DE19850593A1 - Verfahren zum Nachweis von Hybridisierungsereignissen bei DNA - Google Patents

Abstract

Es wird ein Verfahren zum Nachweis von Hybridisierungsereignissen bei DNA vorgeschlagen, bei dem in die Stränge der DNA mindestens zwei Fluorchrome eingebaut werden, und bei dem auf einen der beiden Fluorchrome eine Energie E = h*eta übertragen wird. Anschließend wird die von dem anderen Fluorchrom ausgesandte Energie nachgewiesen.

Description

Stand der Technik

Die Erfindung geht aus von einem Verfahren zum Nachweis von Hybridisierungsereignissen bei DNA nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1.

Der Nachweis von Hybridisierungsereignissen bei DNA beispielsweise auf DNA-Arrays ist durch eine Vielzahl von Detektionssystemen möglich. Die zugrundeliegenden signalgebenden physikalischen Parameter basieren meist auf Einstrahlung und Nachweis einer bestimmten Energie. Hierzu gehören beispielsweise:
Radioaktivität,
Chemolumineszenz,
Fluoreszenz,
Evaneszenz, Nachweis der Brechungsindexänderung aufgrund von Massenanlagerung,
Ellipsometrie (linear polarisiertes Licht wird elliptisch polarisiert).

Daneben sind auch elektrische Nachweisverfahren bekannt. Hierzu gehört zum Beispiel der Nachweis einer Änderung des lokalen Widerstandes einer Oberfläche durch Masseanlagerung.

Die genannten Verfahren haben den Nachteil, daß lediglich die Anlagerung einer Masse detektiert wird. Dies führt dazu, daß Schmutzpartikel von den nachzuweisenden Molekülen nicht unterschieden werden werden können.

Außer den bereits aufgeführten markierungsfreien Verfahren sind Verfahren bekannt, bei denen eine Markierung, wie beispielsweise ein Fluorochrom, in das Molekül, auf dem eine Eigenschaft nachgewiesen werden soll, eingebaut wird. Bei diesen Verfahren können nur noch markierte Moleküle ein Signal ergeben. Damit ist die Signaldetektion auf solche Moleküle beschränkt, die eine Markierung tragen. Nachteiligerweise führt dies zu einer Reduzierung der Möglichkeiten für unspezifische Signale.

Die Erfindung und ihre Vorteile

Demgegenüber hat das erfindungsgemäße Verfahren mit den kennzeichnenden Merkmalen des Anspruchs 1 den Vorteil, daß in die Stränge der DNA mindestens zwei Fluorochrome eingebaut werden, daß auf einen der beiden Fluorochrome eine Energie E = h.η übertragen wird, und daß die von dem anderen Fluorochrom ausgesandte Energie nachgewiesen wird. Dabei überträgt das erste Fluorochrom eine Resonanzenergie auf das zweite Fluorochrom. Dieser Energietransfer findet nur bei einer spezifischen Hybridisierung der DNA-Stränge statt. Somit wird nur bei einem spezifischen Hybridisierungsereignis ein Signal erzeugt. Störende, unspezifische, artifizielle Signale können hierbei ausgeschlossen werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird auch als Zwischenstrang- Fluorochromresonanztransfer bezeichnet. Es eignet sich zur Anwendung einer Festphasenhybridisierung auf einem DNA- Array.

Die beiden Fluorochrome können entweder in zwei Plus-Stränge, die zu demselben Minus-Strang hybridisieren, eingebaut werden oder in einen Plus-Strang und einen Minus-Strang eines Doppelstranges.

Weitere Vorteile und vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind den Ansprüchen entnehmbar.

Zeichnung

In der Zeichnung sind zwei Möglichkeiten eines Fluorochromresonanztransfers dargestellt und im folgenden näher beschrieben. Es zeigen:

Fig. 1 Zwischenstrang-FRET zwischen Fluorochromen, die auf zwei unterschiedlichen Plus-Strängen gebunden sind, die beide auf denselben Minus-Strang hybridisieren,

Fig. 2 Zwischenstrang-FRET zwischen Fluorochromen, die jeweils an einen Plus- und einen Minus-Strang gekoppelt sind.

Beschreibung des Beispiels

In Fig. 1 und 2 sind zwei Möglichkeiten eines Zwischenstrang- Resonanztransfers bei zwei DNA-Strängen 1 und 2 dargestellt. In Fig. 1 sind die Fluorochrome 3 und 4 auf zwei unterschiedlichen Plus-Strängen 1 gebunden, die beide auf denselben Minus- Strang 2 hybridisieren. In Fig. 2 sind die beiden Fluorochrome 3 und 4 jeweils an einen Plus- und einen Minus-Strang 1, 2 gekoppelt. In beiden Fällen wird eine Energie E = h.η auf das erste Fluorochrom 3 übertragen. Dieses nimmt die Energie auf und strahlt eine Energie ab, die einem Resonanzübergang in dem Fluorochrom 3 entspricht. Diese abgestrahlte Energie wird von dem zweiten Fluorochrom 4 aufgenommen. Das zweite Fluorochrom strahlt seinerseits wiederum eine Energie ab, die durch ein geeignetes Nachweissystem detektiert wird. Eine Abstrahlung des zweiten Fluorochroms findet nur dann statt, wenn eine spezifische Hybridisierung der DNA-Stränge vorliegt. Das Nachweisverfahren eignet sich damit dazu, spezifische Hybridisierungsereignisse anzuzeigen.

Alle in der Beschreibung, den nachfolgenden Ansprüchen und der Zeichnung dargestellten Merkmale können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination miteinander erfindungswesentlich sein.

Bezugszahlenliste

1

DNA-Strang

2

DNA-Strang

3

Fluorochrom

4

Fluorochrom

Claims (4)

1. Verfahren zum Nachweis von Hybridisierungsereignissen bei DNA, dadurch gekennzeichnet,
daß in die Stränge der DNA mindestens zwei Fluorochrome eingebaut werden,
daß auf einen der beiden Fluorochrome eine Energie E = h.η übertragen wird, und
daß die von dem anderen Fluorochrom ausgesandte Energie nachgewiesen wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die beiden Fluorochrome in zwei unterschiedliche Plus- Stränge eingebaut werden, die beide auf denselben Minus- Strang hybridisieren.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Fluorochrom in einen Plus-Strang und das andere Fluorochrom in einem Minus-Strang eines DNA- Doppelstranges eingebaut werden.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es auf einem DNA-Array durchgeführt wird.