ES2317643T3

ES2317643T3 - Receptor de galanina, acidos nucleicos, celulas transformadas y usos.

Info

Publication number: ES2317643T3
Application number: ES95909825T
Authority: ES
Inventors: Brigitte Amiranoff; Estelle Habert-Ortoli; Isabelle Loquet
Original assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Aventis Pharma SA
Current assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Aventis Pharma SA
Priority date: 1994-02-17
Filing date: 1995-02-14
Publication date: 2009-04-16
Anticipated expiration: 2015-02-14
Also published as: EP0745122A1; EP0745122B1; CA2182621A1; WO1995022608A1; DE69535886D1; FR2716205A1; ATE414771T1; DK0745122T3; FR2716205B1; JP3989536B2; US6447996B1; US20030166895A1; PT745122E; AU1814995A; JPH09510344A; CA2182621C

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A POLIPEPTIDOS QUE TIENEN UNA ACTIVIDAD DE RECEPTOR DE GALANINA, PERMITIENDO EL MATERIAL GENETICO SU EXPRESION, CUALQUIER CELULA RECOMBINANTE QUE EXPRESA ESTOS POLIPEPTIDOS, Y SU UTILIZACION.

Description

Receptor de galanina, ácidos nucleicos, células transformadas y usos.

La presente invención se refiere a nuevos polipéptidos y al material genético que permite su expresión. Más particularmente, se refiere a nuevos polipéptidos que poseen actividad de receptor de galanina.

La galanina es un neuropéptido ubicuo de 29 aminoácidos en mamíferos (30 en el hombre) que controla funciones biológicas variadas: (i) secreciones endocrinas (insulina, somatostatina, glucagón, hormona del crecimiento...), (ii) tonicidad muscular en el tracto digestivo, (iii) control del comportamiento (ingesta alimenticia, nocicepción, aprendizaje, memoria, dolor...) por efecto neuromodulador a nivel del sistema nervioso central. Esta lista no exhaustiva de los efectos de la galanina, puesta de manifiesto generalmente en animales, explica el interés creciente de los farmacólogos por este neuropéptido. Moléculas selectivas (agonista o antagonista de la galanina) constituirían agentes farmacológicos potenciales en endocrinología, neurología y psiquiatría (Bartfai et al., (1992) TIPS 13, 312-317).

El estudio del mecanismo de acción de la galanina demuestra que actúa por medio de receptores membranarios específicos. La caracterización bioquímica y molecular del receptor (Chen et al., (1993) PNAS 90, 3845-3849, Fisone et al., (1989) Eur. J. Biochem. 180, 269-276) indica que pertenece a una familia de receptores acoplados a las proteínas G. Según los tejidos blanco, el péptido inhibe la adenilato ciclasa, disminuye el calcio intracelular, bloquea los canales cálcicos voltaje-dependientes o activa los canales potásicos ATP sensibles. Estudios sobre relaciones estructura-actividad, con la ayuda de fragmentos C- y N-terminales de la galanina y de péptidos quiméricos, han demostrado que, (1) cualquiera que sea el tejido, no es suficiente una secuencia parcial del péptido para obtener una actividad total, (2) según los tejidos, los 2 primeros aminoácidos N-terminales y el dominio C-terminal 16-29 de la galanina no son siempre esenciales para su actividad. Estas observaciones sugieren la existencia de subtipos de receptores galaninérgicos.

La presente invención describe por primera vez la clonación de un gen que codifica un receptor galaninérgico humano. La presente invención describe igualmente por primera vez la secuencia de receptores galaninérgicos y su expresión en las células recombinantes. La presente invención permite así una mejor comprensión de la estructura de los receptores galaninérgicos y estudiar de manera más precisa su mecanismo de acción. La presente invención permite igualmente obtener receptores galaninérgicos de muy grande pureza y en cantidad elevada, permitiendo la realización de estudios funcionales y farmacológicos, la fabricación de anticuerpos, etc. La invención permite también preparar fragmentos de receptores galaninérgicos de tamaño definido, así como toda clase de derivados de los receptores galaninérgicos. La invención proporciona también células recombinantes que expresan receptores galaninérgicos o fragmentos de receptores galaninérgicos, utilizables para el cribado de ligandos de estos receptores (agonistas, antagonistas, moduladores, etc.). Las secuencias de ADN de la invención permiten igualmente la realización de sondas, capaces de detectar en muestras biológicas cualquier irregularidad en la expresión de un receptor galaninérgico (no expresión, mutación, polimorfismo, etc.). Estas sondas son también utilizables para la clonación por hibridación de cualquier otro ADNc codificante de un receptor galaninérgico, a partir de tejidos de orígenes diversos, como se indica más adelante.

Un primer objeto de la invención reside, por tanto, en una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que posee actividad de receptor galaninérgico. En el sentido de la invención, receptor galaninérgico comprende especialmente todos los subtipos potenciales.

La secuencia de nucleótidos según la invención se escoge entre:

(a): toda o parte de la secuencia nucleotídica SEQ ID nº 1, y

(b): las secuencias derivadas de las secuencias (a) debido a la degeneración del código genético.

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Un modo de realización especialmente particular de la invención se representa por una secuencia nucleotídica que comprende toda o parte de la secuencia nucleotídica SEQ ID nº 1.

Las diferentes secuencias nucleotídicas de la invención pueden ser de origen artificial o no. Puede tratarse de secuencias genómicas, de ADNc, de ARN, de secuencias híbridas o de secuencias sintéticas o semisintéticas. Estas secuencias pueden obtenerse, por ejemplo, mediante cribado de bancos de ADN (banco de ADNc, banco de ADN genómico) por medio de sondas elaboradas sobre la base de la secuencia SEQ ID nº 1. Tales bancos se pueden preparar a partir de células de diferentes orígenes mediante técnicas clásicas de biología molecular conocidas por el experto en la materia. Las secuencias nucleotídicas de la invención se pueden preparar igualmente por síntesis química, principalmente según el método de las fosforamiditas, o también por métodos mixtos que incluyen la modificación química o enzimática de las secuencias obtenidas mediante cribado de bancos.

Las secuencias nucleotídicas de la invención se pueden utilizar para la producción de polipéptidos galaninérgicos. La terminología polipéptido galaninérgico designa todo polipéptido que posee actividad de receptor galaninérgico y todo fragmento o derivado de dicho polipéptido. Para la producción de polipéptidos galaninérgicos, la parte que codifica dicho polipéptido se coloca generalmente bajo el control de señales que permiten su expresión en un anfitrión celular. La elección de estas señales (promotores, terminadores, etc.) puede variar en función del anfitrión celular utilizado. A este efecto, las secuencias nucleotídicas de la invención pueden formar parte de un vector, que puede ser de replicación autónoma o integrador. Más particularmente, se pueden preparar vectores de replicación autónoma utilizando secuencias de replicación autónoma en el huésped elegido. Cuando se trata de vectores integradores, éstos se pueden preparar, por ejemplo, utilizando secuencias homólogas a ciertas regiones del genoma del huésped, permitiendo, por recombinación homóloga, la integración del vector. Los anfitriones celulares utilizables para la producción de los polipéptidos galaninérgicos de la invención por vía recombinante son tanto anfitriones eucarióticos como procarióticos. Entre los anfitriones eucarióticos convenientes se pueden citar las células animales, las levaduras o los hongos. En particular, tratándose de levaduras, se pueden citar las levaduras del género
Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Schwanniomyces o Hansenula. Cuando se trata de células animales, se pueden citar las células COS, CHO, C127, NIH-3T3, etc. Entre los hongos, se pueden citar más particularmente Aspergillus ssp. o Trichoderma ssp. Como anfitriones procarióticos, se prefiere utilizar las bacterias siguientes: E. coli, Bacillus o Streptomyces.

Las secuencias nucleotídicas de la presente invención son igualmente utilizables en el campo farmacéutico, bien para la realización de secuencias antisentido utilizables en el marco de una terapia génica, bien para la realización de sondas que permiten la detección, mediante experiencias de hibridación, de la expresión de receptores galaninérgicos en muestras biológicas y la puesta de manifiesto de anomalías genéticas (polimorfismo, mutaciones) o de expresiones aberrantes.

La inhibición de la expresión de ciertos genes por secuencias antisentido ha demostrado ser una estrategia prometedora en el control de la actividad de un gen. Las secuencias antisentido son secuencias cuyo producto de transcripción es complementario de la hebra codificante de un gen dado, siendo por este hecho capaces de hibridarse específicamente con el ARNm transcrito o con el gen, inhibiendo su transcripción o su traducción en proteína. La invención tiene también como objeto las secuencias antisentido capaces de inhibir al menos parcialmente la producción de polipéptidos galaninérgicos tales como los definidos anteriormente. Tales secuencias pueden estar constituidas por toda o una parte de las secuencias nucleotídicas definidas anteriormente. Se trata generalmente de secuencias o de fragmentos de secuencias complementarios de las secuencias codificadoras para los péptidos de la invención. Tales secuencias se pueden obtener a partir de la secuencia SEQ ID nº 1, por fragmentación, etc, o por síntesis química.

Como se ha indicado anteriormente, la invención permite también la realización de sondas nucleotídicas, sintéticas o no, capaces de hibridarse con las secuencias nucleotídicas definidas anteriormente que codifican polipéptidos galaninérgicos de la invención, o con los ARNm correspondientes. Tales sondas se pueden utilizar in vitro como herramienta de diagnóstico, para la detección de la expresión de un receptor galaninérgico, o todavía para la puesta de manifiesto de anomalías genéticas (corte y empalme defectuosos, polimorfismo, mutaciones puntuales, etc.). Considerando las actividades múltiples de los ligandos endógenos de los receptores galaninérgicos, las sondas de la invención pueden así permitir identificar afecciones neurológicas, cardiovasculares, endocrinológicas o psiquiátricas. Estas sondas pueden utilizarse igualmente para la puesta de manifiesto y el aislamiento de secuencias de ácidos nucleicos homólogos que codifican polipéptidos galaninérgicos tales como los definidos anteriormente, a partir de otras fuentes celulares y preferentemente de células de orígenes humanos. Si bien la presente solicitud se ilustra más particularmente mediante un clon designado GalR1, los estudios bioquímicos e inmunológicos descritos en la literatura indican la existencia de subtipos de receptores galaninérgicos. Las sondas de la invención permiten aislar mediante técnicas conocidas por los expertos en la materia (véase ejemplo 4) estos diferentes subtipos. Las sondas de la invención contienen generalmente al menos 10. bases y pueden contener hasta la totalidad de la secuencia SEQ ID nº 1 o de su hebra complementaria. Preferentemente, estas sondas se marcan antes de su utilización. Para ello se pueden emplear diferentes técnicas conocidas por el experto en la materia (marcaje radioactivo, enzimático, etc.). Las condiciones de hibridación en las que se pueden utilizar estas sondas se indican en las técnicas generales de clonación que se dan más adelante así como en los ejemplos.

La invención tiene igualmente como objeto un polipéptido que comprende toda o una parte de la secuencia peptídica SEQ ID nº 2 o de un derivado de la misma modificada por mutación, sustitución, supresión y/o modificación de uno o varios restos, y que posee la capacidad de enlazar galanina o una variante de la galanina, siendo dicho derivado tal que la galanina 2-29 y la galanina 1-16 inhiben competitivamente el enlace de la (^{125}I)-galanina con una afinidad más débil que la galanina 1-29, y que la galanina 2-29 inhibe competitivamente el enlace de la (^{125}I)-galanina con una afinidad más débil que la galanina 1-16.

Tales derivados se pueden generar con objetivos diferentes, tales como, especialmente, el de aumentar la afinidad del péptido por su(s) ligando(s), el de mejorar sus niveles de producción, el de aumentar su resistencia a las proteasas, el de aumentar y/o modificar su actividad o el de conferir nuevas propiedades farmacocinéticas y/o biológicas. Entre los derivados resultantes de una adición, se pueden citar, por ejemplo, los polipéptidos quiméricos que contienen una parte heteróloga adicional unida a un extremo. El término derivado comprende igualmente los polipéptidos homólogos del polipéptido SEQ ID nº 1, procedentes de otras fuentes celulares y especialmente de células de origen humano o de otros organismos, y que poseen una actividad del mismo tipo. Tales polipéptidos homólogos comprenden especialmente los diferentes subtipos de receptores galaninérgicos. Dichos polipéptidos se pueden obtener en particular mediante experiencias de hibridación como las descritas en los ejemplos.

Preferentemente, los polipéptidos de la invención son polipéptidos que poseen la capacidad de enlazar galanina o una variante de la galanina. Siempre según un modo preferido, los polipéptidos de la invención son susceptibles de ser reconocidos por anticuerpos que reconocen la secuencia peptídica SEQ ID nº 1 completa. Tales anticuerpos se pueden generar mediante cualquier técnica conocida por el experto en la materia, utilizando como antígenos los polipéptidos descritos en la presente solicitud.

Como se indica en los ejemplos, estos polipéptidos se pueden expresar en diferentes tipos celulares para formar receptores galaninérgicos funcionales.

Los polipéptidos de la invención se pueden obtener por expresión en un anfitrión celular de una secuencia nucleotídica tal como la descrita anteriormente por síntesis química, sobre la base de la secuencia SEQ ID nº 1, utilizando las técnicas conocidas por el experto en la materia, o bien por una combinación de estas técnicas.

Otro objeto de la invención se refiere a las células recombinadas capaces de expresar en su superficie un polipéptido que posee actividad de receptor galaninérgico. Estas células se pueden obtener por introducción de una secuencia nucleotídica tal como se ha definido anteriormente y posterior cultivo de dichas células en condiciones de expresión de dicha secuencia.

Las células recombinadas según la invención pueden ser también tanto células eucarióticas como procarióticas. Entre las células eucarióticas convenientes, se pueden citar las células animales, las levaduras o los hongos. En particular, tratándose de levaduras, se pueden citar las levaduras del género Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Schwanniomyces o Hansenula. Cuando se trata de células animales, se pueden citar las células COS, CHO, C127, NIH-3T3, etc. Entre los hongos, se pueden citar más particularmente Aspergillus ssp. o Trichoderma ssp. Como células procarióticas, se prefiere utilizar las bacterias siguientes: E. coli, Bacillus o Streptomyces. Las células así obtenidas se pueden utilizar para medir la capacidad de diferentes moléculas de comportarse como ligando o como modulador de la actividad de los receptores galaninérgicos. Más particularmente, dichas células pueden así utilizarse en un procedimiento de puesta de manifiesto y de aislamiento de ligandos o de modulador de la actividad de los receptores galaninérgicos y, más preferentemente, de agonistas y de antagonistas.

Otro objeto de la invención se refiere, en consecuencia, a un procedimiento de puesta de manifiesto y/o de aislamiento de ligandos de los receptores galaninérgicos, según el cual se realizan las etapas siguientes:

-: se pone en contacto una molécula o una mezcla que contiene diferentes moléculas, eventualmente no identificadas, con una célula recombinada tal como la descrita anteriormente, que expresa en su superficie un polipéptido que posee actividad de receptor galaninérgico, en condiciones que permiten la interacción entre dicho polipéptido y dicha molécula en el caso en que ésta posee una afinidad por dicho polipéptido, y,

-: se detectan y/o se aíslan las moléculas enlazadas a dicho polipéptido.

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En un modo particular, este procedimiento de la invención se adapta a la puesta de manifiesto y/o al aislamiento de agonistas y de antagonistas de la galanina hacia los receptores galaninérgicos.

Otro objeto de la invención se refiere a un procedimiento de puesta de manifiesto y/o de aislamiento de moduladores de los receptores galaninérgicos, según el cual se realizan las etapas siguientes:

-: se pone en contacto una molécula o una mezcla que contiene diferentes moléculas, eventualmente no identificadas, con una célula recombinada tal como la descrita anteriormente, que expresa en su superficie un polipéptido que posee actividad de receptor galaninérgico, en presencia del ligando endógeno de dicho receptor, en condiciones que permiten la interacción entre dicho polipéptido y su ligando, y,

-: se detectan y/o se aíslan las moléculas capaces de modular la actividad del ligando sobre dicho polipéptido.

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En un modo particular, este procedimiento de la invención se adapta a la puesta de manifiesto y/o al aislamiento de moduladores de la actividad de la galanina sobre los receptores galaninérgicos.

Otro objeto de la invención se refiere a la utilización como medicamento de un ligando o de un modulador identificado y/o obtenido según el procedimiento aquí descrito anteriormente. Tales ligandos o moduladores pueden permitir, en efecto, tratar ciertas afecciones relacionadas con los receptores galaninérgicos. En particular, dado que los receptores galaninérgicos son los mediadores de un efecto analgésico, los agonistas de estos receptores pueden utilizarse para disminuir las sensaciones de dolor. En la introducción se han mencionado otras actividades de los receptores galaninérgicos.

La invención se refiere igualmente a todo medicamento que comprende como principio activo al menos una molécula que actúa sobre un receptor de la invención. Preferentemente, la molécula es un ligando o un modulador identificado y/o aislado según el procedimiento anteriormente descrito.

Otras ventajas de la presente invención aparecerán con la lectura de los ejemplos que siguen, que deben ser considerados como ilustrativos y no limitativos.

Leyenda de las figuras

Figura 1: Saturación de los receptores de galanina por galanina de cerdo sobre las membranas de células Cos1 transfectadas por el clon GalR1. El recuadro representa la transformación de Scatchard de los datos de la curva de enlace (Los valores presentados corresponden a una experiencia representativa en la que cada punto se ha determinado por triplicado).

Figura 2: Desplazamientos por péptidos del enlace específico de la (^{125}I)-galanina a las membranas de las células Cos1 transfectadas por el clon GalR1 (Los valores presentados corresponden a una experiencia representativa en la que cada punto se ha determinado por triplicado).

Figura 3: Inhibición por galanina de la estimulación de la producción de AMPc en células Cos1 transfectadas por el clon GalR1 (Los valores presentados corresponden a una experiencia representativa en la que cada punto se ha determinado por duplicado).

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Técnicas generales de clonación

Los métodos utilizados tradicionalmente en biología molecular, tales como extracciones preparativas de ADN plasmídico, centrifugación de ADN plasmídico en gradiente de cloruro de cesio, electroforesis en geles de agarosa o de acrilamida, purificación de fragmentos de ADN mediante electroelución, extracciones de proteínas con fenol o con fenol-cloroformo, precipitación de ADN en medio salino con etanol o isopropanol, transformación en Escherichia coli, etc. son muy conocidos por el experto en la materia y están descritos ampliamente en la bibliografía [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y., 1982; Ausubel F. M. et al. (eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, Nueva York, 1987].

Para las uniones, los fragmentos de ADN se separan según su tamaño mediante electroforesis en geles de agarosa o de acrilamida, se extraen con fenol o con una mezcla de fenol/cloroformo, se precipitan con etanol y después se incuban en presencia de la ADN ligasa del fago T4 según las recomendaciones del proveedor.

El relleno de los extremos 5' prominentes se realiza mediante el fragmento de Klenow de la ADN Polimerasa I de E. coli según las especificaciones del proveedor. La destrucción de los extremos 3' prominentes se realiza en presencia de la ADN Polimerasa del fago T4 utilizada según las recomendaciones del fabricante. La destrucción de los extremos 5' prominentes se efectúa mediante un tratamiento moderado con la nucleasa S1.

La mutagénesis dirigida in vitro por oligodesoxinucleótidos sintéticos se realiza según el método desarrollado por Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764].

La amplificación enzimática de los fragmentos de ADN se realiza mediante la técnica mencionada de PCR [Polymerase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R.K. et al., Science 230 (1985) 1350-1354; Mullis K.B. et Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350].

La verificación de las secuencias nucleotídicas se realiza mediante el método desarrollado por Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467].

Para las experiencias de hibridación, las condiciones de estringencia se basan en la obra de Maniatis T. et al., anteriormente citada.

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1. Aislamiento del receptor humano de galanina

Este ejemplo describe el aislamiento del clon GalRI que codifica el receptor de galanina humano mediante cribado por expresión de un banco de ADNc.

1a. Construcción del banco

Se ha realizado un banco de ADNc a partir del linaje melanocítico humano Bowes (ATCC CRL 9607), utilizando el vector de expresión transitorio de mamífero pcDNA1. Después de la extracción de los ARN totales, los ARN poliA^{+} se purifican en columna de oligodT celulosa. La síntesis de ADNc se efectúa en presencia de una mezcla de iniciadores (oligodT y oligonucleótidos se hibridan al azar). Después de un fraccionamiento por tamaño (>1100 pares de bases), se ha construido el banco mediante la ligadura de los ADNc en el vector pcDNA1 (sitios de clonación Bstx1) y transformación en E. coli (MC 1061/P3). Se han obtenido y amplificado 10^{6} clones independientes. Se han cultivado entonces aproximadamente 720000 clones bacterianos en medio sólido selectivo con una densidad de 8000 colonias por caja. Se han preparado mediante lisis alcalina 90 lotes de ADN plasmídico, cada uno de ellos correspondiente a 8000 colonias.

1b. Transfección

Se ha transfectado el ADN plasmídico de cada lote independientemente en las células Cos1 (ATCC CRL 1650) por electroporación según el protocolo siguiente: 32 mg de ADN, 8 10^{6} células en 500 mL de medio DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium) suplementado con 10% de suero de vaca fetal, glutamina 6 mM, 100 UI/mL de penicilina y 100 mg/mL de estreptomicina bajo CO_{2} al 5%, 960 mFarad, 250 Volts, electroporador Biorad. Después de la electroporación, se han cultivado las células en monocapa en cajas de cultivo (Nunc) de 16 cm de diámetro durante 72 horas. En estas condiciones se transfectan una media de 30% de células.

1c. Selección por expresión

Las células transfectadas se han ensayado con respecto a su capacidad para enlazar (^{125}I)-galanina. Las células se han trasladado 48 horas después de la transfección. El día de la unión, se han puesto en presencia de DMEM durante 1 hora, lavándose a continuación con 10 mL de tampón 1 (Tris HCl 25 mM pH: 7,5, MgCl_{2} 10 mM, BSA 2%). Seguidamente, las células se han incubado durante 5 horas a una temperatura de 20ºC en presencia de tampón 2 (tampón 1 que contiene un cóctel de inhibidores de proteasas: 10 mg/mL de aprotinina, 1mg/mL de bacitracina, 10 mg/mL de pepstatina A y fluoruro de fenilmetilsulfonilo 10^{-5} M) que contiene (^{125}I)-galanina 10^{-10} M (NEN, galanina 1-29 de cerdo, AS: 2200 curie/mmol). Después del lavado (5x15 mL de tampón 1), las cajas se han secado y expuesto en autorradiografía (film Amersham hyperscreen MP) durante 15 días a una temperatura de -80ºC.

1d. Aislamiento del clon GalR1 que codifica el receptor de galanina

Sobre los 720000 clones bacterianos ensayados, se ha identificado un lote de 8000 colonias que da una señal específica en autorradiografía (es decir, (i) que sobrepasa el ruido de fondo, (ii) que desaparece en presencia de galanina fría 10^{-6} M ). Este lote se ha dividido a continuación en 48 lotes de 700 clones cada uno. Después de la transfección, las células se han ensayado con respecto a su capacidad para enlazar (^{125}I)-galanina. Tres lotes produjeron una señal específica en autorradiografía. Uno de ellos se ha subdividido 2 veces (25 lotes de 30 clones y después 60 clones individuales),
conduciendo a 2 clones que confieren a las células Cos1 una fuerte capacidad para enlazarse a la (^{125}I)-galanina.

2. Estudio estructural del receptor de galanina

Los 2 clones aislados en el ejemplo 1 contienen un inserto idéntico de 3,1 kb. Se ha determinado la secuencia de uno de los dos clones en las 2 hebras, mediante la técnica fluorescente (Applied Biosystems) derivada del método de Sanger, utilizando Taq Polimerasa y didesoxinucleótidos fluorescentes.

La secuencia obtenida corresponde a la secuencia SEQ ID nº 1. Dicha secuencia lleva una fase abierta de lectura de 1053 pares de bases: el sitio de iniciación de la traducción se atribuye al codón ATG en posición 787 de la secuencia SEQ ID nº 1.

La fase abierta de lectura así definida codifica una proteína de 349 aminoácidos (SEQ ID nº 1) de peso molecular calculado de 38897 Daltons. El análisis del perfil de hidropaticidad de la secuencia de aminoácidos sugiere que el receptor posee 7 segmentos constituidos por aminoácidos mayoritariamente hidrófobos, formando globalmente segmentos transmembranarios (STM), punto común de los miembros de la familia de los receptores acoplados a las proteínas G. El receptor está organizado de la manera siguiente: MET1-ASN33, segmento N-terminal; PHE34-LEU58, STM I; ALA59-ASN71, bucle intracelular I; LEU72-LEU98, STM II; PRO99-LYS109, bucle extracelular I; PHE110-ASP132, STM III; ARG133-ASN151, bucle intracelular II; ALA152-VAL170, STM IV; ALA171-ALA199, bucle extracelular II; TYR200-VAL223, STMV; LEU224-LYS244, bucle intracelular III; THR245-LEU268, STM VI; TRP269-PRO279, bucle extracelular III; ALA280-SER307, STMVII; GLU308-VAL349, segmento C-terminal.

Además, ciertos aminoácidos conservados en el seno de los miembros de la familia de los receptores acoplados a las proteínas G están presentes en la secuencia proteica del receptor GALR1. En particular, se notan (1) 2 sitios de N-glicosilación (ASN7 y ASN12), (2) 1 sitio de fosforilación por la proteína quinasa cAMP o cGMP dependiente (SER143), (3) 1 sitio de famesilación (CYS340), (4) 2 cisteínas (CYS187 y 308), (5) 4 prolinas (PRO169, 212, 262 y 300), (6) el motivo GLY.ASN.X.X.VAL (50-54), (7) el motivo ASP.ARG.TYR (132-134), (8) el motivo ASN.PRO.ILE.X.TYR (299-303). Finalmente, se ha comparado la secuencia de la proteína de la presente invención con las secuencias de las proteínas de la familia de los receptores acoplados a las proteínas G (banco de datos Swissprot data). La homología más importante (33,8%, incluyendo 3 brechas) se observa con el receptor de somastostaina de tipo 4.

3. Estudios bioquímicos del receptor GalR1 expresado transitoriamente en las células Cos1 3a. Estequiometría y farmacología del receptor GalR1

Se ha preparado el ADN plasmídico del clon GalR1 mediante técnicas de biología molecular clásicas para transfectar células Cos1. Las membranas de las células transfectadas se han utilizado a continuación para estimar los parámetros de enlace en el equilibrio de la galanina 1-29 y de fragmentos de galanina. El ADN plasmídico (90 mg/8 10^{6} células Cos1) se ha transfectado por electroporación como se ha descrito anteriormente (1b). 72 horas después de la transfección, se han recogido y sedimentado las células recombinantes. Las membranas se han preparado entonces de la manera siguiente: a una temperatura de 4ºC, se pone el sedimento celular en presencia de 10 mL de tampón 3 (Hepes 5 mM, pH 7,5) durante 20 minutos; después de centrifugación a 13000 g durante 15 minutos, se vuelve a suspender el sedimento en el tampón 3 y se conserva a una temperatura de -80ºC hasta su utilización.

Se han realizado en las membranas experiencias de enlace en el equilibrio (saturación y competición), en presencia de (^{125}I)-galanina y de diferentes péptidos en las condiciones experimentales siguientes: las membranas (10 mg de proteína) se han incubado durante 30 minutos a una temperatura de 20ºC con (^{125}I)-galanina 5 10^{-11} M en ausencia o en presencia de concentraciones crecientes de galanina 1-29, galanina 2-29, galanina 3-29 o galanina 1-16 (10^{-11} M - 10^{-6} M) en un volumen final de 0,25 mL de tampón 2 (1c). Seguidamente, se ha parado la reacción mediante la adición de 0,25 mL de tampón 1 (1c) y centrifugación durante 15 minutos a 13000 g. El sedimento obtenido se ha lavado tres veces con 0,2 mL de tampón tris 25 mM (pH: 7,5) frío que contiene 10% de sacarosa y seguidamente se ha medido la radioactividad con un contador de centelleo gamma. El enlace no específico se ha medido en presencia de galanina 1-29 de cerdo 10^{-7} M. Los valores de las constantes de afinidad (Ki) se han obtenido siguiendo la ecuación de Cheng y Prussof: Ki = IC50/ (1 + L/Kd).

En las condiciones experimentales anteriormente descritas en este documento, se han observado los resultados siguientes: contrariamente a las células Cos1 no transfectadas, o transfectadas por un plásmido de control, las células Cos1 transfectadas por el clon GalR1 presentan un enlace específico de la galanina yodada. El análisis de los resultados por el método de Scatchard demuestra la existencia de una única clase de sitios de alta afinidad, con una constante de disociación aparente (Kd) = 0,8 nM, y de alta capacidad, con un número máximo de sitios de fijación (Bmax) = 2,8 pmoles/mg proteínas. Teniendo en cuenta la eficacia de la transfección (aproximadamente 30%, 1b), el nivel de expresión de receptores galaninérgicos de la invención en las células Cos1 se estima en 5 10^{5} sitios/célula.

Las galaninas de rata, de cerdo y humana inhiben de forma competitiva el enlace de la (^{125}I)-Galanina a las membranas de las células transfectadas, con una Ki = 0,3, 0,2 y 0,8 nM respectivamente. La galanina 2-29 (Ki = 115 nM) y la galanina 1-16 (Ki = 5 nM) inhiben competitivamente el enlace de la (^{125}I)-galanina con una afinidad más débil que la galanina 1-29. Este clon no posee afinidad por la galanina 3-29.

El orden de eficacia de estas moléculas diferentes confirma la especificidad del receptor GalR1 como receptor galaninérgico. Estos resultados demuestran, por otra parte, que las células Cos1 de la presente invención son capaces de expresar el receptor de galanina que tiene características de enlace comparables a las del receptor natural.

3b. Estudio funcional del receptor GalR1

Se ha estimado el acoplamiento del receptor Galanina a la adenilato ciclasa por medio de la capacidad de la galanina de inhibir la producción de AMPc en las células Cos1 transfectadas por el clon GalR1. Para este estudio, se han sembrado 10^{5} células transfectadas en las condiciones descritas anteriormente en este documento en placas de cultivo multipocillo (1,5 cm de diámetro) y las experiencias de AMPc se han realizado 72 horas después de la transfección (el medio de cultivo se ha renovado la víspera de la experiencia). Después de una preincubación de 1 hora a una temperatura de 37ºC en medio DMEM, las células se han lavado con DMEM que contiene 2% de BSA. Dichas células se han cultivado entonces durante 30 minutos a una temperatura de 37ºC en este mismo medio conteniendo 2 10^{-4} M de isobutilmetilxantina, en ausencia y en presencia de forscolina (10^{-4} M) y/o de galanina humana (10^{-11} M - 10^{-6} M). Después de tres lavados de las células en medio DMEM, se extrae el AMPc intracelular por adición de etanol al 70%. Después de efectuar una liofilización, se mide el AMPc mediante radioinmunología (Kit AMPc, Amersham).

Los resultados demuestran que en las células Cos1 transfectadas por el clon GalR1, la galanina inhibe fuertemente la producción de AMPc intracelular inducida por la forscolina (la producción inducida es del orden de 2 pmol/10^{5} células, es decir, 10 veces la basal). Este efecto no se observa en condiciones basales. La semiinhibición y la inhibición máxima de la producción de AMPc son inducidas por galanina humana 10^{-9} M y 10^{-6} M respectivamente. En presencia de galanina 10^{-6} M, la producción de AMPc intracelular inducida por forscolina disminuye un 50%.

La inhibición por galanina de la producción de AMPc intracelular inducida por forscolina confirma la especificidad del receptor GalR1 como receptor galaninérgico. Estos resultados demuestran, por otra parte, que las células Cos1 de la presente invención son capaces de expresar el receptor de galanina que tiene características funcionales comparables a las del receptor natural.

4. Búsqueda de secuencias homólogas, especialmente de subtipos, en otros tejidos

Este ejemplo demuestra que la secuencia nucleotídica SEQ ID nº 1 o fragmentos de ésta se pueden utilizar para poner de manifiesto secuencias homólogas, especialmente subtipos, a partir de otros tejidos. Para ello, son utilizables diferentes técnicas, tales como PCR, hibridación in situ, transferencia de Northern, etc.

Más particularmente, para la búsqueda por PCR, se preparan los ARN totales de los diferentes tejidos estudiados y se someten a continuación a transcripción inversa y a una amplificación, en presencia de transcriptasa inversa, de Taq polimerasa y de los iniciadores apropiados derivados de la secuencia SEQ ID nº 1. Los productos así obtenidos se transfieren a continuación a filtros de nitrocelulosa y se hibridan en condiciones de estringencia variables. Las secuencias homólogas puestas de manifiesto durante estas experiencias pueden seguidamente aislarse y/o amplificarse mediante las técnicas clásicas de biología molecular.

<110> Aventis Pharma S.A.

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<120> Receptor galanina, ácidos nucleicos, células transformadas y utilizaciones.

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<130> ST94008

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<160> 2

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<170> Patente en versión 3.3

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<210> 1

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<211> 3083

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> CDS

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<222> (787)..(1836)

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<223> /producto = "receptor galanina humano"

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<400> 1

1

2

3

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<210> 2

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<211> 349

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

4

5

Claims

1. Secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido que posee actividad de receptor galaninérgico, caracterizada porque se escoge entre:

(a) toda o parte de la secuencia nucleotídica SEQ ID nº 1, y

(b) las secuencias derivadas de las secuencias (a) debido a la degeneración del código genético.

2. Secuencia nucleotídica según la reivindicación 1, caracterizada porque codifica un receptor galaninérgico humano.

3. Secuencia nucleotídica caracterizada porque comprende la secuencia SEQ ID nº 1 o su hebra complementaria.

4. Secuencia nucleotídica según las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque se escoge entre las secuencias de ADN genómico, ADNc, ARN, las secuencias híbridas o las secuencias sintéticas o semisintéticas.

5. Secuencia nucleotídica según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque la parte que codifica dicho polipéptido está situada bajo el control de señales que permiten su expresión en un anfitrión celular.

6. Polipéptido que posee actividad de receptor galaninérgico resultante de la expresión de una secuencia nucleotídica, escogiéndose dicha secuencia entre:

a) toda o parte de la secuencia nucleotídica SEQ ID nº 1, y

b) las secuencias derivadas de las secuencias (a) debido a la degeneración del código genético.

7. Polipéptido que comprende toda o una parte de la secuencia peptídica SEQ ID nº 2 o de un derivado de la misma, modificada por mutación, sustitución, supresión y/o modificación de uno o varios restos, y que posee la capacidad de enlazar la galanina o una variante de la galanina, siendo dicho derivado tal que la galanina 2-29 y la galanina 1-16 inhiben competitivamente el enlace de la (^{125}I)-galanina con una afinidad más débil que la galanina 1-29, y que la galanina 2-29 inhibe competitivamente el enlace de la (^{125}I)-galanina con una afinidad más débil que la galanina
1-16.

8. Secuencia antisentido capaz de inhibir al menos parcialmente la producción de un polipéptido según una de las reivindicaciones 6 ó 7.

9. Célula recombinada que expresa en su superficie un polipéptido según una de las reivindicaciones 6 ó 7, obtenida por introducción de una secuencia según la reivindicación 5.

10. Célula según la reivindicación 9, caracterizada porque se escoge entre las células eucarióticas o las procarióticas.

11. Procedimiento de puesta de manifiesto y/o de aislamiento de ligandos de los receptores galaninérgicos, caracterizado porque se realiza en las etapas siguientes:

- se pone en contacto una molécula o una mezcla que contiene diferentes moléculas, eventualmente no identificadas, con una célula recombinada según la reivindicación 9 que expresa en su superficie un polipéptido según una de las reivindicaciones 6 y 7, en condiciones que permiten la interacción entre dicho polipéptido y dicha molécula en el caso en que ésta posee una afinidad por dicho polipéptido, y,

- se detectan y/o se aíslan las moléculas enlazadas a dicho polipéptido.

12. Procedimiento según la reivindicación 11, para la puesta de manifiesto y/o el aislamiento de agonistas y/o de antagonistas de los receptores galaninérgicos.

13. Procedimiento de puesta de manifiesto y/o de aislamiento de ligandos moduladores de los receptores galaninérgicos, caracterizado porque se realiza en las etapas siguientes:

- se pone en contacto una molécula o una mezcla que contiene diferentes moléculas, eventualmente no identificadas, con una célula recombinada según la reivindicación 9 que expresa en su superficie un polipéptido, según una de las reivindicaciones 6 y 7, que posee actividad de receptor galaninérgico, en presencia de un ligando de dicho receptor, en condiciones que permiten la interacción entre dicho polipéptido y el ligando, y,

- se detectan y/o se aíslan las moléculas capaces de modular la actividad del ligando sobre dicho polipéptido.

\newpage

14. Anticuerpos que reconocen un polipéptido según la reivindicación 6.

15. Procedimiento de obtención de un polipéptido según una de las reivindicaciones 6 y 7, que comprende la expresión en una célula de una secuencia nucleotídica según una de las reivindicaciones 1 a 5.