ES2276630B1 - Metodo y kit para genotipificacion de hla-b basados en la pcr en tiempo real. - Google Patents
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Método y kit para genotipificación de
HLA-B basados en la PCR en tiempo real.
Método y kit basados en la PCR en tiempo real
con cebadores y sondas específicos que permiten alcanzar un alto
grado de subtipiflcación del locus completo HLA-B.
Sus principales ventajas son la mayor rapidez (65 minutos,
incluyendo la interpretación); la facilidad de automatización ya
que sólo son necesarios dieciocho tubos para obtener un buen nivel
de resolución (tipificación de 300 grupos); reducción del coste
total por test gracias a la facilidad de automatización y la
simplicidad; se consigue un sorprendente alto grado de definición
alélica; y se reducen los riesgos de contaminación de la muestra
debido a que los productos amplificados siempre permanecen en los
tubos y no es necesario ningún paso post-PCR.
Description
Método y kit para genotipificación de
HLA-B basados en la PCR en tiempo real.
Esta invención se relaciona con el campo de la
medicina en general y específicamente con la investigación médica,
la biología molecular, la inmunología, la medicina forense y el
diagnóstico. En particular, la invención proporciona un método para
la determinación del genotipo (es decir, el conjunto de alelos
específicos) de un individuo.
En el trasplante entre individuos
inmunogenéticamente diferentes se establece la inmunidad en el
trasplante y se induce una reacción de rechazo contra el injerto.
Existen antígenos que inducen una inmunidad en el trasplante
particularmente intensa como dianas de esta reacción, que se llaman
antígenos mayores de histocompatibilidad. Estos antígenos son
controlados por un grupo de genes llamado complejo mayor de
histocompatibilidad ("major histocompatibility complex", MHC),
conocido en los humanos como el sistema de antígenos leucocitarios
humanos ("human leukocyte antigens", HLA). Estos genes que
codifican las moléculas HLA se encuentran entre los genes más
variables en humanos: cada variante codifica para moléculas que
unen péptidos diferentes. Estos genes son los mismos en todas las
células de un individuo particular, pero difieren de una persona a
otra. Se ha probado extensivamente que si el HLA del paciente y del
donante no relacionado concuerdan, se reduce significativamente el
rechazo al trasplante, la enfermedad del injerto contra el huésped
y consecuentemente, se reduce la mortalidad relacionada con los
trasplantes (cfr. N. Flomenberg et al., "Impact of HLA
class I and class II high-resolution matching on
outcomes of unrelated donor bone marrow transplantation:
HLA-C mismatching is associated with a strong
adverse effect on transplantation outcome", Blood 2004,
vol. 104, pp. 1923-30).
El HLA comprende varios genes agrupados en un
segmento de 4 Mb en el brazo corto del cromosoma 6. La región HLA
comprende seis loci mayores que codifican estructuralmente
proteínas homólogas que se clasifican en la clase I HLA
(HLA-A, B, Cw) y en la clase II
(HLA-DR, DQ, DP), que presentan antígenos a dos
subtipos diferentes de células. Las moléculas HLA de clase I
presentan antígenos a las células T que expresan la glicoproteína de
superficie celular CD8. Las glicoproteínas HLA son altamente
polimórficas y, en el caso del locus HLA-B, el
polimorfismo está localizado principalmente en los exones 2 y 3.
Hasta el momento, se conocen 699 variantes alélicas de este locus
que se agrupan en 35 especificidades serológicas, lo que significa
que este locus es el más polimórfico de los loci HLA. Las
variaciones alélicas del locus HLA-B son las que
tienen mayor importancia para la selección del trasplante dentro de
las moléculas de clase I.
La genotipificación de HLA por técnicas basadas
en la reacción en cadena de la polimerasa ("polymerase chain
reaction", PCR) se ha convertido en una alternativa a los
métodos serológicos, ampliamente usada en la práctica clínica. Los
métodos de tipificación basados en la PCR más comunmente utilizados
son la PCR con cebadores específicos de secuencia ("PCR with
sequence-specific primers",
PCR-SSP) y la PCR con hibridación con
oligonucleótidos específicos de secuencia ("PCR with
sequence-specific oligonucleotides",
PCR-SSO). En el método PCR-SSP la
secuencia del gen se determina mediante la amplificación de la
región hipervariable del antígeno HLA diana para determinar el tipo
de antígeno HLA (p.ej. cfr. M. Bunce et al., "Phototyping:
comprehensive DNA typing for HLA-A, B, C, DRB1,
DRB3, DRB4, DRB5 & DQB1 by PCR with 144 primer mixes utilizing
sequence-specific primers
(PCR-SSP)", Tissue Antigens 1995, vol. 46,
pp. 355-67). En el método PCR-SSO,
se prepara una membrana (sobre la que se inmobiliza el ADN
amplificado por los cebadores específicos del gen HLA) y se hibridan
las sondas oligonucleotídicas específicas del tipo respectivo de
HLA para la tipificación (p.ej. cfr. R.K. Saiki et al.,
"Analysis of enzymatically amplified beta-globin
and HLA-DQ alpha DNA with
allele-specific oligonucleotide probes",
Nature 1986, vol. 324, pp. 163-6).
Los kits que actualmente están en el mercado
para la genotipificación de HLA-B se basan en estos
dos métodos, la PCR-SSP y la
PCR-SSO. Pero aunque estos métodos han sido
efectivos en la práctica rutinaria de laboratorio, requieren un
procesamiento post-PCR que consume tiempo y
representa una gran fuente de contaminaciones. Asimismo, la
PCR-SSP requiere el uso de un gran número de
reacciones de PCR y es difícil de automatizar, limitando así su
rendimiento. Por otro lado, aunque la PCR-SSO es
capaz de un mayor rendimiento, sus tiempos de procesado son más
largos y no permite discriminar entre motivos situados en las hebras
cis o trans del ADN.
Para superar estas limitaciones, se han
propuesto varias alternativas en los últimos tres años, pero
todavía no están en el mercado: la tecnología de microarray (cfr.
C. Consolandi et al., "Polymorphism analysis within the
HLA-A locus by universal oligonucleotide array",
Hum. Mutat. 2004, vol. 24, pp. 428-34), la
pirosecuenciación (cfr. S. Ringquist et al., "HLA class II
DRB high resolution genotyping by pyrosequencing: comparison of
group specific PCR and pyrosequencing primers", Hum.
Immunol. 2004, vol. 65, pp. 163-74), la técnica
de la extensión de nucleótido único ("single nucleotide
extension") (cfr. M. Han et al., "Multiplex single
nucleotide extension: a robust and high throughput method for
HLA-A locus typing", Hum. Immunol. 2003,
vol. 64, pp. 1111-22) y la PCR en tiempo real. Se
han descrito aplicaciones de la PCR en tiempo real para la
tipificación de HLA-B27 (cfr. C. Tiemann et
al., "Rapid DNA typing of HLA-B27 allele by
real-time PCR using Iightcycler technology",
Clin. Lab. 2001, vol. 47, pp. 131-4; K.
Sylvain et al., "Rapid screening for
HLA-B27 by a TaqMan-PCR assay using
sequence-specific primers and a minor groove binder
probe, a novel type of TaqMan trade mark probe", J. Immunol.
Methods 2004, vol. 287, pp. 179-86; WO
2005/059505) y de HLA-DRB (cfr. WO
2005/059174).
El problema a solucionar por la presente
invención es proporcionar herramientas para conseguir un nivel de
descripción del locus HLA-B que permita abordar
mejor el estudio de la compatibilidad en los trasplantes. Los
laboratorios de tipificación de HLA tienen que analizar un gran
número de muestras y necesitan incrementar la resolución de la
tipificación para tener resultados clínicos válidos que determinen
la compatibilidad de trasplante en un indivi-
duo.
duo.
La solución tiene su base en el trabajo
detallado de los inventores (ver ejemplos de más adelante) que han
encontrado un método basado en la PCR en tiempo real con cebadores
y sondas específicos, que permiten alcanzar un alto grado de
subtipificación del locus completo HLA-B.
Previamente, como ya se ha indicado, se han propuesto protocolos
basados en la PCR en tiempo real con SYBR® green I o con sondas
FRET para la tipificación de otros targets, entre ellos,
HLA-DRB y HLA-B27. Sin embargo no
se han descrito técnicas similares para llegar a un alto nivel de
subtipificación de todo el locus HLA-B. Para la
descripción de este locus, los kits actualmente disponibles en el
mercado se basan en la PCR-SSO reversa (p.ej.
Inno-LiPA HLA-B Update Plus kit de
Innogenetics; Dynal RELI SSO HLA-B Typing kit de
Dynal Biotech-Oxoid S.A.), la
PCR-SSO Luminex (p.ej. LifeMatch
HLA-B Typing Kit de Tepnel
Lifecodes-Diagnostica Longwood; Kit LabType SSO B
Locus de One Lambda-Rafer) y la
PCR-SSP (p.ej. Dynal Biotech /
Pel-Freez; Genovision Olerup; One Lambda;
Protrans).
Así, un aspecto de la presente invención se
refiere a un método para la genotipificación de los alelos del
locus B de HLA a partir de una muestra de ácido nucleico, que
comprende los pasos de: (i) amplificar el ácido nucleico de la
muestra mediante PCR en tiempo real y con cebadores adecuados; (ii)
detectar señales de fluorescencia mediante sondas marcadas con un
marcador fluorescente, después de la amplificación llevada a cabo en
el paso (i), y analizar las temperaturas de fusión de las
secuencias amplificadas de ácidos nucleicos; y (iii) comparar más
de una señal detectada en el paso (ii) con un patrón de
fluorescencia definido experimentalmente; habiendo sido establecido
dicho patrón mediante una definición inicial basada en la
comparación teórica de las secuencias de las sondas del paso (ii)
con las secuencias de los diferentes alelos del locus B, seguido de
una definición definitiva basada en una determinación experimental
de cuales de las señales son realmente positivas para cada
temperatura de fusión (cuadrados negros en la Tabla 6) y cuales son
realmente negativas para cada temperatura de fusión (cuadrados
blancos en la Tabla 6); donde los pasos (i), (ii) y (iii) se
realizan para cada recipiente de una batería de recipientes y los
cebadores para dicha batería comprenden los cebadores con secuencias
SEQ ID NO: 15-19.
El recipiente normalmente será un tubo o vial
adecuado para PCR. Los cebadores y sondas de la presente invención
tienen secuencias diseñadas para amplificar regiones concretas
dentro del intrón 1-exón 2-intrón
2-exón 3-intrón 3 del locus
HLA-B. Serán útiles para esta invención tanto las
secuencias de cebadores y sondas indicadas en esta descripción como
sus secuencias complementarias.
En el paso (ii) se detectan señales de
fluorescencia mediante sondas marcadas con un marcador
fluorescente. Existen en la técnica varias formas de marcar las
sondas fluorescentemente. Una de las más utilizadas actualmente es
el marcaje de sondas con fluorocromos del tipo marcador
donador-marcador aceptor ("donor
label-acceptor label"), que induce el fenómeno
llamado FRET (acrónimo de "Förster or fluorescence resonance
energy transfer"). El fenónemo FRET implica la intervención de
dos sondas, cuyas secuencias son específicas al ADN molde que se
amplifica. Cada una de las sondas se marca con un fluoróforo
diferente. Cuando la sonda con marcador donador es excitada por una
fuente de luz, transfiere su energía a la segunda sonda marcada
como aceptora en lugar de emitir fluorescencia. Las dos sondas
están diseñadas para hibridar en sus dianas específicas de forma
que ambos fluoróforos están en estrecha proximidad, así la
transferencia de energía de resonancia sólo ocurre cuando ambas
sondas se hibridan a la diana, y estando así muy próximas entre sí.
La transferencia de energía resonante de fluorescencia es la
magnitud que permite seguir la producción del amplímero en la PCR
en tiempo real. La cantidad de FRET depende de la cantidad de
sondas hibridadas y ésta es proporcional a la cantidad de amplímero
al cual se pueden unir, por tanto a la cantidad de amplímero que se
produce. Son marcadores específicos para este propósito la
fluoresceína, el LC-RED 640^{TM}, el
LC-RED 705^{TM} y FAM de Tib-Mol
Biol. Los ensayos pueden llevarse a cabo utilizando múltiples
marcadores con distintas longitudes de onda de emisión.
Otras sondas marcadas fluorescentemente
desarrolladas recientemente por Biotools son las sondas Lion. Se
basan en la generación de una señal detectable y/o cuantificable
mediada por una actividad 3'-5' nucleasa. Se pone
en contacto el ácido nucleico substrato que se pretende identificar,
con al menos una sonda diseñada de manera que dicha sonda es capaz
de hibridar con el ácido nucleico substrato, dejando una o más
bases desapareadas en el extremo 3' de la sonda, o bases
adyacentes. La estructura del ácido nucleico de doble hebra con
bases desapareadas en el extremo 3' de la cadena oligonucleotídica
es substrato de la actividad 3'-5' nucleasa,
también presente que escinde las bases desapareadas de la sonda,
así como las bases que se encuentren en posición 3' de la zona
desapareada, generando una señal medible. La cadena de la sonda
presenta un doble marcaje con un fluoróforo bloqueante (quencher) y
un fluoróforo emisor (reporter).
Otras sondas marcadas fluorescentemente
conocidas en la técnica son las sondas Taqman de Applied
Biosystems, Foster City, CA, USA. Las sondas Taqman utilizan la
actividad exonucleasa fluorogénica 5' de la Taq polimerasa para
medir la cantidad de secuencias target en las muestras. Estas sondas
son oligonucleótidos más largos que los cebadores
(20-30 bases de longitud con un valor Tm de 10°C
más alto) que contienen un marcador fluorescente normalmente en 5',
y un marcador de ocultador (normalmente TAMRA) por lo general en
3'. Cuando se irradia, el marcador fluorescente excitado transfiere
energía a la molécula más cercana de marcador de ocultador en lugar
de emitir fluorescencia (fenómeno FRET). Así, la proximidad del
revelador y del ocultador impide la emisión de cualquier
fluorescencia mientras la sonda está intacta. Las sondas TaqMan
están diseñadas para hibridarse a una región interna de un producto
de PCR. Cuando la polimerasa replica, su actividad exonucleasa 5'
libera la sonda. Esto finaliza la actividad del ocultador (no FRET)
y el marcador de revelador empieza a emitir fluorescencia que
aumenta en cada ciclo proporcional al ritmo de liberación de la
sonda. Otras sondas marcadas fluorescentemente conocidas en la
técnica son las sondas Molecular Beacons, con química fluorescente
igual que las Taqman pero con una secuencia que es complementaria
entre sí de manera que se pliegan de manera característica. Otras
sondas marcadas fluorescentemente conocidas en la técnica son las
sondas Scorpion, con química fluorescente igual que las Taqman pero
pueden tener dos estructuras moleculares diferentes: Scorpion
uni-probe, con conformación de bucle similar a las
Molecular Beacons, y Scorpion bi-probe con
conformación duplex. Otras sondas marcadas fluorescentemente
conocidas en la técnica son las sondas Simple, que consisten en una
sola sonda marcada sólo con un fluorocromo llamado LED y sólo emite
fluorescencia cuando está unida a ADN.
El experto en la materia sabría adaptar el
método de la invención de acuerdo con cada uno de los tipos de
sondas indicados.
En general, el ácido nucleico en la muestra será
ADN, normalmente ADN genómico. Sin embargo, el método de la
presente invención se puede usar con otros ácidos nucleicos, tales
como ADN clonado o para determinadas reacciones ARN mensajero, y el
ácido nucleico puede ser de hebra simple o de hebra doble. La PCR
en tiempo real se realiza usando parámetros térmicos de ciclado
universales y condiciones de la reacción de PCR conocidas por un
experto en la materia. Aunque los tiempos de ensayo son más cortos
utilizando un LightCycler^{TM} que con otros termicladores, el
experto en la materia sabría adaptar fácilmente el método de la
invención a otros aparatos de RT-PCR.
En una realización particular de la invención,
las sondas para la batería de recipientes comprenden las sondas con
secuencias SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 40-50. La
Fig. 2, paso 1, es un ejemplo de la bateria de la recipientes
indicados anteriormente. En este caso, la batería consiste en siete
tubos con los cebadores y sondas indicados anteriormente, con los
que se consigue la discriminación de los principales grupos
alélicos de HLA-B.
En una realización más particular, la batería de
recipientes además comprende uno o más de los recipientes segundos
siguientes, cada recipiente comprendiendo los cebadores
indicados:
recipiente 1: cebadores con secuencias SEQ ID
NO: 1-3;
recipiente 2: cebadores con secuencias SEQ ID
NO: 10-12;
recipiente 3: cebadores con secuencias SEQ ID
NO: 13-14;
recipiente 4: cebadores con secuencias SEQ ID
NO: 4-7;
recipiente 5: cebadores con secuencias SEQ ID
NO: 22-23;
recipiente 6: cebadores con secuencias SEQ ID
NO: 20-21.
En una realización más particular, cada uno de
los mencionados recipientes segundos comprende además las sondas
indicadas:
recipiente 1: sondas con secuencias SEQ ID NO:
32-33, o bien
recipiente 1: sondas con secuencias SEQ ID NO:
38-39;
recipiente 2: sondas con secuencias SEQ ID NO:
40-41;
recipiente 3: sondas con secuencias SEQ ID NO:
32-33;
recipiente 4: sondas con secuencias SEQ ID NO:
34-35;
recipiente 5: sondas con secuencias SEQ ID NO:
33 y SED ID NO: 51;
recipiente 6: sondas con secuencias SEQ ID NO:
42-43.
Por lo tanto, la batería de recipientes de la
invención puede estar formada por los recipientes que permiten la
discriminación de los principales grupos alélicos de
HLA-B y, adicionalmente por los recipientes segundos
anteriormente mencionados. Los recipientes segundos permiten
solucionar las confusiones alélicas en el patrón de hibridación
homozigoto. Un ejemplo de recipientes segundos son los indicados en
la Fig. 2 paso 2. En este ejemplo el recipiente 3 correspondería a
T11. Pueden escogerse diferentes combinaciones de recipientes
segundos según las confusiones alélicas que se requiera
solucionar.
En una realización más particular, la batería de
recipientes además comprende uno o más de los recipientes terceros
siguientes, cada recipiente comprendiendo los cebadores
indicados:
recipiente 7: cebadores con secuencias SEQ ID
NO: 8-9;
recipiente 8: cebadores con secuencias SEQ ID
NO: 24-25;
recipiente 9: cebadores con secuencias SEQ ID
NO: 26-27;
recipiente 10: cebadores con secuencias SEQ ID
NO: 15 y SEQ ID NO: 27.
Finalmente, en una realización más particular,
cada uno de los mencionados recipientes terceros comprende además
las sondas indicadas:
recipiente 7: sondas con secuencias SEQ ID NO:
36-37;
recipiente 8: sondas con secuencias SEQ ID NO:
46-47;
recipiente 9: sondas con secuencias SEQ ID NO:
36-37;
recipiente 10: sondas con secuencias SEQ ID NO:
36 y SEQ ID NO: 50.
Por lo tanto, la batería de recipientes de la
invención puede estar formada por los recipientes que permiten la
discriminación de los principales grupos alélicos de
HLA-B, los recipientes segundos que permiten
solucionar las confusiones alélicas en el patrón de hibridación
homozigoto y adicionalmente, por los recipientes terceros
anteriormente mencionados. Los recipientes terceros permiten
solucionar las confusiones alélicas en el patrón de hibridación
heterozigoto. Un ejemplo de recipientes terceros son los indicados
en la Fig. 2 paso 3. En este ejemplo el recipiente 7 correspondería
a T12. Pueden escogerse diferentes combinaciones de recipientes
terceros según las confusiones alélicas que se requiera
solucionar.
En otra realización particular de la invención,
se añaden como control en el paso (i) del método de
genotipificación dos cebadores para el gen de la
\beta-globina con SEQ ID NO:
28-29. En una realización más particular, además se
añaden las sondas con secuencias SEQ ID NO: 52-53
para detectar la amplificación del gen de la
\beta-globina. En vez de un control basado en el
gen de la \beta-globina, puede ser necesario
añadir en algún recipiente, dos cebadores para el gen SCYA4 con SEQ
ID NO: 30-31 que se añaden como control en el paso
(i). En una realización más particular, además se añaden las sondas
con secuencias SEQ ID NO: 54-55 para detectar la
amplificación del gen SCYA4. Esto se da por ejemplo en el tubo T5
de los ejemplos que vienen a continuación. Los controles pueden ser
externos (en un tubo diferente), aunque preferiblemente son
internos (en el mismo tubo).
En una realización preferida, las sondas están
marcadas fluorescentemente con fluorocromos del tipo marcador
donador-marcador aceptor que dan lugar al fenómeno
de transferencia de energía FRET antes explicado.
Otro aspecto de la invención se refiere a un kit
para la genotipificación de los alelos del locus B de HLA a partir
de una muestra de ácido nucleico, mediante el método definido en
cualquiera de la modalidades antes descritas, que comprende el
patrón de fluorescencia, los cebadores y las sondas, tal y como se
definen anteriormente. El kit puede opcionalmente comprender
instrucciones para determinar los alelos de HLA-B de
una muestra según los componentes del kit.
Los términos "genotipificación" y
"tipificación" se usan como sinónimos en esta descripción y se
refieren a cualquier test que revele los alelos específicos
heredados por un individuo, lo cual es particularmente útil para
situaciones en las que más de una combinación genotípica puede
producir la misma presentación clínica. En la presente descripción,
el término "locus" significa la posición ocupada por cada gen
HLA (p.ej. el locus B de HLA). El término "alelo" se refiere a
una de las dos o más formas alternativas de un gen, difiriendo en
la secuencia genética y resultando en diferencias observables en
los carácteres hereditarios (fenotipo), y se encuentran en el mismo
lugar en un cromosoma. En este caso, el locus HLA-B
se distribuye en grupos alélicos diferentes (p.ej. B*35 o B*37) que
contienen varios alelos (p.ej. B*3502, B*3508).
El método y el kit de la presente invención
presentan muchas ventajas frente a los métodos de tipificación de
HLA conocidos en la técnica. Las principales ventajas son la mayor
rapidez (65 minutos, incluyendo la interpretación); la facilidad de
automatización ya que sólo son necesarios dieciocho tubos para
obtener un buen nivel de resolución (tipificación de 300 grupos);
reducción del coste total por test gracias a la facilidad de
automatización y la simplicidad; se consigue un sorprendente alto
grado de definición alélica; y se reducen los riesgos de
contaminación de la muestra debido a que los productos amplificados
siempre permanecen en los tubos y no es necesario ningún paso
post-PCR.
El método y el kit de la invención demuestran
una gran robustez cuando se ensayan muestras reales de laboratorio.
Permiten la reproducibilidad, precisión y simplicidad que se
requiere para el diagnóstico clínico: 1) los valores de Tm muestran
una variación inter-ensayo por debajo de 1°C y una
variación inter-ensayo por debajo de 0,5°C en la
mayoría de los casos; 2) todas las reacciones de PCR se pueden
realizar en 50 ciclos y en las mismas condiciones.
Salvo que se defina de otra manera, todos los
términos técnicos y científicos tienen el mismo significado que el
comúnmente entendido por un experto en la materia a la que la
invención pertenece. A lo largo de la descripción y las
reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no
pretenden excluir otras características técnicas, aditivos,
componentes o pasos. El resumen de la solicitud se incorpora aquí
como referencia. Para los expertos en la materia, otros objetos,
ventajas y características de la invención se desprenderán en parte
de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los
siguientes ejemplos, dibujos y la lista de secuencias se
proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean
limitativos de la presente invención.
La Fig. 1 muestra un ejemplo de los resultados
de los 18 tubos de reacción utilizados para la tipificación de una
muestra. La muestra ejemplo da como resultado de tipificación los
alelos B*14/51. T1 significa tubo número 1 y la misma nomenclatura
sirve hasta el tubo 18 (T18). TB significa tubo de
beta-globina. En cada gráfica T1-T18
se representa fluorescencia 640/Back 530 versus temperatura.
Se indica la temperatura resultado de la muestra ejemplo en cada
tubo. En los tubos en que los alelos de la muestra ejemplo no se
amplifican no se indica la temperatura pues para ellos la muestra es
negativa. Se indica con una línea gris continua la muestra control
negativo (mezcla de reacción sin ADN), con una línea gris
discontinua la muestra control positivo (una muestra de ADN de
tipificación conocida que se amplifica en dicho tubo) y con una
línea negra continua la muestra ejemplo de tipificación
desconocida. Para TB se representa fluorescencia 705/Back 530
versus ciclos.
La Fig. 2 muestra el esquema de tipificación en
tres pasos. El primer paso, indicado con un 1 sirve para la
discriminación de los principales grupos alélicas. En el segundo
paso, indicado con un 2, se solucionan las confusiones alélicas en
el patrón de hibridación homozigoto. En el tercer paso, indicado
con un 3, se solucionan las confusiones alélicas en el patrón de
hibridación heterozigoto. Una "w" significa "con" y
"vs.", versus. Por ejemplo en el T8, se soluciona la
confusión de B*1553 con B*4035.
Todas las muestras utilizadas tanto para la
puesta a punto del método como para su validación, se tipificaron
previamente en el laboratorio mediante una metodología de
tipificación estándar PCR-SSO,
PCR-SSP o secuenciación directa de amplímero
generado ("sequence-based typing", SBT). En
todos los casos, el ADN genómico se obtuvo de muestras utilizando
el QIAamp DNA blood mini kit (Quiagen GmbH, Hilden, Germany).
Todas las reacciones de PCR en tiempo real
fueron realizadas con el equipo LightCycler^{TM} o LightCycler
2.0^{TM} (Roche, Mannheim, Germany) combinando la amplificación
con cebadores específicos (secuencias especificadas en la Tabla 1)
con la detección por sondas específicas marcadas con fluorocromos
(secuencias especificadas en la Tabla 2). Todos los cebadores se
diseñaron para tener una Tm entre 60-62ºC; todas las
sondas de anclaje fueron diseñadas par tener una Tm entre
70-75ºC y todas las sondas sensoras en principio
entre 60-68ºC, aunque en el caso de P20s se
necesitó una Tm superior para incluir todas las posibilidades de
aquella región. Todos los cebadores se compraron a
Sigma-Genosys (London, UK) y todas las sondas de
hibridación se compraron a Tib MolBiol^{TM} (Mannheim, Germany).
Se utilizó un conjunto de 18 tubos de reacción para cada muestra
para definir todos los alelos HLA-B. Para
desarrollar todas las reacciones descritas, se usaron 31 cebadores:
dos pares para los dos genes diferentes de muestra control
(beta-globina y SCYA4) y los otros 27 para las 18
reacciones específicas HLA-B (algunos de ellos se
usaron en diferentes combinaciones para generar amplificaciones
diferentes). Cada reacción contenía dos pares de conjunto de
cebadores y sondas: un conjunto con cebadores para el locus
HLA-B y sondas FRET para el locus B marcadas con
LC-Red 640^{TM}, y un segundo conjunto con
cebadores para el gen control (normalmente
beta-globina) y sondas FRET para este control
interno marcadas con LC-Red 705^{TM}. Como
consecuencia, en cada tubo, la señal obtenida en F2/F1 (o 640/530
en el equipo LightCycler 2.0^{TM}) era de la reacción específica
del locus HLA-B, y la señal obtenida en F3/F1 (o
705/530 en el equipo LightCycler 2.0^{TM}) era del gen control.
Se usaron los cebadores control para el gen SCYA4 en una sola
reacción, en la que las complementariedades entre los cebadores y
sondas para la beta-globina con los cebadores y
sondas específicas para el locus HLA-B (tubo 18;
cebadores Pbx1-R1as; sondas
P18s-P1a) afectaron la reacción de tal manera que se
obtuvo una señal muy baja de la amplificación de
HLA-B (o de la reacción de la
beta-globina, dependiendo de las concentraciones
probadas de los cebadores y sondas). Todas las reacciones se
desarrollaron en un volumen final de 10 \mul, para cada reacción.
Los detalles de cada mezcla (cebadores y sondas utilizadas así como
las concentraciones específicas de reactivos) están listados en la
Tabla 3. En todas las reacciones de PCR, se añadió Taq polimerasa,
dNTPs y tampón de reacción mediante la utilización de 1 \mul de
LightCycler Fast Start Master Hybridization probes^{TM} (x10),
hasta 9 \mul de cada mezcla de reacción; se añadió un volumen de
1 \mul de ADN a una concentración de 0,1 El protocolo de
amplificación a tiempo real para todas las reacciones fue: 10 min
de desnaturalización inicial y activación del enzima Fast
Start^{TM} a 95ºC, seguidos por 50 ciclos de amplificación (5
segundos de desnaturalización a 95ºC, 6 segundos de hibridación a
62ºC y 10 segundos de extensión a 72ºC). Las curvas de fusión se
generaron a 95°C para 0 segundos, 72ºC para 20 segundos, 65ºC para
15 segundos, 42ºC para 270 segundos, 39ºC para 0 segundos (todas a
una rampa de 20ºC/s) y 80ºC para 0 segundos (rampa de 0,05ºC/s;
modo de adquisión: continuo), seguidas por un paso de enfriamiento
de 30 segundos a 40ºC.
Para la tipificación fluorogénica de
HLA-B, la amplificación por PCR de una muestra se
realizó en paralelo con todos las mezclas de 18 cebadores y sondas.
A través del análisis de la presencia de las curvas de fusión en el
canal F2/F1 (640/530) se pudo comprobar la especificidad del
producto de PCR del locus HLA-B. En la Tabla 6 se
listan las especificidades de HLA-B, mostrando
también las diferentes Tms que permiten la discriminación de estas
especificidades. El análisis del canal F3/F1 (F3/F1 channel)
(705/530) durante el paso de amplificación permitió detectar el
producto de PCR control, que se evindencia por el incremento de la
fluorescencia-F3 en las muestras. La interpretación
de los resultados de la tipificación de HLA obtenidos por PCR en
tiempo real se llevó a cabo con el uso de una tabla (Tabla 6) de
confrontación de sondas que contenía los patrones de hibridación
homocigotos de cada alelo HLA-B y utilizando el
Polygene 2.0, el software desarrollado para el análisis de
ambigüedades (ver después).
Para definir los oligonucleótidos (cebadores y
sondas), debido a la necesidad de dirigirlos a las secuencias
polimórficas de HLA-B, se realizó un análisis
manual de las secuencias de HLA-A, B y -C a partir
de las herramientas de alineación de la web de IMGT/HLA (Robinson y
Marsh 2000). Se utilizó el software Oligo® v4 para predecir la
tendencia a generar artefactos procedentes de los cebadores y
sondas y se utilizó la aplicación meltcalc99free.xlm® (Schutz y von
Ahsen 1999) para calcular las Tms de las sondas, así como para
calcular la temperatura teórica de fusión obtenida de todas las
hibridaciones incompatibles diferentes. Con el objetivo de predecir
los resultados de tipificación ambiguos obtenidos de muestras
heterozigotas para alelos HLA-B, se desarrolló el
software Polygene 2.0. Para obtener la genotipificación de cada
muestra considerando situaciones heterozigotas, se codificaron los
diferentes resultados de Tm en código binario, donde para cada Tm,
1 significaba positivo y 0 negativo. El número codificado se analizó
mediante Polygene 2.0. Este software compara todos los posibles
pares de resultados de tipificación predecidos para los alelos
conocidos de HLA-B, incluyendo su frecuencia en
cada alelo [calculada como media de todos los datos conocidos sobre
este alelo en la población Caucasoide (cfr. D. Middleton et
al., "New allele frenquency database:
http://www.allelefrequencies.net", Tissue Antigens 2003,
vol. 61, pp. 403-7) y a partir de las muestras
tipificadas en el año 2004 por el National Marrow Donor Program
(NMDP) (cfr. G.M. Schreuder et al., "HLA dictionary 2004:
summary of HLA-A, -B, -C, -DRB1/3/4/5, -DQB1 alleles
and their association with serologically defined
HLA-A, -B, -C, -DR, and -DQ antigens", Hum.
Immunol. 2005, vol 66(2), pp.170-210)] y
determina qué combinaciones de alelos generarán resultados ambiguos
(cuando coexisten en una muestra heterozigota) así como la
frecuencia de cada combinación alélica.
Para el establecimiento de la aproximación de
PCR en tiempo real FRET con 18 tubos, se seleccionaron un total de
250 muestras pacientes de transplante de médula ósea o de un órgano
sólido, o de donantes sanos del depósito de ADN del Banc de Sang i
Teixits (Barcelona) para representar todos los alelos de
HLA-B definidos serológicamente disponibles en la
población española (en presentación horno y heterozigótica). Las
muestras se seleccionaron para representar todas las situaciones
heterozigóticas involucrando perfiles de Tm próximos en la misma
reacción; de esta manera su Tm se concretaba permitiendo obtener la
asignación precisa para los resultados heterozigóticos con
ambigüedad. Para cada reacción, se ensayaron diferentes
concentraciones de ambos conjuntos de cebadores involucrados
(cebadores para el locus B y para el gen control), así corno la
concentración de MgCl_{2}, hasta encontrar la mejor combinación
para dar la señal de fusión específica mayor para los alelos del
locus HLA-B en cada caso. En reacciones en las que
las condiciones lo requerían, se añadió DMSO después de la
valoración de la concentración requerida en dichas reacciones.
Cuando los cebadores o las sondas diseñadas no funcionaban como se
esperaba, se diseñaron nuevos oligonucleótidos incluyendo
modificaciones respecto a la secuencia original (cfr. Tabla 1 y 2).
Corno el principal parámetro a analizar era el paso de fusión,
todas las sondas fueron diseñadas para trabajar bajo las mismas
condiciones de fusión, aunque algunas de ellas dieron un nivel de
fluorescencia mayor que otras. De hecho, esta variabilidad entre
reacciones indica diferentes eficiencias de PCR de las mezclas
individuales de cebadores y sondas. Para superar este problema, se
midió el máximo y el mínimo de fluorescencia para cada reacción
(Tabla 4). En general, el mínimo de fluorescencia corresponde a 10
ng de ADN (la cantidad mínima de muestra ensayada por reacción). Si
se observaban fluorescencias más bajas, se consideraban como
artefactos de la PCR.
Tipificación de HLA-B
mediante patrones de resultados de Tm de 18 PCR en tiempo real:
cuando se usó en un único ensayo la metodología, se debían
considerar los resultados de las 18 reacciones (Tabla 6). Se
definieron experimentalmente 61 Tms y se addicionaron 47 Tms
teóricas no definidas experimentalmente debido a que correspondían
a especificidades de HLA-B no comunes en la
población. En dos reacciones (tubo 2 y tubo 4) las sondas
HLA-B utilizadas para la monitorización no dieron
una señal de fluorescencia con algunos de los alelos amplificados
debido al gran número de falsos apareamientos con la sonda sensora.
Se consideraron como alelos no amplificados. De manera similar, en
el tubo 4 donde es posible detectar una Tm de 50ºC, algunas de las
muestras que teóricamente tenían que dar esta Tm dieron una señal
de fluorescencia muy débil, mientras que otras muestras no
produjeron señal. Estos resultados de Tm no se tuvieron en cuenta
para en la asignación alélica final para cada muestra
analiza-
da.
da.
Tipificación de HLA-B en
rondas consecutivas de PCR: grupos inciales de tipificación de
HLA-B mediante 7 reacciones; resolución de
ambigüedades mediante reacción adicional como segunda ronda de
rt-PCR: No siempre son necesarios los
resultados de las 18 reacciones para dar una tipificación. Por
ello, para optimizar el procedimiento se diseñó un diagrama de flujo
para hacer la tipificación en varios pasos utilizando el mínimo
óptimo de reacciones en cada caso. En realidad, siete de las
dieciocho reacciones (tubos 1 a 7) permiten clasificar los alelos B
en 188 grupos, dando una asignación inicial para muchos de los
resultados. Cinco de estas siete reacciones (tubos 1 a 5, que usan
los mismos cebadores pero sondas diferentes) amplifican el exón 2
de todos los alelos HLA-B excepto de B*7301. Para
el tercer exón, se diseñaron dos reacciones adicionales (tubos 6 a
7) para amplificar un amplio número de alelos. Así, esas siete
reacciones inciales permitían caracterizar un alelo mediante el
análisis de 26 curvas de fusión definidas experimentalmente
(teóricamente podían definir 21 Tms adicionales que no fueron
analizadas porque correspondían a elelos muy poco frecuentes). Las
subsiguientes once amplificaciones se dividieron en dos grupos
configurando dos rondas más de amplificación. La segunda ronda fue
usada para la resolución de ambigüedades en el caso de combinaciones
homozigotas de alelos y la tercera ronda para resolver las
ambigüedades en combinaciones heterozigotas de alelos.
Así pues, para utilizar el número mínimo posible
de reacciones, la tipificación se pudo hacer utilizando las
primeras siete reacciones (tubos 1-7) para todas
las muestras, y después, dependiendo del resultado obtenido,
utilizando las reacciones necesarias para resolver las ambigüedades
observadas, como se detalla en la Fig. 3. Aunque se diferenciaron
las reacciones en dos pasos, uno para discernir las ambigüedades
homozigotas (paso 2) y las ambigüedades heterozigotas (paso 3),
ambos pasos se pueden desarrollar simultáneamente en un sólo
segundo ensayo de PCR.
Interpretación de los datos de
genotipificación de HLA-B en tiempo real y
definición de indeterminaciones: La interpretación de los
resultados de tipificación de HLA-B obtenidos
mediante PCR en tiempo real, se llevó a cabo mediante el uso de una
tabla de confrontación de sondas que contenía los patrones de
hibridación homozigotos para cada alelo HLA-B (cfr.
Tabla 6) y, utilizando el software Polygene 2.0. A partir del
análisis informático se encontraron cuatro parejas de alelos no
resolubles por esta metodología, (la frecuencia relativa se incluye
en paréntesis): B*3537 (0,0010443%) versus B*7804
(0,0041772%); B*5401 (0,65895%) versus B*5507 (0,0020886%);
B*4047 (0%) versus B*4431 (0%); B*5104 (0,0062658%)
versus B*5306 (0%). Usando el software Polygene 2.0 también
fue posible detectar redundancias de alelo y asignar una
tipificación alelica específica (todos estos datos en relación con
la frecuencia esperada de población). Además, utilizando en
Polygene 2.0. se determinó si la coexistencia de diferentes alelos
HLA-B podía generar indeterminaciones de
tipificación. Se demostró que sólo alelos muy raros en la población
daban asignaciones HLA no resolubles (cfr. Tabla 5).
Para verificar la capacidad de la técnica para
dar resultados en muestras clínicas (una vez todas las condiciones
para las reacciones establecidas), la técnica se ensayó a ciegas
con 200 muestras clínicas seleccionadas al azar de pacientes de
transplante de un órgano sólido o de médula ósea, o de donantes
sanos, que fueron genotificadas previamente mediante
PCR-SSO. Las muestras se distribuyeron en siete
conjuntos de rondas de LightCycler, incluyendo junto con las
muestras a tipificar, una muestra negativa (mezcla de reacción sin
muestra clínica) y una muestra conocida positiva (la misma para los
siete tubos) en cada reacción. El análisis de las Tm de esta muestra
positiva permitió calcular la reproducibilidad del ensayo para
evaluar la variación de Tm inter-ensayo; la
variabilidad intra-ensayo se evaluó entre muestras
positivas de la misma ronda. En 17 reacciones la variabilidad (intra
e inter-ensayo) de las Tm fue menor que \pm0,5ºC;
en una reacción (tubo 2) la Tm de 54ºC tuvo una variabilidad de
\pm0,75ºC (estas variaciones altas no se apreciaron en la
evaluación de otras Tms presentadas en esta reacción). En todos los
casos, la tipificación alcanzados por el procedimiento en tiempo
real concordó con los métodos de tipificación anteriores. Un
ejemplo de la tipificación de HLA-B de una muestra
de ADN con este método se muestra en la Fig. 1.
El conjunto de muestras utilizadas tanto para el
establecimiento como para la validación de la técnica, se
tipificaron utilizando la metodología convencional de
PCR-SSO (Dynal Rely SSO HLA-B typing
kit, Dynal Biotech, Bromborough, UK).
Para la validación de la técnica con las 200
muestras, y cuando la técnica dio una resolución mayor que la
metodología de tipificación anterior (PCR-SSO),
aquellas muestras de PCR en tiempo real que dieron la resolución más
alta fueron re-tipificadas por
PCR-SBT. Esta PCR-SBT se realizó
como describió S. Pozzi, et al., ("HLA-B
locus sequence-based typing", Tissue
Antigens 1999, vol. 53, pp. 275-81) utilizando
polimerasa FastStart^{TM} (Roche) y BigDye^{TM} Terminator
Cycle Sequencing v2.0 (AbiPrism - PE Biosystems, Foster City,
California).
\newpage
M significa mezcla de cebadores (as) para
aquella reacción, en los casos R8, R10 y R13. La mezcla MR8as está
formada por 16.5% de R8as1 y 83.5% de R8as2. MR10as está formada por
80% de R10as1 y 20% de R10as2. MR13as está formada por 46.53% de
R13as1, 52.47% de R13as2 y 1% de R13as3. En todos los tubos había 1x
de Fast Start Master H.P. T significa tubo.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ambigüedades encontradas en la situación
heterozigota. Frecuencias combinatorias de los alelos
HLA-B están calculadas de la media de toda la
población caucásica del National Marrow Donor Program (columna NMDP)
y del Allele Project (columna AP). Esta figura presenta sólo las
indeterminaciones con valores de PNDM mayores que 0.0005%
(5E-6) y con un porcentaje dentro del grupo (% en
grupo) mayor que el 1%, o valores de PA que tienen frecuencia
documentada.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Patrón de fluorescencias para cada alelo
observado en las 18 reacciones. Se indica en la primera columna los
alelos, en la primera fila el número de tubo y en la segunda fila
para cada tubo las temperaturas de fusión observadas; nt significa
no testado; * señal que no siempre se observa. Los cuadros negros
indican señal positiva del alelo correspondiente con esa temperatura
de fusión y los cuadros blancos indican señal negativa del alelo
con esa temperatura de fusión.
<110> Universitat Autònoma de Barcelona /
Banc de Sang i de Teixits
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Método y kit para la
genotipificación de HLA-B basados en la PCR en
tiempo real
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\vskip0.400000\baselineskip
<130> P612ES00 HLA-B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> - -
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2005-12-13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 55
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgccagggtct cacaccc
\hfill17
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
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<211> 16
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcggcggtcca ggagct
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccgcggtcca ggagct
\hfill16
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
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<211> 17
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggagccccgc ttcatct
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtcagtctg tgtgttggt
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcggtaagtct gtgtgttggt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtaagtccg tgtgttggt
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaggtatttct acaccgcca
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcggtaagtct gcgcgga
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtccagggtc tcacacttg
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagccactcca cgcacag
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcccctccac gcacag
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtctcacacc ctccagagc
\hfill19
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgcgctcca gcttg
\hfill15
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggaggagcg aggggaccsc ag
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptmcgtggggg atgggga
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
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<211> 16
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcctcctcc gcgggc
\hfill16
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
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<211> 23
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggaggccatc cccggcgacc tat
\hfill23
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<210> 19
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<211> 18
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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<400> 19
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\hskip-.1em\dddseqskipccctgaacga ggacctga
\hfill18
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<210> 20
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<211> 17
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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<400> 20
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\hskip-.1em\dddseqskipggagccccgc ttcatca
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
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<211> 17
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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<400> 21
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\hskip-.1em\dddseqskipctgtgccttg gccttgc
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccgggtctca cacttgg
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagccactcca cgcacgt
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcacacagact taccgagaga a
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgccatacatc gtctgccaa
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggctacgtgg acgacacc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctctggttg tagtagcgga
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacacaactgt gttcactagc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaacttcatc cacgttcacc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcagaggaag atgcctacca c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggcagaggaa gatgcaaag
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcgtataac cagttcgcct
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgacggcaag gattacatcg ccct
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgccggaatat tgggacc
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgccgtggata gagcaggagg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgaggttcga cagcgacgcc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagtccgagg atggcgc
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcagaggatgt acggctgcg
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgtggggccg gacgg
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccggtgaggc ggagcagct
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagagcctacc tggagggcct gtg
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctacgtgga cgacacccag t
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgtgaggttc gacagcgacg ccg
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcactgcgatg aagcgggg
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcaactgggt gtcgtccacg tagc
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggaacctgcg cccctactac aacca
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagcgaggccg gtgagtgacc ccgg
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtgtgttggt cttgaagatc t
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtgttccggt cccaatactc c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgagtccgag agaggagcc
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggcatgacc agtacgcctv
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaagtctgccg ttactgccct gtggggcaa
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaaacagaca ccatggtgca cctgactcct gagga
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcagcacaga cttgcttgct tctttt
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptttggaatct gtagaacaag gag
\hfill23
Claims (12)
1. Método para la genotipificación de los alelos
del locus B del antígeno leucocitario humano ("human leukocyte
antigen B", HLA-B) a partir de una muestra de
ácido nucleico, que comprende los pasos de:
(i) amplificar el ácido nucleico de la muestra
mediante la reacción en cadena de la polimerasa ("polymerase
chain reaction", PCR) en tiempo real y con cebadores
adecuados;
(ii) detectar señales de fluorescencia mediante
sondas marcadas con un marcador fluorescente, después de la
amplificación llevada a cabo en el paso (i), y analizar las
temperaturas de fusión de las secuencias amplificadas de ácidos
nucleicos; y
(iii) comparar más de una señal detectada en el
paso (ii) con un patrón de fluorescencia definido
experimentalmente; habiendo sido establecido dicho patrón mediante
una definición inicial basada en la comparación teórica de las
secuencias de las sondas del paso (ii) con las secuencias de los
diferentes alelos del locus B, seguido de una definición definitiva
basada en una determinación experimental de cuales de las señales
son realmente positivas para cada temperatura de fusión (cuadrados
negros en Tabla 6) y cuales son realmente negativas para cada
temperatura de fusión (cuadrados blancos en Tabla 6);
donde los pasos (i), (ii) y (iii)
se realizan para cada recipiente de una batería de recipientes y
los cebadores para dicha bateria comprenden los cebadores con
secuencias SEQ ID NO:
15-19.
2. Método según la reivindicación 1, donde las
sondas para la batería de recipientes comprenden las sondas con
secuencias SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 40-50.
3. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1-2, donde la batería de
recipientes además comprende uno o más de los recipientes segundos
siguientes, cada recipiente comprendiendo los cebadores
indicados:
recipiente 1: cebadores con secuencias SEQ ID
NO: 1-3;
recipiente 2: cebadores con secuencias SEQ ID
NO: 10-12;
recipiente 3: cebadores con secuencias SEQ ID
NO: 13-14;
recipiente 4: cebadores con secuencias SEQ ID
NO: 4-7;
recipiente 5: cebadores con secuencias SEQ ID
NO: 22-23;
recipiente 6: cebadores con secuencias SEQ ID
NO: 20-21.
4. Método según la reivindicación 3, donde cada
uno de los mencionados recipientes segundos comprende además las
sondas indicadas:
recipiente 1: sondas con secuencias SEQ ID NO:
32-33, o bien
recipiente 1: sondas con secuencias SEQ ID NO:
38-39;
recipiente 2: sondas con secuencias SEQ ID NO:
40-41;
recipiente 3: sondas con secuencias SEQ ID NO:
32-33;
recipiente 4: sondas con secuencias SEQ ID NO:
34-35;
recipiente 5: sondas con secuencias SEQ ID NO:
33 y SED ID NO: 51;
recipiente 6: sondas con secuencias SEQ ID NO:
42-43.
5. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 3-4, donde la batería de
recipientes además comprende uno o más de los recipientes terceros
siguientes, cada recipiente comprendiendo los cebadores
indicados:
recipiente 7: cebadores con secuencias SEQ ID
NO: 8-9;
recipiente 8: cebadores con secuencias SEQ ID
NO: 24-25;
recipiente 9: cebadores con secuencias SEQ ID
NO: 26-27;
recipiente 10: cebadores con secuencias SEQ ID
NO: 15 y SEQ ID NO: 27.
6. Método según la reivindicación 5, donde cada
uno de los mencionados recipientes terceros comprende además las
sondas indicadas:
recipiente 7: sondas con secuencias SEQ ID NO:
36-37;
recipiente 8: sondas con secuencias SEQ ID NO:
46-47;
recipiente 9: sondas con secuencias SEQ ID NO:
36-37;
recipiente 10: sondas con secuencias SEQ ID NO:
36 y SEQ ID NO: 50.
7. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1-6, donde dos cebadores para el
gen de la \beta-globina con SEQ ID NO:
28-29 se añaden como control en el paso (i).
8. Método según la reivindicación 7, donde
además se añaden las sondas con secuencias SEQ ID NO:
52-53 para detectar la amplificación del gen de la
\beta-globina.
9. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1-6, donde dos cebadores para el
gen SCYA4 con SEQ ID NO: 30-31 se añaden como
control en el paso (i).
10. Método según la reivindicación 9, donde
además se añaden las sondas con secuencias SEQ ID NO:
54-55 para detectar la amplificación del gen
SCYA4.
11. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1-10, donde las sondas están
marcadas fluorescentemente con fluorocromos del tipo marcador
donador-marcador aceptor ("donor
label-acceptor label") que dan lugar al fenómeno
de transferencia de energía FRET.
12. Kit para la genotipificación de los alelos
del locus B del antígeno leucocitario humano ("human leukocyte
antigen B", HLA-B) a partir de una muestra de
ácido nucleico, mediante el método definido en cualquiera de las
reivindicaciones 1-11, que comprende el patrón de
fluorescencia, los cebadores y las sondas, tal y como se definen en
cada una de las reivindicaciones 1-11.
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