ES2253778T3

ES2253778T3 - Sistema y metodos de monitorizacion de una amplificacion de adn mediante fluorescencia.

Info

Publication number: ES2253778T3
Application number: ES97926890T
Authority: ES
Inventors: Carl T. Wittwer; Kirk M. Ririe; Randy P. Rasmussen; David R. Hillyard
Original assignee: University of Utah Research Foundation Inc
Current assignee: University of Utah Research Foundation Inc
Priority date: 1996-06-04
Filing date: 1997-06-04
Publication date: 2006-06-01
Anticipated expiration: 2017-06-04
Also published as: WO1997046712A2; NZ333137A; JP4278712B2; DE69727932T2; AU729644B2; EP0912760A2; ATE309388T1; EP0912760B1; EP1493826B1; EP1704922A2; ES2215230T3; EP0906449B1; DE69727932D1; EP1442794B1; DE69734587T2; AU3380097A; EP1493826A1; ES2304573T3; EP1442794A2; CA2256612A1

Abstract

SE PRESENTAN UN PROCEDIMIENTO Y UN DISPOSITIVO DE CICLADO TERMICO. EL DISPOSITIVO COMPRENDE UNA CAMARA DE MUESTRAS CUYA TEMPERATURA SE PUEDE MODULAR DE MANERA RAPIDA Y PRECISA EN RELACION CON LA GAMA DE TEMPERATURAS NECESARIA PARA LLEVAR A CABO UNA SERIE DE PROCEDIMIENTOS BIOLOGICOS TALES COMO LA REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA DE ADN. LAS MUESTRAS BIOLOGICAS SE COLOCAN EN UNOS TUBOS MICROCAPILARES DE VIDRIO Y A CONTINUACION ESTOS SE COLOCAN EN LA CAMARA DE MUESTRAS. UN CONTROLADOR PROGRAMABLE REGULA LA TEMPERATURA DE LA MUESTRA DENTRO DE LA CAMARA DE MUESTRAS. EL CONTROL DE LA AMPLIFICACION DEL ADN SE LLEVA A CABO MEDIANTE UNA FLUORESCENCIA UNA VEZ POR CICLO O VARIAS VECES POR CICLO. LA PRESENTE INVENCION GARANTIZA QUE EL CONTROL POR FLUORESCENCIA DE UNA PCR ES UNA POTENTE HERRAMIENTA PARA LA CUANTIFICACION DE ADN.

Description

Sistema y métodos de monitorización de una amplificación de ADN mediante fluorescencia.

La presente invención se refiere, en general, a un método de monitorización en tiempo real de una amplificación por la reacción en cadena de la polimerasa de una secuencia de ácido nucleico diana en una muestra biológica.

En numerosas áreas de la industria, tecnología, e investigación existe la necesidad de someter de forma fiable y reproducible muestras relativamente pequeñas a ciclado térmico. La necesidad de someter una muestra a ciclos térmicos repetidos es particularmente importante en aplicaciones biotecnológicas. En el sector biotecnológico, se desea frecuentemente calentar y enfriar repetidamente pequeñas muestras de materiales durante un periodo corto de tiempo. Uno de dichos procesos biológicos que se lleva a cabo de forma regular es la amplificación cíclica de ADN.

La amplificación cíclica de ADN, utilizando una ADN polimerasa termoestable, permite la amplificación automática de ADN específico cebador, conocida ampliamente como la "reacción en cadena de la polimerasa". La automatización de este proceso requiere un ciclado térmico controlado y preciso de las mezclas de reacción contenidas habitualmente en un conjunto de recipientes. En el pasado, el recipiente de preferencia ha sido un tubo micrófugo de plástico normalizado.

En el pasado se han utilizado bloques metálicos comerciales de calentamiento programable para realizar el ciclado de temperatura de muestras en tubos micrófugos a través del perfil deseado de temperatura frente al tiempo. Sin embargo, la incapacidad de ajustar de forma rápida y precisa la temperatura de los bloques de calentamiento a través de un intervalo amplio de temperaturas durante un período corto de tiempo, ha dado lugar a que la utilización de dispositivos del tipo de bloques de calentamiento sea indeseable como sistema de control de calentamiento cuando se lleva a cabo la reacción en cadena de la polimerasa.

Además, los tubos micrófugos que se utilizan generalmente presentan desventajas. El material de los tubos micrófugos, el grosor de sus paredes, y la geometría de los tubos micrófugos es un impedimento para el calentamiento y enfriamiento rápido de la muestra contenida en los mismos. El material plástico y el grosor de las paredes de los tubos micrófugos actúan como aislantes entre la muestra contenida en los mismos y el medio circundante dificultando así la transferencia de energía térmica. Además, la geometría de los tubos micrófugos presenta un área superficial pequeña para cualquier medio que se utilice para transferir energía térmica. La utilización continua de tubos micrófugos en la técnica, con su geometría subóptima, indica que hasta ahora no se han reconocido las ventajas de una transferencia térmica mejorada (que se consiguen mediante el incremento del área superficial de un recipiente de muestra para una muestra de volumen constante).

Además, también se han utilizado dispositivos que utilizan baños de agua con intercambio de fluidos (o transferencia mecánica) como ciclador térmico para la reacción en cadena de la polimerasa. A pesar de que se han utilizado baños de agua en el ciclado de una mezcla de reacción en cadena de la polimerasa a través de un perfil deseado de temperatura frente a tiempo necesario para que tenga lugar la reacción, la elevada masa térmica del agua (y la baja conductividad térmica de los tubos micrófugos de plástico) han sido significativamente limitantes en lo que se refiere al rendimiento del aparato y el rendimiento de la reacción.

Los dispositivos que utilizan baños de agua están limitados en su rendimiento. Esto es debido a que la masa térmica de agua restringe significativamente el gradiente máximo de temperatura frente al tiempo que se puede conseguir de este modo. Además, se ha observado que el aparato con baño de agua es muy incómodo debido al tamaño y al número de mangueras que transportan agua y a los dispositivos externos controladores de la temperatura del agua. Adicionalmente, la necesidad de un mantenimiento excesivo y una inspección periódica de los ajustes del agua con el objetivo de detectar pérdidas en el aparato con baño de agua es tediosa y requiere mucho tiempo. Finalmente, con el aparato con baño de agua es difícil controlar la temperatura en los tubos de muestra con la precisión deseada.

La Patente de Estados Unidos No. 3.616.264 de Ray muestra un aparato térmico de aire forzado para el ciclado de aire para calentar o enfriar muestras biológicas hasta una temperatura constante. A pesar de que el aparato de Ray es algo efectivo en el mantenimiento de una temperatura constante en el interior de una cámara de aire, no está dirigido a la necesidad para el ajuste rápido de la temperatura de forma cíclica según un perfil de temperatura frente a tiempo, tal como el requerido para procedimientos biológicos, tales como la reacción en cadena de la polimerasa.

Tanto la Patente de Estados Unidos No. 4.420.679 de Howe como la Patente de Estados Unidos No. 4.286.456 de Sisti y otros dan a conocer hornos para cromatografía de gases. Los dispositivos descritos en las patentes de Howe y Sisti y otros son adecuados para llevar a cabo procedimientos de cromatografía de gases, pero no proporcionan un ciclado térmico que sea sustancialmente más rápido que el proporcionado por cualquiera de los dispositivos descritos anteriormente. El ciclado térmico rápido es útil para llevar a cabo muchos procedimientos. Los dispositivos como los descritos en las patentes de Howe y Sisti y otros no son adecuados para llevar a cabo de forma eficaz y rápida dichas reacciones.

La Solicitud de Patente Internacional No. WO 95 32306 da a conocer un método para detectar un ácido nucleico diana, cuyo método incluye las etapas de (i) amplificar el ácido nucleico diana para obtener un producto de amplificación que utiliza una polimerasa, un primer cebador con o sin un segmento no contiguo a una primera secuencia de cebado, y un segundo cebador con o sin un segmento no contiguo a una segunda secuencia de cebado en presencia de un oligonucleótido que es incapaz de actuar como cebador para la polimerasa, en la que el oligonucleótido tiene, como mínimo, 5 nucleótidos consecutivos completamente complementarios a, como mínimo, 5 nucleótidos consecutivos del primer cebador, y (ii) detectar la presencia del ácido nucleico diana mediante la monitorización de la amplificación del mismo.

La Solicitud de Patente Europea No. EP 0 229 943 da a conocer sondas fluorescentes de desplazamiento de Stokes para ensayos de hibridación de polinucleótidos que están diseñadas para proporcionar espaciados predeterminados de unidades de bases de nucleótidos entre los fluoróforos dadores y aceptores. Cuando las sondas se hibridan al polinucleótido diana, los fluoróforos apareados para la transferencia de energía no radioactiva están separados por de 2 a 7 unidades de bases de nucleótidos. Los fluoróforos se unen a las sondas de ADN o ARN mediante brazos de unión que tienen longitudes de 4 a 30 Ángstroms. La fluoresceína es un dador preferido para su utilización con un aceptor de Texas Red.

La Solicitud de Patente Europea No. EP 0 566 751 da a conocer un proceso para la detección de una secuencia de ácidos nucleicos en un formato de ensayo homogéneo que utiliza un sistema de transferencia de energía. Este proceso utiliza un cebador marcado en 5' que contiene una secuencia autocomplementaria en un proceso de amplificación junto con una etapa de detección posterior que utiliza una sonda marcada en 3' para la región amplificada. Los marcajes estarán próximos en el espacio tras la hibridación de la sonda próxima al trozo pequeño de ADN de doble cadena resultante del plegamiento interior de la región autocomplementaria del cebador que se ha incorporado al producto amplificado. Este documento también da a conocer el nuevo cebador para su utilización en este proceso.

En particular, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es fundamental para la biología molecular y es la primera técnica molecular práctica para el laboratorio clínico. A pesar de su utilidad y popularidad, el entendimiento actual de la PCR no está demasiado avanzado. Las amplificaciones se deben optimizar mediante prueba y error y frecuentemente se siguen protocolos a ciegas. El limitado entendimiento de la PCR encontrado en la técnica es un buen ejemplo de cómo los técnicos en la materia están satisfechos de utilizar una poderosa técnica sin reflexión o comprensión.

La PCR requiere el ciclado de temperatura de la muestra. La técnica anterior, tal como se ha explicado anteriormente, no sólo lleva a cabo el ciclado de temperatura lentamente, sino que también ignora los principios subyacentes que permiten funcionar a la PCR y que se podrían utilizar para realizar una PCR incluso más útil. De este modo, sería un gran avance en la técnica proporcionar métodos y aparatos que sean particularmente adaptables para llevar a cabo la PCR de forma rápida y analizar la reacción que tiene lugar, particularmente si dicha reacción es analizada a medida que tiene lugar, es decir, en tiempo real.

En vista del estado de la técnica descrito anteriormente, la presente invención busca cumplir los siguientes objetivos y ventajas.

Un objetivo de la presente invención es proporcionar un método para realizar una PCR de forma rápida y para monitorizar simultáneamente la reacción.

Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un método para realizar una PCR de forma rápida y también monitorizar de forma continua la reacción y ajustar los parámetros de la reacción a la vez que se desarrolla la reac-
ción.

Estos y otros objetivos y ventajas de la presente invención quedarán completamente claros a partir de la descripción y las reivindicaciones que se indican a continuación, o se pueden aprender a partir de la práctica de la presente invención.

Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un método de monitorización en tiempo real de una amplificación por la reacción en cadena de la polimerasa de una secuencia de ácidos nucleicos diana en una muestra biológica, comprendiendo dicho método las etapas de

amplificar la secuencia diana mediante la reacción en cadena de la polimerasa en presencia de dos sondas de ácidos nucleicos que se hibridan a las regiones adyacentes de la secuencia diana, estando una de dichas sondas marcadas con un fluoróforo aceptor y la otra sonda marcada con un fluoróforo dador de una pareja de transferencia de energía por fluorescencia, de manera que tras la hibridación de las dos sondas con la secuencia diana, los fluoróforos dador y aceptor están separados de 0 a 25 nucleótidos el uno del otro, comprendiendo dicha reacción en cadena de la polimerasa las etapas de

añadir a la muestra biológica una polimerasa termoestable y cebadores para la secuencia de ácidos nucleicos diana y ciclar térmicamente la muestra biológica entre, como mínimo, una temperatura de desnaturalización y una temperatura de elongación;

excitar la muestra biológica con luz a una longitud de onda absorbida por el fluoróforo dador y detectar la emisión de la muestra biológica.

Un objetivo adicional de la presente invención es proporcionar un método para analizar una secuencia de ADN diana de una muestra biológica para polimorfismos, heterocigosidad o mutaciones de la secuencia de ADN, comprendiendo dicho método las etapas de

(a) añadir a la muestra biológica una cantidad eficaz de dos cebadores de ácidos nucleicos y una sonda de ácido nucleico, en la que uno de dichos cebadores y la sonda están marcados cada uno con un miembro de una pareja de transferencia de energía por fluorescencia que comprende un fluoróforo aceptor y un fluoróforo dador, y en la que la sonda marcada se híbrida a una copia amplificada de la secuencia de ácidos nucleicos diana separada de 0 a 25 nucleótidos del cebador marcado;

(b) amplificar la secuencia de ácidos nucleicos diana mediante la reacción en cadena de la polimerasa, comprendiendo dicha reacción en cadena de la polimerasa las etapas de añadir una polimerasa termoestable y cebadores para la secuencia de ácidos nucleicos diana y ciclar térmicamente la muestra biológica entre, como mínimo, una temperatura de desnaturalización y una temperatura de elongación;

(c) iluminar la muestra biológica con luz de una longitud de onda seleccionada que es absorbida por dicho fluoróforo dador y detectar la emisión de fluorescencia de la muestra.

La presente invención proporciona métodos para una monitorización continua por fluorescencia de la amplificación de ADN. En las realizaciones preferidas de la presente invención, la utilización de componentes ópticos combinados con estructuras para proporcionar un ciclado rápido de temperaturas permite la monitorización continua de la amplificación de ADN mediante una variedad de diferentes técnicas de fluorescencia. La utilización de tubos de vidrio capilares para muestras, y tubos compuestos de plástico/vidrio para muestras permite una rápida transferencia del calor desde el aire (30 ciclos en menos de 15 minutos) y la monitorización óptica simultánea de la reacción. La fluorescencia se adquiere de forma continua a partir de una muestra única o alternativamente, a partir de muestras múltiples en un carro rotatorio con todas las muestras sometidas de forma simultánea a un ciclado térmico rápido.

Según otro aspecto de la presente invención, la fluorescencia durante la amplificación de ADN se monitorizó mediante: 1) el colorante SYBR^{TM} Green I específico de doble cadena, 2) un descenso en la desactivación de la fluoresceína por la rodamina tras la división con exonucleasas de una sonda de hibridación doblemente marcada, y 3) la transferencia de energía por resonancia de fluoresceína a Cy5^{TM} mediante sondas de hibridación adyacentes. Los datos de fluorescencia obtenidos una vez por ciclo permiten la cuantificación del número de copias iniciales de la plantilla si se conocen la especificidad de la fluorescencia y la eficacia de la amplificación.

Además, en contraste con la medición de la fluorescencia una vez por ciclo, se dan a conocer realizaciones de la presente que monitorizan la temperatura, el tiempo y la fluorescencia de forma continua a través de cada ciclo produciendo, de este modo, una espiral tridimensional. Esta espiral tridimensional se puede reducir a representaciones de temperatura frente a tiempo, fluorescencia frente a tiempo, y fluorescencia frente a temperatura. Las representaciones de fluorescencia frente a temperatura de sondas de hibridación discriminan entre la señal acumulada irreversible de la división con exonucleasas y la hibridación reversible dependiente de la temperatura de las sondas adyacentes. Mediante la utilización de colorantes de doble cadena en cada ciclo se puede conseguir la desnaturalización, la rehibridación y la elongación del producto.

La presente invención mantiene que la monitorización por fluorescencia de la PCR es una herramienta poderosa para la cuantificación de ADN. La monitorización ciclo por ciclo utilizando colorantes de ADNbc no requiere sondas únicas y permite la cuantificación en un intervalo dinámico amplio. Las sondas fluorescentes específicas de secuencia ofrecen una mayor especificidad y se pueden utilizar para cuantificar números de copia de la platilla muy bajos. Existen, como mínimo, dos clases de sondas de oligonucleótidos fluorescentes específicas de secuencia que son útiles en la PCR. El mecanismo de generación de la señal se separa de forma natural en sondas de hidrólisis, o bien, de hibridación. Mediante la monitorización de la fluorescencia una vez por ciclo, se puede utilizar cualquier sistema de sondas para la cuantificación. La monitorización continua de la fluorescencia permite la obtención de curvas de fusión y curvas de hibridación del producto durante el ciclado de temperaturas.

Según otro aspecto de la presente invención, los componentes ópticos de la monitorización para la fluorescencia se pueden utilizar en combinación con un ciclador térmico rápido a utilizar para obtener curvas de fusión de ADN durante la PCR mediante la monitorización de la fluorescencia de colorantes específicos de ADN de doble cadena. La representación de la fluorescencia en función de la temperatura a medida que el ciclador térmico se calienta a través de la temperatura de disociación del producto permite obtener una curva de fusión de ADN. La forma y posición de esta curva de fusión de ADN es función de la proporción de GC/AT, la longitud, y la secuencia, y se puede utilizar para diferenciar productos de amplificación separados por menos de 2ºC en la temperatura de fusión. Los productos deseados se pueden distinguir de los productos no deseados, incluyendo dímeros de cebadores. El análisis de las curvas de fusión se puede utilizar para extender el intervalo dinámico de la PCR cuantitativa. La presente invención proporciona aparatos y métodos para la PCR de ciclo rápido con amplificación combinada y el análisis cuantitativo completo en menos de quince minutos y, más preferiblemente, en menos de diez minutos.

La presente invención proporciona un método para monitorizar en tiempo real una amplificación por la reacción en cadena de la polimerasa de una secuencia de ADN diana y también un método para analizar una secuencia de ADN diana de una muestra biológica para polimorfismos, heterocigosidad o mutaciones de secuencias de ADN. El método comprende las etapas de amplificación la secuencia diana mediante la reacción en cadena de la polimerasa en presencia de dos sondas de ácidos nucleicos que se hibridan a las regiones adyacentes de la secuencia diana, la excitación de la muestra con luz a una longitud de onda absorbida por el fluoróforo dador y la detección de la emisión de fluorescencia de la muestra. Una de las sondas se marca con un fluoróforo aceptor y la otra sonda se marca con un fluoróforo dador de una pareja de transferencia de energía por fluorescencia, de manera que tras la hibridación de las dos sondas con la secuencia diana, los fluoróforos aceptor y dador están separados de 0 a 25 nucleótidos el uno del otro. La propia reacción en cadena de la polimerasa comprende las etapas de adición a la muestra biológica de una polimerasa termoestable y cebadores para la secuencia de ácidos nucleicos diana y el ciclado térmico de la muestra biológica entre, como mínimo, una temperatura de desnaturalización y una temperatura de elongación. En una realización alternativa, la fluorescencia de la muestra se monitoriza en función de la temperatura de la muestra. En una realización preferida, el fluoróforo dador es fluoresceína. Un fluoróforo aceptor particularmente adecuado para su utilización con fluoresceína es Cy5.

En otra realización de la presente invención se proporciona un método de monitorización en tiempo real de una amplificación por la reacción en cadena de la polimerasa de una secuencia de ácidos nucleicos diana en una muestra biológica. Este método de la realización también es útil para analizar una secuencia de ADN diana en una muestra bio-
lógica para polimorfismos, heterocigosidad o mutaciones de secuencias de ADN. El método comprende las etapas de

(a) añadir a la muestra biológica una cantidad eficaz de dos cebadores de ácidos nucleicos y una sonda de ácido nucleico, en la que uno de dichos cebadores y la sonda están cada uno marcados con un miembro de una pareja de transferencia de energía por fluorescencia que comprende un fluoróforo aceptor y un fluoróforo dador, y en la que la sonda marcada se hibrida a una copia amplificada de la secuencia de ácidos nucleicos diana separada de 0 a 25 nucleótidos del cebador marcado;

(b) amplificar la secuencia de ácidos nucleicos diana mediante la reacción en cadena de la polimerasa, comprendiendo dicha reacción en cadena de la polimerasa las etapas de adición de una polimerasa termoestable y cebadores para la secuencia de ácidos nucleicos diana y el ciclado térmico de la muestra biológica entre, como mínimo, una temperatura de desnaturalización y una temperatura de elongación;

Ese método puede ser de gran ventaja utilizando la etapa adicional de monitorización de la fluorescencia en función de la temperatura de la muestra.

Se pueden utilizar datos relativos a la fluorescencia en función de la temperatura de la muestra biológica como base para el ajuste de las condiciones de ciclado térmico para optimizar el rendimiento o la especificidad de la reacción. De este modo, también se proporciona un método mejorado de amplificación de una secuencia de ácidos nucleicos diana de una muestra biológica, en la que el método comprende las etapas de

(a) añadir a la muestra biológica una cantidad eficaz de dos sondas de ácidos nucleicos que se hibridan a regiones adyacentes de la secuencia diana, estando una de dichas sondas marcadas con un fluoróforo aceptor y otra sonda marcada con un fluoróforo dador de una pareja de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia, de manera que tras la hibridación de las dos sondas con la secuencia diana, los fluoróforos dador y aceptor están separados por de 0 a 25 nucleótidos el uno del otro;

(b) amplificar la secuencia de ácidos nucleicos diana utilizando la reacción en cadena de la polimerasa, que comprende el ciclado térmico de la muestra biológica utilizando parámetros de temperatura y tiempo determinados;

(c) iluminar la muestra biológica con una longitud de onda seleccionada de luz que es absorbida por dicho fluoróforo aceptor durante la reacción en cadena de la polimerasa;

(d) monitorizar las emisiones fluorescentes de dicha muestra; y

(e) ajustar los parámetros de temperatura y tiempo de acuerdo con los datos generados en la etapa (d) para optimizar el rendimiento o la especificidad del producto.

En cada uno de los métodos de la presente invención que utilizan una pareja de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia como fuente de una señal fluorescente indicativa del estado de una reacción en cadena de la polimerasa, se obtienen buenos resultados en los que la pareja de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia comprende fluoresceína como dador y Cy5 como aceptor. Los métodos se llevan a cabo de forma ventajosa en un dispositivo diseñado para ciclar térmicamente muestras biológicas en tubos capilares óptimamente transparentes con rampas de temperatura elevadas, con tiempos de permanencia mínimos en una temperatura máxima, y en el que la fluorescencia de las muestras se mide o detecta a través del extremo del tubo capilar.

Se proporciona un método para mejorar la detección y eficacia de la obtención de la fluorescencia en una muestra que comprende un fluoróforo. El método utiliza la reflexión interna total para optimizar la obtención y monitorización de emisiones fluorescentes. El método comprende las etapas de colocación de la muestra en un tubo capilar que comprende un material óptimamente transparente y la detección de fluorescencia de la muestra a través de un extremo del tubo capilar. La proporción del área superficial con respecto al volumen del tubo capilar es preferiblemente superior o igual a 4 mm^{-1}. En la circunstancia en la que la fluorescencia es inducida por la iluminación excitatoria del fluoróforo de la muestra, el método además comprende la etapa de iluminación de la muestra a través del extremo del tubo capilar, preferiblemente a lo largo del paso óptico de la fluorescencia detectada.

En una realización preferida la fluorescencia de la muestra biológica es dependiente de la temperatura y el método además comprende la etapa de calentamiento o enfriamiento de la muestra biológica durante la detección de la fluorescencia para monitorizar la fluorescencia dependiente de la temperatura en la muestra. La muestra puede contener una pareja de transferencia de energía por fluorescencia, y se detecta la fluorescencia de, como mínimo, un fluoróforo de la pareja de transferencia de energía por fluorescencia. En una realización, la muestra comprende ácidos nucleicos que incluyen sondas de ácidos nucleicos. Una de dichas sondas se marca con un fluoróforo aceptor, y la otra sonda se marca con un fluoróforo dador de una pareja de transferencia de energía por fluorescencia. La fluorescencia detectada es la del fluoróforo dador o el fluoróforo aceptor o la de ambos.

Breve descripción de los dibujos

Para apreciar mejor cómo se obtiene lo descrito anteriormente y otras ventajas y objetivos de la presente invención, se presentará una descripción más particular de la presente invención descrita brevemente anteriormente con referencias a realizaciones específicas de la misma que se ilustran en los dibujos anexos. Las figuras 30-33 y 47 se han borrado.

La presente invención se describirá y se explicará con especificidad y detalle adicional a través de la utilización de los dibujos adjuntos en los que:

La figura 1 muestra una vista en perspectiva de un aparato de ciclado térmico adaptado para el ciclado térmico de muestras biológicas y especialmente adaptado para su utilización en la amplificación cíclica de ADN.

La figura 2 es una vista lateral elevada de la parte de la cámara de fluido del aparato ilustrado en la figura 1.

La figura 3 es una vista interior plana de la parte de la cámara de fluido del aparato de la figura 1.

La figura 4 muestra una vista interior plana de la cámara de fluido de otra realización.

La figura 5 muestra un perfil de temperatura frente a tiempo optimizado para una reacción en cadena de la polimerasa que utiliza el dispositivo de ciclado térmico.

La figura 6 muestra gráficamente el efecto del tiempo de hibridación sobre la especificidad y el rendimiento de la reacción en cadena de la polimerasa que utiliza el dispositivo de ciclado térmico.

La figura 7 muestra gráficamente el efecto del tiempo de desnaturalización sobre el rendimiento de la reacción en cadena de la polimerasa que utiliza el dispositivo de ciclado térmico.

Las figuras 8A-B, que son vistas de secciones transversales en perspectiva y elevadas, respectivamente, de otra realización.

La figura 8C es una representación diagramática de la relación del elemento productor de calor y los tubos capilares que contienen las muestras biológicas en la realización ilustrada en las figuras 8A-B.

La figura 9A muestra los resultados de cuatro perfiles diferentes de temperatura/tiempo (A-D) y sus productos de amplificación resultantes después de treinta ciclos (A-D).

La figura 9B muestra un ciclo de otro perfil preferido de temperatura/tiempo utilizado por la presente invención. Las figuras 9C-G muestran ciclos de ejemplo de otros perfiles preferidos de temperatura/tiempo utilizados por la presente invención.

La figura 10 proporciona un diagrama de bloques de un circuito de control de la pendiente de temperatura.

La figura 11 es una vista esquemática de un ciclador de temperatura rápido preferido con detección por fluorescencia.

La figura 11A es un gráfico de temperatura frente a tiempo que muestra una operación preferida del aparato de la figura 11.

La figura 12 es un gráfico que muestra representaciones bidimensionales de temperatura frente a tiempo, fluorescencia frente a tiempo, y fluorescencia frente a temperatura, que también se muestran como representaciones tridimensionales.

La figura 13 es una proyección de fluorescencia frente a temperatura para un fragmento de 536 pares de bases del gen de la \beta-globina humana.

La figura 14 es una representación del número de ciclos frente a la fluorescencia.

La figura 15 es una representación del número de ciclos frente a la proporción de la fluorescencia.

La figura 16 es una representación de la proporción de la fluorescencia frente a la temperatura.

La figura 16A es una representación de la proporción de la fluorescencia frente al número de ciclos.

La figura 17 es una representación de la proporción de la fluorescencia frente a la temperatura.

La figura 18 es una representación de la fluorescencia frente al número de ciclos para diferentes números de copias iniciales de la plantilla.

Las figuras 19A-D representan dos disposiciones preferidas para proporcionar la detección específica de secuencias de los productos de PCR.

La figura 20 es una representación de la proporción de la fluorescencia (fluoresceína/rodamina) frente al número de ciclos de la amplificación de ADN monitorizada con una sonda de hidrólisis doblemente marcada.

Las figuras 21A-D proporcionan una comparación de tres técnicas de monitorización por fluorescencia para PCR, incluyendo el colorante SYBR® Green I de ADNbc (A), una sonda de hidrólisis doblemente marcada con fluoresceína/rodamina (B), y una sonda de hibridación marcada con fluoresceína con un cebador marcado con Cy5 (C); la figura 21D muestra el coeficiente de variación para las tres técnicas de monitorización representadas en las figuras 21A-C.

La figura 22 proporciona representaciones que muestran la aplicación de métodos de interpolación para la cuantificación de curvas de PCR por fluorescencia.

La figura 23A proporciona una representación que muestra un cambio lineal en la proporción de la fluorescencia con la temperatura y un incremento paralelo en la fluorescencia a medida que se hidroliza más sonda.

La figura 23B proporciona una representación que muestra que la proporción de la fluorescencia de las sondas de hibridación varía radicalmente con la temperatura.

La figura 24 proporciona una representación que muestra la dependencia con la temperatura del estado de la cadena del producto durante la PCR.

La figura 24A es una representación de la temperatura frente a la fluorescencia de la PCR con SYBR® Green I.

La figura 25 proporciona una representación que muestra los componentes nativos y competitivos de una curva de fusión de producto.

La figura 26 proporciona una representación de la velocidad de rehibridización del producto para diferentes concentraciones del producto de la PCR.

La figura 27 proporciona una representación que muestra la determinación inicial de una constante de velocidad.

La figura 28 es un gráfico que representa un paradigma de equilibrio de PCR y un paradigma cinético de PCR.

La figura 29 muestra que se ha realizado la monitorización sobre un intervalo dinámico de 10 veces en la parte logarítmico-lineal de una amplificación de rutina.

La figura 34 muestra los resultados obtenidos utilizando una sonda de polarización.

La figura 35 muestra los resultados de fluorescencia de la PCR de una sonda con cinco bases intercaladas entre los marcadores de fluoresceína y rodamina.

La figura 36 muestra el efecto de la concentración de la sonda sobre la sensibilidad.

La figura 37 representa el número de ciclos frente a la proporción de fluorescencia en la PCR monitorizada mediante sondas de la transferencia de energía por resonancia e hidrólisis.

La figura 38 es una representación de la longitud de onda de emisión frente a la fluorescencia para la transferencia de energía por resonancia de una sonda doblemente marcada con fluoresceína/Cy5.

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La figura 39 es una representación que muestra el número de ciclos frente a la proporción de fluorescencia sobre un fondo de PCR monitorizada mediante transferencia de energía por resonancia con sondas de hibridación.

La figura 40 es una representación de la temperatura frente a la proporción de fluorescencia en la PCR monitorizada mediante sondas de hibridación adyacentes.

La figura 41 es una representación de la temperatura frente a la proporción de fluorescencia en la PCR monitorizada mediante sondas de hidrólisis.

La figura 42A es una representación de tiempo frente a la fluorescencia que muestra la relación inversa entre la temperatura y la fluorescencia.

La figura 42B es una representación de tiempo frente a la temperatura que muestra la relación inversa entre la temperatura y la fluorescencia.

La figura 43A es una representación de la temperatura frente a la fluorescencia para las curvas de fusión de tres productos de la PCR purificados diferentes.

La figura 43 es una representación de la temperatura frente a la fluorescencia que muestra que la T_{m} aparente de los productos de la PCR es dependiente de la velocidad de calentamiento.

La figura 44 es una representación de la temperatura frente a la fluorescencia relativa que muestra que la T_{f} de los productos de la PCR es dependiente de la concentración de colorante de ADNbc.

La figura 45 es una representación de la temperatura frente a la fluorescencia que muestra la curva de fusión obtenida cuando se mezclan dos productos de PCR purificados que difieren en la T_{f} en, aproximadamente, 2ºC.

La figura 46 es una representación que muestra cómo se pueden cuantificar las cantidades relativas de cada producto de la PCR.

La figura 48 ilustra segmentos útiles de la temperatura frente al tiempo para la monitorización de la hibridación por fluorescencia.

La figura 49 muestra información de las curvas de fusión mostradas como picos de fusión.

La figura 50 representa la fluorescencia de colorantes específicos de ADNbc en función de la temperatura durante la PCR para permitir la monitorización del estado de la cadena durante ciclos individuales de la reacción.

La figura 51 representa un ciclo de adquisición de la curva de fusión.

La figura 52A representa la posición absoluta de las curvas de fusión de los productos de la PCR.

La figura 52B representa cómo las rápidas transiciones de temperatura a través de la temperatura de desnaturalización desplazaban las curvas de fusión hacia una T_{m} aparente más elevada.

La figura 53 representa curvas de fusión para tres productos de la PCR purificados diferentes.

La figura 54 representa las curvas de fusión superpuestas que resultan de mezclar los productos de la PCR purificados.

La figura 55 representa los resultados después de la conversión en picos de fusión que demuestran que es posible resolver mezclas de productos de reacción que difieren en la T_{m} en menos de 2ºC en picos separados.

La figura 56 representa un análisis de las curvas de fusión utilizadas para diferenciar el producto deseado de productos no específicos, tales como dímeros cebadores.

La figura 57 representa la fluorescencia relativa obtenida una vez por ciclo después de la extensión por la polimerasa del producto para una serie de reacciones que varían en la concentración de la plantilla inicial.

La figura 58 representa picos de fusión obtenidos para un número de muestras.

La figura 59 representa los puntos de los datos de la figura 57 multiplicados por la proporción apropiada para obtener la representación corregida.

La figura 60 muestra que los resultados de la figura 58 se correlacionan bien con los resultados de la electroforesis.

La figura 61 muestra que las curvas de fusión representadas en la figura 56 se pueden transformar en picos de producto para estimar la cantidad relativa de los diferentes productos presentes.

A continuación, se hará referencia a los dibujos en los que se proporcionan estructuras similares con designaciones de referencia similares.

A pesar de no ser parte de la invención reivindicada, la figura 1 muestra el dispositivo de ciclado térmico (10) que incluye una cámara cerrada en forma de bucle de fluido (más preferiblemente aire), generalmente designada como (11), que está adaptada para aceptar muestras a ciclar a través de una puerta de ventilación (14). La cámara de fluido cerrada en forma de bucle (11) incluye un conjunto de compartimentos que se describirán brevemente cada uno de ellos. El dispositivo (10) también incluye un controlador (12) que se puede programar por medio de teclas de entrada (25) y una pantalla (26) para provocar el ciclado de la cámara (11) mediante una serie de temperaturas durante un periodo predeterminado de tiempo. Tal como se explicará a continuación, el ciclado térmico de la cámara (11) se puede utilizar para realizar numerosos procedimientos y es particularmente adecuado para la amplificación de ADN específico cebador de muestras que contienen la mezcla de reacción.

La cámara fluido cerrada en forma de bucle (11) está incluida en una configuración en forma generalmente de caja mediante una carcasa (13). Si se desea se pueden situar paneles de montaje de soplador (16) para cortar una sección rectangular más pequeña de la cámara (11) y funcionar para soportar y asegurar a la misma una carcasa inferior (15) de forma generalmente cilíndrica. Alternativamente, el ventilador del soplador (28) se puede situar íntegramente en el interior de la carcasa de la cámara (13).

El interior de la carcasa del soplador (15) contiene las paletas y los ejes del soplador. El motor del soplador (no mostrado) está situado de forma externa a la carcasa del soplador (15) y, por lo tanto, exteriormente a la cámara (11) encerrada. En esta configuración, las paletas y los ejes son las únicas partes del soplador que quedan expuestas al fluido caliente circulante en el interior de la cámara (11). No sería ventajoso montar el motor en el interior de la cámara que sometería el motor a variaciones de temperatura y también añadiría la masa térmica del motor a la que se somete a calentamiento y enfriamiento. Tal como se explicará con más detalle a continuación, la reducción de la masa térmica expuesta al fluido en la cámara (11) es importante para el rendimiento global del dispositivo (10) en su función de someter muestras colocadas en el mismo a perfiles predeterminados de temperatura frente a tiempo.

El soplador (20) es un tipo de soplador bien conocido identificado habitualmente como un soplador del tipo "en línea" que utiliza preferiblemente un ventilador de tipo hélice debido a su masa térmica generalmente baja, o si se desea, un ventilador de tipo jaula de ardilla, teniendo el ventilador preferiblemente una capacidad mínima de 75 pies cúbicos por minuto.

A la plataforma del solenoide (17) se ha asegurado un solenoide (18). La armadura del solenoide (19) está unida al extremo superior (21) de una barra (20) que está unida de forma rígida a la puerta de ventilación (14) y unida de forma rotatoria a la carcasa (13) en los puntos por encima y por debajo de la puerta de ventilación (14). Por lo tanto, la barra (20) permite que la puerta de ventilación (14) gire libremente con respecto a la carcasa (13) sobre el eje longitudinal de la barra.

A la carcasa (13) está unida uno de los extremos de un resorte (22) mediante un poste de soporte (23). El extremo opuesto del resorte (22) está unido al extremo superior (21) de la barra (20) directamente adyacente a la unión de la armadura del solenoide (19). El resorte (22) se alarga entre estos dos puntos de unión para que esté en tensión. Por lo tanto, el resorte (22) tiende a alargar el extremo superior (21) hacia el poste de soporte (23), que a su vez tiende a girar la puerta de ventilación (14) a su posición cerrada. Cuando el solenoide (18) está en funcionamiento, la armadura (19) tiende a tirar del extremo superior (21) de la barra (20) en la dirección del solenoide (18), que es opuesta a la dirección de estirado del resorte (22), y que tiende a abrir la puerta de ventilación (14).

El controlador, designado generalmente como (12), está unido eléctricamente a la cámara (11) por medio de un cable de transmisión (24). El cable (24) también suministra potencia al motor del soplador (no mostrado), y al serpentín calentador (31). Además, el controlador (12) también está conectado a un sensor termopar (35) para recibir señales que corresponden a los datos de temperatura, y al solenoide (18) para disparar la estructura del solenoide.

El controlador (12) puede ser cualquier unidad controladora de temperatura bien conocida que sea programable para controlar el serpentín calentador (31), la puerta de ventilación (14), y el soplador para conseguir temperaturas predeterminadas en función del tiempo en el interior de la cámara (11), y que también sea capaz de ser programado para hacer funcionar una salida de relé y accionar un solenoide a periodos de tiempo y niveles de temperatura de la cámara predeterminados. Un controlador de temperatura (12) preferido para su utilización en las realizaciones de las figuras 1-3 es un controlador de temperatura proporcional Partlow MIC-600, disponible en Omega Engineering Inc, de Stanford, Connecticut, como el controlador de proceso Modelo No. CNB600.

A pesar de que no es parte de la invención reivindicada, tal como se muestra en las figuras 2 y 3, el interior de la cámara (11) está dividido en cuatro compartimentos principales. El compartimento del soplador (28) está formado por la carcasa del soplador (15) y los platos de montaje del soplador (16). La totalidad del compartimento del soplador (28) está ocupado con las partes del ventilador y los ejes de un soplador, tal como se ha descrito anteriormente. El soplador puede ser cualquiera entre un número de diseños bien conocidos, tal como se ha descrito anteriormente y, por lo tanto, se ha omitido de la figura 3 para que quede más claro. Para la presente invención es suficiente entender que el ventilador localizado en el compartimento del soplador (28) traspasa fluido al compartimento del soplador (28) a través de una abertura de entrada (36) empuja el fluido fuera de la abertura de salida (37).

Se prefiere que el fluido se conduzca mediante el soplador a una velocidad de, como mínimo, 75 pies cúbicos por minuto. Sin embargo, con respecto a la presente invención, es importante darse cuenta de que el fluido localizado en la cámara (11) sólo está en contacto con el ventilador y una parte del eje conductor del soplador, estando el propio motor del soplador situado en el exterior de la carcasa del soplador (15) para evitar cualquier contacto del mismo con el fluido en la cámara (11). Esto es importante ya que es crítico para la velocidad de funcionamiento de la presente invención minimizar el material que está en contacto con el fluido en el interior de la cámara (11) para minimizar así la masa térmica del material que se debe calentar y/o enfriar durante el proceso de ciclado. Minimizando la masa térmica que se debe calentar o enfriar mediante el fluido, el tiempo de respuesta necesario para conseguir que el contenido de la cámara (11) alcance una temperatura uniforme disminuye ampliamen-
te.

El fluido que sale del compartimento del soplador (28) a través de la abertura de salida (37) entra en el compartimento de calentamiento (29). El fluido que pasa al compartimento de calentamiento (29) debe pasar por el serpentín calentador (31). Si el serpentín calentador (31) se calienta más que el fluido que pasa al compartimento de calentamiento (29), el fluido quedará así calentado a medida que es forzado a través del compartimento. El serpentín calentador es preferiblemente una bobina de cable de nicromo de 1000 vatios (125 VAC) enrollada alrededor de un microsoporte. Sin embargo, se puede utilizar cualquier unidad de calentamiento adecuada para calentar el tipo de fluido presente en la cámara. El serpentín calentador particular de la realización de las figuras 1-3 está fabricado por Johnstone Supply, de Portland, Oregón.

El serpentín calentador se activa mediante un relé de salida incluido en el controlador (12). El relé preferido es un relé en estado sólido de 25 A, 125 VAC fabricado por Omega Engineering Inc. de Standford, Connecticut, como el Modelo No. Omega SSR 240 D25.

El fluido que pasa a través del compartimento de calentamiento (29) recala en los deflectores (32) y (33) antes de pasar al compartimento de reacción (30). Los deflectores (32) y (33) tienden a romper cualquier flujo laminar del fluido y generan turbulencias en el mismo para mezclar de forma eficaz el fluido, de manera que llega al compartimento de reacción (30) a una temperatura homogénea.

Un sensor termopar (35) proporciona una señal de entrada eléctrica al controlador (12) que corresponde a la temperatura de fluido en el compartimento de reacción (30). La monitorización de la temperatura durante el funcionamiento con el dispositivo de ciclado térmico (10) se consigue, preferiblemente, mediante un termopar "tipo J" de hierro-constantan de calibre 30. El controlador utiliza esta información para regular el serpentín calentador (31) según los perfiles predeterminados de temperatura frente a tiempo programados en el mismo y para accionar el solenoide (18), tal como se explicará inmediatamente.

El fluido que pasa del compartimento de reacción (30) al compartimento de aire de retorno (34) debe pasar a través del compartimento para muestras (27) (tal como se muestra en línea discontinua). El compartimento para muestra (27) también se explicará inmediatamente.

El fluido del compartimento de retorno (34) se ha enfriado ligeramente debido a la transferencia de calor desde el mismo a las muestras situadas en el compartimento para muestras (27). El fluido del compartimento de retorno (34) se extrae a través de la abertura de entrada (36) hacia el compartimento del soplador (28), en el que se fuerza nuevamente, por acción del ventilador, a salir a través de la abertura de salida (37) hacia el compartimento de calentamiento (39). De este modo, la cámara del fluido (11), cuando trabaja con la puerta de ventilación (14) cerrada, es una cámara de fluido cerrada en forma de bucle que recircula continuamente el fluido a lo largo de un paso del bucle cerrado a través de cada compartimento del mismo para conseguir que el contenido del mismo alcance una temperatura uniforme. La circulación continua del aire en la cámara de aire (11) permite a las muestras en el compartimento para muestras (27) que alcancen una temperatura predeterminada tan rápido como sea posible y, a continuación, si se desea, se mantienen a esa temperatura.

Cuando el dispositivo (10) se debe utilizar no sólo para calentar el material situado en el compartimento de reacción (27), sino también para enfriar posteriormente estos materiales tan rápido como sea posible hasta una temperatura igual, o por encima, a la temperatura ambiente del fluido (aire), el controlador (12) se puede programar para accionar el solenoide (18) y provocar que se abra la puerta de ventilación (14) y así permitir que grandes cantidades de fluido ambiente inunde inmediatamente el compartimento (11) a la vez que se escapa simultáneamente del mismo el fluido calentado.

La desactivación del serpentín calentador (31) a la vez que se sigue con la activación del soplador con la puerta de ventilación (14) abierta, llevará el fluido ambiente al compartimento de retorno (34) y desde allí al compartimento soplador (28). A continuación, el soplador empujará este fluido ambiente a través del compartimento de calentamiento (29) donde pasará directamente al compartimento de reacción (30) sin ser calentado por el serpentín (31). A continuación, el fluido ambiente pasa a través del compartimento para muestras (27) y se escapa fuera de la cámara (11) a través de la puerta de ventilación (14). Debido a la masa térmica mínima del material situado en la cámara (11), y la acción del ventilador del soplador, grandes cantidades de fluido ambiente se forzarán a pasar por el compartimento para muestras (27), y desde ahí fuera de la cámara (11). De este modo, se obtiene un enfriamiento rápido de las muestras o los materiales situados en el compartimento de reacción (27).

El compartimento para muestras (27) tiene un tamaño adecuado para permitir que un conjunto de muestras, tales como tubos alargados de vidrio huecos que contienen una muestra en los mismos, se sitúen fácilmente en una orientación separada de manera que el fluido pueda pasar de forma uniforme alrededor de cada muestra. Si se desea, el compartimento para muestras (27) puede tener un tamaño y estar configurado para permitir la inserción de un estante, una cesta o similar que han sido configurados para aceptar un conjunto de muestras en una configuración uniforme separada para simplificar la carga de muestras en la cámara para muestras (27).

El acceso al compartimento para muestras (27) se realiza por rotación de la puerta de ventilación (14) hasta su posición de abertura. Una vez se gira la puerta de ventilación (14) hasta, aproximadamente, 90 grados de su posición de cierre, el compartimento para muestras (27) es accesible fácilmente a través del mismo. Además, tal como se puede observar, la rotación de la puerta de ventilación (14) en, aproximadamente, 90 grados desde su posición de cierre provoca que el compartimento del fluido de retorno (34) esté sustancialmente apartado del compartimento de reacción (30). De este modo, cuando el dispositivo (10) de la presente invención está en modo "enfriamiento", el fluido ambiente entra directamente al compartimento del fluido de retorno (34) y es forzado a través del compartimento del soplador (28), el compartimento de calentamiento (29), el compartimento de reacción (30), y el compartimento para muestras (27) sustancialmente a lo largo del mismo paso que el paso del flujo de fluido en forma de bucle cerrado, descrito anteriormente. A continuación, el fluido es forzado a salir de la cámara de aire (11) y se evita que retroceda al compartimento de retorno de aire (34) mediante el posicionamiento de la puerta de ventilación (14) entre el compartimento para muestras (27) y el compartimento del fluido de retorno (34).

De este modo, la puerta de ventilación (14) no sólo permite que el fluido ambiente entre en la cámara (11), sino que también puede evitar que el fluido recircule en forma de bucle a través de la cámara (11). En cambio, el fluido es forzado a pasar a través del compartimento para muestras (27) y, a continuación, sale de la cámara (11) para ayudar al rápido enfriamiento del contenido de la muestra y la cámara (11).

Cuando se utiliza un dispositivo (10) para la amplificación cíclica de ADN, se necesita un ciclado repetitivo a través de un perfil de temperatura frente a tiempo. Las muestras que contienen una mezcla de reacción para la reacción en cadena de la polimerasa generalmente deben ser cicladas, aproximadamente, 30 veces a través de un perfil de temperatura frente a tiempo que corresponde a las fases de desnaturalización, hibridación y elongación del proceso de amplificación.

El dispositivo (10), debido a su masa térmica global inferior, es capaz de ciclar muestras a través de perfiles de temperatura frente a tiempo significativamente más cortos en comparación con la técnica anterior. La aplicación de la amplificación de ADN de la realización de las figuras 1-3 puede pasar a través de un ciclo de perfil de temperatura frente a tiempo de 30-60 segundos (ver figura 5). Este mismo ciclo utilizando dispositivos de la técnica anterior tendría, aproximadamente, 5-10 tiempos más largos. Estos tiempos de ciclos bajos también han demostrado que incrementan el rendimiento y la especificidad de la reacción en cadena de la polimerasa respecto el ciclado de la técnica anterior.

Ejemplo 1

La reacción en cadena de la polimerasa se llevó a cabo en un volumen de 10 \mul con 50 ng de ADN plantilla, 0,5 mM de cada desoxinucleótido, 500 nM de cada oligonucleótido cebador en un tampón de reacción que consistía en 50 mM de Tris HCl (pH 8,5 a 25ºC), 3,0 mM de cloruro magnésico, 20 mM HCl, y 500 \mug/ml de albúmina de suero bovino (S). Se añadió polimerasa de thermus aquaticus (0/4 unidades de Taq polimerasa - Stratagene^{TM}), las muestras se colocaron en tubos capilares de paredes finas de 8 cm de longitud (fabricados por Kimble, Kimax 46485-1), y los extremos se fusionaron con un quemador de gas de laboratorio, de manera que se observaba una burbuja de aire en ambos extremos de cada tubo.

A continuación, los tubos capilares se colocaron verticalmente en un soporte construido con una "gradilla preperforada" de 1 mm de grosor (fabricado por Radio shack). La mezcla se cicló 30 veces a través de la desnaturalización (90-92ºC), la hibridación (50-55ºC), y la elongación (72-75ºC) para los tiempos indicados en el perfil de temperatura frente a tiempo de la figura 5. La monitorización de la temperatura de los tubos capilares se realizó con un termopar en miniatura (IT-23, Sensortek, Clifton, NJ) colocado en 10 \mul de agua desionizada y conectado a un monitor del termopar (BAT-12, Sensortek). Los productos de amplificación se fraccionaron por electroforesis sobre un gel de agarosa al 1,5%. Se obtuvieron buenos resultados.

Debido al hecho de que el dispositivo (10) cicla aire como medio de transferencia de calor en lugar de agua, tiene la ventaja de que la transferencia de calor tiene lugar a través de un medio de baja capacidad calorífica (aire) que se puede calentar muy rápidamente.

El tiempo de respuesta para el enfriamiento de la muestra es muy rápido debido a la utilización de tubos capilares de vidrio de paredes finas para contener las muestras, en lugar de tubos micrófugos de plástico, tal como se ha realizado en el pasado en procesos de la técnica anterior, y minimizando la masa térmica del material en el interior de la cámara (11) (ver figura 5). Dichos tiempos de respuestas pueden permitir la optimización de las etapas de desnaturalización e hibridación, y elongación en la reacción en cadena de la polimerasa, en términos de tiempo y temperatura.

Además, se obtienen tiempos "en rampa" cortos, es decir, se acorta el tiempo necesario para conseguir que la temperatura de la muestra de un nivel de temperatura alcance el siguiente nivel de temperatura correspondiente a las fases en el proceso de amplificación. Esto disminuye el tiempo necesario para una amplificación completa y permite un estudio específico de la hibridación, desnaturalización y cinética del enzima en un protocolo de la reacción en cadena de la polimerasa.

Los deflectores (32) y (33) (tal como se muestran en la figura 3) se pueden utilizar, si se desea, para conseguir la homogeneidad de temperatura adecuada en el compartimento para muestras (27). Tal como se muestra en esta realización, los deflectores (32) y (33) disminuyen la variación de temperatura en el compartimento de reacción (30) desde, aproximadamente, 10ºC hasta, aproximadamente, 2ºC. Si se desea, se pueden utilizar más deflectores (o más complicados) para disminuir adicionalmente la variación de temperatura en el compartimento de reacción (30). Alternativamente, tal como se muestra en la figura 4, el ventilador se puede colocar en corriente descendente con respecto al serpentín calentador (31) pero antes del compartimento para muestras (27) para conseguir una mezcla más uniforme.

Los productos de amplificación obtenidos a través de la utilización del aparato (10) son cualitativa y cuantitativamente similares a los obtenidos a través del método de ciclado manual con baño de agua. Sin embargo, son posibles las ventajas en la especificidad y el rendimiento con el control térmico rápido de la mezcla de reacción. La figura 6 muestra el efecto de la variación del tiempo de desnaturalización del perfil de la temperatura frente al tiempo de la figura 5 a medida que se utiliza con el aparato (10) para el ciclado térmico sobre el rendimiento de la amplificación del ADN. Cada una de las líneas verticales más marcadas correspone a un tiempo particular a una temperatura de desnaturalización. Tal como se puede observar, el rendimiento es el mayor en el menor tiempo de desnaturalización posible. Dicha respuesta rápida es imposible con los sistemas de la técnica anterior.

La figura 7 muestra el efecto del perfil de la temperatura frente al tiempo de la figura 5, tal como se utiliza con el aparato de ciclado térmico (10), sobre la especificidad (es decir, el rendimiento de un producto específico en oposición a un conjunto de productos similares o "sombra"). Tal como se puede observar, cuanto más corta sea la rampa y el tiempo de hibridación, mayor será la especificidad de producto. La respuesta rápida de temperatura del aparato (10) permite una especificidad y rendimiento mejorados que no son posibles con los sistemas de la técnica anterior.

Tal como se ha observado, mediante el descenso de la capacidad térmica (masa térmica) del aparato (10), el presente aparato puede disminuir de forma marcada el tiempo total requerido para la reacción en cadena de la polimerasa. Además, la utilización de muestras pequeñas reduce las cantidades de reactivos caros que se deben utilizar hasta, aproximadamente, un 90%, reduciendo adicionalmente de este modo el coste de la realización de procedimientos que utilizan la presente invención. Por ejemplo, deseablemente se pueden utilizar tubos capilares (108) que tienen diámetros internos en el intervalo de, aproximadamente, 0,25 mm a, aproximadamente, 1,0 mm. En algunas aplicaciones, deseablemente también se pueden utilizar tubos capilares (108) que tienen diámetros internos en el intervalo de, aproximadamente, 0,02 mm a, aproximadamente, 0,3 mm.

El aparato (10) es útil para amplificar ADN a partir de cualquier fuente. A pesar de que se han descrito configuraciones y disposiciones particulares de la presente invención en conexión con las realizaciones específicas del dispositivo de ciclado térmico (10), se pueden utilizar otras disposiciones y configuraciones. Por ejemplo, en el dispositivo (10) se pueden utilizar alternativamente varios fluidos diferentes al aire de, generalmente, baja masa térmica.

La figura 8A es una vista en perspectiva y la figura 8B es una vista transversal seccionada elevada de la realización adicional. Se entenderá que muchos de estos componentes y enseñanzas explicadas anteriormente también tienen aplicación en la realización ilustrada en las figuras 8A-C. De este modo, a continuación sólo se proporcionará la información adicional pertinente referente a esta realización. De forma importante, en la realización de las figuras 8A-C, el elemento que produce calor está adyacente a los recipientes de muestras biológicas, permitiendo un calentamiento y un enfriamiento más rápido de las muestras biológicas, tal como se explicará a continuación.

Tal como se apreciará brevemente, el aparato de las figuras 8A-C proporciona una mejora incluso mayor sobre la técnica anterior en la velocidad a la que se puede realizar el ciclado térmico, por ejemplo, 15 ó 30 ciclos de amplificación de ADN en 30, 15, 10 ó 5, o incluso menos minutos. Además, el aparato (100) proporciona una mejor homogeneización térmica a través de las muestras que la prevista.

En la figura 8A se muestra la configuración general de la carcasa (102) de la realización. La carcasa (102) descansa sobre unos pies (104) (se observa mejor en la figura 8B) y sirve para aguantar las otras estructuras descritas en el lugar y para aislar aquellas estructuras que se calientan debido al medio que las rodea. En la realización (100) de la figura 8A también se incluyen teclas de entrada (25) y una pantalla (26) al igual que en el aparato (10) descrito anteriormente. Las estructuras de control descritas anteriormente se pueden modificar o utilizar fácilmente como patrones de un medio de control para su utilización en la realización de las figuras 8A-C.

Tal como se observa mejor en la vista transversal de la figura 8B, la cámara para muestras está designada por el paréntesis (106). Se puede abrir una tapa (138) conectada a la carcasa (102) mediante una bisagra (131) para permitir el acceso a la cámara para muestras (106). La cámara para muestras (106) tiene una forma preferiblemente cilíndrica, pero puede tener cualquier forma o tamaño requerido por la aplicación particular.

La cámara para muestras (106) está recubierta con un material de espuma de color negro (110), cuya superficie tiene características de absorción de luz con el cuerpo del grosor de la espuma que tiene características aislantes. El material de espuma negro puede ser el que esté disponible fácilmente en la técnica y fabricado de material plástico. La espuma (110) es, preferiblemente, un material que se enfría fácilmente mediante el aire que pasa por el mismo, es decir, el material tiene una baja conductividad térmica y una superficie porosa.

La superficie porosa oscura o negra del material convierte la radiación de longitud de onda más corta que penetra en la superficie en una radiación de longitud de onda más larga, es decir, calor, que se radia a la cámara para muestras.

La espuma (110) sirve para aislar térmicamente la cámara para muestras del espacio de aire que la rodea en la carcasa y también convierte la luz emitida por la lámpara (112) en energía térmica. La espuma (110) se puede sustituir por otras estructuras. Por ejemplo, un material que tiene una superficie negra, oscura o no reflectante, tal como una lámina fina de policarbonato que tiene una superficie pintada de negro, puede estar soportada por un material aislante, tal como fibra de vidrio o material de espuma. La superficie negra u oscura, que se puede pintar en un número de sustratos diferentes, convierte la radiación de longitud de onda más corta que la penetra en radiación térmica a la vez que el material aislante aisla térmicamente la cámara para muestras del medio que la rodea. De este modo, utilizando las enseñanzas proporcionadas en la presente, los técnicos en la materia pueden utilizar muchos materiales y estructuras diferentes como recubrimientos para la cámara para muestras.

La lámpara (112) es, preferiblemente, una lámpara halógena de 500 vatios. Si se utilizan dispositivos de control adecuados, se pueden utilizar lámparas de potencia más elevada o un conjunto de lámparas, tales como cuatro lámparas halógenas de 500 vatios. Una toma para la lámpara (112A) está unida a la carcasa (102) mediante un soporte (112B). La lámpara (112) es capaz de calentar muy rápida y uniformemente la cámara para muestras (106) hasta la temperatura deseada. Dentro del alcance de la presente invención también se pueden utilizar otras fuentes de calor, es decir, radiación infrarroja, tal como el elemento de cable de nicromo descrito anteriormente.

En la figura 8B se representan dos tubos capilares de paredes finas (108), tales como los descritos anteriormente. Aunque se muestran dos tubos capilares de paredes finas (108), la cámara para muestras (106) puede contener muchos más tubos. Los tubos capilares de paredes finas (108) tienen diversas ventajas importantes sobre los dispositivos utilizados previamente, tal como se ha descrito anteriormente, y, junto con la cámara para muestras (106), sirve como el ejemplo preferido en la presente de un medio para contener una muestra biológica.

Se apreciará que se pueden utilizar muchas otras estructuras que lleven a cabo funciones equivalentes o similares. Para facilitar el acceso, los tubos capilares de paredes finas (108) se alargan parcialmente, preferiblemente, por la izquierda fuera de la cámara para muestras a través de las aberturas (140), pero pueden estar completamente incluidos en la cámara para muestras (106) al igual que muchas otras estructuras que contienen el fluido que son adecuadas para aplicaciones particulares. Los tubos capilares de paredes finas (108) preferidos tienen una capacidad de, aproximadamente, 10 \mul. Tal como se entenderá, el volumen de la muestra debe mantenerse pequeño, y el área superficial de la estructura que contiene las muestras relativamente grande, y juntos deberían presentar una masa térmica relativamente pequeña. También se prefiere que la estructura que contiene las muestras contenga un volumen entre, aproximadamente, 0,1 \mul hasta, aproximadamente, 10.000 \mul, pero los técnicos en la materia apreciarán que otros volúmenes de las muestras también se puedan utilizar dentro del alcance de la presente invención si se considera la diferente masa térmica de la estructura.

La lámpara (112) y la espuma aislante (110) proporcionan juntos un calentamiento rápido y uniforme de la muestra contenida en los tubos capilares de paredes finas (108) y el aire contenido en el interior de la cámara para muestras (106). En el interior de la cámara para muestras (106) se incluye un termopar (134) para detectar la temperatura en el interior de la cámara y se utiliza para mantener la temperatura deseada en el interior de la cámara para muestras, tal como se ha descrito anteriormente.

El termopar (134) es, preferiblemente, uno disponible en la técnica, cuya respuesta térmica coincida sustancialmente con la respuesta térmica de la muestra biológica y el recipiente que contiene a la misma. Dichos termopares se pueden obtener comercialmente a partir de fuentes, tales como Idaho Labs, que fabrica una línea de termopares referidos como termopares de tipo J cubierto de metal. La concordancia de la respuesta térmica del termopar con la de la muestra biológica y el recipiente se puede llevar a cabo, preferiblemente, insertando un microtermopar, tal como el modelo termopar IT-23 disponible en PhysiTemp, según se conoce en la técnica, en una muestra biológica habitual contenida en el recipiente seleccionado y sometiendo la muestra y el termopar a una prueba para los mismos cambios de temperatura. El termopar en la prueba, o algunos criterios externos, se pueden cambiar hasta que la respuesta térmica del termopar coincida de forma adecuada con la respuesta térmica de la muestra y su recipiente.

La disposición representada en la figura 8B proporciona un calentamiento y enfriamiento más uniforme de la muestra que en los dispositivos disponibles previamente. En los dispositivos disponibles previamente, la transferencia de calor a través de la muestra se lleva a cabo por convección a través de la muestra. El movimiento inducido por convención de la muestra en el interior de cualquier estructura que se utiliza para contener la muestra está causado por los gradientes o diferencias de temperatura en las muestras biológicas generalmente pequeñas (por ejemplo,
10-100 \mul).

El efecto de los gradientes de temperatura en la muestra se vuelve más pronunciado y más difícil de controlar a medida que el tiempo del ciclo para una muestra disminuye. La existencia de temperaturas no uniformes en la muestra, y particularmente la dependencia con "el mezclado por convección" en la muestra por los dispositivos de la técnica anterior, incrementa generalmente el tiempo del ciclo para una muestra y probablemente tiene efectos perjudiciales en la muestra biológica. El aparato (100) es capaz de proporcionar un calentamiento y un enfriamiento, de manera que las diferencias térmicas en una muestra de 10 \mul se mantienen en no más de ±1ºC en todos los tiempos durante un ciclo de 30 segundos.

Para conseguir un calentamiento y un enfriamiento uniforme, se prefiere que los tubos capilares de paredes finas (108) estén, como mínimo, en parte, uniformemente separados de la fuente de calor, por ejemplo, la lámpara (112) en el aparato (100). La figura 8C proporciona una vista superior esquemática de la lámpara (112) y el conjunto de tubos capilares de paredes finas (108), tal como se disponen en el aparato (100) representado en las figuras 8A-B.

En la disposición representada en la figura 8C, los tubos capilares de paredes finas (108) que están más alejados de la lámpara (112) (según se indica con la línea F), preferiblemente, no son más de, sustancialmente, un 40%, y más preferiblemente, no son más de, sustancialmente, un 25%, más alejados de la lámpara (112) que la distancia entre la lámpara (112) y los tubos capilares de paredes finas (108) que están más próximos a la lámpara (112) (según se indica con la línea N). Por ejemplo, la distancia indicada por la línea N puede ser de, aproximadamente, 7,3 cm mientras que la distancia indicada por la línea F puede ser de, aproximadamente, 8,5 cm.

Se apreciará que la disposición de los tubos capilares de paredes finas (108) pueda ser otra diferente a la representada en las figuras, por ejemplo, circular o semicircular. Además, se apreciará que el punto desde el que se mide la distancia entre el elemento que produce calor y los recipientes de muestras variará a medida que varía el tipo y el tamaño del elemento que produce de calor. Por ejemplo, el elemento que produce calor puede comprender un conjunto de lámparas o elementos resistivos eléctricos que varían de forma y tamaño. En algunas realizaciones, también puede llegar a ser importante considerar la distancia desde la pared de la cámara para muestras hasta el lugar donde están situados los recipientes de las muestras. En la realización ilustrada, las aberturas (140) (ver figura 8A) actúan como un medio para contener los recipientes de las muestras, pero también se pueden utilizar otras estructuras que actúan con funciones equivalentes según la presente invención.

El aparato (100) también enfría las muestras contenidas en los tubos capilares (108) de forma muy rápida y uniformemente. Para enfriar la cámara para muestras (106), el aire del exterior de la carcasa (102) se introduce al interior de la carcasa a través de una puerta inferior de la carcasa (114) mediante un ventilador (116) que está conectado a un eje del motor (122) accionado por un motor (118). Dado que se desea un enfriamiento rápido de la cámara para muestras, se prefiere que la combinación del motor (118) y el ventilador (116) sea capaz de mover suficientes volúmenes de aire en la cámara para muestras (106) y, a continuación, disperse ese aire del interior de la cámara para muestras (106), tal como se explicará inmediatamente. Dentro del alcance de la presente invención también se pueden utilizar las disposiciones diferentes a la del motor (118) y el ventilador (116), ilustradas en la figura 8B.

La utilización de aire como medio de transferencia térmica, en contraste con otros gases y líquidos, tiene las ventajas de ser barato, fácilmente disponible, fácilmente mezclable, y nunca se forma una masa. En el caso de las realizaciones descritas, la proporción elevada del área superficial con respecto al volumen de los tubos capilares que contienen la muestra proporciona una transferencia térmica rápida utilizando aire como medio de transferencia térmica.

Durante las fases de enfriamiento del ciclo térmico, la acción del ventilador (116) introduce aire a temperatura ambiente en la carcasa (102). Se proporciona una puerta de ventilación (128) articulada con una bisagra (129). La puerta de ventilación (128) se abre automáticamente por medio de un solenoide (132), de manera que el interior de la carcasa (102) se cierra desde la puerta superior de la carcasa (130). En algunas realizaciones, el solenoide (132) se sustituye, preferiblemente, por un motor de paso a paso, tal como se conoce en la técnica. La utilización de un motor de paso a paso permite que la puerta de ventilación (128) se abra y se cierre de forma precisa e incremental según las necesidades para calentar y enfriar las muestras. Los técnicos en la materia serán capaces de obtener un mecanismo de control apropiado para su utilización con un motor de paso a paso, por ejemplo, como un controlador de un motor de paso a paso SC-149 (disponible en Alpha Products), tal como se conoce en la técnica, utilizando la información expuesta en la presente.

Debido a la disposición de la puerta inferior de la cámara para muestras (120) y la mayor área transversal y posición de la puerta superior de la cámara para muestras (126), el aire a temperatura ambiente se mueve en la cámara para muestras (106) y se dispersa y mezcla en el interior de la cámara para muestras (106) mediante una paleta (124) que está conectada al eje del motor (122). La paleta (124) debe rotar a una velocidad relativamente elevada, por ejemplo, suficientemente rápida para crear velocidades del aire de alrededor, preferiblemente, aproximadamente, 250, más preferiblemente 500, y aún más preferiblemente 1000 metros por minuto en el interior de la cámara para muestras (106). Con la paleta (124), que puede ser una paleta con una única hélice o varias, girando a una velocidad elevada, el aire se mueve, o se introduce en la cámara para muestras (106) y se expulsa de la cámara para muestras (106) siguiendo el paso indicado por la línea discontinua (136). La rotación de la paleta (124) también provoca la mezcla del aire que entra en la cámara para muestras (106) y asegura la transferencia más eficaz de energía térmica desde las superficies de los tubos capilares de paredes finas (108) al aire que pasa a través de la cámara para muestras (106). Se apreciará que estructuras diferentes a las ilustradas en la presente invención pueden llevar a cabo funciones similares.

A medida que el solenoide (132) se acciona para abrir la puerta de ventilación (128), todo el aire a temperatura ambiente desplazado a la cámara para muestras (106) se escapa a través de la puerta superior de la cámara para muestras (126) y, a continuación, a través de la parte superior de la carcasa (130), transportando el calor desde la cámara para muestras (106) hasta la atmósfera circundante. La mezcla rápida del aire que pasa a través, y se sitúa en la cámara para muestras (106) da lugar a un enfriamiento rápido y uniforme de las muestras.

Ejemplo 2

La figura 9A muestra los resultados de cuatro perfiles diferentes de temperatura/tiempo (A-D) y sus productos de amplificación resultantes después de treinta ciclos (A-D). Los perfiles A y B en la figura 9A se obtuvieron utilizando un dispositivo de calentamiento en bloque de la técnica anterior que utilizaba tubos micrófugos de la técnica anterior. Tal como se puede observar en la figura 9A, las transiciones entre temperaturas son lentas y muchas bandas no específicas están presentes en los perfiles A y B. El perfil B muestra la mejora en la eliminación de algunas de las bandas no específicas (en contraste con el perfil A) mediante la limitación del tiempo que cada muestra permanece a cada temperatura, indicando así que tiempos más cortos producen resultados más deseables.

Los perfiles C y D se obtuvieron utilizando el aparato de las figuras 8A-B. Tal como se puede observar en la figura 9A, la amplificación es específica y, de forma deseable, aunque el rendimiento es máximo en C (elongación de 60 segundos), aún es totalmente adecuado en D (elongación de 10 segundos).

También se determinaron los tiempos y las temperaturas máximas para la amplificación de un fragmento de 536 pares de bases de \beta-globina de ADN genómico humano. El rendimiento de la amplificación y la especificidad del producto fueron óptimos cuando la desnaturalización (93ºC) y la hibridación (55ºC) eran inferiores a 1 segundo. No se observó ninguna ventaja para tiempos más largos de desnaturalización o hibridación. El rendimiento se incrementó con tiempos de elongación más largos a 77ºC, pero hubo un pequeño cambio con tiempos de elongación superiores a 10-20 segundos. Estos resultados inesperados indican que los dispositivos previamente disponibles utilizados para la amplificación de ADN no maximizan las condiciones necesarias para optimizar las necesidades físicas y enzimáticas de la reacción.

Se puede obtener más información en: Wittwer, Carl T., Marshall, Bruce C., Reed, Gudrun H., y Cherry, Joshua L., "Rapid Cycle Allele-Specific Amplification with Cystic Fibrosis \DeltaF_{50} Locus" ("Amplificación de ciclo rápido específico en alelos con locus \DeltaF_{50} de la fibrosis quística"), 39 Clinical Chemistry 804 (1993) y Wittwer, Carl T., Reed, Gudrun H., y Rire, Kirk M., "Rapid DNA Amplification" ("Amplificación rápida de ADN"), "THE POLYMERASE CHAIN REACTION" ("Reacción en cadena de la polimerasa"), 174 (1994).

A partir de la información proporcionada en la figura 9A, se puede observar que las realizaciones de la presente invención someten las muestras colocadas en las mismas a un ciclado térmico rápido en el que la temperatura de la muestra aumenta o disminuye a una velocidad, preferiblemente, como mínimo, tan grande como 0,5ºC/segundo. En el caso de la presente invención que lleva a cabo la reacción en cadena de la polimerasa, el cambio de temperatura se lleva a cabo, preferiblemente, sobre un intervalo aproximado entre 30ºC y 50ºC. Se prefiere que los ciclos térmicos se lleven a cabo de forma suficientemente rápida para completar, como mínimo, treinta ciclos térmicos en cuarenta minutos y, más preferiblemente, completar treinta ciclos térmicos en veinte minutos y, aún más preferiblemente, completar treinta ciclos térmicos en diez minutos.

El aparato (100) aumenta y disminuye, más preferiblemente, la temperatura de la muestra a una velocidad, como mínimo, tan grande como 1,0ºC/segundo e incluso, más preferiblemente, a una velocidad, como mínimo, tan grande como 4,0ºC/segundo, y aún más preferiblemente, a una velocidad, como mínimo, tan grande como 10,0ºC/segundo. De forma crítica, la muestra biológica, no sólo el medio circundante y/o el recipiente de la muestra, se debe someter al cambio térmico especificado. Los dispositivos disponibles previamente, aunque tienen el inconveniente de no poder realizar cambios térmicos tan rápidamente como el presente aparato, tampoco reconocían el problema del cambio de temperatura de forma rápida y uniforme de la muestra, no tan sólo la temperatura del medio circundante y el recipiente.

En referencia al gráfico de la figura 9B, el método de la presente invención puede conseguir de forma deseable el ciclado térmico, preferiblemente, a una velocidad, como mínimo, tan grande como 10,0ºC/segundo, y más preferiblemente, a una velocidad, como mínimo, tan grande como 20,0ºC/segundo, sobre un intervalo de temperatura superior a, aproximadamente, 20ºC, más preferiblemente sobre un intervalo de temperatura superior a, aproximadamente, 30ºC, y aún más preferiblemente, sobre un intervalo de temperatura de, aproximadamente, 40ºC. La figura 9B muestra la temperatura en ºC de la muestra biológica, no sólo el aire circundante o recipiente, a medida que la muestra biológica se somete al ciclo térmico. La figura 9B muestra una muestra de PCR que empieza a, aproximadamente, 74ºC y se calienta hasta una temperatura de desnaturalización, indicada en D, de, aproximadamente, 92ºC durante 2 segundos. A continuación, la muestra se enfría hasta la temperatura de hibridación, indicada en A, de, aproximadamente, 55ºC durante dos segundos. La transición entre la temperatura de desnaturalización y la temperatura de hibridación cubre un intervalo de 37ºC en sólo 4 segundos proporcionando una velocidad de, como mínimo, tan grande como 10ºC/segundo. A continuación, la muestra se calienta hasta una temperatura de elongación de 74ºC durante cinco segundos, tal como se indica en E en la figura 9B. El ciclado de la muestra a través de la temperatura de desnaturalización, la temperatura de hibridación, y la temperatura de elongación se repite treinta veces o tantas veces como se desee.

Las figuras 9C-G muestran ciclos ejemplo de otros perfiles de temperatura/tiempo que se consiguen mediante la presente invención. Se entenderá que los técnicos en la materia pueden alterar los perfiles de temperatura/tiempo representados para llevar a cabo procesos específicos según la presente invención. Los técnicos en la materia también apreciarán que los dispositivos y métodos previamente disponibles, tales como dispositivos que conducen calor hacia y desde la muestra a través de un sólido o un líquido, no pueden proporcionar, y no sugieren o enseñan, los perfiles temperatura/tiempo descritos en la presente.

Además, se apreciará que los dispositivos y métodos previamente disponibles que utilizan aire y un medio de transferencia, por ejemplo, hornos de cromatografía previamente disponibles, no pueden proporcionar, y no sugieren o enseñan, los perfiles temperatura/tiempo descritos en la presente

Para proporcionar el tiempo de ciclado térmico más rápido, se prefiere que la lámpara (-112- en las figuras 8A y 8B) tenga una potencia de 2000 vatios o se incluyan un conjunto de lámparas que proporcionen una salida de potencia similar. También se prefiere incluir un circuito de control de la pendiente de la temperatura, que está representado en la figura 10, junto con un sistema controlador/obtención A-bus que utiliza una tabla de un microcontrolador 8052 con un reloj y un programa interpretador de alto nivel disponible en Alpha Products (model no. SP-127) de Darían, Conneeticut. El código de programación ejemplo utilizado con respecto al microcontrolador descrito se incluye en el Apéndice de Código de Programación adjuntado e incorporado a la presente invención. El código de programación proporcionado en el Apéndice es un archivo BASIC52 para una descarga en serie en el microcontrolador y proporciona un control de la pendiente de la temperatura de ejemplo durante el ciclado térmico. La utilización del dispositivo que produce calor a 2000 vatios y las estructuras de control descritas permiten velocidades de 20ºC/segundo para obtenerse de forma deseable.

La disposición preferida para el circuito de control de la pendiente de la temperatura representada en la figura 10 se explicará con el entendimiento de que los componentes necesarios adicionales, no ilustrados explícitamente en la figura 10, pueden ser proporcionados fácilmente por los técnicos en la materia.

El circuito de control de la pendiente de la temperatura de la figura 10 incluye un termopar (200) acoplado a la respuesta de la temperatura de la muestra, tal como se ha explicado anteriormente. El termopar (200) está conectado a un circuito integrado (206), que, preferiblemente, es el conocido en la técnica como AD595, cuya salida se transmite a un filtro de paso bajo de cuarto orden (208) con una frecuencia de corte de 100 Hz y a un conversor analógico-digital de 12 bits (210) cuya salida se utiliza para proporcionar una visualización digital de la temperatura.

La salida del circuito (206) también se transmite a un circuito de medición de pendiente (212). El circuito de medición de pendiente (212) incluye, preferiblemente, un amplificador operacional 353 (218), un potenciómetro de 100 k\Omega (214), un potenciómetro de 1 M\Omega (230), y un condensador de 22 \muF. Del circuito de medición de pendiente (212) sale una señal a la entrada de inversión de un amplificador operacional 353 (246).

Un circuito de ajuste de la pendiente (222) incluye un convertidor digital-analógico de ajuste de la pendiente positiva (226) y un convertidor digital-analógico de ajuste de la pendiente positiva (224). Los convertidotes digital-analógicos (224) y (226) son, preferiblemente, convertidores digital-analógico de 8 bits referidos en la técnica como DA147. El circuito de ajuste de la pendiente puede recibir, preferiblemente, instrucciones de otro dispositivo digital (no mostrado en la figura 10), tal como un ordenador personal. La salida del circuito de ajuste de la pendiente (228) está comunicada a un circuito sumador (240).

El circuito sumador (240) incluye, preferiblemente, resistores de 100 K\Omega (236), (238), y (244) y un amplificador operacional 353 (242). La salida del circuito sumador (240) se transmite a la entrada no inversora del amplificador operacional (246) y representa la pendiente deseada del cambio de temperatura. La salida del amplificador operacional (246) está ajustado a un transistor (248) contenido en un circuito de cambio de potencia (262).

El circuito de cambio de potencia (262) incluye un suministrador de 5 VDC (250) que proporciona corriente al transistor (248). El transistor (248) tiene su emisor conectado a un circuito 3010 (254) mediante una resistencia (252) que es, preferiblemente, una resistencia de 330 \Omega. El circuito 3010 (254) incluye una salida conectada en serie con una resistencia (256) que, preferiblemente, es una resistencia de 180 \Omega. Se utiliza, preferiblemente, un triac (258) para controlar la corriente distribuida a una lámpara (262), u otros dispositivos productores de calor, a partir de una fuente de corriente AC (260).

El circuito de control de la pendiente de la temperatura representado en la figura 10, junto con los otros componentes del sistema descritos, proporciona un ciclado térmico de muestras biológicas tan grande como 20ºC/segundo en un intervalo de temperaturas de 30ºC, y más preferiblemente, en un intervalo de temperaturas de 40ºC, manteniendo la homogeneidad a través de la muestra biológica.

Se entenderá que el aparato descrito en la presente invención se pueda utilizar fácilmente para muchas aplicaciones diferentes que incluyen: procesos de reacción en cadena de la polimerasa, secuenciado de ciclos, y otros protocolos de amplificación, tales como la reacción en cadena de la ligasa.

Un aparato también puede controlar de forma precisa la temperatura de las muestras situadas en la cámara para muestras y variar la temperatura de forma rápida y precisa de las muestras situadas en la cámara, según un perfil de temperatura frente a tiempo predeterminado.

Monitorización continua por fluorescencia de la amplificación de ADN

La reacción en cadena de la polimerasa se puede llevar a cabo de forma rápida. Utilizando los métodos y aparatos descritos en la presente invención, el número necesario de ciclos de temperatura se puede completar de forma rutinaria en mucho menos tiempo que el posible con la técnica anterior, por ejemplo, en menos de 15 minutos. Minimizando los tiempos de desnaturalización e hibridación, la especificidad y el rendimiento de los amplificadores de ciclado rápido también se mejoran hasta una extensión no posible previamente. Adicionalmente, además de facilitar la transferencia rápida de calor, la utilización de tubos capilares ópticamente transparentes permite la monitorización continua por fluorescencia de la amplificación de ADN según la presente invención.

Las sondas fluorescentes se pueden utilizar para detectar y monitorizar la amplificación de ADN. Las sondas útiles incluyen colorantes específicos de ADN de doble cadena y sondas específicas de secuencia. Con el intercalador de bromuro de etidio, la fluorescencia roja de excitación en el UV aumenta tras la amplificación en tubos capilares o tubos micrófugos. La detección de la fluorescencia específica de secuencia es posible con sondas de hibridación de oligonucleótidos. Por ejemplo, se pueden dividir sondas doblemente marcadas de fluoresceína/rodamina durante la extensión de la polimerasa por actividad de la 5'-exonucleasa, separando los fluoróforos e incrementando la proporción de la fluorescencia fluoresceína/rodamina.

La fluorescencia se puede medir después de completar el ciclado de la temperatura, una vez por ciclo como una monitorización de la acumulación de producto, o continuamente dentro de cada ciclo. En contraste con la presente inven-
ción, los métodos específicos de secuencia disponibles previamente han sido limitados a un análisis del punto final.

La presente invención permite la monitorización ciclo por ciclo para la cuantificación del número de copias iniciales de la plantilla. Para llevar a cabo dicha monitorización ciclo por ciclo, la fluorescencia se obtiene durante la fase de extensión o hibridación/extensión de cada ciclo y está relacionada con la concentración de producto. En la técnica se conoce un ensayo cuantitativo para ARN de la hepatitis C que utiliza el intercalador YO-PRO-1^{Tm}. Véase Ishiguro, T., J Saitch, H. Yawata, H. Yamagishi, S. Iwasaki, e Y. Mitoma, 1995, "Homogeneus quantitative assay of hepatitis C virus RNA by polymerase chain reaction in the presence of a fluorescent intercalater" ("Ensayo cuantitativo homogéneo del ARN del virus de la hepatitis C mediante la reacción en cadena de la polimerasa en presencia de un intercalador fluorescente"), Anal. Biochem. 229:207-213. Previamente a la presente invención, la monitorización continua de la fluorescencia dentro de cada ciclo no se ha llevado a cabo de forma eficiente y precisa.

En la presente invención se da a conocer un ciclador rápido de temperatura integrado con una óptica de fluorescencia de dos colores que proporciona una monitorización continua de la fluorescencia. Tal como se describirá posteriormente con más detalle, en la presente invención se proporcionan tres técnicas diferentes de fluorescencia preferidas para seguir la amplificación de ADN como ejemplos específicos de la presente invención. Los técnicos en la materia estarán familiarizados con la utilización de bromuro de etidio en técnicas de fluorescencia que se pueden utilizar según la presente invención. En la realización preferida actual descrita a continuación, se prefiere que se utilice como colorante específica de doble cadena el SYBR® Green I, que es conocido en la técnica y está disponible de Molecular Probes of Eugene, Oregón. Según la presente invención, el tiempo, la temperatura y la fluorescencia se obtienen cada 200 ms. Dichos datos revelan detalles precisos de la desnaturalización, hibridación y extensión del producto durante el ciclado rápido, no disponibles con los aparatos y métodos disponibles previamente. Además, tal como se describirá a continuación con más detalle, los resultados obtenidos utilizando una sonda de "desactivación" de 5'-exonucleasa, que es conocida en la técnica se compara con los resultados obtenidos utilizando fluorescencia específica de doble cadena. Además, tal como se describirá a continuación con más detalle, se da a conocer la utilización de un esquema de fluorescencia nuevo basado en sondas de hibridación adyacentes con transferencia de energía por resonancia desde fluoresceína a un colorante conocido de cianina, Cy5^{Tm}. Mujumdar, R.B., L.A. Ernst, S.R. Mujumdar y A.S. Waggoner, 1989, "Cyanine dye labeling reagents containing isothiocyanate groups" ("Reactivos marcadores con colorante de cianina que contienen grupos isotiocianato"), Cytometry 10:11-19.

Tal como se entenderá por los técnicos en la materia, la monitorización de una vez por ciclo de múltiples muestras que experimentan la amplificación de ADN es una herramienta cuantitativa poderosa. Tal como se entenderá mediante la comprensión de esta descripción, la monitorización continua dentro de un ciclo puede identificar la naturaleza de la fluorescencia de la sonda y proporcionar elementos en la mecánica de la amplificación de ADN no disponibles previamente en la técnica.

A pesar de no ser parte de la invención, en la figura 11 se proporciona una vista esquemática de un ciclador rápido de temperatura preferido con detección por fluorescencia, generalmente designado como (300). Una fuente de aire caliente con aire forzado (302) es preferiblemente un dispositivo disponible comercialmente que incluye un serpentín calentador de 1600 vatios y un ventilador. Una fuente de aire frío con aire forzado (304) es preferiblemente un soplador de polo sombreado de 2200 rpm disponible en la técnica de Dayton of Niles, Illinois, modelo no. 4C006B. Se prefiere que la fuente de aire frío con aire forzado (304) proporcione aire a temperatura ambiente, pero está dentro del alcance de la presente invención utilizar medios para proporcionar un fluido que esté a una temperatura inferior a la del aire a temperatura ambiente. En la realización de la figura 11, se utilizan conductos ondulados de nylon negro (306) y (308) que tienen un diámetro de 2,5 cm para conectar la fuente de aire caliente con aire forzado (302) y la fuente de aire frío con aire forzado (304), respectivamente, a una cámara para muestras (310). Una salida de aire (312) y un extractor (314) extraen el aire de la cámara para muestras (310). El interior de la cámara para muestras (310) está protegido de la luz exterior.

La temperatura de las muestras en el interior de la cámara para muestras (310) se monitoriza mediante un termopar tubular de cubierta metálica (316), disponible en Idaho Technology de Idaho Falls, Idaho, modelo no. 1844, en concordancia con la respuesta térmica en muestras contenidas en tubos capilares. La homogeneidad de la temperatura en el interior de la cámara para muestras (310) se consigue mediante un ventilador central de la cámara para muestras (318). El ventilador de la cámara para muestras incluye, preferiblemente, una pala de ventilador de 1,7 x 11 cm disponible en Idaho Technology, modelo no. 1862, y un motor disponible en Idaho Technology, modelo no. 1861, que produce velocidades de aire de, como mínimo, 800 a 1000 m/minuto en el interior de la cámara para muestras (310).

En el interior de la cámara para muestras (310), se colocan verticalmente en un carro rotatorio (322) un conjunto de muestras contenidas en tubos capilares, algunos de los cuales están indicados por (320). El carro (322) tiene, preferiblemente, un diámetro de 14 cm y gira mediante un motor de paso a paso (324) de 400 pasos/rev controlado por un módulo de mando de micropasos (326). El motor de paso a paso (324) es, preferiblemente, uno disponible en New England Affiliated Techonologies of Lawrence, Massachusetts, model no. 2198364, y el módulo de mando de micropasos (326) está también preferiblemente disponible en New England Affiliated Technologies, módulo de mando de micropasos modelo no. MDM7, que proporciona 12800 pasos por rotación del carro (322).

Aún en referencia a la figura 11, se proporciona una fuente de excitación de fluorescencia (328). A continuación, se describirá el mecanismo de excitación. La fuente de excitación de fluorescencia (328) es, preferiblemente, una fuente de arco de xenón de 75 vatios focalizada con un reflector elíptico, estando la fuente de arco de xenón, preferiblemente, disponible en Photon Technology International of South Brunswick, New Jersey, modelo no. A1010, con un reflector elíptico f/2,5. Alternativamente, se puede utilizar un diodo emisor de luz. La luz emitida por la fuente de excitación de fluorescencia (32B) se focaliza hasta, aproximadamente, 2 mm utilizando un iris ajustable (334), tal como uno disponible en la técnica de Rolyn (Covina, California), modelo no. 75.0125. La luz emitida por la fuente de excitación de fluorescencia (328) incide en un espejo frío (330), que está disponible, preferiblemente, en Rolyn, modelo no. 60.4400, y pasa a través del vidrio absorbente de calor (332), que es, preferiblemente, uno disponible en Rolyn, modelo no. 65.3130. Después de la colimación a través de la lente plano convexa (336), preferiblemente, disponible en Rolyn, modelo no. 10.0260, un filtro de interferencia (338) de paso de banda de 450-490 nm, preferiblemente, disponible en Omega Optical de Brattleboro, Vermont, modelo no. 470RDF40, una lente plano convexa de focalización (340), preferiblemente, disponible en Rolyn, modelo no. 10.0260, y una ventana de sílice (342) de 1 mm, preferiblemente, disponible en Omega, para evitar la condensación sobre los componentes ópticos recién descritos durante el ciclado de temperatura. Mediante la utilización del mecanismo de excitación descrito, se ilumina una sección de 5-7 mm de un tubo capilar de muestra (320A).

A continuación, se describirá el mecanismo de obtención para obtener la fluorescencia emitida de la muestra (320A) en referencia aún a la figura 11. La óptica del mecanismo de obtención incluye una ventana de sílice de 1 mm (344) también incluida para evitar la condenación en los otros componentes ópticos. Dos lentes esféricas opuestas (346A&B), preferiblemente, disponibles en Rolyn, modelo no. 17.1175, que sirven para focalizar la fluorescencia emitida en una rendija de 2 x 10 mm (348), que se puede fabricar a partir del corte de una película expuesta a rayos X, que funciona como un filtro espacial. Después del filtro espacial (348), la fluorescencia emitida se impone sobre un obturador electrónico de 35 mm (350) dirigido mediante un control del obturador electrónico (352). El obturador electrónico de 35 mm (350) es, preferiblemente, un obturador Uniblitz modelo no. V535 y el control del obturador electrónico (352) es, preferiblemente, un conductor modelo no. D122, ambos disponibles en Vincent Associates of Rochester, Nueva York. También se proporciona una lente esférica colimadora (354), preferiblemente, disponible en Rolyn modelo no. 17.1175.

Cuando se desea la detección de las emisiones de SYBR® Green I también se incluye un filtro (356). El filtro (356) es un filtro de paso de banda de 520-580 nm disponible en Omega modelo No. 550RDF60, utilizado para la obtención de un único color. Para la detección de otras emisiones, se utiliza una combinación de filtro dicroico (358) y filtros de longitud de onda (358A) y (358B) en un bloque de filtros. Para la separación de las emisiones de la fluoresceína y la rodamina, se utiliza un filtro dicroico (358), que, preferiblemente, consiste en un filtro dicroico de paso largo de 560 nm, preferiblemente disponible en Omega, modelo No. 560 DRLP, y un filtro de paso de banda de 520-550 nm (358B), preferiblemente disponible en Omega, modelo No. 535DF30, para la detección de fluoresceína, y un filtro de paso de banda de 580-620 nm (358A), preferiblemente disponible en Omega, modelo No. 600DF40, para la detección de rodamina. Para la separación de las emisiones de fluoresceína y Cy5, el filtro dicroico (358) preferiblemente es un filtro dicroico de paso largo de 590 nm, disponible en Omega, modelo No. 590 DRLP, y filtros (358A&B) que consisten, preferiblemente, en un filtro de paso de banda de 520-550 nm (-358A-), disponible en Omega, modelo No. 535DF30, para la detección de fluoresceína, y un filtro de paso de banda de 660-680 nm (-358B-), disponible en Omega, modelo No. 670DF20, para la detección de Cy5.

Aún en referencia a la figura 11, después de ser sometida al filtro (358), la fluorescencia se focaliza a través de dos lentes plano-convexas (360A) y (360B), cada una, preferiblemente, disponible en Edmund de Barrington, Nueva Jersey, modelo no. 32970, sobre tubos fotomultiplicadores (362A) y (362B). Los tubos fotomultiplicadores (362A) y (362B) son, preferiblemente, los disponibles en Hamamatsu de Middlessex, Nueva Jersey, modelo no. R928, y están ubicados en una carcasa, preferiblemente la disponible en Photon Technology International, modelo no. 714, con una adquisición analógica. También se dispone, preferiblemente, de un módulo de control de obtención del PMT y datos (364). También se proporcionan obturadores del PMT manuales (366A)y (366B), tal como se conocen en la
técnica.

Los componentes ópticos descritos anteriormente tienen, preferiblemente, 5 cm de diámetro y están montados sobre montajes de lentes universales de 5 cm, tales como las disponibles en Rolyn, modelo No. 90.0190. Tal como se entenderá por los técnicos en la materia, muchos de los componentes estructurales necesarios se fabricaron a partir de Delrin^{TM} negro.

Utilizando el aparato representado en la figura 11, la amplificación de ADN se realizó en Tris 50 mM, pH 8,5 (25ºC), MgCl_{2} 3 mM, albúmina de suero bovino 500 \mug/ml, 0,5 \mu de cada cebador, 0,5 mM de cada desoxinucleósido trifosfato y 0,2 U de Taq polimerasa por cada 5 \mul de muestra, a menos que se indique lo contrario en los siguientes ejemplos. Como plantilla de ADN se utilizó el ADN genómico humano (desnaturalizado durante 1 minuto por ebullición) o el producto de amplificación purificado. El producto de amplificación purificado se obtuvo mediante extracción con fenol/cloroformo y precipitación en etanol, véase Wallace D.M. 1987. "Large- and small-scale phenol extractions and precipitation og nucleic acids" ("Extracciones con fenol y precipitación de ácidos nucleicos a pequeña y gran escala"), p. 33-48, en S.L. Berger y A.R. Kimmel (Eds.), "Guide to Molecular Cloning Tecniques" (Methods in Enzymology, Vol. 152), Academic Press, Orlando, seguido por la eliminación de cebadores mediante el lavado continuo a través de un microconcentrador Centricon 30 (disponible de Amicon de Danvers, Massachusetts). Las concentraciones de la plantilla se determinaron por absorbancia a 260 nm. Las proporciones de A_{260}/A_{240} de las plantillas eran superiores a 1,7.

Los cebadores se sintetizaron mediante química de fosforamidita convencional, tal como se conoce en la técnica, concretamente, utilizando Pharmacia Biotech Gene Assembler Plus (Piscataway, Nueva Jersey). El fragmento de 180 pares de bases del gen del antígeno de superficie de la hepatitis B se amplificó utilizando cebadores 5'-CGTGGTG
GACTTCTCTCAAT-3' (Identificación de secuencia (SEQ ID) No:1) y 5'-AGAAGATGAGGCATAGCAGC-3' (SEQ ID No:2) (Secuencia del Banco de Genes HVHEPE). Se obtuvo SYBR® Green I de Molecular Probes (Eugene, Oregón). Los cebadores de \beta-actina y la sonda dual de fluoresceína/rodamina se obtuvieron de Perkin Elmer (Foster City, California) (No. N808-0230). Los cebadores de \beta-globina humana RS42/KM29 (536 pares de bases) y PC03/PC04 (110 pares de bases) se describen en Wittwer, C.T., G.C. Fillmore y D.R. Hillyard, "Automated polymerase Chain reaction in capillary tubes with hot air", ("Reacción en cadena de la polimerasa automatizada en tubos capilares con aire caliente"), Nucl. Acids. Res. 17:4353-4357.

Las sondas únicas marcadas 5'-CAAACAGACACCATGGTGCACCTGACTCCTGAGGA-fluoresceína-3' (SEQ ID No: 3) y 5'-Cy5-AAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAG-fosfato-3' (SEQ ID No: 4) se sintetizaron utilizando una fosforamidita de fluoresceína (disponible en Glen Research de Sterling, Virginia no. 10-1963), una fosforamidita de Cy5™ (disponible en Pharmacia no. 27-1801-02), y un agente químico de fosforilación (disponible en Glen Research no. 10-1900). Estas sondas adyacentes se hibridan internas a la pareja del cebador de \beta-globina PC03/PC04 en la misma cadena de ADN y están separadas por una pareja de bases. Las sondas se purificaron por cromatografía líquida de alta presión de fase inversa C-18 y se comprobó la homogeneidad mediante electroforesis en poliacrilamida y la absorbancia (A_{260} y la absorbancia máxima del fluoróforo). Las sondas de hibridación (\beta-actina y \beta-globina) se utilizaron cada una en 0,2 \muM.

En los ejemplos correspondientes descritos en la presente invención, se cargaron muestras de amplificación de 5 \mul en tubos capilares para muestras (230). Los tubos capilares para muestras son, preferiblemente, los disponibles en Idaho Technology, modelo no. 1705, que tienen las dimensiones de 1,02 mm de diámetro externo y 0,56 mm de diámetro interno. Una vez cargados, los tubos capilares para muestras se sellaron con llama de butano. La superficie del tubo capilar para muestras se lavó con metanol de calidad óptica antes de cargarlo en el carro (322) del ciclador rápido de temperatura con detección de fluorescencia (300).

El control de los componentes representados en la figura 11 se consiguió mediante la utilización de un lenguaje de programación gráfico conocido como LabView (disponible en National Instruments, Austin, Texas) y una tarjeta multifunción de 12 bits de entrada/salida (disponible en National Instruments bajo la designación AT-MIO-E2) en un ordenador compatible PC (366) que utiliza un microprocesador Intel® 80486 que funciona a una velocidad de 120 MHz. Los canales de salida analógicos de la tarjeta de entrada/salida se utilizaron para controlar la sensibilidad, es decir, el voltaje del PMT, de cada tubo fotomultiplicador (362A&B). Los canales de entrada analógicos de la tarjeta de entrada/salida reciben las señales de cada tubo fotomultiplicador (362A&B). El ordenador PC compatible, a través de la tarjeta de entrada/salida controla la posición, la velocidad y la dirección del movimiento del carro. Tal como se apreciará, cuando se cargan múltiples tubos capilares para muestras, el carro (322) coloca rápidamente cada tubo capilar para muestras (320) de manera secuencial en la posición de monitorización para lecturas cada 100 ms. Para una monitorización continua de un único tubo capilar para muestra (320A), se promedian los datos y se leen cada 200 ms. De forma continua se muestra el tiempo, la temperatura y dos canales de fluorescencia como representaciones de fluorescencia frente al número de ciclos y fluorescencia frente a temperatura. El carro se debe colocar allí donde se obtiene una fluorescencia y unas señales máximas. Cuando se analizó un único tubo capilar para una muestra (320A), las señales se leyeron cada 200 ms con una constante de tiempo de integración en los tubos fotomultiplicadores (364) ajustada a 50 ms. Cuando se utilizaron múltiples tubos fotomultiplicadores (366A&B), la constante de tiempo de ajustó a 0,5 ms y el carro giró una vez para situar la posición exacta en la que cada tubo capilar para muestras (320) proporcionaba la máxima fluorescencia en cada canal. Después de colocar el tubo capilar para muestras (320A) en una posición en la que se obtenía la máxima fluorescencia, se ajustó la sensibilidad de cada PMT (362A&B) y se giró el carro de nuevo para contar y situar la posición de todos los tubos capilares para muestras (320). Las señales se obtuvieron una vez por cada ciclo de amplificación durante la extensión mediante la colocación de forma secuencial de cada tubo capilar para muestras (320) en el carro (322) en la posición de monitorización cada 100 ms. El programa de control de la temperatura se modificó a partir de un ciclador rápido de temperatura comercial disponible en Idaho Technology bajo la designación de Rapidcycler utilizando un compilador cruzado 8051 disponible en Systronics, Salt Lake City, Utah, designado como BCI51 y un sistema de desarrollo Dallas (también disponible en Systronics bajo la designación DPB2).

En la práctica, la respuesta de la temperatura del ciclador rápido de temperatura con detección por fluorescencia (300), permite ciclos de 20-30 segundos (30 ciclos en 10-15 minutos), tal como se representa en el gráfico de temperatura frente a tiempo de la figura 11A. Cuando durante la amplificación está presente un colorante fluorescente específico de doble cadena, la fluorescencia, generalmente, se incrementa a medida que se produce más producto de doble cadena, véase Higuchi, R., G. Dollinger, P.S. Walsh, y R. Griffith, 1992, "Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences" ("Amplificación y detección simultánea de secuencias específicas de ADN"), Bio/Technology 10; 413-417.

La fluorescencia también depende de la temperatura, un efecto confuso durante el ciclado de temperatura que se suele eliminar considerando la fluorescencia una vez por ciclo a una temperatura de extensión constante. Sin embargo, si la temperatura, el tiempo y la fluorescencia se obtienen cada 200 ms durante la amplificación de ciclo rápido, se describe una espiral tridimensional en el espacio tal como se representa en la figura 12. La curva tridimensional representada en la figura 12 también se proyecta en la figura 12 como representaciones bidimensionales de la temperatura frente al tiempo, la fluorescencia frente al tiempo, y la fluorescencia frente a la temperatura. La proyección de la temperatura frente al tiempo de la figura 12 repite cada ciclo y proporciona esencialmente la misma información que la establecida en la figura 11A. Dado que la fluorescencia varía inversamente con la temperatura, la proyección de la fluorescencia frente al tiempo mostrada en la figura 12 en los ciclos iniciales es una imagen especular a escala de la representación de la temperatura frente al tiempo. A medida que se acumula el producto, la fluorescencia se incrementa en todas las temperaturas con producto de doble cadena. Sin embargo, a temperaturas de desnaturalización, la fluorescencia vuelve a la línea base ya que sólo hay presente ADN de cadena única.

La proyección de la fluorescencia frente a la temperatura de colorantes para doble cadena mostrada en la figura 12 elimina el eje del tiempo y muestra la dependencia con la temperatura del estado de la cadena durante la amplificación del ADN. La proyección de la fluorescencia frente a la temperatura mostrada en la figura 12 es para un fragmento de 180 pares de bases de ADN de virus de hepatitis B.

La proyección de la fluorescencia frente a la temperatura mostrada en la figura 13 es para un fragmento de 536 pares de bases de ADN de \beta-globina humana. Los ciclos iniciales representados en la figura 13 aparecen idénticos, con un incremento no lineal en la fluorescencia a temperaturas inferiores. A medida que avanza la amplificación, los últimos ciclos aparecen como bucles ascendentes entre las temperaturas de hibridación y desnaturalización que muestran una histéresis significativa. Es decir, la fluorescencia observada durante el calentamiento es superior a la del enfriamiento. A medida que se calienta la muestra, la fluorescencia es elevada hasta que tiene lugar la desnaturalización (aparece como una disminución brusca de la en fluorescencia). A medida que la muestra se enfría desde la temperatura de desnaturalización hasta la de hibridación, la señal de la doble cadena se incrementa rápidamente. La fluorescencia continúa aumentando durante la extensión mientras que la temperatura se mantiene constante.

Cuando se monitorizan múltiples muestras una vez por ciclo con SYBR® Green I e puede distinguir un intervalo de 10^{7}-10^{9} de concentración inicial de plantilla, tal como se representa en la figura 14. Cuando los datos se normalizan como el porcentaje de fluorescencia máxima de cada tubo capilar para muestras (320), cien copias iniciales están claramente separadas de diez copias. Sin embargo, la diferencia entre una y diez copias es marginal, y no se observa diferencia entre cero y una copia promedio por tubo capilar para muestras (320).

En cambio, las sondas específicas de secuencia tienen un intervalo dinámico similar pero, tal como se muestra en la representación de la figura 15, parecen discriminar incluso una única copia inicial de plantilla a partir de los controles negativos. La generación de señal con sondas de 5'-exonucleasa depende no sólo de la síntesis del ADN, sino que requiere la hibridación y la hidrólisis entre los fluoróforos de la sonda doblemente marcada. Esta hidrólisis reduce la desactivación (quenching) y aumenta la proporción de la emisión de fluorescencia de fluoresceína con respecto a rodamina. Mientras la fluorescencia de los colorantes de doble cadena se estabiliza con un ciclado en exceso, la señal de las sondas de exonucleasa se continúa incrementando con cada ciclo. Aunque no se sintetice producto neto, la hibridación e hidrólisis de la sonda continúan teniendo lugar. A medida que el número de copias de la plantilla disminuye por debajo de 10^{3}, la intensidad de la señal disminuye, pero aún se puede cuantificar el bajo número de copias ya que la señal de control negativa es estable.

Las representaciones de fluorescencia frente a temperatura de sondas de 5'-exonucleasa confirman que la hidrólisis de la sonda es el mecanismo de la generación de señal. En la figura 16, se muestra una representación de la fluorescencia frente a la temperatura de un ciclado de dos temperaturas con la sonda de la exonucleasa de \beta-actina. En cada ciclo la proporción de fluorescencia varía linealmente con la temperatura y si existe histéresis es en poca cantidad. La señal se incrementa en cada ciclo durante la fase de hibridación/extensión cuando se supone que tiene lugar la hidrólisis de la sonda. A pesar de que la fluorescencia de la fluoresceína y la rodamina disminuye con el aumento de la temperatura (datos no mostrados), la velocidad de cambio es mayor para la rodamina, dando lugar a una proporción ascendente con una temperatura ascendente. Los efectos de hibridación dependientes de la temperatura no son evidentes con la sonda de 5'-exonucleasa. La figura 16A muestra una representación de la proporción de fluorescencia frente al número de ciclos para un número de copias diferentes iniciales de plantilla, según la leyenda de la figura 16.

En cambio, cuando la señal de fluorescencia depende sólo de la hibridación, las representaciones de la proporción de fluorescencia frente a la temperatura muestran un patrón diferente con una histéresis obvia durante un ciclado de dos temperaturas, tal como se representa en la figura 17. Están presentes dos sondas de hibridación adyacentes, una sonda en dirección 5' marcada en 3' con fluoresceína y una sonda en dirección 3' marcada en 5' con Cy5^{TM}. Las sondas están separadas por el espacio de una pareja de bases. Durante la fase de hibridación/extensión, las sondas se hibridan al producto acumulado y la proporción de fluorescencia de Cy5^{TM} con respecto a fluoresceína aumenta. Durante el calentamiento hasta las temperaturas de desnaturalización del producto, parece que las sondas se disocian entre 65 y 75ºC, volviendo la proporción de fluorescencia a los niveles base. El cambio de la proporción de fluorescencia durante la hibridación es grande debido al incremento en la fluorescencia del Cy5^{TM} de la transferencia de energía por resonancia.

A partir de la discusión anterior, se entenderá que la monitorización de la fluorescencia durante la amplificación de ADN en una técnica analítica extraordinariamente potente. Utilizando el aparato eficaz en la producción y el coste para proporcionar una monitorización en tiempo real, se puede conseguir una detección y cuantificación específica de secuencia de cinco a veinte minutos, dependiendo del número de copias iniciales de plantilla presentes. Como indicadores genéricos de amplificación se pueden utilizar colorantes específicos de doble cadena, tales como el bromuro de etidio o SYBR® Green I. En muchas aplicaciones se prefiere el SYBR® Green I sobre el bromuro de etidio ya que tiene un máximo de excitación cerca de la fluoresceína y frecuentemente proporciona una señal más intensa con ADN que la excitación en el visible del bromuro de etidio. Los colorantes de doble cadena dependen de la especificidad inherente en los cebadores de amplificación. Tal como se entenderá por los técnicos en la materia, la amplificación no específica con números de ciclos elevados puede limitar la sensibilidad de detección hasta, aproximadamente, cien copias iniciales de plantilla (ver figura 14), mientras que la presente invención puede proporcionar mejoras adicionales en la especificad de la amplificación que podría mejorar adicionalmente su rendimiento.

Cuando se necesita detectar y cuantificar números de copias bajos, se puede proporcionar una especificidad adicional mediante sondas fluorescentes que requieren hibridación para la generación de la señal. La división de una sonda de exonucleasa doblemente marcada es una técnica [véase Lee, L.G., C.R. Connell y W. Bloch 1993, "Allelic discrimination by nick-translation PCR with fluorogenic probes" ("Discriminación alélica por PCR de traslación por muescas con sondas fluorogénicas"), Nucl. Acids. Res. 21, 3761-3766 y Livak. K.J., S.J.A. Flood, J. Marmaro, W. Giusti y K. Deetz, 1995, "Oligonucleotides with fluorescent dyes at opposite ends provide a quenched probe system useful for detecting PCR product and nucleic acid hybridization" ("Oligonucleótidos con colorantes fluorescentes en extremos opuestos proporcionan un sistema de sondas de desactivación adecuado para detectar el producto de PCR y la hibridación de ácidos nucleicos"), PCR Meth. Appl. 4, 357-362) que parece capaz de distinguir una única copia de plantilla de un control negativo (ver figura 15). A pesar de que la señal final de fluorescencia disminuye cuando se amplifican números de copias bajos (presumiblemente debido a la disminución de la eficacia de la amplificación), la cuantificación entre cero y cien copias parece posible. La señal generada por las sondas de exonucleasa es acumulativa y sólo está relacionada indirectamente con la concentración del producto. Por lo tanto, la señal de fluorescencia continúa incrementándose incluso después de que la cantidad de producto haya alcanzado una zona de plateau. Para una cuantificación absoluta serían necesarios patrones apropiados para controlar la eficacia de la amplificación y la división.

El diseño, síntesis, y purificación de las sondas de 5'-exonucleasa requieren atención. La hibridación es una condición necesaria, aunque no suficiente, para la señal derivada de la exonucleasa; todas las sondas no se dividen de forma eficaz. Véase B. Lee, L.G., C.R. Connell y W. Bloch, 1993, "Allelic discrimination by nick-translation PCR with fluorogenic probes" (Discriminación alélica por PCR de traslación de muescas con sondas fluorogénicas''), Nucl. Acids Res. 21:3761-3766, y Livak, K.J., S.J.A. Flood, J. Marmaro, W. Giusti y K. Deltz, 1995, "Oligonucleotides with fluorescent dyes at opposite ends provide a quenched probe system useful for detecting PCR product and nucleic acid hybridization" ("Oligonucleótidos con colorantes fluorescentes en extremos opuestos proporcionan un sistema de sondas de desactivación adecuado para detectar el producto de PCR y la hibridación de ácidos nucleicos"), PCR Meth. Appl. 4, 357-362, ambas incorporadas en la presente invención mediante referencia. La síntesis de las sondas doblemente marcadas implica la adición manual del marcaje de rodamina, normalmente seguida de una cromatografía líquida de alta presión en fase inversa.

En lugar de depender de la hidrólisis de una sonda doblemente marcada, la hibridación se puede detectar directamente a través de la transferencia de energía por resonancia, tal como se describe por Morrison. Véase Morrison, L.E., 1992, "Detection of energy transfer and fluorescence quenching", ("Detección de la transferencia de energía y la desactivación de la fluorescencia"), p. 311-352, en L.J. Kricks (Ed.), "Nonisotopic DNA probe techniques" ("Técnicas con sondas de ADN no isotópicas"), Academic Press, San Diego. Utilizando 2 sondas adyacentes marcadas separadamente con fluoresceína y Cy5^{TM}, la transferencia de energía a Cy5^{TM} aumenta con la acumulación del producto en cada ciclo de amplificación (figura 17). A diferencia de las sondas de exonucleasa, la síntesis de la sonda es relativamente sencilla ya que las amiditas para la fluoresceína y la Cy5^{TM} están disponibles para la incorporación directa durante la síntesis automatizada. La técnica anterior no da a conocer la utilización de fluoresceína y Cy5^{TM} como una pareja para la transferencia de energía por resonancia. A pesar de que el solapamiento espectral es pequeño, el coeficiente de absorción molar y las longitudes onda de absorción de la Cy5^{TM} son elevados comparados con la rodamina. Los tres factores (solapamiento, absortividad, y longitud de onda) contribuyen a la integral de solapamiento que determina las velocidades de transferencia de energía. La Cy5^{TM} también tiene una absorbancia baja a las longitudes onda de excitación de la fluoresceína, reduciendo la excitación directa del aceptor.

El análisis de punto final convencional de la amplificación de ADN mediante electroforesis en gel identifica el tamaño del producto y estima la pureza. Sin embargo, debido a que la amplificación es inicialmente estocástica, luego exponencial, y finalmente estagnante, la utilidad del análisis del punto final es limitada para la cuantificación. La monitorización ciclo por ciclo proporcionada por la presente invención permite una cuantificación relativamente sencilla y la monitorización de la fluorescencia en tubo cerrado tiene ventajas adicionales tal como se entenderá por los técnicos en la materia.

A diferencia del análisis de punto final y del ciclo por ciclo, la presente invención también puede monitorizar la fluorescencia a través de cada ciclo de temperaturas. Tal como se ha descrito previamente, la monitorización continua de la fluorescencia con colorantes específicos de doble cadena se puede utilizar para controlar los parámetros del ciclado de temperaturas. La amplificación se puede detener después de sintetizar una cierta cantidad de producto, evitando la sobreamplificación de plantillas alternativas. La fase de extensión de cada ciclo solamente necesita continuidad siempre y cuando aumente la fluorescencia. La desnaturalización del producto se puede asegurar en tiempo real, incrementando la temperatura hasta que la fluorescencia alcance la línea base. La limitación del tiempo de exposición del producto a las temperaturas de desnaturalización es especialmente útil para la amplificación de productos
largos.

Los usos adicionales de la monitorización continua con colorantes fluorescentes están dentro del alcance de la presente invención. Por ejemplo, con un control preciso de la temperatura y con colorantes específicos de doble cadena, la pureza del producto se podría estimar mediante curvas de fusión. Con un control rápido de la temperatura, se podría determinar la concentración absoluta del producto mediante una cinética de rehibridación. Los únicos requerimientos son la capacidad de producir fluorescencia, la efectividad de cambiar rápidamente las temperaturas, y una homogeneidad estricta de la temperatura en el interior de la muestra. La proporción elevada del área superficial con respecto al volumen de los tubos capilares para muestras, combinada con la facilidad de mezclado de aire, permite un control preciso de la temperatura de la muestra a una velocidad que no es posible con otros diseños. Por ejemplo, las representaciones de la temperatura de la muestra frente al tiempo en tubos capilares muestran picos estrechos en las temperaturas de desnaturalización e hibridación, mientras que se necesitan varios segundos para que toda la muestra alcance el equilibrio en los tubos de plástico cónicos utilizados en la técnica anterior. Sin embargo, a pesar de que son posibles proporciones elevadas del área superficial con respecto al volumen en chips de silicio grabado o de vidrio, tiempos de ciclos descritos aún se pueden aproximar a los conseguidos mediante la presente invención utilizando tubos capilares para muestras y es difícil conseguir una homogeneidad de la temperatura sobre la amplia superficie del chip expuesta a la muestra.

Utilizando la presente invención, son perceptibles muchos aspectos de la amplificación de ADN que hasta el momento se conocían un poco. Por ejemplo, la desnaturalización del producto tiene lugar en menos de un segundo, aunque la técnica anterior requiere de diez segundos a un minuto para la desnaturalización. La observación de la fusión del producto mediante la monitorización de la fluorescencia en tiempo real con colorantes de doble cadena, según la presente invención (ver figuras 12 y 13), muestra que la utilización de tiempos más cortos para la desnaturalización es eficaz. Como otro ejemplo, se han propuesto muchas causas del conocido "efecto plateau", pero hay muy pocos datos disponibles para distinguir entre las diferentes alternativas. Tal como se muestra en la figura 13, la rehibridación del producto es muy rápida. De hecho, durante los últimos ciclos de la amplificación, la mayoría del producto se rehibrida en cada ciclo durante el enfriamiento antes de alcanzar la temperatura de hibridación del cebador. Esto tiene lugar con velocidades de enfriamiento de 5-10ºC/segundo realizadas mediante la presente invención. En la rehibridación del producto con cicladores de temperatura más lentos de la técnica anterior, este efecto indeseable es mayor. La rehibridación del producto parece ser la principal, y quizás la única, causa del "efecto plateau".

Monitorización de la fluorescencia de PCR de ciclado rápido para la cuantificación utilizando monitorización de ciclo por ciclo

En la técnica anterior, el análisis de los productos de la PCR se realiza habitualmente después de completar la amplificación. Cuando se utiliza para la PCR cuantitativa, dichos métodos de punto final requieren buenas estimaciones de la concentración de la plantilla inicial para resultados precisos. Se ha mostrado la monitorización de la fluorescencia de una muestra de PCR para PCR cuantitativa con bromuro de etidio. La presente invención proporciona la ventaja de monitorizar la fluorescencia de una muestra de PCR, como mínimo, en cada ciclo. La fluorescencia se obtiene habitualmente una vez por ciclo durante una fase combinada de hibridación/extensión. La fluorescencia del bromuro de etidio se potencia cuando se intercala en el ADNbc y es una medida de la concentración de producto. La monitorización de una cantidad de producto una vez por ciclo con colorantes de ADNbc es un avance importante de la presente invención que permite analizar un intervalo dinámico amplio de concentraciones de la plantilla inicial.

Según un aspecto de la presente invención, se prefiere utilizar colorantes específicos de ADN de doble cadena. Por ejemplo, el SYBR® Green I es un colorante sensible preferido para el seguimiento de la acumulación de producto de la PCR. En la figura 18, es posible la cuantificación del número de copias iniciales de la plantilla sobre un intervalo de ciento ocho veces. En la figura 18, las curvas de fluorescencia están desplazadas horizontalmente según la concentración de la plantilla inicial. Tal como se representa en la gráfica de la figura 18, la sensibilidad es limitada a concentraciones bajas de la plantilla inicial ya que la especificidad de la amplificación no es perfecta. Cuando no está presente ninguna plantilla, los productos no deseados, tales como dímeros de cebadores, finalmente se amplifican. De este modo, existe una pequeña diferencia entre 0, 1, y 10 copias promedio de la plantilla inicial.

A pesar de que la cuantificación de números de copias muy bajos no se había conseguido previamente con colorantes de ADNbc, la presente invención puede utilizar dichos colorantes, lo cual es ventajoso debido, entre otras cosas, a la simplicidad de la utilización de estos colorantes. Los colorantes de ADNbc se pueden utilizar para cualquier amplificación y los oligonucleótidos habituales marcados de forma fluorescente no son necesarios cuando se utilizan dichos colorantes. La cuantificación de números de copias muy bajos con colorantes de ADNbc requiere una especificidad de amplificación muy buena o, tal como se proporciona mediante la presente invención, pretende diferenciar el producto deseado de la amplificación no específica.

Aún en referencia a la figura 18, se proporciona una representación de la fluorescencia frente al número de ciclos de una amplificación de ADN monitorizada con el colorante de ADNbc SYBR® Green I. La representación de la figura 18 se obtuvo utilizando un fragmento de 536 pares de bases del gen de la \beta-globina humana que se amplificó de 0 a 10^{9} copias de plantilla promedio en presencia de una dilución 1:10.000 de SYBR® Green I. El ADN plantilla purificado se obtuvo mediante amplificación por PCR, extracción con fenol/cloroformo, precipitación en etanol, y ultrafiltración (Centricon 30 disponible en Amicon de Danvers, Massachusetts) y se cuantificó por absorbancia a 260 nm. Cada ciclo de temperaturas duró 28 segundos (máximo de 95ºC, mínimo de 61ºC, 15 segundos a 72ºC, velocidad promedio entre temperaturas de 5,2ºC/segundo). Todas las muestras se amplificaron simultáneamente y se monitorizaron durante 100 milisegundos entre los segundos 5 y 10 de la fase de extensión. La visualización se actualizó en cada ciclo para todas las muestras y se completaron cuarenta y cinco ciclos en 21 minutos. Los datos para cada tubo capilar para muestras se normalizaron hasta un porcentaje de la diferencia entre los valores mínimos y máximos para cada tubo (representado por el eje Y en la figura 18).

Según otro aspecto de la presente invención, también se proporciona la monitorización de la fluorescencia específica de secuencia. La detección específica de secuencia de los productos de la PCR se obtiene por la presente invención mediante la inclusión de dos fluoróforos diferentes en sondas de oligonucleótidos. En la presente invención existen dos disposiciones preferidas, tal como se representa en las figuras 19A-D. Ambas disposiciones requieren un dador con un espectro de emisión que se solape con el espectro de absorbancia de un aceptor.

Las figuras 19 A-D representan dos disposiciones preferidas diferentes para la monitorización de la fluorescencia específica de secuencia durante la PCR. La figura 19A muestra un dador (D) que está inicialmente desactivado por un aceptor (A), ya que ambos están juntos en una única sonda de oligonucleótidos. Después de la hidrólisis mediante la actividad de la polimerasa 5'-exonucleasa, el dador y el aceptor están separados y la fluorescencia del dador aumenta (figura 19B). En la disposición mostrada en la figura 19C, el dador está en una sonda y el aceptor está en uno de los cebadores. Los colorantes en la sonda y el cebador se aproximan mediante hibridación. Esto da lugar a una transferencia de energía por resonancia al aceptor, incrementando la fluorescencia del aceptor (figura 19D).

Si el dador y el aceptor se sintetizan en el mismo oligonucleótido, el colorante aceptor desactiva la fluorescencia del dador debido a su proximidad (figura 19A). Durante el ciclado de temperaturas, algunas de las sondas se hibridan a un producto de PCR de cadena única y se puede hidrolizar por la polimerasa 5'-exonucleasa. Dado que el dador y el aceptor no se encuentran ya unidos, el dador se libera de la desactivación del aceptor y aumenta la fluorescencia del dador. Dado que la señal de fluorescencia depende de la hidrólisis de la sonda en lugar de la hibridación, esta clase de sondas se refiere en la presente invención como sondas de "hidrólisis".

Según la disposición representada en las figuras 19C&D, es posible un esquema de fluorescencia diferente si el dador y el aceptor se colocan en diferentes oligonucleótidos. En las figuras 19C&D, el dador se coloca en el extremo 3' de una sonda y un cebador se marca con el aceptor. Existe una mínima interacción entre los colorantes ya que están en oligonucleótidos diferentes. Durante el ciclado de temperaturas, la sonda se hibrida próxima al cebador marcado tiene lugar la transferencia de energía por resonancia. Dado que la señal de fluorescencia depende de la hibridación de la sonda, esta clase de sondas se refiere en la presente invención como sondas de "hibridación".

Tanto si la fluorescencia del dador está simplemente desactivada o realmente incrementa la fluorescencia del aceptor depende de los fluoróforos específicos y las condiciones del disolvente. Habitualmente se observa un incremento en la fluorescencia del dador durante la PCR con sondas de hidrólisis, mientras que un incremento en la fluorescencia del aceptor se monitoriza habitualmente con sondas de hibridación.

A continuación se proporcionarán información y datos adicionales sobre las sondas de hidrólisis. A diferencia de los colorantes de ADNbc, las sondas específicas de secuencia pueden cuantificar números de copias iniciales de plantilla muy bajos, tal como se representa en la figura 20. Tal como se entenderá a partir de la información descrita en la presente, se puede distinguir una copia única de plantilla de la ausencia de plantilla. La eficacia de la amplificación disminuye a medida que el número de copias iniciales disminuye por debajo de 1500. De forma significativa, la señal de fluorescencia continúa incrementándose incluso después de muchos ciclos a causa de que la hidrólisis es acumulativa y no está relacionada estrictamente con la concentración del producto.

Aún en referencia a la figura 20, se representa un gráfico de la proporción de fluorescencia (fluoresceína/rodamina) frente al número de ciclos de la amplificación de ADN monitorizada con una sonda de hidrólisis doblemente marcada. Las líneas delgadas indican la parte logarítmico-lineal de cada curva. Un fragmento de 280 pares de bases del gen de la \beta-actina humana se amplificó de 0,15 a 15000 copias (promedio) de ADN genómico humano por tubo. La sonda de hidrólisis que se utilizó (incluida a 0,2 \muM) está disponible en Perkin Elmer de Foster City, California. Cada ciclo de temperaturas duró 26 segundos (máximo de 94ºC, 15 segundos a 60ºC, velocidad promedio entre temperaturas de 6,2ºC/segundo). Todas las muestras se amplificaron simultáneamente y se monitorizaron durante 100 milisegundos entre los segundos 5 y 10 de la fase de hibridación/extensión. La visualización se actualizó en cada ciclo para todos los tubos y se completaron 45 ciclos en menos de 20 minutos.

A continuación se proporcionarán información y datos adicionales sobre las sondas de hibridación. A diferencia de las sondas de hidrólisis, la señal de fluorescencia de las sondas de hibridación no es acumulativa y se desarrolla de nuevo durante cada fase de hibridación. La fluorescencia es una medida directa de la concentración de producto ya que la hibridación es una reacción de pseudo-primer orden (véase Young B. y Anderson M., (1985), "Quantitative analysis of solution hybridization" ("Análisis cuantitativo de la hibridación de la solución"), en : "Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach" ("Hibridación de los ácidos nucleicos: aproximación práctica"), Hames, B., Higgins S., eds, pp.47-71, Washington D.C. IRL Press). Debido a que la concentración de la sonda es mucho mayor que la del producto, la fracción de producto hibridizado a la sonda es independiente de la concentración del producto.

Las señales de fluorescencia de SYBR® Green I, las sondas de hidrólisis, y las sondas de hibridación se comparan directamente en las figuras 21A-D. Todas las sondas tienen casi la misma sensibilidad con una fluorescencia detectable que tiene lugar alrededor del ciclo 20. Con una amplificación extendida, la señal continúa incrementándose con la sonda de hidrólisis, se nivela con SYBR® Green I, y desciende ligeramente con la sonda de hibridación. La señal decreciente después de 35 ciclos con las sondas de hibridación puede estar provocada por la hidrólisis de las sondas a partir de la actividad de la polimerasa exonucleasa. A pesar de que el cambio en la proporción de la fluorescencia de la sonda de hidrólisis es mayor que la de la sonda de hibridación (figuras 21B y 21C), el coeficiente de variación de la fluorescencia de las sondas de hidrólisis es mayor (figura 21D). Es decir, la fluorescencia resultante de la sonda de hibridación es más precisa que la sonda de hidrólisis, incluso cuando los niveles de señal absoluta son inferiores.

Las figuras 21A-D proporcionan comparaciones de tres técnicas de monitorización de la fluorescencia para PCR. Las sondas para la fluorescencia son el colorante de ADNbc SYBR® Green I (figura 21A), una sonda de hidrólisis de fluoresceína/rodamina doblemente marcada (figura 21B), y una sonda de hibridación marcada con fluoresceína con un cebador marcado con Cy5 (figura 21C). Todas las amplificaciones se llevaron a cabo en diez réplicas con 15.000 copias de plantilla (50 ng de ADN genómico humano/10 \mul). Los ciclos de temperatura duraron 31 segundos (máximo de 94ºC, 60ºC durante 20 segundos, velocidad promedio entre temperaturas de 6,2ºC/s). La fluorescencia se obtuvo para cada muestra entre los segundos 15 y 20 de la fase de hibridación/extensión. La desviación estándar media +/- está dibujada para cada punto. El SYBR® Green I se utilizó en una dilución de 1:10.000 en la amplificación de un fragmento de 205 pares de bases de \beta-globina humana a partir de los cebadores KM29 y PC04. La sonda de hidrólisis y las condiciones son las representadas en la figura 20. La sonda de hibridación, TCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAG-fluoresceína (SEQ ID No: 5) (de fluoresceína-CPG disponible en Glen Research de Sterling, Virginia) se utilizó con KM29 y el cebador marcado con Cy5 CAACTTCATCCACGTNCACC (SEQ ID No: 6), en la que N era el C6dT modificador de amino (Glen Research) marcado con Cy5 (Mono Reactive disponible en Amersham de Arlington Heights, Illinois). La precisión de las tres técnicas de monitorización de la fluorescencia se comparan en la figura 21D. Los datos están representados como el coeficiente de variación (desviación estándar/media) de la proporción de fluorescencia sobre la línea base (tomada como el promedio de los ciclos 11-15).

A continuación se describirán los algoritmos para la cuantificación que utilizan la monitorización de ciclo por ciclo. A pesar de que la información cuantitativa sobre las concentraciones de la plantilla inicial está contenida en los ajustes de las curvas de fluorescencia, tales como las representadas en las figuras 18 y 20, los técnicos en la materia no entenderán fácilmente cuál es la mejor manera de extraer esta información cuantitativa. En referencia a la figura 22, en la misma se muestran curvas para la amplificación de 10^{4} y 10^{9} copias de plantilla purificada (tomadas de la figura 18) comparadas con la amplificación de 50 ng de ADN genómico. La revisión de los datos proporcionados en la presente informa a un técnico en la materia que el ADN genómico contiene ligeramente más de 10^{4} copias de la diana, pero no cuántas copias más. Según la presente invención, se puede determinar el número de copias.

En referencia a la figura 22, se proporcionan representaciones que comparan métodos de interpolación para la cuantificación de las curvas de fluorescencia de la PCR. En la figura 22 se ilustra una interpolación de punto final que compara la fluorescencia de muestras desconocidas y patrones en un número de ciclos determinados. En la figura 22 también se ilustra la interpolación umbral que determina el número de ciclos en el que cada curva supera un determinado valor de fluorescencia.

Según la presente invención, se describen dos métodos preferentes para la interpolación de los datos. Un método preferido es la interpolación de curvas completas, intentando utilizar todos los puntos de los datos relevantes. Este método de aproximación para el ajuste de curvas proporciona los resultados más precisos. Otro método preferente es la interpolación de las muestras desconocidas a lo largo de líneas únicas verticales u horizontales. La interpolación única vertical es similar al método de análisis de punto final convencional. En un cierto número de ciclos, la fluorescencia desconocida se interpola entre valores conocidos. A continuación, se proporciona en la Tabla 1 una lista que resulta de la interpolación vertical de los ciclos 20-24. La interpolación a lo largo de líneas horizontales requiere el establecimiento de un umbral de fluorescencia. La interpolación de los umbrales de 10, 20, 30 y 40% también se enumeran en la Tabla 1.

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TABLA 1

Métodos de interpolación de línea única para la cuantificación de la fluorescencia (ver figura 22)
Punto final	Umbral
Ciclo	Copias	Fluorescencia (%)	Copias
20	41.000	- - -	- - -
21	12.000	10	17.000
22	12.000	20	14.000
23	13.000	30	15.000
24	14.000	40	18.000
Promedio	18.000	Promedio	16.000

Tal como se entenderá, las interpolaciones de punto final o umbral no utilizan muchos de los datos disponibles y pueden estar seriamente afectadas por puntos de datos aberrantes individuales, por ejemplo, la interpolación de punto final en el ciclo 20. La presente invención proporciona un método mejorado que implica curvas de interpolación que ajustan bien los datos. Por ejemplo, un ajuste exponencial para datos dentro de una parte logarítmico-lineal de cada curva debería seguir: F=AN(1 + E)^{n}, en la que F es la señal de fluorescencia, A es un factor de escalado de la fluorescencia, N es el número de copias inicial, E es la eficacia de la amplificación, y n es el número de ciclos. A y E se podrían determinar primero para valores de N que agrupan el desconocido. A continuación, se podría determinar el valor óptimo de N para el desconocido. Utilizando esta aproximación, el número de copias del gen en 50 ng de ADN genómico es 1,7 x 10^{4}, próximo al valor medio de los valores en la Tabla 1 y cercano al valor aceptado de 1,5 x 10^{4}. Otra curva se ajusta incluso mejor que el ejemplo exponencial descrito anteriormente. El ajuste exponencial depende necesariamente sólo de los ciclos logarítmico-lineales (7 de 45) y estos caen en una región en la que la precisión de la fluorescencia es escasa (figura 21D).

Además, según la presente invención, se utiliza una curva sigmoidal que incluye parámetros que describen la fase lag, la fase logarítmico-lineal, y la fase plateau, utilizando, de este modo, todos los datos disponibles. El ajuste se pondera para reflejar la precisión esperada de los puntos de los datos. Son necesarios diferentes parámetros para sondas de fluorescencia diferentes debido a la variación en las formas de las curvas (figuras 21A-D).

A continuación se describirá la característica de monitorización continua de la presente invención, es decir, la monitorización durante muchas veces dentro de cada ciclo de la PCR. Aunque la monitorización de la fluorescencia durante la PCR se puede realizar una vez para cada ciclo a una temperatura constante, la presente invención proporciona la ventaja importante de proporcionar una monitorización continua a lo largo del ciclo de la PCR. La temperatura es importante ya que la fluorescencia cambia en función de la temperatura. Sin embargo, según la presente invención, la monitorización de la fluorescencia durante los cambios de temperatura es muy informativa. Por ejemplo, si la fluorescencia se obtiene de forma continua a lo largo del ciclado de temperaturas, las sondas de hidrólisis muestran un cambio lineal en la proporción de la fluorescencia con la temperatura y un incremento paralelo en la fluorescencia a medida que se hidrolizan más sondas (ver figura 23A). En cambio, la proporción de la fluorescencia de las sondas de hibridación varía radicalmente con la temperatura (ver figura 23B). Durante la hibridación de las sondas a temperaturas bajas, la proporción se incrementa, seguido por un descenso hasta la línea base cuando la sonda de hibridación se funde en la plantilla.

La dependencia con la temperatura del estado de las cadenas del producto durante la PCR se observa en las representaciones de fluorescencia frente a la temperatura utilizando SYBR® Green I, tal como se muestra en la figura 24. A medida que avanza la amplificación, los ciclos de temperaturas aparecen como bucles ascendentes entre las temperaturas de hibridación y desnaturalización. A medida que se calienta la muestra, la fluorescencia es elevada hasta que tiene lugar la desnaturalización. A medida que se enfría la muestra, se incrementa la fluorescencia, reflejando la rehibridación del producto. Cuando la temperatura durante la extensión es constante, el incremento de la fluorescencia se correlaciona con la síntesis adicional de ADN. La figura 24 proporciona una representación de la fluorescencia frente a la temperatura de la amplificación de ADN con el colorante de ADNbc SYBR® Green I. Se amplificó un fragmento de 536 pares de bases del gen de la \beta-globina humana a partir de 10^{6} copias de plantilla purificada y una dilución 1:30.000 de SYBR® Green I. Las otras condiciones son esencialmente las mismas que las descritas en relación a la figura 18. Se muestran los ciclos 15-25. Los datos de la fluorescencia frente a la temperatura se han transformado para eliminar el efecto de la temperatura sobre la fluorescencia.

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La capacidad de la presente invención para monitorizar la desnaturalización del producto y la rehibridación del producto conduce incluso a métodos adicionales para la cuantificación de ADN. Estos métodos adicionales de la presente invención para la cuantificación de ADN requieren la monitorización de la fluorescencia dentro de los ciclos individuales de temperatura y no se pueden utilizar cuando la fluorescencia sólo se obtiene una vez por ciclo. Por ejemplo, los productos de la PCR tienen curvas de fusión características que dependen de la proporción y longitud GC/AT del producto (ver figura 25). De forma significativa, utilizando algoritmos empíricos para predecir temperaturas de fusión, varios productos de PCR se deberían fundir sobre un intervalo de 50ºC. Dado que los productos no específicos fundirán de forma diferente al producto de PCR deseado, la fluorescencia del ADNbc se puede separar en componentes específicos y no específicos. La utilización de los métodos de la presente invención permite la cuantificación de números de copias muy bajos utilizando colorantes de ADNbc genéricos, tales como SYBR® Green I o bromuro de etidio. La figura 25 muestra las curvas de fusión de tres productos de PCR purificados. Los productos de PCR se purificaron y cuantificaron tal como se explica en relación con la figura 18. Se añadió una dilución 1:10.000 de SYBR® Green I a 50 ng de ADN en 10 ml de Tris 50 nM, pH 8,3, y MgCl_{2} 3 mM. La temperatura se incrementó hasta 0,2ºC/segundo y la fluorescencia se obtuvo y representó frente a la temperatura.

A continuación se explicará la característica de la presente invención de utilizar curvas de fusión para la cuantificación competitiva. Según la presente invención, una utilización adicional para curvas de fusión es la PCR cuantitativa competitiva. Estos métodos de la presente invención requieren una plantilla competitiva para la coamplificación con la plantilla original. Las plantillas de control se eligen de manera que difieran en la temperatura de fusión del amplicón natural. Se puede obtener un desplazamiento de la temperatura de fusión de 3ºC cambiando el porcentaje de GC del producto en un 7-8% (véase Wetmur, J., (1995), "Nucleic acid hybrids, formation and structures of" ("Hibridaciones, formación y estructuras de ácidos nucleicos"), en: Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, Meyers R., ed. pp. 605-608, Nueva York, VCH.

Un desplazamiento de 3ºC en la temperatura de fusión es suficiente para separar los componentes originales y competitivos de la curva de fusión del producto (ver figura 25). Estas curvas de fusión, obtenidas durante la amplificación, se diferencian en los picos de fusión (véase Hillen, W., Goodman T., Benight, A. Wartell R. Y Wells R., (1981), "High resolution experimental and theoretical thermal denaturation studies on small overlapping restriction fragments containing the Escherichia coli lactose genetic control region" ("Estudios de desnaturalización térmica experimentales y teóricos de alta resolución sobre fragmentos de restricción solapantes que contienen la región de control genético de la lactosa en Escherichia coli"), J. Biol. Chem. 256, 2761-2766, que se incorpora en la presente invención mediante referencia) y se utilizan para determinar las cantidades relativas de competidor y plantilla. Utilizando este método se debería eliminar la necesidad de analizar la muestra después del ciclado de temperaturas.

A continuación se describirá la cinética de hibridación para la cuantificación absoluta según la presente invención. La presente invención también permite la monitorización de la rehibridación producto-producto después de la desnaturalización y proporciona un método para la cuantificación absoluta y directa de ADN. Si la temperatura de la muestra disminuye rápidamente desde la temperatura de desnaturalización y se mantiene a una temperatura inferior, la velocidad de rehibridación del producto seguirá una cinética de segundo orden (véase Young, B. y Anderson, M., 1985, "Quantitative analysis of solution hybridization" ("Análisis cuantitativo de la hibridación de la solución"), en: "Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach" ("Hibridación de ácidos nucleicos: aproximación práctica"), Hames, B., Higgins, S. Eds., pp. 47-71, Washington, D.C., IRL Press.

Cuando se prueban diferentes concentraciones de ADN, la forma de la curva de rehibridación es característica de la concentración de ADN (ver figura 26). La figura 26 muestra las curvas de rehibridación para diferentes concentraciones de producto de la PCR. Se mezclaron diferentes cantidades de un fragmento purificado de 536 pares de bases de ADN (ver figura 18) con una dilución 1:30.000 de SYBR® Green I en 5 \mul de Tris 50 mM, pH 8,3, y MgCl_{2} 3 mM. Las muestras se desnaturalizaron a 94ºC y, a continuación, se enfriaron rápidamente hasta 85ºC. Para un producto de PCR y temperatura determinados, se puede medir una constante de velocidad de segundo orden. Una vez se conoce la constante de velocidad, se puede determinar una concentración de ADN desconocida a partir de los datos experimentales de rehibridación. En la figura 27 se muestra la determinación inicial de una constante de velocidad. El enfriamiento no es instantáneo, y parte de la rehibridación tiene lugar antes de alcanzar una temperatura constante. El enfriamiento rápido, que se puede llevar a cabo mediante el aparato de la presente invención, maximiza la cantidad de datos disponibles para la determinación de la constante de velocidad o la concentración de ADN. La figura 27 muestra la determinación de una constante de velocidad de rehibridación de segundo orden. La curva se ajustó mediante una regresión no lineal de mínimos cuadrados con F_{max}, F_{min}, t_{o} y k como los parámetros de flotación. Con la constante de velocidad (k) determinada, posteriormente se pueden determinar las concentraciones de ADN de muestras desconocidas.

Este método de la presente invención requiere producto de PCR puro, aunque esto se puede asegurar mediante las curvas de fusión obtenidas también durante el ciclado de temperaturas. El método de cuantificación por cinética de rehibridación de la presente invención es ventajosamente independiente de cualquier variación de señal entre tubos capilares para muestras.

Monitorización continua de PCR de ciclo rápido

De la descripción anterior, se entenderá que la presente invención consigue diversas ventajas no disponibles hasta la fecha en la técnica. Por ejemplo, la presente invención proporciona métodos de fluorescencia de color único para monitorizar la pureza del producto, cuantificar la plantilla, y detectar mutaciones durante la PCR. La presencia de ADN bicatenario (ADNbc) se puede seguir durante la PCR con colorantes fluorescentes. En cada ciclo, la fluorescencia disminuye cuando el ADNbc se desnaturaliza y se incrementa con la rehibridación del producto y la extensión del cebador. A pesar de que estos colorantes no son específicos de secuencia, la pureza del producto se puede evaluar mediante el análisis de la forma de las curvas de fusión de ADN. Los productos de PCR puros tienen transiciones de fusión estrechas, mientras que las impurezas se funden en un intervalo amplio de temperaturas.

La PCR cuantitativa competitiva requiere la diferenciación de un amplicón natural de un competidor. Las curvas de fusión se pueden utilizar para distinguir productos que tienen diferentes temperaturas de fusión. El número de copias iniciales de la plantilla se cuantificará mediante la amplificación competitiva con una plantilla artificial de control que difiere del amplicón natural en la temperatura de fusión.

Las curvas de fusión también se pueden utilizar para la detección de mutaciones durante la PCR. Los heterodúplex formados durante la amplificación de ADN heterocigótico fundido a temperaturas inferiores que los productos completamente complementarios. La capacidad para identificar deleciones y mutaciones de una única base se mostrará utilizando el análisis de las curvas de fusión.

La monitorización continua de la formación de ADNbc se utiliza para cuantificación absoluta y directa de ADN. Si el ADN desnaturalizado se enfría rápidamente y, a continuación, se mantiene a una temperatura de rehibridación constante, la concentración absoluta de ADN se determina mediante la velocidad de rehibridación.

La presente invención también proporciona métodos de fluorescencia de doble color que dependen de la hibridación de la sonda (no hidrólisis) para la detección específica de la secuencia durante la PCR. La cinética de hibridación y la fusión de las sondas de hibridación proporcionan información no disponible con sondas que dependen de la hidrólisis de la exonucleasa entre fluoróforos. El número de copias iniciales de la plantilla se cuantificará mediante la amplificación competitiva utilizando la temperatura de fusión de la sonda para discriminar entre plantillas. Las mutaciones de una única base se detectarán mediante los desplazamientos de la temperatura de fusión de la sonda. La determinación de la concentración absoluta de producto se muestra mediante el análisis de la cinética de hibridación de la sonda.

La retroalimentación de la fluorescencia se puede utilizar para el control en tiempo real y la optimización de la amplificación. La fluorescencia se utiliza para controlar el ciclado de temperaturas. Con una monitorización continua de colorantes específicos de ADNbc, la extensión finalizará en cada ciclo después de que se detenga el incremento de la fluorescencia. Las condiciones de la desnaturalización están controladas automáticamente por el incremento de la temperatura sólo hasta cuando el producto está completamente fundido. La hibridación del cebador se monitoriza con la transferencia de energía por resonancia a los oligonucleótidos marcados con Cy5. El ciclado de temperaturas finaliza automáticamente después de producir una cierta cantidad de producto.

Las ventajas del ciclado rápido de temperaturas están actualmente reconocidas por la comunidad científica. El ciclado rápido de temperaturas con tiempos de hibridación y desnaturalización mínimos mejora la PCR cuantitativa e incrementa la discriminación de la amplificación específica de alelos. El ciclado rápido para la secuenciación de los ciclos reduce la ambigüedad en la secuenciación y minimiza el "bandeo de sombras" en las amplificaciones repetitivas de dinucleótidos. Para PCR largas de hasta 35 kb, el rendimiento se mejora cuando la muestra está expuesta el mínimo de tiempo posible a temperaturas elevadas de desnaturalización.

Para una PCR es apropiado un paradigma cinético. En lugar de pensar en la PCR como tres reacciones (desnaturalización, hibridación, extensión) que tienen lugar a tres temperaturas diferentes, un paradigma cinético para la PCR puede ser más apropiado (figura 28). Con un paradigma cinético, la curva de la temperatura frente al tiempo consiste en transiciones continuas entre reacciones solapadas. Un análisis completo requeriría el conocimiento de todas las constantes de velocidad pertinentes sobre todas las temperaturas. Si se conocieran las constantes de velocidad de todas las reacciones, se podría desarrollar una "descripción físicoquímica de la PCR". La determinación de estas velocidades requeriría un control preciso de la temperatura de las muestras y estaría ayudada por la monitorización de la reacción durante el ciclado de temperaturas.

La presente invención también proporciona las ventajas que surgen de la monitorización continua de una muestra. La disposición de monitorizar la fluorescencia en cada ciclo para una PCR cuantitativa proporciona ventajas y funciona bien con bromuro de etidio. En una monitorización ciclo por ciclo, la fluorescencia se obtiene una vez por ciclo durante una fase combinada de hibridación/extensión y proporciona una medida relativa de la concentración de producto.

Según la presente invención, el tiempo, la temperatura y la fluorescencia de ADNbc se obtienen cada 200 ms y se pueden observar detalles finos de la desnaturalización e hibridación del producto durante el ciclado rápido de temperaturas. Estos detalles permiten la identificación del producto mediante las curvas de fusión, y proporcionan medios para la cuantificación relativa y absoluta del producto, la detección de mutaciones, y la retroalimentación inmediata para el control de temperaturas. Además de la monitorización continua, la fusión de las sondas específicas de secuencia se puede determinar mediante la transferencia de energía por resonancia. La fusión de las sondas tiene lugar a una temperatura característica que también se puede aprovechar para la cuantificación del producto y la detección de una mutación de una única base.

A continuación se describirá la aplicación de la presente invención a la PCR cuantitativa. Los métodos de la técnica anterior para la PCR cuantitativa son laboriosos y caros. La mayoría de métodos de la técnica anterior utilizan análisis de punto final y requieren buenas estimaciones iniciales para obtener resultados precisos. La monitorización de la fluorescencia de ADNbc una vez por ciclo con colorantes es un avance importante que permite un intervalo dinámico amplio de las concentraciones de la plantilla inicial a analizar. Sin embargo, la monitorización continua de la presente invención en los ciclos de temperaturas permite la verificación de la pureza del producto, la cuantificación relativa simultánea con un competidor, y la determinación de la concentración absoluta del producto. Toda esta información se puede obtener a partir de un tubo capilar para muestras con un indicador genérico de ADNbc dentro de los diez a veinte minutos de ciclado de temperaturas. También es posible la cuantificación basada en la especificidad de secuencia interna utilizando un análisis de dos colores y la transferencia de energía por resonancia.

A continuación se describirá la aplicación de la presente invención para la detección de mutaciones. El cribado de mutaciones en genes es un trabajo difícil. Los métodos de la técnica anterior (electroforesis en gel desnaturalizante en gradiente, electroforesis en gel de gradiente de temperatura, polimorfismo conformacional monocatenario, y secuenciación) requieren una amplificación por PCR seguida por una electroforesis y la posterior detección. Las curvas de fusión con colorantes de ADNbc pueden identificar mutaciones heterocigóticas que producen heterodúplex durante la PCR. El análisis tiene lugar durante la amplificación sin necesitar una manipulación o equipamiento de muestras extra. Por ejemplo, la detección de heterocigotos es importante en la valoración de la susceptibilidad genética en el cáncer de pulmón. Véase Shattuck-Eidens, D., M. McClure, J. Simard, P. Labrie, S. Narod, F. Couch, D. Hoskins, B. Wever, L. Castilla, M. Erdos, L. Brody, L. Friedman, E. Ostermeyer, C. Szabo, M.C. King, S. Jhanwar, X. Offit, L. Norton, T. Gelewski, M. Lubin, M. Osborne, D. Black, M. Boyd, S. Steel, S. Ingles, R. Haile, A. Lindblom, H. Olsson, A. Borg, D.T. Bishop, E. Solomon, P. Radice, G. Spatti, S. Gayther, B. Ponder, W. Warren, M. Stratton, Q. Liu, F. Fujimura, C. Lewis, M.H. Skolnick, D.E. Goldgar. "A collaborative survey of 80 mutations in the BRCA1 breast and ovarían cáncer susceptibility gene. Implications for presymptomatic testing and screening" ("Estudio colaborador de 80 mutaciones en el gen susceptible del cáncer mama y ovario BRCA1. Consecuencias para las pruebas y cribados presimtomáticos"), J. Amer. Med. Assoc. 273:535-541, 1995. La detección de las mutaciones por secuenciación de los genes BRCA1 y BRCA2 (> 10.000 bases) no es viable como prueba clínica. Los costes de las pruebas se podrían disminuir significativamente utilizando métodos de cribado de heterodúplex según la presente invención. Las mutaciones específicas también se pueden detectar con sondas específicas de secuencia a través de la transferencia de energía por resonancia durante la PCR.

A continuación se hará una descripción adicional de las sondas que se pueden utilizar de forma ventajosa según la presente invención. Las mejores sondas para la monitorización continua de PCR serían específicas y baratas. Los colorantes de ADN bicatenaria (ADNbc) se pueden utilizar en cualquier amplificación y son baratos. Por ejemplo, el SYBR® Green I cuesta generalmente 0,01 céntimos por 10 \mul de reacción. Además, la especificidad del producto se puede obtener mediante el análisis de las curvas de fusión. Sin embargo, cuando la especificidad de la secuencia es necesaria, se deben sintetizar sondas de oligonucleótidos fluorescentes para cada secuencia en estudio. Las sondas "TaqMan" impulsadas por Perkin Elmer incorporan dos fluoróforos en cada sonda. La fluorescencia se genera cuando la sonda es hidrolizada por la actividad de la polimerasa exonucleasa. Estas sondas son difíciles de fabricar y son caras de adquirir; su coste actual de fabricante es de 1.200 \textdollar para 0,1 \mumoles de una sonda normal. Para la cuantificación competitiva de una diana son necesarias dos sondas. En cambio, se pueden diseñar sondas de hibridación fluorescentes que no dependen de la hidrólisis. Estas sondas de hibridación solamente requieren un único fluoróforo por sonda y son mucho más fáciles de sintetizar. Dado que su fluorescencia resulta de la hibridación, y no de la hidrólisis, la dependencia con la temperatura de la fluorescencia de la sonda se puede utilizar para la detección y cuantificación de mutaciones.

Según la presente invención, se pueden utilizar sondas de polarización de la fluorescencia. Las sondas de polarización se sintetizaron como 30-mers con 5'-fluoresceína unidas por enlazadores amino de diferentes longitudes. Durante la PCR, se esperaba que la actividad de la 5'-exonucleasa de la polimerasa dividiera la sonda y disminuyera su polarización durante la amplificación. Las sondas intactas tenían una polarización de, aproximadamente, 90 unidades de minipolarización (mP) que disminuyeron hasta 35 mP cuando se hidrolizaron de forma amplia con fosfodiesterasa I. La figura 34 muestra los resultados obtenidos utilizando una sonda que se incluyó en 0,2 \muM en la amplificación de un único gen de copia con ADN genómico como plantilla. La polarización disminuyó entre 20 y 30 ciclos y continuó disminuyendo hasta, como mínimo, 50 ciclos. La disminución, expresada como la proporción de la fluorescencia paralela con respecto a la fluorescencia perpendicular, fue, aproximadamente, del 11%. La longitud del enlazador, el tipo de enlazadores amino y la presencia/ausencia de una cola 5' no complementaria no alteraron de forma significativa los cambios observados durante la PCR. La adición de sacarosa para incrementar la viscosidad de la solución aumentó la polarización de las sondas intactas e hidrolizadas, pero no cambió la diferencia de señal generada después de la amplificación.

En lugar de disminuir la polarización mediante la hidrólisis por la exonucleasa, la hibridación sin hidrólisis incrementa la polarización. Según la presente invención, se utilizó un ácido nucleico de un péptido de 15 mer marcado con fluoresceína. Debido a su esqueleto de amidas, no se puede hidrolizar mediante la actividad de la exonucleasa. Cuando se hibridizó hasta 10 veces en exceso de producto purificado de PCR de cadena única complementaria, su polarización sólo aumentó de 85 a 97 mP.

En resumen, las sondas marcadas con fluoresceína muestran cambios en la polarización cuando se hibridan o se hidrolizan. Estos cambios se pueden utilizar para monitorizar la PCR, pero los cambios son pequeños. La presente invención se puede utilizar en un método para incrementar la señal de polarización pequeña de hibridación para la amplificación del desplazamiento de cadena. Se utilizó una forma alterada genéticamente de la endonucleasa EcoRI sin actividad de escisión pero que retiene especificidad de unión para incrementar la polarización del complejo.

Según la presente invención, también se pueden utilizar sondas de transferencia de energía por resonancia. Las sondas de transferencia de energía por resonancia son superiores a las sondas de polarización para monitorizar la PCR debido a la mayor intensidad de señal. Los usos en la técnica anterior de la transferencia de energía por resonancia en la PCR se han limitado únicamente al análisis de punto final. Un diseño de una sonda depende de la hidrólisis por la exonucleasa para la generación de señal. Las sondas doblemente marcadas con fluoresceína/rodamina se dividen durante la extensión de la polimerasa por la actividad de la 5'-exonucleasa, separando los fluoróforos e incrementando la proporción de emisión de fluoresceína/rodamina. La figura 35 muestra los resultados de la fluorescencia de la PCR a partir de una sonda con cinco bases de separación entre los marcadores de fluoresceína y rodamina. La amplificación de cuarenta y cinco ciclos se completó en 20 minutos utilizando el ciclador rápido de temperaturas con detección de fluorescencia (300) de la figura 11. Monitorizando la proporción de fluorescencia una vez por ciclo, se puede distinguir un intervalo de 10 veces la concentración de la plantilla inicial. Las curvas de amplificación están desplazadas, aproximadamente, 3-4 ciclos por cada cambio de 10 veces en la concentración de plantilla inicial. A pesar de que la eficacia desciende cuando la concentración de plantilla inicial es baja, se puede distinguir una única copia de sin plantilla.

La señal generada por la monitorización de la hidrólisis es acumulativa y está relacionada sólo indirectamente con la concentración de producto. Por lo tanto, tal como se muestra en la figura 35, la proporción de fluorescencia continúa incrementándose incluso después de que una cantidad de producto alcance una fase plateau. Sin embargo, la señal de fluorescencia se correlacionaba bien con la cantidad de producto de PCR medida según la incorporación de ^{17}P-dATP, como mínimo, hasta la fase plateau.

La concentración de la sonda tiene un efecto muy pequeño sobre la sensibilidad tal como se muestra en la figura 36. Cambiando la concentración de la sonda en un factor de 40 sólo desplaza la curva, aproximadamente, 2 ciclos. Las concentraciones de sonda inferiores son ligeramente más sensibles, pero son también más variables debido a una intensidad de señal inferior. Los datos de la figura 36 están normalizados hasta la señal máxima a cada concentración de la sonda. A pesar de que un descenso en la concentración de la sonda proporcionaría una señal más grande para la misma cantidad de sonda hidrolizada, esta ventaja queda compensada por unas velocidades de hibridación inferiores. La velocidad de hibridación de la sonda a elegir como diana depende directamente de la concentración de la sonda.

La presente invención muestra que se pueden utilizar muchas sondas de hidrólisis diferentes, incluyendo las marcadas con colorantes de fluoresceína o bien, con rodamina, eosina o BODIPY (disponible en Molecular Probes). En general, a medida que disminuye el espacio entre fluoróforos, aumenta la desactivación y/o la transferencia de energía, pero disminuye la hidrólisis durante la PCR. Las sondas de transferencia de energía por resonancia que requieren hidrólisis tienen algunas características que se deben indicar. Una característica es que algunas sondas son resistentes a la hidrólisis. Otra característica es que la síntesis es difícil, necesitando la adición manual de, como mínimo, un marcador y cromatografía líquida de alta presión para la purificación.

El Cy5 es un colorante rojo que recientemente quedó disponible como una amidita para la incorporación directa en oligonucleótidos. Trabajar en la región roja/infrarroja del espectro es ventajoso cuando se eligen componentes ópticos. Se pueden utilizar diodos láser para la iluminación, los detectores de fotodiodos tienen una sensibilidad excelente, y la mayoría de materiales tienen una autofluorescencia mínima en la región espectral correspondiente. Con respecto a la presente invención, se ha desarrollado una sonda Cy5/Cy7. La amplificación fue detectable con esta sonda, aunque la señal era débil. Cuando la sonda se hidrolizó completamente con fosfodiesterasa, sólo se observó un incremento de dos veces en la señal. Tal como se representa en la figura 37, entre los ciclos 20 y 40 de la PCR, se observó un incremento de 1,3 veces en la señal. La síntesis de la sonda Cy5/Cy7 requirió la adición manual del Cy7.

Las sondas doblemente marcadas con fluoresceína y Cy5 se pueden fabricar fácilmente en sintetizadores automáticos de oligonucleótidos. Estas sondas de fluoresceína/Cy5 muestran unos cambios en la proporción de la fluorescencia excelentes cuando se hidrolizan completamente con fosfodiesterasa. Las longitudes de onda de emisión de la fluoresceína y Cy5 están bien separadas, y la transferencia de energía por resonancia tiene lugar de forma eficaz entre los fluoróforos tal como se muestra en la figura 38. A pesar de que el solapamiento espectral es pequeño, el coeficiente de absorción molar y las longitudes de onda de absorción del Cy5 son elevados. El solapamiento espectral, la absortividad del aceptor, y la longitud de onda del aceptor contribuyen todos a la integral de solapamiento que determina las velocidades de transferencia de energía. Dado que el Cy5 tiene una absorbancia baja en las longitudes de onda de excitación de la fluoresceína, la excitación directa de Cy5 también es mínima.

Las sondas de fluoresceína/Cy5 no se hidrolizaron de forma eficaz durante la PCR. Aunque un cambio de 200 veces en la proporción de la fluorescencia es posible con la hidrólisis completa, la sonda de fluoresceína/Cy5 preferida sólo produjo un incremento de 1,45 veces entre los ciclos 20 y 40 de la PCR (ver figura 37). Se sintetizaron varias sondas de fluoresceína/Cy5 con diferentes espaciados entre fluoróforos y con fluoresceína o bien, Cy5 en el extremo 5'. Todas produjeron señales débiles con la PCR. Algunos de los resultados con sondas de hidrólisis se resumen a continuación:

Generación de la señal de fluorescencia con sondas de hidrólisis por exonucleasa

	Incremento en la proporción de fluorescencia con:

Fluoróforos	Hidrólisis completa	Cuarenta ciclos de PCR
Fluoresceína	Rodamina	25 veces	8 veces
Fluoresceína	Cy5	200	1,45
Cy5	Cy7	2	1,3

La resistencia de los oligonucleótidos doblemente marcados de fluoresceína/Cy5 a la hidrólisis se volvió en una ventaja desarrollando los esquemas de transferencia de energía por resonancia que dependen de la hibridación de la sonda en lugar de la hidrólisis de la sonda. En lugar de hidrolizar una sonda doblemente marcada, la hibridación se puede detectar directamente mediante la transferencia de energía por resonancia durante la PCR. A diferencia de las sondas de exonucleasas doblemente marcadas, la síntesis de las sondas marcadas una vez es relativamente simple.

La viabilidad de la presente invención utilizando dos métodos diferentes para la detección de la transferencia de energía por resonancia de la hibridación durante la PCR se muestra en la figura 39. El primer método utiliza dos sondas de hibridación adyacentes, una marcada en 3' con fluoresceína y la otra marcada en 5' con cy5. A medida que el producto se acumula durante la PCR, las sondas se hibridan una junto a la otra durante el segmento de hibridación de cada ciclo. El segundo método utiliza un cebador marcado con Cy5 y una única sonda de hibridación. El cebador marcado se incorpora en el producto de PCR durante la amplificación y solamente es necesaria una única hibridación. En ambos métodos, la transferencia de energía por fluorescencia al Cy5 aumenta con la hibridación y está representada como una proporción de la fluorescencia del Cy5 con respecto a la fluorescencia de la fluoresceína. La fluorescencia se monitoriza una vez por ciclo en las proximidades del extremo de un segmento de hibridación/extensión a 2 temperaturas. La
sensibilidad de estas sondas de hibridación es similar a la de las sondas de hidrólisis (comparar las figuras 29 y 39).

La dependencia con la temperatura de la fluorescencia de las sondas de hibridación queda bien demostrada con las representaciones de fluorescencia frente a temperatura tal como se muestra en la figura 40. Estas representaciones están generadas por la monitorización de una única muestra cada 200 ms del ciclado de temperaturas. Durante la fase de hibridación/extensión, las sondas se hibridan a un producto monocatenario y la proporción de fluorescencia (Cy5/fluoresceína) aumenta. Durante el calentamiento hasta las temperaturas de desnaturalización del producto, las sondas se disocian alrededor de los 70-75ºC, volviendo la proporción de la fluorescencia hasta los niveles base. En cambio, las sondas de hidrólisis no muestran esta dependencia con la temperatura (ver figura 41). Tal como se esperaba, las representaciones de la fluorescencia frente a la temperatura con sondas de hidrólisis muestran solamente una dependencia lineal de la fluorescencia con la temperatura. La capacidad de monitorizar la hibridación con fluorescencia durante el ciclado de temperaturas es una potente herramienta. La temperatura de fusión de las sondas específicas de secuencia puede identificar y discriminar productos durante la PCR.

Los colorantes específicos de doble cadena también se pueden utilizar según varios aspectos de la presente invención. El estado de la cadena de los productos de la PCR se puede seguir mediante colorantes que producen fluorescencia en presencia de ADNbc. Cuando el SYBR® Green I está presente durante la amplificación, la fluorescencia se incrementa a medida que se produce más ADNbc. Sin embargo, el ciclado de temperaturas introduce un efecto confuso ya que la fluorescencia es inversamente proporcional a la temperatura, tal como se muestra en las figuras 42A y 42B. Cuando la fluorescencia se monitoriza de manera continua en función de la temperatura y el tiempo de la PCR, los datos forman una espiral tridimensional representada en la figura 12. Tal como se ha descrito anteriormente, la curva tridimensional representada en la figura 12 se puede proyectar en representaciones bidimensionales de temperatura frente a tiempo, fluorescencia frente a tiempo, y fluorescencia frente a temperatura. La proyección de la temperatura frente al tiempo de la figura 12 se repite en cada ciclo; su forma familiar se muestra más claramente en la base de la figura 42B. La proyección de la fluorescencia frente al tiempo de la figura 12 es una imagen especular escalada de la representación de la temperatura frente al tiempo en los ciclos iniciales mostrados en la figura 42B. A medida que se acumula el producto, la fluorescencia aumenta excepto en las temperaturas de desnaturalización, en las que la fluorescencia vuelve a la línea base, tal como se muestra en la figura 12.

Las proyecciones de la fluorescencia frente a la temperatura muestran la dependencia con la temperatura del estado de las cadenas durante la PCR (ver figura 24 y figura 24A). A medida que avanza la amplificación, los ciclos de temperaturas aparecen como bucles ascendentes entre las temperaturas de hibridación y desnaturalización. A medida que se calienta la muestra, la fluorescencia es elevada hasta que tiene lugar la desnaturalización. A medida que se enfría la muestra, aumenta la fluorescencia de la formación de ADNbc, reflejando la rehibridación del producto. Cuando la temperatura es constante durante la extensión, el incremento de la fluorescencia se correlaciona con la síntesis adicional de ADN. Los datos de la fluorescencia frente a la temperatura se pueden transformar para eliminar el efecto de la temperatura en la fluorescencia (ver figura 24). Según la presente invención, la T_{m} y las curvas de fusión del producto se utilizan para evaluar la especificidad de la amplificación. En muchos casos, este método elimina la necesidad de sintetizar una sonda de hibridación. La discriminación basada en las temperaturas de hibridación es una poderosa herramienta para la identificación y cuantificación, y se puede utilizar junto con o, en lugar de la discriminación espectral por análisis multicolor.

Resumen de sondas para la monitorización continua de la PCR. La siguiente tabla compara colorantes de ADNbc, sondas de hidrólisis y sondas de hibridación útiles en la monitorización continua de la PCR. La fluorescencia de los colorantes de ADNbc depende del estado de la cadena del ADN. Las sondas de hidrólisis doblemente marcadas están desactivadas mientras están intactas. La fluorescencia del fluoróforo desactivado se incrementa cuando la sonda se hidroliza. Las sondas de hibridación dependen del aumento de la transferencia de energía por resonancia cuando la hibridación reúne 2 fluoróforos juntos.

Resumen de sondas fluorescentes para la monitorización continua de la PCR

		Sonda fluorescente

	Colorante de ADNbc	Hidrólisis	Hibridación
Mecanismo	Estado de la cadena	Desactivación	Transferencia
Síntesis de la sonda	Innecesaria	Difícil	Sencilla
Especificidad	T_{m} de producto	Secuencia	Secuencia
Análisis de fusión	Sí	No	Sí
Análisis multicolor	No	Sí	Sí

Los técnicos en la materia entenderán que el ciclador rápido de temperaturas con detección de fluorescencia (300) representado en la figura 11 incluye las características ventajosas de un dispositivo fluorímetro con un control rápido de temperatura, una combinación nunca sugerida o mostrada en la técnica. La PCR se puede llevar a cabo y analizar durante diez a veinte minutos del ciclado de temperaturas. La combinación de la presente invención de 1) la monitorización continua de la fluorescencia en cada ciclo de temperaturas y 2) el análisis de la dependencia con la temperatura y el tiempo de la hibridación proporciona ventajas no obtenibles de ningún otro modo.

La presente invención también proporciona métodos de fluorescencia de un único color para monitorizar la pureza del producto, cuantificar la plantilla, y detectar mutaciones durante la PCR. Los colorantes que monitorizan el estado de las cadenas de ADN se añaden a las reacciones de PCR para la observación durante el ciclado de temperaturas. El SYBR® Green I es un colorante sensible que es altamente fluorescente solamente cuando se compleja con ADN bicatenario. A medida que se calienta la reacción de la PCR desde la temperatura de extensión hasta la de desnaturalización, la desnaturalización se puede observar como una disminución en la fluorescencia del SYBR® Green I. La curva de fusión es característica del producto que se desnaturaliza. Para productos de PCR pequeños, la transición de fusión tiene lugar en un intervalo estrecho de temperaturas; al punto central de la fusión se refiere como la T_{m}. Las curvas de fusión por fluorescencia de tres productos de PCR diferentes purificados se muestran en la figura 43A. Los datos de la figura 43A se obtuvieron mediante la monitorización de la fluorescencia con SYBR® Green I a la vez que se incrementaba la temperatura a una velocidad de 0,2ºC/segundo. Las posiciones relativas de la fusión se pueden predecir a partir de ecuaciones empíricas que relacionan el contenido de GC y la longitud con T_{m}. La T_{m} aparente de los productos de PCR depende de la velocidad de calentamiento, tal como se observa en la figura 43. A medida que disminuye la velocidad de calentamiento, la curva de fusión se desplaza hacia temperaturas inferiores y se hace más estrecha. Para un máximo detalle de las curvas de fusión y estimaciones precisas de la T_{m}, los efectos cinéticos de la velocidad de calentamiento necesitan minimizarse. La T_{m} aparente de los productos de la PCR también depende de la concentración de los colorantes de la ADNbc tal como se observa en la figura 44. Las concentraciones más elevadas del colorante incrementan la estabilidad del dúplex y la T_{m} observada.

Las características de diferentes colorantes de ADNbc se describirán, en primer lugar, para seleccionar un colorante óptimo para curvas de fusión durante la PCR y, a continuación, se proporcionará una descripción de las curvas de fusión para evaluar la pureza del producto de la PCR y para detectar mutaciones durante la amplificación. Finalmente, se explicará la utilización de colorantes de ADNbc en la PCR cuantitativa competitiva y la cuantificación absoluta del producto.

A continuación se describirán los diferentes colorantes de ADNbc. Existen muchos colorantes específicos de doble cadena que se pueden utilizar según la presente invención. Un colorante preferido es el SYBR® Green I que es más preferido que el bromuro de etidio, que es más común porque su espectro de excitación es similar al de la fluoresceína. Se probaron una variedad de colorantes de doble cadena para: 1) inhibición de la PCR, 2) detección de la sensibilidad, 3) efectos de la velocidad de calentamiento en la curva de fusión, y 4) efectos de la concentración de los colorantes en la curva de fusión. En primer lugar, se determinó la concentración más elevada del colorante compatible con la PCR de ciclo rápido. Esta concentración se puede utilizar para evaluar la sensibilidad de la detección mediante la monitorización continua durante la PCR con filtros ópticos óptimos. El efecto de las velocidades de transición y la concentración del colorante en las curvas de fusión son específicos del colorante. Los datos se obtendrán y presentarán como en las figuras 43 y 44. Los colorantes enumerados a continuación se comprarán con el SYBR® Green I.

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Colorantes de ADNbc alternativos para las curvas de fusión

(Véase Fu Y-H, DPA Kuhl, A Pizzute, M Pieretti, JS Sutcliffe, S Richards, AJMH Verkerk, JJA Holden, RG Fenwick, ST Warren, BA Dostra, DL Nelson, y CT Caskey, "Variation of the CGG repeat at the fragile X site results in genetic inestability: resolution of the Sherman paradox" ("La variación de la repetición CGG en el sitio X frágil da lugar a inestabilidad genética: resolución de la paradoja de Sherman"), Cell 67: 1047-1058, 1991)

Colorante	Excitación	Emisión	Comentario
Pico Verde	490 nm	520 nm	Para la cuantificación
Bromuro de etidio	520	590	Barato, intercalador común
Naranja de acridina	490	550	Emisión de una única cadena a 620 nm
Naranja de tiazola	510	540	Fluorescencia elevada en la unión a ADN
YO-PRO-1	490	510	Preferencia AT
Cromomicina A3	440	550	Preferencia GC

Para el SYBR® Green I, se prefiere utilizar diluciones de 1:7.000 - 1:30.000 con velocidades de calentamiento de 0,1-0,5ºC/segundo. Para cada colorante se obtienen las curvas de fusión de los productos de la PCR purificados con un contenido elevado de GC y un contenido bajo de GC. Las curvas de fusión con colorantes diferentes pueden variar dependiendo de su preferencia por AT/GC el modo de unión. Los colorantes se pueden redistribuir durante la fusión de los diferentes dominios de ADN, tal como se conoce para el bromuro de etidio. Según la presente invención, se puede determinar el mejor colorante, su concentración, y la velocidad de calentamiento requerida para las curvas de fusión.

A continuación se describirá la pureza del producto. A causa de la heterogeneidad en el tamaño y contenido de GC, los productos de PCR se pueden fundir en un intervalo de 40-50ºC. Por ejemplo, los dímeros cebadores se deben fundir a temperaturas bajas, los productos heterogéneos no específicos se deben fundir en un intervalo amplio, y el producto de la PCR puro se debe fundir en una zona estrecha a una T_{m} específica. Estas características se muestran en la presente invención por comparación de las curvas de fusión por fluorescencia con la electroforesis en gel de agarosa de las amplificaciones de la PCR que se han optimizado para proporcionar el producto o productos deseados. Los productos largos de la PCR pueden tener dominios internos de fusión que se podrían utilizar como huellas para la identificación, pero los fragmentos de ADN más pequeños (< 300 pares de bases) habitualmente se funden en una transición. Dependiendo de la secuencia, los dominios de ADN de fusión varían de 40 a 600 pares de bases.

Según la presente invención también debe considerarse la detección de las mutaciones. Se determinará la capacidad de las curvas de fusión para detectar polimorfismos y mutaciones genéticas. Los polimorfismos repetidos (VNTRs, repeticiones de dinucleótidos) varían en tamaño pero no significativamente en la secuencia. Las mutaciones en puntos homocigóticos (sustituciones de bases) en fragmentos de ADN se puede detectar mediante electroforesis en gel desnaturalizante en gradiente y electroforesis en gel de gradiente de temperatura, pero el desplazamiento de la temperatura es habitualmente inferior a 1ºC, una diferencia que sólo se puede detectar utilizando técnicas de precisión. Sin embargo, cuando el ADN diana en la PCR es heterocigótico, se forman heterodúplex durante el enfriamiento, y los desplazamientos de temperatura observados son 1-5ºC. Utilizando la presente invención se pueden detectar la mayoría de las mutaciones heterocigóticas mediante curvas de fusión simples durante la PCR. La región que rodea el sitio de deleción de las 3 parejas de bases de la mutación más común de la fibrosis quística (\DeltaF_{500}) se amplifica a partir del ADN tipificado previamente según la presente invención. Las curvas de fusión del homocigótico normal, \DeltaF_{500} heterocigótico y \DeltaF_{500} homocigótico también se comparan en la presente invención. Las muestras homocigóticas serán casi indistinguibles, pero la curva del heterocigoto muestra una fusión de heterodúplex con una T_{m} baja seguido por una fusión del "homodúplex" normal. El efecto es más pronunciado con amplicones más pequeños.

El factor de riesgo genético más común conocido para la trombosis es una mutación en un punto único en el gen del factor V. Se amplificó el ADN homocigótico o heterocigótico que rodeaba la mutación tipificado previamente y se obtuvieron las curvas de fusión. Las mutaciones homocigóticas se detectarán por coamplificación con una cantidad igual de ADN del tipo normal. La curva de fusión mixta observada podría parecer idéntica a la de una amplificación de heterocigoto. Si el ADN del tipo normal se mezcla de forma rutinaria con las muestras de prueba en una proporción 1:2, los heterocigotos deberían mostrar una fusión 2:1 tipo normal:mutante y un mutante homocigótico sería 1:2 tipo normal:mutante.

El BRCA1 es el primer gen identificado de susceptibilidad del cáncer de mama, que abarca, aproximadamente, el 5% de los cánceres de mama. La mayoría de las mutaciones son sustituciones, inserciones o deleciones de solamente una o dos bases y la susceptibilidad se otorga por ser heterocigótica para una mutación. Los heterocigotos se pueden detectar por secuenciación automática, pero una prueba clínica que secuencia 5.000 bases codificadoras es cara y difícil utilizando aparatos y métodos de la técnica anterior. Se prueban diez mutaciones conocidas de BRCA2 utilizando la presente invención por amplificación de los amplicones afectados, observación de las curvas de fusión, y comparación con el tipo normal. Los cebadores y las muestras conocidas de ADN están disponibles en la técnica en Myriad Diagnostics.

La PCR cuantitativa competitiva también se obtiene utilizando la presente invención. La capacidad para detectar diferencias en la temperatura de fusión del producto se explota por la presente invención en la PCR cuantitativa para diferenciar entre un producto de la PCR y un competidor. El número de copias iniciales de la plantilla se cuantificará por amplificación competitiva con una plantilla de control que utiliza los mismos cebadores, pero difiere del amplicón natural en la temperatura de fusión. Las ventajas de esta aproximación se muestran en las figuras 45 y 46. La figura 45 muestra la curva de fusión obtenida cuando se mezclan dos productos de la PCR purificados que difieren en la T_{m} en, aproximadamente, 2ºC. Corrigiendo el efecto de la temperatura en la fluorescencia y representando la derivada de la fluorescencia respecto la temperatura, se puede cuantificar la cantidad relativa de cada producto de la PCR, tal como se muestra en la figura 46.

Según la presente invención, se genera una plantilla competitiva para la amplificación de un fragmento de 180 pares de bases del gen del antígeno de la superficie de la hepatitis B a partir de los cebadores descritos previamente. Se puede obtener una plantilla competitiva con una diferencia de 3ºC en la T_{m} cambiando la longitud de la plantilla, el contenido de GC, o bien, una combinación de ambos. Mediante la amplificación por PCR de fragmentos más pequeños de la hepatitis B y la posterior unión a través de los solapamientos terminales, se sintetizaron las siguientes plantillas:

Plantillas competitivas para PCR de hepatitis B con una diferencia de 3ºC con respecto al tipo normal

			Desplazamiento de T_{m}
Plantilla	Contenido de GC	Longitud	estimado (ºC)
Tipo normal	50,0	180	0
Alternativa #1	50,0	87	-3
Alternativa #2	57,3	180	+3
Alternativa #3	42,7	180	-3

Las plantillas alternativas se cuantificaron mediante su A_{260} y se determinaron las eficacias de amplificación mediante la monitorización con SYBR® Green I una vez por ciclo. La cuantificación competitiva del ADN del tipo normal por las tres plantillas alternativas se comparará en la presente invención con un método estándar clínico que utiliza hibridación.

La cuantificación absoluta de producto también se lleva a cabo ventajosamente utilizando la presente invención. La monitorización continua de la formación de ADN bicatenario permite la cuantificación directa y absoluta de ADN mediante cinética de rehibridación. La temperatura de la muestra disminuye rápidamente desde la temperatura de desnaturalización y se mantiene constante a una temperatura inferior que es aún suficientemente elevada para evitar la hibridación del cebador. A continuación, la velocidad de rehibridación del producto sigue una cinética de segundo orden. Cuando se prueban diferentes concentraciones de ADN, la forma de la curva de rehibridación es característica de la concentración de ADN (ver figura 26). Para cualquier producto y temperatura de la PCR determinados, se puede medir una constante de velocidad de segundo orden. Una vez se conoce la constante de velocidad, se puede determinar cualquier concentración de ADN desconocida a partir de datos experimentales de rehibridación. El principio se muestra en la figura 27. Las curvas se pueden ajustar mediante una regresión no lineal de mínimos cuadrados durante el ciclado de temperaturas en tiempo real utilizando un entorno de programación LabView explicado previamente. El enfriamiento no es instantáneo, y parte de la rehibridación tiene lugar antes de alcanzar una temperatura constante, pero el análisis por regresión lo tiene en cuenta, según la presente invención (ver figura 27). La técnica requiere producto de la PCR puro, pero éste se puede asegurar mediante las curvas de fusión obtenidas también durante el ciclado de temperaturas. La cuantificación por cinética de rehibridación es independiente del nivel de señal y no está afectado por diferencias menores en la muestra.

La suposición de una cinética de segundo orden para la rehibridación del producto se confirma mediante la determinación de la constante de velocidad a diferentes concentraciones de ADN. Algunos colorantes fluorescentes afectan a la rehibridación de una manera dependiente de la concentración. Se definirá la relación y es posible la cuantificación. La cuantificación por cinética de rehibridación se compara a la cuantificación que utiliza la fluorescencia al final de cada periodo de extensión.

La presente invención también proporciona métodos de fluorescencia de dos colores que dependen de la hibridación de la sonda (no la hidrólisis) para la detección específica de secuencia durante la PCR. Según la presente invención, se puede utilizar la transferencia de energía por resonancia entre las sondas de hibridación adyacentes marcadas con fluoresceína y Cy5 para monitorizar la amplificación. Sin embargo, cuando se utilizan realizaciones de la presente invención también deberían considerarse el efecto de la longitud de la sonda, la concentración de la sonda, y la distancia óptima entre las sondas.

La presente invención también se proporciona para la optimización de sondas de hibridación adyacentes. Se determina el efecto de la distancia entre las sondas. Según lapresente invención, la síntesis de 30 mers marcados con 5-3'-fluoresceína y 30 mers marcados con 5,5'-Cy5 con vidrio puro con fluoresceína controlada (disponible en Glen. Research) y amiditas con Cy5 (disponible en Pharmacia). Las sondas se diseñan para hibridarse a la misma cadena en la región de la \beta-globina con distancias entre sondas entre la fluoresceína y Cy5 de 0 a 25 bases. Para la purificación se utiliza Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC) combinada con la monitorización de la absorbancia y la fluorescencia. La pureza se comprueba, preferiblemente, mediante electroforesis en gel analítica y proporciones A_{160}:A_{490} o A_{260}:A_{650}. Las sondas se incluirá en una concentración de 0,2 \muM durante la PCR, y se utilizará una ciclado de 2 temperaturas. El cambio en la proporción de fluorescencia durante la PCR se representa frente a la distancia entre sondas para determinar la distancia óptima entre sondas.

Utilizando la distancia óptima entre sondas determinada anteriormente, se sintetizan longitudes de sondas de 20, 25 y 35 bases y se comparan con sondas de 30 mers. Se observa la temperatura de fusión de estas sondas durante la PCR y se representa frente a la longitud de la sonda. La utilización de sondas más largas permite la utilización de un ciclo de 3 temperaturas con una etapa de hibridación de la sonda que precede a una etapa de hibridación del cebador. Se mide el efecto de la concentración de la sonda en la sensibilidad de la detección y la intensidad de la señal durante la PCR.

La utilización de un cebador marcado para la transferencia de energía por resonancia a una sonda de hibridación está de acuerdo con un aspecto de la presente invención. Una de las sondas adyacentes de transferencia de energía por resonancia se pueden incorporar en un cebador de la PCR, tal como se muestra en la figura 39. En el caso ilustrado, una sonda marcada se hibrida a un producto de la PCR de una cadena que incorpora el cebador marcado. Los cebadores marcados se sintetizan con una amidita dT modificada con un enlazador amino (disponible en Glen Research) para el acoplamiento manual a cy5 (disponible en Amersham/BDS). La presente invención también incluye la determinación de la proximidad de la Cy5-dT modificada con respecto al extremo 3' del cebador sin inhibir la PCR. Esta determinación requiere varios cebadores marcados con la base marcada en diferentes posiciones. A continuación, se observa la distancia óptima entre fluoróforos mediante la síntesis y prueba de varias sondas marcadas con 3'-fluoresceína.

También está dentro del alcance de la presente invención la utilización de otros formatos para detectar la hibridación mediante la transferencia de energía por resonancia. En un método preferido, el esquema de la sonda de hibridación adyacente se refiere como "formato no competititvo". Esto contrasta con un "formato competititvo" en el que dos oligonucleótidos complementarios están marcados de manera individual con fluoróforos. Las sondas se pueden hibridar entre ellas (dando lugar a la transferencia de energía o desactivación) o a una diana presente, que en nuestro caso sería el producto de la PCR acumulado. Según la presente invención se pueden llevar a cabo la síntesis y prueba de sondas complementarias de 20, 25 y 30 mer marcadas con 5'-Cy5 y 3'-fluoresceína en la PCR.

El "formato intercalador" de Morrison requiere una sonda marcada que interacciona con un colorante específico de doble cadena cuando se hibrida. Véase Morrison L.E., "Detection of energy transfer and fluorescence quenching" ("Detección de la transferencia de energía y desactivación de la fluorescencia"), en L.J. Kricks (ed.), Nonisotopic DNA probe techniques, Academic Press, San Diego, pp. 311-352, 1992.

La síntesis de sondas de 20-, 25-, y 30- mers doblemente marcadas con Cy5 en los extremos 3' y 5' y la utilización de SYBR® Green I como colorante específico de doble cadena están dentro del alcance de la presente invención. La formación del producto de la PCR da lugar a una hibridación observable como el aumento en la emisión de Cy5. Este método tiene la ventaja de que tanto el producto específico de secuencia como el ADN de doble cadena se pueden monitorizar al mismo tiempo.

La presente invención también aplica métodos de secuencia específica de dos colores para la detección de mutaciones, PCR cuantitativa competitiva, y la cuantificación de producto. La T_{m} de las sondas de hibridación se desplaza, aproximadamente, 10ºC si existe un único desajuste de bases. Si la sonda de hibridación se coloca en un punto de mutación, las mutaciones de una única base son detectables como un desplazamiento de 10ºC en la fusión de la sonda. Las mutaciones heterocigóticas deberían dar una curva de fusión intermedia. La discriminación de una única base se mostrará utilizando la mutación del factor V mencionada anteriormente y las sondas adyacentes de fluoresceína/
Cy5.

Las plantillas de PCR competitivas se pueden diseñar con cambios internos de bases. Si se utilizan sondas de detección de manera que secuencialmente se fusionan diferentes marcadores a diferentes temperaturas, es posible realizar la cuantificación relativa. La cuantificación absoluta de producto es posible siguiendo una cinética de hibridación de la sonda. Si se utilizan un cebador marcado y una sonda de hibridación, la cinética de hibridación debería ser de pseudo primer orden, una predicción que se comprobará con concentraciones conocidas de plantilla.

La presente invención también utiliza retroalimentación de fluorescencia para el control y la optimización de la amplificación en tiempo real. La monitorización de la fluorescencia en tiempo real se utiliza para controlar el ciclado de temperaturas. Con colorantes específicos de doble cadena, la extensión puede finalizar en cada ciclo después de que cese el aumento de la fluorescencia. Para la desnaturalización, es necesario aumentar la temperatura sólo hasta que el producto esté completamente fundido. Finalmente, el ciclado de temperaturas se puede finalizar automáticamente después de producir una cierta cantidad de producto. Estos controles en tiempo real se programarán como opciones en un ciclador de temperatura con fluorescencia.

La presente invención proporciona la monitorización y el control de la hibridación en tiempo real. Cuando uno de los cebadores se marca en 3' con Cy5, no tiene lugar la extensión. Si el cebador marcado (1-10%) se mezcla con cebador no marcado (90-99%), la eficacia de la amplificación disminuirá ligeramente, pero la hibridación es observable como la transferencia de energía por fluorescencia desde un colorante específico de doble cadena a Cy5. Este es el "formato intercalador" descrito anteriormente. El cebador con la T_{m} más baja (según se determina por la termodinámica del vecino más próximo) se marcará con SYBR® Green I como colorante específico de doble cadena. La eficacia de la amplificación y la fluorescencia de Cy5 durante la hibridación se comparan frente al porcentaje de cebador marcado.

La monitorización directa con la realización de la presente invención se puede llevar a cabo directamente con un cebador marcado con Cy5 o indirectamente con oligonucleótidos equivalentes complementarios. Se diseña un oligonucleótido de la misma longitud y T_{m} que el cebador de fusión más bajo sin complementariedad con la secuencia amplificada. Este oligonucleótido está marcado en 5' con Cy5 y su complemento está marcado en 3' con fluoresceína. La hibridación de esta pareja va seguida de una transferencia de energía por resonancia a Cy5. El oligonucleótido marcado con fluoresceína (0,005 \muM) y el oligonucleótido marcado con Cy5 (0,5 \muM) se hibridan con una cinética de pseudo primer orden que se aproxima a la cinética de hibridación del cebador. De esta manera, la eficacia de la hibridación se puede monitorizar y utilizar para controlar la temperatura y los tiempos de hibridación. En el dispositivo de control se incluye opcionalmente un control de las condiciones de hibridación mediante la monitorización de la eficacia de la hibridación.

La PCR convencional se realiza mediante la programación de todos los parámetros de ciclado antes de la amplificación. Para una monitorización continua, la determinación de los requerimientos del ciclado de temperaturas tiene lugar durante la amplificación, basándose en la observación continua de la hibridación, extensión y desnaturalización. La eficacia de la hibridación se controla, incluso durante los ciclos iniciales, utilizando oligonucleótidos equivalentes complementarios al cebador de fusión más baja. Sin embargo, la extensión y la desnaturalización sólo se puede monitorizar con colorantes de ADNbc durante los últimos ciclos cuando se ha producido suficiente producto. Habitualmente, esto no supone un problema, ya que las condiciones de desnaturalización y extensión son suficientemente permisivas para amplificar la mayoría de productos, y se pueden utilizar datos de la primera amplificación para optimizar los procesos posteriores.

A continuación se proporcionarán ejemplos adicionales de diferenciación de producto mediante el análisis de las curvas de fusión de ADN durante la reacción en cadena de la polimerasa.

La PCR se realizó en Tris 50 mM, pH 8,5 (25ºC), MgCl_{2} 3 mM, albúmina de suero bovino 500 \mug/ml, 0,5 mM de cada desoxinucleósido trifosfato, cebadores 0,5 \muM, y 0,2 U de Taq polimerasa por cada 5 \mul de muestra. El SYBR® Green I también se incluyó en una dilución de 1:20.000 a menos que se especifique lo contrario.

El producto de amplificación utilizado como plantillas se purificó por extracción con fenol/cloroformo y precipitación en etanol, seguido de un lavado repetitivo mediante un microconcentrador Centricon 30 (disponible en Amicon de Danvers, Massachusetts). Las concentraciones de las plantillas se determinaron mediante una absorbancia a 260 nm y tenían unas proporciones A_{260}/A_{180} superiores a 1,7.

Los cebadores se sintetizaron mediante química de fosfoamidita estándar (disponible en Pharmacia Biotech Gene Assembler Plus de Piscataway, Nueva Jersey). Los cebadores para la amplificación del gen de 180 pares de bases del antígeno de la superficie de la hepatitis B fueron 5'-CGTGGTGGAC TTCTCTCAAT-3' (SEQ ID No: 1) y 5'-AGAA
GATGAG GCATAGCAGC-3' (SEQ ID No: 2). Los cebadores para la amplificación del gen de 292 pares de bases del antígeno específico de próstata fueron 5'-CTGTCCGTGA CGTGGATT-3' (SEQ ID No: 7) y 5'-AAGTCCTCCG AGTATAGC-3' (SEQ ID No: 8). Los cebadores para la amplificación del gen de 536 pares de bases de la \beta-globina humana fueron RS42 y KM29.

Las curvas de fusión de ADN se obtuvieron en un fluorímetro de microvolúmenes integrado con un ciclador térmico de 24 muestras que utiliza las realizaciones de las figuras 8A&B y ajustado con un módulo óptico (modelo no. 2210 disponible en Idaho Technology de Idaho Falls, Idaho) para la obtención de fluorescencia del SYBR® Green I. Los reactivos de la PCR (volumen de 5 \mul) se pipetearon en un recipiente de plástico abierto con tubos de reacción compuestos de vidrio/plástico, se centrifugaron a baja velocidad para colocar la muestra en la punta del capilar de vidrio, y se sellaron por dentro con un trozo de plástico. La PCR se realizó en una de las realizaciones descritas anteriormente. Los datos de fluorescencia para las curvas de fusión se obtuvieron integrando la señal entre 0,25-2,0 segundos durante una transición lineal de temperatura hasta 95ºC a 0,1-10,0ºC/segundo. Los datos se visualizaron de forma continua utilizando los dispositivos de control descritos anteriormente.

Para convertir la curva de fusión en picos de fusión (ver figura 49) se utilizaron una serie de transformaciones. Se eliminó la fluorescencia de fondo (T1) mediante la realización de una regresión lineal (L1) sobre la curva de fusión por encima de la temperatura de fusión del producto de la PCR purificado. En una buena aproximación (R2 = 0,96 para la curva de fusión en la figura 49), esta línea expresa la fluorescencia de fondo en función de la temperatura. Se utiliza una regresión lineal (L2) sobre la curva de fusión por debajo de la temperatura de fusión del producto para eliminar el efecto de la temperatura sobre la fluorescencia. Finalmente, los datos se readaptan de la curva de fusión a un pico de fusión (T2) mediante la representación de la derivada de la fluorescencia con respecto a la temperatura (-dF/dT) mediante métodos similares a los utilizados para convertir espectrofotométricamente las curvas de fusión en picos de fusión. La integral de la curva de los picos de fusión sobre el intervalo de fusión esperado del producto específico, dividida por la integral sobre el pico de fusión completo, se obtiene un límite superior a la proporción del producto previsto respecto al no específico.

La representación de la fluorescencia de los colorantes específicos de ADNbc en función de la temperatura (ver figura 50) durante la PCR permitió la monitorización del estado de la cadena durante los ciclos individuales de la reacción. Los ciclos de temperaturas iniciales aparecieron como fluorescencia de fondo a lo largo de la base de la representación. A medida que se acumulaba el producto de amplificación, la fluorescencia aumentaba más con cada ciclo durante la transición hacia la temperatura de hibridación y a medida que la actividad de la polimerasa sintetizaba producto nuevo. Durante el calentamiento hacia la temperatura de desnaturalización, la fluorescencia descendió repentinamente hasta niveles base sobre un tramo de varios grados que indicaba la desnaturalización del producto. Esta secuencia dio lugar a una estructura espiral en el sentido de las agujas del reloj característica de las representaciones de la fluorescencia frente a la temperatura de la PCR.

Después de 25 ciclos de temperatura se inició un ciclo de obtención de la curva de fusión (ver figura 51). El producto se desnaturalizó, se hibridizó completamente y, a continuación, se calentó lentamente a través de la temperatura de desnaturalización a 0,2ºC/segundo. La fusión se inició a 85ºC y la fluorescencia cayó hasta niveles base de
87ºC.

La posición absoluta de las curvas de fusión de los productos de la PCR estaban influidas por la concentración de SYBR® Green I (ver figura 52A). A medida que se aumentaba la concentración de colorante, las curvas de fusión se desplazaban hacia temperaturas más elevadas. Las concentraciones por encima de 1 a 7.000 evitaban la amplificación por PCR.

Las transiciones rápidas de temperatura a través de la temperatura de desnaturalización desplazaron las curvas de fusión hasta T_{m} aparentes más elevadas debido a efectos cinéticos (ver figura 52B). Las velocidades de transición de temperatura superiores a 5ºC/s desplazaron la T_{m} aparente en casi 3ºC. La T_{m} aparente se desplazó 0,2ºC incrementando la velocidad de transición de 0,1 a 0,2ºC/segundo. El análisis de la curva de fusión posterior se realizó a una velocidad de transición de 0,2ºC/segundo. El análisis de la curva de fusión a esta velocidad añadió 30 segundos a la reacción de 8 minutos representada en la figura 50.

Las curvas de fusión se obtuvieron para tres productos de la PCR purificados (ver figura 53). Los tres productos tenían curvas de fusión estrechas, fundiendo en 2ºC. La T_{m} aparente del fragmento de 180 pares de bases de la hepatitis B (50,0% de GC) fue, aproximadamente, dos grados por debajo de la T_{m} del fragmento de 536 pares de bases de la \beta-globina (53,2% de GC), y estos eran fácilmente diferenciables. La T_{m} aparente del fragmento de 292 pares de bases del antígeno específico de próstata (60,3% de GC) tenía una temperatura de fusión próxima a cinco grados superior al fragmento más grande de \beta-globina.

Cuando se mezclaron productos de la PCR purificados, se solaparon sus curvas de fusión (ver figura 54). Tras la conversión en picos de fusión, fue posible resolver las mezclas de los productos de la reacción que diferían en la T_{m} en menos de 2ºC en picos separados (ver figura 55).

El análisis de las curvas de fusión se utilizó para diferenciar productos previstos a partir de productos no específicos, tales como dímeros de cebadores (ver figura 56). Los dímeros de cebadores tenían picos de fusión amplios en el intervalo de 75-85ºC, muy diferentes de los picos de fusión estrechos de los productos específicos de amplificación por PCR. Los productos heterogéneos más grandes que surgían de la realización de muchos ciclos a una hibridación poco rigurosa tenían unas curvas de fusión más bajas y más anchas cuando se comparaban con el producto de la PCR puro.

La aproximación de la presente invención en la determinación de la pureza de un producto se utilizó para mejorar la PCR cuantitativa basada en la monitorización ciclo por ciclo de la fluorescencia de colorantes específicos de ADNbc. La fluorescencia se obtuvo una vez en cada ciclo después de la extensión por polimerasa del producto para un conjunto de reacciones que varían en la concentración de plantilla inicial (ver figura 57). El incremento logarítmico-lineal sobre la fluorescencia base comienza en un número de ciclos dependiente de la concentración inicial de plantilla. Las representaciones de las cinco reacciones que varían de 10^{6} a 10^{3} copias por reacción estaban separadas por, aproximadamente, cuatro ciclos. La reacción con un promedio de copias de 10^{3} copias por reacción mostró un descenso en la eficacia de la reacción, y las reacciones con un número de copias iniciales por debajo de 100 produjeron unos perfiles de fluorescencia que fueron menos útiles. Los perfiles de fluorescencia para las reacciones que contenían 10 y 1 copias (promedio) aumentaron en orden inverso, y el control negativo mostró amplificación después de, aproximadamente, 30 ciclos. Esto es debido a la amplificación de los dímeros cebadores y otros productos de amplificación no específicos que no se pueden distinguir del producto deseado mediante la monitorización de la fluorescencia una vez por ciclo de colorantes específicos de ADNbc.

Los picos de fusión se obtuvieron para cada muestra (ver figura 58) y se observó que correlacionaban bien con los resultados de la electroforesis (figura 60). La reacción que contenía cero y una copia promedio iniciales de plantilla produjo una banda de electroforesis no distinguible en el punto esperado de 536 pares de bases. Las reacciones que contenían 10 y 100 copias iniciales de plantilla muestran bandas de electroforesis débiles. Esto concuerda con el análisis de los picos de fusión, que no muestra fusión de ADN en el intervalo del producto deseado (90-92ºC) para las reacciones que contienen cero y una copias iniciales y picos pequeños en este intervalo de temperaturas para 10 y 100 copias. Las bandas de electroforesis importantes para las reacciones que contienen 10^{3}-10^{6} copias iniciales se correlacionan bien con picos de fusión grandes en el intervalo esperado de 90-92ºC.

La proporción del producto deseado con respecto al producto total, determinado mediante la integración de los picos de fusión, variaba desde 0,28 para 10^{5} copias hasta 0,0002 para cero copias iniciales de plantilla. Cada punto de los datos de la figura 57 se multiplicó por la proporción adecuada para obtener la representación corregida (figura 59). Este procedimiento extiende el intervalo dinámico eficaz de cuantificación entre 10 y 1 copias iniciales de plantilla.

Tal como se entenderá de lo expuesto anteriormente, idealmente, la detección y el análisis del producto de la PCR tendrían lugar simultáneamente con el ciclado de temperaturas durante la amplificación. Si una propiedad fundamental del ADN, tal como el tamaño, la secuencia, o el perfil de fusión del producto, pudiera identificar específicamente el producto durante la PCR, no se necesitaría ningún análisis adicional.

La detección específica de secuencia durante la amplificación se puede obtener con sondas fluorescentes. Una única sonda se puede marcar con dos colorantes de fluorescencia (FRET) para la transferencia de energía por resonancia. La hidrólisis de la sonda mediante la actividad de la polimerasa exonucleasa libera el colorante dador de la desactivación. A medida que avanza la amplificación, la fluorescencia del colorante dador aumenta de forma acumulativa. Alternativamente, los colorantes FRET se pueden colocar en dos sondas marcadas individualmente que se hibridan de forma adyacente. Las técnicas de hidrólisis e hibridación permiten la amplificación y la detección del producto específico de secuencia de forma simultánea. Sin embargo, se requieren sondas únicas para cada diana. La síntesis y purificación de las sondas no son triviales, particularmente para sondas doblemente marcadas.

También se puede utilizar la estabilidad hélice/espiral para identificar específicamente los productos de la PCR. Por ejemplo, el polimorfismo de conformación de una cadena, la electroforesis en gel desnaturalizante en gradiente, y la electroforesis en gel de gradiente de temperatura, separan productos basados en la estabilidad de conformaciones diferentes. La estabilidad de la hibridación se puede monitorizar con FRET en tiempo real. También se ha utilizado la monitorización de curvas de fusión como una dimensión discriminante adicional en la secuenciación por técnicas de hibridación.

El homodímero de etidio y el bromuro de etidio se utilizan para monitorizar la desnaturalización del ADN. La PCR es compatible con muchos colorantes específicos de ADNbc, incluyendo el bromuro de etidio y el SYBR® Green I. Estos colorantes están fácilmente disponibles y son baratos, la síntesis de la sonda no es necesaria. Si el bromuro de etidio se incluye en la PCR, tiene lugar un incremento en la fluorescencia de las muestras en tubos capilares de vidrio para muestras. Está dentro del alcance de la presente invención la monitorización de reacciones de la PCR ya que tienen lugar con iluminación de luz ultravioleta y una cámara CCD. A medida que se establece la identidad del producto, la monitorización con estos colorantes genéricos eliminaría la necesidad de una etapa separada de análisis tras la amplificación. La especificidad absoluta de la secuencia es raramente necesaria, pero habitualmente se requiere la diferenciación del producto.

Los productos de la PCR se pueden diferenciar durante la amplificación mediante el análisis de las curvas de fusión cuya forma es función del contenidote GC, la longitud y la secuencia. La temperatura a la que los productos de la PCR se funden varía en un intervalo amplio. Utilizando fórmulas empíricas conocidas en la técnica, el efecto del contenido de GC sobre la temperatura de fusión (T_{m}) de ADN predice que un 0% de dúplex de GC se fundiría 41ºC por debajo de un 100% de dúplex de GC. Con el mismo contenido de GC, un dímero cebador de 40 pares de bases se fundiría 12ºC por debajo de un producto de 1000 pares de bases. Por lo tanto, el intervalo de T_{m} para productos de PCR potenciales abarca, como mínimo, 50ºC. Este intervalo amplio permite diferenciar la mayoría de productos de la PCR mediante curvas de fusión. Debido a las diferencias en la longitud, los dímeros cebadores se funden habitualmente a una temperatura inferior que la de los productos de la PCR deseados. Los productos heterogéneos se funden dentro de un intervalo más amplio que los productos de la PCR puros. Los productos de la PCR largos pueden tener dominios internos de fusión que se podrían utilizar como huellas para la identificación, a pesar de que los productos de la PCR más pequeños, incluyendo los probados en la presente (ver figura 53), funden en una transición más amplia.

A diferencia de la electroforesis en gel, el análisis de las curvas de fusión puede distinguir productos de la misma longitud pero con diferente proporción de GC/AT. Además, dos productos con la misma longitud y contenido de GC, pero que difieren en su distribución de GC (igualmente distribuidos frente a una abrazadera de GC en un extremo) tendrían curvas de fusión muy diferentes. Las diferencias pequeñas en la secuencia pueden ser incluso observables, por ejemplo, en la amplificación de ADN heterocigótico en la que se forman heterodúplex. Las diferencias en bases únicas en ADN heterocigótico dan lugar a desplazamientos de temperatura de 1-5ºC para heterodúplex en comparación con el ADN totalmente complementario.

Los productos de la PCR separados por menos de 2ºC se pueden distinguir en mezclas que se utilizan en la presente invención (ver figura 56). Además, estas curvas de fusión se pueden convertir en picos de producto para estimaciones de la cantidad relativa de los diferentes productos presentes (ver figura 61). La capacidad para determinar las cantidades relativas de diferentes productos de la PCR es muy útil. Por ejemplo, el conocimiento de la cantidad relativa de producto deseado comparado con el ADNbc total se puede corregir para la amplificación no específica cuando las reacciones se monitorizan mediante colorantes de ADNbc. Utilizando bromuro de etidio o SYBR® Green I, es posible la cuantificación sobre de 6-8 órdenes de magnitud de la concentración de plantilla inicial. Sin embargo, la sensibilidad está limitada por la amplificación no específica en un número de copias iniciales de la plantilla (ver figura 57). Las curvas de fusión (ver figura 58) muestran productos múltiples de la PCR, particularmente en un número de copias iniciales bajo, y esto se correlaciona bien con los productos múltiples observados tras la electroforesis en gel (ver figura 60). La proporción de la fusión de producto en el intervalo esperado con respecto al producto total se puede utilizar para corregir la amplificación no específica (ver figura 59). Esta proporción da un límite superior para la cantidad de producto esperado respecto al total. Simplemente como es posible malinterpretar los resultados de la electroforesis debido a la comigración de dos o más productos, es posible que parte de la fusión del producto en el intervalo esperado pueda no ser producto deseado. Sin embargo, si no se funde ADNbc en el intervalo del producto esperado, se puede decir de forma concluyente que ninguno de los productos esperados se encuentran presentes.

El análisis de las curvas de fusión se puede utilizar para extender el intervalo dinámico de cuantificación hasta un número de copias iniciales inferior. De forma más importante, el análisis de los picos de fusión proporciona un nivel más elevado de certeza que la fluorescencia que se deriva del producto deseado en lugar de la amplificación no específica. La utilidad de la monitorización de la fluorescencia en la PCR está limitada si la electroforesis en gel es necesaria para comprobar la identidad del producto. El análisis de los picos de fusión permite la identificación del producto durante la PCR sin la posterior electroforesis.

La capacidad para resolver las cantidades relativas de 2 productos de la PCR también es útil en la PCR cuantitativa competitiva. Las plantillas competitivas con los mismos cebadores están diseñadas según la presente invención con una temperatura de fusión 2-3ºC separadas del amplicón natural mediante el cambio de la proporción GC/AT o la longitud del producto. Se añadirían cantidades conocidas de competidor a cantidades desconocidas de plantilla natural, se amplificarían las plantillas, se obtendrían las curvas de fusión, y se resolverían los picos de producto. Suponiendo que los productos se amplifican con la misma eficacia, la proporción entre productos es la proporción entre las plantillas iniciales.

El análisis de las curvas de fusión tiene varias limitaciones. La posición absoluta y anchura de las curvas de fusión están afectadas por las velocidades de transición de temperatura (ver figura 52B) y la concentración de colorante (figura 52A). La adición de intercaladores, tales como bromuro de etidio, aumenta la temperatura de fusión y amplía la transición de fusión. A pesar de que las curvas de fusión se obtienen frecuentemente a velocidades de, aproximadamente, 0,5ºC/minuto para asegurar el equilibrio, se pueden utilizar velocidades de 12ºC/minuto (0,2ºC/segundo) para diferenciar productos que difieren en 2ºC o menos en la temperatura de fusión (ver figura 53). Es posible una resolución más fina con velocidades de transición más bajas y/o una mayor homogeneidad de las temperaturas de las muestras.

El análisis de los picos de fusión de la presente invención ofrece un método de diferenciación de producto integrado completamente con la PCR. De forma similar a la medición por electroforesis en gel, el análisis de los picos de fusión mide una característica fundamental del ADN y se puede utilizar para identificar los productos amplificados. La combinación de la monitorización de la fluorescencia de la PCR con un análisis de las curvas de fusión proporciona una aproximación prometedora para la amplificación, detección y diferenciación de productos de la PCR de forma simultánea.

La solicitud de Patente de Estados Unidos de no. de serie 08/381.703, solicitada el 31 de enero de 1995, que se incorpora por referencia en la presente invención en su totalidad, muestra información con respecto a Sistema de Análisis de ADN en Línea con Ciclado Rápido de Temperaturas.

El Apéndice del Código de Programación se indica en la siguiente página.

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(Código pasa a página siguiente)

101

100

102

(1) INFORMACIÓN GENERAL

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(i): SOLICITANTE: Carl T. Wittwer, Kirk M. Ririe, Randy P. Rasmussen, y David R. Hillyard

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(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: SISTEMA Y MÉTODO PARA REALIZAR Y MONITORIZAR PROCESOS BIOLÓGICOS

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 6

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(iv): DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

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(A): DIRECCIÓN: Thorpe, North & Western

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(B): CALLE: 9035 South 700 East, Suite 2000

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(C): CIUDAD: Sandy

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(D): ESTADO: Utah

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(E): PAÍS: ESTADOS UNIDOS

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(F): CÓDIGO POSTAL: 84070

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(v): FORMATO DE LECTURA EN EL ORDENADOR:

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(A): TIPO DE MEDIO: Disquete, 3,5 pulgadas, 1,4 Mb de capacidad

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(B): ORDENADOR: Toshiba 200CDS

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(C): SISTEMA OPERATIVO: DOS 7.0

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(D): SOFTWARE: Word Perfect 7.0

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(vi): DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

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(A): NÚMERO DE SOLICITUD:

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(B): FECHA DE REGISTRO: 4 Junio 1997

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(C): CLASIFICACIÓN:

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(vii): DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

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(A): NÚMERO DE SOLICITUD:

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(B): FECHA DE REGISTRO:

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(viii): INFORMACIÓN DEL APODERADO/AGENTE

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(A): NOMBRE: Grant R. Clayton

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(B): NÚMERO DE REGISTRO: 32.462

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(C): NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 8616CIP5

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(ix): INFORMACIÓN POR TELECOMUNICACIÓN:

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(A): TELÉFONO: (801) 566-6633

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(B): TELEFAX: (801) 566-0750

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 1:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 20

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): CADENAS: una

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGTGGTGGAC TTCTCTCAAT

\hfill

20

\newpage

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2:

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(ii): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 20

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENAS: una

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGAAGATGAG GCATAGCAGC

\hfill

20

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3:

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(iii): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 35

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): CADENAS: una

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAAACAGACA CCATGGTGCA CCTGACTCCT GAGGA

\hfill

35

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:4:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAGTCTGCCG TTACTGCCCT GTGGGGCAAG

\hfill

30

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): CADENAS: una

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGTTGGCCAA TCTACTCCCA GG

\hfill

22

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCTCACTCAG TGTGGCAAAG

\hfill

20

Claims

1. Método de monitorización en tiempo real de una amplificación por reacción en cadena de la polimerasa de una secuencia de ácido nucleicos diana en una muestra biológica, comprendiendo dicho método las etapas de

amplificar la secuencia diana mediante la reacción en cadena de la polimerasa en presencia de dos sondas de ácidos nucleicos que se hibridan a regiones adyacentes de la secuencia diana, estando una de dichas sondas marcadas con un fluoróforo aceptor y la otra sonda marcada con un fluoróforo dador de una pareja de transferencia de energía por fluorescencia, de manera que tras la hibridación de las dos sondas con la secuencia diana, los fluoróforos dador y aceptor están separados de entre por 0 a 25 nucleótidos, comprendiendo dicha reacción en cadena de la polimerasa las etapas de

añadir una polimerasa termoestable y cebadores para la secuencia de ácidos nucleicos diana a la muestra biológica y ciclar térmicamente la muestra biológica entre, como mínimo, una temperatura de desnaturalización y una temperatura de extensión;

2. Método, según la reivindicación 1, que comprende además la etapa de monitorización de la fluorescencia dependiente de temperatura de la muestra biológica.

3. Método, según la reivindicación 1, que comprende además las etapas de monitorización de las emisiones fluorescentes de dicha muestra; y el ajuste de los parámetros de temperatura y tiempo según los datos generados a partir de la monitorización para optimizar el rendimiento o la especificidad del producto.

4. Método, según las reivindicaciones 1, 2 ó 3, en el que la pareja de transferencia de energía por resonancia comprende fluoresceína como dador y Cy5 como aceptor.

5. Método, según la reivindicación 1, que comprende además la etapa de colocar la muestra biológica en un tubo capilar que comprende un material óptimamente transparente; y

en el que la etapa de detección comprende además la detección de la fluorescencia a través de un extremo del tubo capilar.

6. Método, según la reivindicación 5, en el que la etapa de excitación comprende además la iluminación de la muestra a través de un extremo del tubo capilar.

7. Método, según la reivindicación 6, en el que la etapa de excitación comprende además la iluminación de la muestra a lo largo del camino óptico de la fluorescencia detectada.

8. Método, según las reivindicaciones 5, 6 ó 7, en el que la proporción del área superficial con respecto al volumen del tubo capilar es mayor o igual a 4 mm^{-1}.

9. Método para analizar una secuencia de ADN diana de una muestra biológica para polimorfismos de secuencia de ADN, heterocigosidades o mutaciones, comprendiendo dicho método las etapas de

(a) añadir a la muestra biológica una cantidad eficaz de dos cebadores de ácidos nucleicos y una sonda de ácidos nucleicos, en la que uno de dichos cebadores y la sonda están cada uno marcados con un miembro de una pareja de transferencia de energía por fluorescencia que comprende un fluoróforo aceptor y un fluoróforo dador, y en la que la sonda marcada se hibrida a una copia amplificada de la secuencia de ácidos nucleicos diana separada de 0 a 25 nucleótidos del cebador marcado;

(b) amplificar la secuencia marcada de ácidos nucleicos diana mediante la reacción en cadena de la polimerasa, comprendiendo dicha reacción en cadena de la polimerasa las etapas de adición de una polimerasa termoestable y cebadores para la secuencia de ácidos nucleicos diana y el ciclado térmico de la muestra biológica entre, como mínimo, una temperatura de desnaturalización y una temperatura de extensión;

10. Método, según la reivindicación 9, que comprende además la etapa de monitorización de la fluorescencia dependiente de la temperatura de la muestra.

11. Método, según la reivindicación 9, en el que la pareja de transferencia de energía por resonancia comprende fluoresceína como dador y Cy5 como aceptor.