ES2262186T5 - Inmunoglobulina humanizada reactiva con integrina alpha4beta7 - Google Patents

Description

DESCRIPCION

Inmunoglobulina humanizada reactiva con integrina alpha4beta7 Antecedentes

Los receptores de integrina son importantes para regular tanto la recirculacion de linfocitos como su reclutamiento en 5 los sitios de inflamacion (Carlos, T.M. y Harlan, J.M., Blood, 84:2068-2101 (1994)). La integrina a4p7 humana tiene varios ligandos, uno de los cuales es la adresina vascular de mucosas MAdCAM-1 (Berlin, C. et al., Cell 74:185-195 (1993); Erle, D.J. et al. J. Immunol. 153:517-528 (1994)), expresada en venulas endoteliales superiores de los ganglios linfaticos mesentericos y en las placas de Peyer (Streeter, P.R. et al., Nature 331:41-46 (1988)). Como tal, la integrina a4p7 actua como receptor de grna que media en la migracion de linfocitos al tejido linfoide de la mucosa 10 intestinal (Schweighoffer, T. et al., J. Immunol. 151:717-729 (1993)). Ademas, la integrina a4p7 interacciona con la fibronectina y la molecula de adhesion celular vascular-1 (VCAM-1).

La enfermedad inflamatoria del intestino (IBD, por sus siglas en ingles), tal como la colitis ulcerosa y la enfermedad de Crohn, por ejemplo, puede ser una enfermedad debilitante y progresiva que implique inflamacion del tracto gastrointestinal. Afectando a una cantidad estimada de dos millones de personas tan solo en los Estados Unidos, los 15 smtomas incluyen dolor abdominal, calambres, diarrea y hemorragia rectal. Los tratamientos para la IBD han incluido

farmacos antiinflamatorios (tales como corticosteroides y sulfasalazina), farmacos inmunosupresores (tales como 6- mercaptopurina, ciclosporina y azatioprina) y cirugfa (tal como colectoirna). Podolsky, New Engl. J. Med., 325:928937 (1991) y Podolsky, New Engl. J. Med., 325:1008-1016 (1991).

Los anticuerpos frente a la integrina a4p7 humana, tales como el anticuerpo monoclonal murino (Acm Act-1), 20 interfieren con la integrina a4p7 que se une a la molecula de adhesion celular de adresina mucosal-1 (MAdCAM-1) presente en las venulas endoteliales superiores situadas en los ganglios linfaticos de las mucosas. Act-1 fue originalmente aislada por Lazarovits, A.I. et al., J. Immunol. 133:1857-1862 (1984), de ratones inmunizados con linfocitos T humanos espedficos para el toxoide del tetanos y se dijo que era un anticuerpo IgG1/K de raton. Un analisis mas reciente del anticuerpo por Schweighaffer, T. et al., J. Immunol. 151:717-729 (1993), demostro que 25 puede unirse a un subgrupo de linfocitos T CD4+ de memoria humanos, que expresan selectivamente la integrina a4p7. Sin embargo, un grave problema con la utilizacion de anticuerpos murinos para aplicaciones terapeuticas en humanos es que son altamente inmunogenicos en humanos e inducen rapidamente una respuesta de anticuerpos humanos anti-murinos (HAMA, por sus siglas en ingles), que reduce la eficacia del anticuerpo de raton en pacientes y puede impedir una administracion continuada. La respuesta HAMA da lugar a un rapido aclaramiento del 30 anticuerpo murino, limitando gravemente cualquier beneficio terapeutico.

Por lo tanto, se necesitan mejores aproximaciones terapeuticas a las enfermedades inflamatorias del intestino.

Compendio de la Invencion

La presente invencion se refiere a:

una inmunoglobulina humanizada o fragmento de la misma de union a antfgeno que se une selectivamente a 35 integrina a4p7, comprendiendo dicha inmunoglobulina o fragmento una cadena ligera y una cadena pesada,

comprendiendo dicha cadena ligera regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que tienen las secuencias de aminoacidos expresadas a continuacion:

cadena ligera:

CDR1 aminoacidos 44-59 de SEQ ID NO:12 40 CDR2 aminoacidos 75-81 de SEQ ID NO:12

CDR3 aminoacidos 114-122 de SEQ ID NO:12, y

una region de marco derivada de la region variable de la cadena ligera del anticuerpo GM607'CL (SEQ ID NO:8); donde en la posicion 2 isoleucina esta cambiada a valina

comprendiendo dicha cadena pesada regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que 45 tienen las secuencias de aminoacidos expresadas a continuacion:

cadena pesada:

CDR1 aminoacidos 50-54 de SEQ ID NO:15 CDR2 aminoacidos 69-85 de SEQ ID NO:15 CDR3 aminoacidos 118-129 de SEQ ID NO:15, y

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una region de marco derivada de la region variable de la cadena pesada del anticuerpo 21/28'CL humano (SEQ ID NO:10); donde en la posicion 24 alanina esta cambiada a glicerina, en la posicion 48 metionina esta cambiada a isoleucina, en la posicion 69 isoleucina esta cambiada a leucina, en la posicion 71 arginina esta cambiada a valina, en la posicion 73 treonina esta cambiada a isoleucina.

La inmunoglobulina humanizada o el fragmento de union a antigeno descritos anteriormente donde la cadena ligera comprende la region variable de SEQ ID NO:21, y la cadena pesada comprende la region variable de SEQ ID NO:19.

La inmunoglobulina humanizada o el fragmento de union a antigeno descritos anteriormente donde dicha inmunoglobulina o fragmento de union a antfgeno compite con el anticuerpo monoclonal Act-1 murino para unirse a integrina a4p7.

La inmunoglobulina humanizada o el fragmento de union a antfgeno descritos anteriormente, en donde dicha inmunoglobulina o fragmento de union a antfgeno tiene la especificidad epitopica del anticuerpo monoclonal Act-1 murino.

La inmunoglobulina humanizada o el fragmento de union a antfgeno descritos anteriormente que comprende ademas una region constante humana del tipo gamma

Una cadena ligera de inmunoglobulina humanizada o un fragmento de la misma, en donde dicha cadena ligera de inmunoglobulina humanizada o fragmento comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal Act-1 murino y una region de marco de cadena ligera derivada de la cadena ligera del anticuerpo GM607'CL (SEQ ID NO:8); donde en la posicion 2 isoleurina esta cambiada a valina, comprendiendo dichas regiones determinantes de complementariedad las secuencias de aminoacidos expresadas a continuacion de manera que un anticuerpo que comprende dicha cadena ligera o fragmento de la misma se une selectivamente a integrina a4p7:

cadena ligera:

CDR1 aminoacidos 44-59 de SEQ ID NO:12 CDR2 aminoacidos 75-81 de SEQ ID NO:12 CDR3 aminoacidos 114-122 de SEQ ID NO:12.

La cadena ligera de inmunoglobulina humanizada o fragmento descritos anteriormente, en donde dicha cadena ligera de inmunoglobulina humanizada o fragmento comprende la region variable de SEQ ID NO:21.

Un acido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica la cadena ligera de inmunoglobulina humanizada o fragmento descritos anteriormente.

El acido nucleico aislado descrito anteriormente en donde dicha secuencia de nucleotidos comprende la secuencia codificante de la region variable de SEQ ID NO:20.

Un vector de expresion que comprende un gen fusionado que codifica una cadena ligera de inmunoglobulina humanizada o fragmento de la misma descritos anteriormente.

El vector de expresion definido mas arriba en donde dicho gen fusionado comprende la secuencia codificante de la region variable de SEQ ID NO:20.

Una cadena pesada de inmunoglobulina humanizada o fragmento de la misma, en donde dicha cadena pesada de inmunoglobulina humanizada o fragmento comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal Act-1 murino, y una region de marco de la cadena pesada derivada de la cadena pesada del anticuerpo 21/28'CL humano (SEQ ID NO:10); donde en la posicion 24 alanina esta cambiada a glicerina, en la posicion 48 metionina esta cambiada a isoleucina, en la posicion 69 isoleucina esta cambiada a leucina, en la posicion 71 arginina esta cambiada a valina, en la posicion 73 treonina esta cambiada a isoleucina, comprendiendo dichas regiones determinantes de complementariedad las secuencias de aminoacidos expresadas a continuacion tales que un anticuerpo que comprende dicha cadena pesada o fragmento de la misma se une selectivamente a integrina a4p7:

cadena pesada:

CDR1 aminoacidos 50-54 de SEQ ID NO:15 CDR2 aminoacidos 69-85 de SEQ ID NO:15 CDR3 aminoacidos 118-129 de SEQ ID NO:15.

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La cadena pesada de inmunoglobulina humanizada o fragmento descritos anteriormente en donde dicha cadena pesada de inmunoglobulina humanizada o fragmento comprende la region variable de SEQ ID NO:19.

Un acido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica la cadena pesada de inmunoglobulina humanizada o fragmento descritos anteriormente.

El acido nucleico aislado descrito anteriormente en donde dicha secuencia de nucleotidos comprende la secuencia codificante de la region variable de SEQ ID NO:18.

Un vector de expresion que comprende un gen fusionado que codifica una cadena pesada de inmunoglobulina humanizada o fragmento de la misma como se describe aqrn.

El vector de expresion que se describe mas arriba en donde dicho gen fusionado comprende la secuencia codificante de la region variable de SEQ ID NO:18.

Una celula hospedante que comprende el vector de expresion descrito anteriormente.

Un metodo de preparacion de una cadena ligera de inmunoglobulina humanizada, un fragmento de una cadena ligera de inmunoglobulina humanizada, una cadena pesada de inmunoglobulina humanizada o un fragmento de una cadena pesada de inmunoglobulina humanizada, que comprende mantener una celula hospedante descrita anteriormente en condiciones apropiadas para la expresion de una cadena ligera o una cadena pesada de inmunoglobulina humanizada, con lo que se expresa y se produce, y opcionalmente se aisla, una cadena ligera de inmunoglobulina humanizada, un fragmento de una cadena ligera de inmunoglobulina humanizada, una cadena pesada de inmunoglobulina humanizada o un fragmento de cadena pesada de inmunoglobulina humanizada.

Una celula hospedante que comprende un primer acido nucleico recombinante que codifica una cadena ligera de inmunoglobulina humanizada o fragmento de la misma, y un segundo acido nucleico recombinante que codifica una cadena pesada de inmunoglobulina humanizada o fragmento de la misma, en donde un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno que comprende dicha cadena ligera o fragmento de la misma y dicha cadena pesada o fragmento de la misma se unen selectivamente a integrina a4p7, en donde

dicho primer acido nucleico comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una CDR derivada de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal Act-1 murino, comprendiendo dicho primer acido nucleico una secuencia de nucleotidos que codifica tres regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que tienen las secuencias de aminoacidos expresadas a continuacion:

cadena ligera:

CDR1 aminoacidos 44-59 de SEQ ID NO:12 CDR2 aminoacidos 75-81 de SEQ ID NO:12 CDR3 aminoacidos 114-122 de SEQ ID NO:12; y

una region de marco derivada de la region variable de la cadena ligera del anticuerpo GM607'CL (SEQ ID NO:8) en donde en la posicion 2 isoleucina esta cambiada a valina; y

dicho segundo acido nucleico comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una CDR derivada de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal Sct-1 murino, comprendiendo dicho segundo acido nucleico una secuencia de nucleotidos que codifica tres regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que tienen las secuencias de aminoacidos expresadas a continuacion:

cadena pesada:

CDR1 aminoacidos 50-54 de SEQ ID NO:15 CDR2 aminoacidos 69-85 de SEQ ID NO:15 CDR3 aminoacidos 118-129 de SEQ ID NO: 15; y

una region de marco derivada de la region variable de la cadena pesada del anticuerpo 21/28'CL humano (SEQ ID NO:10) donde en la posicion 24 alanina esta cambiada a glicerina, en la posicion 48 metionina esta cambiada a isoleucina, en la posicion 69 isoleucina esta cambiada a leucina, en la posicion 71 arginina esta cambiada a valina, en la posicion 73 treonina esta cambiada a isoleucina.

Un metodo de preparacion de una inmunoglobulina humanizada que comprende mantener una celula hospedante como la descrita anteriormente en condiciones apropiadas para la expresion de una inmunoglobulina humanizada, con lo que se expresan las cadenas de inmunogloblina humanizada y se produce y opcionalmente se afsla una inmunoglobulina humanizada.

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Una inmunoglobulina humanizada o fragmento de la misma de union a antfgeno descritos anteriormente para uso en terapia o diagnosis.

Una composicion farmaceutica que comprende una inmunoglobulina humanizada o fragmento de union a antigeno descritos anteriormente y un vehmulo adecuado para uso como medicamento.

El uso de una inmunoglobulina humanizada o fragmento de union a antigeno descritos anteriormente para la fabricacion de un medicamento para tratar una enfermedad inflamatoria o una enfermedad asociada con infiltracion leucocitaria de tejidos, en donde la enfermedad es colecistitis, colangitis, pericolangitis, mastitis, sinusitis cronica, pancreatitis o diabetes mellitus dependiente de insulina.

El uso de una inmunoglobulina humanizada o fragmento de union a antfgeno descritos anteriormente para la fabricacion de un medicamento para tratar la enfermedad inflamatoria del intestino, en donde dicha enfermedad inflamatoria del intestino se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn.

El uso descrito anteriormente en donde dicha inmunoglobulina humanizada o fragmento de union a antfgeno comprende una cadena pesada y una cadena ligera, y en donde dicha cadena pesada comprende la region variable de SEQ ID NO:19 y dicha cadena ligera comprende la region variable de SEQ iD NO:21.

El uso de una inmunoglobulina humanizada o fragmento de union a antfgeno descritos anteriormente para la fabricacion de un medicamento para tratar una enfermedad inflamatoria asociada con tejidos mucosos, en donde la enfermedad es la enfermedad del injerto contra el huesped.

Breve descripcion de las figuras

La Figura 1 es una ilustracion de una secuencia de ADN consenso (SEQ ID No: 1) y de la secuencia deducida de aminoacidos (SEQ ID No: 2), que comprende la region variable determinada a partir de varios clones independientes de la region variable de la cadena pesada de raton.

La Figura 2 es una ilustracion de una secuencia de nucleotidos (SEQ ID No: 3) y de la secuencia deducida de aminoacidos (SEQ ID No: 4), que comprende una porcion de la secuencia de la region variable determinada a partir de un clon independiente de la region variable de la cadena pesada de raton, denominado H2B#34.

La Figura 3 es una ilustracion de una secuencia nucleotfdica (SEQ ID No: 5) y de la secuencia deducida de aminoacidos (SEQ ID No: 6), que comprende la region variable de varios clones independientes de la region variable de la cadena ligera de raton. Se indica la posicion de dos mutaciones hechas para introducir un sitio KasI para clonacion.

La Figura 4A es un grafico de fluorescencia que ilustra la capacidad del Acm Act-1 murino y de un anticuerpo control irrelevante de raton de isotipo parejo (MOPC 21, IgG1, kappa) para tenir celulas HuT 78 que expresan la integrina a4p7.

La Figura 4B es un grafico de fluorescencia que ilustra la capacidad de (i) anticuerpo Act-1 quimerico, (ii) un anticuerpo control irrelevante humano de isotipo parejo (IgG1, kappa) y (iii) un sobrenadante de celulas COS-7, para tenir celulas HuT 78 que expresan la integrina a4p7.

La Figura 5 es una alineacion de las secuencias de aminoacidos de la region variable de la cadena ligera de Act-1 de raton ("Act-l.vl") (SEQ ID No: 7) y de la region variable de la cadena ligera de GM 607'CL humana (SEQ ID No: 8). Los aminoacidos identicos estan indicados por una lmea vertical y los aminoacidos similares estan indicados por cuatro o dos puntos, dependiendo del grado de similitud. Las CDR estan entre parentesis y marcadas y los restos estan numerados secuencialmente.

La Figura 6 es una alineacion de las secuencias de aminoacidos de la region variable de la cadena pesada del Act-1 de raton ("Act-l.vh") (SEQ ID No: 9) y de la region variable de la cadena pesada 21/28'CL humana (SEQ ID No: 10). Los aminoacidos identicos estan indicados por una lmea vertical y los aminoacidos similares estan indicados por cuatro o dos puntos, dependiendo del grado de similitud. Las CDR estan entre parentesis y marcadas y los restos estan numerados secuencialmente.

La Figura 7 es una ilustracion de la secuencia de nucleotidos (SEQ ID No: 11) y de la secuencia deducida de aminoacidos (SEQ ID No: 12) de la region variable de la cadena ligera del Act-1 de raton unida a la secuencia del peptido senal de la cadena ligera del Act-1 de raton.

La Figura 8 es una ilustracion de la secuencia de nucleotidos (SEQ ID No: 13) y de la secuencia de aminoacidos (SEQ ID No: 8) de la region variable de la cadena ligera kappa del anticuerpo humano GM607'CL maduro.

La Figura 9 es una ilustracion de la secuencia de nucleotidos y de la secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena pesada del anticuerpo Act-1 de raton. La secuencia de nucleotidos de la region variable se une a una secuencia de nucleotidos que codifica una secuencia deducida del peptido senal de la cadena pesada del Act-1 de

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raton, para obtener una secuencia compuesta (SEQ ID No: 14 y 15). (La identidad del cebador que amplificaba la region de la cadena pesada fue deducida a partir de la secuencia degenerada, y una secuencia de aminoacidos para el peptido senal fue derivada a partir del cebador, secuencia corriente abajo y secuencias de otros peptidos senal. El peptido senal mostrado puede no ser identico al del hibridoma Act-1).

La Figura 10 es una ilustracion de la secuencia de nucleotidos y de la secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena pesada del anticuerpo 21/28'CL humano. La secuencia de nucleotidos codificante de la region variable se une a una secuencia de nucleotidos que codifica una secuencia de peptido senal derivada de la Vh del anticuerpo humano HG3'CL (Rechavi, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 80:855-859 (1983)), para obtener una secuencia compuesta (SEQ ID No: 16 y 17).

La Figura 11 es una ilustracion de la secuencia de nucleotidos (SEQ ID No: 18) y de la secuencia de aminoacidos (SEQ ID No: 19) de una porcion de la cadena pesada de un anticuerpo Act-1 humanizado (LDP-02) con un peptido senal de cadena pesada.

La Figura 12 es una ilustracion de la secuencia de nucleotidos (SEQ ID No : 20) y de la secuencia de aminoacidos (SEQ ID No: 21) de una porcion de la cadena ligera de un anticuerpo Act-1 humanizado, (LDP-02) con un peptido senal de cadena ligera.

La Figura 13 es una ilustracion de las secuencias de nucleotidos de oligonucleotidos complementarios solapantes, denominados L1-L6 (SEQ ID No: 22-27), que fueron usados para hacer la cadena ligera de una inmunoglobulina Act-1 humanizada (LDP-02), y las secuencias de nucleotidos de oligonucleotidos complementarios solapantes, denominados H1-H10 (SEQ ID No: 28-37), que fueron usados para hacer la cadena pesada de la inmunoglobulina Act-1 humanizada.

La Figura 14 es un grafico de fluorescencia que ilustra la tincion de celulas HuT 78 usando, una inmunoglobulina quimerica Act-1 murina-humana, una inmunoglobulina Act-1 humanizada o un anticuerpo control irrelevante que se corresponde al isotipo humano (IgG1, kappa).

La Figura 15 es un grafico que ilustra los resultados de una titulacion de Act-1 murino y Act-1 humanizado (LDP- 02/3A9/LOTE#l, Ejemplo 4) biotinilados, llevada a cabo por citometna de flujo en celulas Hut-78.

La Figura 16 es un grafico que ilustra la inhibicion competitiva de la union de Act-1 murino biotinilado por Act-1 murino a una inmunoglobulina Act-1 humanizada (LDP-02/3A9/LOTE#l, Ejemplo 4), en comparacion con IgG1 humana o IgG1 murina control.

La Figura 17 es un grafico que ilustra los resultados de un ensayo de liberacion de 51cromo para la lisis celular mediada por complemento de celulas mononucleares de sangre periferica humana en presencia de (a) CAMPATH- 1H, (b) CAMPATH-1G, (c) IgG1 humana, (d) LDP-02/3A9/Lote#l (Ejemplo 4) a (e) LDP-01 (anti-CD18 humanizado, mutado en Fc) a concentraciones de 50, 25, 5, 2,5 y 0,5 pg/ml.

Las Figuras 18A-18B son graficos que ilustran las resultados de un ensayo de adhesion que monitoriza la inhibicion de la adhesion por Act-1 murino (Figura 18A), IgG1 murina (Figura 18A), LDP-02/3A9/Lote#1 (Figura 18B) o IgG1 humana (Figura 18B) de celulas portadoras de a4p7 (RpMI 8866) y una quimera MAdCAM-1-Ig humana (inmunoadhesina).

La Figura 19 es un grafico que muestra la tincion de celulas HuT 78 usando (a) LDP-02 (mutado en Fc), (b) un derivado de LDP-02 (mutado en Fc) que tiene una mutacion en la cadena ligera (MV4) mas una doble mutacion en la cadena pesada (R38K, A4OR), o (c) un anticuerpo control irrelevante que se corresponde al isotipo humano (IgG1, kappa).

Descripcion detallada

Las inmunoglobulinas humanizadas de la presente invencion se pueden unir a integrina a4p7con una afinidad de al menos aproximadamente 107 M-1, preferiblemente al menos aproximadamente 108 M-2, y mas preferiblemente al menos aproximadamente 109 M-1.

Las inmunoglobulinas de origen natural tienen una estructura nuclear comun en la que dos cadenas ligeras identicas (aproximadamente 24 kD) y dos cadenas pesadas identicas (aproximadamente 55 o 70 kD) forman un tetramero. La porcion amino-terminal de cada cadena es conocida como la region variable (V) y puede ser distinguida de las regiones constantes (C) mas conservadas del resto de cada cadena. En la region variable de la cadena ligera hay una porcion C-terminal conocida como la region J. Dentro de la region variable de la cadena pesada, hay una region D, ademas de la region J. La mayor parte de la variacion de la secuencia de aminoacidos en las inmunoglobulinas esta confinada a tres localizaciones separadas en las regiones V, conocidas como regiones hipervariables o regiones determinantes de la complementariedad (CDR), que estan directamente implicadas en la union a antfgeno. Procediendo desde el extremo amino, estas regiones son denominadas CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente. Las CDR son mantenidas en su sitio por regiones de marco (RM) mas conservadas. Procediendo desde el extremo amino, estas regiones son denominadas RM1, RM2, RM3 y RM4, respectivamente. Kabat et al. han definido las

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localizaciones de las regiones CDR y RM y un sistema de numeracion (Kabat, E.A. et al., Sequences of proteins of immunological interest, Quinta Edicion, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los EE.UU., Imprenta del Gobierno de los EE.UU. (1991); veanse tambien las Tablas 3 y 4).

Las inmunoglobulinas humanas se pueden dividir en clases y subclases, dependiendo del isotipo de la cadena pesada. Las clases incluyen IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, en donde las cadenas pesadas son del tipo gamma (y), mu (|j) alfa (a), delta (8) o epsilon (e), respectivamente. Las subclases incluyen IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2, en donde las cadenas pesadas son del tipo y1 , Y2, y3, y4, al y a2, respectivamente. Las moleculas de inmunoglobulina humano de una clase o subclase seleccionadas pueden contener una cadena ligera kappa (k) o lambda (X).Veanse, por ejemplo, Cellular y Molecular Immunology, Wonsiewicz, M.J., Ed., Capttulo 45, pp. 41-50, W.B. Saunders Co., Philadelphia, PA (1991); Nisonoff, A., Introduction to Molecular Immunology, 28 Ed., Capitulo 4, pp. 45-65, Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1984).

El termino "inmunoglobulina", tal como se utiliza aqrn, incluye anticuerpos completos y fragmentos biologicamente funcionales de los mismos. Dichos fragmentos biologicamente funcionales retienen al menos una funcion de union a antfgeno de un correspondiente anticuerpo de longitud total (por ejemplo, especificidad para a4p7 del anticuerpo Act-1) y, preferiblemente, retienen la capacidad de inhibir la interaccion de a4p7 con uno o mas de sus ligandos (por ejemplo, MAdCAM-1, fibronectina). En una realizacion particularmente preferida, los fragmentos biologicamente funcionales pueden inhibir la union de a4p7 a la adresina de mucosas (MAdCAM-1). Como ejemplos de fragmentos de anticuerpos biologicamente funcionales que pueden ser utilizados se incluyen fragmentos capaces de unirse a una integrina a4p7, tales como anticuerpos de una sola cadena, fragmentos Fv, Fab, Fab', y F(ab'). Dichos fragmentos pueden ser producidos por escision enzimatica o por tecnicas recombinantes. Por ejemplo, se puede usar la escision con papama o pepsina para generar fragmentos Fab o F(ab')2, respectivamente. Tambien se pueden producir anticuerpos en una variedad de formas truncadas, utilizando genes de anticuerpos en los que se han introducido uno o mas codones de parada corriente arriba del sitio de parada natural. Por ejemplo, se puede disenar un gen quimerico codificante de la cadena pesada de un fragmento F(ab')2 de forma que incluya secuencias de ADN codificantes del dominio CH1 y de la region bisagra de la cadena pesada.

El termino "inmunoglobulina humanizada", tal como se utiliza aqrn, se refiere a una inmunoglobulina que comprende porciones de inmunoglobulinas de diferente origen, en donde al menos una porcion es de origen humano.

La region de union a antfgeno de la inmunglobulina humanizada (la porcion no humana) puede derivar de una inmunoglobulina, de origen no humano, (a la que se hace referencia como inmunoglobulina donante) que tiene especificidad de union por la integrina a4p7. Por ejemplo, una region adecuada de union a antfgeno puede derivar del anticuerpo monoclonal murino Act-1 (Lazarovits, A.I. et al., J. Inmmunol., 133(4):1857-1862 (1984); veanse, por ejemplo, las Ejemplos 1-3). Otras fuentes incluyen anticuerpos espedficos para la integrina a4p7 obtenidos de fuentes no humanas, tales como roedor (por ejemplo, raton, rata), conejo, cerdo, cabra o primate no humano. Se pueden preparar otros anticuerpos policlonales o monoclonales, tales como anticuerpos que se unen al mismo epitopo o similar que el anticuerpo Act-1 (por ejemplo, Kohler et al., Nature, 256:495-497 (1975); Harlow et al., 1988; Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, NY), y Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2 (Suplemento 27, Verano de 1994), Ausubel et al., Eds. (John Wiley & Sons: New York, NY), Capftulo 11 (1991)).

Por ejemplo, se pueden producir anticuerpos frente a un inmunogeno apropiado en un mairnfero adecuado (por ejemplo, un raton, rata, conejo u oveja). Celulas portadoras de a4p7, fracciones de membrana que contienen a4p7, fragmentos inmunogenicos a4p7, un peptido p7 conjugado a un vehfculo adecuado, son ejemplos de inmunogenos adecuados. Se pueden aislar celulas productoras de anticuerpo (por ejemplo, un linfocito) de, por ejemplo, los ganglios linfaticos o el bazo de un animal inmunizado. Las celulas pueden ser entonces fusionadas a una celula inmortalizada adecuada (por ejemplo, una lmea celular de mieloma), formando asf un hibridoma. Las celulas fusionadas pueden ser aisladas empleando tecnicas de cultivo selectivo. Las celulas que producen anticuerpos con la especificidad deseada pueden ser seleccionadas por medio de un ensayo adecuado (por ejemplo, ELISA). Las inmunoglobulinas de origen no humano que tienen especificidad de union por la integrina a4p7 pueden ser tambien obtenidas a partir de colecciones de anticuerpos (por ejemplo, una coleccion de fagos que contiene moleculas de Fab no humano).

La porcion de la inmunoglobulina humanizada o la cadena de inmunoglobulina que tiene origen humano (la porcion humana) puede derivar de cualquier inmunoglobulina o cadena de inmunoglobulina humana adecuada. Por ejemplo, una region constante humana o porcion de la misma, si esta presente, puede derivar de las cadenas ligeras k o A, y/o las cadenas pesadas y (por ejemplo, y1, y2, y3, y4), j, a (por ejemplo, al, a2), 8 o e de anticuerpos humanos, incluyendo las variantes alelicas. Se puede seleccionar una region constante particular (por ejemplo, IgGl), variante o porciones de la misma con objeto de adaptar la funcion efectora. Por ejemplo, se puede incorporar una region constante mutada (variante) a una protema de fusion para minimizar la union a los receptores Fc y/o la capacidad para fijar el complemento (vease, por ejemplo, el Ejemplo 3; veanse tambien Winter et al., GB 2,209,757 B; Morrison et al., WO 89/07142; Morgan et al., WO 94/29351, 22 de Diciembre de 1994).

Por ejemplo, la secuencia del anticuerpo o region variable usada para obtener la porcion no humana que se ha descrito mas arriba puede ser comparada con secuencias humanas, segun se describe en Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edicion, Departamento de Salud y Servicios Humanos de

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los EE.UU., Imprenta del Gobierno de las EE.UU. (1991). En una realizacion particularmente preferida, las regiones de marco de una cadena de inmunoglobulina humanizada derivan de una region variable humana que tiene al menos aproximadamente un 65% de identidad global de secuencia y, preferiblemente, al menos aproximadamente un 70% de identidad global de secuencia, con la region variable del donante no humano (por ejemplo, anticuerpo Act-1 de raton). Una porcion humana puede tambien derivar de un anticuerpo humano que tiene al menos aproximadamente un 65% de identidad de secuencia y, preferiblemente, al menos aproximadamente un 70% de identidad de secuencia, dentro de la porcion particular (por ejemplo, RM) que se esta utilizando, cuando se compara con la porcion equivalente (por ejemplo, rM) del donante no humano. Por ejemplo, tal como se describe en el Ejemplo 2, la identidad global de secuencia entre las regiones variables de las cadenas ligeras de Act-1 de raton y GM607'CL humano era de un 71,4%, y la identidad global de secuencia entre las regiones variables de las cadenas pesadas de Act-1 de raton y 21/28'CL humano era de un 68,1%.

Tal como se describe en el Ejemplo 2, se pueden hacer cambios en la region de marco, tales como los que sustituyen a un resto de la region de marco de origen humano con un resto de la posicion correspondiente del donante. Se pueden hacer una a mas mutaciones en la region de marco, incluyendo supresiones, inserciones y sustituciones de uno o mas aminoacidos. Se describen varias de tales sustituciones en el diseno de un anticuerpo Act-1 humanizado en el Ejemplo 2. Para un anticuerpo o cadena humanizados seleccionados, se pueden disenar mutaciones de marco como se describe aqrn. Preferiblemente, las inmunoglobulinas humanizadas pueden unirse a la integrina a4p7 con una afinidad similar a, o mejor que, la del donante no humano. Se pueden producir variantes por una variedad de metodos adecuados, incluyendo la mutagenesis de cadenas donantes no humanos o humanos aceptoras.

En una realizacion preferida, la inmunoglobulina humanizada de la presente invencion tiene al menos una funcion caractenstica del anticuerpo Act-1 murino, tal como la funcion de union (por ejemplo, con especificidad por la integrina a4p7, con la misma o similar especificidad epitopica), y/o la funcion inhibitoria (por ejemplo, la capacidad de inhibir la adhesion dependiente de a4p7 in vitro y/o in vivo, tal como la capacidad de inhibir la union de la integrina a4p7 a MAdCAM-1 in vitro y/o in vivo, o la capacidad de inhibir la union de una celula portadora de la integrina a4p7 a un ligando de la misma (por ejemplo, una celula portadora de MAdCAM-1)). Asf, las inmunoglobulinas humanizadas preferidas pueden tener la especificidad de union del anticuerpo Act-1 murino, la especificidad epitopica del anticuerpo Act-1 murino (por ejemplo, puede competir con el Act-1 murino, un anticuerpo Act-1 quimerico (vease, por ejemplo, el Ejemplo 1) o un Act-1 humanizado (por ejemplo, LDP-02) por la union a a4p7 (por ejemplo, sobre una celula portadora de la integrina a4p7)) y/o funcion inhibitoria.

La funcion de union de una inmunoglobulina humanizada que tiene especificidad de union por la integrina a4p7 puede ser detectada por metodos inmunologicos estandar, por ejemplo utilizando ensayos que monitorizan la formacion de un complejo entre la inmunoglobulina humanizada y la integrina a4p7 (por ejemplo, una fraccion de membrana. que contiene la integrina a4p7, sobre una celula portadora de la integrina a4p7, tal como un linfocito humano (por ejemplo, un linfocito del subgrupo CD4+a4hi,p110), una lmea celular de linfocitos humanos o una celula hospedante recombinante que comprende acido nucleico codificante de a4 y/o p7, que expresa la integrina a4p7).

Se pueden emplear ensayos de union y/o adhesion u otros metodos adecuados en los procedimientos para. la identificacion y/o aislamiento de inmunoglobulinas humanizadas (por ejemplo, a partir de una coleccion) con la especificidad requerida (por ejemplo, un ensayo que monitorice la adhesion entre una celula portadora de una integrina a4p7 y un ligando de la misma (por ejemplo, una segunda celula que expresa MAdCAM, una quimera MAdCAM-Ig (vease, por ejemplo, el Ejemplo 4) u otros metodos adecuados).

Las porciones de inmunoglobulinas pueden ser obtenidas o derivar de inmunoglobulinas (por ejemplo, por smtesis de novo de una porcion), o se pueden producir y expresar acidos nucleicos codificantes de una inmunoglobulina o cadena de la misma que tiene la propiedad deseada (por ejemplo, que se une a la integrina a4p7, que tiene similitud de secuencia). Se pueden producir inmunoglobulinas humanizadas que contienen las porciones deseadas (por ejemplo, region de union a antfgeno, CDR, RM, region C) de origen humano y no humano usando acidos nucleicos sinteticos y/o recombinantes para preparar genes (por ejemplo, ADNc) codificantes de la cadena humanizada deseada. Para preparar una porcion de una cadena, se pueden introducir uno o mas codones de parada en la posicion deseada. Por ejemplo, se pueden construir secuencias de acido nucleico (por ejemplo, ADN) codificantes de regiones variables humanizadas de nuevo diseno, usando metodos de mutagenesis por PCR para alterar las secuencias existentes de ADN (vease, por ejemplo, Kamman, M. et al., Nucl. Acids Res. 17:5404 (1989)). Se pueden hibridar cebadores de RCP codificantes de las nuevas CDR a un molde de ADN de una region variable previamente humanizada que se basa en la misma region variable humana, o muy similar (Sata, K. et al., Cancer Research 53:851-856 (1993)). Si no se dispone de una secuencia de ADN similar para uso como molde, se puede construir un acido nucleico que comprende una secuencia codificante de una secuencia de region variable a partir de oligonucleotidos sinteticos (vease, por ejemplo, Kalbinger, F., Protein Engineering 8:971-980 (1993)). Tambien se puede incorporar una secuencia codificante de un peptido senal en el acido nucleico (por ejemplo, en la smtesis, en la insercion en un vector). Si no se dispone de la secuencia del peptido senal natural, se puede usar una secuencia de peptido senal de otro anticuerpo (vease, por ejemplo, Kettleborough, C.A., Protein Engineering 4:773-783 (1991)). Utilizando estos metodos, los metodos aqrn descritos u otros metodos adecuados, se pueden producir facilmente variantes (vease, por ejemplo, el Ejemplo 5). En una realizacion, se pueden mutagenizar regiones variables

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clonadas (por ejemplo, de LDP-02) y se pueden seleccionar secuencias codificantes de variantes con la especificidad deseada (por ejemplo, a partir de una coleccion de fagos; vease, por ejemplo, Krebber y col, EE.UU. 5,5l4,548; Haagenbaam et al., WO 93/06213, publicada el 1 de Abril de 1993)).

Acidos nucleicos y constructos que los contienen

La presente invencion se refiere tambien a acidos nucleicos aislados y/o recombinantes (incluyendo, por ejemplo, esencialmente puros) que contienen secuencias que codifican una globulina humanizada o una cadena ligera o pesada de una inmunoglobulina humanizada de la presente invencion como se ha descrito mas arriba.

Los acidos nucleicos a los que se hace aqrn referencia como "aislados" son acidos nucleicos que han sido separados de los acidos nucleicos del ADN genomico o del ARN celular de su fuente de origen (por ejemplo, tal como existe en las celulas o en una mezcla de acidos nucleicos, tal como una coleccion) e incluyen acidos nucleicos obtenidos por los metodos aqrn descritos o por otros metodos adecuados, incluyendo acidos nucleicos esencialmente puros, acidos nucleicos producidos por smtesis qmmica, por combinaciones de metodos biologicos y qmmicos y acidos nucleicos recombinantes aislados (vease por ejemplo, Daugherty, B.L. et al., Nucleic Acids Res., 19(9): 2471-2476 (1991); Lewis, A.P. y J.S. Crowe, Gene, 101: 297-302 (1991)).

Los acidos nucleicos a los que se hace aqrn referencia como "recombinantes" son acidos nucleicos que han sido producidos por metodologfa de ADN recombinante, incluyendo aquellos acidos nucleicos que son generados por procedimientos que se basan en un metodo de recombinacion artificial, tales como la reaccion en cadena de polimerasa (PCR) y/o clonacion en un vector usando enzimas de restriccion. Los acidos nucleicos "recombinantes" son tambien aquellos que resultan de sucesos de recombinacion que se producen a traves de los mecanismos naturales de las celulas, pero que son seleccionados despues de la introduccion en las celulas de acidos nucleicos disenados para permitir y hacer probable un suceso recombinatorio deseado.

La presente invencion como se ha descrito mas arriba tambien se refiere mas espedficamente a acidos nucleicos aislados y/o recombinantes que comprenden una secuencia de nucleotidos que codifica una inmunoglobulina Act-1 humanizada (es decir, una inmunoglobulina humanizada de la presente invencion en la que la porcion no humana deriva del anticuerpo monoclonal murino Act-1) o cadena del mismo. En una realizacion, la cadena ligera comprende regiones derivadas de la cadena ligera del anticuerpo Act-1, y la cadena pesada comprende tres regiones determinantes de complementariedad derivadas de la cadena ligera del anticuerpo Act-1. Dichos acidos nucleicos incluyen, por ejemplo, (a) un acido nucleico que comprende una secuencia que codifica un polipeptido que comprende la secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena pesada de una inmunoglobulina Act-1 humanizada (por ejemplo, la region variable de la cadena pesada de la Figura 11 (SEQ ID NO:19), la region variable de la cadena pesada de la Figura 9 (SEQ ID NO:15)), (b) un acido nucleico que comprende una secuencia que codifica un polipeptido que comprende la secuencia de aminoacidos de la cadena ligera de la region variable de una inmunoglobulina Act-1 humanizada (por ejemplo, la region variable de la cadena ligera de la Figura 12 (SEQ ID NO:21), la region variable de la cadena ligera de la Figura 7 (SEQ ID NO:12)), (c) un acido nucleico que comprende una secuencia que codifica al menos una porcion funcional de la region variable de la cadena ligera o pesada de una inmunoglobulina Act-1 humanizada (por ejemplo, una porcion suficiente para la union a antfgeno de una inmunoglobulina humanizada que contiene dicha cadena). Debido a la degeneracion del codigo genetico se puede hacer una gama de acidos nucleicos que codifiquen un polipeptido seleccionado. En una realizacion el acido nucleico comprende la secuencia de nucleotidos de la region variable que se indica o sustancialmente como se indica, en la Figura 11 (SEQ ID NO:18), o que se indica, o sustancialmente como se indica en la Figura 12 (SEQ ID NO:20), incluyendo polinucleotidos de cadena doble o sencilla. (Aunque varias figuras pueden ilustrar polipeptidos que son mayores que la region variable (es decir, que incluyen una secuencia codificante de peptido senal o una porcion de una secuencia codificante de region constante), la referencia a la region variable de una figura particular pretende incluir la porcion de region variable de la secuencia mostrada). Los acidos nucleicos aislados y/o recombinantes que cumplen estos criterios pueden incluir acidos nucleicos codificantes de secuencias identicas a las secuencias del anticuerpo Act-1 humanizado o variantes de las mismas segun se ha discutido anteriormente.

Los acidos nucleicos de la presente invencion pueden ser usados en la produccion de inmunoglobulinas humanizadas que tengan especificidad por la integrina a4p7. Por ejemplo, se puede incorporar un acido nucleico (por ejemplo, ADN) codificante de una inmunoglobulina humanizada de la presente invencion en un constructo adecuado (por ejemplo, un vector) para posterior manipulacion de secuencias o para la produccion del polipeptido codificado en celulas hospedantes adecuadas.

Metodo de produccion de inmunoglobulinas humanizadas que tienen especificidad por la integrina a4p7

Otro aspecto de la invencion como se ha descrito mas arriba se refiere a un metodo de preparacion de una inmunoglobulina humanizada que tiene especificidad de union por la integrina a4p7. La inmunoglobulina humanizada puede ser obtenida, por ejemplo, por expresion de uno o mas acidos nucleicos recombinantes codificantes de una inmunoglobulina humanizada como se ha descrito mas arriba que tiene especificidad de union por la integrina a4p7 en una celula hospedante adecuada, por ejemplo.

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Tambien se proporcionan constructos o vectores de expresion adecuados para la expresion de una inmunoglobulina humanizada como se ha descrito mas arriba que tiene especificidad de union por la integrina a4p7. Los constructos pueden ser introducidos en una celula hospedante adecuada y se pueden producir y mantener en cultivo celulas que expresan una inmunoglobulina humanizada de la presente invencion. Las celulas hospedantes adecuadas pueden ser procarioticas, incluyendo celulas bacterianas tales como E. coli, B. subtilis y/u otras bacterias adecuadas, o eucarioticas, tales como celulas fungicas o de levaduras, por ejemplo, Pichia pastoris, especies de Aspergillus, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Neurospora crassa), u otras celulas eucarioticas inferiores, y celulas de eucariotas superiores tales como las de insectos (por ejemplo, celulas Sf9 de insectos (WO 94/26087, O'Connor, publicada el 24 de Noviembre de 1994)) o de mairnferos (por ejemplo, celulas COS, celulas NSO, SP2/0, celulas de ovario de hamster chino (CHO), celulas HuT 78, celulas 293). (Vease, por ejemplo, Ausubel, F.M. et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates y John Wiley & Sons Inc., (1993)).

Se pueden producir celulas hospedantes que producen una inmunoglobulina humanizada como se ha descrito mas arriba que tiene especificidad de union por la integrina a4p7 como sigue. Por ejemplo, se puede insertar un acido nucleico codificante de toda o de una parte de la secuencia codificante de la inmunoglobulina humanizada deseada en un vector de acido nucleico, por ejemplo un vector de ADN, tal como un plasmido, virus u otro replicon adecuado para expresion. Se dispone de una gama de vectores, incluyendo vectores que se mantienen en copia simple o copia multiple, o que se integran en el cromosoma de la celula hospedante.

Los vectores adecuados de expresion pueden contener una serie de componentes, incluyendo aunque sin limitacion, uno o mas de los siguientes: un origen de replicacion; un gen marcador seleccionable; uno o mas elementos de control de la expresion, tales como un elemento de control transcripcional (por ejemplo, un promotor, un potenciador, un finalizador) y/o una o mas senales de traduccion; una secuencia de senal o secuencia lfder para la direccionalizacion a membrana o la secrecion. En un constructo se puede disponer de una secuencia de senal por el vector u otra fuente. Por ejemplo, se pueden usar las senales de transcripcion y/o traduccion de una inmunoglobulina para dirigir la expresion.

Se puede facilitar un promotor para expresion en una celula hospedante adecuada. Los promotores pueden ser constitutivos o inducibles. Por ejemplo, se puede unir de forma operable un promotor a un acido nucleico codificante de una inmunoglobulina o cadena de inmunoglobulina humanizada, de tal modo que dirija la expresion del polipeptido codificado. Se dispone de una gama de promotores adecuados para hospedadores procarioticos (por ejemplo, promotores lac, tac, T3, T7 para E. coli) y eucarioticos (por ejemplo, alcohol deshidrogenasa de levadura (ADH1), SV40, CMV).

Ademas, los vectores de expresion contienen tfpicamente un marcador seleccionable para seleccion de celulas hospedantes portadoras del vector y, en el caso de un vector de expresion replicable, un origen de replicacion. Los genes codificantes de productos que confieren resistencia a antibioticos o a farmacos son marcadores seleccionables comunes y pueden ser usados en celulas procarioticas (por ejemplo, gen S-lactamasa (resistencia a ampicilina), gen Tet para resistencia a tetraciclina) y eucarioticas (por ejemplo, genes de resistencia a neomicina (G418 o geneticina), gpt (acido micofenolico, ampicilina, o higromicina). Los genes marcadores de la dihidrofolato reductasa permiten la seleccion con metotrexato en una gama de hospedadores. Los genes codificantes del producto genico de marcadores auxotroficos del hospedador (por ejemplo, LEU2, URA3, HIS3) son frecuentemente empleados como marcadores seleccionables en levaduras. Se contempla tambien el uso de vectores vmcos (por ejemplo, baculovirus) o de fago y los vectores que son capaces de integrarse en el genoma de la celula hospedante, tales como los vectores retrovmcos. La presente invencion se refiere tambien a celulas portadoras de estos vectores de expresion.

Por ejemplo, se puede introducir un acido nucleico (es decir, uno o mas acidos nucleicos) como se ha descrito mas arriba codificante de las cadenas pesadas y ligeras de una inmunoglobulina humanizada que tiene especificidad de union por la integrina a4p7, o un constructo (es decir, uno o mas constructos) que comprendan dicho(s) acido(s) nucleico(s) en una celula hospedante adecuada mediante un metodo apropiado para la celula hospedante seleccionada (por ejemplo, transformacion, transfeccion, electroporacion, infeccion), de tal forma que el(los) acido(s) nucleico(s) se una(n) operablemente a uno o mas elementos de control de la expresion (por ejemplo, en un vector, en un constructo creado por los procesos celulares, integrado en el genoma de la celula hospedante). Las celulas hospedantes pueden ser mantenidas en condiciones adecuadas para la expresion (por ejemplo, en presencia de inductor, medios adecuados enriquecidos con sales apropiadas, factores de crecimiento, antibiotico, suplementos nutricionales, etc.), mediante las cuales se produce(n) el(los) polipeptido(s) codificado(s). Si se desea, se puede aislar la protema codificada (por ejemplo, anticuerpo Act-1 humanizado) (por ejemplo, de las celulas hospedantes, del medio, de la leche). Este procedimiento incluye la expresion en una celula hospedante de un animal transgenico (vease, por ejemplo, Wo 92/03918, GenPharm International, publicada el 19 de Marzo de 1992).

Se pueden producir protemas de fusion en las que inmunoglobulina como se ha descrito mas arriba o cadena de inmunoglobulina humanizada se une a un resto no inmunoglobulina (es decir, un resto que no aparece en las inmunoglobulinas tal como se encuentran en la naturaleza) en una localizacion N-terminal, en una localizacion C- terminal o interna a la protema de fusion. Por ejemplo se pueden producir algunas realizaciones por insercion de un acido nucleico codificante de secuencias de inmunoglobulinas en un vector de expresion adecuado, tal como un

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vector pET (por ejemplo, pET-15b, Novagen), un vector de fago (por ejemplo, pCANTAB 5 E, Pharmacia), u otro vector (por ejemplo, el vector de fusion pRIT2T Protema A, Pharmacia). El constructo resultante puede ser introducido en una celula hospedante adecuada para expresion. Despues de la expresion se pueden aislar o purificar algunas protemas de fusion de un lisado celular por medio de una matriz de afinidad adecuada (vease, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F.M. et al., eds., Vol. 2, Suppl. 26, pp. 16,4,1-16,7,8 (1991)).

Metodos y composiciones terapeuticos

La invencion como se ha descrito mas arriba proporciona inmunoglobulinas humanizadas que (1) se pueden unir a la integrina a4p7 in vitro y/o in vivo; y/o (2) pueden modular una actividad y/o funcion de la integrina a4p7, tal como (a) la funcion de union (por ejemplo, la capacidad de la integrina a4p7 para unirse a MAdCAM-1, fibronectina y/o VCAM- 1) y/o (b) la funcion de infiltracion leucocitaria, incluyendo el reclutamiento y/o la acumulacion de leucocitos en los tejidos (por ejemplo, la capacidad de inhibir la migracion linfocitaria al tejido de la mucosa intestinal). Preferiblemente, las inmunoglobulinas humanizadas son capaces de unirse selectivamente a a4p7 in vitro y/o in vivo, y de inhibir las interacciones mediadas por a4p7. En una realizacion, una inmunoglobulina humanizada como se ha descrito mas arriba puede unirse a una integrina a4p7, y puede inhibir la union de la integrina a4p7 a uno o mas de sus ligandos (por ejemplo, MAdCAM-1, VCAM-1, fibronectina), inhibiendo asf la infiltracion leucocitaria de los tejidos (incluyendo el reclutamiento y/o la acumulacion de leucocitos en los tejidos), preferiblemente de forma selectiva. Dichas inmunoglobulinas pueden inhibir la adhesion celular de las celulas portadoras de una integrina a4p7 a las celulas endoteliales vasculares en los tejidos mucosales, incluyendo los tejidos asociados al intestino, los organos linfoides o los leucocitos (especialmente linfocitos tales como las celulas T o B) in vitro y/o in vivo. En una realizacion particularmente preferida, una inmunoglobulina humanizada (por ejemplo, Act-1) como se ha descrito mas arriba puede inhibir la interaccion de a4p7 con MAdCAM-1 y/o fibronectina.

Las inmunoglobulinas humanizadas de la presente invencion son utiles en una gama de procedimientos con aplicaciones en investigacion, diagnostico y terapia. Por ejemplo, pueden ser usadas para detectar, aislar y/o purificar la integrina a4p7 o sus variantes (por ejemplo, por purificacion por afinidad u otros metodos adecuados) y para estudiar la estructura (por ejemplo, la conformacion) y la funcion de la integrina a4p7. Las inmunoglobulinas humanizadas de la presente invencion tambien pueden ser usadas en aplicaciones diagnosticas (por ejemplo, in vitro, ex vivo) o para modular la funcion de la integrina a4p7 en aplicaciones terapeuticas (incluyendo las profilacticas).

Por ejemplo, las inmunoglobulinas humanizadas de la presente invencion pueden ser usadas para detectar y/o medir el nivel de integrina a4p7 en una muestra (por ejemplo, tejidos o fluidos corporales, tales como un exudado inflamatorio, sangre, suero, fluido intestinal, sobre celulas portadoras de una integrina a4p7). Por ejemplo, se puede obtener una muestra (por ejemplo, tejido y/o fluido corporal) de un individuo y se puede utilizar un metodo inmunologico adecuado para detectar y/o medir la expresion de integrina a4p7, incluyendo metodos tales como ensayos inmunosorbentes ligados a enzimas (ELISA), incluyendo ensayos de quimioluminiscencia, radioinmunoensayo e inmunohistoqmmica. En una realizacion, se proporciona un metodo de deteccion de una integrina a4p7 seleccionada en una muestra, que comprende poner en contacto una muestra con una inmunoglobulina humanizada de la presente invencion en condiciones adecuadas para la union espedfica de la inmunoglobulina humanizada a la integrina a4p7 y la deteccion de los complejos anticuerpo-integrina a4p7 formados. En una aplicacion del metodo, se pueden usar inmunoglobulinas humanizadas para analizar tejidos normales frente a tejidos inflamados (por ejemplo, de un humano) en cuanto a la reactividad y/o la expresion de integrinas a4p7 (por ejemplo, immunohistologicamente), para detectar asociaciones entre EII u otras condiciones y una mayor expresion de a4p7 (por ejemplo, en tejidos afectados). Las inmunoglobulinas humanizadas de la presente invencion permiten metodos inmunologicos de valoracion de la presencia de integrina a4p7 en tejidos normales frente a tejidos inflamados, a traves de los cuales se puede valorar la presencia de la enfermedad, el progreso de la enfermedad y/o la eficacia de la terapia anti-integrina a4p7 en la enfermedad inflamatoria.

Las inmunoglobulinas humanizadas de la presente invencion pueden ser tambien usadas para modular (por ejemplo, inhibir (reducir o prevenir)) la funcion de union y/o la funcion de infiltracion leucocitaria (por ejemplo, linfocitaria, monocitaria) de la integrina a4p7. Por ejemplo, se pueden administrar inmunoglobulinas humanizadas que inhiben la union de la integrina a4p7 a un ligando (es decir, uno o mas ligandos) segun el metodo en el tratamiento de enfermedades asociadas a la infiltracion leucocitaria (por ejemplo, linfocitaria, monocitaria) de tejidos (incluyendo el reclutamiento /o la acumulacion de leucocitos en los tejidos), particularmente de tejidos que expresan la molecula MAdCAM. Se administra una cantidad efectiva de una inmunoglobulina humanizada de la presente invencion (es decir, una o mas) a un individuo (por ejemplo, un mairnfero, tal como un humano u otro primate) con objeto de tratar dicha enfermedad. Por ejemplo, se pueden tratar enfermedades inflamatorias, incluidas las enfermedades que se asocian a la infiltracion leucocitaria del tracto gastrointestinal (incluyendo el endotelio asociado al intestino), otros tejidos mucosales o tejidos que expresan la molecula MAdCAM (por ejemplo, tejidos asociados al intestino, tales como venulas de la lamina propia del intestino delgado y grueso, y glandula mamaria (por ejemplo, glandula mamaria en lactancia), segun el presente metodo. De forma similar, un individuo que tiene una enfermedad asociada a la infiltracion leucocitaria de tejidos como resultado de la union a celulas (por ejemplo, celulas endoteliales) que expresan MAdCAM-1, puede ser tratado de acuerdo con la presente invencion.

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En una realizacion particularmente preferida, como enfermedades que pueden ser tratadas de acuerdo con esto se incluyen la enfermedad inflamatoria del intestino (EII), tal como colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, ileftis, enfermedad ceKaca, esprue no tropical, enteropatfa asociada a artropatias seronegativas, colitis microscopica o colaginosa, gastroenteritis eosinofflica o saculitis producida tras proctocolectoirna y anastomosis ileoanal.

La pancreatitis y la diabetes mellitus insulino-dependiente y otras enfermedades pueden ser tratadas usando el presente metodo. Se ha descrito que la MAdCAM-1 es expresada por algunos vasos en el pancreas exocrino de ratones NOD (diabeticos no obesos), asf como de ratones BALB/c y SJL. Se ha descrito que la expresion de MAdCAM-1 era inducida en el endotelio de los islotes inflamados del pancreas del raton NOD, y MAdCAM-1 era la adresina predominante expresada por el endotelio de islotes NOD en las etapas tempranas de la insulitis (Hanninen, A., et al., J. Clin. Invest., 92: 2509-2515 (1993)). Ademas, se observo la acumulacion de linfocitos que expresan a4p7 en los islotes, y se implico a la MAdCAM-1 en la union de celulas de linfoma a traves de a4p7 a los vasos de islotes inflamados (Hanninen, A., et al., J. Clin. Invest., 92: 2509-2515 (1993)).

Como ejemplos de enfermedades inflamatorias asociadas a tejidos mucosales que pueden ser tratadas segun el presente metodo se incluyen mastitis (glandula mamaria), colecistitis, colangitis o pericolangitis (conducto biliar y tejido circundante del hngado), bronquitis cronica, sinusitis cronica, asma y rechazo del hospedante por el injerto (por ejemplo, en el tracto gastrointestinal). Como se observa en la enfermedad de Crohn, la inflamacion se extiende frecuentemente mas alla de la superficie de la mucosa, por lo que se pueden tratar las enfermedades inflamatorias cronicas del pulmon que dan lugar a fibrosis intersticial, tales como la pneumonitis por hipersensibilidad, las enfermedades del colageno, la sarcoidosis y otras condiciones idiopaticas.

La inmunoglobulina humanizada es administrada en una cantidad eficaz que inhibe la union de la integrina a4p7 a un ligando de la misma. Para la terapia, una cantidad efectiva sera suficiente para conseguir el efecto terapeutico deseado (incluido el profilactico) (tal como una cantidad suficiente para reducir o evitar la union y/o la senalizacion mediadas por la integrina a4p7, inhibiendo asf la adhesion e infiltracion leucocitaria y/o las respuestas celulares asociadas). La inmunoglobulina humanizada puede ser administrada en una sola dosis o en dosis multiples. La dosificacion puede ser determinada por metodos conocidos en la tecnica y puede depender, por ejemplo, de la edad del individuo, l sensibilidad, la tolerancia y el estado general. Las dosificaciones adecuadas para los anticuerpos pueden ser de aproximadamente 0,1 mg/kg de peso corporal a aproximadamente 10,0 mg/kg de peso corporal por tratamiento.

Segun el metodo, se puede administrar la inmunoglobulina humanizada a un individuo (por ejemplo, un humano) sola o junto con otro agente. Se puede administrar la inmunoglobulina humanizada antes, junto con o a continuacion de la administracion del agente adicional. En una realizacion, se administra mas de una inmunoglobulina humanizada que inhibe la union de integrina a4p7 a sus ligandos. En otra realizacion, se administra un anticuerpo monoclonal, tal como un anticuerpo anti-MAdCAM-1, anti-VCAM-1 o anti-ICAM-1, que inhibe la union de leucocitos a un ligando endotelial, ademas de una inmunoglobulina humanizada de la presente invencion. En aun otra realizacion, se puede administrar un componente adicional farmacologicamente activo (por ejemplo, un compuesto antiinflamatorio, tal como sulfasalazina, otro compuesto antiinflamatorio no esteroideo o un compuesto antiinflamatorio esteroideo) junto con una inmunoglobulina humanizada de la presente invencion.

Son posibles diversas vfas de administracion, incluyendo, aunque sin limitarse necesariamente a ellas, la parenteral (por ejemplo, inyeccion intravenosa, intraarterial, intramuscular, subcutanea), oral (por ejemplo, dietetica), topica, inhalatoria (por ejemplo, inhalacion intrabronquial, intranasal u oral, gotas intranasales), o rectal, dependiendo de la enfermedad o de la condicion que haya que tratar. La administracion parenteral es un modo preferido de administracion.

La formulacion variara segun la via de administracion seleccionada (por ejemplo, solucion, emulsion). Se puede preparar una composicion apropiada, que contiene el anticuerpo humanizado que ha de ser administrado en un vehroulo o portador fisiologicamente aceptable. Para soluciones o emulsiones, como vehfculos adecuados se incluyen, por ejemplo, soluciones, emulsiones o suspensiones acuosas o alcoholicas/acuosas, incluida la solucion salina y los medios tamponados. Como vehfculos parenterales se pueden incluir solucion de cloruro de sodio, dextrosa Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, lactato Ringer o aceites fijos. Como vehfculos intravenosos se pueden incluir varios aditivos, conservantes o reponedores de fluidos, nutrientes o electrolitos (vease, en general, Remington's Pharmaceutical Sciences, 17a edicion, Mack Publishing Co., PA, 1985). Para inhalacion, el compuesto puede ser solubilizado y cargado en un dispensador adecuado para administracion (por ejemplo, un atomizador, nebulizador o dispensador de aerosol presurizado).

Ejemplos

La presente invencion sera ahora ilustrada mediante los siguientes ejemplos, que no pretenden ser limitantes en modo alguno.

Como se describe en el Ejemplo 1, se purifico el anticuerpo murino Act-1 y se realizo el analisis de la secuencia del anticuerpo. Se clonaron por PCR y secuenciaron los ADNc codificantes de las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas. La secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena ligera kappa (Vl) of Act-1 fue

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tambien determinada por secuenciacion de protemas y se vio que se correspondfa exactamente con la secuencia de aminoacidos derivada de la secuencia de ADN del gen Vl. La mayor parte de la secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena pesada (Vh) ha sido determinada por la secuencia proteica y esta secuencia se corresponde tambien con la secuencia de aminoacidos deducida de la secuencia de ADN del gen Vh. Estos resultados indican que las regiones variables correctas del Act-1 de raton eran clonadas a partir de la lmea celular de hibridoma. Se produjeron anticuerpos Act-1 quimericos funcionales que confirmaron que se habfan clonado las secuencias correctas. Concretamente, se unieron los ADN codificantes de las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas del Act-1 de raton a ADN codificantes de las regiones constantes de la cadena ligera kappa humana y de las cadenas pesadas gamma-1 o gamma-4 humanas, respectivamente. Tambien se utilizo el anticuerpo quimerico en un analisis comparativo con un Acm Act-1 humanizado (Acm Act-1 LDP-02 reformado).

Para crear un anticuerpo Act-1 humanizado que se une bien a la integrina a4p7, se disenaron regiones variables humanas reformadas (Ejemplo 2). Con objeto de ayudar en el procedimiento de diseno, se construyo un modelo molecular de las regiones variables del Act-1 de raton. Las regiones del anticuerpo Act-1 murino directamente implicadas en la union al antfgeno, las regiones determinantes de complementariedad o CDR, fueron injertadas en regiones variables humanas seleccionadas. Se hicieron unos pocos cambios dentro de las regiones de marco (RM) de las regiones variables humanas. Las regiones variables reformadas del Act-1 humano inclman un unico cambio de aminoacido en las RM de la region variable de la cadena ligera humana seleccionada y cinco cambios de aminoacidos en las RM de la region variable de la cadena pesada humana seleccionada, cada uno de los cuales cambiaba el resto humano original al correspondiente resto murino.

Tal como se describe en el Ejemplo 3, se construyeron secuencias de ADN codificantes de estas regiones variables del Act-1 humano reformadas y se unieron a secuencias de ADN codificantes de regiones constantes humanas, y se utilizaron los acidos nucleicos resultantes para producir inmunoglobulina Act-1 humanizada. El anticuerpo Act-1 humanizado fue expresado en celulas de mairnfero (Ejemplo 3), y estudiado en cuanto a la union a la integrina a4p7 humana y en comparacion con el anticuerpo Act-1 de raton (Ejemplo 4). Tal como se muestra en la Tabla 5, el anticuerpo Act-1 humanizado retema especificidad por el epitopo reconocido por el Act-1 murino y mostraba afinidad de union inesperadamente mejor en comparacion con el anticuerpo murino nativo.

Se identificaron varias variantes del anticuerpo Act-1 humanizado en el procedimiento de diseno (Ejemplos 2 y 5). Por ejemplo, se hicieron cambios adicionales en una o mas de las siguientes posiciones: mutante de cadena ligera M4V (mutacion Met ^ Val en la posicion 4), mutante de cadena pesada R38K (mutacion Arg ^ Lys en la posicion 38), mutante de cadena pesada A40R (mutacion Ala ^ Arg en la posicion 40). Ademas, se encontro un mutante de cadena pesada I73T (retromutacion Ile ^ Th en la posicion 73), que restauraba la posicion 73 al resto de treonina humana, en esta posicion en la region de marco humana. Se puede llevar a cabo la introduccion de uno o mas de estos cambios en una sola cadena o varias combinaciones de estos cambios en mas de una cadena.

Ejemplo 1 Clonacion de las regiones Vh y Vl de Act-1, y construccion y expresion de una inmunoglobulina quimerica Act-1 murina-humana

Clonacion de las regiones Vh y Vl de Act-1

Se obtuvo ARN de celulas de hibridoma productoras de anticuerpo monoclonal Act-1 (Lazarovits, A.I. et al., J. Immunol., 133(4): 1857-1862 (1984); suministradas por A.I. Lazarovits y R.B. Colvin)) usando Reactivo TRIzol (Gibco/BRL) siguiendo el protocolo sugerido por el fabricante.

Se amplificaron las regiones variables de cadena pesada y ligera transcritas por reaccion en cadena de polimerasa (PCR) utilizando un estuche Ig-Prime (Novagen) segun el protocolo sugerido por el fabricante. Para explicarlo brevemente, se hizo una transcripcion inversa de 1,5 |jg ARN total a ADNc en una reaccion que contema 2,0 jl de tampon 5X MMLV (5X = Tris-HCl 250 mM, pH 8,3 a 25°C, KCl 375 mM, MgCh 15 mM), 1,0 jl de DTT (ditiotreitol) 100 mM, 0,5 jl de mezcla de dNTP 10 mM (10 mM de cada de dATP, dCTP, dTTP, dGTP), 0,5 jl de oligo dT (1 jg/jl), 0,25 jl de BSA acetilada (4 mg/ml), 1,0 jl de cebador Ig-3' apropiado (10 pmol/jl), 0,5 jl de Transcriptasa Inversa MMLv (200 unidades/jl) y agua libre de RNasa anadida hasta un volumen total de 10 jl. La mezcla se incubo durante 5 minutos a 37°C, 30 minutos a 42°C, y 5 minutos a 99°C. Cada cebador-Ig-3' se utilizo en una reaccion aparte.

Se amplificaron las regiones variables a partir del material inversamente transcrito segun el protocolo del fabricante. Resumiendo, se mezclaron 8 jl del material inversamente transcrito con 4 jl de dNTPs 2,5 mM, 5 jl de tampon de reaccion 10X (10X = Tris-HCl 100 mM, pH 8,8 a 25°C, KCl 500 mM, MgCh 15 mM, 1% de Triton X-100), 2,5 jl de cebador lfder Ig-5' (10 pmol/jl) (cada cebador lfder Ig-5' fue usado en una reaccion PCR aparte), 0,25 jl (1,25 unidades) de ADN polimerasa AmpliTaq® (Perkin-Elmer), y agua hasta un volumen total de 50 jl.

Para las amplificaciones con los cebadores 5' MuIgVH5' -A, MuIgVH5' -B, MuIgKVL5' -A, y MuIg*VL5'-B, los parametros de ciclo eran 35 ciclos de 1 minuto, 94°C; 1 minuto, 50°C; 2 minutos, 72°C; seguidos de una extension final de 6 minutos a 72°C. Se utilizaron las mismas condiciones de reaccion para los demas cebadores 5', excepto por la temperatura de reasociacion, que se elevo a 60°C.

La region variable de cadena pesada fue exitosamente amplificada usando MuIgGVH3'-2 o MuIgMVH3'-1 como cebador 3', y MuIgVH5'-B o MuIgVH5'-E como cebadores 5'. La region variable de la cadena ligera fue exitosamente amplificada usando MuIgKVi_3'-1 como cebador 3' y MuIgKVi_5'-G como cebador 5'.

Las secuencias de estos cebadores son como se indica a continuacion:

5 MuIgGVH3' -2 (SEQ ID NO:56):

5'-CCC AAG CTT CCA GGG RCC ARK GGA TAR ACI GRT GG

MuIgMVH3' -1 (SEQ ID NO:57):

5'-CCC AAG CTT ACG AGG GGG AAG ACA TTT GGG AA

MuIgVH5' -B (SEQ ID NO:58):

10 5'-GGG AAT TCA TGR AAT GSA SCT GGG TYW TYC TCT T

MuIgVH5'-E (SEQ ID NO:59) :

5'-ACT AGT CGA CAT GAA GWT GTG GBT RAA CTG GRT MuIgKVi_3' -1 (SEQ ID NO:60) :

5'-CCC AAG CTT ACT GGA TGG TGG GAA GAT GGA

15 MuIg*Vi_5' -G (SEQ ID NO:61) :

5'-ACT AGT CGA CAT GGA TTT WCA RGT GCA GAT TWT CAG CTT

Los fragmentos amplificados fueron purificados por gel de agarosa y ligados en el vector pT7Blue T (Novagen) suministrado con el kit Ig-Prime, y se utilizo la mezcla de ligacion para transformar celulas competentes NovaBlue facilitadas con el kit, segun el protocolo del fabricante.

20 Se secuenciaron las colonias blancas que conteman insertos del tamano apropiado usando cebador del promotor T7 y cebador U-19mero, que reasocian en lados opuestos del inserto, justo fuera del sitio de policlonacion del vector pT7Blue. Se realizo la secuenciacion sobre ADN miniprep usando un kit de ADN polimerasa T7 Sequenase (USB/Amersham Life Science), segun el protocolo recomendado por el fabricante.

En la Figura 1, se muestra la secuencia de ADN de consenso (SEQ ID NO:1) de varios clones de region variable de

25 cadena pesada independientes y la secuencia deducida de aminoacidos (SEQ ID NO:2). Los cebadores degenerados dieron lugar a alguna degeneracion en la secuencia. El codon de iniciacion es la Met codificada por los nucleotidos 13-15, el sitio pronosticado de escision por peptidasa del lfder esta entre la Ser codificada por los nucleotidos 67-69 y la Gln codificada por los nucleotidos 70-72 (codificando los nucleotidos 13-69 el peptido lfder). Se muestra una porcion de la region constante murina, que empieza en la alanina codificada por los restos 433-435.

30 En la Figura 3 se muestra la secuencia de ADN (SEQ ID NO:5) y la secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO:6) de varios clones de region variable de cadena ligera independientes. A diferencia de la region variable de la cadena pesada, las secuencias amplificadas no eran degeneradas, probablemente debido a que los cebadores utilizados no eran muy degenerados y a que la region variable fue amplificada a partir de solo un unico par de cebadores.

Construccion de un gen quimerico de cadena pesada

35 Se produjo un gen codificante de un gen quimerico de cadena pesada murino-humano. La fuente de la region constante de cadena pesada humana era un clon que contema una region constante gamma uno (y1) humana de tipo salvaje (obtenida del Dr. Herman Waldmann (Universidad de Oxford); un constructo designado 3818 que comprende el gen de cadena pesada anti-CD18 en un vector de expresion pEE6 (Celltech). La region constante corresponde a la del gen de cadena pesada CD18 humanizado clonado en pEE6.hCMV segun describen Sims, M.J.

40 et al., J. Immunol., 151 (4): 2296-2308 (1993) y WO 93/02191, publicada el 4 de febrero de 1993, cuyas ensenanzas son aqrn cada una incorporada a modo de referencia en su totalidad. Las secuencias codificantes de la region variable y constante de la cadena pesada (gamma uno de tipo salvaje) del anticuerpo anti-CD18 humanizado fueron liberadas del vector de expresion por digestion con HindIII y EcoRI. El fragmento de 1.421 pares de bases que contema el gen de cadena pesada fue recuperado y subclonado en los sitios HindIII y EcoRI de pCR-Script™

45 (Stratagene) para dar un plasmido denominado pCR-CD18H. Un sitio de restriccion SpeI se localiza en la union entre la region variable y la region constante en el gen de la cadena pesada de anti-CD18. pCR-CD18H se digirio por restriccion con HindIII y Spe I para liberar la region variable de la cadena pesada. Esta region variable se reemplazo con la region variable de Act-1 de raton generada como sigue.

Se sintetizaron dos cebadores para incorporar nuevos sitios de restriccion- Estos cebadores eran:

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cebador 5' (SEC :d ir ; 41);

Hind ITT

5'-T[AA GCT T] CC GCC ATG GGA TGG AGC Cebador 3J (SEC ID N*; 42) :

Spe I

5'-GGT GAG [ACT ACT] GCC TTG ACC CCA G

Las negrillas indican los nucleotidos en los cebadores que difieren de la secuencia del molde. Se utilizo un clon independiente de cadena pesada del Act-1 de raton denominado H2B#34, con la secuencia nucleotfdica (SEQ ID NO:3) y la secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO:4) presentada en la Figura 2, como molde con los anteriores cebadores 5' y 3' para amplificar una region variable de raton introduciendo concomitantemente un sitio Hindlll 5' del codon de iniciacion y un sitio Spe I justo 3' de la region J. El fragmento de PCR se subclono directamente en pCR- Script™ dando lugar al plasmido pCR-mACT1HV, y se confirmo la secuencia correcta. Se libero entonces el fragmento a partir de pCR-mACT1HV por digestion con Hindlll y Spe I, y se inserto en los sitios Hindlll y Spe I de pCR-CD18H en lugar de la region variable anti-CD18 para dar pCR-mhACT1Hchi. Se libero entonces el gen quimerico de cadena pesada (variable de Act-1 de raton mas constante de gamma uno humana) a partir de pCR- mhACTIHchi con Hindlll y EcoRI y se retroclono en el vector pEE6hCMV-B, que contema el promotor hCMV, para dar un constructo denominado pEE6mhACT1Hchi.

Construccion de un gen quimerico de cadena ligera

Se construyo un gen de cadena ligera murino-humano de una forma similar a la cadena pesada. Sin embargo, en el caso de la cadena ligera quimerica, se incluyo por ingenieria un nuevo sitio de restriccion, Kas I, en el constructo por amplificacion por PCR de un fragmento de region variable, utilizando uno de los clones de region variable de cadena ligera del Act-1 de raton, denominado KG#87 como molde, y por amplificacion por PCR de una region constante de cadena ligera kappa usando un constructo que contema un gen de cadena ligera kappa anti-CD18 humanizada como molde (obtenido del Dr. Herman Waldmann (Universidad de Oxford); constructo denominado 3819 que contiene una cadena ligera anti-CD18 humanizada en el vector de expresion pEE12). La region constante corresponde a la del gen de cadena ligera CD18 humanizada clonado en pEE12 segun describen Sims, M.J. et al., J. Immunol., 151 (4): 2296-2308 (1993) y WO 93/02191, publicada el 4 de febrero de 1993.

Los cebadores para la region variable eran:

Cebador 5' (SEC ID N°: 43):

Hindlll

6* -TULA GCT TlCC GCC ATG AAG TTG CCT Cebador S' (SEC IDF: 44} r Kas I

5'-[GGC GCC] GCA TCA GCC CGT TTT

Las negrillas indican nucleotidos en el cebador que difieren de los del molde. Los dos cambios de nucleotidos en la region codificante, T ^ G en la posicion 423 y A ^ G en la posicion 426 en la Figura 3, para crear el sitio Kas I son silenciosas y no cambian la secuencia de aminoacidos.

Los cebadores para la region constante kappa eran:

Cebador 5J (SEC ID N*: 45):

Ka& I

-C[OG CGC C]AT CTG TCT TCA TC Cebador 3' (SEC ID N*: 46):

Hindm

5'-[AAG CTT] CTA ACA CTC TCC

Las regiones variables y constantes de la cadena ligera fueron amplificadas por separado con respectivos moldes y cebadores, y los productos de PCR fueron individualmente subclonados en pCR-Script™ para confirmar la secuencia. Cada fragmento fue entonces liberado del vector por digestion con Hindlll y Kasl, purificado en gel y triplemente ligado en el sitio Hindlll del vector de expresion 3819 pEE12, del que se habfa separado el gen de cadena ligera anti-CD18 humanizado por digestion con Hindlll. El constructo resultante se denomina pEE12mhACT1Lchi.

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Expresion de una inmunoglobulina quimerica

Para la construccion de un vector de expresion que contiene genes de cadenas quimericas tanto ligeras como pesadas, se libero todo el gen de cadena pesada mas el promotor CMV del vector de expresion pEE6 (pEE6mhACT1Hchi) por digestion con BglII y BamHI. Este fragmento fue entonces ligado en el sitio BamHl del vector de expresion del gen de cadena ligera pEE12 (pEE12mhACT1Lchi) dando lugar a un plasmido simple denominado pEE12mhLHchi, que contiene tanto el gen de cadena ligera quimerica como el gen de cadena pesada quimerica, cada uno bajo el control de un promotor CMV independiente.

Los vectores de expresion pEE6hCMV-B y pEE12 y el sistema de amplificacion genica de la glutamina sintetasa Celltech han sido descritos previamente (veanse, por ejemplo, WO 86/05807 (Celltech), WO 87/04462 (Celltech), WO 89/01036 (Celltech), EP 0 323 997 B1 (Celltech), y WO 89/10404 (Celltech).

Para la expresion transitoria del anticuerpo quimerico, se transfectaron 20 |jg de pEE12mhLHchi en celulas COS-7 (American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 20852) por electroporacion como se indica a continuacion. Se recogieron celulas COS-7 que credan en fase logantmica de matraces de cultivo de tejidos por tratamiento con tripsina-EDTA. Las celulas fueron lavadas una vez en solucion salina tamponada con fosfato (PBS) y una vez con solucion de sales equilibrada de Hank (HBSS), y resuspendidas a una concentracion de 1,5 x 107 celulas por ml de HBSS. Se mezclaron 1,2 x 107 celulas en 0,8 ml de HBSS con 20 jg del ADN plasmfdico y se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente. La mezcla de ADN/celulas se transfirio entonces a una cubeta de electroporacion de 0,4 cm y se aplico corriente a 250 V, 960 jF con un Gene-Pulser Bio-Rad. Despues de una incubacion post-electroporacion de 10 minutos a temperatura ambiente, se transfirieron las celulas a 20 ml de medio de cultivo (medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) mas 10% de FCS) y se cultivaron en un matraz de cultivo de tejidos de 162 cm2 (Costar). Al cabo de 5 dfas, se recogio el sobrenadante del cultivo de celulas y se estudio en cuanto a la capacidad para tenir celulas HuT 78, que expresan la integrina a4p7. Las celulas HuT 78 (una lmea de linfoma de celulas T humanas) pueden obtenerse de la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, N° de Acceso ATCC TIB 161.

Se incubaron 100 jl de sobrenadante de cultivo de celulas COS-7 con simulacro de transfeccion, anticuerpo Act-1 murino purificado (10 jg/ml), o los anticuerpos control irrelevantes de isotipo parejo purificados respectivos para raton (IgG1 de raton, Kappa (MOPC21), 10 ug/ml de Sigma) y para humano (IgG1 humana, Kappa, 10 ug/ml de Sigma) con 1 X 105 celulas HuT 78 sobre hielo durante 30 minutos. Las celulas se lavaron dos veces con tampon enfriado en hielo consistente en PBS que contema 2% de suero de ternera fetal (FCS) y 0,01% de azida sodica (tampon FACS). Las celulas fueron entonces incubadas durante 30 minutos en hielo con el anticuerpo secundario fluorescente apropiado (bien el fragmento F(ab')2 de IgG(H+L) de cabra anti-raton AffiniPure conjugado a fluorescema (FITC) (Jackson ImmunoResearch) o bien el fragmento F(ab')2 de IgG(H+L) de cabra anti-humano AffiniPure conjugado a fluorescema (FITC) (Jackson ImmunoResearch)). Despues de 30 minutos sobre hielo, las celulas fueron lavadas dos veces con tampon FACS, resuspendidas en 300 ml del mismo tampon, y analizadas por citometna de flujo en un FACscan Becton Dickinson. La Figura 4A muestra la tincion del Acm Act-1 murino en comparacion con un anticuerpo control irrelevante de raton de isotipo parejo, MOPC 21 (IgG1, kappa). La Figura 4B muestra la tincion con anticuerpo Act-1 quimerico de celulas HuT 78 en comparacion con un anticuerpo control irrelevante humano de isotipo parejo (IgG1, kappa), y el sobrenadante de celulas COS-7 con simulacro de transfeccion. De este modo, en comparacion con la tincion producida por el anticuerpo Act-1 murino, el anticuerpo quimerico tenia las celulas HuT 78 de forma similar. En conjunto, estos datos demuestran que las secuencias apropiadas para las regiones variables del Act-1 de raton eran clonadas y expresadas con exito.

Analisis de la secuencia de aminoacidos

Se llevo a cabo el analisis de la secuencia de aminoacidos sobre cadenas pesadas y ligeras de Act-1 murino purificado para confirmar las identidades de los ADNc para las regiones variables de cadena ligera y pesada aisladas del hibridoma. Se llevo a cabo para la cadena ligera como sigue:

Se redujo Act-1 murino (5 mg/ml) con DTT 2 mM durante 2 horas a 37°C en borato de sodio 0,3 M, cloruro de sodio 0,15 M bajo nitrogeno. Se hizo entonces la solucion 10 mM en yodoacetamida y se incubo durante 4 h a temperatura ambiente. El analisis SDS-PAGE en condiciones no desnaturalizantes confirmo que las protemas eran reducidas cuantitativamente. La solucion de protemas fue entonces dializada de forma extensiva en PBS y se aplico una almuota a una columna Superdex 75 (16/60, Pharmacia) (vuelta 1). La cadena pesada y la ligera coeluyeron de esta columna con un volumen de elucion correspondiente al del volumen de exclusion, lo que indica que las dos cadenas aun se manteman juntas. Se hizo entonces otra almuota 8 M en urea y se llevo a una columna Superdex 75 en condiciones desnaturalizantes (urea 6M) (vuelta 2). Ambas cadenas coeluyeron una vez mas en el volumen de vado, probablemente debido al desplegamiento. El analisis SDS-PAGE confirmo la presencia de ambas cadenas en las dos muestras eluidas de las 2 vueltas de filtracion por el gel. Estas muestras fueron sometidas a analisis de secuencia N-terminal (Commonwealth Biotechnologies, Inc.) con el siguiente resultado:

Muestra 2: DWVTQTPLSLPVSFDSQV (SEC ID N" ; 47)

Muestra 1: dwvtQTPLSL (SEC lu r; 48}

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La secuencia que se obtuvo corresponde al extremo N de la cadena ligera madura deducida de la secuencia de ADN. Este y otros intentos de obtener la secuencia de la cadena pesada indicaron que su extremo N estaba probablemente bloqueado. Por lo tanto, el analisis de la secuencia de aminoacidos de los fragmented peptidicos internos fue realizado sobre la cadena pesada.

Para simplificar la secuenciacion de aminoacidos internos, se produjeron fragmented F(ab)'2 del anticuerpo por escision con pepsina. Se escindio el Act-1 murino con pepsina a una razon de anticuerpo:pepsina de 1:200 durante 2 h a 37°C en citrato de sodio 0,1 M, pH 3,0. La reaccion se complete, segun se valoro por analisis SDS-PAGE. La protema fue entonces purificada a traves de columnas de protema G y protema A. Se redujo entonces la muestra y se alquilo como se ha descrito antes y se separo el fragmento de la cadena pesada de la cadena ligera por SDS- PAGE preparatoria (15%). Se escindio el fragmento de la cadena pesada y se electroeluyo en 1 ml de SDS al 0,1% haciendo correr el tampon durante 2 horas. Se escindio esta muestra con 2 ng de Asp-N endoproteinasa durante 30 minutos y se separaron los fragmentos por SDS-PAGE (17,5%). Los productos de la digestion fueron pasivamente eluidos en Hepes 0,1 M, pH 8,0, 0,1 % de SDS durante la noche y sometidos a analisis de secuencia N-terminal (Commonwealth Biotechnologies, Inc.).

La secuencia obtenida de un fragmento de 17 kDa era DYAIDYWG (SEQ ID NO:49), que estaba presente en el clon para la cadena pesada (Figura 1; la secuencia AIDY corresponde al comienzo de la region JH4).

Ejemplo 2 Modelacion molecular de las regiones variables del Act-1 de raton

Con objeto de ayudar en el diseno de las regiones variables injertadas con CDR, se produjo un modelo molecular de las regiones variables del Act-1 de raton. La modelacion de las estructura de las familias de protemas bien caracterizadas con inmunoglobulinas fue realizada usando los metodos establecidos para modelacion por homologfa. La modelacion molecular fue llevada a cabo usando una estacion de trabajo IRIS 4D de Silicon Graphics, que funcionaba bajo el sistema operativo UNIX, el paquete de modelacion molecular QUANTA (Polygen Corp., Waltham, MA), y la base de datos cristalograficos Brookhaven de estructuras proteicas resueltas. Como primera etapa se modelaron las regiones de marco (RM) de las nuevas regiones variables en RM de regiones variables de inmunoglobulinas similares estructuralmente resueltas. Mientras que las cadenas laterales de aminoacidos identicas fueron mantenidas en su orientacion original, las cadenas laterales mutadas fueron sustituidas usando el procedimiento de maximo solapamiento para mantener los angulos chi como en el anticuerpo Act-1. La mayor parte de las CDR de las nuevas regiones variables fueron modeladas en base a las estructuras canonicas para CDR (Chothia, C., y A.M. Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia, C., et al., Nature 342:877-883 (1989); Tramontano, A., et al., J. Mol. Biol. 225:175-182 (1990); Chothia, C., et al., J. Mol. Biol. 227:799-817 (1992)). En casos tales como CDR3 de la region variable de la cadena pesada, en donde no existen estructuras canonicas reconocidas, se modelo el bucle de CDR en base a la estructura similar de bucle presente en cualquier protema estructuralmente resuelta. Finalmente, con objeto de eliminar los contactos atomicos no favorables y de optimizar las interacciones de Van der Waals y electrostaticas, se sometio el modelo a minimizacion de energfa usando el potencial CHARMm (Brooks, B.R., J. Comp. Chem. 4:187-217 (1983)) ejecutado en QUANTA.

Para las regiones variables del Act-1 de raton, las RM de la region variable de la cadena ligera fueron modeladas sobre las RM del fragmento Fab del anticuerpo monoclonal de raton 4-4-20 (Herron, J.N., et al., Proteins. Structure, Function y Genetics 5:271-280 (1989)). Las Rm de la region variable de cadena pesada fueron modelados sobre las RM del fragmento Fab del anticuerpo monoclonal de raton D11.15 (Chitarra, V., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 90:7711-7715 (1993)). Las cadenas laterales de aminoacidos que difenan entre el anticuerpo Act-1 de raton y las regiones variables sobre las que se baso el modelo estaban sustituidas. La cadena ligera del Fab del anticuerpo 4-420 fue entonces superpuesta a la cadena ligera de D11.15 alineando en el espacio los restos 35-39, 43-47, 84-88 y 98-102 (segun definen Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edicion, Ministerio de Salud y Servicios Humanos de los EE.UU., Imprenta del Gobierno (1991)), con objeto de poner las dos regiones variables heterologas (es decir, la region variable de cadena ligera kappa basada en 4-4-20 y la region variable pesada basada en D11.15) en la orientacion correcta una con respecto a la otra.

La CDR1 (L1) de la region variable de la cadena ligera de Acm Act-1 se ajustaba al subgrupo canonico L1 4, segun propusieron Chothia, C., et al., Nature 342:877-883 (1989). El bucle L1 del Fab 4-4-20 de raton (vease lo anterior) era identico en cuanto a longitud de aminoacidos, similar en cuanto a secuencia de aminoacidos y tambien se ajustaba al subgrupo canonico 4. En consecuencia, el bucle L1 fue modelado sobre el bucle L1 de Fab 4-4-20. De forma similar, CDR2 (L2) y CDR3 (L3) de la region variable de cadena ligera del Acm Act-1 se correspondfa tanto a sus respectivas estructuras de bucle del subgrupo canonico 1 como a las correspondientes CDR de Fab 4-4-20. En consecuencia, los bucles L2 y L3 de la region variable de cadena ligera kappa de Act-1 fueron modelados sobre las CDR L2 y L3 de Fab 4-4-20.

CDR1 (H1) de la region variable de cadena ligera del Acm Act-1 se ajustaba al subgrupo canonico H1 1, definido por Chothia, C., et al., Nature 342:877-883 (1989), al igual que el correspondiente bucle H1 del Acm D11.15 de raton (vease lo anterior). Mas aun, el bucle de la CDR1 del Acm D11.15 era identico en cuanto a longitud y muy similar en cuanto a secuencia de aminoacidos a H1 del Acm Act-1. En consecuencia, como con la cadena ligera, este bucle fue modelado sobre el bucle CDR1 de la region variable pesada en la que se basaba este modelo. La CDR2 de la region variable de cadena pesada (H2) era mas difteil de definir, pero parecfa corresponder al subgrupo carbonico

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H2 2. Una vez mas, el bucle H2 del anticuerpo D11.15 se correspondfa tambien al mismo subgrupo canonico y era muy similar en secuencia de aminoacidos y, por lo tanto, el bucle H2 del Acm Act-1 fue modelado sobre el bucle H2 de D11.15.

Tal como se ha discutido anteriormente, las CDR3 de las regiones variables de cadena pesada son altamente variables y no pueden dividirse en grupos estructurales identificables. Para modelar los bucles H3, se identifican los bucles de identica longitud y similar secuencia de aminoacidos -preferiblemente de otro anticuerpo- y se usan como base para el bucle modelado. Hubo tres bucles, todos bucles H3 de tres anticuerpos, que se correspondfan con la CDR3 de Act-1 en cuanto al tamano del bucle. Despues de estudiar las tres estructuras del bucle en cuanto a discordancias estericas en el modelo, el bucle H3 del anticuerpo humano Pot (Fan, Z.C., et al., J. Mol. Biol. 228:188207 (1992)) fue elegido para modelar el bucle H3 del Acm Act-1. Despues de ajustar todo el modelo en cuanto a discordancias estericas obvias, fue sometido a minimizacion de energfa, ejecutada en QUANTA.

Diseno de las regiones variables injertadas con CDR

La primera etapa en el diseno de regiones variables injertadas con CDR es la seleccion de las regiones variables de cadenas ligeras y pesadas humanas que serviran como base de las regiones variables humanizadas. Se estudiaron y compararon dos aproximaciones para seleccionar las regiones variables humanas. En una aproximacion, las regiones variables humanas fueron seleccionadas entre las secuencias consenso para los diferentes grupos de regiones variables humanas (Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edicion, Ministerio de Salud y Servicios Humanos de los EE.UU., Imprenta del Gobierno de los EE.uU (1991)). Se compararon las regiones variables de cadena ligera y pesada de roedores con las secuencias consenso humanas y se seleccionaron las secuencias consenso de cadena ligera y pesada humanas mas similares entre los seis subgrupos de regiones variables de cadena ligera lambda humanas, los cuatro subgrupos de regiones variables de cadena ligera kappa humanas y los tres subgrupos de regiones variables de cadena pesada humana (vease Kettleborough, C.A., Protein Engineering 4:773-783 (1991)). En otra aproximacion, las regiones variables humanas fueron seleccionadas entre todas las secuencias publicadas para regiones variables humanas (Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edicion, Ministerio de Salud y Servicios Humanos de los EE.UU., Imprenta del Gobierno de los EE.UU (1991)). Las secuencias de aminoacidos de las regiones variables de cadena ligera y pesada de roedores fueron comparadas con secuencias humanas y se seleccionaron las regiones variables humanas con un grado alto de similitud con las regiones variables de roedores. Se pueden usar las regiones variables de cadena ligera y pesada humanas del mismo anticuerpo humano para asegurar que las dos regiones variables se ensamblen apropiadamente (Queen, C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 86:10029-10033 (1989)). Sin embargo, tal como se describe aqrn, las regiones variables de cadena ligera y pesada humanas seleccionadas como moldes derivaban de dos diferentes anticuerpos humanos. de este modo era posible seleccionar regiones variables humanas con un mayor grado de similitud con las regiones variables humanas con un mayor grado de similitud con las regiones variables de roedores. Hay muchos ejemplos exitosos de anticuerpos injertados con CDRR basados en regiones variables derivadas de dos diferentes anticuerpos humanos. Uno de los dos ejemplos mejor estudiados es el anticuerpo CAMPATH-1 humano reformado (Riechmann, L., et al., Nature 332:323-327 (1988)).

Para disenar regiones variables de ACT-1 humano reformado, se compararon las regiones variables del ACT-1 de raton con las secuencias consenso para todos los subgrupos de regiones variables de raton y humanas (Kabatt, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edicion, Ministerio de Salud y Servicios Humanos de los EE.UU., Imprenta del Gobierno de los EE.UU (1991)). Los resultados estan resumidos en las tablas 1 y 2.

La region variable de la cadena ligera del Act-1 de raton era muy similar a la secuencia consenso para el subgrupo II de cadena ligera kappa de raton, con una identidad global del 83,9% y una identidad del 87,5% en las RM solamente (Tabla 1). Con respecto a las secuencias del anticuerpo humano, la region variable de la cadena ligera del Act-1 de raton era muy similar a la secuencia consenso para el subgrupo II de la cadena ligera kappa humana, con una identidad global del 72,3% y una identidad del 78,8% en las RM solamente (Tabla 1).

Tabla 1. Comparacion de la region variable de la cadena ligera kappa del Act-1 de raton con las secuencias consenso para los subgrupos de las regiones variables de la cadena ligera kappa de raton y humanas. Se comparo la secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena ligera kappa de raton y humanas, con y sin las secuencias de las CDR. Se dan los porcentajes de similitud y de identidad con los subgrupos de raton y humanos mas similares.

5

10

15

20

25

30

35

40

Region variable de raton o humana

Subgrupo de Kabat Region variable completa o RM solo Porcentaje de similitud Porcentaje de identidad

Raton

II Completa 91,07 83,93

RM solo 95,00 87,50

Humana

II Completa 83,93 72,32

RM solo 90,00 78,75

La region variable de la cadena pesada del Act-1 de raton era muy similar a la secuencia consenso para el subgrupo IIb de la cadena pesada de raton, con una identidad global del 83,5% y una identidad del 94,3% en las RM solamente (Tabla 2). Con respecto a las secuencias del anticuerpo humano, la region variable de la cadena pesada del Act-1 de raton era muy similar a la secuencia consenso para el subgrupo I de cadena pesada humana, con una identidad global del 68,6% y una identidad del 75,9% en las RM solamente (Tabla 2). Estos resultados confirman que las regiones variables del Act-1 de raton parecen ser tfpicas de las regiones variables de raton. Los resultados tambien indican los subgrupos de las regiones variables humanas que pueden servir como buenas fuentes de moldes de region variable humana o aceptores para injertacion de CDR.

Tabla 2. Comparacion de la region variable de la cadena pesada del Act-1 de raton con las secuencias consenso para los subgrupos de regiones variables de cadena pesada de raton y humanas. Se comparo la secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena pesada del Act-1 de raton, con y sin las secuencias de las CDR, con las secuencias consenso de los diferentes subgrupos de regiones variables de cadena pesada de raton y humanas, con y sin las secuencias de las CDR. Se dan los porcentajes de similitud y de identidad con los subgrupos mas similares de raton y humanos.

Region variable de raton o humana

Subgrupo de Kabat Region variable completa o RM solo Porcentaje de similitud Porcentaje de identidad

Raton

IIB Completa 89,26 83,47

RM solo 95,40 94,25

Humana

I Completa 81,82 68,60

RM solo 85,06 75,86

Tambien se compararon las regiones variables del Act-1 de raton con las secuencias individuales de todos los ejemplos registrados de regiones variables de raton y humanas (Kabat, B.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta edicion, Ministerio de Salud y Servicios Humanos de los EE.UU., Imprenta del Gobierno de los EE.UU (1991); paquete UW GCG (Universidad de Wisconsin)). Con respecto a las secuencias de anticuerpos humanos, la region variable de cadena ligera del Act-1 de raton era muy similar a la secuencia para la region variable de la cadena ligera kappa humana del anticuerpo humano GM607'cL (Klobeck, H.-G., et al., Nature 309:73-76 (1984)). La Figura 5 muestra una alineacion de las secuencias de aminoacidos de la region variable de la cadena ligera del Act-1 de raton (SEQ ID NO:7) y de la region variable de la cadena ligera del GM607'CL humano (SEQ ID NO:8). Tal como se esperaba, la region variable de cadena ligera del GM607'CL humano es un miembro del subgrupo II de las regiones variables de cadena ligera kappa humanas. La identidad global de secuencia entre las regiones variables de cadena ligera de Act-1 de raton y GM607'CL humano se calculo como del 71,4%. La region variable de la cadena pesada del Act-1 de raton era muy similar a la secuencia para la region variable de la cadena pesada humana del anticuerpo humano 21/28'CL (Dersimonian, H., et al., J. Immunol. 139:2496-2501 (1987)). La Figura 6 muestra una alineacion de las secuencias de aminoacidos de la region variable de la cadena pesada del Act-1 de raton (SEQ ID NO:9) y de la region variable de la cadena pesada del 21/28'CL humano (SEQ ID NO:10). Tal como se esperaba, la region variable de la cadena pesada del 21/28'CL humano es un miembro del subgrupo I de regiones variables de cadena pesada humana. La identidad global de secuencia entre las regiones variables de cadena pesada de Act-1 de raton y 21/28'CL humano se calculo como del 68,1%. En base a estas comparaciones, se selecciono la region variable de cadena ligera del GM607'CL humano como molde humano para el diseno de la region variable de la cadena pesada del Act-1 humano reformado.

La segunda etapa en el procedimiento de diseno era insertar las CDR de roedores en las regiones variables de cadena ligera y pesada humanas seleccionadas. Se unieron las CDR completas de roedores, segun definen Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta edicion, Ministerio de Salud y Servicios Humanos de los EE.UU., Imprenta del Gobierno de los EE.UU (1991)), a las RM humanas para crear un injerto

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

CDR simple. En algunos casos, un anticuerpo de roedores humanizado en un injerto CDR simple mostrara poca o ninguna union a antigeno. Es importante estudiar las secuencias de aminoacidos de las RM humanas para determinar si alguno de estos restos de aminoacidos tiene probabilidad de influir de manera adversa sobre la union al antigeno, ya sea directamente a traves de interacciones con el antfgeno, o indirectamente, alterando el posicionamiento de los bucles CDR.

En la tercera etapa, se tomaron decisiones en cuanto a que restos de aminoacido en las RM humanas tendnan que ser alteradas para conseguir una buena union al antigeno. En esta etapa, el modelo de las regiones variables de roedores resulta de lo mas util en el procedimiento de diseno. Tambien son utiles las estructuras canonicas para las CDR, segun definen Chothia C. et al., Nature 342:877-883 (1989). Es importante conservar en las regiones variables humanizadas cualquiera de los restos de aminoacido de roedores que son parte de las estructuras canonicas. Es util comparar la secuencia del anticuerpo de roedores que ha de ser humanizada con secuencias similares de otros anticuerpos de roedores para determinar si los aminoacidos en determinadas posiciones son poco habituales o raros. Esto podna indicar que el aminoacido de roedor en esa posicion tiene un papel importante en la union al antigeno. Estudiando el modelo de las regiones variables de roedores, es posible predecir si los aminoacidos en posiciones particulares podnan o no influir en la union antfgeno. Cuando se estan usando regiones variables humanas de anticuerpos humanos individuales como base del diseno, entonces es aconsejable comparar la secuencia humana individual con la secuencia consenso para ese subgrupo de regiones variables humanas. Hay que observar cualquier aminoacido que sea particularmente inusual. En la mayona de los casos, se identifican unos cuantos aminoacidos en las RM humanas que debenan ser cambiados del aminoacido presente en esa posicion en la region variable humana al aminoacido presente en esa posicion en la region variable de roedores.

Las Tablas 3 y 4 resumen como fueron disenadas las regiones variables del Act-1 humano reformado. La Tabla 3 es una alineacion de secuencias de aminoacidos usadas en el diseno de regiones Vl del Acm humano reformado Act-I y de la secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena ligera del Act-1 de raton que ha de ser humanizada (SEQ ID NO:7) en la columna 4, la secuencia consenso para el subgrupo de regiones variables de raton al que pertenece la region variable del act-1 de raton (SEQ ID NO:50) en la columna 5 (k-II de raton), la secuencia consenso para el subgrupo de regiones variables humanas al que es mas similar la variable del Act-1 de raton (SEQ ID NO:51) en la columna 6 (k-II humana), la secuencia de aminoacidos de la region variable humana que sirve como molde (es decir, GM607'CL) (SEQ ID NO:8) en la columna 7, y la secuencia de aminoacidos de la region variable del Act-1 humano reformado (SEQ ID NO:52) disenada en la columna 8 (Act-1 RHVh). La Tabla 4 es la alineacion de las secuencias de aminoacidos usadas en el diseno de las regiones Vh del Acm humano Act-1 reformado y da la secuencia de aminoacidos de la region variable de cadena pesada del Act-1 de raton que ha de ser humanizada (SEQ ID NO:9) en la columna 4, la secuencia consenso para el subgrupo de las regiones variables de raton al que pertenece la region variable del Act-1 de raton (SEQ ID NO:53) en la columna 5 (IIB de raton), la secuencia consenso para el subgrupo de regiones variables humanas al que el Act-1 de raton es mas similar (SEQ ID NO:54) en la columna 6 (I humana), la secuencia de aminoacidos de la region variables humana que sirve como molde (es decir, 21/28'CL) (SEQ ID NO:10) en la columna 7, y la secuencia de aminoacidos de la region variable del Act-1 reformado (SEQ ID NO:55) disenada en la columna 8 (Act-1 RHVh). La penultima columna en las Tablas 3 y 4 indica la posicion (superficial o enterrada) de los restos en las RM que difieren entre las RM del Act-1 de raton y las humanas seleccionadas. La columna final en las Tablas 3 y 4 da comentarios relevantes en cuanto a esa posicion en la region variable.

En la Tabla 3, se utilizan los siguientes sfmbolos: (*) restos invariantes definidos por las secuencias consenso de Kabat, es decir una aparicion del 95% o mas en el subgrupo de Kabat (Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta edicion, Ministerio de Salud y Servicios Humanos de los Ee.UU., Imprenta del Gobierno de los EE.UU (1991)) (en el caso de las columnas 5 y 6) o como parte de la estructura canonica para los bucles CDR (en el caso de las columnas 5 y 6) o como parte de la estructura canonica para los bucles CDR (en el caso de la columna 8) segun definen Chothia, C., et al., Nature 342:877-883 (1989) ; (NEGRILLA) posiciones en las RM y CDR en las que el resto de aminoacido humano fue sustituido por el correspondiente resto de raton; (SUBRAYADO) posiciones en las RM en las que el resto humano difiere del numero de restos de raton analogos; (A) numeracion de los cambios en las RM humanas; (Ac Act-1 de raton) secuencia de aminoacidos de la region Vl del anticuerpo Act-1 de raton; (k-II de raton) secuencia consenso de las regiones Vl kappa del subgrupo II (Kabat, E.A., et al., supra); (human k-II) secuencia consenso de las regiones Vl humanas del subgrupo II (Kabat, E.A., et al., antes citado) ; (GM607'CL) secuencia de aminoacidos del anticuerpo GM607'CL humano (Klobeck, H.-G., et al., Nature 309:73-76 (1984)); (Superficial o enterrado) posicion de aminoacido en relacion con los demas restos en ambas cadenas de las regiones variables del anticuerpo; (RH Vk de Act-1) secuencia de aminoacidos de la region Vl del Acm Act-1 humano reformado.

Tabla 3. Alineamiento de las secuencias de aminoacidos usadas en el diseno de las regiones Vl del mAb Act-1 humano reformado

Kabat

n° RM o CDR Act-1 Raton K- II Raton K-II humana GM 607 CL Act-1 o RH Vk Superf. o enterr. Comentario

1

1

FR1 D D* D* D D

2

2

1 V V I* I V enterr. AA canonico para bucle L1 (A1).

3

3

1 V V V* V V

4

4

1 V M M M M enterr. Enterrado entre L1 y L2. V=9/245, M = 202/245 k-II de raton. M=42/45, V no observada en k-II humana. Si la union es deficiente, considerese cambiar este a Val en segunda version.

5

5

1 T T* T* T T

6

6

1 Q Q* Q* Q Q

7

7

1 T T S S S Superf. Distal al sitio de union (SU). T= 164/245 en k-II de raton. T= 10/37, S=27/37 en k-II humana.

8

8

1 P P P* P P

9

9

1 L L L* L L

10

10

1 S S S* S S

11

11

1 L L L* L L

12

12

1 P P P P P

13

13

1 V V* V* V V

14

14

1 S S T* T T Superf. Distal al SU. S = 151/248 en k- II de raton. T sola (30/30) observada en k-II humana.

15

15

1 F L P P P Superf. Distal al SU. F=9/253 en k-II de raton, F no observada en k-II humana. P=29/31 en k-II humana.

16

16

1 G G* G* G G

17

17

1 D D E E E Superf. Distal al SU. E=18/30, D no observada en k-II humana.

18

18

1 Q Q P* P P Superf. Distal al SU y en una vuelta. P sola (31/31) observada en k-II humana.

19

19

1 V A A* A A enterr. Senalando al nucleo, pero cambio estandar de raton a humana. V = 66/253, A = 187/253 en k-II de raton. A sola (30/30) observada en k-II humana.

20

20

1 S S* S* S S

21

21

1 I I* I* I I

22

22

1 S S* S* S S

23

23

FR1 C C* C* C C

24

24

CDR1 R R R R R

Kabat

n° RM o CDR Act-1 Raton K- II Raton K-II humana GM 607 CL Act-1 o RH Vk Superf. o enterr. Comentario

25

25

1 S S* S* S S AA canonico para el bucle L1

26

26

1 S S* S* S S AA canonico para el bucle L1

27

27

1 Q Q Q Q Q AA canonico para el bucle L1

27A

28 1 S S S S S AA canonico para el bucle L1

27B

29 1 L L L* L L AA canonico para el bucle L1

27C

30 1 A V L L A AA canonico para el bucle L1

27D

31 1 K H H H K AA canonico para el bucle L1

27E

32 1 S S S S S AA canonico para el bucle L1

27F

1 - - X - -

28

33 1 Y N D N Y AA canonico para el bucle L1

29

34 1 G G* G G G AA canonico para el bucle L1

30

35 1 N N N Y N AA canonico para el bucle L1

31

36 1 T T* N N T AA canonico para el bucle L1

32

37 1 Y Y* Y* Y Y AA canonico para el bucle L1

33

38 1 L L* L* L L SS canonico para el bucle L1

34

39 CDR1 S E N D S AA de empaquetamiento. Inusual (117/1365). A, H y N mas comunmente observados aqrn.

35

40 FR2 W W* W* W W

36

41 1 Y Y Y Y Y AA de empaquetamiento. AA el mas comun.

37

42 1 L L* L L L

38

43 1 H Q* Q Q Q enterr. AA de empaquetamiento. H es inusual (31/1312). Q es el AA mas comun (1158/1312). H=6/225. Q=219/225 en k-II de raton. Q=15/17, H no observada en k-II humana.

39

44 1 K K K K K

40

45 1 P P* P P P

41

46 1 G G* G* G G

42

47 1 Q Q* Q Q Q

43

48 1 S S* S S S

44

49 1 P P* P* P P AA de empaquetamiento. AA el mas comun.

45

50 1 Q K Q Q Q

46

51 1 L L L L L AA de empaquetamiento. AA el mas comun.

47

52 1 L L* L L L

48

53 1 I I* I* I I AA canonico para el bucle L2

49

54 FR2 Y Y Y* Y Y

50

55 CDR2 G K L L G AA canonico para el bucle L2

Kabat

n° RM o CDR Act-1 Raton K- II Raton K-II humana GM 607 CL Act-1 o RH Vk Superf. o enterr. Comentario

51

56 1 I V V G I AA canonico para el bucle L2

52

57 1 S S* S* S S AA canonico para el bucle L2

53

58 1 N N N N N

54

59 1 R R R* R R

55

60 1 F F A A F

56

61 CDR2 S S* S* S S

57

62 FR3 G G* G* G G

58

63 1 V V* V* V V

59

64 1 P P P* P P

60

65 1 D D* D D D

61

66 1 R R* R R R

62

67 1 F F* F* F F

63

68 1 S S S* S S

64

69 1 G G* G G G AA canonico para el bucle L2

65

70 1 S S* S* S S

66

71 1 G G* G* G G

67

72 1 S S* S S S

68

73 1 G G* G G G

69

74 1 T T* T* T T

70

75 1 D D D D D

71

76 1 F F* F* F F AA canonico para el bucle L1

72

77 1 T T* T* T T

73

78 1 L L* L* L L

74

79 1 K K K K K

75

80 1 I I* I* I I

76

81 1 S S S S S

77

82 1 T R* R R R Superf. Distal al SU. T=6/221, R =211/221 en k-II de raton. R=11/12, T no observada en k- II humana

78

83 1 I V V* V V enterr. Senalando al nucleo, pero cambio estandar de raton a humana. I=6/213, V = 195/213 en k-II de raton. V sola (12/12) observada en k-II humana

79

84 1 K E E E E Superf. Distal al SU. K=20/215 E=191/215 en k-II de raton. E=9/12, K no observada en k-II humana

80

85 1 P A* A A A Superf. Distal al SU. P=6/183, A=175/183 en k-II de raton. P=1/12, A=11/12 en k-II humana.

81

86 1 E E* E E E

Kabat

n° RM o CDR Act-1 Raton K- II Raton K-II humana GM 607 CL Act-1 o RH Vk Superf. o enterr. Comentario

82

87 1 D D* D D D

83

88 1 L L V* V V semi- enterr. Distal al SU. V sola (12/12) observada en k-II humana

84

89 1 G G* G* G G

85

90 1 M V V* V V semi- enterr. Distal al SU. M=6/212, V= 196/212 en k-II de raton. V sola (12/12) observada en k-II humana.

86

91 1 Y Y* Y* Y Y

87

92 1 Y Y Y* Y Y AA de empaquetamiento. AA el mas comun.

88

93 FR3 C C* C* C C

89

94 CDR3 L F M* M L AA de empaquetamiento. L es inusual (93/1238). Q es el AA mas comun (654/1238).

90

95 1 Q Q* Q Q Q AA canonico para el bucle L3

91

96 1 G G A A G Canonico para L3/AA de empaquetamiento. El 3er AA el mas comun.

92

97 1 T T L L T AA canonico para el bucle L3

93

98 1 H H Q Q H AA canonico para el bucle L3

94

99 1 Q V X T Q AA canonico para el bucle L3

95

100 1 P P* P P P AA canonico para el bucle L3

95A

1 - P R* -

95B

1 - - - -

95C

1 - - - -

95D

1 - - - -

95E

1 - - - -

95F

1 - - - -

96

101 1 Y Y X Q Y AA de empaquetamiento. El 2° AA el mas comun.

97

102 CDR3 T T* T* T T Canonico para L3

98

103 FR4 F F* F* F F AA de empaquetamiento. AA el mas comun

99

104 1 G G* G* G G

100

105 1 G G Q Q Q semi- enterr. Distal al SU. Q=12/13, G=1/12 en k-II humana

101

106 1 G G* G* G G

102

107 1 T T* T* T T

103

109 1 K K* K K K

104

109 1 L L* V V V semi- enterr. Distal al SU. L=5/14, V=9/14 en k-II humana

105

110 1 E E* E E E

106

111 1 I I I* I I

Kabat

n° RM o CDR Act-1 Raton K-II Raton K-II humana GM 607 CL Act-1 o RH Vk Superf. o enterr. Comentario

106A

1 - - - -

107

112 FR4 K K* K K K

En la Tabla 4, se usan los siguientes sfmbolos: (*) restos invariantes definidos por las secuencias consenso de Kabat, es dedr, 95% o mas de aparicion en el subgrupo de Kabat (Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta edicion, Ministerio de Salud y Servicios Humanos de los EE.UU., Imprenta del 5 Gobierno de los EE.UU (1991)) (en el caso de las columnas 5 y 6) o como parte de la estructura canonica para los bucles CDR (en el caso de la columna 8) segun definen Chothia, C., et al., Nature 342:877-883 (1989); (NeGrILLA) posiciones en las RM y CDR en las que el resto de aminoacido humano fue sustituido por el correspondiente resto de raton; (SUBRAYADO) posiciones en las RM en las que el resto humano difiere del numero de restos de raton analogos; (A) numeracion de los cambios en las RM humanas; (Ac Act-1 de raton) secuencia de aminoacidos de la 10 region Vh del anticuerpo Act-1 de raton; (IIB de raton) secuencia consenso de las regiones Vh de raton del subgrupo IIB (Kabat, E.A., et al., antes citado); (I humana) secuencia consenso de las regiones Vh humanas del subgrupo I (Kabat, E.A., et al., antes citado); (21/28'CL humana) secuencia de aminoacidos del anticuerpo humano 21/28'CL (Dersimonian, H., et al., J. Immunol. 139:2496-2501 (1987)); (Superficial o enterrado) posicion de aminoacido en relacion con los demas restos en ambas cadenas de las regiones variables del anticuerpo; (RH Vh de Act-1) 15 secuencia de aminoacidos de la region Vh del Acm Act-1 humano reformado.

Tabla 4. Alineamiento de las secuencias de aminoacidos usadas en el diseno de las regiones Vh del Acm Act-1 humano reformado

Kabat

N° FR o CDR Act-1 de raton IIB de raton I humana 21/28CL donante humana Act-1 RH Vh Superf. o enterr. Comentario

1

1

FR1 Q Q Q Q Q

2

2

1 V V* V V V

3

3

1 Q Q* Q* Q Q

4

4

1 L L* L* L L

5

5

1 Q Q V V V superf. Distal al sitio de union (SU). Q=135/143 en IIB de raton. V =49/53, Q=1/53 en I humana.

6

6

1 Q Q Q Q Q

7

7

1 P P S* S S semi- enterr. Distal al SU. P= 102/150 en IIB de raton. P no observada en I humana

8

8

1 G G* G* G G

9

9

1 A A A A A

10

10

1 E E E E E

11

11

1 L L* V V V superf. Distal al SU. V=50/54, L=4/54 en I humana

12

12

1 V V* K K K enterr. Senalando al nucleo, pero cambio estandard de raton a humano. K=41/55, V=3/55 en I humana

13

13

1 K K K* K K

14

14

1 P P* P* P P

15

15

1 G G* G* G G

16

16

1 T A A A A superf. Distal al SU. T=12/139, A=117/139 en IIB de raton. T=1/52, A=23/52 en I humana

Kabat

N° FR o CDR Act-1 de raton IIB de raton I humana 21/28CL donante humana Act-1 RH Vh Superf. o enterr. Comentario

17

17

1 S S* S* S S

18

18

1 V V* V V V

19

19

1 K K K K K

20

20

1 L L V V V enterr. Senalando al nucleo, pero cambio estandard de raton a humano. L= 138/179 en IIB de raton. V=36/52, L=1/52 en I humana

21

21

1 S S* S S S

22

22

1 C C* C* C C

23

23

1 K K* K K K

24

24

1 G A* A A G enterr. AA canonico para el bucle H1 (A1). G - no observada en IIB de raton. G=12/51, A=34/51 en I humana

25

25

1 Y S* S* S S superf. Senalando lejos del SU y por ello no parece unirse al antfgeno (Ag). Y=1/185 en IIB de raton. S=48/50, Y no observada en I humana

26

26

1 G G* G* G G AA canonico para el bucle H1

27

27

1 Y Y Y Y Y AA canonico para el bucle H1

28

28

1 T T T T T AA canonico para el bucle H1

29

29

1 F F* F* F F AA canonico para el bucle H1

30

30

FR1 T T T T T AA canonico para el bucle H1

31

31

CDR1 S S S S S AA canonico para el bucle H1

32

32

1 Y Y Y Y Y AA canonico para el bucle H1

33

33

1 W W A A W

34

34

1 M M I M M AA canonico para el bucle H1

35

35

1 H H S H H AA de empaquetamiento. El AA mas comun

35A

1 - - - -

35B

CDR1 - - - -

36

36

FR2 W W* W* W W

37

37

1 V V V V V AA de empaquetamiento. El AA mas comun

38

38

1 K K R* R R enterr. Senalando al nucleo, pero cambio estandar de raton a humano. K=177/188 en IIB de raton. R=48/49, K no observada en I humana. Sin embargo, Lys puede estar empaquetando el bucle H2, por lo que hay que considerar el cambio en segunda version, junto con A40R, si la union es deficiente

Kabat

N° FR o CDR Act-1 de raton IIB de raton I humana 21/28CL donante humana Act-1 RH Vh Superf. o enterr. Comentario

39

39

1 Q Q Q* Q Q AA de empaquetamiento. El AA mas comun

40

40

1 R R A A A enterr. Senalando al nucleo, pero cambio estandar de raton a humano. R=160/177 en IIB de raton. A=37/49, R=0/49 en I humana. Sin embargo, Lys puede estar empaquetando el bucle H2, por lo que hay que considerar el cambio en segunda version, junto con A38K, si la union es deficiente

41

41

1 P P P P P

42

42

1 G G G G G

43

43

1 Q Q Q Q Q

44

44

1 G G G R R enterr. Senalando al nucleo, pero cambio estandar de raton a humano. G=43/48, R=5/48 en I humana

45

45

1 L L* L* L L AA de empaquetamiento. El AA mas comun

46

46

1 E E* E* E E

47

47

1 W W* W* W W AA de empaquetamiento. El AA mas comun

48

48

1 I I* M M I enterr. Ile por debajo y soportando el bucle H2 (A2). Met=41/48, Ile=1/48 en I humana

49

49

FR2 G G* G G G

50

50

CDR2 E R W W E

51

51

1 I I I I I

52

52

1 D D N N D

52A

53 1 P P* P A P AA canonico para el bucle H2

52B

1 - - Y -

52C

1 - - - -

53

54 1 S N G G S AA canonico para el bucle H2

54

55 1 E S N N E AA canonico para el bucle H2

55

56 1 S G G G S AA canonico para el bucle H2

56

57 1 N G D N N

57

58 1 T T T T T

58

59 1 N N N K N

59

60 1 Y Y Y Y Y

60

61 1 N N A S N

61

62 1 Q E Q Q Q

62

63 1 K K* K K K

63

64 1 F F* F F F

Kabat

N° FR o CDR Act-1 de raton IIB de raton I humana 21/28CL donante humana Act-1 RH Vh Superf. o enterr. Comentario

64

65 1 K K Q Q K

65

66 CDR2 G S G G G

66

67 FR3 K K* R R R superf. Distal al SU. R=39/49, K no observada en I humana

67

68 1 A A* V V V semi- enterr. Distal al SU. V=45/48, A no observada en I humana

68

69 1 T T* T T T

69

70 1 L L* I I L enterr. Leu por debajo y soportando el bucle H2 (A3). Ile=26/49, Leu=1/49 en I humana

70

71 1 T T* T T T

71

72 1 V V A R V enterr. AA canonico para el bucle H2 (A4)

72

73 1 D D* D D D

73

74 1 I K T T I superf. Detras del bucle H2 y puede participar directamente en la union al Ag (A5). Ile no observada en IIB de raton o I humana. T=21/49 en I humana

74

75 1 S S S* S S

75

76 1 S S* T A A superf. Distal al SU. T=26/50, A=4150, S no observada en I humana

76

77 1 S S S S S

77

78 1 T T* T T T

78

79 1 A A A A A

79

80 1 Y Y* Y Y Y

80

81 1 M M M M M

81

82 1 Q Q E E E semi- enterr. Distal al SU. Q=163/194 en IIB de raton. E=35/50, Q=11/50 en I humana

82

83 1 L L* L L L

82A

84 1 S S s S S

82B

85 1 S S S S S

82C

86 1 L L* L* L L

83

87 1 T T* R R R superf. Distal al SU. R=33/51, T=4/51 en I humana

84

88 1 S S* S S S

85

89 1 E E E E E

86

90 1 D D* D* D D

87

91 1 S S* T T T superf. Distal al SU. T=48/51, S=2/51 en I humana

88

92 1 A A* A A A

89

93 1 V V* V V V

90

94 1 Y Y* Y* Y Y

Kabat

N° FR o CDR Act-1 de raton IIB de raton I humana 21/28CL donante humana Act-1 RH Vh Superf. o enterr. Comentario

91

95 1 Y Y Y Y Y AA de empaquetamiento. El AA mas comun

92

96 1 C C* C* C C

93

97 1 A A A* A A AA de empaquetamiento. El AA mas comun

94

98 FR3 R R R R R AA canonico para el bucle H1.

95

99 CDR3 G Y A G G AA de empaquetamiento. El 2° resto mas comun observado en este punto - OK.

96

10 0 1 G Y P - G

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10 1 1 Y Y G - Y

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10 2 1 D G Y - D

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10 3 1 G G G G G

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10 4 1 W S S - W

100A

10 5 1 D S G D

100B

o v- CD 1 Y X G - Y

100C

10 7 1 A X G - A

100D

10 8 1 I V C - I AA de empaquetamiento. 1=2611211. F y M son los mas conmunente observados.

100E

1 - Y Y -

100F

1 - X R Y

100G

1 - - G Y

100H

1 - Y* D G

100I

1 - W Y S

100J

1 - Y X G

100K

1 - F F S

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10 9 1 D D D N D

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11 0 CDR3 Y Y Y Y Y

103

11 1 FR4 W W* W* W w AA de empaquetamiento. El AA mas comun

104

11 2 1 G G* G G G

105

11 3 1 Q Q Q Q Q

106

11 1 G G* G* G G

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Kabat

N° FR o CDR Act-1 de raton I IB de raton I humana 21/28CL donante humana Act-1 RH Vh Superf. o enterr. Comentario

4

107

11 5 1 T T* T T T

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11 6 1 S T L L L superf. Distal al SU. T=88/149 en IIB de raton. L=25/39, T=7/39 en I humana

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11 7 1 V V V* V V

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11 8 1 T T* T T T

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11 9 1 V V* V V V

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12 0 1 S S* S* S S

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12 1 FR4 S S S* S S

Con respecto al diseno de la region variable de la cadena ligera del Act-1 humano reformado (Tabla 3), se cambio un resto en las RM humanas del aminoacido presente en las RM humanas al aminoacido presente en las RM de raton originales. Este cambio estaba en la posicion 2 in RM1 (segun definen Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta edicion, Ministerio de Salud y Servicios Humanos de los EE.UU., Imprenta del Gobierno de los EE.UU (1991)). Concretamente, la isoleucina encontrada en la region variable de la cadena ligera del GM607'CL humano fue cambiada a valina, tal como se encuentra en la region variable de la cadena ligera del Act-1 de raton. Esta posicion en la region variable de la cadena ligera kappa ha sido identificada por Chothia, C., et al., Nature 342:877-883 (1989) como una de las localizaciones cnticas para la correcta orientacion y estructura del bucle L1, y, como tal, se conoce como uno de los "aminoacidos canonicos". Debido a su importante papel en la conformacion de bucles, dichos restos de marco de raton se conservan generalmente siempre en la region variable reformada.

En la posicion 4 de RM1, existe una valina en la secuencia de raton y una metionina en la secuencia humana. Un cambio de una valina a una metionina no es un cambio drastico en sf mismo, ya que ambos aminoacidos son restos hidrofobicos, no polares, por lo que la metionina presente en la secuencia humana fue usada en la region variable del Act-1 humano reformado. Sin embargo, el modelo indica que la valina esta enterrada entre los bucles L1 y L2 y el volumen medio de valina cuando esta enterrada en las protemas es 142A3, mientras que la metionina ocupa aproximadamente 171A3 de espacio. El resto de metionina, mas grande, podna causar un cambio en la conformacion de cualquiera de los bucles L1 y L2, o ambos. La union a antfgeno del Act-1 humano reformado puede mejorar por medio de un cambio adicional en la posicion 4 de metionina a valina en la region variable de cadena ligera del Act-1 humano reformado.

Con respecto al diseno de la region variable de cadena pesada del Act-1 humano reformado (Tabla 4), habfa cinco restos en las RM humanas que fueron cambiados de los aminoacidos presentes en las RM humanas a los aminoacidos presentes en las RM de raton originales. En las posiciones 24 de RM1 y 71 de RM3 (segun definen Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta edicion, Ministerio de Salud y Servicios Humanos de los EE.UU., Imprenta del Gobierno de los EE.UU (1991)), los restos de aminoacido presentes en la secuencia de raton fueron retenidos en la region variable de cadena pesada del Act-humano reformado, ya que estas posiciones son parte de las estructuras canonicas para los bucles H1 y H2, respectivamente (Chothia, C., et al., Nature 342:877-883 (1989)). Dado que cualquier cambio de aminoacidos en estas posiciones podna alterar el empaquetamiento y las estructuras finales de los bucles H1 y H2, los restos de raton en estas localizaciones cnticas son rutinariamente conservados en la region variable de cadena pesada humanizada.

En la posicion 48 de RM2, la metionina en la secuencia humana fue cambiada a una isoleucina, tal como esta presente en la secuencia del Act-1 de raton. La sustitucion de una metionina por una isoleucina es inusual. Lo que es mas importante, el modelo muestra que el resto de isoleucina esta enterrado debajo del bucle H2. Como resultado de ello, los cambios en esta posicion enterrada pueden haber influido en la estructura del bucle H2 y, por lo tanto, haber interferido con la union a antfgeno.

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En la posicion 69 de RM3, la isoleucina en la secuencia humana fue cambiada a una leucina, tal como esta presente en la secuencia del Act-1 de raton. Aunque la sustitucion de una isoleucina por una leucina no es inusual, el modelo muestra que la leucina este enterrada bajo el bucle H2. En consecuencia, como el resto en posicion 48, los cambios en esta posicion podnan influir en la conformacion del bucle H2 y de este modo alterar la union a antigeno.

Finalmente, en la posicion 73 de RM3, la treonina en la secuencia humana fue cambiada a una isoleucina, tal como esta presente en la secuencia de raton. Una isoleucina en esta posicion en RM3 no ha sido nunca vista con anterioridad en el subgrupo IIB de raton o el subgrupo I humano (segun definen Kabat, E.A., et al., Quinta edicion, Ministerio de Salud y Servicios Humanos de los EE.UU., Imprenta del Gobierno de los EE.UU (1991)), lo que sugiere que la isoleucina en esta localizacion puede tener un importante papel en la union a antigeno.

En el modelo, la leucina en la posicion 73 aparece en la superficie cerca del lfmite del sitio de union y, dependiendo del tamano y orientacion del epitopo sobre la integrina a4p7, puede posiblemente tomar parte directa en la union a antigeno. Sin embargo, como posicion de resto superficial, el anticuerpo en conjunto tendna menos potencial inmunogenico si estuviera presente el aminoacido de raton en el anticuerpo humano reformado y el nuevo constructo podna ser reestudiado para determinar si la segunda version mantiene un nivel similar de union a antigeno.

Ademas de los cinco cambios en las RM humanas hechos en el diseno original de la region variable de cadena pesada del Act-1 humano reformado, se podnan hacer otros dos cambios que pueden mejorar la union a antigeno. El modelo sugiere que los restos 38Lys y 40Arg en la region variable pesada del Acm Act-1 de raton estan posicionados por debajo del bucle H2 y en proximo empaquetamiento a 63Phe en CDR2 (numeracion como en la Tabla 4). Sin embargo, estos restos se localizan tambien en el nucleo de la region variable de la cadena pesada y pueden tener otros efectos, posiblemente perjudiciales, si se usan para sustituir a sus correspondientes aminoacidos humanos (38 Arg y 40 Ala, respectivamente). Por lo tanto, los cambios a las posiciones 38 y 40 en RM2 no fueron incorporados a la region variable pesada humana reformada del Acm Act-1. Sin embargo, se puede usar cualquiera de las modificaciones, o ambas, de la cadena pesada reformada en derivados para mejorar la union a antfgeno.

Conclusiones

Se construyo un modelo de las regiones variables del Act-1 de raton en base, principalmente, a las estructuras resultas de otras regiones variables de anticuerpos. El modelo fue utilizado en el diseno de regiones variables del Act-1 humanizado. Se puso un enfasis particular en el mantenimiento de la estructura del sitio de union a antfgeno en las regiones variables humanas reformadas.

Se disenaron una region variable de cadena ligera del Act-1 humano reformado y regiones variables de cadena pesada del Act-1 humano reformado (Tablas 3 y 4). La region variable de cadena ligera del Act-humano reformado estaba basada en las CDR de la region variable de cadena ligera del Act-1 de raton y en las RM de la region variable de la cadena ligera del anticuerpo GM607'CL humano. Se hizo un cambio de aminoacido en las RM humanas en la posicion 2. La region variable de la cadena pesada del Act-1 humano reformado estaba basada en las CDR de la region variable de la cadena pesada del Act-1 de raton y en las RM de la region variable de la cadena pesada del anticuerpo humano 21/28'CL. Se hicieron cinco cambios de aminoacidos en las RM humanas, en las posiciones 24, 48, 69, 71 y 73.

Ademas, se observaron un unico sitio en la posicion 4 de RM1 de la cadena ligera kappa y dos sitios en las posiciones 38 y 40 en RM2 en la cadena pesada que podnan ser considerados en el diseno de versiones adicionales de las regiones variables del Act-1 humano reformado. Ademas, tambien se identifico un unico resto en la posicion 73 de RM3 de la cadena pesada como candidato para la retromutacion del aminoacido de raton al humano, en vista de su localizacion sobre la superficie del anticuerpo.

Ejemplo 3 Construccion de acidos nucleicos codificantes de regiones variables reformadas

Despues de confirmar que se habfan clonado las regiones variables de cadena pesada y de cadena ligera correctas bioqmmica (secuencia parcial de aminoacidos) y funcionalmente (tincion con anticuerpos quimericos de celulas HuT 78), se diseno una secuencia reformada de aminoacidos como se ha descrito antes. A continuacion se disenaron y prepararon genes codificantes de las cadenas de anticuerpo reformadas.

Diseno, construccion y expresion de ACT-1 humanizado

Despues de determinar la secuencia primaria de aminoacidos del anticuerpo humanizado segun se describe en el Ejemplo 2, se hizo una traduccion inversa de la secuencia a una secuencia degenerada de acido nucleico y se analizo en cuanto a sitios de enzimas de restriccion potenciales usando la version 4.5.3 de MacVector (Kodak, Scientific Imaging Systems). Se selecciono entonces una secuencia de acido nucleico que incorporaba sitios de escision para enzimas de restriccion pero que conservaba la secuencia primaria de aminoacidos. En la Figura 11 se muestran la secuencia de acido nucleico de la cadena pesada (SEQ ID NO:18) y la secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO:19), y en la Figura 12 se muestran la secuencia nucleica de la cadena ligera (SEQ ID NO:20) y la

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secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO:21), con indicacion de los sitios de enzimas de restriccion que fueron utilizados en la subclonacion.

Se construyeron los genes de las regiones variables de cadena pesada y ligera del Act-1 humanizado como sigue. Se sintetizaron oligonucleotidos complementarios solapantes, denominados L1-L6 (SEQ ID NOS: 22-27, respectivamente) para la cadena ligera, y H1-H10 (SEQ ID NOS:28-37, respectivamente) para la cadena pesada usando un Sintetizador de ADN de Applied Biosystems Modelo 392 (Figura 13). Despues de desproteccion durante la noche 55°C, los oligos fueron secados en un Speed-Vac, resuspendidos en 100 ml de agua y desalificados sobre columnas Bio-Spin 6 (Hio-Rad). La concentracion de oligos se determino midiendo la absorbancia a 260 nm, y los oligos se purificaron por electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante.

Se mezclaron 100 |jg of cada oligo con 2 volumenes de colorante de carga (formamida 95%, EDTA 20 mM, azul de bromofenol 0,05%, xileno cianol FF 0,05%), se calento durante 2 minutos a 65°C, y se hizo correr en 1X TBE durante aproximadamente 3 horas a 250 V. Se tino el gel con bromuro de etidio y se observo con luz ultravioleta. Se sacaron del gel los oligos de longitud correcta, se pusieron en tubos de dialisis con agua y se electroeluyeron. Se extrajeron dos veces los oligos con volumenes iguales de fenol/cloroformo/alcohol isoamflico (25:24:1 v/v) (Gibco/BRL) y se precipitaron anadiendo 0,1 volumenes de acetato de potasio 3,0 M (pH 6) y 2 volumenes de etanol fno. Despues de la centrifugacion, se lavaron los pelets una vez con etanol al 70%, se secaron a vacfo y se resuspendieron en 50 jl de agua.

Se reasociaron los oligos complementarios mezclando cantidades molares iguales (aproximadamente 100 jg en 50 jl de agua) del oligo purificado con un volumen igual (100 jl) de 2X tampon de reasociacion (2X = NaCl 1M, Tris-HCl 40 mM a pH 7,5, EDTA 2 mM). Los oligos fueron desnaturalizados calentando a 95°C durante 10 minutos, seguido de una incubacion de 8 horas a 65°C. Los oligos reasociados fueron entonces precipitados con etanol como se ha descrito previamente y resuspendidos en 40 jl agua.

La extension de los oligos reasociados fue realizada por adicion de 2 jl de Fragmento Grande de ADN Polimerasa I (Klenow), 5 jl de dNTP 2,5 mM y 5 jl de Tampon 10 X (10X = Tris-HCl 10 mM, MgCh 10 mM, DTT 1 mM, pH 7,9 a 25 °C) llevando el volumen final hasta 52 jl. Se incubo la mezcla durante una hora a temperatura ambiente. Se anadieron 1 jl de dNTP y 1 jl de Klenow con una incubacion de media hora a 37°C. Observese que el fragmento A de cadena pesada no tuvo que ser extendido.

Los fragmentos reasociados y extendidos fueron purificados a partir de un material no reasociado, monocatenario, por electroforesis a traves de un gel de poliacrilamida nativo al 12%. El gel fue tenido con bromuro de etidio y observado con luz ultravioleta. Se sacaron los fragmentos de longitud correcta y se recuperaron por electroelucion en tubos de dialisis como se ha descrito antes. Los fragmentos fueron lavados dos veces con volumenes iguales de fenol/cloroformo/alcohol isoairnlico, precipitados con etanol y resuspendidos en 10jl de agua.

Los tres fragmentos de cadena ligera (LA, LB y LC) y cinco fragmentos de cadena pesada (denominados HA-HE) fueron independientemente ligados en pCR-Script™ y transformados, excepto por lo que se describe a continuacion, en Celulas Supercompetentes XL-1 Blue usando un kit pCR-Script (Stratagene) segun el protocolo recomendado por el fabricante. Los fragmentos pCR-LA y pCR-LB fueron transformados en celulas competentes DM1 (Gibco/BRL) para evitar la Dcm metilasa, que bloqueana la digestion con la enzima de restriccion Msc I. Se recogieron las colonias blancas y se secuencio el ADN miniprep usando un kit de ADN polimerasa Sequenase T7 segun el protocolo recomendado por el fabricante. Se usaron cebadores T3 y T7, que se reasocianan en lados opuestos del inserto, para la secuenciacion.

La subclonacion de recopilacion de los fragmentos de la region variable de cadena pesada y de la region variable de cadena ligera humanizadas fue llevada a cabo usando sitios de restriccion espedficos incorporados a la secuencia durante la smtesis. Los fragmentos de cadena pesada HA-HD incluyen un sitio adicional de restriccion Age I al final de cada secuencia, que permite la subclonacion secuencial de los fragmentos como se describe a continuacion.

Se digirio ADN miniprep de pCR-HA y pCR-HB con enzimas de restriccion Spe I y Age I. El ADN fue sometido a electroforesis en un gel de agarosa al 1%. El fragmento HB de 141 pb fue recuperado del gel y ligado en pCR-HA en los sitios Spe I y Age I dando lugar a pCR-HAB. A continuacion, el fragmento Hc de 112 pb fue liberado de pCR-HC usando Xba I y Age I y ligado en los sitios Xba I y Age I en pCR-HAB dando como resultado el plasmido pCR-AC. Los fragmentos HD (141pb) y HC (130pb) fueron ligados de la misma forma secuencial usando sitios de restriccion Nhe I y Age I para el Fragmento HD, y BstE II y Age I para el fragmento E. El plasmido final que contema los cinco fragmentos de la region variable de cadena pesada en pCR-script fue denominado pCR-HAE. Todos los digestos fueron realizados utilizando ADN miniprep con incubaciones a 37°C durante al menos dos horas excepto aquellos en los que se utilizo BstE II, que tiene una temperatura optima de incubacion de 65°C. Las ligaciones se hicieron durante la noche a 16°C usando ADN ligasa de T4 con una razon vector a inserto 1:10 y se transformaron al dfa siguiente en celulas competentes en cuanto a eficacia de subclonacion DH5a (Gibco/BRL) siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante.

La region variable de la cadena pesada humanizada del Act-1 en pCR-Script™ fue liberada por diigestion de pCR- HAE con HindIII y Age I. Este fragmento de 411 pb fue usado para sustituir las secuencias de la region variable de

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raton de pEE6mhACT1Hchi (Ejemplo 1) que ha^an sido digeridas con Hindlll y Age I, generando el gen de cadena pesada de ACT-1 humanizada en pEE6hCMV-B. El plasmido resultante es denominado pEE6hACT1H. Se determino la secuencia correcta de ADN por secuenciacion.

El fragmento A de cadena ligera en pCR-Script™ fue digerido con BspE I y MscI. Este fragmento de 153pb fue luego utilizado para sustituir la porcion de raton de BspE I a MscI de la cadena ligera variable de raton en pCR-script™. Este plasmido es denominado pCR-LhAmBC. El fragmento B de cadena ligera, digerido con Msc I y Nru I, y el fragmento C de cadena ligera, digerido con Nru I y Kas I, se ligaron triplemente en los sitios MscI y Kas I de pCR- LhAmBC sustituyendo a la parte restante de la secuencia de raton. Las digestiones, ligaciones y transformaciones utilizaron los mismos procedimientos que los previamente indicados, excepto por la utilizacion de celulas competentes DM1 en todas las transformaciones, excepto en la final.

La region variable de la cadena ligera humanizada en pCR-Script™ y el plasmido pEE12mhACT1Lchi (Ejemplo 1) fueron digeridos con Hind III y Kas I. El fragmento de la region variable de la cadena ligera de 360 pb y la region constante de la cadena ligera de 315 pb fueron purificados en gel y triplemente ligados en el sitio de restriccion Hind III de pEE12 para dar pEE12hACT1L. Se realizo secuenciacion para confirmar la orientacion y la secuencia de acido nucleico correctas.

Se construyo un vector de expresion que contema tanto los genes humanizados de cadena pesada como los de cadena ligera usando el mismo metodo que el descrito para el anticuerpo quimerico (vease el Ejemplo 1, Expresion de una Inmunoglobulina quimerican) con la siguiente salvedad. Debido a un sitio adicional de restriccion Bgl II en la region de cadena pesada variable humanizada, se uso un digesto parcial al cortar con Bgl II para obtener el fragmento correcto. El vector que contema los genes humanizados de cadena pesada y ligera es denominado pEE12hACT1LH.

Se llevo a cabo la expresion transitoria de todos los constructos de anticuerpos humanizados y la tincion de celulas usando los mismos protocolos que los empleados para el anticuerpo quimerico (vease Ejemplo 1, Expresion de una inmunoglobulina quimerica). La Figura 14 muestra los resultados de la tincion de HuT 78 usando el anticuerpo Act-1 quimerico murino-humano o el anticuerpo Act-1 humanizado en comparacion con un anticuerpo control irrelevante de isotipo parejo (IgG1, kappa).

Se obtuvieron transfectantes estables de celulas NSO, una lmea de celulas de mieloma (Methods in Enzymol. 73 (B):3-46 (1981); European Collection of Animal Cell Cultures, PHLS CAMR, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, U.K., ECACC N° 85110503) por electroporacion de celulas NSO con pEE12hACT1LH.

Expresion estable en celulas NSO

Se linealizaron 40|jg de pEE12hACT1LH para transfeccion estable por digestion con la enzima de restriccion SalI, que corta dentro de la porcion de plasmido bacteriano del constructo. Se precipito el ADN linealizado en el seno de la solucion usando dos volumenes de etanol mas 1/10 de volumen de acetato de sodio, se lavo en etanol al 70%, se seco y se resuspendio en agua esteril.

Se mantuvieron celulas NSO de crecimiento exponencial en medio no selectivo (medio de Eagle modificado por Dulbecco (rico en glucosa) con L-glutamina 2 mM, sin piruvato de sodio, con 4500 mg/L de glucosa, y con tampon HEPES 25 mM (GIBCO/BRL, N° de catalogo 12430-021), mas 10% de suero bovino fetal (Gibco/BRL, N° de catalogo 16000-044)). Las celulas NSO se centrifugaron, lavaron y resuspendieron en PBS frio, de forma que, despues de la adicion del ADN, las celulas estuvieran a una concentracion de 107 celulas/ml. Se anadio el ADN plasmfdico linealizado (40 ug) a 107 celulas en una cubeta de electroporacion en hielo. Se mezclaron suavemente las celulas y el ADN para evitar la generacion de burbujas y se dejo la mezcla sobre hielo durante 10 minutos. Se seco el exterior de la cubeta y se dieron dos pulsos consecutivos de 1500 V, 3 uFe, usando un pulsador genico (BioRad). Se devolvio la cubeta al hielo durante 10 minutos.

Las celulas transfectadas se transfirieron a placas de 96 pocillos a densidades de 3 x 105, 7,5 x 104 y 1,5 x 104 celulas/ml en 50 jl de medio no selectivo y se incubo a 37°C durante 24 horas. A continuacion, se anadieron a todos los pocillos 150 ul de medio selectivo (medio de Eagle modificado por Dulbecco libre de glutamina, con 4500 mg/L de glucosa, con 4 mg/L de piridoxina.HCl, con 110 mg/L de piruvato de sodio, sin nitrato ferrico, sin L-glutamina (JRH BioSciences, N° de catalogo 51435-78P), mas Suplemento GS 1X (Suplemento GS 50X obtenido a partir de JRH Bioscience, N° de catalogo 58672-77P), mas 10% de suero bovino fetal dializado (Gibco/BRL, N° de catalogo 26300-061)). Las placas fueron devueltas a la incubadora hasta que se hubo producido la muerte sustancial de las celulas y hubieron aparecido colonias supervivientes discretas. Una vez que se pudieron ver las colonias de transfectantes independientes de glutamina, se seleccionaron los pocillos con colonias simples y se recogieron y estudiaron los sobrenadantes gastados del cultivo de tejidos en cuanto a secrecion de IgG humana por ELISA, segun se describe a continuacion. Se obtuvo un clon productor de anticuerpo, denominado 3A9, que fue usado en posteriores estudios de este modo. Se realizo una segunda transfeccion como se ha descrito antes, excepto por el hecho de que se realizo la seleccion en presencia de L-metionina sulfoximina (MSX, un inhibidor de la glutamina sintetasa).

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Las colonias positivas fueron estudiadas por ELISA en cuanto a secrecion de IgG humana como sigue. Se revistieron placas de ELISA (NUNC Maxisorp) durante una noche a 4°C con 100 |jl de fragmento AffiniPure F(ab')2 de burro anti-IgG humana (H+L) (Jackson ImmunoResearch Laboratories) a 2,5 jg/ml en tampon carbonato pH 9,5. Las placas se lavaron cuatro veces con PBS Tween 20 y se bloquearon durante 2 h a 37°C con 200 jl de PBS, 1% BSA. Las placas se lavaron e incubaron 15 min a 37°C con 100 jl de sobrenadante de NSO estables transfectadas. Se uso IgG1 humana kappa a 1 mg/ml in PBS con 1% de BSA como patron. Se uso medio NSO fresco (DME + suplemento GS) como control negativo. Las placas fueron lavadas e incubadas 15 min a 37°C con 100 jl de fragmento AffiniPure F(ab')2 de burro conjugado a peroxidasa anti-IgG humana (H+L) (Jackson ImmunoResearch Laboratories) a 0,05 ug/ml en PBS (sin Ca2+/Mg2+). Se disolvio un comprimido de 5 mg de dihidrocloruro de O- fenilendiamina (OPD) (Sigma) en 12 ml de tampon citrato (0,1M, pH 5,0), y se anadieron 12 jl de peroxido de hidrogeno al 30% despues de disolverse el comprimido. Despues de lavar para separar el anticuerpo secundario, se anadieron 100 jl de sustrato OPD disuelto. La reaccion se detuvo con 12,5% de acido sulfurico y las placas se leyeron en un Lector de Placas Dynatech a 490 nm. Se clonaron los pocillos positivos por dilucion limitante a 2, 1 y 0,5 celulas por pocillo. Cuando todos los pocillos de un solo clon dieron positivo para la produccion de anticuerpo por ELISA, se considero la lmea como clonada.

La purificacion del anticuerpo ACT-1 humanizado de los sobrenadantes de cultivo celular de cultivos de transfectantes celulares transitorios o estables fue llevada a cabo por cromatograffa de afinidad con Protema A (Poros A/M 4,6/100 mm, 5 mL/min usando una estacion de trabajo Bio-Cad (Perseptive Biosystems, Inc.). La columna se equilibro con PBS seguido de aplicacion del sobrenadante del cultivo celular, que habfa sido previamente filtrado a traves de filtros de 0,2 micras. El volumen de sobrenadante de cultivo celular aplicado por vuelta variaba segun la concentracion de anticuerpo. Normalmente no se aplicaron mas de 15 mg de anticuerpo a la columna en una vuelta dada. El caudal era 5 ml/min a lo largo de todo el procedimiento de purificacion. Despues de la union, la columna fue lavada primero extensamente con PBS hasta OD280 nm = 0. La columna fue entonces lavada otra vez con un mmimo de 50 volumenes de columna. La columna fue posteriormente lavada con acetato de sodio 0,1 M, pH 5,0. La elucion fue llevada a cabo por lavado con Na Citrato, 0,1 M, pH 3,5. El eluato fue recogido en fracciones de 5 ml y el pH fue neutralizado por adicion de 200 jl de Na2CO3 1,5 M, pH 12. Se reunieron entonces las fracciones que conteman anticuerpo y se concentraron hasta la concentracion deseada por ultracentrifugacion (centricon, corte a los 30.000 KDa, Amicon).

Construccion de una variante mutada en Fc

Se construyo tambien una version de union no-Fc (mutada en Fc) del anticuerpo Act-1 humanizado. Este anticuerpo tiene las mismas regiones variables que el anticuerpo Act-1 humanizado (Figura 11 y Figura 12), y una region constante de IgG1 humana identica, con la excepcion de dos sustituciones de aminoacidos en la region constante de la cadena pesada de la IgG1, disenada para abolir el reconocimiento de FcR y eliminar la union de Fc (es decir, una

1 235 235 1 237 237 J '

sustitucion Leu ^ Ala y una sustitucion Gly ^ Ala ). El acido nucleico codificante de la cadena pesada del derivado mutado en Fc fue construido como sigue. Se digirio un constructo designado 3678 (obtenido a partir del Dr. Herman Waldmann, Universidad de Oxford), que codifica la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo anti- CD18 humanizado (WO 93/02191 (publicada el 4 de febrero de 1993); Sims, M.J., et al., J. Immunol. 151(4): 22962308 (1993)) en un vector de expresion pEE12, pero en el que se introdujeron dos sustituciones de aminoacido en la region constante de la cadena pesada de IgG1 por mutagenesis dirigida al sitio (Leu ^ Ala y Gly ^ Ala ), con Age I y EcoRI para liberar un fragmento de 900 pb que contema el mutante de la region constante gamma. Este fragmento fue usado entonces para sustituir la region constante gamma de tipo salvaje de cadena pesada en los sitios AgeI/EcoRI en pEE6hACT1H dando lugar a pEE6hACT1H/FCmut. De una forma analoga a la descrita anteriormente para otros constructos que contienen ambas cadenas, se preparo un solo constructo (pEE12hACT1LH/FCmut) que contiene el gen de cadena ligera reformado y el gen de cadena pesada reformado mutado en Fc.

Ejemplo 4 Caracterizacion de LDP-02, un anticuerpo ACT-1 humanizado

Se llevaron a cabo estudios de caracterizacion inicial usando anticuerpo producido a partir de celulas COS-7 transitoriamente transfectadas con pEE12hACT1LH/FCmut. Esta preparacion de anticuerpo fue producida y purificada como se ha descrito antes y se hace referencia a ella a continuacion como "1°HUM ACT-1" seguido del numero de lote apropiado.

Se realizaron ensayos adicionales usando anticuerpo producido a partir de un transfectante estable de la lmea celular murina NSO segun se ha descrito anteriormente (transfectada con pEE12hACT1LH/FCmut linealizado). A continuacion se hace referencia a esta preparacion de anticuerpo como "LDP-02/3A9/Lote 1".

Se utilizo el anticuerpo "LDP-02/3A9/Lote #1" en los siguientes estudios descritos a continuacion: SDS-PAGE, analisis por transferencia Western, enfoque isoelectrico, analisis de la composicion de aminoacidos, reactividad cruzada de especie, titulacion, ensayos de lisis mediada por el complemento, ensayos ADCC, y ensayos de inhibicion de la union. Se utilizo "1°hUm ACT-1 Lote #7 en los ensayos de afinidad #1-2, se utilizo 1°HUM ACT-1 Lote #8/9 en los ensayos de afinidad #3-5, y se utilizo 1°HUM ACT-1 Lotes #8/9 en los ensayos de union a C1q.

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A. Propiedades fisicoqwmicas

1. SDS-PAGE

Con objeto de ayudar a establecer la identidad, caracterizar la primera preparacion y valorar la pureza, se sometio LDP-02/3A9/Lote#1 a electroforesis en dodecilsulfato de sodio-gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) en condiciones no reductoras y se tino con Azul Coomassie coloidal.

Se anadieron 80 pl de LDP-02/3A9/Lote#1 a una concentracion nominal de 0,82 mg/ml a un microconcentrador. Se cambio el tampon citrato, en el que estaba disuelto el anticuerpo, tres veces, con 160 pl de tampon TRIS (0,5 mM, pH 8,8). El volumen final de la muestra despues del cambio de tampon era de 135 pl, dando una concentracion de protema de 0,486 mg/ml. Esta solucion fue diluida dos veces con tampones no reductores y reductores para obtener una concentracion de 0,243 mg/ml. Se cargo una almuota de 13 pl de la solucion de 0,243 mg/ml, que contema 3,16 pg de protema, en las calles designadas para las muestras del gel de SDS. Se realizo la SDS-PAGe y los artfculos control inclrnan patrones de peso molecular Mark 12 (Novex, #LC5677).

En condiciones no reductoras, estaba presente una banda mayoritaria con un peso molecular aparente ligeramente inferior a 200.000 Daltons en LDP-02/3A9/Lote#1. Se observaron varios componentes minoritarios entre 116.300 y 200.000 Daltons. Se observaron tambien tres componentes minoritarios adicionales con pesos moleculares aproximados de 97,400 Daltons, ligeramente mas de 55.400 Daltons, y menos de 31.000 Daltons. El barrido de gel usando una densitometna laser permitio el analisis cuantitativo de las bandas tenidas del polipeptido y luego el calculo del porcentaje de area asociada a cada banda visible (Tabla 5). Los datos obtenidos a partir del analisis cuantitativo indican que el componente mayoritario observado a aproximadamente 200.000 Daltons representaba un 84,4% de las bandas tenidas totales en la banda de la muestra de ensayo. Esta banda mayoritaria representaba el anticuerpo intacto, mientras que las otras bandas a 55.000 y 31.000 Daltons representaban las cadenas pesadas y ligeras simples, respectivamente.

En condiciones reductoras se observaron dos componentes mayoritarios en el gel de electroforesis. El peso molecular de uno de los componentes era de aproximadamente 55.400 Daltons y representaba un 68,6% de las bandas tenidas totales visualizadas en la banda del gel, mientras que el segundo componente correspondiente a ligeramente menos de 31.000 Daltons, representaba un 30,5% de las bandas tenidas totales (Tabla 5). Los pesos moleculares de estos dos componentes estan de acuerdo con los pesos moleculares esperados de las cadenas pesadas y ligeras de una inmunoglobulina G. Estos datos indican que aproximadamente un 99% de la preparacion consistfa en anticuerpo intacto o en cadenas simples de inmunoglobulinas de cadena pesada o ligera. Ademas de los componentes mayoritarios, se observo tambien un componente minoritario a ligeramente menos de 66.300 Daltons.

A partir de estos analisis, una especie de alto peso molecular, consistente con la de la inmunoglobulina G esta presente como banda mayoritaria en LDP-02/3A9/Lote#1. Tambien estan presentes varias bandas minoritarias en LDP-02/3A9/Lote1. Despues de la reduccion, se observaron dos bandas mayoritarias que muestran migraciones electroforeticas consistentes con las de las cadenas pesadas y ligera de una molecula de inmunoglobulina G.

Tabla 5

RESUMEN DE LOS DATOS DE PUREZA, AZUL COOMASSIE COLOIDAL, CONDICIONES NO REDUCTORAS Muestra Calle Area porcentual (compuesto principal)

LDP-02/3A9/Lote#1 5 84,4%

RESUMEN DE LOS DATOS DE PUREZA, AZUL COOMASSIE COLOIDAL, CONDICIONES REDUCTORAS Muestra Calle Area porcentual, bajo PM Area porcentual, bajo PM

LDP-02/3A9/Lote#1 9 68,6% 30,5%

2. Analisis por transferencia Western

Se analizaron las muestras y los patrones por SDS-PAGE como se ha descrito anteriormente. Resumiendo, se analizaron muestras reducidas y no reducidas en un gel de Tris-Glicina al 4-20%. Se hicieron correr tambien por el gel patrones de peso molecular Novex Mark 12. Se cargaron volumenes de almuotas de 2,1 pl y 4,5 pl de la solucion de 0,2143 mg/ml, dando 0,51 y 1,09 pg de protema, respectivamente, en las calles designadas para muestras en el gel de SDS.

Despues de la SDS-PAGE, se transfirieron las protemas de la muestra del gel a nitrocelulosa, segun las instrucciones del aparato de transferencia Western Novex. El tampon de transferencia utilizado fue tampon 1X Tris- Glicina en metanol al 20%. Despues de aproximadamente 2 horas, se retiro la mancha de la nitrocelulosa del aparato de transferencia y se lavo con agua DDI. Se bloqueo entonces la mancha de la nitrocelulosa a 37°C durante

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35 minutos en tampon Tris (20 mM), que contema un 3% de gelatina y 0,1% de Tween 20. Se retiro la mancha de la solucion bloqueante y se lavo dos veces con tampon Tris. Se anadio una solucion de anticuerpos de cabra anti-IgG de raton, que se preparo diluyendo x1000 una solucion madre de anticuerpos anti-IgG de raton con solucion Tris 20 mM-3% de BSA, a la mancha, y se incubo a 2-8°C durante una noche. Despues de la incubacion, la mancha se lavo con cuatro cambios de tampon Tris durante 5 minutos cada vez. Se anadio solucion de conjugado de anti-IgG de cabra y fosfatasa alcalina, preparada diluyendo x5000 el conjugado de anti-IgG de cabra y fosfatasa alcalina con solucion Tris-20 mM-3% de BSA, a la mancha y se incubo a temperatura ambiente durante 2 horas. Despues de la incubacion, se lavo la mancha con cuatro cambios de tampon Tris durante 5 minutos cada uno. Se anadio sustrato de BCIP/NBT (sal de p-toluidina de fosfato de 5-bromo-4-cloro-3'-indolilo/cloruro de nitro-azul de tetrazolio), 10 ml de una vez, a la mancha. La mancha se revelo a temperatura ambiente con agitacion. La reaccion se detuvo lavando la mancha con tampon Tris. Se repitio el procedimiento anterior usando anticuerpos de cabra anti-IgG humana en vez de anticuerpos de cabra anti-IgG de raton.

Tanto en condiciones reductoras como no reductoras, usando el reactivo anti-IgG de raton, las muestras de IgG de 0,51 |jg y 1,09 |jg fueron claramente detectadas en la mancha de nitrocelulosa. La intensidad de las bandas aumento al aumentar la concentracion. En condiciones no reductoras, se detecto una banda principal, que migraba ligeramente mas rapido que el marcador de 200.000 Daltons. Se detectaron tambien varias bandas mas palidas. Dos de estas bandas migraban mas lentamente que la banda principal y aproximadamente otras tres bandas migraron mas rapido. En condiciones reductoras, se detectaron dos bandas, caractensticas de las cadenas pesadas y ligeras de la inmunoglobulina G.

Usando el reactivo anti-IgG humana tanto en condiciones reductoras como no reductoras, se detectaron claramente las muestras de IgG de 0,51 jg y 1,09 jg en la mancha de nitrocelulosa. La intensidad de las bandas aumento al aumentar la concentracion. En condiciones no reductoras, se detecto una banda principal, correspondiente a una especie con un marcador de peso molecular aparente ligeramente menor que 200.000 Daltons. Las bandas mas palidas observadas en la mancha, detectadas con la anti-Ig de raton, tambien fueron detectadas. La intensidad de la inmunotincion era mayor para todas las bandas cuando se detectaron con anti-IgG humana. Se detectaron varias bandas adicionales, no observadas en la otra mancha. Es probable que estas bandas correspondan a fragmentos de IgG que carecen de epitopos reconocidos por el anti-IgG de raton. En condiciones reductoras, se detecto una banda caractenstica de la cadena pesada de una inmunoglobulina G. Como el anticuerpo era espedfico para la porcion Fc de la IgG humana, no se detecto la cadena ligera. Se observaron varias bandas minoritarias, no observadas en la mancha revelada con anti-IgG de raton, cuando la deteccion fue llevada a cabo con anti-IgG humana. Esta diferencia entre las dos manchas puede ser el resultado de la presencia de fragmentos de IgG que carecen de epitopos para la union al anti-IgG de raton.

3. Enfoque isoelectrico

Se sometio LDP-02/3A9/Lote#1 a enfoque isoelectrico (IEF) y se tino con azul Coomassie coloidal. Se compararon los resultados obtenidos para LDP-02/3A9/Lote1 con patrones de IEF (enfoque isoelectrico por sus siglas en ingles) que fueron enfocados sobre el mismo gel.

Se anadieron 80 jl of LDP-02/3A9/Lote#1 a una concentracion nominal de 0,82 mg/ml, a un microconcentrador. El tampon citrato, en el que estaba el anticuerpo, fue cambiado tres veces con 160 jl de tampon Tris (0,5 mM, pH 8,8). El volumen final de la muestra fue 135 jl. Se calculo que la concentracion final era de 0,486 mg/ml. Esta solucion fue diluida dos veces con tampon para muestras de IEF 2X para obtener una concentracion de 0,243 mg/ml. Se cargo una alfcuota de 13 jl de la solucion de 0,243 mg/ml, dando 3,16 yg de protema, sobre la muestra designada del gel de IEF. Los artfculos de control inclrnan patrones de IEF con pI 3,6-9,3 (Sigma, Cat #I-3018).

Se genero un grafico patron representando graficamente la media de la migracion a distancia relativa de ocho patrones de IEF frente al pI conocido para cada una de estas protemas patron. El ajuste de rearesion lineal de estos datos dio una pendiente negativa de 0,03459 y una ordenada en el origen de 8,91857. La R~del ajuste era igual a 0,99206.

La Tabla 6 contiene las distancias medias a las que migraron los seis patrones de IEF y el LDP-02/3A9/Lote#1. Los pI calculados para LDP-02/3A9/Lote#1 tambien se muestran en esta tabla.

Usando los parametros de regresion lineal de la grafica patron, se calculo que los pI aproximados de las cinco bandas para LDP-02/3A9/Lote#1 eran 7,88, 7,95, 8,09, 8,26, y 8,43, con el pico predominante representado por un pI de 8,09 (Tabla 6). El pI de este pico principal es favorable cuando se compara con un pI de 7,91 pronosticado, en base a la secuencia primaria de aminoacidos.

Patron

Distancia de migracion* p^

Lectina

3,3 mm 8,8

Lectina

9,5 mm 8,6

Lectina

17,88 mm 8,2

Mioglobina

59,3 mm 6,8

Anhidrasa carbonica I

74,0 mm 6,6

Anhidrasa carbonica II

92,5 mm 5,9

p-Lactoglobulina A

105,8 mm 5,1

Inhibidor de tripsina

122,0 mm 4,6

Muestra

Distancia de migracion p^

LDP-02/3A9/Lote #1 (Banda 1)

14,0 mm 8,43

LDP-02/3A9/Lote#1 (Banda 2)

19,0 mm 8,26

LDP-02/3A9/Lote #1 (Banda 3)

24,0 mm 8,09

LDP-02/3A9/Lote #1 (Banda 4)

28,0 mm 7,95

LDP-02/3A9/Lote #1 (Banda 5)

30,0 mm 7,88

* Media 1 Basado en la curva patron (pI frente a distancia migratoria) donde: pI de la muestra = Ordenada en el origen - pendiente (distancia de migracion de la muestra).

4. Analisis de la composicion de aminoacidos

Se realizo el analisis de la composicion de aminoacidos para determinar el contenido proteico y la composicion de 5 aminoacidos LDP-02/3A9/Lote#1 y confirmar la identidad.

Se retiraron primero almuotas de 45 jl por triplicado para hidrolisis. Se realizo la hidrolisis a 165°C durante 60 minutos usando vapores de HCl 6N. Como control, el recipiente de hidrolisis contema una protema patron, que fue hidrolizada simultaneamente con el LDP-02/3A9/Lote#1. Tambien se cromatografiaron patrones de aminoacidos antes y despues del analisis del LDP-02/3A9/Lote#1. Los artmulos control inclman seroalbumina bovina (solucion 10 control Tektagen:310:197A) como protema patron y mezcla de hidrolizado de aminoacidos (solucion control Tektagen:310:199A) como patron de aminoacidos.

El metodo del ensayo empleaba el analisis del hidrolizado de protema resuspendido o solucion de aminoacidos libres por "HPLC" de intercambio ionico con reaccion de ninhidrina post-columna y monitorizacion de la absorbancia a dos longitudes de onda. Se cuantifico la absorbancia a ambas longitudes de onda por comparacion con una tabla 15 de calibracion obtenida analizando patrones de aminoacidos por triplicado.

En la Tabla 7 se presenta la composicion de aminoacidos. Se determino que la concentracion proteica del LDP- 02/3A9/Lote#1 era de 0,709 mg/mL. Despues de corregir la falta de cuantificacion de W y C, la concentracion de protema se reviso a 0,740 mg/mL. Los datos y los calculos pertinentes se resumen en la Tabla 8.

Para LDP-02/3A9/Lote#1, se hizo un solo punto temporal de hidrolisis (60 min) a 165°C usando vapores de HCl 6N. 20 Se aplicaron factores de correccion, que se habfan obtenido a partir de la protema patron (BSA), a las determinaciones del contenido proteico (Tabla 8).

En las condiciones de este metodo, los valores de porcentaje en moles obtenidos para la prolina (Tabla 7) pueden estar ligeramente elevados, debido a la presencia de un pico coeluyente de cistema. En consecuencia, la exactitud de la cuantificacion de la prolina es dependiente de la muestra, en base a la cantidad de cistema presente en los hidrolizados de la muestra. Para este analisis, el contenido de prolina ha sido corregido usando un factor de 5 correccion derivado de BSA (Tabla 8). La exactitud de esta correccion es dependiente de la muestra, en base a las cantidades relativas de cistema en la BSA (6,0%) y en la muestra.

La composicion predicha de aminoacidos de LDP-02 como porcentaje relativo /frecuencia o porcentaje en moles) en base a la secuencia nucleotidica de las cadenas pesadas y ligeras (% pronosticado) y los resultados reales del analisis de aminoacidos (% real) se presentan en la Tabla 9. La comparacion de los valores pronosticados frente a 10 los reales muestra una buena correlacion, excepto para la prolina, que, como se ha descrito previamente, es probablemente artificialmente alta debido a un pico coeluyente de cistema.

Tabla 7

Muestra:

LDP-02/3A9/LOTE#1 Sin correccion LDP-02/3A9/LOTE#1 Con factores de correccion obtenidos a partir de BSA LDP-02/3A9/LOTE#1 con correccion para W/C1 y factores derivados de BsA

AA

% moles % moles % moles

N/D

9,1 9,0 8,6

T

6,5 7,5 7,2

S

9,2 13,3 12,7

Q/E

11,4 11,3 10,8

P

8,2 9,8 9,4

G

7,8 7,4 7,1

A

5,9 5,8 5,6

V

10,2 9,5 9,1

M

0,3 0,7 0,7

I

2,5 2,6 2,5

L

8,2 7,9 7,6

Y

5,2 5,0 4,8

F

3,4 3,4 3,3

H

2,2 2,2 2,1

K

7,0 6,9 6,6

R

2,9 2,9 2,8

TOTAL

100

1 - El factor de correlacion es 0,958, basado en el contenido de W y C de 1,8% y 2,4%, respectivamente.

Determinacion del contenido proteico

AA

Media nmoles 2Factor de correccion nmoles corregidos PM residuo Cantidad encontrada (ng)

N/D

5,954 0,991 5,900 115,1 679

T

4,243 1,156 4,905 101,1 496

S

6,054 1,448 8,766 87,1 764

Q/E

7,436 0,991 7,369 128,1 944

P

5,365 0,830 4,453 97,1 432

G

5,080 0,951 4,831 57,1 276

A

3,884 0,983 3,818 71,1 271

V

6,681 0,930 6,213 99,1 616

M

0,221 2,433 0,538 131,2 71

I

1,606 1,036 1,664 113,2 188

L

5,379 0,961 5,169 113,2 585

Y

3,374 0,954 3,219 163,2 525

F

2,229 0,992 2,211 147,2 325

H

1,442 0,981 1,415 137,2 194

K

4,616 0,984 5,542 125,2 582

R

1,922 1,005 1,392 156,2 302

Cantidad total inyectada en la columna (ng):

Volumen de reconstitucion (pl):

3Cantidad total hidrolizada (ng):

Cantidad total hidrolizada (pg):

Volumen de muestra original (pl):

Volumen de muestra diluida (pl):

Valor de alfcuota para hidrolisis (pl):

Concentracion de protema (mg/ml):

Concentracion de protema (mg/ml) despues de la correccion para W/C

7250

220

31900

31,9

45

45

45

0,709

0,740

1 El contenido proteico no esta corregido para cistema y triptofano.

3 Se ha aplicado un factor de correccion obtenido a partir de BSA a cada aminoacido detectado. ng totales hidrolizados = (ng totales inyectados x volumen de reconstitucion (50 pl).

Composicion de aminoacidos

Sfmbolo del aminoacido

Aminoacido Numero % Pronosticado % Real

A

Ala 68 5,06 5,6

C

Cys 32 2,38 ---

D

Asp 56 4,17 ---

E

Glu 68 5,06 ---

F

Phe 40 2,98 3,3

G

Gly 90 6,70 7,1

H

His 28 2,08 2,1

I

Ile 30 2,23 2,5

K

Lys 96 7,14 6,6

L

Leu 98 7,29 7,6

M

Met 10 0,74 0,7

N

Asn 50 3,72 ---

P

Pro 94 6,99 9,4

Q

Gln 64 4,76 ---

R

Arg 36 2,68 2,8

S

Ser 170 12,65 12,7

T

Th 100 7,44 7,2

V

Val 126 9,38 9,1

W

Trp 24 6,98 ---

Y

Tyr 64 4,76 4,8

N/D

Asn/Asp 106 7,89 8,6

Q/E

Gln/Glu 132 9,82 10,8

5. Analisis EM MALDI-TOF

5 Se analizo LDP-02/3A9/Lote#1 por EM MALDI-TOF para determinar el peso molecular. Se detecto un pico principal con una masa centrada a 149.808 Da. El pico centrado a 74.927 Da representaba el ion +2 de la especie encontrada en el pico principal. Se observara que la masa del ion +2 no es exactamente la mitad del ion M+H; esta ligera disparidad se debe probablemente a la imprecision experimental, que esta dentro de +/-0,2% del valor medido.

En base a la secuencia primaria predicha del anticuerpo, la masa molecular esperada debena ser de 147.154 Da. La 10 diferencia de masa de 2.654 Da entre la masa molecular de la IgG observada y la predicha, muy probablemente,

puede atribuirse a la glicosilacion de la molecula. Esta diferencia observada representana un nivel de glicosilacion de aproximadamente 1,8%.

B. Afinidad

En primer lugar, se realizo la titulacion del LDP-02/3A9/Lote#1 y del ACT-1 murino (Lote#2) usando citometna de 15 flujo en celulas HUT-78 de origen humano. Para explicarlo brevemente, se suspendieron 1,0 x 106 celulas HUT 78 en un volumen de 100 pl de ACT-1 murino biotinilado (Lote#2), IgG1 murina biotinilada (Lote#1, preparado en LeukoSite, Inc.), LDP-02/3A9/Lote#1 biotinilado, o IgG humana biotinilada (Jackson ImmunoResearch, Avondale, PA; Lote 25794) durante 20 minutos a 4°C, despues de lo cual se retiraron los anticuerpos. Salvo indicacion en contrario, todos los reactivos se diluyeron en PBS 0,15 M/1,0% de FCS/0,1% de azida sodica. Las concentraciones 20 variables para ambos anticuerpos inclrnan 30 pg/ml (ACT-1 murino solo), 15 pg/ml, 7,5 pg/ml, y subsiguientes

diluciones 1:10 de cada una. Despues de separar los anticuerpos primarios, las celulas se suspendieron entonces en 100 pl de estreptavidina ficoeritrina (Dako Corp., Carpinteria, cA) diluida 1:200. Despues de lavar en 200 pl de

5

10

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30

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40

PBS, se resuspendieron las en 0,5 ml de PBS/1% de formalina y se refrigeraron hasta su analisis. Las muestras se analizaron en un FACScan (Becton Dickinson Corp., San Jose, CA) usando un laser de 488 nm para excitar la ficoeritrina. Para cada muestra, se analizo un mmimo de 10.000 celulas y se calculo la fluorescencia media de canal (MCF). Todas las muestras fueron realizadas por duplicado.

Estos estudios de titulacion indicaron que, a concentraciones de aproximadamente 1,0 ug/ml, se aproximaba a la fluorescencia maxima usando tanto ACT-1 murino como LDP-02/3A9/Lote#1 (Figura 15). Se consiguio la fluorescencia media de canal semimaxima a concentraciones de LDP-02 menores que para ACT-1 murino (0,1 pg/ml para ACT-1 murino biotinilado Lote#2, y 0,02 pg/ml para LDP-02/3A9/Lote#, respectivamente).

Las valoraciones relativas de afinidad (y especificidad) fueron realizadas utilizando citometna de flujo y union competitiva cruzada de LDP-02 y anticuerpo Act-1 murino y viceversa en celulas HuT-78 de origen humano. Resumiendo, se suspendieron 1,0 x 106 HuT-78 celulas, o bien en 100 pl de Act-1 murino biotinilado (Lote#2) a 0,1 pg/ml con concentraciones variables de 1°HUM ACT-1 no conjugado o de Act-1 murino no conjugado durante 20 minutos a 4°C, despues de lo cual se retiraron los anticuerpos. En un experimento aparte, se usaron 100 pl de LDP- 02/3A9/Lote#1 biotinilado a 0,02 pg/ml con concentraciones variables de ACT-1 murino no conjugado ACT-1 (Lote#2) y LDP-02/3A9/Lote#1 no conjugado. Las concentraciones de anticuerpos biotinilados mantenidas constantes eran la concentraciones que daban lugar a una fluorescencia media de canal (MCF) semimaxima en celulas HUT-78 tenidas en identicas condiciones, como se demostro anteriormente. Salvo indicacion en contrario, todos los reactivos se diluyeron en PBS 0,15 M/1,0% de FCS/0,1% de azida sodica. Las concentraciones variables para ambos anticuerpos variaban en incrementos semilogantmicos de 2,0 x 10'6M a 5,0 X 10-11M. Despues de separar los anticuerpos primarios, las celulas fueron entonces resuspendidas en 100 pl estreptavidina ficoeritrina (Dako Corp., Carpinteria, CA) diluida 1:200. Despues de lavar en 200 pl de PBS, las celulas fueron resuspendidas en 0,5 ml de PBS/1% de formalina y refrigeradas hasta ser analizadas. Las muestras se analizaron en un FACScan (Becton Dickinson Corp., San Jose, CA) usando un laser de 488nm para excitar la ficoeritrina. Para cada muestra, se analizo un mmimo de 10.000 celulas y se calculo MCF. Todas las muestras se realizaron por duplicado. La CI50 se determino como la concentracion de anticuerpo no conjugado que produdas una reduccion del 50% en la FMC del anticuerpo homologo biotinilado.

Se realizaron estimaciones de afinidad en cinco experimentos independientes competitivos cruzados entre LDP-02 (1° HUM ACT-1) y ACT-1 murino. Cuando se uso Act-1 murino biotinilado como anticuerpo mantenido constante en el ensayo, los valores de CI50 (± 1 SEM) para LDP-02 (5,43 ± 0,86 nM) fueron estadfsticamente menores que para ACT-1 murino (7,94 ± 1,17 nM; p=,02, prueba t de dos colas: parejas de dos muestras para las medias), mientras que la IgG1 humana irrelevante o la IgG1 murina no teman ningun efecto competitivo (todos los experimentos se resumen en la Tabla 10; un experimento se muestra en la Figura 16). De forma similar, cuando el LDP- 02/3A9/Lote#1 era el anticuerpo mantenido constante en el ensayo, se necesitaba mayor concentracion de Act-1 murino no conjugado que de LDP-02/3A9/Lote#1 para competir con LDP-02 y expulsarlo de las membranas de las celulas HuT-78 (CI50 = 6,3 nM frente a 4,3 nM, respectivamente). En cada experimento, LDP-02 tema una CI50 menor que el Act-1 murino. Estos resultados demuestran que LDP-02 era espedfico para el epitopo reconocido por el Act-1 murino y que su afinidad de union era mejor que la del anticuerpo murino.

Tabla 10

Valoracion de la afinidad para ACT-1 murino y ACT-1 humanizado (LDP-02)

Experimento #

Anticuerpo Lote # Cl50(nM)

1

ACT-1 (murino) 2 7,57

2

2 10,95

3

2 6,02

4

2 4,91

5

2 10,24

MEDIA ± SEM 7,94 ± 1,17

1

LDP-02 (humanizado) 7 4,34

2

7 6,13

3

8/9 4,71

4

8/9 3,53

5

8/9 8,44

MEDIA ± SEM 5,43 ± 0,86

p = 0,02

Prueba t de dos colas: Parejas de dos muestras para las medias

5

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30

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55

C. Reactividad cruzada de especie

Se utilizo citometna de flujo para evaluar la reactividad cruzada de especie. Se anadieron 100 |jl de sangre anticoagulada con EDTA extrafda de ser humano, perro, gato, cobaya o rata a tubos FACS. Se separo el plasma y se resuspendieron entonces las pellas de sangre en 100 jl de, o bien LDP-02/3A9/LOTE#1 biotinilado, IgG humana biotinilada irrelevante (Jackson ImmunoResearch, Avondale, PA), Act-1 murino biotinilado Lote#2, o IgG1 murina biotinilada irrelevante (Dako Corp., Carpinteria, CA) a una concentracion de 15 ug/ml. Salvo indicacion en contrario, todos los reactivos se diluyeron en PBS 0,15 M/1,0% de FCS/0,1% de azida sodica. Las muestras fueron incubadas con anticuerpos durante 20 minutos a 4°C despues de lo cual los anticuerpos fueron retirados por lavado. Se incubaron entonces las celulas con 100 jl de estreptavidina ficoeritrina diluida 1:200 (Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, AL) durante 20 minutos a 4°C. Se dializaron entonces los globulos rojos de la sangre usando un reactivo de lisis comercial (solucion de lisis FACS, Becton Dickinson, San Jose, CA) segun el protocolo del fabricante. Despues de lavar en PBS, se resuspendieron las celulas en 0,5 ml de PBS/1% de formalina y se refrigeraron hasta su analisis. Las muestras fueron analizadas en un FACScan (Becton Dickinson Corp., San Jose, CA) usando un laser de 488nm para excitar la ficoeritrina. Se ajusto la puerta de adquisicion de linfocitos con parametros de dispersion de la luz hacia adelante y a 90°C. Se analizaron 10.000 celulas para cada muestra.

LDP-02/3A9/Lote#1 biotinilado reconoda una subpoblacion de linfocitos humanos con un patron heterogeneo de tincion, similar al producido con el Act-1 murino y distinto del patron producido por tincion con controles emparejados en cuanto a isotipo humanos o murinos. Ademas, cuando se examinaron en linfocitos de perro o de gato, tanto el LDP-02/3A9/Lote#1 como el Act-1 murino produdan un patron de tincion heterogeneo similar al derivado usando linfocitos humanos. El LDP-02/3A9/Lote#1 o el ACT-1 murino no reconodan los linfocitos de rata o de cobaya en estas condiciones.

D. Union a C1q

Se utilizo citometna de flujo para valorar el potencial de LPD-02 para unirse al componente C1q, usando una tecnica descrita previamente (Sims, M.J. et al., J. Immunol. 151: 2296-2308 (1993)). Se aislaron celulas mononucleares de sangre periferica (PBMCs) humana por separacion por densidad de Ficoll estandar. Primero, se bloquearon 375.000 celulas con suero normal de conejo al 10% en PBS durante 10 minutos a 4°C. Una vez separadas por lavado, las celulas se incubaron con 100 jl de, o bien (a) CAMPATH-1H (Therapeutic Antibody Center, Cambridge, U.K.), (b) IgG1 humana (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), (c) LDP-01 (un derivado del anticuerpo anti-CD18 descrito en WO 93/02191 (publicada el 4 de febrero de 1993) y Sims, M.J., et al., J. Immunol. 151(4): 2296-2308 (1993), que contiene dos sustituciones de aminoacidos en la region constante de la cadena pesada de IgG1 (Leu235 ^ Ala235 y Gly237 ^ Ala237), tambien denominado "FcRmut CD18", Therapeutic Antibody Center, Cambridge, U.K.), o (d) LDP-02 (1°C hum ACT-1 Lote#8/9) a 10 ug/ml durante 20 minutos a 4°C. CAMPATH-1H sirvio como anticuerpo control positivo, mientras que LDP-01 e IgG1 humana se utilizaron como anticuerpos control negativos. Todos los reactivos se diluyeron en 2% de BSA/PBS. Como control negativo adicional, tambien se anadio 2% de BSA/PBS en solitario. Se retiro entonces el anticuerpo por lavado, y se resuspendieron las celulas en 50 jl de componente C1q (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) de complemento humano a 10 jg/ml durante 30 minutos a 4°C. Las celulas fueron entonces lavadas y resuspendidas en 100 jl de anticuerpo de conejo anti-C1q humano conjugado a FITC (Dako Corp., Carpinteria, CA) a 20 ug/ml durante 20 minutos a 4°C. Despues de lavar en 200 jl PBS, las celulas fueron resuspendidas en 0,5 ml de PBS/1% de formalina y refrigeradas hasta su analisis. Las muestras se analizaron en un FACScan (Becton Dickinson Corp., San Jose, CA) usando un laser de 488 nm para excitar FITC. Para cada muestra, se analizo un mmimo de 10.000 celulas y se calculo la fluorescencia media de canal (MCF).

Las PBMC humanas incubadas con CAMPATH-1H fijaron C1q humano, dando como resultado un desplazamiento significativo en MCF, mientras que los patrones de tincion provocados por incubacion de las PBMC con LDP-01, BSA, o IgG1 humana fueron todos similares y se caracterizaron por una tincion de fondo relativamente baja. el patron de tincion producido por la preincubacion de PMBC con LDP-02 fue identico al producido en estas muestras control negativas, lo que demuestra que LDP-02 no fija C1q en estas condiciones.

E. Lisis mediada por complemento

Se examino la capacidad de LDP-02/3A9/Lote#1 para participar en la lisis celular mediada por complemento usando un protocolo ya descrito en Bindon, C.I., et al. (Transplantation, 40: 538-544 (1985)). Se extrajo sangre humana heparinizada asepticamente y se recogio el plasma y se puso inmediatamente sobre hielo. Se aislaron las celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) por centrifugacion durante 15 minutos sobre una capa de Ficoll- Hypaque, densidad 1,077 g/ml, y se lavaron dos veces en medio completo consistente en RPMI 1640/10% de FCS/100 U/ml de penicilina/100 jg/ml de estreptomicina/L-glutamina 2,0 mM. Se incubaron entonces 25 millones de celulas a 37°C durante 1 h en 150 jCi de 51cromato de sodio en solucion salina esteril (E.I. du Pont de Nemours & Co. Inc., Wilmington, DE). Las celulas fueron lavadas dos veces en medio y resuspendidas a 106/ml. Se anadieron entonces 50 jl de la suspension (5,0 x 104 celulas) a pocillos de una placa de microtitulacion de fondo en U, que contema 100 jl de, o bien (a) CAMPATH-1H (Therapeutic Center, Cambridge, U.K.), (b) CAMPATH-1G (Therapeutic Center, Cambridge, U.K.), (c) IgG1 humana (Sigma Chemical Co., St. Louis, mO), (d) LDP-02/3A9/Lote#1, o (e)

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LDP-01 (FcRmut CD18, Therapeutic Antibody Center, Cambridge, U.K. (vease mas arriba)) a concentraciones de 50, 25, 5, 2,5, y 0,5 |jg/ml en medio. Los anticuerpos CAMPATH-1 fueron utilizados como anticuerpos control positivos en el ensayo, mientras que IgG1 humana y LDP-01 fueron utilizados como controles negativos. Los pocillos adicionales conteman celulas suspendidas en 100 jl de 0,1% de Triton-X-100 (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ) en medio completo. Las celulas incubadas con Triton-X-100 fueron usadas para medir la liberacion total, mientras que los pocillos control sin anticuerpo fueron usados para medir la liberacion espontanea. Despues de incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente, se anadieron 50 jl de plasma autologo como fuente de complemento a cada pocillo hasta una concentracion final de 20%. Las celulas fueron incubadas durante 45 minutos a 37°C, despues centrifugadas a 100 g durante 2 minutos, y se recogieron 100 jl de los sobrenadantes. Se midio el 51Cr liberado en un contador gamma Cobra II todas las muestras (Packard Instruments, Downers Grove, IL). Todas las muestras fueron hechas por duplicado. El porcentaje de liberacion espedfica de 51Cr fue calculado usando la formula:

L,iberaci&n eepecifica =

(ensayu-eaponttinsc) kI-00% total - espontSrteo

Como han descrito previamente Bindon et al. (Transplantation, 40: 538-544 (1985)), tanto CAMPATH-1H como ATH- 1G indudan hasta un 35% de lisis mediada por complemento de PBMC humanas de manera dependiente de la dosis. Ademas, como era de esperar, los controles de IgG1 humana y LDP-01 (Fc-mut CD18) no indujeron ninguna lisis celular detectable. LDP-02 no medio la lisis celular a ninguna de las concentraciones examinadas, hasta 25 ug/ml inclusive (Figura 17).

F. Toxicidad mediada por celulas dependiente de anticuerpos (ADCC)

Se utilizaron blastos CD3+ humanos como celulas diana para valorar la capacidad de LDP-02 para participar en la citotoxicidad mediada por celulas y dependiente de anticuerpos (ADCC). Se generaron blastos CD3+ en placas de 24 pocillos revestidos con el anticuerpo RT66 anti-CD3 a una concentracion de 5 jg/ml diluido en PBS. Celulas mononucleares de sangre periferica (PBMCS) humanas fueron aisladas por centifugacion durante 15 minutos sobre una capa de Ficoll-Hypaque, densidad 1,077 g/ml, lavadas y resuspendidas en medio completo, segun se ha descrito en la seccion anterior. Despues se anadieron 2 millones de celulas a cada pocillo de la placa de 24 pocillos y se incubaron a 37°C, 5% CO2 durante 4 dfas. Las celulas fueron entonces transferidas a un matraz de cultivo e incubadas a 37°C, 5% CO2, en medio con IL-2 recombinante humana (Genzyme Corp., Cambridge, MA) a una concentracion de 10 unidades/ml. Despues de tres dfas en cultivo, 10,0 x 106 blastos CD3 fueron entonces incubados a 37°C durante 45 minutos en 150 jCi 51cromato de sodio en solucion salina esteril (E.I. du Pont de Nemours & Co. Inc., Wilmington, DE; Lote#95M682). Despues de dos lavados en medio completo, las celulas fueron resuspendidas hasta 2 x 105 celulas/ml, y se anadieron 50 jl (10,000 celulas) de la suspension a los pocillos de una placa de microtttulo de una placa de microtitulacion de 96 pocillos de fondo en U. Los pocillos conteman 50 jl de, o bien CAMPATH-1H (Therapeutic Antibody Center, Cambridge, U.K.) o LDP-02/3A9/Lote#1 a concentraciones finales de 50, 5, 2,5, 0,5, 0,25, o 0,05 jg/ml en medio. Las celulas fueron incubadas con anticuerpos durante 30 minutos a temperatura ambiente despues de lo cual se anadieron 0,5 x 106 PBMC recien aisladas (gradiente de ficoll-hypaque, 2 lavados en medio completo a 37°C), procedentes de un donante diferente, a cada pocillo como celulas efectoras (relacion efectoras:diana de 50:1). A los pocillos adicionales, se anadieron 100 jl de 5% Triton-X-100 en medio (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ). Las celulas incubadas con Triton-X-100 fueron usadas para medir la liberacion total, mientras que los controles sin anticuerpo y las celulas efectoras se incluyeron para medir la liberacion espontanea de radiactividad. Las celulas se centrifugaron a 100g durante 2 minutos a temperatura ambiente y se incubaron durante 20 horas a 37°C, 5% CO2, despues de lo cual las celulas fueron transferidas a una placa de 96 pocillos de fondo en V y se dejaron precipitar a temperatura ambiente. Se recogieron 100 jl de sobrenadantes y se midio la reactividad liberada usando un contador gamma Cobra II (Packard Instruments, Downers Grove, IL). Todas las muestras fueron realizadas por duplicado. El porcentaje de liberacion espedfica de 51Cr se calculo usando la formula:

L,iberaci&n eepecifica =

(ensayu-eaponttinsc) kI-00% total - espontSrteo

Como demostraron previamente Sims, M.J. et al., J. Immunol., 151(4): 2296-2308 (1993), CAMPATH-1H participo en ADCC de manera dependiente de la dosis, provocando hasta aproximadamente un 30% de liberacion espedfica de 51Cr a concentraciones > 5,0 ug/ml. No se detecto liberacion espedfica alguna en pocillos que conteman LDP-02 a ninguna de las concentraciones examinadas.

G. Inhibicion de la adhesion a MAdCAM-1

Se valoro la capacidad de LDP-02 para inhibir la union de a4p7 a MAdCAM-1 usando celulas a4p7+ RPMI 8866 (un linfoma humano de celulas B) marcadas fluorescentemente y una quimera MAdCAM-1 que comprende el dominio extracelular de MAdCAM-1 humano fusionado a la region Fc de una IgG1 humana (una region constante derivada del mismo constructo usado para hacer la region constante de LDP-02 mutado en Fc).

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1. Construccion de la quimera MAdCAM-IgG

Se uso un clon MAdCAM-1 humano designado pcDhuMAd4 (ADNc del clon 4 en pCADN3; Shyjan, A.M. et al., J. Immunol., 156: 2851-2857 (1996); cuyas ensenanzas se incorporan aqu mtegramente como referencia) como molde para amplification por PCR de las regiones extracelulares de MAdCAM-1 humano que hataan de ser fusionadas con la region constante de IgG1 humana, segun se describe en la Solicitud Internacional n° PCT/US96/02153 (WO 96/24673), presentada el 12 de febrero de 1996, que es una continuation en parte de la n° de serie EE.UU. 08/523,004, presentada el 1 de setiembre de 1995, que es una continuacion en parte de la n° de serie EE.UU. 08/386,857, presentada el 10 de febrero de 1995. Para construir la quimera MAdCAM-IgG, se sintetizo el cebador HUMADIG4/2 (SEQ ID NO:62), que contiene el extremo 5' de la secuencia codificante de mAdCAM-1 humana (codon ATG, en negrilla):

HindiII

5'-GGAAGCTTCCACCATGGATTTCGGACTGGCCC-3'

Este cebador 5' fue usado junto con un cebador 3' denominado HUMADIG3 para amplificar una region codificante de todo el dominio extracelular de la MAdCAM-1 humana. El cebador 3' HUMADIG3 (SEQ ID NO:63) tiene la siguiente secuencia:

imagen1

Los cebadores fueron disenados con un sitio HindIII 5' o sitios 3' SpeI segun se indica. Estos cebadores fueron utilizados para amplificar por PCR un fragmento MAdCAM usando un kit optimizador de PCR de Invitrogen (San Diego, CA). Los productos de la PCR fueron digeridos con las enzimas HindIII y SpeI para generar extremos para la donation y fueron purificados por electroforesis en gel usando el sistema de aislamiento de ADN Glassmax (Gibco, Bethesda, MD).

Se corto un fragmento de aprox. 1 kb que abarcaba las regiones CH1, H (bisagra), CH2 y CH3 por digestion con SpeI y EcoRI a partir de un constructo codificante de una cadena pesada y1 de inmunoglobulina humana que tenia una region constante humana mutada en Fc. La region constante humana en este constructo corresponde a la obtenida por amplificacion por PCR de la cadena pesada de CAMPATH-1H (Reichmann, L. et al., Nature, 322: 323327 (1988)) como describen by Sims, M.J. et al. (J. Immunol., 151: 2296-2308 (1993)) y Waldmann et al. (WO 93/02191, 4 de febrero de 1993 (pagina 23)). Las mutaciones en la region constante de este constructo (Leu235 ^ Ala235 y Gly237 ^ Ala237) fueron disenadas para reducir la union a los receptores Fcy, y fueron producidas por mutagenesis dirigida a oligonucleotidos. Asi, la fusion MAdCAM-Ig producida contiene el fragmento de region constante SpeI-EcoRI descrito por Sims et al. (J. Immunol., 151: 2296-2308 (1993)) y Waldmann et al. (WO 93/02191), excepto por la introduction de mutaciones Leu235 ^ Ala235 y Gly237 ^ Ala237.

Se aislo el fragmento SpeI-EcoRI de 1 kb codificante de la region constante de IgG1 mutada en Fc por electroforesis en gel usando el sistema de aislamiento de ADN Glassmax (Gibco, Bethesda MD). Este fragmento de region constante y el fragmento HindIII-SpeI que contema todo el dominio extracelular de MAdCAM fueron ligados en una ligacion de tres vias al vector pEE12 (Stephens, P.L. y M.L. Cockett, Nucl. Acids Res., 17: 7110 (1989) y Bebbington, C.R. y C.C.G. Hentschel, 1987, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells, (Academic Press, N.Y.), que habia sido digerido con HindIII y EcoRI. Se obtuvieron transformantes de la cepa bacteriana DH10B. Se hizo crecer a las colonias y se analizaron las preps miniplasmido por cartografia de restriction. Se secuencio un constructo, que codifica una protema de fusion que contiene todo el dominio extracelular de MAdCAM-1 (constructo HuMAdIg21) fusionado a la region constante de IgG1 mutada en Fc, a traves de toda la portion MAdCAM-1, confirmando la apropiada fusion de segmentos y la ausencia de mutaciones inducidas por la PCR. La quimera fue producida en celulas NSO y purificada por cromatografia de afinidad por Protema A estandar.

2.Ensayo de adhesion

Se revistio una placa de 96 pocillos de fondo plano y de alta union (Costar) durante 1 h a 37°C con 50 ^l de quimera MAdCAM-1 diluida a 2,5 ^g/ml en tampon carbonato, pH 9,5. Se lavaron entonces los pocillos una vez con tampon de lavado (Tris HCl 50 mM, NaCl 0,14 M, MnCh 1 mM, pH 7,2) usando una lavadora automatica de microplacas (Bio-Tek Instruments, Winooski, VT) y se bloquearon durante 1,5 h a 37°C con 100 ^l de 10% de FBS diluido en PBS.

Se lavaron primero celulas RPMI 8866 (una lmea humana de linfoma de celulas B que expresa a407 (y no a401) (Erle, D.J., et al., J. Immunol., 153:517 (1994); una donation de D. Erle)) en 20 ml de PBS (4°C) y se resuspendieron a 4,0 x 106 celulas/ml en PBS. Se reconstituyo BCECF (2',7'-bis-(2-carboxietil)-5-(y 6)-carboxi fluorescema, ester acetoximetflico; Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) a 50 ug/ml en DMSO y se anadio a la suspension celular a una dilution final de 1:500. Despues de incubar durante 30 minutos a 37°C, se lavaron las celulas entonces en tampon

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de ensayo (HBSS con 2% de suero bovino fetal, HEPES 25 mM, penicilina/estreptomicina, pH 7,2), y se anadieron 50.000 celulas a cada pocillo de una placa de 96 pocillos con fondo en V. Las celulas fueron entonces resuspendidas en 100 jl de, o bien (a) Act-1 murino, (b) IgG1 murina (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), (c) LDP- 02/3A9/Lote#1, o (d) IgG1 humana (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) a concentraciones de 15,0 a 0,00075 jg/ml en tampon de ensayo durante 10 minutos a temperatura ambiente. La placa revestida con la quimera MAdCAM-1 se lavo para separar el tampon bloqueante y entonces se transfirieron estas celulas RPMI 8866 marcadas fluorescentemente a cada pocillo. La placa se puso sobre un agitador de plataforma (New Brunswick Scientific Co., Inc., Edison, NJ) a 40 RPM durante 30 minutos a temperatura ambiente envuelta en una lamina de aluminio. Las celulas no unidas se separaron mediante una sola etapa de lavado y seguidamente se midio la fluorescencia (excitacion a 485nm, lectura a 535nm) con un Analizador Concentrador de Fluorescencia (IDEXX Laboratories, Inc., Westbrook, ME) antes y despues del lavado. Se calculo el porcentaje de celulas unidas para cada pocillo a partir de las unidades fluorescentes relativas (RFU) usando la formula:

RFU antes del lavado

% de celulas unidas =-----------------------x 100

RFU despues del lavado

Tanto LDP-02 como Act-1 murino inhibieron la adhesion de celulas RPMI 8866 a MAdCAM humana de una manera dependiente de la dosis (Figuras 18A-18B). Las concentraciones que inhibieron la adhesion en un 50% (CI50) fueron relativamente similares para Act-1 murino (0,0018 jg/ml) y LDP-02 (0,0014 jg/ml). Por lo tanto, LDP-02 inhibfa funcionalmente la adhesion mediada por a4p7 a MAdCAM-1 al menos al menos tan eficazmente como Act-1 murino.

Ejemplo 5 Anticuerpos humanizados adicionales

Como se ha descrito mas arriba, se pueden hacer algunas variaciones del anticuerpo reformado designado en el Ejemplo 2 para mejorar la afinidad y/o disminuir la capacidad antigenica del anticuerpo reformado. Tales constructos incluyen, pero sin limitarse a ellos, los que tienen una o mas de las siguientes mutaciones: mutacion M4V en la cadena ligera, mutacion R38K en la cadena pesada, mutacion A40R en la cadena pesada, y retromutacion I73T en la cadena pesada. Los mutantes pueden ser producidos individualmente (por ejemplo, una mutacion en una cadena), o en varias combinaciones.

Por ejemplo, la Figura 19 muestra los resultados de la tincion de HuT 78 usando el anticuerpo reformado (disenado en el Ejemplo 2) o un derivado con una mutacion adicional en la cadena ligera (MV4) y dos mutaciones adicionales en la cadena pesada (R38K, A40R). Estos dos anticuerpos muestran patrones de tincion similares en celulas HuT 78 (Figura 19). Las mutaciones fueron realizadas cambiando la secuencia de acido nucleico utilizando un kit de mutagenesis dirigida al sitio transformador (Transformer Site-Directed Mutagenesis Kit) (Clontech) de acuerdo con el protocolo sugerido por el fabricante. Se hicieron mutaciones tanto de las regiones variables de cadena pesada como de las de cadena ligera con fragmentos variables clonados en pCR-Script™. Se uso el trans oligo Sca I/Stu I (Clontech) para el trans oligo. Las secuencias de los oligos mutagenicos fueron las siguientes (SEQ ID NOS:38-40):

H/R38K (SEQ ID NO:38):

5'-C TGG CCA ACG

H/I73T (SEQ ID NO:39):

5'-CAC ATT GAC TGT AGA CAC TTC CGC TAG CAC AGC C L/M4V (SEQ ID NO:40):

5'-CCG GAG GTG ATG TTG TGG TGA CTC

Todas las demas manipulaciones, incluyendo la subclonacion en los vectores de expresion pEE6hCMV-B y pEE12, y la construccion de plasmidos de expresion que contienen genes tanto de cadena ligera como de cadena pesada, fueron como se ha descrito para el anticuerpo reformado primario. Las transfecciones transitorias y la tincion celular tambien se hicieron como se ha descrito para el anticuerpo reformado primario.

Claims (28)

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   REIVINDICACIONES

   1. Una inmunoglobulina humanizada o fragmento de la misma de union a antfgeno que se une selectivamente a integrina alpha4beta7, comprendiendo dicha inmunoglobulina o fragmento una cadena ligera y una cadena pesada,

   comprendiendo dicha cadena ligera regiones determinates de complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que tienen las secuencias de aminoacidos que se expresan a continuacion:

   cadena ligera:

   CDR1 aminoacidos 44-59 de SEQ ID NO:12 CDR2 aminoacidos 75-81 de SEQ ID NO:12 CDR3 aminoacidos 114-122 de SEQ ID NO:12, y

   una region de marco derivada de la region variable de la cadena ligera del anticuerpo GM607'CL (SEQ ID NO: 8), en donde en la posicion 2 la leucina esta cambiada a valina;

   comprendiendo dicha cadena pesada regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que tienen las secuencias de aminoacidos que se expresan a continuacion:

   cadena pesada:

   CDR1 aminoacidos 50-54 de SEQ ID NO:15 CDR2 aminoacidos 69-85 de SEQ ID NO:15 CDR3 aminoacidos 118-129 de SEQ ID NO:15, y

   una region de marco derivada de la region variable de la cadena pesada del anticuerpo 21/28'CL (SEQ ID NO: 10), en donde en la posicion 24 la alanina esta cambiada a glicina, en la posicion 48 la metionina esta cambiada a isoleucina, en la posicion 69 la isoleucina esta cambiada a leucina, en la posicion 71 la arginina esta cambiada a valina, en la posicion 73 la treonina esta cambiada a isoleucina.
2. 2. La inmunoglobulina humanizada o fragmento de union a antfgeno de la reivindicacion 1, en donde la cadena ligera comprende la region variable de SEQ ID NO:21, y la cadena pesada comprende la region variable de SEQ ID NO:19.
3. 3. La inmunoglobulina humanizada o fragmento de union a antfgeno de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en donde dicha inmunoglobulina o fragmento de union a antfgeno compite con anticuerpo monoclonal Act-1 murino para unirse a integrina a4p7.
4. 4. La inmunoglobulina humanizada o fragmento de union a antfgeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde dicha inmunoglobulina o fragmento de union a antfgeno tiene la especificidad epitopica del anticuerpo monoclonal Act-1 murino.
5. 5. La inmunoglobulina humanizada o fragmento de union a antfgeno de la reivindicacion 1, que comprende ademas una region constante humana del tipo gamma.
6. 6. Una cadena ligera de inmunoglobulina humanizada, o un fragmento de la misma, en donde dicha cadena ligera de inmunoglobulina humanizada o fragmento comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal Act-1 murino y una region de marco de la cadena ligera derivada de la cadena ligera del anicuerpo GM607'CL (SEQ ID NO:8), en donde en la posicion 2 la isoleucina esta cambiada a valina; comprendiendo dichas regiones determinantes de complementariedad las secuencias de aminoacidos que se expresan a continuacion de manera que un anticuerpo que comprende dicha cadena ligera o fragmento de la misma se une selectivamente a integrina a4p7:

   cadena ligera:

   CDR1 aminoacidos 44-59 de SEQ ID NO:12 CDR2 aminoacidos 75-81 de SEQ ID NO:12 CDR3 aminoacidos 114-122 de SEQ ID NO:12.
7. 7. La cadena ligera de inmunoglobulina humanizada o fragmento de la reivindicacion 6, en donde dicha cadena ligera de inmunoglobulina humanizada o fragmento comprende la region variable de SEQ ID NO:21.

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8. 8. Un acido nucleico aislado que comprende una secuencia nucleotidica que codifica la cadena ligera de inmunoglobulina humanizada o el fragmento de la reivindicacion 6 o la reivindicacion 7.
9. 9. El acido nucleico aislado de la reivindicacion 8, en donde dicha secuencia nucleotfdica comprende la secuencia codificante de la region variable de SEQ ID NO:20.
10. 10. Un vector de expresion que comprende un gen fusionado que codifica una cadena ligera de inmunoglobulina humanizada o un fragmento de la misma de la reivindicacion 6 o la reivindicacion 7.
11. 11. El vector de expresion de la reivindicacion 10, en donde dicho gen fusionado comprende la region variable que codifica la secuencia de SEQ ID NO:20.
12. 12. Una cadena pesada de inmunoglobulina humanizada o un fragmento de la misma, en donde dicha cadena pesada de inmunoglobulina humanizada o fragmento comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal Act-1 murino, y una region de marco de la cadena pesada derivada de la cadena pesada del anticuerpo 21/28'CL humano (SEQ ID NO:10), en donde en la posicion 24 alanina esta cambiada a glicina, en la posicion 48 metionina esta cambiada a isoleucina, en la posicion 69 isoleucina esta cambiada a leucina, en la posicion 71 arginina esta cambiada a valina, en la posicion 73 treonina esta cambiada a isoleucina, comprendiendo dichas regiones determinantes de complementariedad las secuencias de aminoacidos representadas mas abajo de manera que un anticuerpo que comprende dicha cadena pesada o fragmento de la misma se une selectivamente a integrina a4p:

    cadena pesada:

    CDR1 aminoacidos 50-54 de SEQ ID NO:15 CDR2 aminoacidos 69-85 de SEQ ID NO:15 CDR3 aminoacidos 118-129 de SEQ ID NO:15.
13. 13. La cadena pesada de inmunoglobulina humanizada o fragmento de la misma de la reivindicacion 12, en donde dicha cadena pesada de inmunoglobulina humanizada o fragmento comprende la region variable de SEQ ID NO: 19.
14. 14. Un acido nucleico aislado que comprende una secuencia nucleotidica que codifica la cadena pesada de inmunoglobulina humanizada o fragmento de la reivindicacion 12 o reivindicacion 13.
15. 15. El acido nucleico aislado de la reivindicacion 14, en donde dicha secuencia nucleotfdica comprende la secuencia codificante de la region variable de SEQ ID NO:18.
16. 16. Un vector de expresion que comprende un gen fusionado que codifica una cadena pesada de inmunoglobulina humanizada o fragmento de la misma de la reivindicacion 12 o reivindicacion 13.
17. 17. El vector de expresion de la reivindicacion 16, en donde dicho gen fusionado comprende la secuencia codificante de la region variable de SEQ ID NO:18.
18. 18. Una celula hospedante que comprende el vector de expresion de una cualquiera de las reivindicaciones 10, 11, 16 o 17.
19. 19. Un metodo de preparacion de una cadena ligera de inmunoglobulina humanizada, fragmento de cadena ligera de inmunoglobulina humanizada, cadena pesada de inmunoglobulina humanizada o fragmento de cadena pesada de inmunoglobulina humanizada, que comprende mantener una celula hospedante de la reivindicacion 18 en condiciones apropiadas para la expresion de una cadena ligera o cadena pesada de inmunoglobulina humanizada, por el cual se expresa y produce, y opcionalmente se afsla, una cadena ligera de inmunoglobulina humanizada, un fragmento de cadena ligera de inmunoglobulina humanizada, una cadena pesada de inmunoglobulina humanizada o un fragmento de cadena pesada de inmunoglobulina humanizada.
20. 20. Una celula hospedante que comprende un primer acido nucleico recombinante que codifica una cadena ligera de inmunoglobulina humanizada o un fragmento de la misma, y un segundo acido nucleico recombinante que codifica una cadena pesada de inmunoglobulina humanizada o un fragmento de la misma, en donde un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno que comprende dicha cadena ligera o fragmento de la misma y dicha cadena pesada o fragmento de la misma se unen selectivamente a integrina a4p7, en donde

    dicho primer acido nucleico comprende una secuencia nucleotidica que codifica una CDR derivada de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal Act-1 murino, comprendiendo dicho primer acido nucleico una secuencia nucleotfdica que codifica tres regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que tienen las secuencias de aminoacidos que se expresan a continuacion:

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    cadena ligera:

    CDR1 aminoacidos 44-59 de SEQ ID NO:12 CDR2 aminoacidos 75-81 de SEQ ID NO:12 CDR3 aminoacidos 114-122 de SEQ ID NO:12; y

    una region de marco derivada de la region variable de la cadena ligera del anticuerpo GM607'CL (SEQ ID NO:8), en donde en la posicion 2 la isoleucina esta cambiada a valina; y

    dicho segundo acido nucleico comprende una secuencia nucleotfdica que codifica una CDR derivada de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal Act-1 murino, comprendiendo dicho segundo acido nucleico una secuencia nucleotidica que codifica tres regiones determinates de complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que tienen las secuencias de aminoacidos que se expresan a continuacion:

    cadena pesada:

    CDR1 aminoacidos 50-54 de SEQ ID NO:15 CDR2 aminoacidos 69-85 de SEQ ID NO:15 CDR3 aminoacidos 118-129 de SEQ ID NO:15; y

    una region de marco derivada de la region variable de la cadena pesada del anticuerpo 21/28'CL humano (SEQ ID NO:10), en donde en la posicion 24 la alanina esta cambiada a glicina, en la posicion 48 la metionina esta cambiada a isoleucina, en la posicion 69 la isoleucina esta cambiada a leucina, en la posicion 71 la arginina esta cambiada a valina, en la posicion 73 la treonina esta cambiada a isoleucina.
21. 21. Un metodo de preparacion de una inmunoglobulina humanizada, que comprende mantener una celula hospedante de la reivindicacion 20 en condiciones apropiadas para la expresion de una inmunoglobulina humanizada, por lo que se expresan cadenas de inmunoglobulina humanizada y se produce, y opcionalmente se afsla, una inmunoglobulina humanizada.
22. 22. Una inmunoglobulina humanizada o fragmento de union a antfgeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para uso en terapia o diagnosis.
23. 23. Una composicion farmaceutica que comprende una inmunoglobulina humanizada o un fragmento de union a antfgeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y un vetculo adecuado para uso como medicamento.
24. 24. Uso de una inmunoglobulina humanizada o fragmento de union a antfgeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para la fabricacion de un medicamento para tratar una enfermedad inflamatoria o enfermedad asociada a infiltracion leucocitaria de tejidos, en donde la enfermedad es colecistitis, colangitis, pericolangitis mastitis, sinusitis cronica, pancreatitis o diabetes mellitus insulino-dependiente.
25. 25. Uso de una inmunoglobulina humanizada o fragmento de union a antfgeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para la fabricacion de un medicamento para tratar la enfermedad inflamatoria del intestino.
26. 26. El uso de la reivindicacion 25, en donde dicha enfermedad inflamatoria del intestino se selecciona del grupo que consiste en colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn.
27. 27. El uso de la reivindicacion 25 o reivindicacion 26, en donde dicha inmunoglobulina humanizada o fragmento de union a antfgeno comprende una cadena pesada y una cadena ligera, y donde dicha cadena pesada comprende la region variable de SEQ ID NO:19 y dicha cadena ligera comprende la region variable de SEQ ID NO:21.
28. 28. Uso de una inmunoglobulina humanizada o fragmento de union a antfgeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para la fabricacion de un medicamento para tratar una enfermedad inflamatoria asociada a tejidos mucosales, en donde la enfermedad es la enfermedad del injerto contra el hospedante.