ES2260573T3

ES2260573T3 - Anticuerpos y moleculas antisentido para el receptor acoplado a proteinas g que muestran afinidad selectiva por el atp.

Info

Publication number: ES2260573T3
Application number: ES03076084T
Authority: ES
Inventors: Didier Communi; Jean-Marie Boeynaems
Original assignee: Euroscreen SA
Current assignee: Ogeda SA
Priority date: 1997-07-09
Filing date: 1998-07-09
Publication date: 2006-11-01
Anticipated expiration: 2018-07-09
Also published as: DE69813476D1; JP2001500389A; ATE321789T1; EP1342729B1; CA2263798C; US20020035734A1; EP1342729A2; EP0923644A1; US20050203282A1; US7288631B2; US20020142988A1; DE69833988D1; DK1342729T3; DE69813476T2; DE69833988T2; US7264940B2; CA2263798A1; US20050158800A1; US7045345B2; EP1342729A3

Abstract

Un anticuerpo capaz de unirse a un receptor que tiene una afinidad selectiva por el ATP y que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene más del 70% de homología con una secuencia de aminoácidos que va desde el aminoácido 424 hasta el aminoácido 795 de la secuencia de aminoácidos completa mostrada en la figura 1.

Description

Anticuerpos y moléculas antisentido para el receptor acoplado a proteínas G que muestran afinidad selectiva por el ATP.

Objeto de la presente invención

La presente invención se refiere a un anticuerpo capaz de unirse a un nuevo receptor acoplado a proteínas G que tiene afinidad selectiva por el ATP y a un oligonucleótido antisentido que tiene una secuencia capaz de hibridar específicamente con la molécula de ácido nucleico que codifica para dicho receptor, y a las composiciones farmacéuticas que comprenden dichos productos.

Antecedentes de la invención

Desde 1993 se ha clonado un número impresionante de subtipos de receptores P2. Se ha creado entonces una nueva nomenclatura molecular en la que los receptores P2 acoplados a proteínas G se han denominado P2Y, mientras que los receptores P2 que tienen una actividad intrínseca de canal iónico se han denominado P2X. La familia P2Y engloba receptores purinérgicos selectivos (el receptor P2Y_{1} activado por ATP y ADP), receptores nucleotídicos responsables tanto de los nucleótidos de adenina como de los de uracilo (receptor P2Y_{2}: activados equipotencialmente por ATP y UTP) y receptores pirimidinérgicos (los receptores P2Y_{3} y P2Y_{6} activados por UDP; el receptor P2Y_{4}: activado por UTP). Los receptores P2Y_{5} y P2Y_{7} muestran homologías limitadas con los otros miembros de la familia P2Y. Se han incluido en esta familia especialmente partiendo de la base de estudios de unión a radioligandos que muestran afinidades por los nucleótidos de adenina (1-18).

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a un anticuerpo capaz de unirse a un nuevo receptor que tiene la secuencia de aminoácidos que va desde el aminoácido 424 hasta el aminoácido 795 de la secuencia completa mostrada en la figura 1 o a cualquier receptor que presente más del 50%, preferiblemente más del 70%, más preferiblemente más del 85%, más específicamente más del 95% de homología con la secuencia de aminoácidos que va desde el aminoácido 424 hasta el aminoácido 795 de la secuencia completa mostrada en la figura 1.

La invención se refiere también a un oligonucleótido antisentido que tiene una secuencia capaz de hibridar específicamente con una molécula de ARNm que codifica para el receptor según la invención de modo que se evite la traducción de dicha molécula de ARNm o a un oligonucleótido antisentido que tiene una secuencia capaz de hibridar específicamente con la molécula de ADNc que codifica para el receptor según la invención.

Dicho oligonucleótido antisentido puede comprender análogos químicos de nucleótidos o sustancias que inactivan el ARNm, o puede incluirse en una molécula de ARN dotada de actividad ribozima.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un ligando (preferiblemente un anticuerpo) distinto a las moléculas conocidas, especialmente el ATP, capaz de unirse al receptor según la invención y a un anti-ligando (preferiblemente también un anticuerpo) capaz de inhibir competitivamente la unión de dicho ligando al receptor según la invención.

Preferiblemente, dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal dirigido a un epítopo del receptor según la invención y presente sobre la superficie de una célula que expresa dicho receptor.

La invención también se refiere a la composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz del oligonucleótido según la invención, eficaz para disminuir la actividad de dicho receptor al pasar a través de una membrana celular y unirse específicamente con el ARNm que codifica para el receptor según la invención en la célula, de modo que evite su traducción. La composición farmacéutica también comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable capaz de pasar a través de dicha membrana celular.

Preferiblemente, en dicha composición farmacéutica, el oligonucleótido está acoplado a una sustancia, tal como una ribozima, que inactiva el ARNm.

Preferiblemente, el vehículo farmacéuticamente aceptable comprende una estructura que se une a un receptor sobre una célula capaz de ser captado por la célula tras su unión a la estructura. La estructura del vehículo farmacéuticamente aceptable en dicha composición farmacéutica es capaz de unirse a un receptor que es específico para un tipo celular seleccionado.

Preferiblemente, dicha composición farmacéutica comprende una cantidad del anticuerpo según la invención eficaz para bloquear la unión de un ligando al receptor según la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 representa la secuencia de nucleótidos y aminoácidos deducidos del nuevo receptor P2Y humano. Los supuestos sitios de fosforilación mediante la proteína cinasa C o mediante proteínas cinasas dependientes de calmodulina se indican respectivamente mediante un círculo negro (\bullet) o un rombo negro (\blacklozenge). El posible sitio de N-glicosilación está indicado mediante un cuadrado negro (\blacksquare).

La figura 2 representa un dendrograma de la relación estructural del receptor P2Y_{11} con los otros subtipos de P2Y. La representación gráfica se construyó utilizando el programa de alineación de secuencias múltiples, Pileup, del paquete GCG. La secuencia publicada similar a P2Y_{5} (18) es idéntica a la secuencia de P2Y_{9} presentada al Banco de Datos GenBank/EMBL.

La figura 3 representa un análisis de inmunotransferencia de tipo Northern de la expresión del mensajero de P2Y_{11}. Cada banda de la inmunotransferencia MTN contiene 2 \mug de poliA^{+} ARN procedente de diversos tejidos humanos. Cada banda de la inmunotransferencia de HL-60 contiene 10 \mug de ARN total procedente de células HL-60 diferenciadas o no diferenciadas. La hibridación con la sonda se llevó a cabo tal como se describe en Materiales y Métodos. Se obtuvieron fotos de la inmunotransferencia MTNII y de la inmunotransferencia de HL-60, respectivamente, a partir de una autorradiografía y a partir de un PhosphorImager SI (Molecular Dynamics). Los transcritos de P2Y_{11} de 2 kb de longitud se indican mediante una flecha negra.

La figura 4 representa curvas de concentración - acción de varios nucleótidos en la acumulación de IP_{3} y AMPc en células transfectadas con el receptor P2Y_{11}. Se sometieron a ensayo células transfectadas 1321N1 y CHO-K1 para determinar la acumulación de, respectivamente, IP_{3} (A) o AMPc (B) en respuesta a diversas concentraciones de los nucleótidos siguientes: ATP, 2MeSATP, ADP y 2MeSADP. Los tiempos de incubación fueron de 30 s para las mediciones de IP_{3} y de 15 min para los ensayos de AMPc. Los datos representan las medias \pm D.E. de puntos experimentales por triplicado y son representativos de dos experimentos independientes.

Descripción de una realización preferida de la presente invención Procedimientos experimentales Materiales

La tripsina procedió de Flow Laboratories (Bioggio, Suiza). Los medios de cultivo, G418 (neomicina), el suero bovino fetal (SBF), las enzimas de restricción y la Taq polimerasa se adquirieron de GIBCO BRL (Grand Island, NY). Los productos radiactivos mio-D-[2-^{3}H]inositol (17,7 Ci/mmol) y [\alpha^{32}P]ATP (800 Ci/mmol) procedieron de Amersham (Ghent, Bélgica). Dowex AG1X8 (columnas de intercambio iónico) (forma de formiato) procedieron de Bio-Rad Laboratories (Richmond, Calif.). ATP, ADP, AMP, adenosina, UTP, UDP, AP_{4}A, AP_{6}A, ácido retinoico todo trans (AR) y 12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato (TPA) se obtuvieron de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). El 2-metiltio-ATP (2MeSATP), 2-metiltio-ADP (2MeSADP) y 8(p-sulfofenil)teofilina procedieron de Research Biochemicals International (Natick, MA). La forscolina se adquirió de Calbiochem (Bierges, Bélgica). La indometacina y el dimetilsulfóxido (DMSO) procedieron de Merck (Países Bajos). El rolipram se obtuvo de los Laboratoires Jacques Logeais (Trappes, Francia). La línea celular humana HL-60 se obtuvo de la Colección Americana de Cultivos Tipo (American Type Culture Collection) (Rockville, EE.UU.). La biblioteca de ADN genómico humano procedió de Stratagene (La Jolla, CA). pEFIN3 es un vector de expresión obtenido de Euroscreen (Bruselas, Bélgica). La inmunotransferencia múltiple de tipo Northern de tejidos humanos (Multiple Human Tissues Northern blot) (MTN) procedió de Clontech (Palo Alto, CA).

Clonación y secuenciación

Se seleccionó una biblioteca de ADNc de placenta humana en condiciones de rigurosidad moderadas con una sonda de receptor P2Y_{4} marcado con [\alpha^{32}P] dATP correspondiente a una secuencia parcial que cubre los segmentos transmembrana del tercero al séptimo. Se aislaron tres clones solapantes que codifican para un nuevo receptor acoplado a proteínas G, pero que no contenía el extremo 3' de la región codificante. Se seleccionó entonces una biblioteca de ADN genómico humano con esta secuencia parcial para obtener la secuencia completa de este nuevo receptor. Las condiciones de hibridación para la selección de las dos bibliotecas fueron 6 X SSC (1 X SSC: NaCl 0,15 M, citrato de sodio 0,015 M) y formamida al 40% a 42ºC durante 14 horas y las condiciones de lavado final fueron 0,5 X SSC, SDS al 0,1% a 60ºC. Se purificaron cuatro clones genómicos y se demostró que contenían el extremo 3' del marco de lectura abierto que faltaba en los clones de ADNc. La secuencia se obtuvo en ambas cadenas tras subclonar los fragmentos de restricción solapantes en M13mp18 y M13mp19 utilizando el método de terminación de cadena didesoxi de Sanger.

Análisis de inmunotransferencia de tipo Northern

Se hibridaron dos inmunotransferencias de órganos humanos (MTN I y MTN II: 2 \mug poliA^{+} ARN/banda) y una inmunotransferencia que contenía el ARN total procedente de células HL-60 diferenciadas y no diferenciadas (10 \mug de ARN total/banda) con una sonda correspondiente al nuevo receptor con el fin de caracterizar su distribución tisular. Las células HL-60 se mantuvieron en medio RPMI 1640 complementado con un 10% de SBF, L-glutamina 5 mM, penicilina 50 U/ml y estreptomicina 50 \mug/ml a 37ºC con un 5% de CO_{2}. Las células HL-60 se incubaron durante seis días con o sin ácido retinoico 1 \muM o DMSO al 1,25% o durante ocho horas con TPA 25 nM. El ARN procedente de las células HL-60 diferenciadas o no diferenciadas se preparó con el kit RNeasy (Quiagen). Las inmunotransferencias se hibridaron previamente durante 8 horas a 42ºC en una disolución de formamida al 50%, SDS al 2%, y se hibridaron durante 18 horas en la misma disolución complementada con la sonda marcada con [\alpha^{32}P]. Las condiciones de lavado finales fueron 0,1 x SSC y SDS al 0,1% a 55ºC. Las inmunotransferencias se expusieron durante doce días y se visualizaron como una autorradiografía o utilizando el PhosphorImager SI (Molecular Dynamics).

Cultivo celular y transfección

La secuencia completa del nuevo receptor según la invención se subclonó entre los sitios Hind III y Nhe I del vector de expresión bicistrónico pEFIN3. Se transfectaron células 1321N1 y CHO-K1' con el plásmido recombinante pEFIN3 o con el plásmido sólo utilizando el método de precipitación con fosfato de calcio tal como se ha descrito (19). Las células transfectadas se seleccionaron con G418 400 \mug/ml en un medio completo (10% de SBF, penicilina 100 unidades/ml, estreptomicina 100 \mug/ml y anfotericina B 2,5 \mug/ml en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM)) dos días tras la transfección y se mantuvieron en el mismo medio (10).

Mediciones de fosfatos de inositol (IP)

Se marcaron células 1321N1 durante 24 horas con [^{3}H]inositol 10 mCi/ml en medio DMEM libre de inositol que contenía el 5% de SBF, antibióticos, anfotericina, piruvato de sodio y G418 400 \mug/ml. Las células se lavaron dos veces con tampón Krebs-Ringer Hepes (KRH) de la siguiente composición (NaCl 124 mM, KCl 5 mM, MgSO_{4} 1,25 mM, CaCl_{2} 1,45 mM, KH_{2}PO_{4} 1-25 mM, Hepes 25 mM (pH: 7,4) y glucosa 8 mM) y se incubaron en el mismo medio durante 30 min. Las células se expusieron entonces a varios nucleótidos durante 30 s. La incubación se detuvo mediante la adición de una disolución helada de ácido perclórico al 3%. Se extrajeron los IP y se separaron en columnas Dowex, tal como se ha descrito anteriormente (20).

Mediciones de AMP cíclico

Se diseminaron líneas celulares CHO-K1 o 1321N1 establemente transfectadas en placas de Petri (150.000 células por placa) y se cultivaron en medio F12 de Ham o DMEM que contenía el 10% de SBF, antibióticos, anfotericina, piruvato de sodio y G418 400 \mug/ml. Las células se incubaron previamente durante 30 min en tampón KRH con rolipram (25 \muM) y se incubaron durante diferentes tiempos en presencia de agonistas (15 min en la mayoría de los experimentos). La incubación se detuvo mediante la adición de 1 ml de HCl 0,1 M. El medio de incubación se secó, se resuspendió en agua y se diluyó según fue necesario. Se cuantificó el AMP cíclico mediante radioinmunoensayo tras acetilación, tal como se ha descrito anteriormente (21).

Resultados Clonación y secuenciación

Se seleccionó una biblioteca de ADNc de placenta humana en condiciones de rigurosidad moderada con una sonda de P2Y_{4} humano. Se obtuvieron, se purificaron y se analizaron nueve clones que hibridaban débilmente con la sonda de P2Y_{4}. Seis de ellos correspondían a la secuencia del receptor P2Y_{6} (10), mientras que los tres clones solapantes correspondían a una secuencia parcial que codifica para un nuevo receptor acoplado a proteínas G, que presenta aproximadamente el 30% de identidad con los otros receptores P2Y. El marco de lectura abierto parcial comenzó con un codón ATG en un consenso de Kozak, pero el extremo 3' faltaba en los tres clones de ADNc. Los inventores seleccionaron una biblioteca de ADN genómico humano utilizando esta secuencia parcial como sonda. Se obtuvieron cuatro clones genómicos solapantes. El mapeo de la secuencia codificante y la secuenciación parcial permitieron determinar que el gen que codifica para el nuevo receptor contiene un intrón que interrumpe la secuencia codificante en el extremo 5' del gen. Este intrón separa los tres primeros codones del resto de la secuencia codificante. Además de estos tres primeros codones, los cuatro clones genómicos contenían el marco de lectura abierto completo que incluye el extremo 3' que falta en los clones de ADNc. El marco de lectura abierto completo apareció como 1113 pares de bases (pb) de longitud y codificaba para una proteína de 371 aminoácidos que contenía un posible sitio para la N-glicosilación y dos posibles sitios para la fosforilación mediante una proteína cinasa C o mediante proteínas cinasas dependientes de calmodulina (figura 1). El nuevo receptor, denominado provisionalmente P2Y_{11}, muestra homologías significativas con los otros receptores P2Y (figura 2). En particular, se observaron un 33% y un 28% de identidad de aminoácidos, respectivamente, con los receptores P2Y_{1} y P2Y_{2} humanos.

Distribución tisular del nuevo receptor

La distribución tisular de los transcritos del nuevo receptor se investigó mediante inmunotransferencia de tipo Northern (figura 3) utilizando una sonda correspondiente a una secuencia parcial que codifica para los segmentos transmembrana 3 a 7. La señal más fuerte se observó para el bazo humano y correspondió a un ARN mensajero de 2 kilobases (kb) de longitud (MTN II). Se observó una señal más débil en el intestino delgado (MTN II). Todas las bandas en MTN I (corazón, cerebro, placenta, pulmón, hígado, músculo esquelético, riñón, páncreas) fueron negativas. Los inventores también detectaron transcritos específicos de 2 kb de longitud en células HL-60. La señal fue muy débil en las células HL-60 no diferenciadas pero aumentó cuando las células se habían tratado con ácido retinoico o DMSO. No se observó aumento cuando las células HL-60 se estimularon con TPA. Se observó una débil hibridación no específica con ARNr 18S. Estos datos se confirmaron con una sonda no solapante correspondiente a los primeros 300 pb de la región codificante, presentando homologías limitadas con los otros subtipos de P2Y.

Expresión funcional del nuevo receptor en células de astrocitoma 1321N1

La secuencia completa del nuevo receptor se introdujo en el vector de expresión pEFIN3 con el fin de transfectar la línea celular de astrocitoma 1321N1, utilizada anteriormente para caracterizar diversos subtipos de P2Y (6, 10, 12). El conjunto de clones resistentes a G418 se probó para determinar su respuesta funcional a varios nucleótidos. El ATP (100 \muM) indujo una fuerte acumulación de trifosfato de inositol (IP_{3}) en células transfectadas con el plásmido recombinante, mientras que ADP, AMP, adenosina, UTP, UDP, AP_{4}A y AP_{6}A fueron inactivos a la misma concentración. Todos los nucleótidos fueron totalmente inactivos sobre las células transfectadas con el vector solo. Se probó entonces el ATP, 2MeSATP, ADP y 2MeSADP en un gran intervalo de concentraciones. Tal como se muestra en la figura 4A, el ATP fue el agonista más potente (CE_{50} del ATP = 38 \pm 7 \muM; CE_{50} de 2MeSATP = 118 \pm 15 \muM; medias \pm intervalo de dos experimentos independientes). El efecto del ADP y el 2MeSADP fueron mínimos. La toxina pertussis (tos ferina) (50 ng/ml; 24 h de pretratamiento) no tuvo efecto sobre la respuesta del ATP, mientras que se demostró previamente que una concentración inferior de toxina pertussis suprimía la respuesta al UTP en las células de astrocitoma 1321N1 transfectadas con P2Y_{4} (22). También se obtuvo una respuesta al ATP (10 \muM) tras las mediciones de [Ca^{2+}]_{i} realizadas en las células 1321N1 transfectadas, mientras que el ADP fue inactivo a esta concentración.

Expresión funcional del nuevo receptor en células CHO-K1

Las células 1321N1 transfectadas con el nuevo receptor mostraron un fuerte aumento del AMPc en respuesta al ATP. También se obtuvo una respuesta endógena mucho más inferior, pero significativa, debido a la degradación de los nucleótidos de adenina en adenosina en las células 1321N1 transfectadas con el vector solo. Las células CHO-K1 expresan un receptor P2Y_{2} endógeno acoplado a la ruta del fosfoinosítido (23), pero no poseen receptores de adenosina acoplados a la adenilil ciclasa. Por tanto, se utilizaron células CHO-K1 con el fin de caracterizar el acoplamiento del nuevo receptor a la ruta del AMPc. En primer lugar se probó un conjunto de clones de CHO-K1 resistentes a G418 para determinar su respuesta a varios nucleótidos a una concentración de 100 \muM. El ATP pudo inducir un fuerte aumento en el contenido de AMPc, mientras que fue inactivo sobre células transfectadas con el vector solo. ADP, AMP, adenosina, UTP y UDP fueron completamente inactivos. Se establecieron curvas concentración - acción para ATP, 2MeSATP, ADP y 2MeSADP (figura 4B). El orden de clasificación de la potencia fue el mismo que en el estudio con fosfato de inositol en las células 1321N1. Se obtuvieron curvas tras 15 min de estimulación por los agonistas; sin embargo, ya se obtuvo una respuesta significativa del AMPc con respecto al ATP tras 2 min de estimulación. La respuesta al ATP (30 \mum) no se inhibió ni por indometacina (10 \mug/ml, presente desde 30 minutos antes de la estimulación y añadida de nuevo en el medio de estimulación) ni mediante 8(p-sulfofenil)teofilina (100 \muM).

El receptor según la invención presenta algunas peculiaridades estructurales que lo diferencian de algunos otros subtipos de P2Y. Con respecto a su estructura génica, la secuencia codificante está interrumpida por un intrón. La comparación entre las secuencias del ADNc y el ADN genómico ha demostrado claramente la ausencia del intrón en la región codificante del receptor P2Y_{1} humano (24, 25), el receptor P2Y_{2} de rata (26) y el receptor P2Y_{6} de rata (11). En lo que se refiere a la estructura de la proteína, los bucles extracelulares segundo y tercero son significativamente más grandes que los de los otros receptores P2Y. La homología con los otros subtipos es relativamente débil (aproximadamente del 30%). El receptor acoplado a proteínas G más próximo es el receptor P2Y_{1} humano (33%), que también es un receptor de respuesta a nucleótidos de adenina (3, 4). Los experimentos de mutagénesis con el receptor P2Y_{2} han identificado tres aminoácidos cargados positivamente en los dominios transmembrana sexto y séptimo (His^{262}, Arg^{265} y Arg^{292}), que desempeñan un papel crucial en la unión a nucleótidos (presumiblemente mediante la neutralización de la carga negativa de los grupos fosfato) (27). Estos tres residuos se conservan en este nuevo receptor.

Hasta ahora, se han descrito en la bibliografía ocho subtipos del receptor P2Y (P2Y_{1}-P2Y_{8}). Además, recientemente se han presentado dos secuencias relacionadas con el receptor P2Y_{5} y denominadas P2Y_{9} y P2Y_{10}, en el Banco de Datos GenBank/EMBL. La secuencia de P2Y_{9} es idéntica a la publicada recientemente con el nombre "similar a P2Y_{5}" (18). Por tanto, el nuevo receptor descrito en este documento podría denominarse P2Y_{11}. Sin embargo, ya ha quedado claro que la nomenclatura necesita una revisión. Recientemente se demostró que el receptor P2Y_{7} es realmente un receptor para el leucotrieno B_{4} (16) y no hay evidencia funcional de que los receptores P2Y_{5} y relacionados (similares a P2Y_{5} o P2Y_{9}, P2Y_{10}) sean receptores de nucleótidos (17, 18).

Entre los dieciséis órganos humanos probados mediante inmunotransferencia de tipo Northern, los transcritos de P2Y_{11} de 2 kb de tamaño sólo fueron detectables en el bazo, y con menor intensidad en el intestino delgado. Esta distribución recuerda a la del mensajero de 1,7 kb del P2Y_{6} humano. La observación de la expresión del receptor P2Y_{11} en la línea celular HL-60 demuestra que esta expresión se aumentó fuertemente tras el tratamiento mediante DMSO o ácido retinoico, dos agentes que se sabe que inducen la diferenciación de estas células en granulocitos (28). Por el contrario, TPA, que se sabe que induce la diferenciación monocítica de las células HL-60 (29), no estimuló la expresión del receptor P2Y_{11}. La confirmación de estos datos con una segunda sonda del ADNc de P2Y_{11}, que comparte poca similitud con otras secuencias de P2Y, excluye una posible hibridación cruzada con otro transcrito del receptor P2Y. En vista de los resultados de la inmunotransferencia de tipo Northern, se está intentando especular con que el receptor P2Y_{11} participa en la acumulación descrita recientemente de AMPc en las células HL-60 estimuladas por ATP (30).

Entre los receptores P2Y, el subtipo P2Y_{11} tiene la propiedad única de activar tanto la ruta del fosfoinosítido como la del AMPc. Otros receptores P2Y clonados están acoplados a la fosfolipasa C exclusivamente. El orden de clasificación de la potencia de los agonistas fue el mismo para las dos rutas. El ATP fue claramente mucho más potente que el ADP. Esta diferencia puede estar incluso subestimada como resultado del bajo nivel de contaminación del ATP en la preparación del ADP o la conversión del ADP en ATP durante los ensayos (4, 11). Por otra parte, el 2MeSATP tuvo el mismo efecto máximo que el ATP, pero presentó una potencia inferior, mientras que el 2MeSADP, un potente activador de los subtipos P2Y_{1} y P_{2T} (4), fue casi inactivo. Los valores de CE_{50} fueron comparables a los obtenidos en el estudio referente a los efectos de los nucleótidos extracelulares sobre la acumulación de AMPc en las células HL-60 (30).

Los efectos estimuladores de los nucleótidos de adenina sobre la ruta del AMPc se han descrito en diferentes tipos de células (31, 32). En la mayoría de los casos, los efectos estimuladores de los nucleótidos se inhibieron por las xantinas. Estos datos resultan afectados por el hecho de que es difícil excluir que el efecto de los nucleótidos de adenina está mediado por su degradación en adenosina debido a la presencia ubicua de ectonucleotidasas expresadas en la superficie celular. El estudio del AMPc se ha realizado con células CHO-K1 para evitar la respuesta del AMPc endógeno a la adenosina en la línea celular de astrocitoma. Ni las células CHO-K1 no transfectadas ni las células CHO-K1 transfectadas con P2Y_{11} hicieron que la adenosina aumentara la acumulación de AMPc. Además, la respuesta del AMPc al ATP fue insensible a la inhibición por xantina. También fue insensible a la indometacina, lo que indica que no está mediada por la liberación de prostaglandinas. Es improbable que la respuesta del AMPc fuera una consecuencia indirecta de la respuesta al calcio, puesto que el uso de ATP, que activa la ruta del fosfoinosítido mediante la activación de los receptores P2Y_{2} endógenos, o el uso de ionóforos de calcio en las células CHO-K1, no estimula la acumulación de AMPc (33). Por tanto, estos datos constituyen la primera evidencia consistente de que un receptor P_{2} puede estar acoplado a la estimulación de la adenilil ciclasa.

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30. Jiang, L. et al. (1997) Biochem. Biophys. Res. Commun. 232, 626-630.

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33. Thekkumkara, T.J. et al. (1995) Mol. Cell Biochem. 152, 77-86.

Claims

1. Un anticuerpo capaz de unirse a un receptor que tiene una afinidad selectiva por el ATP y que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene más del 70% de homología con una secuencia de aminoácidos que va desde el aminoácido 424 hasta el aminoácido 795 de la secuencia de aminoácidos completa mostrada en la figura 1.

2. Anticuerpo según la reivindicación 1, capaz de unirse a un receptor que tiene más del 85% o más del 95% de homología con una secuencia de aminoácidos que va desde el aminoácido 424 hasta el aminoácido 795 de la secuencia de aminoácidos completa mostrada en la figura 1.

3. Anticuerpo según la reivindicación 1 ó 2, capaz de unirse a un receptor que tiene una secuencia de aminoácidos que va desde el aminoácido 424 hasta el aminoácido 795 de la secuencia de aminoácidos completa mostrada en la figura 1.

4. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 3, que es un anticuerpo monoclonal.

5. Anticuerpo según la reivindicación 4, que se dirige a un epítopo de un receptor que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene más del 70% de homología con una secuencia de aminoácidos que va desde el aminoácido 424 hasta el aminoácido 795 de la secuencia de aminoácidos completa mostrada en la figura 1, estando presente dicho epítopo sobre la superficie de una célula.

6. Anticuerpo según la reivindicación 4, que se dirige a un epítopo de un receptor que tiene más del 85% o más del 95% de homología con una secuencia de aminoácidos que va desde el aminoácido 424 hasta el aminoácido 795 de la secuencia de aminoácidos completa mostrada en la figura 1, estando presente dicho epítopo sobre la superficie de una célula.

7. Anticuerpo según la reivindicación 4, que se dirige a un epítopo de un receptor que tiene una secuencia de aminoácidos que va desde el aminoácido 424 hasta el aminoácido 795 de la secuencia de aminoácidos completa mostrada en la figura 1, estando presente dicho epítopo sobre la superficie de una célula.

8. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, eficaz para disminuir o bloquear la unión de un ligando al receptor.

9. Un oligonucleótido antisentido que tiene una secuencia capaz de hibridar específicamente con una molécula de ácido nucleico que tiene más del 50% de homología con una secuencia de ADN truncada que va desde el nucleótido 1309 hasta el nucleótido 2424 de la secuencia de ácidos nucleicos completa mostrada en la figura 1.

10. Oligonucleótido antisentido según la reivindicación 9, que tiene una secuencia capaz de hibridar específicamente con una molécula de ácido nucleico que tiene más del 70%, preferiblemente más del 85% o más del 95% de homología con una secuencia de ADN truncada que va desde el nucleótido 1309 hasta el nucleótido 2424 de la secuencia de ácidos nucleicos completa mostrada en la figura 1.

11. Oligonucleótido antisentido según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 9 ó 10, que tiene una secuencia capaz de hibridar específicamente con una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de ADN truncada que va desde el nucleótido 1309 hasta el nucleótido 2424 de la secuencia de ácidos nucleicos completa mostrada en la figura 1.

12. Oligonucleótido antisentido según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 9 a 11, que comprende análogos químicos de nucleótidos.

13. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad del oligonucleótido antisentido según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, eficaz para disminuir la actividad de un receptor que tiene una afinidad selectiva por el ATP y que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene más del 70%, preferiblemente más del 85%, más preferiblemente más del 95% de homología con una secuencia de aminoácidos que va desde el aminoácido 424 hasta el aminoácido 795 de la secuencia de aminoácidos completa mostrada en la figura 1, o que tiene una secuencia de aminoácidos que va desde el aminoácido 424 hasta el aminoácido 795 de la secuencia de aminoácidos completa mostrada en la figura 1, al pasar a través de una membrana celular y unirse específicamente con el ARNm que codifica para dicho receptor en una célula de modo que evite su traducción y un vehículo farmacéuticamente aceptable capaz de pasar a través de una membrana celular.

14. Composición farmacéutica según la reivindicación 13, en donde el oligonucleótido se acopla a una sustancia que inactiva el ARNm.

15. Composición farmacéutica según la reivindicación 14, en donde la sustancia que inactiva el ARNm es una ribozima.

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16. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 13 a 15, en donde el vehículo farmacéuticamente aceptable comprende una estructura que se une a un receptor sobre una célula capaz de ser captado por la célula tras la unión a la estructura.

17. Composición farmacéutica según la reivindicación 16, en donde la estructura del vehículo farmacéuticamente aceptable es capaz de unirse a un receptor que es específico para un tipo de célula seleccionado.