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ES2257139A1 - Metodo y kit para genotipificacion de la hla-drb basados en la pcr en tiempo real. - Google Patents

Metodo y kit para genotipificacion de la hla-drb basados en la pcr en tiempo real.

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ES2257139A1
ES2257139A1 ES200400010A ES200400010A ES2257139A1 ES 2257139 A1 ES2257139 A1 ES 2257139A1 ES 200400010 A ES200400010 A ES 200400010A ES 200400010 A ES200400010 A ES 200400010A ES 2257139 A1 ES2257139 A1 ES 2257139A1
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Maria Rosa Faner Canet
Ricardo Pujol Borrell
Ana Ribera Crusafont
Roger Colobran Oriol
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SERVEIS SANITARIS DE REFERENCIA - CENTRE DE TRANSFUSIONS I BANC DE TEIXITS
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Universitat Autonoma de Barcelona UAB
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Abstract

Método y kit para genotipificación de HLA-DRB basados en la PCR en tiempo real. Método para determinar el genotipo de los loci DRB del antígeno leucocitario humano a partir de una muestra de ácido nucleico, y kit para realizar dicho método. El kit comprende cebadores específicos de alelo para amplificar ácidos nucleicos derivados de los loci HLA-DRB mediante PCR en tiempo real, sondas específicas de alelo marcadas fluorescentemente para detectar la señales de fluorescencia durante la amplificación; y patrones de fluorescencia definidos experimentalmente para comparar las señales detectadas. En particular los genes de los loci DRB se seleccionan entre DRB1, DRB3, DRB4 Y DRB5. Supera algunas de las limitaciones de los métodos de tipificación convencionales basados en ADN, en términos de tiempo, posibilidad de automatización y aumento de la resolución, mientras se reduce el número de reacciones PCR. Es útil p.ej. para determinar compatibilidad en trasplantes o predisposición a una enfermedad específica.

Description

Método y kit para genotipificación de HLA-DRB basados en la PCR en tiempo real.
Esta invención se relaciona con el campo de la medicina en general y específicamente con la investigación médica, la biología molecular, la medicina forense y el diagnóstico. En particular, la invención proporciona un método para la determinación del genotipo (es decir, el conjunto de alelos específicos) de un individuo. Esto facilita la determinación de la compatibilidad en los trasplantes y la propensión a una enfermedad específica del individuo.
Estado de la técnica anterior
En el trasplante entre individuos inmunogenéticamente diferentes se establece la inmunidad en el trasplante y se induce una reacción de rechazo contra el injerto. Existen antígenos que inducen una inmunidad en el trasplante particularmente intensa como dianas de esta reacción, que se llaman antígenos mayores de histocompatibilidad. Estos antígenos son controlados por un grupo de genes llamado complejo mayor de histocompatibilidad ("major histocompatibility complex", MHC), conocido en los humanos como el sistema de antígenos leucocitarios humanos ("human leukocyte antigens", HLA). Estos genes que codifican las moléculas HLA se encuentran entre los genes más variables en humanos: cada variante codifica para moléculas que unen péptidos diferentes. Estos genes son los mismos en todas las células de un individuo particular, pero difieren de una persona a otra.
El HLA comprende varios genes agrupados en un segmento de 4 Mb en el brazo corto del cromosoma 6 (cfr. D.A. Rhodes et al., "Genetics and molecular genetics of the MHC", Rev. Immunogenet. 1999, vol. 1, pp. 21-31). La región HLA comprende seis loci mayores que codifican estructuralmente proteínas homólogas que se clasifican en la clase I HLA (HLA-A, B, Cw) y en la clase II (HLA-DR, DQ, DP), que presentan antígenos a dos subtipos diferentes de células. Las moléculas de clase II son glicoproteínas heterodiméricas que consisten en una cadena alfa y una cadena beta. Las moléculas MHC de clase II se expresan en la superficie celular de los macrófagos, células B, células T activadas y otros tipos celulares involucrados en la presentación de antígenos a las células T que expresan la glicoproteína de superficie celular CD4 (cfr. Bjorkman et al., Ann. Rev. Biochem. 1990, vol. 59, pp. 253-88). Los genes DP, DQ y DR se localizan en regiones separadas del MHC. En la región DR, un único locus DRA codifica la cadena DRalfa no polimórfica, pero nueve loci DRB diferentes, denominados de DRB1 a DRB9, codifican la cadena DRbeta polimórfica. El número de alelos DRB identificados está aumentando continuamente. Debido a este hecho, la determinación precisa de los subtipos alélicos es esencial para la tipificación de potenciales donantes para el trasplante, donde la compatibilidad HLA muy precisa entre el donante y el receptor del trasplante parece ser crítica para minimizar el riesgo de rechazo.
Para la tipificación de HLA generalmente se han usado tests serológicos utilizando reacciones con antisueros y tests citológicos. Sin embargo, se requiere mucho tiempo y gran trabajo para su examen, la operación es complicada, y la precisión en los resultados obtenidos es más bien pobre. La tipificación de HLA por técnicas basadas en la reacción en cadena de la polimerasa ("polymerase chain reaction", PCR) se ha convertido en una alternativa a los métodos serológicos, ampliamente usada en la práctica clínica. Los métodos de tipificación de HLA basados en la PCR más comunes, que han superado las limitaciones de los tests serológicos, son la PCR con cebadores específicos de secuencia ("PCR with sequence-specific primers", PCR-SSP) (cfr. O. Olerup et al., "HLA-DR typing by PCR amplification with sequence specific primers (PCR-SSP) in 2 hours: an alternative to serological DR typing in clinical practice including donor-recipient matching in cadaveric transplantation", Tissue Antigens, 1992, vol. 39, pp. 225-35; M. Bunce et al., "Phototyping: comprehensive DNA typing for HLA-A, B, C, DRB1, DRB3, DRB4, DRB5 & DQB1 by PCR with 144 primer mixes utilizing sequence-specific primers (PCR-SSP)", Tissue Antigens, 1995, vol 46, pp. 355-67) y la hibridación con cebadores específicos de secuencia ("sequence-specific oligonucleotide", PCR-SSO) (cfr. EP 514.534; EP 417.160 and R.K. Saiki et al., "Analysis of enzymatically amplified beta-globin and HLA-DQ alpha DNA with allele-specific oligonucleotide probes", Nature, 1986 vol 324, pp. 163-6).
En el método PCR-SSP, la secuencia del gen se confirma mediante la amplificación de la región hipervariable del antígeno HLA diana para determinar el tipo de antígeno HLA. En el método PCR-SSO, se prepara una membrana de nilón (sobre la que se inmobiliza el DNA amplificado por los cebadores específicos del gen HLA) y se hibridan las sondas de oligonucleótidos específicas del tipo respectivo de HLA para la tipificación. Aunque ambos métodos han sido efectivos en la práctica rutinaria de laboratorio, requieren un procesamiento post-PCR que consume tiempo y la contaminación post-PCR es un riesgo real. Además, la PCR-SSP requiere el uso de un gran número de reacciones de PCR y es difícil de automatizar, limitando así su rendimiento. Por otro lado, incluso si la PCR-SSO es capaz de un mayor rendimiento, sus tiempos de procesado son más largos y no permite discriminar entre motivos situados en las hebras cis o trans de DNA.
Los laboratorios de tipificación de HLA tienen que analizar un gran número de muestras y necesitan incrementar la resolución de la tipificación para tener resultados clínicos más válidos para el trasplante, particularmente para el trasplante de médula ósea. Por lo tanto, sería altamente deseable proporcionar nuevos métodos de tipificación, particularmente si estos están mejorados en el sentido de ser más rápidos, de ser potencialmente automatizables, de proporcionar mayor resolución y de reducir los riesgos de contaminación.
Explicación de la invención
En algunos estudios previos se ha publicado que la tipificación de HLA basada en la PCR en tiempo real, también llamada fluorotipificación, no requiere procesado post-PCR y podría automatizarse completamente (cfr. EP 1.229.128 A1; S.J. Faas et al., "Sequence-specific priming and exonuclease-released fluorescence detection of HLA-DQB1 alleles", Tissue Antigens 1996, vol. 48, pp. 97-112; K. Slateva et al., "HLA-DRB fluorotyping by dark quenching and automated analysis", Tissue Antigens 2001, vol. 58, pp. 250-4). En la técnica anterior la PCR en tiempo real para la tipificación de HLA se ha utilizado únicamente como un equivalente a la PCR-SSP con una sonda específica de locus fluorogénica. Expadiendo todavía más la utilidad de la PCR en tiempo real, en la presente invención esta tecnología se utiliza para distinguir entre los alelos de un locus dado.
Así, un aspecto de la presente invención se refiere a un método para determinar el genotipo HLA-DRB de una muestra de ácido nucleico, que comprende los pasos de: (i) amplificar cualquier ácido nucleico que comprenda el exón 2 de al menos uno de los genes de los loci DRB por la PCR en tiempo real; (ii) detectar las señales de fluorescencia mediante sondas nucleotídicas marcadas fluorescentemente durante la amplificación llevada a cabo en el paso (i), en condiciones donde dichas sondas específicamente se unen a las secuencias de ácidos nucleicos amplificadas; y (iii) comparar más de una señal detectada en el paso (ii) con un patrón de fluorescencia definido experimentalmente, habiendo sido establecido dicho patrón por una definición inicial basada en la comparación teórica de las secuencias de las sondas nucleotídicas del paso (ii) con las secuencias de diferentes alelos de los genes seleccionados del paso (i), seguido de una definición definitiva basada en una determinación experimental de cuales de las señales teóricas son en realidad positivas (cuadrados negros en la Fig. 2) y cuales son en realidad negativas (cuadrados blancos en la Fig. 2). Los pasos (i) y (ii) de este método se llevan a cabo en el mismo tubo y sin ninguna manipulación adicional de la muestra.
En general, el ácido nucleico en la muestra será ADN, normalmente ADN genómico. Sin embargo, el método de la presente invención se puede usar con otros ácidos nucleicos; tales como ARN mensajero o ADN clonado, y el ácido nucleico puede ser de hebra simple o de hebra doble.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un kit para determinar el genotipo HLA-DRB de una muestra de ácido nucleico llevando a cabo el método descrito anteriormente. El kit comprende: (i) cebadores para amplificar los ácidos nucleicos de al menos uno de los genes de los loci HLA-DRB por la PCR en tiempo real; (ii) sondas nucleotídicas marcadas fluorescentemente para detectar señales de fluorescencia durante la amplificación; y (iii) patrones de fluorescencia definidos experimentalmente para comparar las señales detectadas como se describe anteriormente. En una realización particular de esta invención, los genes de los loci DRB en el paso (ii) se seleccionan del grupo formado por DRB1, DRB3, DRB4 y DRB5.
La PCR en tiempo real sigue la fluorescencia emitida durante la reacción como un indicador de la producción del amplímero durante cada ciclo de la PCR (es decir, en tiempo real), contrariamente a la detección en el punto final por los métodos de PCR cuantitativos convencionales. La PCR en tiempo real no detecta el tamaño del amplímero y así no permite la diferenciación entre ADN y la amplificación de ADNc. El sistema de PCR en tiempo real se basa en la detección y cuantificación de un revelador fluorescente.
En una realización particular de la invención, el kit proporciona cebadores que son ácidos nucleicos de hebra simple que tienen una longitud de 10 a 30 nucleótidos, particularmente de 14 a 24 nucleótidos, y que comprenden secuencias complementarias a las secuencias de una región situada a lo largo de intrón1-exón 2-intrón 2 de al menos uno de los genes seleccionados del grupo formado por DRB1, DRB3, DRB4 y DRB5. Particulamente, las secuencias de los cebadores se seleccionan del grupo formado por SEQ ID NO: 1-19. El paso de amplificación (i) del método se lleva a cabo con dos o más cebadores. La PCR en tiempo real se realiza usando parámetros térmicos de ciclado universales y condiciones de la reacción de PCR conocidas por un experto en la materia.
El kit de la invención también proporciona sondas que son ácidos nucleicos de hebra simple que tienen una longitud de 10 a 45 nucleótidos, particularmente de 13 a 34 nucleótidos, y que comprenden secuencias complementarias a las secuencias de un región situada a lo largo de exón 2 de al menos uno de los genes seleccionados del grupo formado por DRB1, DRB3, DRB4 y DRB5. Particularmente, las secuencias de las sondas se seleccionan del grupo formado por SEQ ID NO: 22-48 o de las secuencias complementarias de este grupo. En una realización particular, las sondas se marcan como fluorocromos del tipo marcador de revelador-marcador de ocultador ("reporter label-quencher label"), y las sondas se degradan debido a la actividad exonucleasa 5'->3' de la ADN polimerasa. En particular, se utilizan las sondas TaqMan de Applied Biosystems, Foster City, CA, USA, para este fin. Marcadores específicos para este propósito son FAM (6-carboxi-fluoresceina), VIC y TET (6-carboxi-4,7,2',7'-tetracloro-fluoresceina), que son marcadores de revelador fluorescentes, y TAMRA (6-carboxi-N,N,N',N'-tetrametil-rodamina) y MGB (ligando del surco menor del ADN) que son marcadores de ocultador fluorescentes y no fluorescentes, repectivamente. Las sondas Taqman utilizan la actividad exonucleasa fluorogénica 5' de la Taq polimerasa para medir la cantidad de secuencias target en las muestras. Estas sondas son cebadores más largos que los cebadores (20-30 bases de longitud con un valor Tm de 10ºC más alto) que contienen un marcador fluorescente normalmente en 5', y un marcador de ocultador (normalmente TAMRA) por lo general en 3'. Cuando se irradia, el marcador fluorescente excitado transfiere energía a la molécula más cercana de marcador de ocultador en lugar de emitir fluorescencia (esto se llama FRET, acrónimo de "Fórster or fluorescence resonance energy transfer"). Así, la proximidad del revelador y del ocultador impide la emisión de cualquier fluorescencia mientras la sonda está intacta. Las sondas TaqMan están diseñadas para hibridarse a una región interna de un producto de PCR. Cuando la polimerasa replica, su actividad exonucleasa 5' libera la sonda. Esto finaliza la actividad del ocultador (no FRET) y el marcador de revelador empieza a emitir fluorescencia que aumenta en cada ciclo proporcional al ritmo de liberación de la sonda. La acumulación de productos de PCR se detecta monitorizando el aumento de fluorescencia del marcador de revelador (los cebadores no están marcados). Debido a que la liberación ocurre sólo si la sonda se hibridiza a la secuencia diana, la fluorescencia detectada se origina de una amplificacion específica. Los ensayos se pueden realizar utilizando múltiples marcadores con distintas longitudes de onda de emisión.
Los cebadores específicos sintéticos y las sondas específicas del kit están diseñadas a partir de las secuencia de HLA-DRB genómico humano. El término "específico" significa que los cebadores y las sondas comprenden una secuencia nucleotídica totalmente complemetaria a una secuencia alélica de HLA-DRB.
En otra realización particular, el kit comprende además dos cebadores para el gen de la gliceraldehidofosfato deshidrogenasa (GAPDH) con SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 21, y una sonda para GAPDH con SEQ ID NO: 49, añadidos como control. Este control puede ser externo (en un tubo diferente), pero es preferiblemente interno (en el mismo tubo). El kit puede opcionalmente comprender instrucciones para determinar el genotipo HLA-DRB de una muestra según los ingredientes del kit.
El método de genotipificación de la presente invención y el kit par realizar el método tiene algunas ventajas claras respecto a los métodos y los kits conocidos en la técnica: se evitan los pasos de post-amplificación y así se ahorra trabajo y se reduce el riesgo de contaminación; el tiempo que se requiere para la tipificación pueden acortarse hasta dos horas y media si los pasos iniciales de cargar los reactivos y la muestra en las cubetas de reacción finalmente se automatizan; el uso de sondas específicas de alelo y el uso de más de una sonda en un único tubo permite la reducción del número de tubos de PCR, con lo que se simplifica aún más el procedimiento de tipificación de PCR y se alcanza un recorte importante de reactivos y coste, mientras que la resolución se aumenta.
Los términos "genotipificación" y "tipificación" se usan como sinónimos en esta descripción y se refieren a cualquier test que revele los alelos específicos heredados por un individuo, lo cual es particularmente útil para situaciones en las que más de una combinación genotípica puede producir la misma presentación clínica. En la presente descripción, el término "locus" significa la posición ocupada por cada gen HLA. Los "loci" (plural de locus) para los antígenos DR incluyen DRA y DRB1-B9. El término "alelo" se refiere a una de las dos o más formas alternativas de un gen, difiriendo en la secuencia genética y resultando en diferencias observables en los carácteres hereditarios (fenotipo), y se encuentran en el mismo lugar en un cromosoma. En el caso del locus HLA DRB1, los alelos diferentes de este locus se llaman DRB1*01, DRB1*02, etc., y estos alelos en conjunto forman lo que se llama un "grupo alélico" en esta descripción.
El método de genotipicación de la presente invención facilita por ejemplo la determinación de la compatibilidad de trasplante en un individuo y su propensión a una enfermedad específica. Como se menciona anteriormente, en comparación con algunos métodos de tipificación de HLA conocidos en la técnica, el método de la presente invención es más rápido y más fácil de automatizar, da una resolución mayor y reduce los riesgos de contaminación de la muestra.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos, dibujos y la lista de secuencias se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
Breve descripción de los dibujos
La Fig. 1 muestra un ejemplo de los resultados de tipificación de HLA-DRB de una muestra de ADN.
La Fig. 2 (Fig. 2A-K) muestra el patrón de fluorescencia para la interpretación de los resultados.
Descripción detallada de realizaciones particulares Descripción detallada de las figuras
En la Fig. 1 \DeltaRn representa la señal normalizada del revelador menos la señal de la línea de base establecida en los primeros ciclos de la PCR. Rn es la señal normalizada del revelador, que representa la señal de fluorescencia del marcador de revelador dividida por la señal de fluorescencia del marcador de referencia pasivo (ROX, incluido en el Tampón A). Ct representa el ciclo de PCR en el que se puede detectar por primera vez un aumento de la fluorescencia del revelador por encima de la señal de la línea de base. El Ct para una curva de amplificación sucede en el punto en el que la señal de fluorescencia crece más allá del valor umbral. La Fig. 1A muestra el gráfico de la amplificación fluorescente de las sondas FAM. Se representa \DeltaRn FAM vs. Ct. La Fig. 1B muestra el gráfico de la amplificación fluorescente de las sondas TET (control de amplificación GAPDH). Se representa \DeltaRn TET vs. Ct. La Fig. 1C muestra el gráfico de la amplificación fluorescente de las sondas VIC. Se representa \DeltaRn VIC vs. Ct. Las sondas positivas para estas muestras fueron las siguientes: las sondas FAM de los tubos 5, 6, 8, 12, 13 y 15; las sondas VIC de los tubos 3, 4, 7, 12, 13 y 15. El genotipo HLA-DRB deducido de esta muestra fue HLA-DRB1*11,15; DRB3; DRB5.
En la Fig. 2 (Fig.2A-K) se listan las especificidades HLA-DRB detectadas para cada reacción. Horizontalmente están las sondas fluorescentes usadas, y verticalmente las especificidades correspondientes. Un cuadrado negro indica un positivo real, una cruz indica un positivo no específico, "p" indica un positivo probable (no probado), y "pi" indica un positivo probable no especifico (no probado).
Puesta a punto del método de tipificación: construcción de un patrón de fluorescencia
Muestras de ADN: Un total de 100 muestras provenientes de pacientes trasplantados con órganos sólidos o con médula ósea, y de donantes sanos, se seleccionaron del almacén de muestras de ADN de los inventores, para representar los alelos de todas las especificidades HLA-DRB definidas serológicamente en la población española. El ADN genómico de estas muestras fue obtenido por un método estándar de precipitación por salado (cfr. S.A. Miller et al., "A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells", Nucleic Acids Res. 1988, vol. 16, pp. 1215).
Reacción de PCR: Se usó un conjunto de 16 tubos de PCR. Un total de 19 cebadores (14 pares) y de 28 sondas fluorogénicas se utilizaron para identificar todos los alelos HLA-DRB1, DRB3, DRB4 y DRB5, correspondientes a las especificidades serológicas HLA-DR1-16 y DR51-53. Se usaron 2 pares de cebadores por reacción: un par para los genes HLA-DRB y otro par para el gen GAPDH para proporcionar el control interno de amplificación positiva. La secuencia y la localización de los cebadores están listadas en la Tabla 1. En cada tubo se usaron 3 sondas con diferente marcador fluorescente, dos sondas específicas para DRB marcadas en su extremo 5' con FAM y VIC (exceptuando los tubos 14 y 16 donde sólo se usó una sonda específica para DRB), y una tercera sonda para GAPDH marcada con TET. La secuencia, localización, el marcador fluorescente y la temperatura de fusión de las sondas están listadas en la Tabla 2. El diseño de cebadores y de sondas se hizo a partir de las secuencias de los genes de HLA-DRB que se encuentran en la base de datos: EMBL-EBI Immunogenetics database > IMGT/HLA > Introduction to the IMGT/HLA Sequence Database, cop. 2003. http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/intro.html [consultado en 2003]. Todos los cebadores se diseñaron para tener una temperatura de fusión entre 58 y 60ºC, y las sondas entre 65 y 67ºC, para asegurar que las reacciones de PCR trabajasen bajo las mismas condiciones. Mientras que la mayoría de sondas están unidas al extremo 3' del marcador de ocultador TAMRA, en algunas de ellas se usó un ocultador no fluorescente (sonda MGB) para poder usar sondas más cortas pero manteniendo la temperatura de fusión. Cada reacción de PCR se llevó a cabo en un volumen final de 20 \mul que contenía los siguientes componentes: Tampón A (TagMan®1000 Rxn Gold/Tampón A Pack, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), 0.46 u de AmpliTaq Gold, MgCl_{2} [ver las concentraciones finales en la Tabla 4], 200 \muM de cada dNTP, cebadores, una sonda FAM, una sonda VIC (en la Tabla 4 se detallan las mezclas de cebadores y las sondas usadas en cada tubo, y sus concentraciones finales), 25 nM de cada cebador de GAPDH, 75 nM de la sonda GAPDH-TET y 50-100 ng de ADN. Las amplificaciones se llevaron a cabo en un 7700 SDS (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) que detectó y grabó la emisión de fluorescencia durante el proceso de amplificación en tiempo real. Después de una desnaturalización inicial a 95ºC durante 10 min, las muestras se sometieron a 40 ciclos de temperatura de un paso de desnaturalización a 95ºC durante 20 s y de un paso de hibridación/extensión a 64ºC durante 1 min. Las sondas Taqman fueron adquiridas a Applied Biosystems, Foster City, CA, USA: FAM (6-carboxi-fluoresceina), VIC, TET (6-carboxi-4,7,2',7'-tetracloro-fluoresceina), TAMRA (6-carboxi-N,N,N',N'-tetrametil-rodamina) y MGB (ligando de surco menor de
ADN).
La Tabla 1 muestra las secuencias y la posición del extremo 3' de los cebadores usados. Las posiciones de los cebadores de GAPDH se refieren a la secuencia del GenBank con el número de acceso J04038. El asterisco indica que estos cebadores están descritos en O. Olerup et al., "HLA-DR typing by PCR amplification with sequence specific cebadores (PCR-SSP) in 2 hours: an alternative to serological DR typing in clinical practice including donor-recipient matching in cadaveric transplantation", Tissue Antigens 1992, vol. 39, pp. 225-35. El símbolo # indica que el cebador está descrito en K. Kotsch et al., "Sequencing of HLA class II genes based on the conserved diversity of the non coding regions: sequencing based typing of HLA-DRB genes", Tissue Antigens 1999, vol. 53, pp. 486-97. RN indica el número de registro de CAS. En las secuencias degeneradas de cebadores, el símbolo Y indica C o T, S indica G o C, y K indica G o T.
Construcción de un patrón de fluorescencia: El patrón para la interpretación de las señales positivas se dedujo comparando las secuencias de los cebadores y de las sondas usadas en cada reacción y las secuencias de todos los alelos publicados. En algunos casos los resultados predichos se modificaron por los resultados observados que se obtuvieron con las muestras de ADN durante la puesta a punto del método. La Fig. 2 muestra el patrón de fluorescencia resultante.
Validación del método de genotipificación
Muestras de ADN y reacción de PCR: Para validar el método se seleccionaron al azar doscientas muestras de pacientes trasplantados y de donantes sanos. El ADN genómico de estas muestras se obtuvo mediante un método estándar de precipitación de ácidos nucleicos. La reacción de PCR para estas muestras se llevó a cabo como en la puesta a punto del método descrito anteriormente. Un ejemplo de la tipificación del HLA-DRB de una muestra de ADN con el nuevo método, se presenta en la Fig. 1.
Análisis de datos e interpretación
Para la tipificación fluorogénica del HLA-DRB, la amplificación por PCR de una muestra se realizó en paralelo con las 16 mezclas de cebadores y sondas. La presencia de un producto de PCR se asoció con un incremento significativo en la emisión de fluorescencia del correspondiente marcador de revelador. En la Tabla 5 se detallan las especificidades HLA-DRB detectadas por cada reacción.
Comparación con otros métodos de genotipificación
Independientemente, todas las muestras se tipificaron por métodos convencionales basados en la PCR, como la PCR-SSO, la PCR-SSP o la tipificación basada en la secuencia ("sequence-based typing", SBT). Las doscientas muestras analizadas para validar la técnica dieron resultados que fueron concordantes en todos los casos con los tipos HLA obtenidos previamente con los métodos convencionales de tipaje de ADN, como se muestra en la Tabla 6. Se observó una reducción importante en la proporción de los resultados ambiguos obtenidos por el nuevo método comparado con los métodos estándar de baja resolución como la PCR-SSP y la PCR-SSO. Con el nuevo método, en algunos casos se consiguió una resolución intermedia-alta de la tipificación.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 1 Secuencias y posición de los cebadores 3' usados
1
TABLA 2 Secuencias, marcadores fluorescentes, temperaturas de fusión y posición de las sondas flurogénicas usadas
Todas las sondas HLA-DRB de sitúan en el exón 2. La posición de la sonda de GAPDH está referida a la secuencia del GenBank con el número de acceso J04038. Un asterisco significa sonda MGB.
2
TABLA 3 Preparación de las mezclas de cebadores
La concentración final de las mezclas fue de 12.5 \muM excepto la mezcla 10 que era a 50 \muM. El símbolo * indica una concentración para ese cebador de 1.56 \muM; el símbolo # indica 5 \muM; y el símbolo \infty indica 25 nM.
Mezcla cebadores sentido cebadores antisentido
1 I1-04 FW E2-144C RV
I1-07 FW
2 I1-Com FW E2-210 RV
3 I1-Com FW E2-201 RV
4 E02 E2-322 RV
7 E2-100 FW E2-201 RV
8 E2-100 FW E2-322 RV
5 E2-201 FW I2-45 RV
12 E2-100 FW* I2-1 Com RV*
E02* I2-15 RV*
9 E04 I2RB7
10 DRB5 102-FW^{#} E2-322 RV^{#}
DRB3 102-FW^{#}
11 DRB4 115-FW DRB4 327-RV
GAPDH GAPDH FW^{\infty} GAPDH Intron H^{\infty} 
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(Tabla pasa a página siguiente)
3
TABLA 5 Cebadores y sondas usados en cada tubo y especificidades detectadas en cada reacción
Tubo Mezcla de sonda especificidad HLA-DRB
cebadores
1 1 1F 04
1V 07
2 2 2F 09
2V 10
3 3 3F 01
3V 03, 0820, 1101-04/..., 1301-16/..., 1401-03/...
4 3 4F 0801-19/..., 1105, 12, 1317, 1404/...
4V 15,16
5 4 5F 15
5V 1504, 1601/02/...
6 7 6F 0317, 0801-08/..., 1101-08/..., 1303/04/..., 1425/...
6V 0301-16/..., 0809/21, 1109/..., 12, 1301-02/05-06/..., 1401-24/...
7 8 7F 0310, 0808, 1343/..., 1401/04/...
7V 0308, 11, 1204, 1411
8 5 8F 0301/04/..., 0817, 1101-16/..., 12, 1301-02/04-06/..., 1417/..., 1501-06/...
8V 0101-02/04-05/..., 0403-05/06-0701/08/..., 09, 1126, 1344, 1401/02/04-11/...
9 5 9F 0103, 0402, 1102-03/..., 1301-02/04/..., 1416, 1510
9V 1303/10/...
10 5 10F 0701-05/07, 090102, 1201-03/...
10V 0312, 0405/09-12/..., 0801/03/05-06/..., 1303-04/..., 1413, 1512
11 5 11 F 0412/..., 0801-04/06-17/..., 1123/25, 1313/..., 1403/..., 1604
11 V 0301-10/..., 0422, 1107
12 5 12F 0101/03/..., 0302/..., 0401/05/07-09/..., 07, 0801-03/05/07-09/..., 09, 10,
12V 0102/..., 0301/03-04/..., 0402-04/06/10-13/..., 0804/06/..., 1102-04/..., 1201/...,
13 12 13F 0803/10/..., 1102/..., 1203-06/08, 1301-04/06/..., 1416/..., 1501-03/...
13V 0801-02/04-09/..., 1101/03-06/..., 1202, 1305/07/..., 1415/..., 1504
14 9 14V 0403/06-07/11/...
15 10 15F DRB5*0101-09,02
15V DRB3
16 11 16F DRB4*01, 02
TABLA 6 Concordancia de resultados del nuevo método de tipificación y otros métodos usados
Se indica el número de muestras para cada tipo de análisis.
grupo alélico tipificación PCR-SSO y PCR-SBT nuevo método de tipificación concordancia
DRB1*01 38 38 100%
DRB1*03 55 55 100%
DRB1*04 44 44 100%
DRB1*07 69 69 100%
DRB1*08 10 10 100%
DRB1*09 8 8 100%
DRB1*10 3 3 100%
DRB1*11 62 62 100%
DRB1*12 11 11 100%
DRB1*13 47 47 100%
DRB1*14 14 14 100%
DRB1*15 31 31 100%
DRB1*16 8 8 100%
DRB3 165 165 100%
DRB4 109 109 100%
DRB5 37 37 100%
<110> Universitat Autonoma de Barcelona/Serveis Sanitaris de Referencia - Centre de Trasfusions i Banc de Teixits
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\vskip0.400000\baselineskip
<120> Método y kit para la genotipificación de HLA-DRB basados en la PCR en tiempo real
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<130> Juan-1 DRB
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<140> - -
\vskip0.400000\baselineskip
<141> 2003-12-17
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\vskip0.400000\baselineskip
<160> 49
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\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.1
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<210> 1
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<211> 20
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcctgtggca gcctaagagg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
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<211> 23
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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<400> 2
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
acgtttcttg gagcaggtta aac 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
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<211> 24
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
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\hskip-.1em\dddseqskip
gcacgtttct tggagtactc tacg 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
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<211> 19
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccgtcccgt tgaagaaat 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
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<211> 17
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgcttcgaca gcgacgt 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
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<211> 18
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cacgtcgctg tcgaagcg 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tactccccca cgtcgctg 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
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<211> 19
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cyccgtagtt gtgtctgca 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cttctgtaac cggatcgttc tt 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtcagtgttt ttcccggaga 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttcgtgtccc cacagcac 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccgcggccat gctcac 
\hfill
16 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
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<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgcgccgcgc tcac 
\hfill
14 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
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<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cacacacaca cacacactca gattc 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
acacacacac tcagattctc c 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
acgtttctyg sagctgykta a 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
caggctaagt gtgagtgtca tttcc 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctctccacaa ccccgtagtt gta 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aygtttcttg cagcaggata agta 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aaggtggtga agcaggcgt 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tctgagccag ccaccagag 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cactcatgtt taacctgctc caagaaacg 
\hfill
29 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttaccctgcc acaggaaacg tgc 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agaaatgaca ctcaaactta tcctgcttca aga 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctcaaactta acctcc 
\hfill
16 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atgacattca aacttaagct gccacaagaa a 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcagacgtag agtactc 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agaaataaca ctcacccgta gagtactcca agaa 
\hfill
34 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
actccctctt aggctgccac agga 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cggcccgcgc ctgct 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgtcttccag gaagtccttc tggctg 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tacttccata accaagagga g 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tacttccata accaggagg 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgttccagtg ctccgcagca g 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccagtactc ctcatcaggc cgc 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgcccggaac tccccca 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cggcccgcct ctgctcc 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cggcccgctc gtcttcca 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgcggcccgc ttgtcttc 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccaggactc ggcgacaggc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tactcggcgc taggccgcc 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
taggtgtcca ccagggcccg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccggccccgc ttctgct 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgaagctctc accaaccccg tagttg 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgaagctctc cacaaccccg tagttg 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccaggatgt ccttc 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aggtgtccac ctcggcccg 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttccagtact cagcgtcagg ccg 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
caagggcatc ctgggctaca ctga 
\hfill
24

Claims (23)

1. Método para determinar el genotipo de los loci DRB del antígeno leucocitario humano ("human leukocyte antigen DRB", HLA-DRB) a partir de una muestra de ácido nucleico, que comprende los pasos de:
(i) amplificar cualquier ácido nucleico que comprende el exón 2 de al menos uno de los genes de los loci DRB mediante la reacción en cadena de la polimerasa ("polymerase chain reaction", PCR) en tiempo real;
(ii) detectar señales de fluorescencia mediante sondas nucleotídicas marcadas fluorescentemente durante la amplificación llevada a cabo en el paso (i), en condiciones en las que dichas sondas específicamente se unen a las secuencias de ácidos nucleicos amplificadas; y
(iii) comparar más de una señal detectada en el paso (ii) con un patrón de fluorescencia experimentalmente definido; habiendo sido dicho patrón establecido mediante una definición inicial basada en la comparación teórica de las secuencias de sondas nucleotídicas del paso (ii) con las secuencias de los diferentes alelos de los genes seleccionados del (i), seguido de una definición definitiva basada en una determinación experimental de cuales de las señales teóricas son en
realidad positivas (cuadrados negros en la Fig. 2) y cuales en realidad son negativas (cuadrados blancos en la Fig. 2);
donde los pasos (i) y (ii) se llevan a cabo en el mismo tubo y sin ninguna manipulación adicional de la muestra.
2. Método según la reivindicación 1, donde los genes de los loci DRB en el paso (ii) se seleccionan del grupo formado por DRB1, DRB3, DRB4 y DRB5.
3. Método según la reivindicación 2, donde el paso de amplificación (i) se lleva a cabo con dos o más cebadores los cuales son hebras simples de ácidos nucleicos teniendo una longitud de 10 a 30 nucleótidos y que comprenden secuencias complementarias a secuencias de una región situada a lo largo de intrón1-exón 2-intrón 2 de al menos uno de los genes seleccionados del grupo formado por DRB1, DRB3, DRB4 y DRB5.
4. Método según la reivindicación 3, donde la longitud de los cebadores es de 14 a 24 nucleótidos.
5. Método según la reivindicación 4, donde las secuencias del cebador se seleccionan del grupo formado por SEQ ID NO: 1-19.
6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 2-5 donde el paso de detección (ii) se lleva a cabo con una o más sondas las cuales son hebras simples de ácidos nucleicos con una longitud de 10 a 45 nucleótidos y las cuales comprenden secuencias complementarias a secuencias de una región situada a lo largo de exón 2 de al menos uno de los genes seleccionados del grupo formado DRB1, DRB3, DRB4 y DRB5.
7. Método según la reivindicación 6, donde la longitud de las sondas es de 13 a 34 nucleótidos.
8. Método según la reivindicación 7, donde las secuencias de las sondas se seleccionan del grupo formado por SEQ ID NO: 22-48.
9. Método según la reivindicación 7, donde las secuencias de las sondas se seleccionan de las secuencias complementarias del grupo formado por SEQ ID NO: 22-48.
10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 6-9, donde las sondas se marcan con fluorocromos del tipo marcador de revelador-marcador de ocultador ("reporter label-quencher label"), y las sondas se degradan debido a la actividad exonucleasa 5'->3' de la polimerasa del ADN.
11. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dos cebadores para el gen de gliceraldehidofosfato deshidrogenasa (GAPDH) con SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 21, y una sonda para GAPDH con SEQ ID NO: 49 se añaden como control.
12. Kit para determinar el genotipo de los loci DRB del antígeno leucocitario humano (HLA-DRB) a partir de una muestra de ácido nucleico mediante la realización del método de la reivindicación 1, que comprende:
(i) cebadores para amplificar los ácidos nucleicos de al menos uno de los genes de los loci HLA-DRB mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real;
(ii) sondas nucleotídicas marcadas fluorescentemente para detectar las señales de fluorescencia durante la amplificación; y
(iii) patrones de fluorescencia definidos experimentalmente para comparar las señales detectadas, habiendo sido establecidos dichos patrones mediante una definición inicial basada en la comparación teórica de las secuencias de sondas nucleotídicas con las secuencias de los diferentes alelos de los loci HLA-DRB, seguido de una definición definitiva basada en una determinación experimental de cuales de las señales teóricas en realidad son positivas (cuadrados negros en Fig. 2) y cuales son en realidad negativas (cuadrados blancos en Fig. 2).
13. Kit según la reivindicación 12, donde los genes de los loci DRB se seleccionan del grupo formado por DRB1, DRB3, DRB4 y DRB5.
14. Kit según la reivindicación 13, donde los cebadores son ácidos nucleicos de hebra simple que tienen una longitud 10 a 30 nucleótidos y que comprenden secuencias complementarias a secuencias de la región situada a lo largo de intrón 1-exón 2-intrón 2 de al menos uno de los genes seleccionados del grupo formado DRB1, DRB3, DRB4 y DRB5.
15. Kit según la reivindicación 14, donde la longitud de los cebadores es de 14 a 24 nucleótidos.
16. Kit según la reivindicación 15, donde las secuencias de cebador se seleccionan del grupo formado por SEQ ID NO: 1-19.
17. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 13-16, donde las sondas son ácidos nucleicos de hebra simple que tienen una longitud 10 a 45 nucleótidos y que comprenden secuencias complementarias a secuencias de la región situada a lo largo de exón 2 de al menos uno de los genes seleccionados del grupo formado por DRB1, DRB3, DRB4 y DRB5.
18. Kit según la reivindicación 17, donde la longitud de las sondas es de 13 a 34 nucleótidos.
19. Kit según la reivindicación 18, donde las secuencias de las sondas se seleccionan del grupo formado por SEQ ID NO: 22-48.
20. Kit según la reivindicación 18, donde las secuencias de las sondas se seleccionan de las secuencias complementarias del grupo formado por SEQ ID NO: 22-48.
21. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 17-20, donde las sondas se marcan con fluorocromos de tipo marcador de revelador-marcador de ocultador ("reporter label-quencher label"), y las sondas se degradan debido a la actividad exonucleasa 5'->3' de la polimerasa del ADN.
22. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 12-21, donde dos cebadores para el gen gliceraldehidofosfato deshidrogenasa (GAPDH) con SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 21, y una sonda para GAPDH con SEQ ID NO: 49 se añaden como control.
23. Kit para determinar el genotipo de los loci DRB del antígeno leucocitario humano (HLA-DRB) a partir de una muestra de ácido nucleico mediante la realización del método de la reivindicación 1, que comprende:
(i) cebadores para amplificar los ácidos nucleicos de al menos uno de los genes de los loci HLA-DRB mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real, siendo las secuencias de estos cebadores seleccionadas del grupo formado por SEQ ID NO: 1-19;
(ii) sondas nucleotídicas marcadas fluorescentemente para detectar las señales de fluorescencia durante la amplificación, siendo las secuencias de estas sondas seleccionadas del grupo formado por SEQ ID NO: 22-48.
(iii) dos cebadores para el gen gliceraldehidofosfato deshidrogenasa (GAPDH) con SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 21, y una sonda para GAPDH con SEQ ID NO: 49 añadidos como control; y
(iv) patrones de fluorescencia definidos experimentalmente para comparar las señales detectadas, habiendo sido establecidos dichos patrones mediante una definición inicial basada en la comparación teórica de las secuencias de sondas nucleotídicas con las secuencias de los diferentes alelos de los loci HLA-DRB, seguido de una definición definitiva basada en una determinación experimental de cuales de las señales teóricas en realidad son positivas (cuadrados negros en Fig. 2) y cuales son en realidad negativas (cuadrados blancos en Fig. 2).
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ALBIS-CAMPS, M. et al., "Fluorotyping of HLA-DRB by sequence- specific priming and fluorogenic probing.", TISSUE ANTIGENS, 1999, Vol. 53, No. 3, páginas 301-307. Todo el documento. 18,21,22 *
FAAS, S.J. et al., "Sequence-specific priming and exonuclease- released fluorescence detection of HLA-DQB1 alleles.", TISSUE ANTIGENS., 1996, Vol. 48, No. 2, pags 97-112. Todo el documento. *
FAAS, S.J. et al., "Sequence-specific priming and exonuclease- released fluorescence detection of HLA-DQB1 alleles.", TISSUE ANTIGENS., 1996, Vol. 48, No. 2, págs 97-112. Todo el documento. *
LI, X,Y. et al., "Determination of a real-time fluorotyping strategy for the HLA-DR locus.", TRANSPLANT. PROC., 2001, Vol. 33, No. 1-2, paginas 498-499. Todo el documento. *
LI, X,Y. et al., "Determination of a real-time fluorotyping strategy for the HLA-DR locus.", TRANSPLANT. PROC., 2001, Vol. 33, No. 1-2, páginas 498-499. Todo el documento. *
LIVAK, K.J., "Allelic discrimination using fluorogenic probes and the 5' nuclease assay.", GENET. ANAL. 1999, Vol. 14, No. 5-6, paginas 143-149. Todo el documento. *
LIVAK, K.J., "Allelic discrimination using fluorogenic probes and the 5' nuclease assay.", GENET. ANAL. 1999, Vol. 14, No. 5-6, páginas 143-149. Todo el documento. *
SAIKI, R.K. et al., "Analysis of enzymatically amplified beta- globin and HLA-DQ alpha DNA with allele-specific oligonucleotide probes.", NATURE, 1986, Vol. 324, No. 6093, paginas 163-166. Todo el documento. *
SAIKI, R.K. et al., "Analysis of enzymatically amplified beta- globin and HLA-DQ alpha DNA with allele-specific oligonucleotide probes.", NATURE, 1986, Vol. 324, No. 6093, páginas 163-166. Todo el documento. *
TREMMEL, M. et al., "High-resolution typing for HLA-DRB1*15 amd - DRB1*16 by fluorescence-marked sequence-specific priming (TaqMan assay)", TISSUE ANTIGENS, 1999, Vol. 54, No. 5, paginas 508-516. Todo el documento. *
TREMMEL, M. et al., "High-resolution typing for HLA-DRB1*15 amd - DRB1*16 by fluorescence-marked sequence-specific priming (TaqMan assay)", TISSUE ANTIGENS, 1999, Vol. 54, No. 5, páginas 508-516. Todo el documento. *

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