ES2255741T3

ES2255741T3 - Composiciones de acido linoleico conjugado enriquecidas con isomeros.

Info

Publication number: ES2255741T3
Application number: ES99105496T
Authority: ES
Inventors: Daria Jerome; Carl Skarie; Asgeir Saebo
Original assignee: Natural ASA
Current assignee: Aker Biomarine ASA
Priority date: 1998-05-04
Filing date: 1999-03-17
Publication date: 2006-07-01
Anticipated expiration: 2019-03-17
Also published as: MXPA00010794A; DE69928986D1; NO20005565L; DE69936484T2; NO332473B1; JP2001508085A; JP2002223722A; WO1999056780A1; JP2015037410A; JP2003113080A; CA2293336C; JP2010259437A; JP2013165717A; NO20005565D0; MX234917B; KR20010071205A; ATE366521T1; WO1999056780A8; JP2010195825A; EP0954975B1

Abstract

SE PRESENTAN COMPOSICIONES Y PROCEDIMIENTOS PARA UTILIZAR PREPARACIONES DE ACIDO LINOLEICO CONJUGADO ENRIQUECIDAS POR LOS ISOMEROS T10,C12 Y C9,T11. SE HA ENCONTRADO QUE LAS PREPARACIONES DE ACIDO LINOLEICO CONJUGADO QUE CONTIENEN UNA PROPORCION DE T10,C12:C9,T11 MAYOR DE 1,2:1 SON ADECUADAS PARA UNA AMPLIA VARIEDAD DE USOS NUTRICIONALES, TERAPEUTICOS Y FARMACOLOGICOS.

Description

Composiciones de ácido linoleico conjugado enriquecidas con isómeros.

La presente invención se refiere al campo de la nutrición animal y humana y, en particular, a las composiciones que contienen ácidos linoleicos conjugados (ALC).

Antecedentes de la invención

El ácido linoleico conjugado (ALC) se ha convertido en el centro de numerosos programas de investigación que buscan poner de manifiesto sus propiedades nutricionales, terapéuticas y farmacológicas.

Se ha demostrado que la reorganización de los enlaces dobles del ácido linoleico en posiciones conjugadas se produce durante el tratamiento con catalizadores como el níquel o las bases a temperaturas elevadas y durante la autooxidación. Teóricamente, se formarían ocho posibles isómeros geométricos del ácido 9,11 y 10,12 octadecadienoico (c9,c11; c9,t11; t9,c11; t9,t11; c10,c12; c10,t12; t10,c12 y t10,t12) a partir de la isomerización del ácido c9,c12 octadecadienoico. J. C. Cowan, en JAOCS 72: 492-99 (1950), describió un mecanismo general para la isomerización del ácido linoleico. Se cree que el doble enlace se polariza como resultado de una colisión con un catalizador activador. Por tanto, el átomo de carbono polarizado y su carbono adjunto son libres de rotar y las fuerzas son tales que hacen que al átomo de carbono deficiente quede esencialmente plano. Luego, cuando el sistema se mueve para liberar esas fuerzas instaladas como resultado de la colisión, se forman los dos isómeros cis y trans. La formación de determinados isómeros del ALC está favorecida termodinámicamente. Esto se debe a las características coplanares de los cinco átomos de carbono alrededor del doble enlace conjugado y a un conflicto espacial del radical en resonancia. La distribución relativamente elevada de los isómeros 9,11 y 10,12 es, aparentemente, el resultado de la estabilización de los isómeros geométricos c9,t11 o t10,c12.

Los avances en la cromatografía de gases han permitido que los investigadores determinen con precisión la composición de los isómeros de las muestras de ALC. En Christie et al., JAOCS 74 (11): 1231 (1997) se describió que la distribución de isómeros de una muestra comercial del ALC era la siguiente: 8,10 (14%), 9,11 (30%), 10,12 (31%) y 11,13 (24%). En otro estudio publicado por Christie et al. que aparece en Lipids 33(2): 217-21 (1998), se describió la siguiente composición de isómeros del ALC en una preparación comercial: t11,t13 (74%), t10,t12 (1,23%), t9,t11 (1,18%), t8,t10 (0,46%), c11,t13 y t11,c13 (21,7%), c10,t12 y t10,c12 (29,0%), c9,t11 y t9,c11 (29,5%), c8,t10 y t8,c10 (12,3%), c11,c13 (0,96%), c10,c12 (0,88%), c9,c11 (0,88%) y c8,c10 (0,20%). Como se puede observar a partir de estos estudios, incluso aunque esté favorecida la formación de determinados isómeros, a la composición de las preparaciones isomerizadas por álcali del ALC pueden contribuir enormemente otros isómeros del ALC.

En 1978, unos investigadores de la Universidad de Wisconsin descubrieron cuál era la sustancia que aparecía en la carne cocinada que parecía inhibir la mutagénesis. Se encontró que esta sustancia era el ALC. Los ácidos grasos con insaturaciones conjugadas normalmente no forman parte de la dieta de las vacas. Sin embargo, el ácido c9,t11 octadecadienoico es un primer intermediario que se forma en la panza durante la biohidrogenación del ácido linoleico realizada por la ácido linoleico isomerasa de la bacteria anaerobia Butyrivibrio fibrisolvens, como se describe en Kepler et al., J. Biol. Chem. 241: 1250-54 (1966).

La actividad biológica de determinados isómeros del ALC ha sido objeto de cierta especulación. Generalmente, la bibliografía sugiere que el isómero biológicamente activo es el isómero c9,t11 producido por Butyribrio fibrisolvens [para revisiones que adopten esta hipótesis, véase P. W. Parodi, J. Nutr. 127(6): 1055-60 (1997) y M. A. Belury, Nutition Reviews 53(4): 83-9 (1995)]. Otros datos que apoyan esta hipótesis aparecen en Ha et al., Cancer Res., 50: 1097 (1991). Aquí, los investigadores llevaron a cabo estudios de captación con marcación que indican que el isómero 9,11 se toma, de algún modo, con preferencia, y se incorpora en la fracción de los fosfolípidos de los tejidos animales, y el isómero 10,12 se capta en menor medida.

La actividad biológica asociada con el ALC es diversa y compleja. En la actualidad, poco se sabe acerca de los mecanismos de acción del ALC, aunque varios estudios preclínicos y clínicos en curso probablemente arrojen nuevos datos sobre los modos de acción fisiológicos y bioquímicos. Se han documentado bien las propiedades antineoplásicas del ALC. La administración del ALC inhibe la carcinogenia mamaria de la rata, como se demostró en Ha et al., Cancer Res., 52: 2035-s (1992). En Ha et al., Cancer Res., 50: 1097 (1990) se describieron resultados similares con un modelo de neoplasia del preestómago de ratón. También se ha identificado que el ALC es un potente agente citotóxico contra las células diana in vitro humanas de melanoma, de cáncer colorrectal y de cáncer de mama. Un reciente e importante artículo de revisión confirma las conclusiones extraídas de los estudios individuales [Ip, Am. J. Clin. Nutr. 66(6): 1523s (1997)].

Aunque los mecanismos de la acción del ALC son todavía oscuros, hay indicios de que puede(n) estar implicado(s), al menos in vivo, algún(os) componente(s) del sistema inmunitario. La patente de los EE. UU. n.º 5 585 400 (Cook et al.) describe un método para atenuar las reacciones alérgicas en animales mediadas por la hipersensibilidad de tipo I o TgE al administrar una dieta que contiene ALC. También se demostró que el ALC en concentraciones de aproximadamente el 0,1% al 1,0% era un adyuvante eficaz a la hora de proteger los leucocitos. La patente de los EE. UU. n.º 5 674 901 (Cook et al.) describió que la administración oral o parenteral del ALC, tanto en forma de ácido libre como de sal, daba lugar a un aumento de las subpoblaciones de linfocitos CD-4 y CD-8 asociados con la inmunidad celular. Los efectos secundarios que surgen del pretratamiento con factor de necrosis tumoral exógeno se podrían mitigar indirectamente mediante el aumento o el mantenimiento de los niveles de linfocitos CD-4 y CD-8 en animales a los que se administró el ALC. Finalmente, la patente de los EE. UU. n.º 5 430 066 describe el efecto del ALC en la prevención del adelgazamiento y la anorexia mediante la estimulación inmunitaria.

Además de las posibles aplicaciones terapéuticas y farmacológicas del ALC como se expuso anteriormente, se ha formado mucho revuelo en relación al uso del ALC en la nutrición como complemento alimenticio. Se ha encontrado que el ALC ejerce un profundo efecto generalizado en la composición corporal, en particular, al reencauzar el reparto de la masa del tejido graso y magro. La patente de los EE. UU. n.º 5 554 646 (Cook et al.) describe un método que utiliza el ALC como complemento alimenticio, en la que los cerdos, ratones y los humanos se alimentaron con dietas que contenían el ALC al 0,5%. En cada especie, se observó una caída significativa del contenido de grasa con un aumento simultáneo de la masa de proteínas. Es interesante que, en estos animales, el aumento del contenido de ácidos grasos en la dieta por adición de ALC no da lugar a ningún aumento de la masa corporal, sino que se asocia con una redistribución de la grasa y de carne magra dentro del cuerpo. Otro fenómeno alimenticio de interés es el efecto del complemento con ALC sobre la conversión de los alimentos. La patente de los EE. UU. n.º 5 428 072 (Cook et al.) proporcionó datos que demuestran que la incorporación del ALC en la alimentación de los animales (pájaros y mamíferos) aumentaba la eficacia de la conversión de los alimentos, lo que condujo a un mayor aumento de peso en los animales con complemento de ALC. En la patente internacional WO n.º 9746230 se describe un método para mantener un nivel existente de grasa corporal en los humanos administrando ALC.

Los posibles efectos beneficiosos del complemento con ALC son evidentes para los criadores de animales para la alimentación. Se necesita determinar cuáles son los isómeros biológicamente activos reales y las proporciones adecuadas en las que se deben utilizar estos isómeros.

Compendio de la invención

La bibliografía científica sugiere que el isómero activo del ALC es el isómero c9,t11. Sin embargo, como se muestra en la presente memoria, un aumento de la proporción de los isómeros 10,12:9,11 tiene un efecto pronunciado sobre la actividad biológica de las preparaciones del ALC. Por lo tanto, un objeto de la presente invención es proporcionar el uso de composiciones que contienen isómeros biológicamente activos del ALC en un contenido enriquecido para optimizar los efectos biológicos deseados.

En una realización, la invención proporciona el uso de composiciones y preparaciones que comprenden, al menos, el ALC t10,c12 al 80% para la fabricación de un medicamento para reducir la grasa mala. En algunas realizaciones, el ALC t10,c12 es puro, al menos, al 90% aproximadamente, y en otras realizaciones más, el ALC t10,c12 es puro, al menos, al 92% aproximadamente.

Las composiciones anteriormente citadas se pueden incorporar en acilglicéridos o alquilésteres. En algunas realizaciones, la composición de los acilgliceroles comprende una variedad de moléculas de acilgliceroles de la estructura:

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en la que R_{1}, R_{2} y R_{3} se seleccionan del grupo que consiste en un grupo hidroxilo y en un ácido octadecadienoico, la composición se caracteriza por que al menos el 80%, aproximadamente, contiene ácido t10,c12 octadecadienoico en las posiciones R_{1}, R_{2} y R_{3}. En otras realizaciones, la composición de los acilgliceroles se caracteriza por que al menos el 90%, aproximadamente, contiene ácido t10,c12 octadecadienoico en las posiciones R_{1}, R_{2} y R_{3}. En otras realizaciones adicionales, la composición de los acilgliceroles se caracteriza por que al menos el 92%, aproximadamente, contiene ácido t10,c12 octadecadienoico en las posiciones R_{1}, R_{2} y R_{3}.

En posteriores realizaciones, se pueden incorporar las composiciones ricas en t10,c12 a productos comestibles, que incluyen piensos para animales y alimentos para consumo humano, o se pueden formular con un excipiente o un vehículo de administración oral.

Se pueden utilizar composiciones que contengan ALC t10,c12 en la fabricación de un medicamento para disminuir la grasa corporal en humanos y en otros animales. En algunas realizaciones, el ALC t10,c12 es puro, al menos, al 80% aproximadamente, en otras realizaciones, el ALC t10,c12 es puro, al menos, al 90% aproximadamente, y aún en otras realizaciones, el ALC t10,c12 es puro, al menos, al 92% aproximadamente. En otras realizaciones más, se administra la preparación con t10,c12 a animales, incluidos los humanos, de manera que se reduce la grasa corporal.

En otras realizaciones, la presente invención proporciona métodos para producir el ALC t10,c12 para aceites de consumo de semilla, incluidos, pero sin limitarse a ellos, el aceite de girasol, el aceite de alazor, el aceite de soja y el aceite de maíz. En algunas realizaciones, se proporcionan un aceite de semilla de consumo y un método para tratar el aceite de semilla. En otras realizaciones, se trata el aceite de semilla en condiciones como las que se usan para producir una preparación que comprende ALC t10,c12. En algunas realizaciones, al menos el 80% aproximadamente del ALC es t10,c12, en otras realizaciones, al menos el 90% aproximadamente del ALC es t10,c12, y aún en otras realizaciones, al menos el 92% aproximadamente del ALC es t10,c12. En otras realizaciones, se forma una mezcla de alquilésteres a partir del aceite de semilla de consumo. En otras realizaciones más, luego se conjugan los alquilésteres. En algunas realizaciones, los alquilésteres conjugados se diluyen en un solvente y se precipitan al disminuir la temperatura a, al menos, de -56ºC a -57ºC. En otras realizaciones, se retiran los ácidos grasos saturados de la preparación al disminuir la temperatura a aproximadamente -30ºC. En otras realizaciones más, se pueden retirar los ácidos grasos saturados mediante el fraccionamiento con urea. En otras realizaciones, la invención proporciona el ALC t10,c12 producido mediante el procedimiento que se acaba de describir.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es una representación gráfica de un análisis de regresión logarítmica de tres estudios distintos que comparan la proporción de los isómeros 10,12 y 9,11 del ALC frente al porcentaje de reducción de grasa en la espalda de los cerdos.

La figura 2 es una representación gráfica de un análisis de regresión lineal de tres estudios diferentes que comparan el porcentaje total del isómero 10,12 del ALC en la dieta de los cerdos frente al porcentaje de reducción de la grasa en la espalda.

Descripción detallada de la invención Definiciones

Tal y como se usa en la presente memoria, "ácido linoleico conjugado" o "ALC" se refiere a cualquier ácido linoleico conjugado o ácido graso octadecadienoico libre. Se pretende que este término abarque e indique todos los isómeros posicionales y geométricos del ácido linoleico con dos dobles enlaces carbono-carbono conjugados en cualquier lugar en la molécula. El ALC difiere del ácido linoleico normal en que el ácido linoleico normal tiene dobles enlaces en los átomos de carbono 9 y 12. Los ejemplos de ALC incluyen isómeros cis- y trans- ("isómeros E/Z") de los isómeros posicionales siguientes: ácido 2,4-octadecadienoico, ácido 4,6-octadecadienoico, ácido 6,8-octadecadienoico, ácido 7,9-octadecadienoico, ácido 8,10-octadecadienoico, ácido 9,11-octadecadienoico, ácido 10,12-octadecadienoico y ácido 11,13-octadecadienoico. Tal y como se usa en la presente memoria, "ALC" abarca un solo isómero, una mezcla seleccionada de dos o más isómeros y una mezcla no seleccionada de isómeros obtenidos de fuentes naturales, así como ALC sintético y semisintético.

Tal y como se usa en la presente memoria, se pretende que los "triglicéridos" de ALC contengan el ALC en cualquiera de las 3 posiciones, o en todas ellas, del esqueleto del triglicérido. De acuerdo con esto, un triglicérido que contenga ALC puede contener cualquiera de los isómeros posicionales y geométricos del ALC.

Tal y como se usa en la presente memoria, se pretende que los "ésteres" de ALC incluyan cualquiera y todos los isómeros posicionales y geométricos del ALC unidos mediante un enlace éster a un alcohol o a cualquier otro grupo químico, incluidos, pero sin limitarse a ellos, alcoholes fisiológicamente aceptables que se producen en la naturaleza (p. ej., metanol, etanol y propanol). Por lo tanto, un éster del ALC o el ALC esterificado puede contener cualquiera de los isómeros posicionales y geométricos del ALC.

Se pretende que los "isómeros que no se producen en la naturaleza" del ALC incluyan, pero sin limitarse a ellos, c11,t13; t11,c13; t11,t13; c11,c13; c8,t10; t8,c10; t8,t10; c8,c10; e isómeros trans-trans del ácido octadecadienoico y no incluya los isómeros t10,c12 ni c9,t11 del ácido octadecadienoico. Los "isómeros que no se producen en la naturaleza" también se pueden citar como "isómeros menores" del ALC ya que, generalmente, estos isómeros se producen en pequeñas cantidades cuando el ALC se sintetiza por isomerización básica.

"Producto comestible preparado" significa cualquier comida pre-empaquetada apta para el consumo humano.

Tal y como se usa en la presente memoria, "c" abarca un enlace químico en la orientación cis y "t" se refiere a un enlace químico en la orientación trans. Si se cita un isómero posicional del ALC sin una "c" o una "t", entonces la citación incluye los cuatro posibles isómeros. Por ejemplo, el ácido 10,12 octadecadienoico abarca el ácido c10,t12; t10,c12; t10,t12 y c10,c12 octadecadienoico, mientras que el ácido t10,c12 octadecadienoico o ALC se refiere solamente a dicho isómero.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "aceite" se refiere a un líquido que fluye libremente y que contiene ácidos grasos de cadena larga (incluido el ALC) u otros grupos de hidrocarburos de cadena larga. Los ácidos grasos de cadena larga incluyen, pero sin limitarse a ellos, los distintos isómeros del ALC.

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Tal y como se usa en la presente memoria, el término "vehículo fisiológicamente aceptable" se refiere a cualquier vehículo o excipiente comúnmente utilizado con medicamentos oleosos. Tales vehículos o excipientes incluyen aceites, almidón, sacarosa y lactosa.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "vehículo de administración oral" se refiere a cualquier medio de administrar un fármaco oralmente, incluidos, pero sin limitarse a ellos, cápsulas, píldoras, comprimidos y jarabes.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "producto comestible" se refiere a cualquier pienso o alimento apto para el consumo por humanos, animales no rumiantes o animales rumiantes. El "producto comestible" puede ser un alimento preparado y empaquetado (p. ej., mahonesa, aderezo de ensalada, pan o queso) o un pienso animal (p. ej., pienso de animal extrudido y sedimentado o pienso mezclado burdamente). Se han documentado bien varios usos del ALC en patentes y bibliografía científica. Estos usos se pueden dividir en dos categorías generales. La primera categoría es el uso nutritivo del ALC como un complemento alimenticio. La segunda categoría es el uso terapéutico y farmacológico.

La patente de los EE. UU. n.º 5 554 646 (Cook et al.), incorporada en la presente memoria mediante referencia, describe el uso del ALC para reducir la grasa corporal en los animales. En este método, se alimenta al animal con una cantidad segura y eficaz de ALC suficiente como para causar la reducción de la masa corporal. Los ratones alimentados con una dieta que contenía ALC al 0,5% tenían un contenido de grasa total al final de su alimentación que era significativamente menor al contenido de grasa de los ratones de control que se alimentaron con una dieta que contenía el 0,5% de aceite de maíz. La cantidad exacta de ALC a administrar para reducir la grasa corporal depende del animal, de la forma del ALC utilizado y de la vía de administración. La cantidad generalmente oscila de unos 0,001 g/kg a aproximadamente 1 g/kg de la masa corporal del animal. Las cantidades farmacéuticas generalmente oscilarán de unas 1000 partes por millón (ppm) a aproximadamente 10 000 ppm de ALC en la dieta de humanos. Sin embargo, el límite superior de la cantidad a emplear no es decisivo porque el ALC prácticamente no es tóxico. También se puede preparar el ALC para este y otros usos de muy diversas formas. Éstas incluyen sales de sodio y de potasio no tóxicas del ALC en combinación con un diluyente farmacéutico y ésteres activos. También se puede incorporar el ALC directamente al pienso del animal o a la comida para alimentar a un humano de modo que el ALC comprenda aproximadamente del 0,01% al 2,0% o más en peso de la comida del animal o del humano. Esta patente describe también que el complemento de una dieta de animal con ALC puede servir para conservar la proteína corporal en un animal o para aumentar la proteína del músculo en un animal.

Se describe otro uso nutritivo de ALC en la patente de los EE. UU. n.º 5 428 072 (Cook et al), incorporada en la presente memoria mediante referencia. Aquí, se demuestra que alimentar a los animales con una cantidad segura y eficaz de ALC potencia el aumento de peso y la eficacia del pienso en el animal. Los grupos de polluelos alimentados con una dieta complementada con ALC al 0,5% mostraron un aumento de masa equivalente al de los polluelos de control alimentados con ácido linoleico al 0,5%, incluso aunque los polluelos alimentados con ALC consumieron menos comida. Además, los polluelos alimentados con el ALC al 0,5% y a los que posteriormente se les inyectó endotoxina mostraron un aumento de masa, mientras que los polluelos alimentados con dietas de control adelgazaron o aumentaron muy poco su peso. Se observaron unos resultados similares en las ratas alimentadas con una dieta que contenía el ALC al 0,5% y en los conejos alimentados con ALC bien al 0,5% o al 1%. Las directrices para las cantidades de ALC a alimentar o a incluir en la dieta son idénticas a las descritas en la patente de los EE. UU. n.º 5 554 646.

Los estudios también han demostrado que el ALC se puede utilizar para reducir realmente el peso corporal en humanos. En un estudio con doble anonimato llevado a cabo en Noruega por Erling Thom en 1997, se complementaron las dietas de 20 individuos sanos bien con 3 g de una mezcla de ALC o bien con 3 g de un placebo. El grupo alimentado con ALC experimentó tanto una disminución en la masa corporal como en el porcentaje de grasa corporal, mientras que el grupo alimentado con placebo experimentó un aumento de la masa corporal y del porcentaje de grasa corporal. La publicación de la patente internacional PCT WO 97/46230 describe un método para mantener un nivel determinado de grasa corporal y/o masa corporal. Las reivindicaciones de esa patente dependen de un estudio anecdótico sin controles en el que un total de 3 individuos consumieron ALC.

Otras patentes sobre el ALC se han centrado en el papel del ALC en la respuesta inmunitaria. La patente de los EE. UU. n.º 5 585 400 (Cook et al), incorporada en la presente memoria mediante referencia, describe un método para atenuar las reacciones alérgicas en animales mediadas por la hipersensibilidad de tipo I o TgE con la administración de una dieta que contiene ALC. Esta patente también describe cómo administrar el ALC en concentraciones de aproximadamente 0,1 al 1,0% para conservar el recuento leucocitario. Los estudios descritos en esa patente utilizaron un modelo de alergia de la tráquea del conejillo de indias. Los conejillos de indias se alimentaron con ALC al 0,25% o con dietas de control durante dos semanas y luego se inmunizaron con ovalbúmina en las semanas dos y tres para la hiperinmunización. Se utilizó un sistema de modelo de superfusión para determinar si la alimentación con ALC tenía algún efecto sobre la contracción de la tráquea inducida por el alérgeno. Las tráqueas de los conejillos de indias alimentados con ALC eran más estables en el sistema de superfusión que las tráqueas de los conejillos de indias alimentados de control. Cuando se inyectó el alérgeno en la tráquea del conejillo de indias, se observó menos contracción de la tráquea en el tejido de los animales alimentados con ALC. El recuento de leucocitos de los animales alimentados con el ALC fue elevado en comparación con los animales de control: los animales alimentados con ALC que tienen un recuento de leucocitos de 3,5 x 10^{6} \pm 0,6 en comparación con 2,4 x 10^{6} \pm 0,3 para los animales de control.

El uso del ALC para mejorar el crecimiento y prevenir la anorexia y el adelgazamiento debidos a la estimulación inmunitaria (p. ej., exposición a la endotoxina) y los efectos secundarios de las hormonas catabólicas (p. ej., IL-1) se describió en la patente de los EE. UU. n.º 5 430 066 (Cook et al), incorporada en la presente memoria mediante referencia. Los polluelos alimentados con una dieta de ALC al 0,5% y posteriormente provocados mediante la inyección de la endotoxina mostraron un aumento de peso mientras que los polluelos alimentados con una dieta de control no aumentaron de peso tras la exposición a la endotoxina. Se obtuvieron unos resultados similares con ratas alimentadas con una dieta que contenía el ALC al 0,5% en comparación con los animales alimentados con una dieta de control de aceite de maíz al 0,5%. Las preparaciones y los intervalos de dosificación descritos fueron idénticos a los descritos en la patente de los EE. UU. n.º 5 554 646.

En la patente de los EE. UU. n.º 5 674 901 (Cook et al.), incorporada en la presente memoria mediante referencia, se describieron métodos para tratar animales para mantener o aumentar la cantidad de linfocitos CD-4 y CD-8, y para prevenir o aliviar los efectos secundarios en el animal causados por la producción o la administración exógena del factor de necrosis tumoral (TNF) o mediante un virus que consiste en administrar al animal un cantidad segura y eficaz de ALC. Se alimentaron los ratones bien con una dieta de control o bien con ALC al 0,5% y posteriormente se les provocó con inyecciones de TNF. Los ratones alimentados con ALC adelgazaron menos que los ratones de control. Igualmente, los polluelos alimentados con una dieta con ALC al 0,5% y posteriormente provocados con una punción en la membrana del ala con el virus de la viruela aviar atenuado pero vivo engordaron más que los polluelos alimentados con una dieta de control. Los polluelos alimentados con la dieta de ALC al 0,5% mostraron una mejora destacable del porcentaje de linfocitos CD-4 y CD-8 en comparación con los polluelos alimentados con una dieta de control.

La solicitud de patente europea 779 033 A1 (Lievense et al), incorporada en la presente memoria mediante referencia, describe el uso del ALC para mejorar la composición en lípidos de la sangre. Brevemente, se alimentaron los hámsteres con dietas que contenían el ALC incorporado en un triglicérido en forma de una margarina comestible a un ritmo del 1,5% de las calorías totales de su dieta. Los hámsteres alimentados con ALC mostraron una disminución en el colesterol total, una disminución en el colesterol transportado por las HDL y una disminución en el colesterol transportado por las LDL.

También se ha demostrado que el ALC afecta a la deposición ósea, tal y como se describió en las publicaciones PCT internacionales WO 98/05318 (Cook et al). y WO 98/05319 (Cook et al.), ambas incorporadas en la presente memoria mediante referencia. Los polluelos alimentados con una dieta que contenía el 0,1875%, el 0,375% o el 0,75% de la dieta mostraron una disminución significativa de las anomalías óseas en comparación con los polluelos que no recibieron ALC alguno en su dieta. Además, los polluelos alimentados con una dieta que contenía ALC al 0,5% mostraron un aumento del contenido mineral de los huesos.

Otras patentes describen varias formulaciones del ALC. La solicitud de patente europea EP779033 A1 describe una margarina comestible que contiene del 0,05 al 20% (en peso) de restos de ácido linoleico conjugado. En ella, una mezcla disponible comercialmente de ácidos grasos libres que tenía un contenido de ácido linoleico del 95,3% se sometió a isomerización básica con NaOH en etilenglicol. Se incorporaron los ácidos grasos libres en triglicéridos mezclándolo con 10 partes de aceite de palma y lipasa. Se agitó la mezcla durante 48 horas a 45ºC y se retiraron la lipasa y los ácidos grasos libres. Se combinaron y se procesaron setenta partes de esta composición y 29 partes de agua, 0,5 partes de polvo de proteína de suero de la leche, 0,1 partes de sal y una pequeña cantidad de aroma y de ácido cítrico (para proporcionar un pH de 4,5) para producir una margarina untable.

En la publicación PCT internacional WO 97/46118 (Cook et al.), incorporada en la presente memoria mediante referencia, se describen otras comidas que contienen una cantidad segura y eficaz de ALC. En ella, se describe una comida dietética líquida para la administración parenteral a los humanos que contiene partículas de grasa emulsionada de unos 0,33 a 0,5 micrómetros de diámetro. La emulsión contiene de 0,5 mg/g a 10 mg/g de ALC o, alternativamente, ALC del 0,3% al 100% basándose en los lípidos de la comida, o de 0,03 g a 0,3 g de ALC por 100 calorías de ración. Esta solicitud también describe una fórmula de bebé que contiene cantidades similares de ALC junto con 2,66 g de proteínas, 5,46 g de grasas, 10,1 g de glúcidos, 133 g de agua, y vitaminas y minerales en los márgenes de la CDR. Se describe otro ejemplo de un producto dietético gastrorresistente líquido de pocos residuos, útil como un complemento rico en proteínas, vitaminas y minerales. Este complemento contiene ALC del 0,05% a aproximadamente el 5% en peso del producto, o del 0,3% hasta alrededor del 100% de los lípidos presentes, o aproximadamente de 0,03 a 0,3 g de ALC por 100 calorías. Adicionalmente, 140 calorías de una fórmula representativa pueden contener 7,5 g de sólidos de la clara de huevo, 0,1 g de ALC, 27,3 g de glúcidos como la sacarosa o el almidón de maíz hidrolizado, 1,9 g de agua y vitaminas y minerales en el intervalo de la CDR.

En la presente invención se utilizan, preferiblemente, preparaciones enriquecidas en el isómero 10,12 para cada una de los usos descritos anteriormente. Las preparaciones del ALC enriquecidas en el isómero t10,c12 se pueden preparar preferiblemente mediante cromatografía de gases a escala preparativa o mediante el método de precipitación presentado en el ejemplo 4.

Los inventores han descubierto, contrariamente a la opinión científica mayoritaria actualmente, que el isómero t10,c12 del ALC puede ser un isómero particularmente activo del ALC.

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La composición de isómeros de las distintas preparaciones de ALC de la presente invención se puede confirmar preferiblemente mediante cromatografía de gases, como se conoce en la técnica.

Se pueden proporcionar los isómeros 10,12 en una ración diaria incluidos en un vehículo con un componente lipídico que contenga o comprenda de 0,01 a 10 gramos equivalentes de los isómeros 10,12, más preferiblemente de 0,01 a 10 gramos equivalentes del isómero t10,c12. "Gramos equivalentes" significa que la cantidad total de los isómeros 10,12 proporcionados, con independencia de otros isómeros presentes, es de 0,01 a 10 gramos. Cuando los isómeros 10,12 se proporcionan como parte de una ración diaria, la captación se puede proporcionar en una dosis única, o como una serie de dosis en un pienso o varios productos alimenticios consumidos a lo largo del
día.

Las composiciones de la presente invención también pueden adquirir la forma de un producto a granel para la venta comercial. El producto a granel de ALC contiene o comprende los isómeros de ácido linoleico conjugado al menos al 50%. Este producto a granel se puede diluir en productos nutricionales como piensos para animales, complementos alimenticios humanos y productos comestibles para los humanos.

Las composiciones de la presente invención se utilizan para la fabricación de un fármaco para reducir la grasa corporal en animales. El término "animal" incluye todos los mamíferos, entre ellos los humanos. Las dosis y las proporciones preferidas de los isómeros 10,12, más preferiblemente el isómero t10,c12, utilizadas para la solicitud son las mismas que se describieron anteriormente.

En una realización preferida de la presente invención, se utiliza una cantidad nutricional segura y eficaz o una cantidad terapéutica de ALC t10,c12 para fabricar un medicamento para la administración oral en un animal (incluidos los humanos) para disminuir el peso o la grasa corporal. En algunas realizaciones, el ALC t10,c12 es puro, al menos, al 80% aproximadamente, en otras realizaciones, el ALC t10,c12 es puro, al menos, al 90% aproximadamente, y en otras realizaciones más, el ALC t10,c12 es puro, al menos, al 92% aproximadamente. Se puede administrar el ALC t10,c12 a los humanos obesos y no obesos. Ya que el ALC t10,c12 es un ingrediente no tóxico de la comida que se produce en la naturaleza y no un fármaco, se puede consumir el ALC t10,c12 como parte de una dieta normal y es utilizable como parte de la nutrición diaria de las personas sin obesidad. Una cantidad nutricionalmente eficaz es aquella cantidad de ALC t10,c12 que, cuando se ingiere en forma purificada o como un complemento de la comida da lugar a una disminución de la masa o la grasa corporal sin deteriorar o interferir en una nutrición adecuada. De acuerdo con esto, la administración de una cantidad nutricionalmente eficaz de ALC t10,c12 logra el adelgazamiento sin la sensación de hambre asociada con una disminución en la ingesta de comida. También se puede usar el ALC t10,c12 para tratar a los humanos con obesidad clínica de leve a profunda. Cuando se trata a los humanos con obesidad clínica, se administra una cantidad terapéuticamente eficaz de ALC t10,c12. Una cantidad terapéuticamente eficaz es aquella cantidad que causa un adelgazamiento o una reducción de grasa corporal de una persona clínicamente obesa. En la presente invención se pueden administrar de 0,1 a 15 g de ALC por día, preferiblemente se pueden administrar aproximadamente de 0,1 a 5 g por día y, más preferiblemente, se pueden administrar aproximadamente 1,8 g por día. En general, la cantidad de ALC administrada no es decisiva ya que se trata de una cantidad suficiente para ser eficaz nutritiva o terapéuticamente. Las cantidades de ALC consideradas eficaces nutritiva o terapéuticamente son aquéllas que dan lugar a un adelgazamiento o pérdida de grasa mensurables cuando se administran durante un periodo de cuatro semanas o más.

Se anticipa que habrá cierta variación en la eficacia debido a las diferencias entre los individuos en parámetros como masa corporal, metabolismo basal, ejercicio y otros aspectos de la dieta. El individuo debe comenzar con la dosis preferida de 1,8 g durante un periodo inicial de dos semanas y, luego, si no se experimenta adelgazamiento, aumentar gradualmente la dosis de ALC hasta unos 10 a 15 g por día.

La presente invención también contempla el uso de derivados de la preparación enriquecida en isómeros del ALC. Por ejemplo, el ALC puede estar libre o unido mediante enlaces éster o proporcionarse en forma de un aceite que contiene triglicéridos con ALC enriquecido en isómeros, como se describe en el ejemplo 5. En estas realizaciones, los triglicéridos puede comprender parcial o totalmente un ALC enriquecido en isómeros unido a un esqueleto de glicerol. También se puede proporcionar el ALC enriquecido en isómeros como un metiléster o un etiléster, como se describe en los ejemplos. Además, el ALC enriquecido en isómeros puede estar en forma de una sal no tóxica, como una sal de potasio o una sal de sodio (p. ej., una sal formada al hacer reaccionar químicamente cantidades equivalentes de ácidos libres con un hidróxido básico con un pH de aproximadamente 8 a 9).

En algunas realizaciones preferidas, la administración es oral. Se puede formular el ALC enriquecido en isómeros con vehículos adecuados como almidón, sacarosa o lactosa en comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, soluciones, líquidos, suspensiones viscosas, suspensiones y emulsiones. Se puede proporcionar el ALC enriquecido en isómeros en una solución acuosa, una solución aceitosa, como las otras formas mencionadas anteriormente o en cualquiera de ellas. El comprimido o la cápsula de la presente invención puede estar recubierto con una cubierta gastrorresistente que se disuelve a un pH de aproximadamente 6,0 a 7,0. Una cubierta gastrorresistente adecuada que se disuelve en el intestino delgado pero no en el estómago es el ftalato de acetato de celulosa. En una formulación preferida, se proporciona el ALC enriquecido en isómeros como unas cápsulas de gelatina blandas. También se puede proporcionar el ALC enriquecido en isómeros mediante cualquiera de una serie de vías distintas, incluidas, pero sin limitarse a ellas, las vías intravenosa, intramuscular, intraarterial, intramedular, intratecal, intraventricular, transdérmica, subcutánea, interperitoneal, intranasal, entérica, tópica, sublingual o rectal. Se pueden encontrar más detalles sobre las técnicas para la formulación y la administración en la última edición de Remington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co., Easton, PA, EE. UU.).

También se puede proporcionar el ALC enriquecido en isómeros como un complemento en varios productos comestibles preparados y bebidas. Para los propósitos de esta solicitud, "producto comestible preparado" significa cualquier producto comestible natural, procesado, dietético o no dietético al que se ha añadido el ALC enriquecido en isómeros. El ALC enriquecido en isómeros se puede añadir en forma de ácidos grasos libres o como un aceite que contiene triglicéridos sustituidos parcial o completamente con el ALC enriquecido en isómeros. Por lo tanto, el ALC enriquecido en isómeros se puede incorporar directamente en varios productos comestibles preparados, incluidos, pero sin limitarse a ellos, bebidas dietéticas, barritas dietéticas, complementos, comidas congeladas preparadas, caramelos, productos de tentempié (p. ej, patatas fritas), productos de carne preparada, leche, queso, yogur y otro alimento que contiene grasa o aceite.

El ALC también es susceptible a la oxidación. Por lo tanto, es deseable empaquetar el ALC enriquecido en isómeros para uso humano con antioxidantes adecuados como lecitina, tocoferoles, ascorbato, palmitato de ascorbilo o extractos de especias como el extracto de romero.

Actualmente, se fabrica la mayor parte del ALC mediante un procedimiento de isomerización básica. Se hace reaccionar un aceite que contiene una cantidad elevada de ácido linoleico, como el aceite de girasol, el aceite de onagra o el aceite de alazor, en un medio inerte con nitrógeno con hidróxido de potasio y un disolvente como propilenglicol a aproximadamente 180ºC durante aproximadamente 2,5 horas. Se acidifica el producto de reacción y se lava varias veces con agua ácida y, finalmente, se seca al vacío. Para una descripción completa de una producción de ALC a escala de laboratorio mediante isomerización básica, véase la patente de los EE. UU. n.º 5 554 646, incorporada en la presente memoria mediante referencia. También se puede producir ALC mediante el procedimiento de isomerización básica de flujo continuo descrito en la patente de los EE. UU. n.º 4 164 505, incorporada en la presente memoria mediante referencia. El producto de reacción obtenido de estos procedimientos es una mezcla de ALC, ácido linoleico y otros ácidos grasos encontrados en el aceite de origen. Por lo general, la cantidad de ALC obtenido de la isomerización básica del aceite de girasol es de aproximadamente el 60% del producto total de ácidos grasos libres y contiene aproximadamente cantidades iguales de los isómeros c9,t11 y t10,c12. En la patente internacional WO 97/18320 se describe un procedimiento para preparar los ALC con una proporción predeterminada entre c9,t11 y t10,c12.

En la patente de los EE. UU. n.º 5 674 901, incorporada en la presente memoria mediante referencia, se describe otro método para producir una preparación que consiste, principalmente, en ALC cis-9, trans-11. En ese método, se incuba el aceite que contiene el ácido linoleico con el microorganismo Butyrivibrio fibrisolvens. B. fibrisolvens contiene una \Delta^{12}-cis,\Delta^{11}-isomerasa que convierte el ácido linoleico en ALC cis-9, trans-11.

En los siguientes ejemplos, cualquier composición que contenga ALC cis-10, trans-12 a más del 80% se consideran que forma parte de la invención.

Ejemplos Ejemplo 1

Se han llevado a cabo tres estudios diferentes que examinan la relación entre el contenido de ALC en el pienso y la cantidad de grasa en la espalda de los cerdos. En un estudio llevado a cabo en la Iowa State University y descrito en las conferencias de la Midwest Animal Science, R. L. Thiel et al. describieron que los cerdos alimentados con ALC experimentan una reducción de la grasa de la espalda. Brevemente, se asignaron aleatoriamente en pocilgas individuales ocho réplicas de cinco cerdos jóvenes castrados de la misma camada con un peso inicial promedio de 26,3 kg. Se alimentó a los cerdos durante una media de 93 días y arrojaron un peso promedio de 116 kg al degollarlos. El grupo alimentado con una dieta de ALC al 0,5% experimentó una reducción del 10,3% de la grasa de la espalda. Aunque no se publicó inicialmente, el ALC utilizado en las dietas contenía una proporción de los isómeros 10,12:9,11 del ALC de 1,05:1.

En otro estudio llevado a cabo por investigadores en la Kansas State University y descrito en las conferencias de la Midwest Animal Science, se alimentaron 36 cerdos jóvenes castrados de distintos cruces con un peso inicial promedio de 38 kg con una dieta que contenía ALC al 0,50%. El peso promedio al final fue aproximadamente de 104 kg. Los cerdos jóvenes castrados alimentados con dietas que contenían ALC experimentaron una reducción del 7,2% de la grasa de la espalda. La proporción de los isómeros 10,12:9,11 del ALC en el ALC utilizado en este experimento fue de 0,487:1.

En otro estudio, que todavía no se ha publicado, se alimentaron 24 cerdos jóvenes castrados con un peso inicial de 26 kg con una dieta que contenía ALC al 0,48% o con una dieta de control. Los cerdos se alimentaron a hasta un peso final de 118 kg. Los cerdos alimentados con ALC experimentaron una reducción del 13,7% de la grasa de la espalda. La proporción de los isómeros 10,12:9,11 del ALC en este experimento fue de 1,16:1.

Se representó la proporción de los isómeros 10,12:9,11 del ALC utilizados en cada uno de estos estudios frente a la reducción del porcentaje de grasa de la espalda y se analizó mediante una regresión logarítmica. Estos resultados se presentan en la figura 1. Estos resultados indican que a medida que aumenta la proporción de los isómeros 10,12:9,11 del ALC, también aumenta la disminución del porcentaje de la grasa de la espalda. Por lo tanto, son deseables unas preparaciones de ALC que contengan una proporción 10,12:9,11 mayor de aproximadamente 1,2:1.

La cantidad total de isómeros 10,12 en la dieta también puede afectar la deposición de la grasa en la espalda. Se representó el porcentaje de isómeros 10,12 en las dietas frente a la disminución del porcentaje de grasa de la espalda y se analizó mediante regresión lineal. Se presentan los resultados en la figura 2. Estos resultados demuestran que, a medida que aumenta la cantidad total de isómeros 10,12 en la dieta, se reduce la grasa de la espalda. El efecto observado no es tan grande como con la proporción de isómeros. Sin embargo, estos resultados pueden concordar con los resultados de las proporciones. Los estudios de los que proceden no diferenciaron entre isómeros. Es posible que las cantidades y las proporciones del isómero 9,11 y otros isómeros presenten algún efecto enmascarado relacionado con el aumento del porcentaje del 10,12 en la dieta. Cuando se utiliza una preparación de ALC enriquecida en el isómero 10,12, se espera que los resultados sean comparables a los resultados de las proporciones.

Ejemplo 2

La bibliografía científica indica que, o bien no se han identificado los isómeros biológicamente activos del ALC, o bien el ALC c9,t11 es el isómero biológicamente activo. Sobre la base de los resultados del ejemplo 1, los inventores creen que el isómero t10,c12 es un isómero activo. Por consiguiente, se examina el efecto de alimentar ratones con diferentes proporciones y cantidades de isómeros del ALC para demostrar que el isómero t10,c12 es un isómero biológicamente activo y que se puede manipular la proporción de t10,c12:c9,t11 para producir unos efectos biológicos deseables.

Se llevó a cabo el ensayo con 84 ratones ICR comprados a Harlan Sprague Dawlwy (Madison, WI, EE. UU.). Se mezclaron las dietas utilizando la dieta basal, azúcar, aceite de maíz y un isómero o una mezcla de isómeros del ácido linoleico conjugado. Cada tratamiento consistió en 2 jaulas de 3 ratones. Los ratones tenían comida y agua a voluntad. Se monitorizó el consumo de comida diariamente y se pesaron los ratones en días alternos cuando se les cambiaba el lecho. A las tres semanas de alimentarlos con la dieta, se aplicó la eutanasia a los ratones mediante CO_{2} y se tomaron las masas corporales finales. Luego, se hizo la autopsia a los ratones y se pesaron las almohadillas de grasa. También se analizó la grasa corporal total de los ratones. Los ratones se liofilizaron y se pulverizaron. Se analizaron las muestras duplicadas mediante análisis inmediato (extracción con éter, ceniza, método Kjeldahl y humedad). Los resultados se describen en la tabla 1.

TABLA 1

Tratamiento	Aumento (g)	Consumo de alimento	Conversión de alimento	% de grasa
9,11:10,12		0 a 3 semanas (g)	0 a 3 semanas
0,0:0,0	9,88	85,75	8,75	13,995
0,0:0,1	9,38	87,67	9,34	8,806
0,0:0,2	8,88	81,72	9,73	6,439
0,0:0,4	9,35	83,27	8,97	3,003
0,1:0,0	9,77	86,58	8,87	9,880
0,2:0,0	11,38	92,83	7,02	10,346
0,4:0,0	11,55	88,62	7,86	13,403
0,1:0,1	10,49	92,38	8,89	9,560
0,1:0,2	8,17	82,98	10,28	7,306
0,2:0,0	11,38	92,83	7,02	10,346
0,2:0,1	11,23	89,43	8,49	7,922
0,2:0,2	8,75	79,82	9,15	7,115
0,2:0,4	10,23	88,20	8,64	3,088
0,4:0,0	11,55	88,62	7,86	13,403
0,4:0,2	9,50	85,27	8,98	7,508
0,4:0,4	9,97	81,57	8,19	0,476

Los ratones alimentados sólo con ALC c9,t11 mostraron una mejora lineal en el crecimiento (16%) cuando no estaba presente el t10,c12. Ocurrió lo contrario con el isómero t10,c12, con el que se produjo una disminución del crecimiento del 10%. Como consecuencia, el c9,t11 también aumentó el consumo en torno al 8% en la proporción 0,2%:0%. Estos datos también indican que el aumento de las cantidades del isómero t10,c12 en la dieta causa una reducción de la grasa corporal. Cuando se comparan con ratones de control que no recibieron el ALC en la dieta, los ratones alimentados sólo con el t10,c12 ALC experimentan una reducción de la grasa corporal y una reducción del crecimiento. En cambio, los ratones que recibieron sólo el ALC c9,t11 mostraron un aumento del crecimiento, de la velocidad a la que gana el peso y de la conversión de alimento. Cuando se alimentaron los ratones con ALC t10,c12 y c9,t11, se redujo la grasa corporal con el aumento del t10,c12. Se encontró que la proporción óptima para mejorar el crecimiento, la conversión de alimento y reducir la grasa es aproximadamente de 2:1 c9,t11:t10,c12. Estos datos indican que los distintos isómeros del ALC tienen diferentes efectos biológicos.

Ejemplo 3

Se preparó una preparación de ALC enriquecido en el isómero 10,12 mediante cromatografía de gases a escala preparativa. Se analizó el producto resultante mediante cromatografía de gases. Para las descripciones recientes de métodos de cromatografía de gases para identificar los isómeros del ALC, véanse Christie et al., JAOCS 74(11): 1231 (1997), Christie et al., Lipids 33(2): 217-21 (1998), Sehat et al., Lipids 33(2): 217-21 (1998) y Marcel S. F. Lie Ken Jie y J. Mustafa, Lipids 32 (10): 1019-34 (1997). Las referencias anteriores se incorporan en la presente memoria mediante referencia. Las condiciones de la cromatografía de gases fueron las siguientes:

Sistema:	Perkin-Elmer Auto System
Inyector:	Sin división de flujo a 240ºC
Detector:	Detector de ionización de llama a 280ºC
Vehículo:	Helio
Columna:	\begin{minipage}[t]{124mm} Sílice fusionado WCOT 0,25 mm X100M, CP-SL 88 para ésteres de metilo de ácidos grasos, DF 0,2.\end{minipage}
Programa del horno:	\begin{minipage}[t]{124mm} 80^{o}C (0 min) que se aumenta hasta 220^{o}C a 10^{o}C por min y se mantiene a 220^{o}C durante 10 min.\end{minipage}

Todos los resultados se expresan como el porcentaje relativo del área del pico. Los resultados del análisis fueron:

Isómero	Área (%)
C16:0	2,01
C18:0	0,57
C18:1	0,26
c9,t11	1,61
t10,c12	92,75
t9,t11;t10,t12	1,16
Sin identificar	1,64
Total	100,10

Ejemplo 4

Se puede producir el ALC t10,c12 en grandes cantidades con un método alternativo. Se utiliza aceite de girasol refinado totalmente (se puede sustituir por aceite de alazor) como el material bruto. Se forman etilésteres añadiendo etanol puro en exceso que contiene etilato de sodio al 1% a modo de catalizador para el aceite. Se calienta la mezcla a 60ºC durante 30 minutos mientras que se agita y se deja que se separen. Se quita el líquido de la capa inferior y se lava la capa superior con agua ligeramente ácida, y se seca al vacío.

Luego, se purifica la mezcla de etilésteres mediante destilación molecular a 160ºC y una presión de 10^{-2} mbar, y se desecha el residuo. Se realiza la conjugación añadiendo de 0,5 a 1% de etanol y de 0,5 a 1% de etilato de potasio al éster de etilo, y agitando la mezcla a 120ºC durante 1 hora. Se para la reacción añadiendo ácido cítrico diluido. Luego, el aceite se lava y se seca.

Entonces, se diluye el etiléster conjugado en acetona y se enfría a -30ºC, y se filtra para retirar la mayor parte de los ácidos grasos saturados. Luego, se enfría adicionalmente el filtrado de -56 a -57ºC para permitir que se precipite el etiléster t10,c12. Se obtiene el etiléster al retirar la acetona del precipitado al aplicar un vacío con un calentamiento suave. El etiléster t10,c12 obtenido así es puro, al menos, al 90% aproximadamente. Si se desea una mayor pureza, se puede retirar más grasa saturada del etiléster antes de la conjugación. Esto se puede llevar a cabo mediante el fraccionamiento con urea. El producto resultante es t10,c12, al menos, al 97% aproximadamente después de la precipitación final.

Se producen ácidos grasos libres de los etilésteres mediante saponificación seguida de neutralización. Para saponificar, se añade a los alquilésteres una cantidad de agua del 10% que contiene etanol para mejorar la solubilidad y un exceso del 100% de NaOH para formar un jabón. Se realiza la reacción a 70ºC. Luego, se diluye el jabón con agua y se añade HCl para formar la mezcla ácida total mientras que se agita bien. Se separan los ácidos grasos libres para formar una capa superior y se lavan con ácido cítrico diluido, y, finalmente, se secan. Los resultados se analizaron mediante cromatografía de gases como se describió anteriormente. Los resultados de usar el fraccionamiento con urea fueron:

Isómero	Área (%)
c9,t11	1,80
t10,c12	97,49
t9,t11;t10,t12	0,71
Total	100,00

Los resultados sin fraccionamiento con urea fueron:

Isómero	Área (%)
C16:0	1,75
C18:2, c9,c12	0,16
C18:1, c9	2,22
c9,t11	6,36
t10,c12	88,84
t9,t11;t10,t12	0,23
c9,c11;c10,c12	0,15
Sin identificar	1,64
Total	100,00

Ejemplo 5

Se pueden preparar triacilgliceroles con ALC mediante esterificación directa. Se añade la lipasa de Candida antarctica (1,25 g) inmovilizada a una mezcla de glicerol (1,22 g, 13,3 mmol) y ALC enriquecido en isómeros del ALC (enriquecido bien en t10,c12 o bien en c9,t11) como ácido graso libre (masa molecular 280,3 g/mmol; 11,6 g, 41,5 mmol). Se agita suavemente la mezcla en una placa caliente de un agitador magnético a 65ºC al vacío continuo de 0,01 a 0,5 Torr. El agua volátil producida durante el transcurso de la reacción se condensa continuamente en trampas enfriadas con nitrógeno líquido. Después de 48 h, se suspende la reacción, se añade n-hexano y se separa la enzima mediante filtración. Se trata la fase orgánica con una disolución acuosa alcalina de carbonato de sodio para retirar el exceso de ácidos grasos libres (cuando se necesite). Se retira el disolvente orgánico (después del secado sobre sulfato de magnesio anhidro cuando sea adecuado) al vacío en un evaporador rotatorio seguido de un tratamiento a gran vacío para obtener el producto virtualmente puro como un aceite ligeramente amarillento. Cuando se utilizan cantidades estequiométricas de ácidos grasos libres, se aplica la valoración mediante hidróxido de sodio estandarizado para determinar el contenido de ácidos grasos libres del producto de reacción bruto (contenido de ácidos grasos libres a menos del 1% que se basa en el número de moles de los grupos éster, que corresponde a la incorporación de, al menos, el 99%, que equivale al mínimo de contenido de triglicéridos del 97%). Se introduce el producto bruto directamente en la HPLC y se eluye con dietiléter al 10% en n-hexano para obtener el triglicérido puro al 100% como un aceite incoloro.

Para monitorizar el progreso de la reacción y proporcionar más detalles sobre la composición de determinados triglicéridos durante la reacción, se recogen muestras regularmente a medida que transcurre la reacción. Se analizan mediante espectroscopia de H-RMN y se proporciona una detallada información sobre la composición de mono- di- y triacilgliceroles durante el transcurso de la reacción.

Ejemplo 6

Este ejemplo describe la producción en lotes a gran escala de EMAG (ésteres de metilo de ácidos grasos) de alazor conjugados. Se puede dividir la producción de los EMAG conjugados de alazor en dos etapas: metanólisis y conjugación. Para la metanólisis, se condujeron 6000 kg de aceite de alazor a un reactor cerrado. Se purgó el reactor con nitrógeno a presión atmosférica y se añadieron 1150 litros de metanol y 160 kg de NaOCH_{3} (disolución al 30%). Se calentó la mezcla a 65ºC mientras se agitaba y se hizo reaccionar a 65ºC durante 2 horas. Se decantó la capa inferior resultante mientras se purgaba el reactor con nitrógeno gaseoso. Luego, se añadieron 1000 litros de agua (de 40 a 50ºC, en los que se disolvieron 50 kg de ácido cítrico monohidratado) mientras se agitaba. Se dejó separar las capas (aproximadamente 60 min) y se decantó la capa inferior mientras se purgaba el reactor con nitrógeno gaseoso. Se seca el producto de los EMAG de alazor resultante a 80ºC al vacío durante una hora. Se puede conjugar el producto de los EMAG de alazor resultante y enriquecerlo bien en ALC t10,c12 o bien en ALC c9,t11 como se describió anteriormente.

Claims

1. El uso de una composición de ácido linoleico conjugado, comprendiendo esta composición al menos un 80% de ácido t10,c12-octadecadienoico, para la fabricación de un medicamento para disminuir la grasa corporal.

2. El uso de la reivindicación 1, en el que dicha composición comprende al menos un 90% de ácido t10,c12-octadecadienoico.

3. El uso de la reivindicación 2, en el que dicha composición comprende al menos un 92% de ácido t10,c12-octadecadienoico.

4. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que se proporciona dicha composición como ácidos grasos libres.

5. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que se proporciona dicha composición como alquilésteres de ácidos grasos.

6. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que se proporciona dicha composición como acilglicéridos.

7. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que se proporciona la composición como moléculas de acilgliceroles de la estructura:

2

en la que R_{1}, R_{2} y R_{3} se seleccionan del grupo que consiste en un grupo hidroxilo y un ácido octadecadienoico, caracterizándose dicha composición por que contiene al menos aproximadamente un 80% de ácido t10,c12 octadecadienoico en las posiciones R_{1}, R_{2} y R_{3}.

8. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho medicamento es para uso humano.