ES2241842T3

ES2241842T3 - Regulacion del receptor acoplado a proteinas g tipo receptor adrenergico alfa 1(a) humano.

Info

Publication number: ES2241842T3
Application number: ES01949336T
Authority: ES
Inventors: Shyam Ramakrishnan
Original assignee: Bayer Healthcare AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 2000-05-15
Filing date: 2001-05-11
Publication date: 2005-11-01
Anticipated expiration: 2021-05-11
Also published as: WO2001088126A8; EP1287137B1; AU7051901A; ATE296353T1; WO2001088126A2; WO2001088126A3; EP1287137A2; DK1287137T3; DE60111045D1; DE60111045T2

Abstract

Uso de una célula hospedadora que comprende un vector, comprendiendo dicho vector un polinucleótido, codificando dicho polinucleótido: (i) una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID Nº: 3, o (ii) una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90% idéntica a la SEQ ID Nº: 3, para el rastreo de sustancias útiles en el tratamiento de un trastorno del sistema nervioso central.

Description

Regulación del receptor acoplado a proteínas G tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano.

Campo técnico de la invención

La invención se refiere al campo de los receptores acoplados a proteínas G. Más concretamente, se refiere al campo de los receptores acoplados a proteínas G tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano y a su regulación.

Antecedentes de la invención Receptores acoplados a proteínas G

Muchos procedimientos biológicos de relevancia médica son mediados por vías de transducción de señales en las que participan las proteínas G (Lefkowitz, Nature 351, 353-354, 1991). La familia de los receptores acoplados a proteínas G (GPCR, G-Protein Coupled Receptors) incluyen a los receptores de hormonas, neurotransmisores, factores de crecimiento y virus. Ejemplos específicos de GPCR incluyen receptores de tales agentes diversos como dopamina, calcitonina, hormonas adrenérgicas, endotelina, AMP cíclico, adenosina, acetilcolina, serotonina, histamina, trombina, cinina, hormonas foliculoestimulantes, opsinas, gen 1 de diferenciación endotelial, rodopsinas, odorizantes, citomegalovirus, las propias proteínas G, proteínas efectoras tales como la fosfolipasa C, adenil ciclasa y fosfodiesterasa, y proteínas de actuación tales como la proteína quinasa A y la proteína quinasa C.

Los GPCR poseen siete dominios transmembrana conservados que se conectan con al menos ocho bucles hidrófilos divergentes. Los GPCR (también conocidos como 7TM) han sido caracterizados por incluir estos siete tramos hidrófobos conservados de aproximadamente 20 a 30 aminoácidos, que se conectan con al menos ocho bucles hidrófilos divergentes. La mayoría de los GPCR tienen residuos individuales de cisteína conservados en cada uno de los dos primeros bucles extracelulares, que forman enlaces disulfuro que se cree que estabilizan la estructura funcional de las proteínas. Las siete regiones transmembrana son designadas como TM1, TM2, TM3, TM4, TM5, TM6 y TM7. La región TM3 ha estado implicada en la transducción de señales.

La fosforilación y lipidización (palmitilación o farnesilación) de los residuos de cisteína pueden influir en la transducción de señales de algunos GPCR. La mayoría de los GPCR contienen sitios de fosforilación potencial dentro del tercer bucle citoplasmático y/o carboxi-terminal. Para varios GPCR, tales como el receptor adrenérgico \beta, la fosforilación realizada por la proteína quinasa A y/o determinadas quinasas receptoras media la desensibilización de receptores.

Para algunos receptores, se cree que los sitios de unión a ligandos de los GPCR comprenden cavidades hidrófilas formadas por varios dominios transmembrana de GPCR. Las cavidades hidrófilas están rodeadas de residuos hidrófobos de los GPCR. Se presupone que el lado hidrófilo de cada hélice de transmembrana de GPCR mira hacia dentro, formando un sitio de unión a ligandos polares. La TM3 ha estado implicada en varios GPCR por tener un sitio de unión a ligandos, tal como el residuo de aspartato de TM3. Las serinas de TM5, una asparagina de TM6 y las fenilalaninas o tirosinas de TM6 o TM7 también están implicadas en la unión a ligandos.

Los GPCR son acoplados dentro de la célula por proteínas G heterotriméricas en varias enzimas intracelulares, canales iónicos y transportadores (véase Johnson et al., Endoc. Rev. 10, 317-331, 1989). Varias subunidades alfa de proteínas G diferentes estimulan de forma preferente determinados efectores para modular varias funciones biológicas de las células. La fosforilación de residuos citoplasmáticos de GPCR es un mecanismo de regulación importante de algunos GPCR. Por ejemplo, en una forma de transducción de señales, el efecto de la unión a hormonas es la activación en el interior de la célula de la enzima adenil ciclasa. La activación enzimática por parte de las hormonas depende de la presencia del nucleótido GTP. El GTP también influye en la unión a hormonas. Una proteína G conecta el receptor hormonal a la adenil ciclasa. Una proteína G intercambia el GTP por GDP unido cuando es activada por un receptor hormonal. La forma que lleva el GTP se une entonces con la adenil ciclasa activada. La hidrólisis del GTP al GDP, catalizada por la propia proteína G, devuelve a la proteína G a su forma inactiva elemental. Por tanto, la proteína G desempeña un papel dual, como intermediaria que transmite la señal del receptor al efector, y como un reloj que controla la duración de la señal.

Durante los últimos 15 años, se han introducido satisfactoriamente en el mercado casi 350 agentes terapéuticos centrados en los receptores GPCR. Esto indica que estos receptores cuentan con una historia probada y establecida como objetivos terapéuticos. Evidentemente, continúa existiendo la necesidad de identificar y caracterizar más GPCR que puedan desempeñar un papel en la prevención, mejora o corrección de disfunciones o enfermedades que incluyen, pero no se limitan a, infecciones tales como infecciones bacterianas, micóticas, protozoarias y víricas, concretamente aquéllas causadas por el virus VIH, dolores, cánceres, anorexia, bulimia, asma, enfermedades de Parkinson, insuficiencia cardiaca aguda, hipotensión, hipertensión, retención urinaria, osteoporosis, angina de pecho, infarto de miocardio, úlceras, asma, alergias, hipertrofia prostática benigna, y trastornos psicóticos y neurológicos, incluyendo ansiedad, esquizofrenia, depresión maníaca, delirios, demencia, diversos retrasos mentales y disquinesias, tales como le enfermedad de Huntington y el síndrome de Tourett.

Receptores adrenérgicos

Los receptores adrenérgicos humanos son proteínas integrales de membrana que han sido clasificadas en dos amplias clases, los receptores adrenérgicos alfa y beta (véase la patente estadounidense US.5.922.722). Los dos tipos median la acción del sistema nervioso simpático periférico en la fijación de catecolaminas, norepinefrina y epinefrina.

La norepinefrina es producida por las terminaciones nerviosas adrenérgicas, mientras que la epinefrina es producida por la médula suprarrenal. La afinidad de unión de los receptores adrenérgicos por estos compuestos forma una base de clasificación: los receptores alfa se unen a la norepinefrina con más fuerza que a la epinefrina y con mucha más fuerza que al compuesto sintético isoproterenol. La afinidad de unión de estas hormonas se invierte para los receptores beta. En muchos tejidos, las respuestas funcionales, tales como la contracción del músculo liso, inducidas por la activación del receptor alfa son opuestas a las respuestas inducidas por la unión del receptor beta.

Posteriormente, la distinción funcional entre los receptores alfa y beta fue puesta de mayor relieve y perfeccionada por la caracterización farmacológica de estos receptores a partir de diversas fuentes animales y de tejidos. Como consecuencia, los receptores adrenérgicos alfa y beta se subdividieron aún más en los subtipos \alpha_{1} y \alpha_{2}. Se han reconocido diferencias funcionales entre los receptores \alpha_{1} y \alpha_{2}, y se han desarrollado compuestos que muestran una unión selectiva entre estos dos subtipos. Así, en el documento WO 92/0073, se informa de la capacidad selectiva del enantiómero R(+) de la terazosina de unirse selectivamente a los receptores adrenérgicos subtipo \alpha_{1}. Se reveló la importancia de la selectividad \alpha_{1}/\alpha_{2} de este compuesto porque se decía que la estimulación agonista de los receptores \alpha_{2} inhibía la secreción de epinefrina y norepinefrina, mientras que el antagonismo del receptor \alpha_{2} aumentaba la secreción de estas hormonas. Por lo tanto, el uso de bloqueantes adrenérgicos \alpha no selectivos, tales como fenoxibenzamina y fentolamina, está limitado por su inducción mediada por el receptor adrenérgico \alpha_{2} al aumento de la concentración de la catecolamina plasmática y las secuelas fisiológicas que conlleva (aumento de la frecuencia cardiaca y de la contracción del músculo liso).

Para informarse de los antecedentes generales de los receptores adrenérgicos \alpha, véase Ruffolo, "\alpha adrenoreceptores: Molecular Biology, Biochemistry and Pharmacology" (Progress in Basic and Clinical Pharmacology series, Karger, 1991), donde se trata la base de la subclasificación \alpha_{1}/\alpha_{2}, la biología molecular, la transducción de señales (interacción de la proteína G y posición de un sitio relevante para ésta, y la actividad de unión a ligandos lejos del terminal 3' de los receptores adrenérgicos alfa), las relaciones agonistas entre estructura y actividad, las funciones de los receptores, y las aplicaciones terapéuticas de los compuestos que muestran una afinidad por el receptor adrenérgico \alpha.

La clonación, secuenciación y expresión de los subtipos de receptor alfa procedentes de tejidos animales han conducido a la subclasificación de los receptores \alpha_{1} en \alpha_{1a} (Lomasney et al., J. Biol. Chem. 266, 6365-369, 1991); \alpha_{1a} de rata (Bruno et al., BBRC 179, 1485-90, 1991), \alpha_{1a} y \alpha_{1b} humanos(Cotecchia et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 7159-63, 1998), \alpha_{1b} de hámster (Libert et al., Science 1989), \alpha_{1b} de perro (Ramarao et al., J. Biol. Chem. 267, 21936-945, 1992) y \alpha_{1b} humano. Más recientemente, en un estudio en el que se utilizó cerebro bovino, se propuso un nuevo subtipo \alpha_{1c} (Schwinn et al., J. Biol. Chem. 265, 8183-89, 1990). Hirasawa et al. (BBRC 195, 902-09, 1993) describieron la clonación, expresión funcional y distribución de tejidos del receptor adrenérgico \alpha_{1c} humano. Hoehe et al., Human Mol. Genetics 1(5) 349, 1992) observaron la existencia de un polimorfismo de dos alelos de los fragmentos de restricción de la Pst1 en el gen receptor adrenérgico \alpha_{1c}.Otro estudio sugiere que puede incluso haber un subtipo \alpha_{1d} de receptor (véase Pérez et al., Mol. Pharm. 40, 876-83, 1992). Cada subtipo de receptor \alpha_{1} muestra sus propias especificidades farmacológicas y de tejidos. Schwirm y colaboradores observaron que el receptor \alpha_{1c} bovino clonado mostraba propiedades farmacológicas propuestas para el subtipo \alpha_{1a}. No obstante, se otorgó una nueva designación al receptor basándose en su falta de expresión en tejidos en los que el subtipo \alpha_{1a} sí se expresaba y en su sensibilidad a la cloroetilclonidina.

La base de datos del EMBL revela la secuencia AC016468 que corresponde al clon de Homo sapiens RP11-14N15. Este clon tiene cierta homología con polinucleótidos de la invención. Sin embargo, la entrada de la base de datos no revela la existencia de una relación entre la secuencia y los trastornos del sistema nervioso central.

El documento US 5.994.506 también revela un receptor adrenérgico, su secuencia de nucleótidos y proteínas, y sus procedimientos de expresión. Sin embargo, el documento US 5.994.506 no revela la existencia de una relación entre la secuencia y los trastornos del sistema nervioso central.

El documento WO 98/46620 y Lee et al. (2000, Biochim. Biophys. Acta, 1490: 311-323) proporciona m\alphas receptores acoplados a proteínas G. Sin embargo, no revela la existencia de una relación entre los polipéptidos o polinucleótidos de la invención con trastornos y dolor del sistema nervioso central.

Como de costumbre, la identificación de compuestos activos se realiza mediante el uso de tejidos animales que se sabe que est\alphan enriquecidos con receptores adrenérgicos. Así, se han examinado tejidos de ratas en busca de posibles antagonistas de receptores adrenérgicos. Sin embargo, debido a la variabilidad de las especies, los compuestos que aparecen activos en tejido animal pueden no ser activos o suficientemente selectivos en humanos. Esto supone una pérdida substancial de tiempo y esfuerzos, particularmente cuando se emplean programas de rastreo de grandes volúmenes de compuestos. Existe también el peligro de que determinados compuestos, que podrían ser muy eficaces en humanos, fueran perdidos debido a la ausencia de una afinidad apreciable por los receptores animales heterólogos. A este respecto, se ha observado que incluso cambios de un solo aminoácido entre la secuencia de proteínas biológicamente activas de una especie pueden dar origen a substanciales diferencias farmacológicas. Por lo tanto, Fong et al. (J. Biol. Chem, 267, 25668-71, 1992) demostraron que existen 22 residuos de aminoácidos divergentes entre la secuencia del receptor de neurocinina-1 humano y el receptor homólogo en ratas. Demostraron además, en estudios con receptores mutantes, que la substitución de sólo dos residuos de aminoácidos fue tanto necesaria como suficiente para reproducir en el receptor humano la afinidad de unión a antagonistas del receptor de la rata. Oksenberg et al. (Nature 360, 161-63, 1992) demostraron que la diferencia en un único aminoácido confiere una importante variación farmacológica entre los receptores 5-hidroxitriptamina de humano y roedor. Asimismo, Kuhse et al. (Neuron 5, 867-873, 1990) demostró que el intercambio de un único aminoácido altera la farmacología de la subunidad de receptor de glicina en ratas neonatales. Esta dificultad e imprevisión ha resultado en una necesidad por el rastreo de compuestos que identifique aquellos compuestos que serán activos en humanos. Así, existe la necesidad en la técnica de identificar receptores adrenérgicos tipo \alpha_{1} humano cuya actividad pueda ser regulada para proporcionar efectos terapéuticos.

Resumen de la invención

Un objeto de la invención consiste en proporcionar reactivos y procedimientos de regulación de un receptor humano acoplado a proteínas G. Éste y otros objetos de la invención son proporcionados mediante una o más realizaciones descritas abajo.

Una realización de la invención es el uso de un polinucleótido de receptor adrenérgico \alpha_{1a} en el rastreo de sustancias útiles en el tratamiento de un trastorno del sistema nervioso central. Otra realización de la invención es el uso de un polipéptido de receptor adrenérgico \alpha_{1a} en el rastreo de sustancias útiles en el tratamiento de un trastorno del sistema nervioso central. En una realización preferida de la invención, el trastorno del sistema nervioso central es dolor.

La invención proporciona así un GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano que puede ser empleado para identificar compuestos de prueba que pueden actuar como agonistas o antagonistas en el sitio receptor. El GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano y los fragmentos del mismo también son útiles para generar anticuerpos específicos que pueden bloquear al receptor y prevenir eficazmente la unión a ligandos.

Breve descripción de las figuras

Fig. 1 muestra el ADN genómico humano en el cromosoma 22 que comprende el CDS del receptor adrenérgico \alpha_{1a}.

Fig. 2 muestra una secuencia de ADN que codifica un polipéptido GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} (CDS).

Fig. 3 muestra una secuencia de aminoácidos de un polipéptido de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} codificado por la secuencia de ADN de la fig. 2.

Fig. 4 muestra la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de proteínas de Oryctolagus cuniculus.

Fig. 5 muestra la región promotora y los 118 primeros nucleótidos de la secuencia de ADN de la fig. 1.

En la región promotora hay dos módulos:

A.: EBOX_E2FF_01

1.: Módulo promotor: EBOX_E2FF_01 (que consta de dos dominios de unión mediante actuación en trans, EBOX y E2F).

2.: El módulo participa en la activación del promotor pol del virus de Epstein-Barr.

3.: Referencia: Liu C. Et al., J. Virol. 70, 2545-2555, 1996 (MEDLINE: 8642684).

B.: GATA_AP1F_01

1.: Módulo promotor: GATA_AP1F_01 (que consta de dos dominios de unión mediante actuación en trans, GATA y AP1F).

2.: El módulo se requiere para la expresión constitutiva del gen IL-5 en las células adultas de leucemia de células T.

3.: Referencia: Yamagata T. et al., Mol. Cell. Biol. 17, 4272-4281, 1997 (MEDLINE: 9234684).

Fig. 6 muestra la alineación del GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} de la fig. 3 con el nº de identificación O02824 de la base de datos SwissProt de la fig. 4 (valor esperado 4e-25).

Fig. 7 muestra la alineación BLASTX del GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} de la fig. 3 con el nº de identificación O02824 de la base de datos SwissProt de la fig. 4 (valor esperado 0,013).

Fig. 8 muestra la expresión relativa del GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} en varios tejidos humanos y líneas celulares diferentes según lo determinado mediante RT-PCR.

Fig. 9 muestra la expresión relativa del GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} en varios tejidos humanos según lo determinado mediante RT-PCR utilizando genotecas de fagos o ADNc como molde.

Fig. 10 muestra la expresión relativa del GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} en varios tejidos humanos según lo determinado mediante un análisis Taqman.

Fig. 11 muestra la expresión relativa del GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} en varios tejidos humanos de relevancia en las enfermedades cardiovasculares según lo determinado mediante un análisis Taqman.

Fig. 12 muestra la expresión relativa del GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} en varios tejidos humanos de relevancia en las enfermedades del sistema nervioso central o periférico según lo determinado mediante un análisis Taqman.

Descripción detallada de la invención

La invención se refiere a un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a}.

Además, el presente solicitante ha descubierto que se puede utilizar un GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a}, concretamente un GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano, en procedimientos terapéuticos para tratar trastornos tales como enfermedades de Parkinson, y trastornos psicóticos y neurológicos, incluyendo ansiedad, esquizofrenia, depresión maníaca, delirios, demencia, diversos retrasos mentales y disquinesias, tales como la enfermedad de Huntington y el síndrome de Tourett. El GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano también puede ser empleado para rastrear agonistas y antagonistas del GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a}.

El GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano es un 30% idéntico a lo largo de 216 aminoácidos a la proteína del Oryctolagus cuniculus que tiene el nº de identificación en SwissProt de O02824 (SEQ. ID. Nº: 4) y que está anotada como receptor adrenérgico \alpha_{1a} (fig. 4). El GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano es también un 29% idéntico a lo largo de 74 aminoácidos al O02824. Se espera, por tanto, que el GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano tenga una función tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} y que sea útil para los mismos propósitos que los receptores adrenérgico \alpha_{1a} previamente identificados. El GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano tiene regiones transmembrana desde los aminoácidos 36-53, 71-89, 108-125, 144-161, 189-210, 395-417 y 428-450.

Variantes biológicamente activas

Las variantes de polipéptidos de GPCR que son biológicamente activas, i.e., que conservan la capacidad de unirse a un ligando para producir un efecto biológico, tal como la formación de AMP cíclico, la movilización del calcio intracelular o el metabolismo de la fosfoinositida, también son polipéptidos de GPCR. Preferiblemente, las variantes de polipéptidos de GPCR que se dan de forma natural o no natural tienen secuencias de aminoácidos que son al menos un 50, preferiblemente, aproximadamente un 90% idénticas a una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ. ID. Nº: 3 o un fragmento de la misma. El porcentaje de coincidencia entre una variante putativa de polipéptido de GPCR y una secuencia de aminoácidos de SEQ. ID. Nº: 3 se determina mediante el programa de alineación Blast2 (empleando Blosum62, Expect 10, códigos genéticos estándar).

Las variaciones en el porcentaje de coincidencia pueden deberse, por ejemplo, a sustituciones, inserciones o eliminaciones de aminoácidos. Las sustituciones de aminoácidos se definen como reemplazos de aminoácidos uno a uno. Conservan la naturaleza cuando el aminoácido sustituido tiene propiedades estructurales y/o químicas similares. Como ejemplos de reemplazos conservativos están la sustitución de una leucina por una isoleucina o valina, y la de un aspartato por un glutamato, o una treonina por una serina.

Las inserciones o eliminaciones de aminoácidos son cambios en o dentro de una secuencia de aminoácidos. Lo habitual es que estén en el rango de aproximadamente 1 a 5 aminoácidos. Se puede encontrar orientación sobre la determinación de qué residuos de aminoácido pueden ser sustituidos, insertados o eliminados sin suprimir la actividad biológica o inmunológica de un polipéptido de GPCR mediante la utilización de programas informáticos muy conocidos en la técnica, tales como el software DNASTAR. Se puede determinar fácilmente si un cambio de aminoácido resulta en un polipéptido de GPCR biológicamente activo realizando un ensayos de unión a un ligando o un análisis funcional, como se describe, por ejemplo, en los ejemplos específicos que figuran más adelante.

Proteínas de fusión

Las proteínas de fusión sirven para generar anticuerpos contra las secuencias de aminoácidos de polipéptidos de GPCR y para su uso en varios sistemas de análisis. Por ejemplo, las proteínas de fusión pueden emplearse para identificar proteínas que interactúan con porciones de un polipéptido de GPCR. La cromatografía de afinidad proteica o los análisis basados en genoteca para interacciones entre proteínas, tales como los sistemas de visualización de dos híbridos de levadura o de fagos, pueden emplearse para este propósito. Tales procedimientos son muy conocidos en la técnica y pueden utilizarse también como rastreos de fármacos.

Una proteína de fusión de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano comprende dos segmentos polipeptídicos fusionados por medio de un enlace peptídico. El primer segmento de polipéptidos comprende al menos 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450 ó 500 aminoácidos contiguos de SEQ. ID. Nº: 3 o una variante biológicamente activa de los mismos, tales como las descritas anteriormente. El primer segmento de polipéptidos puede comprender además un GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano de longitud completa.

El segundo segmento de polipéptidos puede ser una proteína de longitud completa o un fragmento de proteína. Las proteínas comúnmente utilizadas en la construcción de proteínas de fusión incluyen la \beta-galactosidasa, \beta-glucuronidasa, proteína verde fluorescente (GFP, Green Fluorescent Protein), proteínas autofluorescentes, que incluyen la proteína azul fluorescente (BFP, Blue Fluorescent Protein), la glutationa-S-transferasa (GST), luciferaza, peroxidasa de rábano picante (HRP, Horseradish peroxidase) y cloranfenicol acetiltransferasa (CAT). Adicionalmente, en las construcciones de proteínas de fusión se utilizan marcadores de epitopo, incluyendo marcadores de histidina (His), marcadores FLAG, marcadores de la hemaglutinina de la gripe (HA) marcadores Myc; marcadores VSV-G y marcadores de tioredoxina (Trx). Otras construcciones de fusión pueden incluir la proteína de unión a la maltosa (MBP), el marcador S, fusiones de dominios de unión Lex A al ADN (DBD), fusiones de dominios de unión al ADN GAL4 y fusiones de proteínas BP16 del virus herpes simplex (HSV). También se puede diseñar una proteína de fusión para que contenga un sitio de clivaje localizado entre la secuencia codificante del polipéptido de GPCR y la secuencia de proteínas heterológas, de manera que el polipéptido de GPCR pueda ser clivado y purificado lejos del resto heterólogo.

Una proteína de fusión puede sintetizarse químicamente, como se conoce en la técnica. Preferiblemente, una proteína de fusión se produce mediante enlace covalente de dos segmentos polipeptídicos o mediante procedimientos estándar de la técnica de la Biología Molecular. Se pueden emplear los procedimientos de ADN recombinante para preparar proteínas de fusión, por ejemplo, haciendo un constructo de ADN que comprenda secuencias codificantes seleccionadas del complementario del SEQ. ID. Nº: 2 en un marco de lectura adecuado con nucleótidos que codifiquen el segundo segmento de polipéptidos y expresen el constructo de ADN en una célula hospedadora, tal y como se conoce en la técnica. Hay muchos equipos para la construcción de proteínas de fusión disponibles en compañías tales como Promega Corporation (Madison, WI), Stratagene (La Jolla, CA), CLONTECH (Mountain View, CA), Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), MBL International Corporation (MIC; Watertown, MA) y Quantum Biotechnologies (Montreal, Canadá; 1-888-DNA-KITS).

Identificación de homólogos de especies

Los homólogos de especies de polipéptidos de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano se pueden obtener utilizando polinucleótidos de la invención (descritos a continuación) para hacer sondas o cebadores aptos para el rastreo de genotecas de expresión de ADNc procedentes de otras especies, tales como ratones, monos o levadura, identificando los ADNc que codifiquen homólogos de polipéptido de GPCR y expresando los ADNc como se conoce en la técnica.

Polinucleótidos

Un polinucleótido de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano puede ser de cadena sencilla o doble, y comprende una secuencia codificante o el complementario de una secuencia codificante de un polipéptido de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano. En la SEQ. ID. Nº: 2 se muestra una secuencia codificante para un GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano. La secuencia codificante obedece a la norma clásica KOZAK para el sitio de inicio de la transcripción. La secuencia codificante de SEQ. ID. Nº: 1 comprende esta secuencia codificante y contiene además un módulo promotor (EBOX_E2FF_01), que consta de dos dominios de unión mediante actuación en trans, EBOX y E2F. El módulo participa en la activación del promotor pol del virus de Epstein-Barr. Véase Liu et al., J. Virol. 70, 2545-55, 1996. La SEQ. ID. Nº: 1 contiene también un módulo promotor (GATA_AP1F_01), que consta de dos dominios de unión mediante actuación en trans, GATA y AP1F. El módulo es necesario para la expresión constitutiva del gen IL-5 de células adultas de leucemia de células T. Véase Yamagata et al., Mol. Cell. Biol. 17, 4272-81, 1997.

Las secuencias de nucleótidos degenerados que codifican polipéptidos de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano, así como las secuencias de nucleótidos homólogos que son al menos aproximadamente un 50, preferiblemente, aproximadamente un 75, 90, 96 ó 98% idénticas a las secuencias de nucleótidos mostradas en la SEQ. ID. Nº: 1 ó 3 son también polinucleótidos de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano. El porcentaje de coincidencia entre las secuencias de dos polinucleótidos se determina mediante programas informáticos tales como ALIGN, que emplea el algoritmo FASTA, utilizando una búsqueda de huecos afines con una penalización de apertura de huecos de -12 y una penalización de extensión de huecos de -2. Las moléculas de ADN complementario (ADNc), los homólogos de especies y las variantes de polinucleótidos de GPCR que codifican polipéptidos de GPCR biológicamente activos son también polinucleótidos de GPCR.

Preparación de polinucleótidos

Los polinucleótidos naturales pueden ser aislados libres de otros componentes celulares tales como componentes de la membrana, proteínas y lípidos. Los polinucleótidos pueden ser hechos por una célula y aislados utilizando técnicas estándar de purificación de ácidos nucleicos, o sintetizados mediante una técnica de amplificación, tal como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, Polymerase Chain Reaction) o mediante un sintetizador automático. Los procedimientos para aislar polinucleótidos son muy habituales y conocidos en la técnica. Cualquiera de tales técnicas utilizadas para la obtención de un polinucleótido puede utilizarse para obtener polinucleótidos aislados. Por ejemplo, se pueden emplear enzimas de restricción y sondas para aislar fragmentos de polinucleótidos que comprendan secuencias de nucleótidos de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano. Los polinucleótidos aislados se encuentran en preparaciones que están libres o al menos un 70, 80 ó 90% libres de otras moléculas.

Las moléculas de ADNc de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano pueden formarse con técnicas estándar de biología molecular, empleando ARNm de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano como molde. Las moléculas de ADNc pueden ser a partir de entonces replicadas mediante técnicas de biología molecular conocidas en la técnica y reveladas en manuales tales como Sambrook et al. (1989). Se puede utilizar una técnica de amplificación, tal como una PCR, para obtener copias adicionales de los polinucleótidos de la invención, usando bien ADN de genoma humano o ADNc como molde.

Alternativamente, se pueden utilizar técnicas de química sintética para sintetizar polinucleótidos de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano. La degeneración del código genético permite alternar secuencias de nucleótidos para ser sintetizadas, lo que codificará un polipéptido que tenga, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ. ID. Nº: 3 o una variante biológicamente activa de la misma.

Extensión de polinucleótidos

Hay varios procedimientos basados en la PCR que pueden ser utilizados para extender las secuencias de ácido nucleico que codifican las porciones reveladas del GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano para rastrear corriente arriba secuencias tales como promotores y elemento reguladores. Por ejemplo, la PCR de los sitios de restricción utiliza cebadores universales para reparar una secuencia desconocida adyacente a un locus conocido (Sarkar, PCR Methods Applic. 2, 318-322, 1993). El ADN genómico se amplifica primero en presencia de un cebador a una secuencia enlazante y a un cebador específico de la región conocida. Las secuencias amplificadas son luego sometidas a una segunda serie de la PCR con el mismo cebador enlazante y otro cebador específico interno del primero. Los productos de cada serie de la PCR son transcritos con una polimerasa de ARN adecuada y secuenciados empleando una transcriptasa inversa.

La PCR inversa también pueden ser utilizada para amplificar o extender las secuencias, empleando cebadores divergentes basados an una región conocida (Triglia et al., Nucleic Acids Res. 16, 8186, 1988). Los cebadores pueden ser diseñados con softwares comercialmente disponibles, tales como el software de análisis de cebadores OLIGO 4.06 (National Biosciences Inc., Plymoth, Minn.), tener de 22 a 30 nucleótidos de longitud, tener un contenido de GC del 50% o mayor, y aparearse con la secuencia diana a temperaturas de aproximadamente 68-72ºC. El procedimiento utiliza varias enzimas de restricción para generar un fragmento adecuado en la región conocida del gen. El fragmento es luego rodeado por una unión intramolecular y utilizado como molde de la PCR.

Otro procedimiento que puede ser empleado es la PCR de captura, que supone la amplificación mediante PCR de los fragmentos de ADN adyacentes a una secuencia conocida de ADN cromosómico artificial humano y de levadura (Lagerstrom et al., PCR Methods Applic. 1, 111-119, 1991). En este procedimiento, las digestiones y ligaciones de múltiples enzimas de restricción también pueden ser utilizadas para colocar una secuencia de doble cadena creada por ingeniería dentro de un fragmento desconocido de la molécula de ADN antes de realizar la PCR.

Otro procedimiento que puede utilizarse para reparar secuencias desconocidas es el de Parker et al., Nucleic Acids Res. 19, 3055-3060, 1991). Adicionalmente, se pueden utilizar la PCR, cebadores anidados y las genotecas PROMOTERFINDER (CLONTECH, Palo Alto, Calif.). Este procedimiento evita la necesidad de genotecas de rastreo y es útil en la búsqueda de uniones intron/exon.

Cuando se rastrea en busca de ADNc de longitud completa, es preferible utilizar genotecas que hayan sido seleccionadas por tamaño para incluir ADNc más largos. Se prefieren las genotecas de cebado aleatorio, ya que contendrán más secuencias que contengan las regiones 5' de genes. El uso de una genoteca de cebado aleatorio puede ser especialmente preferible en aquellas situaciones en las que una genoteca de oligo d(T) no produzca un ADNc de longitud completa. Las genotecas pueden resultar útiles para la extensión de una secuencia en regiones reguladoras no transcritas 5'.

Se pueden utilizar sistema de electroforesis capilar comercialmente disponibles para analizar el tamaño o confirmar la secuencia de nucleótidos de la PCR o los productos de la secuenciación. Por ejemplo, la secuenciación capilar puede emplear polímeros circulantes para la separación electroforética, cuatro colores fluorescentes distintos (uno por cada nucleótido) que se activan con láser, y rastreo de las longitudes de onda emitidas mediante una cámara con dispositivo de carga acoplado. La intensidad de salida / luz puede convertirse en una señal eléctrica utilizando un software adecuado (p.ej.: GENOTYPER y Sequence NAVIGATOR, Perkin Elmer), y el procedimiento completo desde la carga de las muestras al análisis informático y la visualización de datos electrónicos puede ser controlado por ordenador. La electroforesis capilar es especialmente preferible para la secuenciación de pequeños trozos de ADN que podrían estar presentes en cantidades limitadas en una determinada muestra.

Obtención de polipéptidos de GPCR

Se pueden obtener polipéptidos de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano, por ejemplo, mediante la purificación a partir de células humanas, mediante la expresión de polinucleótidos o mediante una síntesis química directa.

Purificación de proteínas

Los polipéptidos de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano pueden ser purificados a partir de cualquier célula humana que exprese el receptor, incluyendo células hospedadoras que hayan sido transfectadas con polinucleótidos de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano. El polipéptido purificado es separado de otros compuestos normalmente asociados con el polipéptido en la célula, tales como ciertas proteínas, carbohidratos o lípidos, mediante procedimientos muy conocidos en la técnica. Tales procedimientos incluyen, pero no se limitan a, cromatografía por exclusión de tamaño, fraccionamiento con sulfato de amonio, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad y electroforesis en gel preparativo.

Un polipéptido de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano puede ser convenientemente aislado como un complejo con su proteína G asociada, como se describe en los ejemplos específicos de más adelante. Una preparación de polipéptidos de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano purificados es al menos un 80% pura; preferiblemente, las preparaciones son un 90, 95 ó 99% puras. La pureza de las preparaciones puede medirse mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica, tal como electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS.

Expresión de polinucleótidos

Para expresar un polipéptido de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano, se puede insertar un polinucleótido de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano en un vector de expresión que contenga los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia codificante insertada. Se pueden utilizar procedimientos que son muy conocidos por los expertos en la técnica para construir vectores de expresión que contengan secuencias que codifiquen polipéptidos de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano, así como elementos de control transcripcional y traduccional adecuados. Estos procedimientos incluyen técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas y recombinación genética in vivo. Tales técnicas se describen, por ejemplo, en Sambrook et al. (1989) y en Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, Nueva York, N.Y., 1989.

Se puede utilizar una variedad de sistemas vectoriales / hospedadores de expresión para contener y expresar secuencias que codifiquen un polipéptido de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano. Éstos incluyen, pero no se limitan a, microorganismos, tales como bacterias transformadas con vectores de expresión de ADN de bateriófagos recombinantes, plásmidos o cósmidos; levadura transformada con vectores de expresión de levadura; sistemas celulares de insectos infectados con vectores de expresión de virus (p.ej.: baculovirus); sistemas celulares de plantas transformados con vectores de expresión de virus (p.ej.: virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco TMV) o con vectores de expresión bacterianos (p.ej.: plásmidos Ti o pBR322), o sistemas celulares animales.

Los elementos de control o secuencias reguladoras son aquellas regiones no traducidas del vector (potenciadores, promotores, regiones no traducidas 5' y 3') que interactúan con proteínas de las células hospedadora para llevar a cabo la transcripción y traducción. Tales elementos pueden variar en su longitud y especificidad. Dependiendo del sistema vectorial y del hospedador utilizado, se puede utilizar cualquier número de elementos de transcripción y traducción aptos, incluyendo promotores constitutivos e inducibles. Por ejemplo, cuando se realizan clonaciones en sistemas bacterianos, se pueden utilizar promotores inducibles tales como el promotor lacZ híbrido del fagémido BLUESCRIPT (Stratagene, La Jolla, Calif.) o del plásmido pSPORT1 (Life Technologies) y similares. El promotor de polihedrina de los baculovirus puede ser utilizado en células de insectos. Los promotores o potenciadores derivados de los genomas de células de plantas (p.ej.: genes de proteínas de choque térmico, RUBISCO, y almacenamiento) o de virus de plantas (p.ej.: promotores víricos o secuencias guías) pueden ser clonados dentro del vector. En los sistemas celulares de mamíferos, se prefieren los promotores de genes de mamíferos o de virus de mamíferos. Si es necesario generar una línea celular que contenga múltiples copias de una secuencia de nucleótidos que codifiquen un polipéptido de GPCR, se pueden utilizar vectores basados en SV40 o EBV con un marcador seleccionable adecuado.

Sistemas de expresión bacterianos y de levadura

En los sistemas bacterianos, se puede seleccionar un número de vectores de expresión en función del uso que se pretende dar al polipéptido de GPCR. Por ejemplo, cuando se necesita una gran cantidad de polipéptido de GPCR para la inducción de anticuerpos, se pueden utilizar vectores que dirijan una expresión de alto nivel de las proteínas de fusión que son fácilmente purificadas. Tales vectores incluyen, pero no se limitan a, vectores multifuncionales de clonación y expresión de E. coli tales como el BLUESCRIPT (Stratagene). En un vector BLUESCRIPT, se puede unir una secuencia codificante del polipéptido de GPCR dentro del vector del marco con secuencias para el extremo amino terminal Met y los 7 residuos posteriores de la \beta-galactosidasa, de manera que se produzca una proteína híbrida. Los vectores pIN (Van Heeke y Schuster, J. Biol. Chem. 264, 5503-5509, 1989) o los vectores pGEX (Promega Madison, Wis.) también pueden ser empleados para expresar polipéptidos foráneos como proteínas de fusión con glutationa-S-transferasa (GST). En general, tales proteínas de fusión son solubles y pueden ser fácilmente purificadas a partir de células lisadas mediante una adsorción en perlas de glutationa-agarosa seguida de una elución en presencia de glutationa libre. Las proteínas formadas en tales sistemas pueden ser diseñadas para que incluyan heparina, trombina o sitios de clivaje de proteasa mediante el factor Xa, de manera que el polipéptido clonado de interés pueda ser liberado del resto de GST a voluntad.

En la levadura Saccharomyces cerevisiae, se puede utilizar un número de vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles tales como factor alfa, alcohol oxidasa y PGH. Para más información, véase Ausubel et al. (1989) y Grant et al., Methods Enzymol. 153, 516-544, 1987.

Sistemas de expresión de plantas e insectos

Si se utilizan vectores de expresión de plantas, la expresión de las secuencias que codifican polipéptidos de GPCR puede ser dirigida por cualquiera de una serie de promotores. Por ejemplo, se pueden utilizar promotores víricos, tales como los promotores 35S y 19S de CaMV, solos o en combinación con la secuencia guía omega del TMV (Takamatsu, EMBO J. 6, 307-311, 1987). Como alternativa, se pueden utilizar promotores de plantas tales como la pequeña subunidad del RUBISCO o promotores de choque térmico (Coruzzi et al., EMBO J. 3, 1671-1680, 1984; Broglie et al., Science 224, 838-843, 1984; Winter et al., Results Probl. Cell Differ. 17, 85-105, 1991). Estos constructos pueden ser introducidos en células de plantas mediante transformación directa del ADN o mediante transfección mediada por un patógeno. Tales técnicas se describen en un número de revistas generalmente disponibles (p.ej. Hobbs o Murray, en "McGraw Hill Yearbook of Science and Technology", MacGraw Hill, Nueva York, N.Y., pp. 191-196, 1992).

También se puede utilizar un sistema de insectos para expresar un polipéptido GPCR. Por ejemplo, en uno de tales sistemas, el virus de la polihedrosis nuclear, Autographa californica (AcNPV), se emplea como un vector para expresar genes foráneos en células de Spodoptera frugiperda o de Trichoplusia larvae. Las secuencias que codifican polipéptidos de GPCR pueden ser clonadas dentro de una región no esencial del virus, tal como el gen de polihedrina, y puestas bajo el control del promotor de polihedrina. Una buena inserción de los polipéptidos de GPCR desactivará al gen de polihedrina y producirá una proteína sin cubierta de virus recombinante. Los virus recombinantes pueden entonces utilizarse para infectar a células de S. frugiperda o de Trichoplusia larvae en las que se pueden expresar polipéptidos de GPCR (Engelhard et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 91, 3224-3227, 1994).

Sistemas de expresión de mamíferos

Se puede utilizar una serie de sistemas de expresión basados en virus para expresar los polipéptidos de GPCR en células hospedadoras de mamíferos. Por ejemplo, si se utiliza un adenovirus como vector de expresión, las secuencias codificantes de los polipéptidos de GPCR pueden ser ligadas dentro de un complejo de transcripción / traducción de adenovirus que comprenda el último promotor y una secuencia guía tripartita. La inserción en una región E1 o E3 no esencial del genoma vírico puede emplearse para obtener un virus viable que sea capaz de expresar un polipéptido de GPCR en células hospedadoras infectadas (Loan y Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 3655-3659, 1984). Si se desea, se pueden utilizar potenciadores de la transcripción, tales como el potenciador del virus del sarcoma de Rous (RSV), para aumentar la expresión en células hospedadoras mamíferas.

También se pueden usar cromosomas artificiales humanos (HAC, Human Artificial Chromosomes) para administrar fragmentos más largos de ADN de los que pueden estar contenidos y expresados en un plásmido. Los HAC de 6M a 10M son construidos y administrados en células mediante procedimientos convencionales de administración (p.ej.: liposomas, polímeros amino policatiónicos o vesículas).

También se puede hacer uso de señales de iniciación específica para conseguir una traducción más eficaz de las secuencias que codifican los polipéptidos de GPCR. Tales señales incluyen el codón de iniciación ATG y secuencias adyacentes. En los casos en los que se insertan dentro del vector de expresión adecuado las secuencias codificantes de un polipéptido de GPCR, su codón de iniciación y secuencias de corriente arriba, puede que no se necesiten señales adicionales de control transcripcional o traduccional. Sin embargo, en los casos en los que sólo se inserta la secuencia codificante o un fragmento de la misma, se deberían proporcionar señales exógenas de control traduccional (incluyendo el codón de iniciación ATG). El codón de iniciación debería estar en el marco de lectura correcto para garantizar la traducción de todo el inserto. Los elementos traduccionales exógenos y los codones de iniciación pueden tener varios orígenes, tanto naturales como sintéticos. La eficacia de la expresión puede mejorarse mediante la inclusión de potenciadores que sean adecuados para el sistema celular concreto que se utiliza (véase Scharf et al., Results Probl. Cell Differ. 20, 125-162, 1994).

Células hospedadoras

Las cadenas celulares hospedadoras se pueden seleccionar en base a su capacidad para modular la expresión de las secuencias insertadas o para procesar el polipéptido de GPCR expresado del modo deseado. Tales modificaciones del polipéptido incluyen, pero no se limitan a, la acetilación, carboxilación, glicosilación, fosforilación, lipidación y acilación. También se puede utilizar un procesamiento post traduccional que clive una forma "prepro" del polipéptido para facilitar una inserción, un plegamiento y/o una función correcta. Hay distintas células hospedadoras que tienen una maquinaria celular específica y unos mecanismos característicos para las actividades post traduccionales (p.ej.: OHC, HeLa, MDCK, HEK293 y WI38) que se encuentran disponibles en la colección de cultivos tipo estadounidense (ATCC, American Type Culture Collection; 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209) y que pueden seleccionarse para garantizar una modificación y un procesamiento correctos de la proteína foránea.

Se prefiere una expresión estable para una producción a largo plazo y de alto rendimiento de proteínas recombinantes. Por ejemplo, las líneas celulares que expresan establemente polipéptidos de GPCR pueden ser transformadas utilizando vectores de expresión que pueden contener orígenes víricos de elementos de replicación y/o expresión endógena, así como un gen marcador seleccionable en el mismo o en otro vector. Tras al introducción del vector, se puede dejar crecer a las células durante 1 ó 2 días en un medio enriquecido antes de ser cambiadas a un medio selectivo. El propósito del marcador seleccionable consiste en conferir resistencia a la selección, y su presencia permite el crecimiento y la recuperación de las células que expresan correctamente las secuencias de GPCR introducidas. Se pueden hacer proliferar clones resistentes de células transformadas establemente utilizando técnicas de cultivo de tejidos adecuadas al tipo de célula. Véase, por ejemplo, "Animal Cell Culture", R.I. Freshney, ed., 1986.

Se puede utilizar cualquier número de sistemas de selección para recuperar líneas celulares transformadas.

Éstos incluyen, pero no se limitan a, genes de timidina quinasa del virus del herpes simplex (Wigler et al., Cell 11, 223-32, 1997) y adenina fosforibosiltransferasa (Lowy et al., Cell 22, 817-23, 1980) que pueden ser empleados en células tk^{-} y aprt^{-} respectivamente. También se puede utilizar como base de selección la resistencia a antimetabolitos, antibióticos o herbicidas. Por ejemplo, dhfr confiere resistencia al metotrexato (Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 77, 3567-70, 1980), npt confiere resistencia a las aminoglicosidas, neomicin y G-418 (Colbere-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150, 1-14, 1981), y als y pat confieren resistencia al clorosulfurón y fosfinotricin acetiltransferasa, respectivamente (Murray, 1992, supra). Hay más genes seleccionables descritos: por ejemplo, el trpB permite a la células utilizar indol en lugar de triptofano, o hisD, que permite a las células utilizar histinol en lugar de histidina (Hartman y Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 8047-51, 1998). Se pueden utilizar marcadores visibles tales como antocianinas, \beta-glucuronidasa y su sustrato GUS, y luciferaza y su sustrato luciferina, para identificar los transformantes y cuantificar la cantidad expresión de proteínas transitorias o estables atribuible a un determinado sistema vectorial (Rhodes et al., Methods Mol. Biol. 55, 121-131, 1995).

Detección de la expresión de polipéptidos

Aunque la presencia de la expresión de genes marcadores sugiera que también está presente el polinucleótido de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano, puede que se necesite la confirmación de su presencia y expresión. Por ejemplo, si se inserta una secuencia codificante de un polipéptido de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano dentro de una secuencia de genes marcadores, se pueden identificar las células transformadas que contienen las secuencias que codifican un polipéptido de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano mediante la ausencia de la función de genes marcadores. Alternativamente, se puede colocar un gen marcador conjuntamente con una secuencia codificante de un polipéptido de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano bajo el control de un único promotor. La expresión del gen marcador como respuesta a una inducción o selección indica normalmente la expresión del polinucleótido de GPCR.

Alternativamente, las células hospedadoras que contienen un polinucleótido de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano y que expresan un polipéptido de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano pueden ser identificadas mediante una variedad de procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. Estos procedimientos incluyen, pero no se limitan a, hibridaciones ADN-ADN o ADN-ARN y técnicas de bioanálisis o inmunoanálisis de proteínas, que incluyen tecnologías de membrana, soluciones o basadas en chips para la detección y/o cuantificación del ácido nucleico o proteína. Por ejemplo, la presencia de una secuencia de polinucleótidos codificante de un polipéptido de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano puede ser detectada mediante hibridación o amplificación ADN-ADN o ADN-ARN, utilizando sondas o fragmentos de polinucleótidos codificantes de un polipéptido de GPCR. Los análisis basados en la amplificación de ácido nucleico suponen el uso de oligonucleótidos seleccionados entre las secuencias codificantes de un polipéptido de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano para detectar los transformantes que contengan un polinucleótido de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano.

Se conocen en la técnica una variedad de protocolos para el rastreo y medición de la expresión de un polipéptido de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano, que utilizan bien anticuerpos policlonales o monoclonales específicos del polipéptido. Los ejemplos incluyen el análisis de inmunoabsorción ligado a una enzima (ELISA), el análisis radioinmunológico (RIA) o la separación de células activadas por fluorescencia (FACS). Se puede utilizar un inmunoanálisis de base monoclonal de dos sitios que usa anticuerpos monoclonales reactivos a dos epitopes de no interferencia sobre un polipéptido de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano, o también, un ensayos de unión competitiva. Éstos y otros análisis se encuentran descritos en Hampton et al., "Serological Methods: A Laboratory Manual", APS Press, St. Paul, Minn., 1990) y en Maddox et al., J. Exp. Med. 158, 1211-1216, 1983).

Hay una gran variedad de etiquetas y técnicas de conjugación conocidas por los expertos en la técnica y que se pueden utilizar en varios análisis de ácidos nucleicos y aminoácidos. Los procedimientos para producir hibridación marcada o sondas PCR para rastrear las secuencias relacionadas con los polinucleótidos que codifican polipéptidos de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano incluyen oligomarcado, traslado de mellas, marcado del extremo o amplificación PCR utilizando un nucleótido marcado. Alternativamente, se pueden clonar las secuencias codificantes de un polipéptido de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano en un vector para producir una sonda de ARNm. Tales vectores son conocidos en la técnica, están comercialmente disponibles y pueden ser empleados para sintetizar sondas de ARN in vitro mediante la adición de nucleótidos marcados y una polimerasa de ARN adecuada tal como T7, T3 o SP6. Estos procedimientos pueden ser dirigidos utilizando una variedad de equipos comercialmente disponibles (Amersham Pharmacia Biotech, Promega y US Biochemical). Las moléculas o etiquetas indicadoras aptas que pueden utilizarse para facilitar el rastreo incluyen radionuclidas, enzimas y agentes fluorescentes, quimioluminiscentes o cromogénicos, así como sustratos, cofactores, inhibidores, partículas magnéticas y similares.

Expresión y purificación de polipéptidos de GPCR

Las células hospedadoras transformadas con secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano pueden ser cultivadas bajo condiciones aptas para la expresión y recuperación de la proteína del cultivo celular. El polipéptido producido mediante una célula transformada puede ser segregado o estar contenido intracelularmente en función de la secuencia y/o el vector utilizado. Como los expertos en la técnica entenderán, los vectores de expresión que contienen polinucleótidos que codifican los polipéptidos de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano pueden ser diseñados para que contengan secuencias de señales que dirijan la secreción de polipéptidos solubles a través de la membrana de la célula procariota o eucariota, o que dirijan la inserción de membrana del polipéptido unido a membrana.

Como se trata anteriormente, se pueden emplear otras construcciones para unir una secuencia codificante de un polipéptido de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano a una secuencia de nucleótidos codificante de un dominio polipeptídico que facilitará la purificación de las proteínas solubles. Tales dominios que facilitan la purificación incluyen, pero no se limitan a, péptidos quelantes de metal tales como módulos histidina-triptofano, que permiten la purificación sobre metales inmovilizados; dominios de proteína A, que permiten la purificación sobre inmunoglobulina inmovilizada, y el dominio utilizado en el sistema de purificación mediante extensión / afinidad FLAGS (Immunex Corp., Seattle, Wash.). También se puede emplear la inclusión de secuencias de ligadores clivables, tales como las específicas del factor Xa o la enteroquinasa (Invitrogen, San Diego, CA), entre el dominio de purificación y el polipéptido de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano para facilitar la purificación. Uno de tales vectores de expresión mantiene la expresión de una proteína de fusión que contiene un polipéptido de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano y 6 residuos de histidina, precediendo a una tioredoxina o un sitio de clivaje de enteroquinasa. Los residuos de histidina facilitan la purificación mediante cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados (IMAC, Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography), como se describe en Porath et al., Prot. Exp. Purif. 3, 263-281, 1992), mientras que los sitios de clivaje de enteroquinasa proporcionan un medio para la purificación del polipéptido de la proteína de fusión. En Kroll et al., DNA Cell Biol. 12, 441-453, 1993, se revelan vectores que contienen proteínas de fusión.

Síntesis química

Se pueden sintetizar secuencias codificantes de un polipéptido de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano, completamente o en parte, empleando procedimientos químicos muy conocidos en la técnica (véase Caruthers et al., Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 215-223, 1980; Horn et al. Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 225-232, 1980). Alternativamente, se puede producir un propio polipéptido de GPCR empleando procedimientos químicos para sintetizar su secuencia de aminoácidos, tales como mediante síntesis directa de péptidos empleando técnicas de fase sólida (Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154, 1963; Roberge et al., Science 269, 202-204, 1995). La síntesis de proteínas puede realizarse utilizando técnicas manuales o mediante automoción. La síntesis automatizada puede conseguirse, por ejemplo, empleando el sintetizador de péptidos 431A de Applied Biosystems (Perkin Elmer). Opcionalmente, se pueden sintetizar fragmentos de polipéptidos de GPCR por separado o combinados, utilizando procedimientos químicos para producir una molécula de longitud completa.

El péptido recién sintetizado puede ser substancialmente purificado mediante cromatografía preparativa de líquidos de alta resolución (p.ej.: Creighton, "Proteins: Structures and Molecular Principles", WH Freeman y Co., Nueva York, N.Y., 1983). La composición de un polipéptido de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano sintético puede confirmarse mediante un análisis o secuenciación de aminoácidos (p.ej.: el procedimiento de degradación de Edman; véase Creighton, supra). Adicionalmente, se puede modificar cualquier porción de la secuencia de aminoácidos del polipéptido de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano durante la síntesis directa y/o combinada, utilizando procedimientos químicos con secuencias de otras proteínas para producir una variante del polipéptido o una proteína de fusión.

Procedimientos de rastreo

La invención proporciona análisis para el rastreo de los compuestos de prueba que se unen a o modulan la actividad de un polipéptido o polinucleótido de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano. Un compuesto de prueba se une preferiblemente a un polipéptido o polinucleótido de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano. Más preferiblemente, un compuesto de prueba hace aumentar o disminuir una actividad biológica mediada por un GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano en aproximadamente un 10%, preferiblemente, aproximadamente un 50% y más preferiblemente, aproximadamente un 75, 90 ó 100% con respecto a la ausencia del compuesto de prueba.

Compuestos de prueba

Los compuestos de prueba pueden ser agentes farmacológicos ya conocidos en la técnica o pueden ser compuestos cuya actividad farmacológica antes era desconocida. Los compuestos pueden ser naturales o diseñados en laboratorio. Pueden estar aislados de microorganismos, animales o plantas, y pueden ser producidos recombinatoriamente o sintetizados mediante procedimientos químicos conocidos en la técnica. Si se desea, se pueden obtener los compuestos de prueba empleando cualquiera de los numerosos procedimientos de genoteca combinatoria conocidos en la técnica, incluyendo, pero no limitándose a, genotecas biológicas, genotecas de fase sólida o de fase solución paralelas dirigibles espacialmente, procedimientos de genoteca sintética que requieren deconvolución, el procedimiento de genoteca "one-bead one-compound" y los procedimientos de genoteca sintética que utilizan la selección mediante cromatografía de afinidad. El enfoque de la genoteca biológica se limita a las genotecas de polipéptidos, mientras que el resto de los cuatro enfoques son aplicables a genotecas de polipéptidos, oligómeros no peptídicos o pequeñas moléculas de compuestos. Véase Lam, Anticancer Drug Des. 12, 145, 1997.

Los procedimientos para la síntesis de genotecas moleculares son muy conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 90, 6909, 1993; Erb et al. Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 91, 11422, 1994; Zuckermann et al.,J. Med. Chem. 37, 2678, 1998; OHC et al, Science 261, 1303,1993; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Inglesa. 33, 2059, 1994; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Inglesa. 33, 2061; Gallop et al. J. Med. Chem. 37, 1233, 1994). Las genotecas de compuestos pueden presentarse en solución (véase, p.ej.: Houghten, Biotechniques 13, 412-421, 1992) o en perlas (Lam, Nature 354, 82-84, 1991), chips (Fodor, Nature 364, 555-556, 1993), bacterias o esporas (Ladner, Patente US5.223.409), plásmidos (Cull et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89, 1865-1869, 1992) o fago (Scott y Smith, Science 249, 386-390, 1990; Devlin, Science 249, 404-406, 1990); Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 97, 6378-6382, 1990; Felici, J. Mol. Biol. 222, 301-310, 1991; y Ladner, Patente US5.223.409).

Rastreo de alta capacidad

Los compuestos de prueba pueden ser rastreados en busca de su capacidad de unirse a polipéptidos o polinucleótidos de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano, o de afectar a la actividad o expresión genética de los GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano utilizando un rastreo de alta capacidad. Mediante la utilización del rastreo de alta capacidad, se pueden probar numerosos compuestos discretos en paralelo, de manera que se pueden rastrear grandes números de compuestos de prueba rápidamente. Las técnicas más ampliamente asentadas utilizan placa de microvaloración de 96 pozos. Lo normal es que los pozos de las placas de microvaloración necesiten volúmenes de análisis que varían de 50 a 500 \mul. Además de las placas, hay disponibles comercialmente numerosos instrumentos, materiales, pipetas, robótica, limpiadores de placa y lectores de placa que se ajustan al formato de 96 pozos.

Alternativamente, se pueden utilizar "análisis de formato libre" o análisis sin barrera física entre las muestras. Por ejemplo, en Jayawickreme et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 19, 1614-18 (1994), se describe un análisis que utiliza células de pigmentación (melanocitos) en un análisis homogéneo simple para genotecas combinatorias de péptidos. Se colocan las células bajo agarosa en placas petri, luego se colocan perlas que llevan compuestos combinatorios sobre la superficie de la agarosa. Los compuestos combinatorios son parcialmente liberados de las perlas. Se pueden visualizar los compuestos activos como zonas con un pigmento oscuro porque, a medida que se difunden los compuestos localmente dentro de la matriz del gel, los compuestos activos hacen que las células cambien de color.

Otro ejemplo de análisis de formato libre se describe en Chelsky, "Strategies for Screening Combinatorial Librarles: Novel and Traditional Approaches", difundido en la primera conferencia anual de la Sociedad para el Rastreo Biomolecular de Filadelfia, Pa. (7-10 Nov, 1995). Chelsky introdujo un análisis enzimático homogéneo simple para la anhidrasa carbónica dentro de un gel de agarosa, de manera que la enzima del gel produjera un cambio de color en el gel. Después de ello, se introdujeron perlas portadoras de compuestos combinatorios mediante un fotoligador dentro del gel, y los compuestos fueron liberados parcialmente mediante luz ultravioleta. Los compuestos que inhibieron la enzima fueron observados como zonas locales de inhibición con un menor cambio de color.

Todavía se describe otro ejemplo más en Salmon et al., Molecular Diversity 2, 57-63 (1996). En este ejemplo, las genotecas combinatorias fueron rastreadas en busca de compuestos que tenían efectos citotóxicos sobre las células cancerígenas que crecían en agar.

En Beutel et al., Patente US5.976.813, se describe otro procedimiento de rastreo de alta capacidad. En este procedimiento, las muestras son colocadas en una matriz porosa. Entonces se colocan uno o más componentes de análisis en, encima o en el fondo de una matriz tal como un gel, una lámina de plástico, un filtro u otra forma de soporte sólido fácilmente manipulable. Cuando se introducen las muestras en la matriz porosa, se difunden lo suficientemente despacio, como para que los análisis puedan ser realizados sin que las muestras funcionen conjuntamente.

Ensayos de unión

Para los ensayos de unión, es preferible que el compuesto de prueba sea una molécula pequeña que se una y ocupe el sitio de unión a ligandos del polipéptido de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano, haciendo de ese modo el sitio de unión a ligandos inaccesible al sustrato, de manera que se prevenga una actividad biológica normal. Los ejemplos de tales moléculas pequeñas incluyen, pero no se limitan a, pequeños péptidos o moléculas tipo peptídico. Los posibles ligandos que se unen a un polipéptido de la invención incluyen, pero no se limitan a, los ligandos naturales de GPCR conocidos y análogos o derivados de los mismos. Los ligandos naturales de GPCR incluyen adrenomedullina, amilina, proteína relacionada con el gen de la calcitonina (CGRP), calcitonina, anandamida, serotonina, histamina, norepinefrina, adrenalina, noradrenalina, factor de activación de plaquetas, trombina, C5a, bradiquinina y quimioquinas.

En los ensayos de unión, bien el compuesto de prueba o el polipéptido de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano puede comprender una etiqueta detectable, tal como una etiqueta fluorescente, radioisotópica, quimioluminiscente o enzimática, tal como la peroxidasa de rábano picante, alcalina fosfatasa o luciferaza. La detección de un compuesto de prueba que esté unido a un polipéptido de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano se puede entonces conseguir, por ejemplo, mediante un recuento directo de la radioemisión, mediante recuento por centelleo o mediante la determinación de la conversión de un sustrato adecuado en un producto detectable.

Alternativamente, la unión de un compuesto de prueba a un polipéptido de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano puede ser determinada sin marcar ninguno de los intaractuantes. Por ejemplo, se puede utilizar un microfisiómetro para detectar la unión de un compuesto de prueba con un polipéptido de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano. Los microfisiómetros (p.ej.: Cytosensor®) son instrumentos analíticos que miden la velocidad a la que una célula acidifica su entorno utilizando un sensor potenciométrico de luz direccionable (LAPS). Los cambios producidos en esta velocidad de acidificación pueden utilizarse como indicador de la interacción entre un compuesto de prueba y un polipéptido de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano (McConnell et al., Science 257, 1906-1912, 1992).

La determinación de la capacidad de un compuesto de prueba de unirse a un polipéptido de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano también se puede conseguir mediante una tecnología tal como el análisis de interacción biomolecular en tiempo real (BIA) (Sjolander y Urbaniczby, Anal. Chem. 63, 2338-2345, 1991; y Szabo et al., Curr. Opin. Struct. Biol. 5, 699-705, 1995). El BIA es una tecnología para el estudio de las interacciones bioespecíficas en tiempo real, sin marcar ninguno de los interactuantes (p.ej.: BIAcore®). Los cambios en el fenómeno óptico de la resonancia de plasmones de superficie (SPR) pueden utilizarse como una indicación de las reacciones en tiempo real entre las moléculas biológicas.

En todavía otro aspecto de la invención, se puede utilizar un polipéptido de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano "proteína cebo" en un análisis bihídrico o en un análisis trihídrico (véase, p.ej., la Patente US5.283.317; Zervos et al., Cell 72, 223-232, 1993; Madura et al., J. Biol. Chem. 268, 12046-12054, 1993; Bartel et al., BioTechniques 14, 920-924, 1993; Iwabuchi et al., Oncogene 8, 1693-1696, 1993; y Brent W094/10300), para identificar otras proteínas que se unen a o interactúan con el polipéptido de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano y modulan su activi-
dad.

El sistema bihídrico se basa en la naturaleza modular de la mayoría de los factores de transcripción, que están constituidos por ADN de unión separable y dominios de activación. Brevemente, el análisis utiliza dos constructos de ADN distintos. Por ejemplo, en un constructo, se puede fusionar un polinucleótido codificante de un polipéptido de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano con un polinucleótido codificante del ADN unido al dominio de un factor de transcripción conocido (p.ej.: GAL-4). En el otro constructo, se puede fusionar una secuencia de ADN codificante de una proteína no identificada ("presa" o "muestra") con un polinucleótido que codifique el dominio de activación del factor de transcripción conocido. Si las proteínas "cebo" y "presa" pueden interactuar in vivo para formar un complejo dependiente de proteínas, los dominios de unión y activación de ADN del factor de transcripción se colocan muy próximos. Esta proximidad permite la transcripción de un gen indicador (p.ej.: LacZ), que es factiblemente enlazado a un sitio de regulación transcripcional sensible al factor de transcripción. Es posible detectar la expresión del gen indicador, y se pueden aislar la colonias de células que contienen el factor de transcripción funcional, para utilizarlas en la obtención de la secuencia de ADN codificante de la proteína que interactúa con el polipéptido de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano.

Puede ser deseable inmovilizar bien el polipéptido (o polinucleótido) de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano o el compuesto de prueba para facilitar la separación de las formas con y sin enlace de uno o ambos interactuantes, así como para facilitar la automatización del análisis. Por lo tanto, bien el polipéptido (o polinucleótido) de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano o el compuesto de prueba puede estar unido a un soporte sólido. Los soportes sólidos aptos incluyen, pero no se limitan a, portaobjetos de vidrio o plástico, placas de cultivos de tejido, pozos de microvaloración, tubos, chips de silicio o partículas tales como perlas (incluyendo, pero no limitándose a, perlas de látex, poliestireno o vidrio). Se puede utilizar cualquiera de los procedimientos conocidos en la técnica para unir el polipéptido (o polinucleótido) de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano o el compuesto de prueba a un soporte sólido, incluyendo el uso de enlaces covalentes y no covalentes, la absorción pasiva o pares de restos de unión enlazados respectivamente al polipéptido (o polinucleótido) o al compuesto prueba y el soporte sólido. Es preferible que los compuestos de prueba estén unidos al soporte sólido en un matriz, de manera que se pueda hacer un seguimiento de la localización de cada uno de los compuestos de prueba por separado. La unión de un compuesto de prueba con un polipéptido (o polinucleótido) de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano puede conseguirse en cualquier recipiente apto para contener reactantes. Los ejemplos de tales recipientes incluyen placas de microvaloración, tubos de ensayo y tubos de microcentrifugación.

En una realización, el polipéptido de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano es una proteína de fusión que comprende un dominio que permite la unión del polipéptido con un soporte sólido. Por ejemplo, las proteínas de fusión glutationa-S-transferasa pueden ser adsorbidas sobre perlas de glutationa-sefarosa (Sigma Chemical, St. Louis, Mo.) o placas de microvaloración derivadas de la glutationa, que son luego combinadas con el compuesto de prueba, o el compuesto de prueba y el polipéptido de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano no adsorbido; se incuba luego la mezcla bajo condiciones propicias para la formación de un complejo (p.ej.: a condiciones fisiológicas de sal y pH). Tras la incubación, las perlas o los pozos de la placa de microvaloración son lavados para eliminar cualquier componente no unido. Se puede determinar la unión de los interactuantes bien directa o indirectamente, como se describe anteriormente. Existe la alternativa de poder disociar los complejos del soporte sólido antes de determinar la unión.

También se pueden emplear otras técnicas de inmovilización de proteínas o polinucleótidos sobre un soporte sólido en los análisis de rastreo de la invención. Por ejemplo, bien un polipéptido (o polinucleótido) de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano o un compuesto de prueba puede ser inmovilizado utilizando una conjugación de biotina y estreptavidina. Se pueden preparar los polipéptidos (o polinucleótidos) de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano o los compuestos de prueba biotinilados a partir de biotina-NHS (N-hidroxi-succinimida) utilizando técnicas muy conocidas en la técnica (p.ej.: con un equipo de biotinilación, Pierce Chemicals, Rockford, Ill.) e inmovilizarlos en los pozos de placas de 96 pozos cubiertos con estreptavidina (Pierce Chemical). Alternativamente, se pueden derivar a los pozos de la placa anticuerpos que se unen específicamente a un polipéptido o polinucleótido de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano o a un compuesto de prueba, pero que no interfieren con el sitio de unión deseado, tal como el sitio activo del polipéptido de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano. La proteína o diana no unida puede quedar retenida en los pozos mediante la conjugación de los anticuerpos.

Los procedimientos para detectar tales complejos, además de los descritos anteriormente para los complejos inmovilizados de GST, incluyen la inmunodetección de complejos mediante anticuerpos que se unen específicamente al polipéptido de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano o compuesto de prueba, los análisis de enzima enlazada, que se basan en la detección de una actividad del polipéptido de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano, y la electroforesis en gel SDS bajo condiciones no reductoras.

El rastreo de compuestos de prueba que se unen a un polipéptido o polinucleótido de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano también puede llevarse a cabo en una célula intacta. En los sistemas de análisis de base celular, se puede utilizar cualquier célula que comprenda un polipéptido o polinucleótido de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano. El polinucleótido de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano se puede originar de manera natural en la célula o puede ser introducido mediante técnicas tales como las descritas anteriormente. La unión del compuesto de prueba con un polipéptido o polinucleótido de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano se determina como se describe anteriormente.

La especificidad de unión de compuestos que muestran afinidad por el GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano se muestra mediante la comparación de la afinidad por las membranas obtenidas de las líneas celulares transfectadas que expresan el receptor y por las membranas de las líneas celulares o tejidos conocidos que expresan otros tipos de receptores adrenérgicos alfa (p.ej.: \alpha_{1d}, \alpha_{1b}) o beta. La especificidad de unión de compuestos que muestran afinidad por el GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano puede ser comparada con las afinidades de unión a otros tipos de receptores adrenérgicos alfa o beta. Por ejemplo, se ha identificado, clonado y expresado el receptor adrenérgico alfa humano del subtipo 1a (W094/08040 y WO 94/21660). La expresión de los receptores \alpha_{1d} y \alpha_{1b} humanos clonados y el GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano, así como la comparación de sus propiedades de unión con antagonistas selectivos conocidos proporciona un modo racional para la selección de los compuestos y el descubrimiento de nuevos compuestos con actividades farmacológicas predecibles. El antagonismo por estos compuestos del subtipo GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano puede ser funcionalmente demostrado en animales anestesiados. Se pueden utilizar estos compuestos para aumentar el flujo de orina sin que se observen efectos hipotensivos ortostáticos.

Los compuestos identificados mediante los procedimientos de rastreo descritos anteriormente pueden ser definidos en mayor profundidad mediante un contrarrastreo. Esto se consigue de acuerdo con los procedimientos conocidos en la técnica, utilizando otros receptores responsables de mediar varias funciones biológicas. Véase, p. ej., W094/10989 y la Patente US5.403.847. Se prefieren particularmente los compuestos que son selectivos entre los distintos subtipos de receptores adrenérgicos \alpha_{1} humano y que tienen una baja afinidad por otros receptores, tales como los receptores adrenérgicos \alpha_{2}, los receptores adrenérgicos \beta, los receptores muscarínicos, los receptores de serotonina y otros. La ausencia de estas actividades no específicas puede ser confirmada mediante receptores clonados y expresados de forma análoga al procedimiento revelado aquí para la identificación de compuestos que tienen una alta afinidad por los distintos receptores adrenérgicos \alpha_{1} humanos. Además, se utilizan pruebas biológicas para confirmar los efectos de los compuestos identificados como antagonistas de los receptores adrenérgicos \alpha_{1a}.

Análisis funcionales

Los compuestos de prueba pueden ser analizados en base a su capacidad de hacer aumentar o disminuir un efecto biológico de un polipéptido de GPCR. Tales efectos biológicos pueden determinarse mediante los análisis funcionales descritos en los ejemplos específicos que se presentan más adelante. Los análisis funcionales pueden ser llevados a cabo tras poner en contacto bien un polipéptido de GPCR purificado, una preparación de membrana celular o una célula intacta con un compuesto de prueba. Los compuestos de prueba que hagan disminuir la actividad funcional de un GPCR en al menos aproximadamente un 10%, preferiblemente aproximadamente un 50%, y más preferiblemente aproximadamente un 75, 90 ó 100% se identifican como agentes potenciales para aumentar la actividad de los GPCR.

Uno de tales procedimientos de rastreo supone el uso de melanoforas que son transfectadas para expresar un polipéptido de GPCR. Tal técnica de rastreo queda descrita en el documento WO 92/01810 publicado el 6 de febrero de 1992. Así, por ejemplo, se puede emplear tal análisis para rastrear un compuesto que inhiba la activación del polipéptido del receptor, poniendo en contacto las células melanoforas que comprenden el receptor tanto con el ligando del receptor como con un compuesto de prueba por rastrear. La inhibición de la señal generada por el ligando indica que el compuesto de prueba es un antagonista potencial para el receptor, i.e., que inhibe la activación del receptor. Se puede emplear el rastreo para identificar un compuesto de prueba que active al receptor, poniendo en contacto tales células con los compuestos por rastrear y determinando si cada uno de los compuestos de prueba genera una señal, i.e., si activa al receptor.

Otras técnicas de rastreo incluyen el uso de células que expresen un polipéptido de GPCR humano (por ejemplo, células de OHC transfectadas) en un sistema que mida los cambios extracelulares de pH causados por la activación del receptor (véase, p.ej., Science 246, 181-296, 1989). Por ejemplo, se pueden poner en contacto los compuestos de prueba con una célula que exprese un polipéptido de GPCR humano, y se puede medir una segunda respuesta del mensajero, p.ej., transducción de señales o cambios de pH, para determinar si el compuesto de prueba activa o inhibe al receptor.

Hay otra de tales técnicas de rastreo que supone la introducción de ARN codificante de un polipéptido de GPCR humano en Xenopus oocytes para expresar transitoriamente el receptor. Se puede entonces poner en contacto el oocytes transfectado con el ligando del receptor y un compuesto de prueba por rastrear, seguido de la detección de la inhibición o activación de una señal de calcio en el caso del rastreo de compuestos de prueba que se cree que inhiben la activación del receptor.

Otras técnicas de rastreo suponen la expresión de un polipéptido de GPCR humano en células en las que el receptor está enlazado a una fosfolipasa C o D. Tales células incluyen células endoteliales, células del músculo liso, células de riñón embrionario, etc. Se puede lograr el rastreo como se describe anteriormente mediante la cuantificación del grado de activación del receptor a partir de los cambios producidos en la actividad de la fosfolipasa.

En los ejemplos específicos que se presentan más adelante se proporcionan datos de análisis funcionales como los descritos anteriormente.

Expresión de genes de GPCR

En otra realización, se identifican compuestos de prueba que hacen aumentar o disminuir la expresión de los genes de GPCR. Se pone en contacto un polinucleótido de GPCR con un compuesto de prueba, y se determina la expresión de un ARN o producto polipeptídico del polinucleótido de GPCR. Se compara el nivel de expresión del ARNm o polipéptido apropiado en presencia del compuesto de prueba con el nivel de expresión del ARNm o polipéptido en ausencia del compuesto de prueba. Se puede entonces identificar el compuesto de prueba como un modulador de expresión basándose en esta comparación. Por ejemplo, cuando la expresión del ARNm o polipéptido es mayor en presencia del compuesto de prueba que en su ausencia, se identifica el compuesto de prueba como un estimulador o potenciador de la expresión del ARNm o el polipéptido. Alternativamente, cuando la expresión del ARNm o el polipéptido es menor en presencia del compuesto de prueba que en su ausencia, se identifica el compuesto de prueba como un inhibidor de la expresión del ARNm o el polipéptido.

Se puede determinar el nivel de expresión de ARNm o polipéptido de GPCR en las células mediante procedimientos muy conocidos en la técnica para la detección de ARNm o polipéptidos. Se pueden emplear bien procedimientos cualitativos o cuantitativos. Se puede determinar la presencia de productos polipeptídicos de un polinucleótido de GPCR, por ejemplo, utilizando una variedad de técnicas conocidas en la técnica, incluyendo procedimientos inmunoquímicos tales como el análisis radioinmunológico, la transferencia western y la inmunohistoquímica. Alternativamente, se puede determinar la síntesis de polipéptidos in vivo, en un cultivo celular, o en un sistema de traducción in vitro mediante la detección de la incorporación de aminoácidos marcados dentro de un polipéptido de
GPCR.

Se puede llevar a cabo tal rastreo bien en un sistema de análisis libre de células o en una célula intacta. En los sistemas de análisis de base celular, se puede utilizar cualquier célula que exprese un polinucleótido de GPCR . El polinucleótido de GPCR puede producirse de forma natural en la célula o puede ser introducido empleando técnicas como las descritas anteriormente. Se puede utilizar bien un cultivo primario o una línea celular establecida, tal como células de OHC o 293 de riñón embrionario.

Indicaciones terapéuticas y procedimientos

Los GPCR son ubicuos en el hospedador mamífero, y son responsables de muchas funciones biológicas, incluyendo numerosas patologías. Por consiguiente, es deseable encontrar compuestos y fármacos que estimulen un GPCR por un lado, y que puedan inhibir la función de un GPCR por el otro. Por ejemplo, los compuestos que activan los GPCR pueden emplearse con objetivos terapéuticos, tales como el tratamiento de la enfermedad de Parkinson.

En general, los compuestos que inhiben la activación de un GPCR pueden utilizarse para una variedad de objetivos terapéuticos, por ejemplo, para el tratamiento de trastornos psicóticos y neurológicos, incluyendo esquizofrenia, excitación maníaca, depresión, delirios, demencia o retraso mental grave, disquinesias, tales como la enfermedad de Huntington o el síndrome de Tourett, entre otros.

La obesidad y el sobrepeso se definen como un exceso de la grasa corporal en relación con la masa corporal magra. Un aumento en el consumo de calorías o una disminución en el gasto de energía, o ambos factores, pueden provocar este desequilibrio que conduce al almacenamiento en forma de grasa del excedente de energía. La obesidad está asociada con importantes morbosidades médicas y con un aumento de la mortalidad. Las causas de la obesidad son poco conocidas y pueden estar debidas a factores genéticos, factores mediambientales o a una combinación de ambos que producen una equilibrio de energía positivo. En cambio, la anorexia y caquexia se caracterizan por un desequilibrio en el consumo de energía frente al gasto de energía que conduce a un equilibrio energético negativo y a una pérdida de peso. Los agentes que bien hacen aumentar el gasto de energía y/o disminuir el consumo de la misma, la absorción o el almacenamiento serían útiles para tratar la obesidad, el sobrepeso y las comorbosidades asociadas. Los agentes que bien hacen aumentar el consumo de energía y/o disminuir el gasto de la misma o hacen aumentar la cantidad de tejido magro serían útiles para tratar la caquexia, anorexia y enfermedades de desgaste.

La invención corresponde además al uso de nuevos agentes identificados mediante los análisis de rastreo descritos anteriormente. Por consiguiente, la utilización de un compuesto de prueba identificado como se describe aquí en un modelo animal adecuado pertenece al alcance de esta invención. Por ejemplo, se puede utilizar un agente identificado como se describe aquí (p.ej.: un agente de modulación, una molécula de ácido nucleico antisentido, un determinado anticuerpo, una ribozima o una molécula de unión a un polipéptido de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano) en un modelo animal para determinar la eficacia, toxicidad o efectos laterales del tratamiento con tal agente. Alternativamente, se puede utilizar un agente identificado como se describe aquí en un modelo animal para determinar el mecanismo de acción de tal agente. Además, esta investigación corresponde a los usos de nuevos agentes identificados mediante los análisis de rastreo arriba descritos para los tratamientos que se describen aquí.

Los efectos del bloqueo de un GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano incluyen la reducción de la presión intraocular, el control de las arritmias cardíacas y, posiblemente, un hospedador de los hechos del sistema nervioso central mediados por el receptor \alpha_{1c}.

Se puede administrar un reactivo que afecte a la actividad del GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano a una célula humana, bien in vitro o in vivo, para reducir la actividad del GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano. El reactivo se une preferiblemente a un producto de expresión de un gen de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano. Si el producto de expresión es un proteína, es preferible que el reactivo sea un anticuerpo. Para el tratamiento de células humanas ex vivo, se puede añadir un anticuerpo a una preparación de células madre que han sido separadas del cuerpo. Las células pueden entonces ser reemplazadas en el mismo u otro cuerpo humano, con o sin propagación clonal, como se conoce en la técnica.

Ejemplo 1 Detección de la actividad de los GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a}

Se inserta el polinucleótido de SEQ ID Nº 2 dentro del vector de expresión pCEV4, y el polipéptido de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} pCEV4-\alpha_{1a} del vector de expresión obtenido es transfectado en células 293 de riñón embrionario humano. Se raspan las células del matraz de cultivo en 5 ml de HCl Tris, 5mM de EDTA, pH 7,5, y se lisan mediante un tratamiento con ultrasonidos. Se centrifugan los lisados celulares a 1.000 rpm durante 5 minutos a 4ºC. Se centrífuga el sobrenadante a 30.000 xg durante 20 minutos a 4ºC. Se suspende la pella en una solución tamponada de unión que contiene 50 mM de HCL Tris, 5 mM de MgSO_{4}, 1 mM de EDTA, 100 mM de NaCl, a pH 7,5 complementada con 0,1% de BSA, 2 \mug/ml de aprotinina, 0,5 mg/ml de leupeptina y 10 \mug/ml de fosforamidona. Se añaden diluciones óptimas de suspensión membranosa, definidas como la concentración de proteínas necesaria para unir menos del 10% de un radioligando añadido, i.e., norepinefrina marcada como ^{125}I, a placas de microvaloración de polipropileno de 96 pozos que contienen ligando, péptidos no marcados y solución tamponada de unión hasta un volumen final de 250 \mul.

En ensayos de unión mediante saturación en equilibrio, las preparaciones membranosas son incubadas en presencia de concentraciones cada vez mayores (0,1 nM a 4 nM) de ligando ^{125}I.

Las mezclas de la reacción de unión son incubadas durante una hora a 30ºC. Se detiene la reacción mediante filtración a través de filtros GF/B tratados con 0,5% de polietileneimina, utilizando un cosechador celular. Se mide la radioactividad mediante recuento por centelleo, y se analizan los datos con un programa informático de regresión no lineal. Se define la unión no específica como la cantidad de radioactividad que queda tras la incubación de la proteína membranosa en presencia de 100 nM de péptido sin marcar. Se mide la concentración de proteína mediante el método Bradford, utilizando un reactivo Bio-Rad, con albúmina de suero bovino como estándar. Se demuestra así la actividad del GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 3.

Ejemplo 2 Ensayos de unión a radioligandos

Se raspan células 293 de riñón embrionario humano transfectadas con un polinucleótido que expresa GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano de un matraz de cultivo en 5 ml de HCl Tris, 5mM de EDTA, pH 7,5, y se lisan mediante un tratamiento con ultrasonidos. Se centrifugan los lisados celulares a 1.000 rpm durante 5 minutos a 4ºC. Se centrífuga el sobrenadante a 30.000 xg durante 20 minutos a 4ºC. Se suspende la pella en una solución tamponada de unión que contiene 50 mM de HCL Tris, 5 mM de MgSO_{4}, 1 mM de EDTA, 100 mM de NaCl, a pH 7,5 complementada con 0,1% de BSA, 2 \mug/ml de aprotinina, 0,5 mg/ml de leupeptina y 10 \mug/ml de fosforamidona. Se añaden diluciones óptimas de suspensión membranosa, definidas como la concentración de proteínas necesaria para unir menos del 10% de un radioligando añadido, i.e., norepinefrina, a placas de microvaloración de polipropileno de 96 pozos que contienen ligando marcado como ^{125}I o compuesto de prueba, péptidos sin marcar y solución tamponada de unión hasta un volumen final de 250 \mul.

En ensayos de unión mediante saturación en equilibrio, las preparaciones membranosas son incubadas en presencia de concentraciones cada vez mayores (0,1 nM a 4 nM) de ligando ^{125}I o compuesto de prueba (2.200 Ci/mmol de actividad específica). Se determinan las afinidades de unión de varios compuestos de prueba distintos en ensayos de unión mediante competición en equilibrio, utilizando 0,1 nM de péptido ^{125}I en presencia de 12 concentraciones diferentes de cada compuesto de prueba.

Las mezclas de la reacción de unión son incubadas durante una hora a 30ºC. Se detiene la reacción mediante filtración a través de filtros GF/B tratados con 0,5% de polietileneimina, utilizando un cosechador celular. Se mide la radioactividad mediante recuento por centelleo, y se analizan los datos con un programa informático de regresión no lineal.

Se define la unión no específica como la cantidad de radioactividad que queda tras la incubación de la proteína membranosa en presencia de 100 nM de péptido sin marcar. Se mide la concentración de proteína mediante el método Bradford, utilizando un reactivo Bio-Rad, con albúmina de suero bovino como estándar. El compuesto de prueba que hace aumentar la radioactividad de la proteína membranosa en al menos un 15% en relación con la radioactividad de la proteína membranosa que no fue incubada con un compuesto de prueba es identificado como un compuesto que se une a un polipéptido de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano.

Ejemplo 3 Efecto de un compuesto de prueba sobre la formación de AMP cíclico mediada por un GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano

La inhibición de la formación de AMPc mediada por receptores puede ser analizada en células hospedadoras que expresen GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humanos. Se colocan las células en placas de 96 pozos y se incuban en una solución de Dulbecco salina tamponada de fosfato (PBS) complementada con 10 mM de HEPES, 5 mM de teofilina, 2 \mug/ml de aprotinina, 0,5 mg/ml de leupeptina y 10 \mug/ml de fosforamidona durante 20 minutos a 37ºC en un 5% de CO_{2}. Se añade un compuesto de prueba y se incuba durante 10 minutos más a 37ºC. Se aspira el medio, y se detiene la reacción mediante la adición de 100 mM de HCl. Se almacenan las placas a 4ºC durante 15 minutos. Mediante análisis radioinmunológico, se mide el contenido de AMPc en la solución que detiene la rea-
cción.

Se cuantifica la radioactividad con un contador gamma equipado con un software de reducción de datos. El compuesto de prueba que hace disminuir la radioactividad de los contenidos de un pozo en relación con la radioactividad de los contenidos de un pozo en ausencia del compuesto de prueba es identificado como un inhibidor potencial de la formación de AMPc. El compuesto de prueba que hace aumentar la radioactividad de los contenidos de un pozo en relación con la radioactividad de los contenidos de un pozo en ausencia del compuesto de prueba es identificado como un posible potenciador de la formación de AMPc.

Ejemplo 4 Efecto de un compuesto de prueba sobre la movilización del calcio intracelular

La concentración de calcio libre intracelular puede medirse mediante microespectrofluorometría, utilizando el indicador fluorescente Fura-2/AM (Bush et al., J. Neurochem. 57, 562-74, 1991). Se siembran células transfectadas establemente en una placa de cultivo de 35 mm que contiene una cubierta de vidrio insertada. Se lavan las células con HBS, se incuban con un compuesto de prueba y se cargan con 100 \mul de Fura-2/AM (10 \muM) durante 20-40 minutos. Tras lavar con HBS para eliminar la solución de Fura-2/AMM, se equilibran las células en HBS durante 10-20 minutos. Se visualizan entonces las células con un objetivo 40X de un microscopio Leitz Fluovert FS.

Se determina la emisión de fluorescencia a 510 nM, con longitudes de onda de excitación que alternan entre 340 nM y 380 nM. Se convierten los datos brutos de fluorescencia en concentraciones de calcio utilizando curvas estándar de concentración de calcio y técnicas de análisis con software. El compuesto de prueba que hace aumentar la fluorescencia en al menos un 15% en relación con la fluorescencia producida en ausencia de un compuesto de prueba es identificado como un compuesto que moviliza el calcio intracelular.

Ejemplo 5 Efecto de un compuesto de prueba sobre el metabolismo de la fosfoinositida

Se colocan células que expresan establemente ADNc de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano en placas de 96 pozos y se dejan crecer hasta una confluencia. El día anterior a la realización del análisis, se cambia el medio de crecimiento a 100 \mul de medio que contiene un 1% de suero y 0,5 \muCi de ^{3}H-minositol. Se incuban las placas durante toda la noche en una incubadora de CO_{2} (5% de CO_{2} a 37ºC). Inmediatamente antes de realizar el análisis, se separa el medio y se reemplaza por 200 \mul de PBS que contiene 10 mM de LiCl, y se equilibran las células con un nuevo medio durante 20 minutos. Durante este intervalo, las células son también equilibradas con antagonista, añadido como un alícuota de 10 \mul de una solución 20 veces concentrada en PBS.

Se inicia la acumulación de fosfato de ^{3}H-inositol procedente del metabolismo de fosfolípidos de inositol mediante la adición de 10 \mul de una solución que contiene un compuesto de prueba. Se añaden 10 \mul al primer pozo para medir la acumulación basal. Se realizan análisis con once concentraciones diferentes del compuesto de prueba en los siguientes 11 pozos de cada fila de las placas. Todos los análisis se realizan por duplicado, repitiendo las mismas adiciones en dos filas consecutivas de las placas.

Se incuban las placas en una incubadora de CO_{2} durante una hora. Se detiene la reacción añadiendo 15 \mul de 50% v/v de ácido tricloroacético (TCA), seguido de una incubación de 40 minutos a 4ºC. Tras la neutralización del TCA con 40 \mul de Tris 1M, se transfiere el contenido de los pozos a una placa filtrantes Multiscreen HV (Millipore) que contiene Dowex AG1-X8 (malla de 200-400, forma del formato). Se preparan las placas filtrantes mediante la adición de 200 \mul de suspensión Dowex AG1-X8 (50% v/v, agua:resina) en cada pozo. Se colocan las placas filtrantes en un colector al vacío para lavar o eluir el lecho de resina. Se lava cada pozo dos veces con 200 \mul de agua, seguida de 2 x 200 \mul de 5mM de tetraborato de sodio / 60 mM de formato de amonio.

Se eluyen los ^{3}H-IP en placas de 96 pozos vacíos con 200 \mul de formato de amonio 1,2 M / 0,1 ácido fórmico. Se añade el contenido de los pozos a 3 ml de cocktail para centelleo, y se determina la radioactividad mediante recuento por centelleo líquido.

Ejemplo 6 Procedimientos de unión a receptores

Ensayos de unión estándar. Los ensayos de unión son llevados a cabo en una solución tamponada de unión que contiene 50 nM de HEPES, pH 7,4, 0,5% de BSA y 5 mM de MgCl_{2}. El análisis estándar para la unión de radioligandos a fragmentos de membrana que comprenden polipéptidos de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano es llevado a cabo como sigue en placas de microvaloración de 96 pozos (p.ej.: placas Immulon II Removawell de Dynatech). Se diluye el radioligando en solución tamponada de unión + PMSF / Baci al cpm deseado por 50 \mul, luego se añaden alícuotas de 50 \mul a los pozos. Para muestras de unión no específica, se añaden también 5 \mul de 40 \muM de ligando frío por pozo. Se inicia la unión mediante la adición de 150 \mul por pozo de membrana diluida a la concentración deseada (10-30 \mug de proteína membranosa / pozo) en solución tamponada de unión + PMSF / Baci. Se tapan entonces las placas cinta de sellado mylar Linbro (Flow Labs) y se colocan sobre un microagitador II de Dynatech. Se permite que prosiga la unión a la temperatura de la habitación durante 1-2 horas, y se detiene mediante la centrifugación de la placa durante 15 minutos a 2.000 xg. Se decantan los sobrenadantes, y se lavan las pellas membranosas una vez mediante la adición de 200 \mul de solución tamponada de unión helada, una breve agitación y otra centrifugación. Se coloca cada uno de los pozos en tubos de 12 x 75 mm y se cuentan en un contador gamma automático LKB (78% de eficacia). La unión específica obtenida mediante este procedimiento es idéntica a la medida cuando se elimina el ligando libre mediante filtración rápida (3-5 segundos) y lavado sobre filtros de fibra de vidrio cubiertos de polietilenoimina.

También se utilizan tres variaciones del ensayo de unión estándar:

1.: Se llevan a cabo ensayos de unión competitiva de radioligandos con un rango de concentraciones del ligando frío frente al ligando marcado como ^{125}I como se describe anteriormente con una modificación. Todas las diluciones de los ligandos analizadas son hechas en PMSF / Baci x40 a una concentración de 40 veces la concentración final del ensayo. Se añaden luego las muestras de péptido (5 \mul cada una) por pozo de microvaloración. Las membranas y el radioligando son diluidos en una solución tamponada de unión con inhibidores de proteasa. Se añade radioligando y se mezcla con ligando frío, y se inicia luego la unión mediante la adición de membranas.

2.: Se realiza un enlace químico cruzado del radioligando con el receptor tras una etapa de unión idéntica al análisis estándar. Sin embargo, la etapa de lavado se realiza con solución tamponada de unión menos BSA para reducir la posibilidad de que se cree enlazamiento cruzado no específico del ligando con el BSA. La etapa de enlace cruzado se lleva a cabo como se describe a continuación.

3.: También se llevan a cabo ensayos de unión a mayor escala para obtener pellas de membrana para estudiar la disolución del complejo receptor: ligando y para la purificación del receptor. Éstos son idénticos a los análisis estándar, con la excepción de que (a) la unión es llevada a cabo en tubos de polipropileno en volúmenes de 1-250 ml, (b) la concentración de proteína membranosa siempre es de 0,5 mg/ml, y (c) para la purificación del receptor, la concentración de BSA de la solución tamponada de unión es reducida a un 0,25%, y la etapa de lavado se realiza con solución tamponada de unión sin BSA, lo que reduce la contaminación con BSA del receptor purificado.

Ejemplo 7 Enlace químico cruzado de radioligando con receptor

Tras una etapa de unión a radioligando como se describe anteriormente, se vuelven a suspender las pellas de membrana en 200 \mul por pozo de placa de microvaloración de solución tamponada de unión helada sin BSA. Luego, se añaden 5 \mul por pozo de 4 mM de N-5-azido-2-nitrobenzoiloxisuccinimida (ANB-NOS, Pierce) en DMSO, y se mezcla. Se mantienen las muestras en hielo y se irradia luz UV durante 10 minutos con una lámpara Mineralight R-52G (UVP Inc., San Gabriel, Calif.) a una distancia de 5-10 cm. Se transfieren luego las muestras a tubos microfuge tipo Eppedorf, se transforman las membranas en pellas mediante centrifugación, se eliminan los sobrenadantes, y se disuelven las membranas en una solución tamponada de muestra Laemmli SDS para realizar una electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE). La PAGE es llevada a cabo como se describe a continuación. Se visualizan las proteínas radiomarcadas mediante la autorradiografía de los geles secados con una película Kodak XAR y pantallas Dupont intensificadores de la imagen.

Ejemplo 8 Disolución de membranas

La disolución de membranas es llevada a cabo en una solución tamponada que contiene 25 mM de Tris, pH 8, un 10% de glicerol (p/v) y 0,2 mM de CaCl_{2} (tampón de disolución). Los detergentes altamente solubles que incluyen Triton X-100, deoxicolato, deoxicolato : lisolecitina, CHAPS y zwitergente se preparan en tampones de disolución a concentraciones del 10% y se almacenan como alícuotas congeladas. La lisolecitina se prepara fresca debido a su insolubilidad ante la congelación-descongelación, y la digitonina se prepara fresca a concentraciones bajas debido a que tiene una solubilidad más limitada.

Para disolver membranas, se vuelven a suspender las pellas lavadas tras la etapa de unión libres de partículas visibles mediante el pipeteo y la rotación en el tampón de disolución a 100.000 xg durante 30 minutos. Se eliminan los sobrenadantes y se mantienen en hielo, deshaciéndose de las pellas.

Ejemplo 9 Análisis de receptores disueltos

Tras la unión de los ligandos ^{125}I y la disolución de las membranas con detergente, se puede analizar el complejo
R : L intacto mediante cuatro procedimientos diferentes. Todos ellos son llevados a cabo sobre hielo o en una habitación fría a 4-10ºC).

1.: Cromatografía en columna (Knuhtsen et al., Biochem. J. 254, 641-647, 1988). Se equilibran columnas G-50 Sephadex (8 x 250 mm) con tampón de disolución que contiene detergente a la concentración utilizada para disolver las membranas y 1 mg/ml de albúmina de suero bovino. Se aplican las muestras de las membranas disueltas (0,2-0,5 ml) a las columnas y se eluyen a una velocidad de flujo de aproximadamente 0,7 ml/minuto. Se recogen las muestras (0,18 ml). Se determina la radioactividad en un contador gamma. Se determinan los volúmenes vacíos de las columnas mediante el volumen de elución de azul dextrano. La radioactividad que eluye en el volumen vacío se considerada que está unida a la proteína. La radioactividad que eluye después, al mismo volumen que los ligandos ^{125}I libres, se considera que no está unida.

2.: Precipitación de polietilenoglicol (Cuatrecasas, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 69, 318-322, 1972). Se añaden 0,5 ml de un 1% (p/v) de globulina gamma bovina (Sigma) en una solución tamponada de fosfato de sodio 0,1 M para una muestra de 100 \mul de membranas disueltas en un tubo de polipropileno de 12 x 75 mm, seguidos de 0,5 ml de un 25% (p/v) de polietilenoglicol (Sigma), para mezclarlo todo. Se mantiene la mezcla en hielo durante 15 minutos. Luego se añaden 3 ml de fosfato de sodio 0,1 M, pH 7,4, por muestra. Las muestras son rápidamente filtradas (1-3 segundos) sobre filtros de fibra de vidrio GF/B Whatman y lavadas con 4 ml de solución tamponada de fosfato. El complejo receptor de precipitado PEG : ligando ^{125}I se determina mediante el recuento gamma de los filtros.

3.: Unión al filtro GFB / PEI (Bruns et al., Analytical Biochem. 132, 74-81, 1983). Se empapan unos filtros de fibra de vidrio GF/B Whatman en un 0,3% de polietilenoimina (PEI, Sigma) durante 3 horas. Se pasan las muestras de membranas disueltas (25-100 \mul) a tubos de polipropileno de 12 x 75 mm. Luego se añaden 4 ml por muestra de tampón de disolución sin detergente, y se filtran las muestras inmediatamente a través de filtros GFB / PEI (1-3 segundos) y se lavan con 4 ml de tampón de disolución. El CMP del complejo de receptor : ligando ^{125}I adsorbido en los filtros se determina mediante recuento gamma.

4.: Carbón / Dextrano (Paul y Said, Peptides 7[Suppl. 1], 147-149, 1986). Se disuelve Dextrano T70 (0,5 g, Pharmacia) en 1 litro de agua, luego se añaden 5 g de carbón activo (Norit A, alcalino; Fisher Scientific). Se agita la suspensión durante 10 minutos a la temperatura de la habitación y se almacena luego a 4ºC hasta su uso. Para medir el complejo R : L, se añaden 4 partes por volumen de suspensión de carbón / dextrano en una parte por volumen de membrana disuelta. Se mezclan las muestras y se mantienen en hielo durante 2 minutos, para centrifugarlas luego durante 2 minutos a 11.000 xg en un microfuge Beckman. El radioligando libre es adsorbido por el carbón / dextrano, siendo desechado con la pella. Los complejos de receptor: ligando ^{125}I quedan en el sobrenadante y son determinados mediante recuento gamma.

Ejemplo 10 Purificación del receptor

La unión del receptor biotinil a las membranas de GH_{4}Cl se lleva a cabo como se describe anteriormente. Las incubaciones se realizan durante 1 hora a la temperatura de la habitación. En el protocolo de purificación estándar, las incubaciones de unión contienen 10 nM de Bio-S29. Se añade ligando ^{125}I como trazador a niveles de 5.000-100.000 cpm por mg de proteína de membrana. Las incubaciones de control contienen 10 \muM de ligando frío para saturar el receptor con ligando no biotinilado.

La disolución del complejo de receptor : ligando también se lleva a cabo como se describe anteriormente, con un 0,15% de deoxicolato : lisolecitina en tampón de disolución que contiene 0,2 mM de MgCl_{2}, para obtener 100.000 xg de sobrenadantes que contienen complejo R : L disuelto.

Se lava la estreptavidina inmovilizada (estreptavidina con enlace cruzado a un 6% de agarosa en perlas, Pierce Chemical Co.; "Agarosa SA") en un tampón de disolución y se añade a las membranas disueltas como 1/30 del volumen final. Se incuba la mezcla agitando constantemente mediante una rotación de extremo a extremo durante 4-5 horas a 4-10ºC. Luego se aplica la mezcla a una columna y se realiza un lavado a través del material no unido. La unión del radioligando a la SA-agarosa se determina mediante la comparación de cmp del sobrenadante de 100.000 xg con el del efluente de la columna tras la adsorción por la SA-agarosa. Finalmente, se lava la columna con 12-15 volúmenes de columna de tampón de disolución + 0,15% de deoxicolato: lisolecitina + 1/500 (v/v) de 100 x 4pase. Se eluye la columna de estreptavidina con tampón de disolución + 0,1 mM de EDTA + 0,1 mM de EGTA + 0,1 mM de GTP-gamma-S (Sigma) + 0,15% (pt /v) de deoxicolato : lisolecitina + 1/1000 (v/v) 100.veces.4pase. Primero se pasa un volumen de columna de la solución tamponada de elución a través de la columna y se detiene el flujo durante 20-30 minutos. Luego se pasan a través 3-4 volúmenes de columna más de solución tamponada de elución. Se mezclan todos los eluatos.

Se incuban los eluatos de la columna de estreptavidina durante toda la noche (12-15 horas) con aglutinina de germen de trigo inmovilizada (agarosa WGA, Vector Labs) para adsorber el receptor mediante la interacción del carbohidrato unido mediante enlace covalente con la lectina WGA. La proporción (vol/vol) de la agarosa WGA con respecto al eluato de la columna de estreptavidina es generalmente de 1:400. También se puede utilizar un rango de 1:1000 a 1:200. Tras la etapa de unión, se forman pellas de resina mediante centrifugación, se elimina el sobrenadante y se guarda, y se lava la resina 3 veces (aproximadamente 2 minutos cada lavado) con solución tamponada que contiene 50 mM de HEPES, pH 8, 5 mM de MgCl_{2} y 0,15% de deoxicolato: lisolecitina. Para eluir el receptor unido a la WGA, se extrae la resina tres veces mediante la mezcla repetida (mezclador de rotación a baja velocidad) durante un período de 15-30 minutos sobre hielo, con 3 columnas de resina cada vez, de 10 mM de N-N'-N''-triacetilquitotriosa en la misma solución tamponada de HEPES utilizada para lavar la resina. Tras cada una de las etapas de elución, se centrifuga la resina hacia abajo, eliminando cuidadosamente el sobrenadante, libre de pellas de agarosa WGA. Los tres eluatos mezclados contienen el receptor final purificado. El material no unido a la WGA contiene subunidades de proteína G, específicamente eluída de la columna de estreptavidina, así como contaminantes no específicos. Todas estas fracciones se congelan a -90ºC.

Ejemplo 11 Identificación de los compuestos de prueba que se unen a polipéptidos de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano

Los polipéptidos de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} purificados que comprenden una proteína glutationa-S-transferasa y que han sido absorbidos sobre pozos derivados de glutationa de placas de microvaloración de 96 pozos se ponen en contacto con compuestos de prueba de una genoteca de moléculas pequeñas a un pH 7 en una solución fisiológica tamponada. Los polipéptidos de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano comprenden una secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID Nº: 3. Los compuestos de prueba comprenden una etiqueta fluorescente. Se incuban las muestras durante 5 minutos a una hora. Las muestras de control son incubadas en ausencia de un compuesto de prueba.

Se lava de los pozos la solución tamponada que contiene los compuestos de prueba. La unión de un compuesto de prueba con un polipéptido de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano se detecta midiendo la fluorescencia de los contenidos de los pozos. El compuesto de prueba que hace aumentar la fluorescencia en un pozo en al menos un 15% en relación con la fluorescencia de un pozo en el que no se incubó compuesto de prueba se identifica como un compuesto que se une a un polipéptido de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano.

Ejemplo 12 Ensayos de unión selectiva

Se utilizan membranas preparadas a partir de líneas celulares \alpha_{1b} y \alpha_{1d} humanas transfectadas establemente (ATCC CRL 11138 y CRL 11139, respectivamente) para identificar los compuestos que se unen selectivamente al GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha1a humano. Estas reacciones de unión competitiva (volumen total = 200 \mul) contienen 50 mM de HCl Tris , pH 7,4, 5 mM de EDTA, 150 mM de NaCl, 100 pM de ^{125}I-HEAT, membranas preparadas a partir de líneas celulares transfectadas con el respectivo plásmido de expresión subtipo \alpha1, y cantidades en aumento de ligando sin marcar. Se incuban las reacciones a la temperatura de la habitación durante una hora con agitación. Se filtran las reacciones sobre filtros de fibra de vidrio GF/C Whatman con un cosechador de células de 96 pocos Inotec. Se lavan los filtros tres veces con solución tamponada helada y se determina la radioactividad de unión (Ki).

Ejemplo 13 Análisis funcionales de ejemplaridad

Para confirmar la especificidad de los compuestos por el GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano y definir la actividad biológica de los compuestos, se pueden realizar las siguientes pruebas funcionales:

1. Próstata humana, de perro y rata, y uretra de perro in vitro

: Se sacrifican ratas macho Sprague-Dawley de Taconic Farms que pesan 250-400 g mediante dislocación cervical bajo anestesia (metohexital; 50 mg/kg, i.p.). Se hace una incisión en el abdomen inferior para eliminar los lóbulos ventrales de la próstata. Se corta longitudinalmente cada una de las próstatas extraídas de perros mestizos en 6-8 trozos a lo largo de la abertura de la uretra y se almacenan en una solución de Krebs oxigenada helada durante toda la noche antes de su uso, si es necesario. Se corta la uretra de perro próxima a la próstata en anillos de aproximadamente 5 mm, se cortan luego los anillos abriéndolos para realizar la medida contráctil de los músculos circulares. Los trozos de próstata humana procedentes de una cirugía trasuretral de una hiperplasia benigna de próstata son también almacenados durante toda la noche en una solución de Krebs helada, si es necesario.

: Se coloca el tejido en una placa Petri que contiene solución de Krebs oxigenada (118 mM de NaCl; 4,7 mM de KCl; 2,5 mM de CaCl_{2}; 1,2 mM de KH_{2}PO_{4}; 1,2 mM de MgSO_{4}; 2 mM de NaHCO_{3}; 11 Mm de dextrosa) calentado a 37ºC. Se eliminan cuidadosamente el material lipídico en exceso y el tejido conectivo. Se agarran los segmentos de tejido a sujeciones de tejido de vidrio con seda quirúrgica 4-0, se colocan en un baño enfundado de tejidos que contiene solución tamponada de Krebs a 37ºC y se burbujean con 5% de CO_{2} / 95% de O_{2}. Se conectan los tejidos a un transductor de presión Statham-Gould; se aplica 1 g (rata, humano) o 1,5 g (perro) de tensión, y se dejan equilibrar los tejidos durante una hora. Se registran las contracciones en un registrador de banda Packard serie 7700.

: Tras una única dosis cebado de 3 \muM (para rata), 10 \muM (para perro) y 20 \muM (para humano) de fenilefrina, se genera una curva acumulativa concentración-respuesta a un agonista; los tejidos son lavados cada 10 minutos durante una hora. Se añade vehículo o antagonista al baño y se deja incubar durante una hora, y se genera la otra curva acumulativa concentración-respuesta al agonista.

: Con el software GraphPad Inplot, se calculan los valores EC_{50} para cada grupo. Cuando se prueban tres o más concentraciones, se obtienen valores pA2 (aproximadamente log Kb) de la línea de Schild.

2. Medida de la presión intra uretral en perros anestesiados

: Para medir los cambios mediados adrenérgicamente en la presión intra uretral y en la presión arterial de perros anestesiados se utiliza el siguiente modelo con el fin de evaluar la eficacia y potencia de los antagonistas de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano. En el estudio, se utilizan perros mestizos macho (7-12 kg). Se anestesian los perros con sodio pentobarbital (35 mg/kg, i.v. más 4 mg/kg/h de infusión iv). Se inserta un tubo endotraqueal y se ventila al animal con aire de la habitación mediante un ventilador de desplazamiento positivo para animales grandes de instrumentos Harvard. Se colocan unos catéteres (PE 240 ó 260) en la aorta por la arteria femoral, y en la vena cava por las venas femorales (2 catéteres, uno en cada vena) para medir la presión arterial y administrar los fármacos, respectivamente. Se realiza una incisión supra-púbica de aproximadamente 1,25 cm lateral al pene para dejar los uréteres, la vejiga y la uretra al descubierto. Se ligan y canulan los uréteres para que la orina fluya libremente dentro de los vasos de precipitados. Se retrae la parte superior de la vejiga para facilitar la disección de la uretra proximal y distal. Se pasa la cinta umbilical por debajo de la uretra en el cuello de la vejiga y se coloca otro trozo de cinta umbilical debajo de la uretra distal, aproximadamente a 1-2 cm de distancia de la próstata. Se hace una incisión en la vejiga y se lleva un transductor de presión micro-tip de Millar dentro de la uretra. Se sutura la incisión de la vejiga con seda 2-0 ó 3-0 (sutura en bolsa) para sujetar el transductor. Se coloca la punta del transductor en la uretra prostática, y se verifica la posición del catéter Millar apretando cuidadosamente la próstata y apreciando el gran cambio de presión uretral que se produce.

: Se administra fenilefrina, un agonista adrenérgico \alpha1, (0,1-100 \mug/kg, iv; volumen de 0,05 ml/kg) para formar curvas dosis-respuesta para los cambios producidos en la presión intra uretral y arterial. Tras la administración de dosis cada vez mayores de un antagonista adrenérgico alfa (o vehículo), se vuelven a evaluar los efectos de la fenilefrina en la presión arterial y en la presión intra uretral. Se generan cuatro o cinco curvas dosis-respuesta de fenilefrina en cada animal (una control, tres o cuatro dosis de antagonista o vehículo). La potencia antagonista relativa sobre los cambios inducidos por la fenilefrina en la presión arterial e intra uretral se determina mediante un análisis de Schild. Se ajusta simultáneamente la familia de curvas medias (utilizando el paquete de software ALLFIT) con una ecuación logística de cuatro parámetros obligando que la pendiente, la respuesta mínima y la respuesta máxima sean constantes entre las curvas. Se calculan las proporciones de dosis para las dosis de antagonista (desplazamiento hacia la derecha de las curvas dosis-respuesta con respecto de la curva control) como la proporción de ED_{50} para las respectivas curvas. Se utilizan entonces estas proporciones de dosis para construir una línea de Schild y determinar la Kb (expresada en \mug/kg, iv). La Kb (dosis de antagonista que produce un desplazamiento duplicado hacia la derecha de la curva dosis-respuesta de fenilefrina) se utiliza para comparar la potencia relativa de los antagonistas sobre la inhibición de las respuestas de fenilefrina para la presión intra uretral y arterial. La selectividad relativa se calcula como la proporción entre las Kb de presión intra uretral y arterial. También se estudian los efectos de los antagonistas \alpha1 sobre la presión arterial base. La comparación de la potencia antagonista relativa sobre los cambios producidos en la presión arterial y la presión intra uretral deja ver si el subtipo alfa de receptores responsable del aumento de la presión intra uretral se encuentra también presente en la vasculatura sistémica. De acuerdo con este procedimiento, se puede confirmar la selectividad de los antagonistas de receptores adrenérgicos \alpha_{1a} que evitan que la fenilefrina provoque un aumento en la presión intra uretral sin producir ninguna actividad en la vasculatura.

Ejemplo 14 Identificación de un compuesto de prueba que haga disminuir la expresión génica de los GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humanos

Se administra un compuesto de prueba a un cultivo de células gástricas humanas y se incuba a 37ºC durante 10 a 45 minutos. Un cultivo del mismo tipo de células incubado durante el mismo tiempo sin el compuesto de prueba proporciona un control negativo.

Se aísla ARN de ambos cultivos como se describe en Chirgwin et al., Biochem. 18, 5294-99, 1979). Se preparan transferencias Northern empleando de 20 a 30 \mug de ARN total y se hibridan con una sonda específica de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano marcado como ^{32}P a 65ºC en un Express-hyb (CLONTECH). La sonda comprende al menos 11 nucleótidos contiguos seleccionados de la secuencia complementaria a la SEQ ID Nº: 1. El compuesto de prueba que hace disminuir la señal específica de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano con respecto a la señal obtenida en ausencia del compuesto de prueba se identifica como un inhibidor de la expresión génica del GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano.

Ejemplo 15 Tratamiento de la obesidad con un reactivo que se une específicamente a un producto génico de GPCR

Se realiza la síntesis de oligonucleótidos antisentido de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano que comprenden al menos 11 nucleótidos contiguos seleccionados de la complementaria a la SEQ ID Nº: 2 sobre un sintetizador de serie Pharmacia Gene Assembler utilizando un procedimiento con fosforamidita (Uhlmann et al., Chem. Rev. 90, 534-83, 1990). Tras el ensamblaje y la desprotección, se hacen precipitar los oligonucleótidos con etanol dos veces, se secan y se suspenden en una solución salina tamponada de fosfato (PBS) a la concentración deseada. Se mide la pureza de estos oligonucleótidos mediante electroforesis capilar en gel y CLAR de intercambio iónico. Se determinan los niveles de endotoxina de la preparación de oligonucleótidos mediante el análisis de amebocitos de Limulus (Bang, Biol. Bull. (Woods Hole, Mass.) 105, 361-362, 1953).

Se administran los oligonucleótidos antisentido a un paciente con obesidad. Disminuye la gravedad de la obesidad del paciente.

\newpage

Ejemplo 16 Expresión específica de tejidos Análisis de la PCR mediante genotecas de fagos de ADNc de tejidos humanos

Se adquirieron genotecas de fagos de ADNc humano (Stratagene) en un "panel de tejidos humanos AI" como se describe en la tabla 1. Se utilizó medio \mul de cada muestra de genoteca adquirida como molde en un análisis de la PCR independientemente de la base (fago/ml) para un análisis de expresión no cuantitativo. Se realizó además una PCR de control positivo con aproximadamente 20 ng de ADN genómico humano como molde, realizando un control negativo sin molde.

Los procedimientos estándar de la PCR fueron los indicados por Perkin Elmer. El protocolo de la PCR fue el siguiente:

Cebadores:

Cebador A: 5'-ACAAGGGTCGCACAGAGGTC-3'

Cebador B: 5'-TGTTTCTCGTGTTATGGACAGTTCA-3'

\vskip1.000000\baselineskip

Mezcla de la PCR

0,5 \mul	molde
1 x	solución tamponada PCR Gold (Perkin Elmer)
0,2 mM	dNTP (Pharmacia)
1,5 mM	MgCl_{2} (Perkin Elmer)
0,5 \muM	cebador A
0,5 \muM	cebador B
2,5 U	Polimerasa de ADN Gold AmpliTaq (Perkin Elmer)

hasta 25 \mul de volumen final de reacción con H_{2}O estéril.

El protocolo de amplificación fue realizado en un termociclador 9700 de Perkin Elmer.

1 vez la siguiente etapa:

\hskip0,5cm pre PCR	9' a 94ºC

40 veces las siguientes etapas:

\hskip0,5cm desnaturalización	30'' a 94ºC
\hskip0,5cm apareamiento	1' a 56ºC
\hskip0,5cm extensión	30'' a 72ºC

La longitud esperada de un determinado producto de la PCR: 560 bp.

La amplificación de los productos fue analizada mediante electroforesis sobre un 2% de gel de agarosa (Agarosa SeaKem LE, bioproductos FMC) en una solución tamponada (1XTAE) siguiendo el procedimiento estándar descrito por Maniatis et al. Se detectaron productos de amplificación de la PCR del tamaño esperado en el control positivo (ADN genómico humano) y las líneas correspondientes a la genoteca de fagos de ADNc de cerebro (Corpus striatum).

Para comprobar la identidad del producto de la PCR, se utilizó una mezcla de productos de amplificación obtenida para el análisis de restricción con la enzima ApaI (BioLabs) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se analizaron los fragmentos de restricción mediante electroforesis sobre un 2% de gel de agarosa (Agarosa SeaKem LE, bioproductos FMC) en solución tamponada (1XTAE) de acuerdo con el procedimiento estándar descrito por Maniatis et al. La restricción realizada por la ApaI produjo dos fragmentos del tamaño esperado (aproximadamente 240 bp y
330 bp).

\newpage

Análisis de la PCR utilizando ADNc de tejidos humanos

Se adquirieron ADNc de clon QUICK humano (Clontech) en un "panel de tejidos humanos IB" (a no ser que se especifique algo distinto) como se describe en la tabla 2. Se utilizó medio \mul de cada muestra de ADNc adquirida como molde en la PCR para un análisis de expresión no cuantitativo. Se realizó además una PCR de control positivo con aproximadamente 20 ng de ADN genómico humano como molde, y se realizó un control negativo sin
molde.

El protocolo experimental fue como el anteriormente descrito.

Los productos de amplificación de la PCR del tamaño esperado, como se muestra en la fig. 9, fueron detectados en el control positivo (ADN genómico humano) y en las líneas correspondientes a los siguientes ADNc:

- Cerebro completo

- Cerebro (hipocampo)

- Cerebro (cerebelo)

- Cordón espinal: producto de amplificación muy ligeramente visible

- Vejiga

- Próstata

- Glándula suprarrenal: producto de amplificación muy ligeramente visible

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 1

1

2

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 17 Clonación de ADNc de longitud completa

Se obtuvo ADNc de longitud completa mediante una PCR utilizando ADN genómico humano como molde. El procedimiento estándar de la PCR fue como indica Perkin Elmer.

El protocolo de la PCR fue el siguiente:

Cebadores:

Cebador C: 5'-TGCCTGCGTGTTTCTTTTGT-3'

Cebador D: 5'-TCTTGTTTCTCGTGTTATGGACAGT-3'

Mezcla de la PCR

0,5 \mul	50 ng de ADN genómico
5 \mul	solución tamponada Pfu clonada de Stratagene x 10
0,2 mM	dNTP (Pharmacia)
0,5 \muM	cebador C
0,5 \muM	cebador D
2,5 U	Polimerasa de ADN Pfu (Stratagene, Catálogo 600154)

hasta 50 \mul de volumen final de reacción con H_{2}O estéril.

1 vez la siguiente etapa:

\hskip0,5cm pre PCR	4' a 94ºC

30 veces las siguientes etapas:

\hskip0,5cm desnaturalización	1' a 94ºC
\hskip0,5cm apareamiento	1' a 56ºC
\hskip0,5cm extensión	1'30'' a 72ºC
\hskip0,5cm 1 vez la siguiente etapa:	7' a 72ºC

La longitud esperada de un determinado producto de la PCR era de 1694 bp.

La longitud de producto de la PCR fue controlada mediante electroforesis en un 1% de gel de agarosa (Agarosa SeaKem LE, bioproductos FMC) en una solución tamponada (1XTAE) siguiendo el procedimiento estándar descrito por Maniatis et al. La banda electroforética del tamaño esperado fue separada del gel y purificada mediante el equipo quiaquik de extracción en gel (Quiagen) siguiendo las instrucciones.

La PCR anidada fue realizada utilizando el ADN obtenido de la primera PCR como molde.

El procedimiento estándar de la PCR fue como indica Perkin Elmer.

El protocolo de la PCR fue el siguiente:

Cebadores:

Cebador E: 5'-GGAATTCCGCCGCCATGGCGTCCACCTGCACCAACAGCAC-3'

Cebador F: 5'-CGCGGATCCGCGTTCAAGGAAAAGTAGCAGAA-3'

\vskip1.000000\baselineskip

Mezcla de la PCR

0,5 \mul	molde
5 \mul	solución tamponada Pfu clonada de Stratagene x 10
0,2 mM	dNTP (Pharmacia)
0,5 \muM	cebador E
0,5 \muM	cebador F
2,5 U	Polimerasa de ADN Pfu (Stratagene, Catálogo 600154)

hasta 50 \mul de volumen final de reacción con H_{2}O estéril.

1 vez la siguiente etapa:

\hskip0,5cm pre PCR	4' a 94ºC

30 veces las siguientes etapas:

\hskip0,5cm desnaturalización	1' a 94ºC
\hskip0,5cm apareamiento	1' a 56ºC
\hskip0,5cm extensión	1'30'' a 72ºC

1 vez la siguiente etapa:	10' a 72ºC

Tras la PCR, el producto de la PCR fue purificado utilizando una columna de purificación (equipo Quiaquick de purificación PCR, catálago 28104 Quiagen). Tras esta etapa, se realizó una reacción de "prolongación A" mediante la adición de 0,2 mM de dATP (Pharmacia) y 2,5 U de polimerasa de ADN Gold ampiTaq (Perkin Elmer) al producto de la PCR, y una incubación en un termociclador 9700 Perkin Elmer:

10' a 72ºC

El producto purificado de la PCR fue clonado en un vector Pcr II TOPO® (catálogo 45-0640, Invitrogen) con un equipo de ligación rápida de ADN, (catálogo 1635-379, Roche Diagnostics) siguiendo el procedimiento estándar y las instrucciones del fabricante.

El clon recombinante, llamado #96pCRIITOPO fue seleccionado y secuenciado. La secuenciación reveló que el plásmido recombinante contiene el ORF de longitud completa como el depositado en el banco de datos, sin mutaciones. Véase SEQ ID Nº: 7 y Nº: 8.

Ejemplo 18 Subclonación de ADNc de longitud completa en un vector de expresión de mamíferos

Se seleccionó el vector pIRES2-EGFP (catálogo 6029-1, CLONTECH Laboratories, Inc.) para su expresión en células mamíferas. Este vector contiene el sitio interno de entrada de ribosomas del virus de la encefalomiocarditis (ECMV) entre los sitios de clonación múltiple y la región de codificación de la proteína verde fluorescente reforzada (EGFP, Enhanced Green Fluorescent Protein). Esto permite la trancripción del gen de interés (clonado en el MCS) y del gen de la EGFP en un único ARNm bicistrónico, y por tanto, poder usarlo para una selección altamente eficaz (mediante citometría de flujo) de las células trasfectadas.

Se insertó el fragmento de restricción EcoRI-BamHI del pCRIITOP de GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano en pIRES2-EGFP digerido por Ori-BamHI siguiendo el procedimiento estándar. Se aisló ADN de plásmido de los tranformantes y fue examinado mediante un análisis de restricción en busca de la presencia del fragmento correcto y de la orientación 5'-3' correcta.

Ejemplo 19 Análisis cuantitativo de la expresión relativa del GPCR tipo receptor adrenérgico \alpha_{1a} humano en tejidos humanos

El esbozo de la expresión cuantitativa fue realizado mediante la forma de análisis cuantitativo de la PCR llamada "análisis cinético", que fue descrita por primera vez en Higuchi et al., 1992 y en Higuchi et al., 1993. El principio consiste en que en cualquier ciclo dado dentro de la fase exponencial de la PCR, la cantidad de producto es proporcional al número inicial de copias de molde.

Si se realiza la amplificación en presencia de un oligonucleótido fluorescente internamente enfriado (sonda TaqMan) complementario a la secuencia diana, la sonda es clivada por la actividad de la endonucleasa 5'-3' de la polimerasa de ADN Taq, liberándose un color fluorescente en el medio (Holland et al.). Como la emisión fluorescente aumentará en proporción directa con la cantidad de producto amplificado en cuestión, se puede detectar la fase de crecimiento exponencial del producto de la PCR y utilizarla para determinar la concentración inicial de molde (Heid et al., 1996, y Gibson et al., 1996).

Para estandarizar la cantidad de muestra de ARN añadida a una reacción, se puede realizar la amplificación de un control endógeno. En este tipo de experimentos, el control de la elección es el ARN ribosomal 18S. Debido a la disponibilidad de indicadores que se colorean con diferentes espectros de emisión, se pueden cuantificar independientemente la diana y el control endógeno en el mismo tubo si se utilizan sondas marcadas con diferentes colores.

Todas las medidas de fluorescencia de la "PCR en tiempo real" fueron realizadas en el sistema de detección de secuencias ABI Prism 7700 (PE Applied Biosystems, Foster City, CA).

\newpage

Referencias

\bulletHiguchi, R; Dollinger, G; Walsh, P.S. y Griffith, R. 1992. "Simultaneous Amplification and Detection of Specific DNA Sequences". BioTechnology 10: 413-417.

\bulletHiguchi, R; Fockler, C.; Dollinger G y Watson, R. 1993. "Kinetic PCR Analysis: Real-Time Monitoring of DNA Amplification Reactions". BioTechnology 11: 1026-1030.

\bulletHolland, P.M.: Abramson, R.D.; Watson, R. y Gelfand, D.H. 1991. "Detection of Specific Polymerase Chain Reaction Product by Utilizing the 5'-3' Exonuclease Activity of Thermus Aquaticus DNA polymerase". Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 7276-7280.

\bulletHeid, C.; Stevens, J.; Livak, K y Williams, P.M. 1996. "Real Time Quantitative PCR". Genome Res. 6: 986-994.

\bulletGibson, U.E.; Heid, C.A. y Williams, P.M. 1996. "A Novel Method for Real Time Quantitative RT-PCR". Genome Res. 6: 995-1001.

Preparación de ADNc

Los ARNc totales utilizados para la cuantificación de la expresión son enumerados en la tabla 3 junto con sus fuentes. Se trataron cincuenta \mug de cada ARN con DNase I durante 1 hora a 37ºC en la siguiente mezcla de reacción:

DNase I, libre de Rnase (Roche Dignostics, Alemania)	0,2 U/\muL
Inhibidor RNase (PE Applied Biosystems, CA)	0,4 U/\muL
HCl Tris pH 7,9	10 mM
MgCl_{2}	10 mM
NaCl	50 mM
DTT	1 mM

Tras la incubación, se extrajo el ARN una vez con 1 volumen de fenol : cloroformo : isoamil alcohol (24 : 24 :1) y una vez con cloroformo, y se hizo precipitar con 1/10 de volumen de acetato de sodio 3M a pH 5,2 y 2 volúmenes de etanol. Tras la cuantificación espectrofotométrica, se transcribe inversamente cada muestra con los reactivos de transcripción inversa TaqMan (PE Applied Biosystems, CA) de acuerdo con el protocolo del vendedor. La concentración final de ARN en la mezcla de la reacción fue de 200 ng/\muL. La transcripción inversa fue realizada con 2,5 \muM de hexámeros aleatorios.

Análisis cuantitativo TaqMan

Se diseñaron cebadores y una sonda específicos de acuerdo con las recomendaciones de PE Applied Biosystems, que se encuentran listados a continuación:

Cebador directo: 5'-AACAGCACGCGCGAGAGT-3'

Cebador inverso: 5'-GCTGATGGGCATTTTGGAGA-3'

Sonda: 5'-(FAM)ACAGCAGCCACACGTGCATGCC(TAMRA)-3'

en la que FAM = 6-carboxi-fluoresceína

y TAMRA = 6-carboxi-tetrametil-rodamina.

La longitud esperada del producto de la PCR era de 63 bp.

Los experimentos de cuantificación fueron realizados sobre 50 ng de ARN transcrito inversamente de cada muestra. Cada una de las determinaciones se realizó por triplicado.

El contenido de ADNc total fue normalizado con la cuantificación simultánea (PCR multiplex) del ARN ribosomal 18S mediante el uso de un equipo de control de reactivos de análisis TaqMan predesarrollados (PDAR, Pre-Developed TaqMan Assay Reagents) (PE Applied Biosystems, CA).

La mezcla de la reacción de análisis fue como sigue:

	Final
Mezcla maestra PCR universal TaqMan (x2)	x1
\hskip0,5cm(PE Applied Biosystems, CA)
control PDAR - ARN 18S (x20)	x1
Cebador directo	900 nM
Cebador inverso	300 nM
Sonda	200 nM
ADNc	10 ng
Agua	hasta 25 \muL

Las condiciones de la PCR fueron:

1 vez las siguientes etapas:

\hskip0,5cm pre PCR	2' a 50ºC
	10' a 95ºC

40 veces las siguientes etapas:

\hskip0,5cm desnaturalización	15'' a 95ºC
\hskip0,5cm apareamiento / extensión	1' a 60ºC

El experimento fue realizado sobre un detector de secuencias ABI Prism 7700 (PE Applied Biosystems, CA). Al final de la ejecución, se procesaron los datos de la fluorescencia adquiridos durante la PCR como se describe en el manual de usuario del ABI Prism 7700 con el fin de conseguir una mejor sustracción del fondo, así como una alineación de señales con la cantidad diana inicial.

En las fig. 10, 11 y 12, se muestran los resultados.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 1

(Véase fig. 10)
ARN	Vendedor y # catálogo
Cerebro fetal h.	Clontech (CA) 640191
Cerebro h.	OriGene (MD) HT1001
Músculo h.	OriGene (MD) HT1008
Corazón h.	OriGene (MD) HT1002
Pulmón h.	OriGene (MD) HT1009
Riñón h.	OriGene (MD) HT1003
Hígado h.	OriGene (MD) HT1005
Timo h.	Clontech (CA) 640281
Testículos h.	OriGene (MD) HT1011
Colon h.	OriGene (MD) HT1015
Placenta h.	OriGene (MD) HT1013

TABLA 2

(Véase fig. 11)
ARN	Comprador y # catálogo
Hígado fetal h.	Clontech (CA) 640181
Vejiga h.	Invitrogen (CA) D602001
Próstata h.	Clontech (CA) 640381
Glándula suprarrenal h.	Clontech (CA) 640161
Bazo h.	OriGene (MD) HT1004
Próstata hipertrófica h.	de autopsia
Próstata h.	de autopsia

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 3

3

<110> Bayer AG

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<120> REGULACIÓN DEL RECEPTOR ACOPLADO A PROTEÍNAS G TIPO RECEPTOR ADRENÉRGICO alfa1A HUMANO

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<130> Países extranjeros Lio062

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<140>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<141>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> US 60/204.145

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 15-05-2000

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> US 60/250.505

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 04-12-2000

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn Ver. 2.1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1920

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (237)...(1763)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia codificante

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

4

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1527

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

5

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 508

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

6

7

8

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 466

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

9

10

11

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1194

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> promotor

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1076)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1077)..(1079)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> codón inicial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<405> 5

\vskip1.000000\baselineskip

12

Claims

1. Uso de una célula hospedadora que comprende un vector, comprendiendo dicho vector un polinucleótido, codificando dicho polinucleótido:

(i): una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID Nº: 3, o

(ii): una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90% idéntica a la SEQ ID Nº: 3,

para el rastreo de sustancias útiles en el tratamiento de un trastorno del sistema nervioso central.

2. Uso de un polipéptido que comprende:

(i): una secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 3, o

3. Uso de la reivindicación 1 ó 2, en el que el trastorno del sistema nervioso central es dolor.