérdida de la función citolítica característica hasta la muerte de las células.

Esta propiedad de los linfocitos NK-92 modificados es importante porque los linfocitos NK-92 originales se derivaron de una estirpe celular tumoral que puede continuar propagándose en una muestra reintroducida en un mamífero después de un tratamiento ex vivo, o in vivo cuando se administra así. Por lo tanto, es importante eliminar las células después de que hayan realizado su función terapéutica. Convertir las células sensibles a un agente, como el aciclovir o el ganciclovir, es un modo ventajoso de lograr este objetivo.

Vector para transfectar NK-92 con una molécula de HLA alterada en la superficie celular

La proteína HLA de superficie celular, implicada en presentar antígenos a otras células del sistema inmunitario, incluye una subunidad inmunoinespecífica: la proteína microglobulina \beta_{2}. Si esta proteína está alterada o mutada, la proteína HLA pierde su afinidad por el receptor de los linfocitos T al que se une normalmente. El gen de la microglobulina \beta_{2} en los linfocitos NK-92 de la invención se puede mutar por mutagénesis específica de sitio para, de este modo, transformar sus propiedades. El resultado es un linfocito NK-92 que ya no tiene una gran afinidad por los receptores de los linfocitos T. Como resultado, el linfocito NK-92 modificado de este modo permanece dentro del organismo hospedador durante un mucho tiempo, en lugar de ser eliminado mediante la acción de la respuesta inmunitaria celular del huésped.

Vector para transfectar NK-92 con un gen que codifica una molécula receptora de la célula cancerosa

Los linfocitos NK-92 también se pueden modificar por transfección con un vector de tal forma que las células expresan constitutivamente un receptor para una célula cancerosa. Las células cancerosas expresan moléculas en la superficie celular que son idiosincrásicas para el origen del cáncer y que, frecuentemente, también son idiosincrásicas para el hospedador concreto. La población de los LTC en tales pacientes enfermos pueden haberse activado mediante la exposición a las células del cáncer en crecimiento. Tales LTC activados expresan proteínas en la superficie celular que son específicas para las células del cáncer, o los dirigen contra éstas. Se pueden aislar estos LTC e identificar, aislar y transfectar el gen del receptor director en los linfocitos NK-92 de la invención. Esto confiere a los linfocitos NK-92 la capacidad de actuar también específicamente contra las células cancerosas presentes en el hospedador concreto. Esto tiene el efecto de mejorar la especificidad de la actividad citotóxica de los linfocitos NK-92 frente a las células cancerosas de ese individuo. El correspondiente procedimiento se llevaría a cabo para cada hospedador que padece cáncer, aprovechándose de la especificidad idiosincrásica del resto director del LTC en cada caso.

Uso

Los linfocitos citolíticos naturales de la invención se utilizan para la preparación de un medicamento para tratar muestras biológicas con el fin de purgarlas de células de un cáncer, una neoplasia maligna o un tumor. Los linfocitos NK incluyen, a modo de ejemplo no limitante, linfocitos NK-92 y NK-92 modificados, como NK-92MI y NK-92CI, así como otros linfocitos NK-92 modificados concebidos dentro del alcance de esta invención. Los linfocitos NK-92MI y NK-92CI se modifican mediante la transfección con vectores que dan lugar a la secreción de la IL-2. Además, cualquiera de los linfocitos NK-92, NK-92MI y NK-92CI se pueden tratar de tal forma que mantengan la actividad citolítica de las células sin tratar pero que no puedan proliferar. Los linfocitos NK así tratados también pueden ser estirpes celulares equivalentes que tienen las propiedades tales como la citotoxicidad y los marcadores de superficie celular específicos de los NK descritos en la presente memoria. Las neoplasias malignas del sistema inmunitario, del sistema linfático y del sistema hematopoyético se pueden tratar mediante los métodos de la invención. Además, también se pueden tratar los tumores formes y los tumores sólidos. También se pueden tratar las infecciones por virus patógenos, como el VIH, VEB, CMV y el herpes.

Tratamiento de una muestra biológica. Las muestras biológicas in vitro se pueden tratar experimental o terapéuticamente para eliminar las células malignas, o las células infectadas por virus, de una manera eficaz. Se puede extraer la muestra de un mamífero y mantenerla in vitro en un medio de cultivo adecuado. Los expertos en biología celular, inmunología celular y oncología conocen bien tales medios. Los medios y las técnicas de cultivo celular se presentan, en términos generales, en, por ejemplo, Freshney, R. I., "Culture of Animal Cells, 3ª Ed.", Wiley-Liss, Nueva York (1994) y en Martin, B. M., "Tissue Culture Techniques, An Introduction", Birkhauser. Boston, MA (1994). La muestra biológica se establece en un cultivo in vitro y se pone en contacto con un medio que incluye los linfocitos citolíticos naturales de la presente invención. La actividad citolítica de los linfocitos NK elimina de manera eficaz las células malignas o las células infectadas por virus de la muestra. La prevalencia y la retirada de las células diana se puede trazar mediante cualquiera de los numerosos métodos que los expertos en los campos de la biología celular y la inmunología celular conocen bien. Estos incluyen la microscopia de inmunofluorescencia indirecta para analizar células tumorales intactas o células que portan virus, clasificación de células activadas fluorescentes, análisis de liberación de cromo y similares.

Tratamiento de un cáncer o una infección por virus ex vivo: purga. La memoria descriptiva describe adicionalmente el tratamiento ex vivo de una muestra biológica sospechosa de contener células cancerosas o células infectadas por virus poniendo en contacto la muestra con los linfocitos NK. La muestra biológica se extrae del cuerpo de un mamífero, como un humano, y puede ser sangre, células de la médula ósea o tejidos o células similares de un órgano afectado por un cáncer. Los expertos en los campos de la inmunología celular, la oncología y la cirugía conocen bien los métodos para obtener tales muestras. Estos incluyen recoger muestras de sangre por los medios bien conocidos, u obtener biopsias de la médula ósea u otro tejido u órgano. Las células cancerosas o las células infectadas por virus contenidas en la muestra se eliminan con eficacia gracias a la actividad citotóxica de los linfocitos NK-92. Luego, la muestra se puede devolver al cuerpo del mamífero del que se ha obtenido.

Los linfocitos NK-92 utilizados para tratar la muestra se pueden suspender libremente en el medio. Por lo general, se prefiere que la muestra purgada, antes de devolverse al cuerpo del mamífero del cual se ha obtenido, se limpie de linfocitos NK-92, que pueden continuar creciendo ya que se generaron a partir de un linfoma proliferativo. La memoria descriptiva contempla varias maneras de alcanzar este objetivo. Los linfocitos NK, antes de utilizarlos, se pueden irradiar con rayos \gamma o con luz ultravioleta hasta que mantengan su actividad citolítica pero no pueden crecer. Los linfocitos NK se pueden inmovilizar permanentemente sobre un soporte sólido macroscópico. Luego, el soporte con los linfocitos NK adheridos se puede separar físicamente de las células de la muestra biológica, por ejemplo por centrifugación o filtración con una columna que permite que las células sin adherir de la muestra pasen a través de ésta, o una técnica similar. Soportes sólidos adecuados incluyen partículas de poliacrilamida, agarosa, celulosa, Sepharose™ (Pharmacia, Piscataway, NJ, EE. UU.), celita y similares, y se pueden suministrar con grupos como un aldehído, carbonildiimidazol, bromoacetilo, epiclorhidrina y similares, que se activan para reaccionar con los grupos de la superficie celular. Los grupos activados sobre el soporte reaccionan con grupos tales como los grupos amino o carboxilo, por ejemplo, sobre la superficie celular, por lo que inmovilizan las células sobre el
soporte.

Los linfocitos NK se pueden modificar con un vector que dirige la síntesis de un componente celular sensible a un agente, de tal forma que cuando se administra el agente a la muestra ex vivo, se inactivan los linfocitos NK-92. Ejemplos de tales agentes incluyen aciclovir o ganciclovir, a modo de ejemplo no limitante. También se contemplan vectores funcionalmente equivalentes, que dirigen la síntesis de componentes celulares alternativos sensibles a diferentes agentes.

Los linfocitos NK a utilizar en los métodos de la invención pueden requerir una citocina como la IL-2 para mantener su eficacia funcional como células citolíticas. Se puede añadir simplemente la citocina a la preparación ex vivo. Alternativamente, si se desea, se puede utilizar un linfocito NK-92 modificado que porta un vector que dirige la síntesis constitutiva de la citocina. De este modo, se evita la necesidad de proporcionar la citocina exógena.

Tratamiento de un cáncer o una infección por virus in vivo: administración de NK-92. Un aspecto más de la invención se refiere al uso de un medio que comprende linfocitos NK-92 para preparar un medicamento para el tratamiento de un cáncer in vivo en un mamífero. Las células son las adecuadas para administrarlas de diferentes maneras. A modo de ejemplo no limitante, las células se pueden administrar por vía intravenosa, o en una cavidad del cuerpo adyacente a la localización de un tumor sólido, como la cavidad intraperitoneal, o inyectarlas directamente dentro de un tumor sólido o adyacentes a él. Por ejemplo, la administración intravenosa es ventajosa para el tratamiento de leucemias, linfomas y neoplasias malignas comparables del sistema linfático, así como para el tratamiento de infecciones víricas.

Tal y como se ha descrito en detalle en la sección anterior, es deseable utilizar métodos que eliminen o extirpen los linfocitos NK-92 después de que hayan lisado eficazmente (o de otra manera, destruido) las células diana. Algunos métodos descritos más arriba se pueden utilizar para este propósito, a saber, el uso de linfocitos NK-92 irradiados, y el uso de linfocitos NK-92 que albergan un vector que dirige la síntesis de un componente celular sensible a un agente, de tal forma que cuando se administra el agente, se inactivan los linfocitos NK-92, y métodos equivalentes. Cuando las células producen tal componente sensible al agente específico, la administración del agente al mamífero es eficaz para inactivar los linfocitos NK-92 dentro del mamífero.

Los linfocitos NK-92 se pueden administrar junto con una citocina como la IL-2 para mantener la eficacia funcional de las células como efectores citotóxicos. Tal y como se utiliza para describir la invención, la terminología "junto con" indica que la citocina se puede administrar inmediatamente antes de la administración de los linfocitos NK-92, o que se puede proporcionar simultáneamente con las células, o brevemente después de haber administrado las células. También se puede dar la citocina en dos veces, o en tres veces, en relación con el momento en el que se administraron los linfocitos NK-92. Alternativamente, en el método in vivo de tratamiento de un cáncer, se pueden emplear linfocitos NK-92 que albergan un vector que dirige la síntesis constitutiva de la citocina. Esto elimina eficazmente la necesidad de proporcionar citocina exógena.

Los siguientes ejemplos se incluyen para ilustrar la invención.

Ejemplos Ejemplo 1 Linfocitos NK-92

Se obtuvieron linfocitos NK-92 [Gong et al. (1994)] a partir de las células obtenidas de un paciente que padece linfoma no de Hodgkin. Se cultivaron los LMSP del paciente en el medio MEM alfa enriquecido complementado con suero de ternero fetal (12,5%) y suero de caballo (12,5%) más hidrocortisona 10^{-6} M y 1000 U/ml de IL-2 humana recombinante (rhIL-2). Las células se cultivaron a 37ºC en aire humidificado que contiene CO_{2} al 5%. Se hicieron subcultivos después de 4 semanas, y se propagaron indefinidamente con cambios en el medio dos veces a la semana. En estas últimas etapas, se pudo omitir la hidrocortisona sin que se observara ningún efecto sobre el crecimiento celular. Este cultivo se ha designado NK-92 y se ha depositado en la American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, MD, EE. UU.).

Las células tienen forma de grandes linfocitos granulados. Las células llevan los marcadores de superficie CD56^{bright}, CD2, CD7, CD11a, CD28, CD45, y CD54. En cambio, no muestran los marcadores CD1, CD3, CD4, CD5, CD8, CD10, CD14, CD16, CD19, CD20, CD23 y CD34. El crecimiento de los linfocitos NK-92 en cultivo depende de la presencia de la interleucina 2 (IL-2) recombinante, siendo suficiente una dosis tan baja como 10 UI/ml para mantener la proliferación. La IL-7 y la IL-12 no mantienen el crecimiento a largo plazo, ni lo hacen las otras citocinas probadas, la IL-1\alpha, la IL-6, el factor \alpha de necrosis tumoral, el interferón \alpha y el interferón \gamma.

Ejemplo 2 Actividad citotóxica de NK-92 contra diferentes estirpes celulares leucémicas

Se determinó la actividad citotóxica de NK-92 contra las células K562, Daudi, TF-1, AML-193, y SR-91 [Gong et al. (1994))]. Las estirpes celulares K562 (eritroleucemia) y Daudi (linfoma de Burkitt) se obtuvieron de la ATCC. Se mantuvieron en un cultivo de suspensión continua en un medio RPMI 1640 complementado con suero de ternero fetal al 10% (STF). TF-1 es una estirpe celular mielomonocítica [Kitamura et al., J. Cell Physiol. 140: 323-334 (1989)] que requiere la presencia de un medio que contiene 2 ng/ml del GM-CSF humano. La AML-193 es una estirpe celular mieloide que se mantiene en presencia del medio 5637 acondicionado al 10% [Lange et al., Blood 70: 192-199 (1987)]. Las células TF-1 y AML-193 se obtuvieron del Dr. D. Hogge, Terry Fox Laboratory, Universidad de British Columbia, Vancouver, BC, EE. UU. La SR-91 es una estirpe celular que presenta las células progenitoras iniciales establecidas por Gong et al. (1994) de un paciente con leucemia linfoblástica aguda (LLA) [Klingemann et al., Leuk. Lymphoma, 12: 463-470 (1994)]. Es resistente tanto a la citotoxicidad de los linfocitos NK como a la de los linfocitos NK activados (NK-A). La SR-91 también se mantiene en RPMI 1640/SFT al 10%. Esta estirpe celular se puede hacer sensible a la destrucción por los NK-92 mediante el tratamiento con la citocina. Naki et al, "Induction of sensitivity to the NK-mediated cytotoxicity by TNF-\alpha treatment. Possible role of ICAH-3 and CD44" Leukemia, en prensa.

Se evaluó la actividad citotóxica de NK-92 (efector) contra estas células diana por medio de un análisis de liberación de ^{51}Cr [Gong et al. (1994)] con el procedimiento descrito por Klingemann et al [Cancer Immunol. Immunother. 33: 395-397 (1991)]. Se calculó el porcentaje de citotoxicidad específica en especímenes triplicados como:

% de liberación de ^{51}Cr = \frac{\text{(media de cpm experimentales – media de cpm espontáneas)}}{\text{(media de cpm máximas – media de cpm espontáneas) x 100}}

La figura 1 presenta los resultados de este cálculo. Se observa que los linfocitos NK-92 destruyen las células K562 y Daudi con gran eficacia. Incluso en la baja proporción de E:D de 1:1, el 83% de las células K562 y el 76% de las células Daudi fueron destruidas por los linfocitos NK-92. La susceptibilidad a ser destruida por los linfocitos NK-92 fue menor para los linfocitos TF-1 (23% a E:D = 1:1) y para las células AML-193 (6% a E:D = 1:1). Las células SR-91 son resistentes al efecto citotóxico de los linfocitos NK-92. Sin pretender estar restringido por la teoría, se cree que las células SR-91 carecen de las moléculas de adhesión necesarias para mediar la unión inicial con los linfocitos NK-92.

Ejemplo 3 Citotoxicidad de NK-92 contra las estirpes celulares de leucemia, linfoma y mieloma

Las estirpes celulares K562 [eritroleucemia positiva del cromosoma Ph (Ph+)], HL60 (promielocítica), U937 (mielomonocítica), KG1a (subestirpe variante de la estirpe celular KG1 de LMA), DHL-10 (linfoma de linfocitos B), Daudi (linfoma de Burkitt), Raji (linfoma de linfocitos B), Jurkat (linfoma de linfocitos T), U266 (mieloma de IgE), NCI H929 (mieloma de IgA) y RPMI 8226 (mieloma, secretor de la cadena ligera) se obtuvieron de la ATCC. Las estirpes celulares derivadas de linfoma Ly3 (estirpe de linfocitos B, células grandes difusas), Ly8 (inmunoblástica) y Ly13.2 (estirpe de linfocitos T, células grandes difusas) las proporcionó el Dr. H. Messner, Toronto, Ontano. Sus características están descritas [Chang et al., Leuk. Lymphoma 19: 165 (1995)]. Todas las estirpes se mantuvieron en el medio RPMI 1640 complementado con 2 mM de glutamina, 1 mM de piruvato de sodio, 0,1 mM de aminoácidos no esenciales, 50 U/ml de penicilina, 25 mM de HEPES (Stem Cell Technologies) y STF inactivado al calor al 5% (RPMI/STF al 5%) a 37ºC en una atmósfera humidificada de CO_{2} al 5% en aire.

Se determinó la lisis celular mediante un análisis de liberación de ^{51}Cr de 4 horas utilizando varias proporciones de E:D. Para permitir la comparación, los LMSP de donantes normales se activaron con IL-2 (500 U/ml) durante 4 días y se midió la liberación de ^{51}Cr frente a las mismas células diana a la vez. Se presenta la media de dos experimentos distintos.

Los resultados de la citotoxicidad mediada por NK-92 (análisis de liberación de ^{51}C) para varias estirpes celulares de diana de leucemia, linfoma y mieloma se resumen en la tabla 1. Para compararlo, también se probó la lisis de las mismas células diana tumorales en el mismo experimento con los LMSP obtenidos de donantes normales. Esas células se habían activado con IL-2 (500 U/ml) durante 4 días antes de probarlas. Los resultados muestran que los linfocitos NK-92 lisan muy eficazmente todas las células diana probadas. Se observa una gran citotoxicidad incluso a la baja proporción de E:D de 1:1. La citotoxicidad alcanzada con estas células es significativamente mayor que la observada con los LMSP normales (alógenos) activados en las condiciones óptimas con IL-2 para todas las células diana menos RPMI 8226 y U266.

TABLA 1 Actividad citotóxica de los linfocitos NK-92 contra varias estirpes celulares de leucemia, linfoma y mieloma

Diana			50:1	20:1	10:1	5:1	1:1
	HL-60	NK-92	97	90	77	46	40
		LMSP + IL-2	31	26	17	2	0
	K562	NK-92	68	68	64	59	50
		LMSP + IL-2	63	73	67	51	19
	KGla	NK-92	90	91	80	67	39
		LMSP + IL-2	15	11	12	6	0
	U937	NK-92	99	98	96	91	85
		LMSP + IL-2	57	43	23	13	2

TABLA 1 (continuación)

Diana			50:1	20:1	10:1	5:1	1:1
	DHL-10	NK-92	95	95	92	94	80
		LMSP + IL-2	60	40	24	19	5
	Daudi	NK-92	94	87	71	48	39
		LMSP + IL-2	65	57	29	16	6
	Jurkat	NK-92	100	100	98	93	80
		LMSP + IL-2	67	50	36	27	4
	Ly3	NK-92	63	59	53	42	28
		LMSP + IL-2	47	35	18	6	0
	Ly8	NK-92	95	104	102	88	42
		LMSP + IL-2	67	65	62	59	44
	Ly 13.2	NK-92	104	105	100	97	67
		LMSP + IL-2	61	63	52	4	13
	Raji	NK-92	81	75	74	70	54
		LMSP + IL-2	32	67	57	35	13
	NCI H929	NK-92	94	89	89	86	51
		LMSP + IL-2	75	58	39	24	5
	RPMI 8224	NK-92	82	72	70	72	41
		LMSP + IL-2	95	83	81	67	25
	U266	NK-92	84	77	85	81	53
		LMSP + IL-2	84	74	73	56	21

Ejemplo 4 Efecto de la retirada de la IL-2 sobre la actividad citotóxica de los NK-92

Para probar durante cuánto tiempo los linfocitos NK-92 mantendrían su actividad citolítica sin que la IL-2 estuviera presente en el medio de cultivo, se privaron los linfocitos NK de la IL-2 y se midió la liberación de ^{51}Cr en intervalos de 24 horas. Los resultados, resumidos en la figura 2, sugieren que las células mantienen una completa actividad citotóxica durante, al menos, 48 horas. Después, la actividad cae bruscamente hasta niveles despreciables. Así, para una purga a corto plazo, la IL-2 no tiene que estar presente en los cultivos para alcanzar un efecto adecuado.

Ejemplo 5 Cocultivo de células K562-neo^{r} con LMSP y NK-92

Se ha descrito la transfección de las células R562 con el gen de resistencia a la neomicina (neo^{r}) [Wong et al., Bone Marrow Transplant 18: 63 (1966)]. Brevemente, se suspendieron 5 x 10^{7} células K652 en 0,8 ml de RPMI 1640/STF al 5% y se incubaron en hielo durante 10 minutos con 30 \mug del plásmido pMCI-Neo (proporcionado por el Dr. K. Humphries, Terry Fox Laboratory, Vancouver, BC). Luego, se expusieron las células a un único pulso de voltaje (125 \muF/0,4 kV) a temperatura ambiente, se las dejó en reposo en un tampón durante 10 minutos, se transfirieron a frascos de cultivo de tejido de 25 cm^{2} (Falcon, Lincoln Park, NJ, EE. UU.) y se incubaron a 37ºC en una atmósfera humidificada de CO_{2} al 5% en aire durante 2 días. Las células transfectadas se seleccionaron en el medio de metilcelulosa de Iscove al 0,8% (Stem Cell Technologies) complementado con STF al 30%, 10^{-4} M de 2-mercaptoetanol y 2 mM de glutamina, que contiene 0,8 mg/ml de G418 (neomicina) (Gibco-BRL, Grand Island, NY, EE. UU.). Se identificaron clones neo^{r} de las células K562 después de dos semanas, se picaron y se mantuvieron en RPMI/STF al 10% con 0,8 mg/ml de neomicina. Las células K562-neo^{r} cultivadas durante 2 días mostraron un tiempo de generación de células clonógenas neo^{r} de 36 a 42 horas.

Se enriquecieron los LMSP normales (10^{4}/ml) con células K562-neo^{r} al 10% y se añadieron linfocitos NK-92 para producir diferentes proporciones efector:diana (E:D) de linfocitos NK-92:células K562-neo^{r}. [Wong et al. (1996)]. Brevemente, se suspendieron los LMSP en medio enriquecido alfa (Myelocult™) como se describió más arriba. Se ha demostrado que este medio proporciona las condiciones óptimas para mantener tanto la activación de los LMSP con la IL-2 como la función de célula progenitora hematopoyética [Klingemann et al., Exp. Hematol. 21: 1263 (1993)]. La concentración final de los LMSP en las placas de cultivo de tejidos de 35 mm (Corning, East Brunswick, NJ, EE. UU.) fue de 1 x 10^{6}/ml, y la proporción de la aportación de células K562-neo^{r} se mantuvo en el 10% en todos los experimentos. Se añadieron varias cantidades de linfocitos NK-92 irradiados (1000 cGy) (véanse los ejemplos 7 y 8), lo que dio lugar a varias proporciones de E:D como se especifica en la tabla 2. Estas mezclas se cultivaron en una atmósfera de CO_{2} al 5% en aire durante 4 ó 48 horas a 37ºC con y sin IL-2 (500 U/ml).

Después del cultivo, se lavaron las células en RPMI/STF al 5%, se suspendieron 10^{3} células en metilcelulosa de Iscove al 0,8% que contiene 0,8 mg/ml de neomicina y, se sembraron volúmenes de 1,1 ml en placas de Petri de 3 mm. Después de 7 días a 37ºC en una atmósfera humidificada de CO_{2} al 5% en aire, se contaron las colonias. El número de colonias neo^{r} proporcionó una medida del número de células K562-neo^{r} clonógenas supervivientes presentes en la suspensión celular sembrada originalmente. Se determinaron los valores de supervivencia porcentuales para los cocultivos que contienen varias cantidades de linfocitos NK-92, comparando el número de células K562-neo^{r} clonógenas presentes en los cocultivos de prueba con el número de las presentes en los cocultivos de control (sin linfocitos NK-92 añadidos) y recogiendo después del mismo periodo de incubación. Con un número inicial de 10^{3} células K562-neo^{r} antes de la purga, el número absoluto de células K562-neo^{r} clonógenas después de 4 horas sin la presencia de linfocitos NK-92 fue de 6400 \pm 820 células y, después de 48 horas, de 28.300 \pm 2100 células. Se presenta la media \pm EEM de 4 a 8 experimentos.

Cuando sólo se sembraban los LMSP en el medio de metilcelulosa que contiene neomicina, no se observaban nunca colonias. Para cuantificar la capacidad de purga de los linfocitos NK-92, los LMSP se enriquecieron con células K562-neo^{r} al 10% y se cultivaron durante 4 ó 48 horas en el medio en presencia o ausencia de IL-2. Los resultados, resumidos en la tabla 2, muestran que los linfocitos NK-92 utilizados en proporciones de E:D de 10:1 y 5:1 eliminaban las células K562-neo^{r} de los LMSP, y se observaba esta muy baja supervivencia a la E:D de 1:1. La presencia de IL-2 durante la purga no dio lugar a ningún aumento en el número de células K562 purgadas en comparación con la ausencia de IL-2 (tabla 2).

TABLA 2 Efecto de la purga de los linfocitos NK-92

Proporción de E:D de	% de supervivencia de	% de supervivencia de
NK-92: K562-neo^{r}	K562-neo^{r} (sin IL-2)	K562-neo^{r} (con IL-2)
	4 horas	48 horas	4 horas	48 horas
10:1	0	0	0	0
5.1	0	0	0	0
1.1	10,5 \pm 2,1	15,4 \pm 7,2	6,5 \pm 3	15,2 \pm 5,9
0,1:1	56 \pm 14,1	68,5 \pm 19,5	54,4 \pm 13	69,6 \pm 16,8

Ejemplo 6 Efecto de los linfocitos NK-92 sobre las células progenitoras hematopoyéticas

Se determinó el efecto de los linfocitos NK-92 sobre los LMSP [Cashman et al., Blood 75: 96 (1990)]. Brevemente, se cocultivaron LMSP normales con linfocitos NK-92 irradiados (1000 cGy) (véanse los ejemplos 7 y 8) durante 2 días. Luego, se sembraron las células en alícuotas duplicadas de 1,1 ml de medios que contienen metilcelulosa a unas densidades ajustadas para dar aproximadamente de 10 a 100 colonias grandes de células eritroides (de unidades formadoras rápidas-eritroides [las UFR-E]), granulocitos y macrófagos (de unidades formadoras de colonias-granulocito/macrófago [las UFC-GM]) y combinaciones de todas estas (de UFC granulocito/eritroide/macrófago/megacariocito [UFC-GEMM]). Se contaron las colonias en un microscopio de inversión 2 semanas después.

Se cuantificaron el número y la cinética de crecimiento de las células hematopoyéticas clonógenas a una proporción de 1:1 de NK-92:LMSP después de 2 días de cocultivo con linfocitos NK-92 irradiados (1000 cGy). Se sembraron las células en metilcelulosa estándar y se contaron 2 semanas después. Los resultados obtenidos de tres donantes diferentes se presentan como el porcentaje de controles normales en la tabla 3. No se observó ningún efecto inhibidor de los linfocitos NK-92 sobre los progenitores hematopoyéticos.

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TABLA 3 Efecto de los linfocitos NK-92 sobre la formación de colonias de células progenitoras hematopoyéticas normales

Número del experimento	UFC-GEMM	UFR-E	UFC-C
1	100	46	94
2	200	98	64
3	33	104	103

Ejemplo 7 Irradiación \gamma de los linfocitos NK-92

Se irradiaron los linfocitos NK-92 en frascos T25 (Corning, Newark, NJ, EE. UU.) con la dosis indicada utilizando una fuente de cesio (Cis-US, Bedford, MA, EE. UU.). Se probó un intervalo de dosis de 200 a 2000 cGy. Después de la irradiación, se lavaron las células dos veces en RPMI, se resuspendieron en el medio y se cultivaron durante 72 horas a 37ºC en presencia de 500 UI/ml de IL-2. Se comprobó la citotoxicidad (análisis de liberación del ^{51}Cr) con estas células tal y como se describe más arriba en el ejemplo 2. Antes de realizar el análisis de liberación del ^{51}Cr, se dejaron las células durante 24 horas en un medio complementado con IL-2 para permitir que se recuperen. Se evaluó la proliferación mediante el análisis de incorporación de [^{3}H]-timidina. Antes de añadir la [^{3}H]-timidina (0,5 \muCi/célula), se resuspendieron los linfocitos NK-92 en RPMI sin timidina. Se midió la captación de la [^{3}H]-timidina en un contador de centelleo líquido 4 horas más tarde [Klingemann et al., Leuk. Lymphoma 12: 463 (1994)]. Se presentan la cuentas por minuto (cpm) de tres experimentos diferentes.

El uso clínico de esta estirpe celular para purgar de células cancerosas requiere que los linfocitos NK-92 no experimenten un crecimiento y una proliferación significativas. Esto se logró irradiando las células. La proliferación, que se midió mediante la incorporación de ^{3}H, disminuyó eficazmente a una dosis de 1000 cGy (tabla 4). La citotoxicidad de los linfocitos NK-92 después de la administración de varias dosis de irradiación se presenta en la figura 3. En dosis de hasta 1000 cGy se mantuvo una respuesta citolítica que esencialmente no disminuye.

TABLA 4 Efecto de la irradiación sobre la proliferación de los linfocitos NK-92

Número de	Dosis de irradiación (cGy)
experimento
	0	500	1000	1500	2000
1	5766	3071	406	125	114
2	4236	2411	1216	1192	562
3	3994	2046	824	689	748

Ejemplo 8 Susceptibilidad de los linfocitos NK-92 a la irradiación

Se irradiaron los linfocitos NK-92 mediante una fuente de rayos \gamma (Gammacell 40, Atomic Energy of Canada. Ltd., Canadá). Se analizó un intervalo de dosis de 100 a 3000 cGy. Después de la irradiación, se lavaron las células y se resuspendieron en un medio de cultivo con rhIL-2. Se realizaron análisis de colonias, de viabilidad y de actividad citotóxica de los linfocitos NK-92 irradiados mediante técnicas estándares [Yan et al., Leukemia, 7: 131-139 (1993)]. Para cuantificar los linfocitos NK-92 clonógenos, se cultivaron linfocitos NK-92 (500 linfocitos por ml de medio de cultivo) en un medio a base de agar al 0,3% complementado con STF al 12,5%, suero de caballo al 12,5%, 2 mM de L-glutamina, 100 \mug/ml de penicilina y 50 \mug/ml de estreptomicina, 10^{-5} M de mercaptoetanol y 500 U/ml de rhIL-2 a 37ºC durante 14 días. Se añadió una alícuota adicional de 500 U/ml de rhIL-2 en el día 7 durante el cultivo. Se realizaron cultivos triplicados para cada punto de datos.

La viabilidad de los linfocitos NK-92, determinada mediante tinción con azul de tripano y la recuperación de la capacidad de los linfocitos NK-92 para generar colonias después de la exposición a varias dosis de irradiación se muestran en las figuras 4 y 5, respectivamente. Los linfocitos NK-92 mantuvieron una considerable supervivencia durante 3 ó 4 días después de la exposición a dosis elevadas de irradiación (1000 a 3000 cGy). Sin embargo, los linfocitos NK-92 clonógenos in vitro desaparecieron significativamente después de dosis bajas de irradiación y se eliminaron totalmente mediante dosis por encima de 300 cGy. La figura 6 muestra la citotoxicidad de los linfocitos NK-92 para K562, HL60 y dos muestras leucémicas derivadas de pacientes después de la exposición a diferentes dosis de irradiación. Unas dosis de 300, 500 y 1000 cGy permiten una citólisis significativa para las estirpes celulares leucémicas y para las leucemias primarias 1 a 2 días después de la irradiación.

Estos experimentos sugieren que los linfocitos NK-92, irradiados hasta tal grado que los hace no clonógenos, conservan su actividad citolítica contra un amplio espectro de células diana. Por lo tanto, se pueden utilizar ex vivo para purgar de las células tumorales así como para el tratamiento de varias neoplasias malignas in vivo.

Ejemplo 9 Citólisis de las células leucémicas primarias humanas por los linfocitos NK-92

a. Muestras leucémicas derivadas de pacientes. Se obtuvieron muestras, con consentimiento informado, durante los estudios diagnósticos habituales de la sangre o aspirados de médula ósea (MO) de pacientes con unas leucemias recién diagnosticadas o recidivadas. Se estudiaron 9 casos de leucemia mieloide aguda (LMA), 11 de leucemia mieloide crónica (LMC) (6 de fase crónica, 1 de fase acelerada y 4 de crisis hemoblásticas), 14 de leucemia linfoblástica aguda (LLA) de la estirpe B (13 LLA pre-B y 1 LLA-B) y 6 casos de LLA-T (véase la tabla 5). Se aislaron las células mononucleadas enriquecidas con hemoblastos mediante separación en gradiente de densidad de Ficoll Hypaque (Pharmacia, Piscataway, NJ, EE. UU.) y se lavaron en medio RPMI 1640.

b. Células efectoras. Se cultivaron linfocitos NK-92 y se mantuvieron en un medio \alpha-MEM complementado con STF al 12,5%, suero de caballo al 12,5% e rhIL-2 (500 U/ml, Chiron, Emeryville, CA, EE. UU.). Las células TALL-104 (un clon de linfocitos T citotóxicos humanos sin restringir por el CMH, generosamente proporcionado por los Drs. D. Santoli y A. Cesano, The Wistar Institute, Filadelfia, EE. UU.) se mantuvieron en el medio de Dulbecco modificado de Iscove complementado con STF al 10% y rhIL-2 (100 U/ml) [Cesano et al., Blood. 87: 393-403 (1996)]. Otro clon de linfocitos NK humanos, YT, se mantuvo en medio RPMI 1640 con STF al 10% e rhIL-2 (100 U/ml) [Yodoi et al., J. Immunol., 134: 1623-1630 (1985)].

c. Análisis de citotoxicidad. La actividad citotóxica de los linfocitos NK-92 sin irradiar y de los linfocitos T respondedores contra dianas leucémicas se midió por un análisis de liberación de cromo (ALC) de 4 horas estándar. Algunas de las muestras también se midieron por un ALC de 18 horas. Se analizó un número fijo de células diana marcadas con ^{51}Cr (5 x 10^{3}/pocillo) para determinar su susceptibilidad a 4 concentraciones de células efectoras. La liberación del ^{51}Cr de las células diana solas (liberación espontánea, determinada colocando las células diana en Tritón al 5%) fue siempre < 25% de la liberación máxima de ^{51}Cr. Los datos del ALC se expresaron como lisis específica (%) a una proporción determinada de efector:diana (E:D) o se convirtieron a unidades líticas (UL) definidas como el número de efectores que dan lugar a una lisis del 30% de las células diana [Cesano et al., Cancer Immunol. Immunother., 40: 139-151 (1995)]. El grado de sensibilidad a cada efector por parte de las dianas de las células leucémicas derivadas de pacientes se definió como insensible (lisis de -/+ < 10/10-19%), sensible (++/+++/++++: lisis de 20-29/30-39/40-49%) y muy sensible (+++++/++++++: lisis de 50-59/>60%) a una proporción de E:D de 9:1.

d. Resultados de la citólisis de los linfocitos NK-92 sobre las células leucémicas primarias humanas. La sensibilidad de células leucémicas derivadas de pacientes al efecto citotóxico de los linfocitos NK-92 se resume en la columna 4 de la tabla 5. De las 40 muestras leucémicas derivadas de pacientes mostradas en la tabla 5, 26 (el 65%) fueron sensibles o muy sensibles a la citotoxicidad in vitro mediada por los linfocitos NK-92. Seis de las muestras que fueron insensibles a los linfocitos NK-92 en el ALC de 4 horas estándar (primeras entradas o únicas) se hicieron sensibles después de una incubación de 18 horas (segundas entradas, encerradas entre paréntesis). Los hemoblastos leucémicos obtenidos de 6 de las 9 LMA (el 67%), 6 de las 6 LLA-T (el 100%) y 6 de las 14 LLA-B (el 43%) fueron o bien sensibles o muy sensibles a la lisis mediada por los NK-92. Siete de las 8 muestras de leucemia aguda que mostraron una gran sensibilidad al efecto citotóxico de los linfocitos NK-92 se obtuvieron de pacientes con recidiva y 1 fue de un paciente recién diagnosticado. De las 11 muestras de LMC, 8 (el 73%) fueron sensibles (5 en fase crónica) o muy sensibles (2 en crisis hemoblástica; 1 en fase acelerada) a la citólisis mediada por los NK-92 (tabla 5).

En comparación, las últimas dos columnas en la tabla 5 presentan los resultados obtenidos con estirpes celulares conocidas en el campo por tener una actividad citolítica contra las células tumorales, a saber, células TALL-104 y YT. Sólo 16 de las 37 muestras leucémicas probadas (el 43%) fueron sensibles (4 LMA, 5 LLA-B y 3 LMC) o muy sensibles (1 LMA, 1 LLA-B y 2 LMC) a la citólisis mediada por TALL-104 del clon de linfocitos T citotóxicos sin restricción por el CMH. Las leucemias sensibles a las células TALL-104 no fueron coherentemente sensibles a los linfocitos NK-92, y las células que lisaron los NK-92 no siempre se lisaron con las células TALL-104. Además, la actividad citolítica de las células TALL-104 normalmente se detectó sólo después de 18 horas de incubación (segundas entradas, encerradas entre paréntesis). Sólo cuatro de las 16 (el 25%) muestras diana que se lisaron a las 18 horas se lisaron también en el ALC de 4 horas estándar. Las 12 restantes (el 75%) respondieron sólo después de una incubación de 18 horas, siendo la respuesta generalmente menor que la observada con los linfocitos NK-92 de la invención. Sin desear estar restringido por la teoría, estas observaciones se pueden deber a la posibilidad de que 1) diferentes estructuras de diana sean reconocidas por las células TALL-104 frente a los linfocitos NK-92 o 2) puede estar implicada una vía diferente en la citólisis mediada por los linfocitos NK-92 y en la mediada por las células TALL-104.

Se encontró que la mayoría de muestras leucémicas tratadas con las células YT, el otro clon de tipo NK probado, eran resistentes, con la excepción de 2 muestras (una LMC en crisis hemoblástica y una LLA-T) (véase la tabla 5).

En conclusión, los linfocitos NK-92 de la invención son sorprendente y significativamente más eficaces a la hora de lisar células tumorales obtenidas de pacientes, y ejercen su efecto en menos tiempo que las células de dos estirpes celulares citolíticas conocidas en el campo.

TABLA 5 Citotoxicidad de NK-92, TALL-104 y el clon YT contra células leucémicas derivadas de pacientes^{a}

	Pacientes		Estado de la	Hemoblastos (%)	Sensibilidad citotóxica
			enfermedad	en la muestra
					NK-92	TALL-104	YT
LMA
	1	(M4)	Recidiva	SP (66%)	++++++	+++++	-
	2	(M1)	Recidiva	SP (50%)	+++++	-	-
	3	(M3)	Recidiva	SP (50%)	+++ (++++)	+ (++++)	- (-)
	5	(M2)	Nueva	MO (28%)	+++ (+++)	+ (+++)	NH
	4	(M4)	Resistente	SP (90%)	++ (++)	- (+)	- (-)
	6	(M4)	Nueva	MO (97%)	-	-	-
	7	(M4)	Nueva	SP (39%)	- (-)	- (++)	- (-)
	8	(M3)	Nueva	SP (55%)	- (++)	- (+++)	+ (-)
	9	(M3)	Nueva	MO (32%)	-	-	-
LLA-T
	1		Recidiva	MO (98%)	++++++	-	+
	2		Recidiva	SP (85%)	++++++	- (-)	+++ (+++)
	3		Recidiva	SP (77%)	++++++	- (+)	- (-)
	4		Recidiva	SP (60%)	+++++	- (-)	+ (-)
	5		Nueva	MO (40%)	+++	-	-
	6		Nueva	MO (66%)	+++	-	-
LLA-B
	1	\bullet	Recidiva	MO (78%)	+++++	++++	-
	2		Nueva	MO (30%)	++++	NH	NH
	3		Recidiva	MO (75%)	+++ (++++)	+ (++++)	++ (++)
	4		Nueva	MO (97%)	++ (+++)	+ (+++)	- (-)
	5		Recidiva	MO (60%)	+ (+)	- (+)	- (-)
	6		Recidiva	MO (80%)	-	NH	NH
	7		Recidiva	SP (80%)	-	- (-)	-
	8		Nueva	MO (68%)	-	-	-
	9		Nueva	MO (33%)	-	- (+)	- -
	10		Recidiva	MO (87%)	-	- (++)	-
	11		Recidiva	MO (75%)	- (+++)	- (+++++)	- (-)
	12		Nueva	MO (30%)	-	-	NH
	13		Nueva	SP (90%)	- (+++)	- (+++)	NH
	14		Nueva	MO (81%)	-	-	NH
LMC
	1		CH	SP (45%)	++++++	+++++	+++
	2		FA	SP (22%)	++++++	++	-
	3		CH	SP (93%)	+++++	+	-
	4		FC	SP (15%)D	++++	+	-
	5		FC	SP (8%)D	++ (++++)	NH	NH
	6		FC	MO (12%)D	+ (+++)	+ (+)	NH
	7		FC	MO (10%)D	+ (+++)	- (++++)	NH
	8		CH	SP (60%)	-	-	-
	9		CH	MO (48%)	+	- (-)	-
	10		FC	SP (21%)D	- (++)	- (++++)	- (-)
	11		FC	SP (11%)D	-	- (+++++)	- (-)
\begin{minipage}[t]{158mm} Notas y abreviaturas: ^{a}) Las columnas muestran los resultados de análisis de liberación de cromo a la E:D = 9:1 después de 4 horas sin paréntesis y (los resultados después de 18 horas están encerrados entre paréntesis); Nueva: recién diagnosticada; NH: no hecho; o: clasificación de FAB; D: hemoblasto y promielocito; MO: médula ósea; SP: sangre periférica; 1: LLA-B; CH: crisis hemoblástica; FA: fase acelerada; FC: fase crónica. \end{minipage}

Ejemplo 10 Citotoxicidad de NK-92 frente a las estirpes celulares leucémicas humanas

Las siguientes estirpes celulares leucémicas humanas se cultivaron a 37ºC CO_{2} al 5% en el medio RPMI 1640 complementado con suero de ternero fetal (STF) inactivado por calor al 10%, L-glutamina y antibióticos: K562 (leucemia mieloide crónica en crisis hemoblástica), HL60 (leucemia promielocítica aguda), KGI (eritroleucemia), NALM6 (leucemia linfoblástica aguda pre-B), Raji (linfoma de Burkitt), CEM/S (estirpe celular leucémica linfoblástica T aguda sensible al metotrexato (MTX), un fármaco antitumoral usado habitualmente) así como CEM/T (subestirpe de CEM/S resistente al metotrexato) (Mini, E. et al., Cancer Res. 45: 325-330 (1985)).

Los linfocitos NK-92 fueron muy tóxicos para las 8 estirpes celulares leucémicas probadas en un ALC de 4 horas estándar (tabla 6). La estirpe celular CEM/S de LLA-T sensible al MTX así como su subestirpe CEM/T resistente al transporte del MTX mostraron una sensibilidad similar a los linfocitos NK-92. Esto sugiere que los tumores que no responden al tratamiento con MTX se podrían tratar administrando los linfocitos NK-92 de la presente invención. La tabla 6, sorprendentemente, muestra una gran eficacia citolítica para los NK-92 contra las células diana probadas. Merecen destacarse especialmente los resultados obtenidos con la baja proporción de E:D de 1:1.

Por el contrario, las estirpes celulares citolíticas TALL-104 y YT tienen poca o virtualmente ninguna actividad citolítica contra muchas de estas células diana en estas condiciones; cuando son activas, su actividad es por lo general menor que la de los NK-92 a una E:D de 1:1. Los TALL-104 fueron citotóxicos para las células K562, NALM6 y HL60, pero las células Raji mostraron una lisis de tan solo el 22,2% a una proporción de E:D de 9:1 y las células KG1, CEM/S así como las CEM/T fueron resistentes. El clon YT no mostró actividad citotóxica significativa. Se encontró actividad sólo contra las células K562 y Raji, las cuales mostraron una lisis del 32% y del 25% a una proporción de E:D de 9:1, respectivamente.

Tal y como se muestra en la tabla 6, los linfocitos NK-92 de la presente invención tienen un espectro de acción significativamente más amplio y actividades más elevadas que las estirpes celulares citolíticas conocidas TALL-104 y YT. Estas actividades son mayores que cualquier valor previamente descrito en el campo de la citoterapia de los tumores.

TABLA 6 Lisis específica de los clones NK-92, TALL-104 y YT de linfocitos citolíticos naturales sobre las estirpes celulares de leucemia humana

	Lisis específica (%)
	NK-92	TALL-104	YT
	Proporción efector:diana
	9:1	3:1	1:1	9:1	3:1	1:1	9:1	3:1	1:1
K652	94,1	91,2	82,1	88,5	85,2	72,5	34,2	28,2	18,4
HL60	87,9	75,3	79,6	43,0	16,0	6,9	2,1	1,1	1,5
KG1	64,6	53,8	43,7	2,7	0,5	0	0,1	0	0
NALM6	72,6	56,8	52,4	67,8	55,6	33,3	1,0	0,5	0
Raji	86,0	75,4	70,0	22,2	10,2	0,3	25,1	18,0	14,2
TALL-104	57,3	53,2	44,1	-	-	-	3,2	1,4	0,9
CEM/S	56,6	48,8	34,7	2,7	1,6	0,9	0,9	0,4	0,3
CEM/T	57,5	42,1	39,1	1,5	0,6	0,3	1,2	0,1	0,2

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Ejemplo 11 Efecto de los linfocitos NK-92 sobre las células hematopoyéticas humanas de la médula ósea normal

La médula ósea heparinizada recogida de donantes normales se separó mediante aislamiento por gradiente de densidad de Ficoll Hypaque para producir células mononucleadas. El enriquecimiento de las células hematopoyéticas y la eliminación de los linfocitos T se consiguió mediante la aglutinación con lectina de soja (ALS) de elementos de médula ósea maduros y la retirada de los linfocitos T residuales mediante el restablecimiento con eritrocitos de oveja [Reisner et al., Lancet, 2: 327-31 (1981)].

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Se analizaron las fracciones enriquecidas en células hematopoyéticas de médulas óseas normales de 14 donantes normales mediante ALC estándar para determinar su susceptibilidad a la lisis por los linfocitos NK-92. Todas las muestras de médula ósea fueron insensibles a la citólisis mediada por los linfocitos NK-92 (figura 7).

Ejemplo 12 Leucemogenia in vivo de linfocitos NK-92 en ratones IDCG

a. Animales experimentales. Ratones inmunodeficientes combinados graves (IDCG) (CB17 idcg/idcg y pfp/Rag-2) (de 6 a 8 semanas; Taconic Farms, Germantown, NY, EE. UU.) se mantuvieron en cajas microaislantes en condiciones estériles con un entorno específicamente desprovisto de patógenos. Para determinar el potencial que los linfocitos NK-92 tienen de inducir la leucemia in vivo, se administraron 2 x 10^{7} linfocitos NK-92 viables en 0,3 ml de una disolución salina tamponada con fosfato (PBS) bien por vía intraperitoneal (i. p.) o intravenosa (i. v.) en días alternos con 5 inyecciones para cada animal. Para las inoculaciones subcutáneas (s. c.), se inyectaron 2 x 10^{7} linfocitos NK-92 en el costado derecho del ratón IDCG, como se describió anteriormente [Yan et al., Blood, 88: 3137-3146(1996)]. De ahí en adelante, a todos los animales experimentales rhIL-2 se les administró 5 x 10^{4} U en días alternos durante 2 semanas me-
diante inyección s. c. Se siguió la supervivencia de los animales durante, al menos, 6 meses después de la inoculación.

b. Análisis de los tejidos. Para cada grupo, se sacrificaron 2 ratones IDCG al final de la observación y se recogieron tejidos de la sangre periférica, la médula ósea, el bazo, el hígado, el riñón, el pulmón y el cerebro para el análisis histopatológico y/o por clasificación de células activadas fluorescentes (FACS, por sus siglas en inglés). Las secciones de tejidos de los ratones IDCG sacrificados se fijaron en formol tamponado neutro al 10%, se deshidrataron y se incluyeron en parafina, se seccionaron y se tiñeron de acuerdo con la técnicas histológicas estándares. Las células viables recuperadas de varios tejidos se tiñeron mediante acM conjugados a isotiocianato de fluoresceína (FITC) o conjugados a ficoeritrina (PE), como está descrito [Yan et al., (1996)]. Para el análisis se utilizó un citómetro de flujo para la detección de las FACS (Becton Dickinson). Se utilizaron anticuerpos monoclonales (acM) dirigidos contra los respectivos antígenos de superficie celular humanos para determinar su presencia: CD2, CD3, CD5, CD7, HLA-DR, CD45, CD56 (Becton Dickinson)). Se utilizó un acM de rata contra ratón conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC), el mCD45 (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN, EE. UU.), para caracterizar el antígeno común de los leucocitos murinos.

c. Leucemogenia. Se inocularon ratones CB-17 idcg/idcg así como ratones pfp/Rag-2 con linfocitos NK-92 con una inyección por vía i. v. (n = 3, para cada grupo), s. c. (n = 2, cada grupo) e i. p. (CB-17: n = 8; pfp/Rag-2 n = 3). Se siguió la supervivencia de los animales al menos 6 meses después de la inoculación. Al final del periodo de seis meses, todos los animales seguían sanos; no hubo hepatoesplenomegalia, linfadenopatía o crecimiento nodular leucémico, que habría indicado leucemia. No se detectó infiltración celular leucémica en los diferentes tejidos de los animales sacrificados mediante histopatología. No se detectaron células de origen humano en los tejidos mediante análisis por FACS.

Ejemplo 13 Comparación del efecto antileucémico de los linfocitos NK-92 con LCAC, linfocitos NK y linfocitos T contra estirpes celulares leucémicas humanas

Para aislar las poblaciones de linfocitos NK, se utilizó un sistema de separación de células Ceprate^{R} basado en la inmunoafinidad avidina-biotina (CellPro, Bothel, WA, EE. UU.) para purificar una fracción de células CD56^{+} a partir de los LCAC cultivados. Brevemente, las células recogidas se lavaron y se resuspendieron en PBS con seroalbúmina bovina (SAB) al 1%. Por cada 1 a 2 x 10^{8} células/ml se añadieron 40 \mul de anticuerpo monoclonal primario (de ratón anti-CD56 humano) y se incubaron las células a 4ºC durante 25 minutos. Después de la incubación, se lavaron las células y se resuspendieron a una concentración de 1 x 10^{8} células/ml en PBS con SAB al 1%. Luego, por cada mililitro de suspensión celular, se añadieron 20 \mul de anticuerpo IgG1 de rata contra ratón marcado con biotina, y se incubaron las células de nuevo a 4ºC durante 25 minutos. Después de la incubación, se lavaron las células y se resuspendieron a una concentración de 1 x 10^{8} células por mililitro en PBS con SAB al 5% y, lentamente, se pasó por la columna de avidina. Se capturaron las células CD56^{+}; se eliminaron de la columna otras células, incluida la fracción de linfocitos T. Luego, después de lavar la columna, se disociaron las células adheridas a la columna por agitación y eliminación. Después de la separación, las poblaciones enriquecidas en linfocitos NK contenían > 85% de linfocitos NK CD56^{+} CD3^{-}. La mayoría de las células restantes en la fracción (> 95%) eran linfocitos T CD3^{+} CD56^{-}.

Para generar linfocitos T alocitotóxicos reactivos a la leucemia (los LTC), los linfocitos mononucleados de la sangre periférica (LMSP) aislados de donantes normales se cultivaron con células diana estimulantes leucémicas irradiadas y con LMSP autólogos irradiados como células alimentadoras. Los cultivos se comenzaron en placas de 60 pocillos a 1000 células respondedoras por pocillo en medio RPMI 1640 que contiene suero humano al 15% y 100 U/ml de rhIL-2 a 37ºC y CO_{2} al 5%. Las proporciones de las células estimulantes y de las células alimentadoras por las células respondedoras fueron 5:1 y 10:1, respectivamente. Después de un cultivo de 10 a 12 días, se recogieron los LTC de los pocillos en los que había crecimiento, y se cuantificó la lisis específica de las células diana leucémicas y las células K562 mediante el análisis de liberación de ^{51}Cr. Los LTC se cultivaron continuamente y se alimentaron en frascos con células estimulantes y células alimentadoras. Después de cultivarlas de 2 a 3 semanas, se añadió el anticuerpo monoclonal
OKT3 (Ortho Biotech, Raritan. N. J., EE. UU.) al cultivo para la expansión rápida de las estirpes celulares de los LTC.

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Se evaluaron los efectos antileucémicos de los linfocitos NK-92, los linfocitos humanos LCAC, los linfocitos NK (CD56^{+} CD3^{-}, CD56^{+} en la figura 8) y los linfocitos T (CD3^{+} CD56^{-}; CD3^{+} en la figura 8) midiendo la actividad citolítica in vitro en un ALC estándar (figura 8, paneles A y B) y midiendo la inhibición del crecimiento in vivo de los xenoinjertos de células leucémicas (figura 8, paneles C y D) cuando las células efectoras y las dianas se coinocularon por vía subcutánea en ratones IDCG. Para evaluar la inhibición del crecimiento in vivo, se determinó el área de los crecimientos subcutáneos de los nódulos leucémicos como una medida de su tamaño una vez a la semana después de la inoculación, y también se realizó un seguimiento de la supervivencia de los animales. Los linfocitos NK-92 mostraron la mayor citotoxicidad in vitro contra K562 (figura 8, panel A) y HL60 (figura 8, panel B) de las células probadas, con una lisis específica media del 89% y el 78%, respectivamente. Esta fue superior a la destrucción mediada por los linfocitos humanos LCAC (52% y 11%, respectivamente), los NK (72% y 28%, respectivamente) y los T (12% y 12%, respectivamente).

Como corresponde, los linfocitos NK-92 mostraron una inhibición más eficaz in vivo del crecimiento de los xenoinjertos de las células leucémicas K562 (figura 8, panel C) y HL60 (figura 8, panel D) que los linfocitos NK y los LCAC humanos. Los resultados que se muestran en la figura 8 indican que los linfocitos NK-92 de la presente invención tienen actividad citolítica in vitro y una actividad inhibidora del tumor in vivo que es superior a las actividades manifestadas por las preparaciones conocidas de las células citolíticas que aparecen normalmente en los humanos. Por lo tanto, estas actividades son inesperadas para un experto en el campo de la citoterapia tumoral.

Ejemplo 14 Comparación del efecto antileucémico de los linfocitos NK-92 con linfocitos LTC alógenos reactivos contra los leucémicos

Para examinar los efectos in vivo de los linfocitos NK-92 y otras células efectoras sobre el crecimiento de los xenoinjertos de la leucemia humana, 5 x 10^{6} células diana leucémicas solas o mezcladas con 2 x 10^{7} de linfocitos NK-92 u otras células efectoras (proporción de E:D = 4:1) se inyectaron por vía s. c. en los ratones IDCG. Las células efectoras TALL-104 se irradiaron con 3000 cGy antes de la inoculación para evitar la leucemogenia en los ratones IDCG. La rhIL-2 se administró al ratón como en el ejemplo 13. Se utilizaron la prueba del orden logarítmico y la prueba de Wilcoxon para comprobar la supervivencia de los ratones IDCG portadores de leucemia.

Se evaluó el efecto contra la leucemia de los linfocitos NK-92 utilizando linfocitos LTC alógenos reactivos contra la leucemia [obtenidos de un paciente con LLA-T (TA27)]. Los linfocitos NK-92 y los LTC activados por exposición a TA27 mostraron una citólisis específica significativamente mayor (70% y 58% a una proporción de E:D de 9:1, respectivamente) que los otros efectores [LCAC: lisis específica del 22%; linfocitos NK (reflejados como CD56^{+} en la figura 9): lisis específica del 38%, TALL-104: lisis específica del 8%; y linfocitos T (CD3^{+} en la figura 9): lisis específica del 1,5%] contra las células leucémicas TA27 (figura 9, panel A). Como se corresponde, el crecimiento subcutáneo de las células leucémicas TA27 se inhibió con la coinyección bien de linfocitos NK-92 o bien de LTC contra TA27 (figura 9, panel B). La supervivencia de estos animales que se inocularon con células leucémicas TA27 más linfocitos NK-92 o con LTC contra TA27 se prolongó significativamente más allá que la de los animales que llevan leucemia TA27 sola (linfocitos NK-92: p = 0,001; LTC contra TA27: p = 0,002; véase la figura 10). En cambio, las células TALL-104 no mostraron una destrucción significativa in vitro de las células leucémicas TA27 mediante el ALC (figura 9, panel A). Sin embargo, se observó una inhibición moderada del crecimiento tumoral leucémico in vivo (figura 9, panel B), junto con un aumento estadísticamente insignificante (p > 0,05) de la supervivencia en los animales coinoculados con las células leucémicas TA27 y las células TALL-104 irradiadas (figura 10).

Ejemplo 15 Efecto antileucémico de los linfocitos NK-92 en el modelo de ratones IDCG con xenoinjerto de leucemia humana

Para el estudio de la capacidad tumoricida in vivo de los linfocitos NK-92, células leucémicas obtenidas de un paciente con LLA-T (TA27), de un paciente con LMA (MA26) y de un paciente con LLA pre-B (BA31) se hicieron crecer por adopción y se expandieron en ratones IDCG mediante inoculación por vía s. c. En estos experimentos, se utilizaron células leucémicas recuperadas de los nódulos leucémicos en el ratón (primer pase). Los ratones IDCG en cada grupo se inocularon por vía i. p. con 5 x 10^{6} de células leucémicas del primer pase en 0,2 ml de PBS, y 24 horas más tarde se administraron 2 x 10^{7} linfocitos NK-92 en 0,4 ml de PBS administrados mediante inyección i. p. Los animales recibieron 1 dosis o una serie de 5 dosis de linfocitos NK-92 que se administraron en los días 1, 3, 5, 7 y 9 con y sin rhIL-2 como se indicó en las figuras.

Todas las leucemias humanas crecieron agresivamente en los ratones IDCG. Las células leucémicas derivadas de un paciente con LLA-T (TA27) y de un paciente con leucemia LMA (MA26) fueron muy sensibles in vitro a los linfocitos NK-92 (destrucción específica del 73% y el 66% a una proporción de E:D de 9:1 determinada mediante ALC, respectivamente), mientras que las células de un paciente con LLA pre-B (BA31) fueron insensibles a los linfocitos NK-92 (destrucción específica del 4% a una proporción de E:D de 9:1 evaluada mediante ALC). La figura 11 muestra que la supervivencia de los ratones que llevan la leucemia TA27 se prolongó significativamente con la administración de los linfocitos NK-92. El tiempo de supervivencia media (TSM) de los animales sin ningún tratamiento o con rhIL-2 sola fue de 72 días (n = 5) y de 63 días (n = 5) (p > 0,05), respectivamente. Todos estos animales murieron de leucemia. El tratamiento con los linfocitos NK-92 (solos o con rhIL-2) aumentó el TSM a 102 días (n = 6) y 114 días (n = 6), respectivamente, para la posología de inyección de 1 dosis (2 x 10^{7} linfocitos NK-92, día 1). El TSM aumentó a 160 días (n = 6) y 129 días (n = 6), respectivamente, con 5 dosis de linfocitos NK-92 con o sin una inyección de rhIL-2 (figura 11). Los tres animales que recibieron 5 dosis de inyecciones de linfocitos NK-92 con o sin administración de la rhIL-2 sobrevivieron sin ningún signo de desarrollo de leucemia 6 meses después de la inoculación. No hubo una diferencia significativa de supervivencia entre los ratones que recibieron tratamientos con o sin administración de rhIL-2, tanto en el grupo que recibió 1 dosis de linfocitos NK-92 (p = 0,75) como en el grupo que recibió 5 dosis (p = 0,45). En comparación con el grupo que recibió 1 dosis de linfocitos NK-92, con o sin tratamiento con rhIL-2, la supervivencia se extendió significativamente en los animales que recibieron 5 dosis de linfocitos NK-92 sin tratamiento con rhIL-2 (p = 0,009 y p = 0,009, respectivamente).

En los ratones IDCG inoculados con leucemia LLA pre-B humana (BA31), con o sin tratamiento con rhIL-2, el TSM fue de 63 días (n = 5) y 64 días (n = 5), respectivamente (véase la figura 12). En los animales que recibieron 5 dosis de 2 x 10^{7} linfocitos NK-92, con o sin administración de rhIL-2, el TSM se aumentó hasta 79 días (n = 5) y 76 días (n = 5), respectivamente. Estos tiempos de supervivencia no difieren significativamente de los animales que no se trataron con linfocitos NK-92 (p > 0,05).

En los animales que portan LMA humana (MA26), el TSM fue de 97 días (n = 6) (véase la figura 13). El TSM se extendió a 173 días entre los animales que recibieron 5 dosis de 2 x 10^{7} linfocitos NK-92 (p < 0,01) (n = 6). Tres de los 6 animales que recibieron linfocitos NK-92 seguían vivos 6 meses después de la inoculación de la leucemia. Dos de ellos estaban sanos sin ningún signo de desarrollo de la leucemia. Un ratón tuvo un ensanchamiento del abdomen, lo que indicó la presencia de una leucemia residual. Los 6 animales que recibieron los linfocitos NK-92 más el tratamiento con rhIL-2 seguían vivos 6 meses después de la inoculación de la leucemia sin ningún signo que sugiriera un desarrollo de la leucemia.

Los resultados presentados en las figuras 11 a 13 muestran que el tratamiento in vivo de los tumores leucémicos puede dar lugar a un aumento de la longevidad del ratón estudiado. El grado de prolongación de la vida y la mejora de la salud de los animales es dependiente del tumor leucémico implicado en particular, y varía desde modesto o insignificante (figura 12) a muy espectacular (figura 13). Sobre la base de estos resultados, se concluye que el tratamiento de los tumores in vivo al administrar los linfocitos NK-92, dependiendo del tumor en cuestión, puede ser sorprendentemente eficaz.

Ejemplo 16 Preparación de estirpes de linfocitos NK-92 modificados que secretan IL-2

Con el fin de generar linfocitos NK-92 que secretan constitutivamente IL-2, se emplearon dos plásmidos que codifican la IL-2 humana.

a. Métodos. Clones de ADN: el vector MG-hIL-2 (figura 7) lo proporcionó desinteresadamente el Dr. Craig Jordan (en el pasado en Somatix Corp., Alameda, CA, EE. UU.). El vector pCEP4-LTR.hIL-2 (figura 8) se creó al escindir el fragmento HindIII-BamHI del vector MFG-hIL-2, que contiene la LTR en 5' y el gen de la hIL-2, e insertándolo en los sitios complementarios del esqueleto del vector episómico pCEP4 (In Vitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.).

Transferencia del gen mediante partículas: los linfocitos NK se transdujeron por la transferencia génica mediante partículas con el sistema de expulsión de partículas Biolistic PDS-1000/He (BioRad Laboratories, Hercules, CA, EE. UU.). Las células se transdujeron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, se recubrieron partículas de oro de 1,0 o 1,6 \mum con 5 \mug de ADN con el uso de cloruro de calcio, espermidina y etanol. Los linfocitos NK-92 se prepararon para el bombardeo adhiriéndolos a placas de cultivo de tejidos de 35 mm recubiertas con poli-L-lisina (Sigma. St. Louis, MO, EE. UU.). Las células se bombardearon en una cámara vacía (con un vacío de 508 mm de mercurio) y las partículas recubiertas de ADN se aceleraron con un pulso de helio de 1100 psi. Las células se devolvieron al medio Myelocult complementado con IL-2 inmediatamente después del bombardeo y se dejó que se recuperaran durante 24 horas antes de transferirlas a un medio sin IL-2. El medio se cambió periódicamente. Las células que se seleccionaron crecían con independencia de la presencia de IL-2. Los experimentos preliminares mostraron que se obtenía la eficiencia del 5 al 15% en las transferencias por calor en las condiciones
usadas.

PCR y análisis por transferencia Southern: la transfección de los linfocitos NK-92 se confirmó mediante el análisis con la reacción en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en inglés) del ADN aislado tanto de las estirpes de linfocitos NK-92 originales como de los transfectados buscando la presencia de formas genómicas y de ADNc del gen de la IL-2 humana. El ADN se aisló con DNAzol (Gibco Life Technologies Inc., Burlington, ON, EE. UU.). Brevemente, las células se lisaron en DNAzol y el ADN se precipitó con etanol a temperatura ambiente. Los precipitados de ADN se recogieron, se lavaron en etanol al 95% y se secaron brevemente al aire. El ADN se resuspendió en NaOH a 8 mM a 62ºC y la solución se neutralizó con tampón HEPES. El ADN se cuantificó por absorbencia a 260 nm. Los cebadores que flanquean el exón 1 del gen de la IL-2 humana (directo: 5'-CAA CTC CTG TCT TGC ATT GC-3' e inverso: 5'-GCA TCC TGG TGA GTT TGG G-3', Gibco Lift Technologies Inc., Burlington, ON, EE. UU.) se usaron para amplificar el ADN (30 ciclos, 1 min 95ºC, 2 min 50ºC y 2 min 72ºC). Los productos de la PCR se resolvieron en un gel de agarosa al 2%. Para el análisis por transferencia Southern, el ADN se transfirió a una membrana de nilón Hybond + (Amersham Life Sciences, Arlington Heights, IL, EE. UU.) mediante transferencia por capilaridad en SSC 10X (NaCl a 1,5 M, citrato de sodio a 1,5 M) y se fijó mediante interconexión con UV (StrataLinker Stratagene, La Jolla, CA, EE. UU.). La transferencia se hibridó con una sonda de IL-2 humana radiomarcada con ^{32}P durante 8 a 12 horas, se lavó y se visualizó por autorradiografía a -70ºC con la película X-Omat XAR de Kodak.

Análisis por transferencia Northern: la expresión de los genes de la citocina y la quimiocina se analizó mediante el análisis por transferencia Northern. El ARN se extrajo de las estirpes de linfocitos NK-92 original y transfectada con el uso del reactivo Trizol (Gibco Life Technologies Inc., Burlington, ON, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, las células se lisaron en Trizol y el lisado se extrajo con cloroformo. La fase acuosa se precipitó después con isopropanol. El precipitado de ARN se recogió, se secó brevemente al aire y se resuspendió en agua tratada con DEPC (dietil-pirocarbonato, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EE. UU.). El ARN se cuantificó midiendo su A_{260nm}. Se resolvieron 15 \mug de ARN en un gel de agarosa al 1% de formaldehído en MOPS al 1% (ácido 3-[N-morfolino]propanosulfónico, Sigma, St. Louis, MO, EE. UU.) y se transfirió tal y como se describe anteriormente para el análisis por transferencia Southern. La membrana transferida se hibridó con sondas radiomarcadas con ^{32}P de IL-2 y TNF-\alpha humanos. Las sondas de ADN para los análisis por transferencia Southern y Northern se radiomarcaron mediante la extensión con cebadores al azar. Las sondas de ADN de IL-2 y TNF-\alpha humanos se purificaron por digestión con las endonucleasas de restricción adecuadas y la electroforesis en agarosa. El ADN se escindió del gel y se purificó por centrifugación a través de un filtro en un tubo Spin-X (CorningCostar, Cambridge, MA, EE. UU.), extracción con fenol:cloroformo y precipitación con etanol. La sonda de ADN se marcó con \alpha-[^{32}P]-dCTP (act. esp. 3000 Ci/mmol; ICN, Montreal, PQ).

Determinación de la citocina: la producción de IL-2 por parte de las estirpes de linfocitos NK-92 se determinó por ELISA. Se cultivaron alícuotas de 1 x 10^{6} linfocitos NK-92 originales o transfectados en 8 ml de medio Myelocult sin IL-2 durante 1, 2, y 3 días. Los sobrenadantes se recogieron a -20ºC hasta que todas las muestras se recogieron. Las muestras se descongelaron y se analizó la cantidad de IL-2 por ELISA de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Quantikine; R&D Systems, Minneapolis, MN, EE. UU.). El ELISA es un ensayo colorimétrico basado en peroxidasa de rábano/tetrametilbenzidina y las placas de microvaloración para el ELISA se leyeron a 450 nm (con una corrección a 540 nm) en un lector de placas de microvaloración (modelo EK309, Bio-Tek Instruments Inc., Winooski, VT, EE. UU.).

Irradiación de los linfocitos NK-92. Para determinar la sensibilidad a la irradiación de los linfocitos NK-92 originales y transfectados, se irradiaron los linfocitos utilizando una fuente de cesio 437c de Cis BioInternational 437c (Cis-US, Bedford, MA, EE. UU.). Se recogieron los linfocitos, se lavaron y se resuspendieron en medio y se irradiaron en tubos cónicos de centrifugación de 15 ó 50 ml (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, EE. UU.). Después de la irradiación, los linfocitos se lavaron y se resuspendieron en Myelocult con (para los linfocitos NK-92 originales) o sin (para los linfocitos transfectados) IL-2. Se cultivaron los linfocitos durante 24, 48 y 72 horas y se les analizó la viabilidad mediante exclusión con azul de tripano, la proliferación mediante la incorporación de [^{3}H]-timidina y la citotoxicidad mediante análisis de liberación de ^{51}Cr (como se describió anteriormente).

b. Plásmido MFG-hIL-2. Para los linfocitos NK transfectados con el vector MFG-hIL-2, del 85 al 95% de las células murieron después de 4 a 7 días después de la transferencia a medios sin complementar. Sin embargo, una pequeña cantidad de linfocitos siguió siendo viable. Se asumió que eran células que se habían transfectado con éxito. Sin embargo, incluso con estas células, no se detectaron células viables después de dos a tres semanas. Se esperaba esto, ya que la construcción del vector MFG-hIL-2 no contenía los elementos genéticos requeridos para la replicación y el mantenimiento en las células eucarióticas como un origen de replicación de mamíferos. Por lo tanto, como las células transfectadas se mantuvieron en cultivo y comenzaron a replicarse, la construcción del vector se habría perdido de las células y las células habrían revertido a su fenotipo dependiente de la IL-2. No obstante, estos cultivos se propagaron durante varias semanas. Sorprendentemente, un pequeño número de células viables apareció en los cultivos después de aproximadamente 4 a 5 semanas tras la transferencia inicial de las células a los medios sin IL-2. Estos linfocitos pudieron crecer independientemente de la IL-2 al subcultivarlos en medios nuevos y aparecieron como transfectados establemente, manteniendo su fenotipo independiente de la IL-2 durante el cultivo prolongado. Dado que el vector no pudo replicarse, la aparición de las células transfectadas establemente sugiere que el vector se había integrado en el genoma de una célula transfectada. Como esto sería un fenómeno muy raro, estas células transfectadas probablemente surgieron de una célula o de una cantidad muy pequeña de células. Los linfocitos NK-92 independientes de la IL-2 que surgieron de la transfección con el MFG-hIL-2 se designaron como NK-92MI.

c. Plásmido pCEP4-LTR.hIL-2. Las observaciones iniciales de las células transfectadas con el vector episómico pCEP4-LTR.hIL-2 fueron idénticas a las observadas con los NK-92MI. La mayoría de las células transfectadas murieron durante 4 a 7 días después de la transferencia al medio Myelocult sin IL-2. Sin embargo, a diferencia de los linfocitos NK-92MI, el resto de las células no perdió su fenotipo independiente de la IL-2 o la viabilidad y murieron después del periodo inicial de 2 a 3 semanas. En cambio, las células que eran inicialmente independientes de la IL-2 fueron capaces inmediatamente de crecer y sobrevivir a largo plazo independientemente de la IL-2. Esto era esperable, ya que el vector pCEP-LTR.hIL-2 contiene elementos que le permiten mantenerse en las células eucarióticas como un elemento genético que se replica de manera autónoma. Por lo tanto, cualquier célula que se había transfectado inicialmente debe mantener su fenotipo independiente de la IL-2 durante un tiempo indefinido. Aunque las células que albergan vectores episómicos no se transfieren establemente por estricta definición, estas células están bajo una presión selectiva constante en el medio sin IL-2 en favor de las células que mantienen el vector. Por lo tanto, estas células son aptas para el cultivo a largo plazo. Los linfocitos NK-92 independientes de la IL-2 que surgieron de la transfección con el pCEP4-LTR.hIL-2 se designaron como NK-92CI.

Para confirmar que los linfocitos NK-92MI y NK-92CI realmente se habían transfectado con el gen hIL-2, se realizó un análisis por PCR en las estirpes celulares originales y transfectadas. Se emplearon los cebadores que flanquean el exón I del gen hIL-2, que tiene 88 pares de bases (pb), para amplificar el ADN aislado de los linfocitos NK-92, NK-92MI y NK-92CI para analizar la presencia de las formas de ADN genómico y ADNc. La electroforesis en gel de agarosa de los productos de la PCR de la estirpe celular original reveló un único fragmento de 263 pb que corresponde al tamaño esperado para el fragmento de ADN amplificado a partir del gen genómico de la IL-2 (figura 16, panel A). Sin embargo, el análisis de los productos de los linfocitos NK-92 MI y NK-92CI mostró dos bandas, correspondiendo el fragmento de 263 pb al gen genómico de la hIL-2 así como un fragmento de 175 pb que es resultado de la amplificación del ADNc de la hIL-2. Para confirmar la identidad de estos fragmentos de ADN, se realizó un análisis por transferencia Southern con una sonda radiomarcada específica del gen de la hIL-2. Tal y como se observa en la figura 16, panel B, tanto el fragmento genómico de 263 pb como el fragmento de ADNc de 175 pb se hibridaron con la sonda. Estos datos indican que tanto los linfocitos NK-92MI como los NK-92CI se han transferido exitosamente y contienen el ADNc de la hIL-2.

d. Análisis de la expresión génica. Para analizar la expresión de las citocinas específicas en las estirpes celulares originales y transfectadas, se analizaron mediante análisis por transferencia Northern. Se separó por electroforesis el ARN aislado de los linfocitos NK-92, NK-92MI y NK-92CI, se transfirió a una membrana de nilón y se hibridó con sondas para las citocinas hIL-2 y hTNF-\alpha (véase la figura 17). El análisis por transferencia Northern de la IL-2 en estas células reveló que el ARN de la IL-2 no era detectable en la estirpe celular original (figura 17, panel A, calle 1). Sin embargo, se encontró la hIL-2 en el ARN de los linfocitos NK-92MI y NK-92CI (calles 2 y 3, respectivamente). Se observaron dos transcritos de ARNm en los linfocitos NK-92MI, un tipo principal de ARN de aproximadamente 1,9 kDa y un transcrito menos intenso de 2,4 kDa. Se detectó un transcrito de ARNm de la hIL-2 de aproximadamente 1,4 kDa en los linfocitos NK-92CI. También, se observó una banda muy tenue de 2,5 kDa. Estos datos confirman que las células transfectadas expresaban la IL-2 mientras que los linfocitos NK-92 originales no. No está clara la importancia de los diferentes transcritos de ARNm de la hIL-2 en los dos transfectantes, aunque posiblemente sea una consecuencia de las diferentes construcciones de los vectores. Además, en el caso de NK-92MI, la integración del gen hIL-2 en el ADN genómico podría haber afectado también el tamaño del ARN. También se examinó la expresión del TNF-\alpha en los linfocitos NK utilizando esta técnica (figura 17, panel B). Se ha visto que las tres estirpes celulares expresaban el gen de esta citocina. Se hibridó una sonda del TNF-\alpha a una banda de 1,6 kDa en el ARN aislado de los linfocitos NK-92, NK-92MI y NK-92CI (figura 17, panel B). Estos resultados indican que, aunque la transfección de los linfocitos NK-92 con el gen IL-2 dio lugar a la expresión de la IL-2 en los transfectantes, no influyó en la expresión de otra citocina.

e. Secreción de la hIL-2. Después de confirmar la expresión del gen IL-2 mediante análisis por transferencia Northern, se analizó la producción y la secreción de la hIL-2 desde las células mediante ELISA. Las alícuotas de 10^{6} linfocitos NK-92, NK-92MI y NK-92CI se sembraron en alícuotas de 8 ml y se cultivaron en Myelocult en ausencia de IL-2. Se recogieron los sobrenadantes después de 24, 48 y 72 horas para analizar la IL-2 mediante ELISA. Se detectaron niveles basales de la IL-2 en el sobrenadante de los linfocitos NK-92 en tres momentos en el tiempo (2 a 3 pg/ml). Se detectaron grandes cantidades de la IL-2 en los sobrenadantes de los linfocitos NK-92 MI y NK-92CI (tabla 7). Los linfocitos NK-92MI produjeron mucha más cantidad de IL-2 en comparación con NK-92CI, pues los niveles oscilan de 60x más elevados después de 24 horas (9,3 pg/ml frente a 549,3 pg/ml) fasta aproximadamente 80x más elevados después de 48 horas (15,7 pg/ml frente a 1260,3 pg/ml) y 72 horas (27,2 pg/l frente a 2248,3 pg/ml).

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TABLA 7 Síntesis de la IL-2 por parte de NK-92, NK-92MI y NK-92CI

		IL-2, pg/ml, en el experimento
		n.º 1	n.º 2	n.º 3	MED \pm DE
NK-92	Día 1	0	7	1	2,7 \pm 3,8
	Día 2	0	4	1	1,7 \pm 2,1
	Día 3	0	3	3	2,0 \pm 1,7
NK-92MI	Día 1	517	586	545	549,3 \pm 34,7
	Día 2	977	1462	1342	1260,3 \pm 252,6
	Día 3	1872	2610	2263	2248,3 \pm 369,2
NK-92CI	Día 1	7	13	8	9,3 \pm 3,2
	Día 2	14	16	17	15,7 \pm 1,5
	Día 3	52	18	13	27,7 \pm 21,2

f. Comparación de los antígenos de la superficie celular de los linfocitos NK-92, NK-92MI y NK-92CI. Para comparar los transfectantes independientes de la IL-2 con las estirpes originales, se analizaron los linfocitos NK-92MI y NK-92CI en busca de la expresión de CD2, CD3, CD4, CD8, CD10, CD16, CD28, CD56, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3 y LFA-1 mediante análisis de clasificación de células activadas fluorescentes (FACS). Las células transfectadas mostraron un patrón de expresión idéntico al observado en la estirpe celular original sin transfectar, con la excepción del receptor de la IL-2. El análisis por FACS del CD25 (la cadena \alpha del receptor de la IL-2) sobre los linfocitos NK-92 indicó que el receptor se expresaba en la superficie de los linfocitos NK-92 y que su expresión se reducía en respuesta a la IL-2. Esto confirmó unos resultados similares obtenidos en un trabajo anterior (Gong et al., 1994). Por lo tanto, los linfocitos NK-92 en medios sin complementar tenían una cantidad relativamente elevada de CD25 en su superficie, mientras que las células en medios complementados con una cantidad tan baja como 100 U/ml tenían unos niveles bajos de expresión del CD25 en la superficie celular.

La expresión del CD25 en el transfectante que produce grandes cantidades de IL-2, el NK-92MI, disminuyó tanto en el medio sin complementar como en el medio complementados con 100 U/ml o 1000 U/ml de IL-2. Estos resultados son coherentes con los observados con las células originales. Como la cantidad de IL-2 producida endógenamente en NK-92MI era elevada, se esperaba la disminución de la cantidad de receptor de la IL-2 incluso en ausencia de la IL-2 administrada exógenamente.

El cultivo de NK-92CI en medios complementados con 100 U/ml y 1000 U/ml de IL-2 dio lugar a la inducción del CD25 y al aumento de la expresión en la superficie celular. Sin embargo, no son tan claros los resultados para NK-92CI en medios sin complementar. Aparecen dos poblaciones distintas: una población que expresa muy poca cantidad de CD25, similar a NK-92MI, y una población que expresa una gran cantidad, similar a los linfocitos NK-92 originales. Esto sugiere que NK-92CI consiste en una población policlonal que consiste en células que expresan mucha y poca IL-2 y no en una población uniforme de células que expresan una cantidad de intermedia a baja de la IL-2. Por lo tanto, cuando se cultivan en medios sin IL-2, las células que expresan una gran cantidad de IL-2 tendrían poca cantidad de CD25 en la superficie, mientras que las células que expresan poca cantidad de la IL-2 tendrían gran cantidad de CD25 en su superficie.

Ejemplo 17 Citotoxicidad de los linfocitos NK-92 transfectados para producir IL-2

Para evaluar la citotoxicidad de estos linfocitos transfectados, se realizó un análisis estándar de liberación de ^{51}Cr de 4 horas para comparar la toxicidad de las células originales de los linfocitos NK-92MI y NK-92CI contra las células diana de prueba estándar K562 and Raji. La citotoxicidad de los linfocitos NK-92MI y NK-92CI fue comparable a la observada con las células originales (figura 18). Las estirpes celulares transfectadas muestran una actividad citotóxica contra K562 y Raji que es muy similar a las de las células originales. La citotoxicidad de NK-92 contra K562 osciló del 82 al 67%, mientras que NK-92MI y NK-92CI mostró una citotoxicidad que oscila del 77 al 62% y del 82 al 62%, respectivamente. Para las células Raji, los linfocitos NK-92 tuvieron una citotoxicidad del 81 al 47%, los NK-92MI tuvieron una citotoxicidad del 75 al 65% y los NK-92CI tuvieron una citotoxicidad del 82 al 52%.

Ejemplo 18 Efecto de los linfocitos NK-92 transfectados sobre las células progenitoras hematopoyéticas

Una posible aplicación clínica de los linfocitos NK-92, NK-92MI y NK-92CI es la de agente de purga ex vivo para los autoinjertos. Para que los linfocitos NK sean adecuados para este propósito, deben ser capaces de purgar las células malignas sin destruir las células progenitoras hematopoyéticas en el injerto o alterar su potencial hematopoyético. Para analizar esto, se realizó un análisis de células formadoras de colonias (CFC) donde se examinó la producción clonógena de los LMSP después de una incubación de 48 horas con linfocitos NK-92MI y NK-92CI a varias proporciones de E:D. Se observó previamente que los linfocitos NK-92 tenían un efecto mínimo sobre los hemocitoblastos hematopoyéticos (ejemplo 6). En este ejemplo, los linfocitos NK-92MI y NK-92CI también tuvieron poco o ningún efecto sobre la producción clonógena. El número total de colonias después de la incubación con linfocitos NK-92MI o NK-92CI fue muy similar al control, aunque se observó una ligera disminución con la mayor proporción efector:LMSP de 1:1 (figura 19). La producción clonógena total tanto de linfocitos NK-92MI como de los NK-92CI fue de aproximadamente el 80% del control en estas condiciones. Sin embargo, no se observó una tendencia coherente en términos de producción clonógena en relación con la proporción de NK:LMSP. En términos de tipos de colonias específicas, no hubo diferencias detectables en el número de producción de colonias de UFR-E, que son las más numerosas. Se observó algo de efecto con las colonias UFC-GM y UFC-GEMM. Sin embargo, los valores absolutos de estas colonias son muy bajos, lo que hace difícil cualquier conclusión, ya que pequeñas variaciones en el número de colonias tiene un gran efecto sobre el cálculo de la producción clonógena. Se observa una influencia sobre UFC-GM y UFC-GEMM a proporciones más elevadas, pero no se advirtió ninguna correlación coherente entre la proporción y la producción.

Ejemplo 19 Irradiación de los linfocitos NK-92 transfectados

Para establecer una dosis de irradiación eficaz para inhibir la proliferación y mantener la citotoxicidad, se irradiaron los linfocitos NK-92MI y los NK-92CI con 500, 1000, 1500 y 2000 cGy y se analizó la proliferación mediante el análisis de incorporación de [^{3}H]-timidina (véanse los ejemplos 7 y 8). Tanto los linfocitos NK-92MI como los NK-92CI fueron más sensibles a la irradiación que los linfocitos NK-92 originales. Se encontró que la proliferación de los linfocitos NK-92MI y NK-92CI se suprimía más fuertemente que la de los linfocitos NK-92 con todas las dosis de irradiación probadas (figura 20, panel A). En los linfocitos NK-92MI y NK-92CI se suprimió completamente la proliferación mediante una dosis de irradiación entre 500 y 1000 cGy. La cantidad de timidina incorporada alcanza un máximo estable a aproximadamente el 20% de las células de control sin irradiar para los linfocitos NK-92CI y un 10% para los linfocitos NK-92MI. Para determinar la viabilidad, se irradiaron linfocitos NK-92, NK-92MI y NK-92CI con 250, 500, 1000 y 2000 cGy y se determinó la exclusión por azul de tripano 24, 48 y 72 horas después de la irradiación. Se encontró que la irradiación destruía mayores porcentajes de linfocitos NK-92MI y NK-92CI en comparación con las células originales con dosis equivalentes (figura 20, panel B). La viabilidad de los linfocitos NK-92 fue mayor que la de los dos transfectantes a todas las dosis probadas.

La citotoxicidad de estos linfocitos después de la irradiación se muestra en la figura 21. Se probaron los linfocitos irradiados con 0, 1000 y 2000 cGy después de tres días para determinar la citotoxicidad contra las células K562 y Raji a unas proporciones de efector:diana de 20:1, 10:1, 5:1 y 1:1. Se determinó que la citotoxicidad de los linfocitos NK-92 tres días después de la irradiación con 1000 cGy era aproximadamente del 10 al 30% para K562 (figura 21, panel A) y del 30 al 50% para Raji (figura 21, panel B). La irradiación con 2000 cGy dio lugar a una citotoxicidad del 1 al 5% contra K562 y del 3 al 13% contra Raji. En cambio, los linfocitos NK-92MI tuvieron una actividad citotóxica sólo del 0 al 5% y del 0 al 1% contra K562, y del 0 al 1% y del 0% contra Raji, tres días después de las dosis de irradiación de 1000 y 2000 cGy, respectivamente. Los linfocitos NK-92CI tuvieron una citotoxicidad sólo del 1 al 4% contra K562 y del 2 al 7% contra Raji tres días después de la irradiación con 1000 cGy, y del 0% para K562 y del 0 al 2% contra Raji después de la irradiación con 2000 cGy.

En los datos descritos aquí, se observa que los transfectantes con IL-2 son más sensibles a la irradiación que la cepa original. La proliferación y la citotoxicidad de los linfocitos NK-92MI y NK-92CI se suprimieron con menos irradiación que para las cepas originales, y la letalidad inducida por la irradiación con dosis de irradiación equivalentes fue mucho mayor en los linfocitos modificados independientes de la IL-2 que en los linfocitos NK-92. Los linfocitos NK-92MI que producen grandes cantidades de IL-2 son más sensibles a la irradiación que la variante NK-92CI que produce poca cantidad de IL-2. Como resultado del aumento de la sensibilidad a la irradiación, sería suficiente un nivel bajo de irradiación para controlar adecuadamente la proliferación mientras se minimiza la letalidad de las células y la inhibición de la citotoxicidad. En los experimentos sistemáticos, el experto en la técnica será capaz de repetir experimentos como los descritos en este ejemplo. Al utilizar dosis de irradiación más bajas, en el intervalo entre 0 y 1000 cGy, se pueden determinar las dosis óptimas que inhiben la proliferación al mismo tiempo que mantienen la viabilidad y la actividad citolítica de los linfocitos NK-92 MI y NK-92CI.

Ejemplo 20 Transfección de los linfocitos NK-92 con un gen de timidina cinasa

Los linfocitos NK-92 se han de transfectar con un vector que lleva un gen de timidina cinasa (TK). Los linfocitos NK-92 modificados con TK resultantes se convierten, por lo tanto, en susceptibles a los efectos tóxicos de los análogos de la guanosina ganciclovir y aciclovir.

Se ha de construir un vector capaz de transfectar una célula de mamífero, como un vector retrovírico que albergue un gen TK del virus del herpes común (VHC), bajo el control del promotor del TK del VHC, y que contiene su propio sitio de adición de poli-A. Se ha de llevar a cabo la transfección mediante un método conocido por los expertos en biología celular y biología molecular de mamíferos, como la electroporación (Bio-Rad Gene Pulser™) o mediante lipofección [Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413 (1987)]. Los linfocitos NK-92 producidos así son susceptibles a la inactivación mediante la administración de ganciclovir o aciclovir.

Ejemplo 21 Mutación de la proteína HLA de la superficie celular de los linfocitos NK-92

Se han de obtener los linfocitos NK-92 de la estirpe celular descrita por Gong et al. (1994). Se ha de aislar el cromosoma que lleva el gen de la microglobulina \beta_{2}, y se ha de purificar el ADN contenido en de este cromosoma eliminando las histonas y otras proteínas unidas al ADN. Se ha de escindir el fragmento génico que lleva la microglobulina \beta_{2} con nucleasas de restricción, y la mutagénesis específica de sitio se realiza por medio de un casete de oligonucleótidos que alberga la secuencia de nucleótidos mutada. Estos procedimientos utilizan técnicas que se conocen normalmente en la tecnología del ADN recombinante, como se presenta, por ejemplo, en "Current Protocols in Molecular Biology", Ausubel et al., John Wiley and Sons, Nueva York, 1987 (actualizado trimestralmente) y en "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2ª ed., Sambrook, Fritsch y Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989. Se ha de reincorporar la microglobulina \beta_{2} mutada en el ADN celular, y se ha de reintroducir en los linfocitos NK-92. Luego, esta preparación de células expresarán moléculas HLA en la superficie celular que incorporan restos de la microglobulina \beta_{2} mutada y que habrán perdido la capacidad de unirse a los receptores de los linfocitos T.

Ejemplo 22 Linfocitos NK-92 que expresan receptores para una célula cancerosa

Se recogen los LTC de un paciente que padece un cáncer mediante centrifugación diferencial sobre un gradiente de densidad. Los LTC han de estar purificados por inmunoafinidad para contener predominantemente los LTC que se dirigen a un receptor de la célula cancerosa del paciente. Se ha de aislar el ADN de la población de LTC obtenida, y los genes para el receptor del CMH de clase I en el LTC dirigido contra el cáncer se ha de aislar mediante la escisión con nucleasas de restricción. Se han de amplificar los genes así purificados con el uso de la reacción en cadena de la polimerasa y se han de incorporar los genes amplificados resultantes en un vector adecuado para la expresión constitutiva de los genes en los linfocitos NK-92. Se deben transfectar los vectores en los linfocitos NK-92, y se deben seleccionar los linfocitos NK-92 modificados obtenidos así utilizando, por ejemplo, un marcador de resistencia a antibióticos incorporado en el vector. Los linfocitos así seleccionados se deben cultivar para aumentar su número. Luego, se pueden emplear para dirigirlos específicamente contra las células cancerosas en el paciente, y tratar ex vivo o in vivo el cáncer que se produce en el paciente.

Ejemplo 23 Uso de los linfocitos NK-92 para destruir células infectadas por el VIH

8E5 es una estirpe celular que alberga un VIH y que produce viriones del VIH. 8E5L es la estirpe celular correspondiente infectada con un VIH que no produce viriones. En un experimento de actividad citotóxica en el que se utilizó el análisis de liberación de cromo para evaluar la actividad, se obtuvieron los resultados que se presentan en la tabla 8. En estos experimentos, las células A3.01 son una estirpe celular de control sin infectar.

TABLA 8 Actividad citotóxica de los linfocitos NK-92 sobre las células infectadas por el VIH

Diana	Proporción E:D	% de citotoxicidad
A3.01 1	50:1	43
	20:1	51
	5:1	44
	1:1	44
8E5L	50:1	43
	20:1	37
	5:1	44
	1:1	40
8E5	50:1	76
	20:1	69
	5:1	77
	1:1	65

En la tabla 8 se observa que las células 8E5 que producen partículas del VIH desencadenan una mayor actividad citotóxica que las células 835L, que no producen partículas del VIH, y mayor actividad citotóxica que las células de control. Sin desear estar comprometido por la teoría, se cree que el efecto antivírico de los linfocitos NK-92 se debe a factores como un efecto citotóxico directo, así como a la inhibición a través de MIP-1\alpha, que los linfocitos NK-92 producen a concentraciones elevadas [Bluman et al., J. Clin. Investig. 97: 2722 (1996)]. Los resultados indican que los linfocitos NK-92 lisan en efecto las células que producen el VIH in vitro.

Claims

1. Uso de un medio que comprende linfocitos NK-92 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un cáncer o de un tumor, en el que los linfocitos NK-92 destruyen las células que comprenden el cáncer o el tumor in vivo cuando se administran a un sujeto.

2. El uso del medio de la reivindicación 1, en el que dicho cáncer o tumor es un tumor sólido.

3. El uso de un medio de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que el cáncer comprende melanoma, cáncer de próstata, neuroblastoma, carcinoma microcítico de pulmón o cáncer de mama.

4. El uso del medio de la reivindicación 1, en el que dicho cáncer es un cáncer hemático.

5. El uso de un medio de una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 4, en el que el cáncer comprende leucemia linfoblástica y mielógena aguda y crónica, linfoma o mieloma.

6. El uso del medio de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el medicamento es adecuado para la administración al sujeto mediante infusión intravenosa, inyección intraperitoneal, inyección subcutánea o inyección intratumoral.

7. El uso del medio de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el sujeto es un ser humano.