ES2283403T3

ES2283403T3 - Regulacion de la proteina similar al receptor de la lipoxina a4 humana.

Info

Publication number: ES2283403T3
Application number: ES01925421T
Authority: ES
Inventors: Shyam Ramakrishnan
Original assignee: Bayer Healthcare AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 2000-03-14
Filing date: 2001-03-12
Publication date: 2007-11-01
Anticipated expiration: 2021-03-12
Also published as: EP1266005B1; DE60127102T2; WO2001068839A9; ATE356208T1; US20020058259A1; DE60127102D1; WO2001068839A2; WO2001068839A3; AU2001252181A1; EP1266005A2

Abstract

El uso de un polipéptido seleccionado entre el grupo constituido por (i) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos idéntica en un 90% a la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 2; (ii) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 2 en la selección de los compuestos útiles en el tratamiento de una enfermedad asociada con procesos inflamatorios, en el que se pone en contacto un compuesto de ensayo con el polipéptido, se mide el enlace del compuesto de ensayo con el polipéptido y se selecciona un compuesto de ensayo que enlaza con el polipéptido como un compuesto útil en el tratamiento de una enfermedad asociada con procesos inflamatorios.

Description

Regulación de la proteína similar al receptor de la lipoxina A_{4} humana.

Campo técnico de la invención

La invención se refiere al área de los receptores acoplados a la proteína G. De manera más particular, se refiere al área de las proteínas similares al receptor de la lipoxina A_{4} y a su uso en la selección de fármacos en el campo de las enfermedades inflamatorias.

Antecedentes de la invención Receptores acoplados a la proteína G

Muchos procesos biológicos médicamente significativos están mediados por las rutas de transducción de la señal que implican a las proteínas G (Lefkowitz, Nature 351, 353-354, 1991). La familia de los receptores acoplados a la proteína G (GPCR) incluye receptores para las hormonas, neurotransmisores, factores de crecimiento, y virus. Los ejemplos específicos de GPCR incluyen los receptores para dichos diversos agentes tales como dopamina, calcitonina, hormonas adrenérgicas, endotelina, AMPc, adenosina, acetilcolina, serotonina, histamina, trombina, cinina, hormona estimulante del folículo, opsinas, gen-1 de la diferenciación endotelial, rodopsinas, odorizantes, citomegalovirus, las propias proteínas G, proteínas efectoras tales como fosfolipasa C, adenil ciclasa, y fosfodiesterasa, y proteínas accionadoras tales como la proteína quinasa A y proteína quinasa C.

Los GPRC poseen siete regiones conservadas de expansión de la membrana que conectan al menos ocho bucles hidrófilos divergentes. Se han caracterizado los GPRC (conocidos también como receptores 7TM) como incluyendo estas siete extensiones hidrófobas conservadas de aproximadamente 20 a 30 aminoácidos, que conectan al menos ocho bucles hidrófilos divergentes. La mayor parte de los GPRC tienen residuos con una única cisteína conservada en cada uno de los primeros dos bucles extracelulares, que forman enlaces disulfuro que se piensa que estabilizan la estructura funcional de la proteína. Se designaron estas siete regiones transmembrana como TM1, TM2, TM3, TM4, TM5, TM6, y TM7. Se ha implicado a TM3 en la transducción de la señal.

La fosforilación y lipidación (palmitilación o farnesilación) de los residuos de cisteína puede tener influencia sobre la transducción de la señal de algunos GPCR. La mayor parte de los GPCR contienen emplazamientos potenciales de fosforilación dentro del tercer bucle citoplásmico y/o el término carboxilo. Para diversos GPRC, tales como el receptor \beta-adrenérgico, la fosforilación mediante la protein quinasa A y/o las quinasas específicas del receptor media la insensibilización del receptor.

Para algunos receptores, se cree que los emplazamientos de enlace del ligando de los GPRC comprenden manguitos hidrófilos formados por varias regiones GPRC transmembrana. Estos manguitos hidrófilos están rodeados por residuos hidrófobos de los GPRC. Se piensa que el lado hidrófilo de cada hélice GPRC transmembrana está orientado hacia el interior, y forma un emplazamiento de enlace del ligando polar. Se ha implicado a TM3 en diversos GPRC que tienen un emplazamiento de enlace del ligando, tal como el residuo aspartato del TM3. Las serinas de TM5, una asparagina de TM6, y las fenilalaninas o tirosinas de TM6 o TM7 están también implicadas en el enlace del ligando.

Los GPRC se acoplan en el interior de la célula mediante proteínas G heterotriméricas a diversos enzimas, canales iónicos, y transportadores intracelulares (véase Johnson y col., Endoc. Rev. 10, 317-331, 1989). Las diferentes subunidades alfa de la proteína G estimulan efectores concretos para modular las diversas funciones biológicas de una célula. La fosforilación de los residuos citoplásmicos de los GPRC es un mecanismo importante para la regulación de algunos GPRC. Por ejemplo, en una forma de transducción de la señal, el efecto del enlace de la hormona es la activación del enzima, adenilato ciclasa, en el interior de la célula. La activación del enzima mediante las hormonas es dependiente de la presencia del nucleótido GTP. GTP tiene influencia también sobre el enlace de la hormona. Una proteína G conecta el receptor de la hormona a la adenilato ciclasa. La proteína G intercambia GTP para enlazar GDP cuando se activa mediante un receptor de la hormona. La forma transportadora de GTP se enlaza a continuación con la adenilato ciclasa activada. La hidrólisis de GTP a GDP, catalizada por la propia proteína G, devuelve la proteína G a su forma basal inactiva. De esta manera, la proteína G tiene un doble papel, como un intermedio que retransmite la señal desde el receptor al efector, y como un reloj que controla la duración de la señal.

En los pasados 15 años se han introducido satisfactoriamente en el mercado cerca de 350 agentes terapéuticos que hacen diana en los receptores 7TM. Esto indica que estos receptores tienen un historial establecido y probado como dianas terapéuticas. De manera clara, existe necesidad de identificación y caracterización de otros receptores que puedan jugar un papel en la prevención, mejoramiento, o corrección de disfunciones o enfermedades entre las que se incluyen, pero no se limitan a, infecciones tales como las infecciones bacterianas, fúngicas, protozoarias, y víricas, de manera particular aquellas producidas por los virus VIH, dolor, cánceres, anorexia, bulimia, asma, enfermedades de Parkinson, fracaso agudo del corazón, hipotensión, hipertensión, retención urinaria, osteoporosis, angina de pecho, infarto de miocardio, úlceras, asma, alergias, hipertrofia prostática benigna, y transtornos psicóticos y neurológicos que incluyen ansiedad, esquizofrenia, depresión maníaca, delirio, demencia, algunos retrasos mentales, y disquinesias, tales como enfermedad de Huntington y síndrome de Tourett.

Lipoxina A_{4}

Las lipoxinas (productos de interacción con la lipoxigenasa) son una nueva serie de metabolitos derivados del ácido araquidónico (Serhan y col., Biochem. Biophys. Res. Commun. 18, 943-949 (1984); Serhan y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 5335-5339, 1984). La característica distintiva de una lipoxina es la presencia de una estructura de tetraeno conjugada con trihidroxilo. Se han caracterizado al menos dos lipoxinas biológicamente activas: la lipoxina A_{4} [ácido (5S,6R,15S)-5,6,15-trihidroxi-7,9,13-trans-11-cis-eicosa-tetraenoico] y la lipoxina B_{4} [ácido (5S,14R,15S)-5,14,15-trihidroxi-6,10,12-trans-8-cis-eicosatetraenoico] (Serhan. y col., J. Biol. Chem. 261, 16340-16345; Serhan y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 1983-1987, 1986).

Se ha demostrado que la lipoxina A_{4} contrae el músculo liso pulmonar (pulmón de cobaya), pero no el íleo o la tráquea de cobaya, y relaja (dilata) el músculo liso pulmonar a concentraciones de menos de 1 \muM (Dahlen y col., Acta Physiol. Scand. 130, 643-647, 1987). La administración tópica de la lipoxina A_{4} en la bolsa de la quijada del hámster induce una pronunciada dilatación arteriolar, pero no cambia los diámetros venulares (Dahlen y col., en ADV. EXPER. MED. BIOL. 229, Capítulo 9, pp. 107-130, 1988). Se ha demostrado también que la lipoxina A_{4} induce los neutrófilos para generar radicales superóxido, liberación de la elastasa, y promueve la quimiotaxis por los leucocitos (Serhan y col., en PROSTAGLANDINS, LEUKOTRIENES AND LIPOXINS, J. M. Bailey, ed., Plenum, N. Y., pp. 3-16, 1985).

Se ha sugerido el uso de la lipoxina A_{4} para inducir la respuesta inflamatoria de los neutrófilos con el fin de proporcionar un modelo experimental para evaluar la eficacia de compuestos tales con los derivados de la lipoxina B_{4} en la prevención de esta respuesta (Samuelsson y col., Patente de Los Estados Unidos 4.560.514): Se ha sugerido también que la lipoxina A_{4} puede ejercer algunos de sus efectos biológicos mediante el enlace con el receptor de la lipoxina D_{4} (Jacques y col., Br. J. Pharmacol. 95, 562-568, 1988), y que la lipoxina A_{4} y LTD_{4} pueden incluso compartir un receptor común (Lefer y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 8340-8344, 1988).

Los estudios en neutrófilos humanos han establecido una relación inversa entre la generación de lipoxinas y leucotrienos tras la exposición de estas células al 15-HETE y al ionóforo de calcio A23187 (Serhan, en ADVANCES IN PROSTAGLANDIN, THROMBOXANE AND LEUKOTRIENE RESEARCH, B. Samuelsson y col., eds., Raven Press, N. Y., Volumen 18). De manera adicional, resultados recientes indican que las células mesengiales pueden generar lipoxinas a partir de fuentes endógenas de LT_{4} (Garrick y col., Kidney Int. Proceedings 21st Annual Meeting of the American Society of Nephrology, Vol. 25, p. 292, 1989), que se pueden proporcionar mediante leucocitos activados (por ejemplo, durante el metabolismo transcelular). De esta manera, los niveles locales de estos compuestos pueden ser elevados tras la infiltración de los leucocitos en los glomérulos.

Resumen de la invención

Una forma de realización de la invención es un procedimiento de selección de agentes que puedan regular la actividad de un polipéptido similar al receptor A_{4}. Se pone en contacto un compuesto de ensayo con el polipéptido similar al receptor A_{4} que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por secuencias de aminoácidos que son al menos un 30% idénticas a la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC DE ID Nº. 2 y la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC DE ID Nº. 2. Se detecta el enlace del compuesto de ensayo con el polipéptido. Se identifica por tanto un compuesto de ensayo que enlaza con el polipéptido como agente potencial para la actividad reguladora de un polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} útil en el tratamiento de una enfermedad asociada con los procesos inflamatorios.

Otra forma de realización de la invención es un procedimiento de selección de agentes útiles en el tratamiento de una enfermedad asociada con procesos inflamatorios que reduce la actividad de un polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4}. Se pone en contacto, o se incuba, un compuesto de ensayo con una célula biológica, en la que la célula biológica es una célula-T y/o ha sido transformada con un polinucleótido, en el que el polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada entre el grupo constituido por las secuencias de nucleótidos que se hibridan bajo condiciones de restricción con la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº 1 y la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº 1. Se detecta el enlace del compuesto de ensayo con el polinucleótido. Se identifica un compuesto de ensayo que enlaza con el polinucleótido como un agente potencial para reducir la actividad de un polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4}. El agente puede trabajar disminuyendo la cantidad del polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} mediante la interacción con el ARNm similar al receptor de la lipoxina A_{4}.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 muestra la secuencia de ADN que codifica un polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4}.

La Fig. 2 muestra la secuencia de aminoácidos de un polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4}.

Descripción detallada de la invención

La invención se refiere al uso, tal como se define mediante las reivindicaciones, de un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} y que se selecciona entre el grupo constituido por:

a): un polinucleótido que comprende la secuencia de la SEC DE ID Nº 1;

b): un polinucleótido que se hibrida bajo condiciones de restricción con un polinucleótido especificado en (a),

c): un polinucleótido, que comprende un polinucleótido tal como se ha definido en a) o b).

También se puede usar un polipéptido similar al receptor de la lipoxina humana en la selección de agonistas o antagonistas del receptor similar al de la lipoxina A_{4} útiles en el tratamiento de una enfermedad asociada con procesos inflamatorios.

Se muestra en la SEC DE ID Nº 2 la secuencia de aminoácidos del polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} útil para la invención y definida mediante las reivindicaciones o es al menos un 30% idéntica con la SEC DE ID Nº: 2. Se muestra en la SEC DE ID Nº 1 una secuencia de nucleótidos que codifica la SEC DE ID Nº 2, con los codones de inicio y parada indicados.

Polipéptidos similares al receptor de la lipoxina A_{4}

Los polipéptidos similares al receptor de la lipoxina A_{4} útiles para la invención tal como se definen mediante las reivindicaciones comprenden la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC DE ID Nº 2 o son idénticos en al menos un 30% a la SEC DE ID Nº. 2. Un polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} de la invención puede ser por tanto una porción de una molécula similar al receptor de la lipoxina A_{4}, una molécula de longitud completa similar al receptor de la lipoxina A_{4}, o una proteína de fusión que comprende toda o una porción de de una molécula similar al receptor de la lipoxina A_{4}.

De manera preferible, un polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} enlaza con la lipoxina A_{4} o un análogo de la lipoxina A_{4}. Se puede determinar el enlace tal como se describe, por ejemplo, en los ejemplos específicos a continuación.

Variantes biológicamente activas

Las variantes del polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} que son biológicamente activas, es decir, retienen la capacidad de enlazar la lipoxina A_{4} o un análogo de la lipoxina A_{4}, y/o que media un efecto biológico, tal como la formación de AMP cíclico, la movilización de calcio intracelular o el metabolismo del fosfoinositido, también son polipéptidos similares al receptor de la lipoxina A_{4.} Se determina el porcentaje de identidad entre una variante de polipéptido pretendido similar al receptor de la lipoxina A_{4} y una secuencia de aminoácidos de la SEC DE ID Nº. 2 usando el programa de alineación Blast2.

Las variaciones en el porcentaje de identidad pueden ser debidas, por ejemplo, a las sustituciones, inserciones, o delecciones de aminoácidos. Se definen las sustituciones de aminoácidos como un reemplazo de un aminoácido. Son de naturaleza conservativa cuando el aminoácido sustituido tiene propiedades estructurales y/o químicas similares. Los ejemplos de sustituciones conservativas son la sustitución de una leucina con una isoleucina o valina, un aspartato con glutamato, o una treonina con una serina.

Las inserciones o delecciones de aminoácidos son cambios en o dentro de una secuencia de aminoácidos. Están comprendidas normalmente en el intervalo de aproximadamente 1 a 5 aminoácidos. Se puede encontrar la directriz para la determinación de qué residuos de aminoácidos se pueden sustituir, insertar, o borrar sin suprimir la actividad biológica o inmunológica de un polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} usando programas de ordenador bien conocidos en la técnica, tales como el software DNASTAR. Se puede determinar fácilmente si un cambio de aminoácido da como resultado un polipéptido biológicamente activo similar al receptor de la lipoxina A_{4} evaluando la actividad del polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4}, tal como se describe, por ejemplo, en los ejemplos específicos a continuación.

Proteínas de fusión

Las proteínas de fusión son útiles para generar anticuerpos frente a las secuencias de aminoácidos de polipéptidos similares al receptor de la lipoxina A_{4} y para el uso en diversos sistemas de ensayo. Por ejemplo, se pueden usar las proteínas de fusión para identificar las proteínas que interactúan con las porciones de un polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4}. Se pueden usar con este objetivo la cromatografía de afinidad de proteínas o los ensayos basados en bibliotecas para las interacciones proteína-proteína, tales como los sistemas híbridos de dos levaduras o los de exposición de fagos. Dichos procedimientos son bien conocidos en la técnica y se pueden usar también para la selección de fármacos.

Una proteína de fusión de un polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} comprende dos segmentos de polipéptido fusionados conjuntamente por medio de un enlace peptídico. Se pueden seleccionar los aminoácidos contiguos para uso en una proteína de fusión a partir de la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC DE ID Nº 2 o a partir de una variante biológicamente activa de aquellas secuencias, tales como aquellas descritas anteriormente. El primer segmento de polipéptido puede comprender también el polipéptido de longitud completa similar al receptor de la lipoxina A_{4}.

El segundo segmento de polipéptido puede ser una proteína de longitud completa o un fragmento de proteína. Las proteínas comúnmente usadas en la construcción de una proteína de fusión incluyen \beta-galactosidasa, \beta-glucuronidasa, proteína fluorescente verde (GFP), proteínas autoflorescentes, que incluyen proteína fluorescente azul (BFP), glutatión-S-transferasa (GST), luciferasa, peroxidasa de rábano picante (HRP), y cloranfenicol acetiltransferasa (CAT). De manera adicional, se usan etiquetas de epitopos en las construcciones de las proteínas de fusión, que incluyen etiquetas de histidina (His), etiquetas FLAG, etiquetas de hemaglutinina de la gripe (HA), etiquetas Myc, etiquetas VSV-G, y etiquetas de tioredoxina (Trx). Otras construcciones de fusión pueden incluir proteína de enlace con la maltosa (MBP), etiqueta S, fusiones de regiones de enlace Lex a ADN (DBD), y fusiones de proteínas BP16 y virus del herpes simple (VSH). Se puede construir mediante ingeniería genética una proteína de fusión para que contenga un emplazamiento de rotura localizado entre la secuencia que codifica el polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} y la secuencia de la proteína heteróloga, de tal manera que se pueda romper el polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} y purificarse por eliminación del resto heterólogo.

Se puede sintetizar químicamente una proteína de fusión, tal como se conoce en la técnica. De manera preferible, una proteína de fusión se produce mediante dos segmentos de polipéptido enlazados covalentemente o mediante procedimientos estándar en la técnica de la biología molecular. Se pueden usar procedimientos de ADN recombinante para preparar proteínas de fusión, por ejemplo, fabricando un constructo de ADN que comprenda las secuencias de codificación seleccionadas a partir de la SEC DE ID Nº 1 en un marco de lectura apropiado con nucleótidos que codifiquen el segundo segmento de polipéptido y expresen el constructo de ADN en una célula huésped, tal como se conoce en la técnica. Están disponibles muchos kits para construir proteínas de fusión de compañías tales como Promega Corporation (Madison, WI), Stratagene (La Jolla, CA), CLONTECH (Mountain View, CA), Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), MBL Internacional Corporation (MIC; Watertown, MA), y Quantum Biotechnologies (Montreal, Canadá; 1-888-DNA-KITS).

Identificación de especies homólogas

Se pueden obtener especies homólogas del polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} humana usando polinucleótidos del polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} (descritos anteriormente) para fabricar sondas o cebadores adecuados para seleccionar bibliotecas de expresión de ADNc a partir de otras especies, tales como ratones, monos, o levaduras, que identifican los ADNc que codifican los homólogos del polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4}, y que expresan los ADNc tal como se conoce en la técnica.

Polinucleótidos similares al receptor de la lipoxina A_{4}

Un polinucleótido similar al receptor de la lipoxina A_{4} puede ser de cadena única o doble y comprende una secuencia de codificación o el complemento de una secuencia de codificación de un polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4}. Se muestra en la SEC DE ID Nº 1 una secuencia de codificación del polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4}.

Las secuencias de nucleótidos degenerados que codifican los polipéptidos similares al receptor de la lipoxina A_{4}, así como las secuencias de nucleótidos homólogos que son idénticas en al menos 50, de manera preferible aproximadamente 75, 90, 96, o 98% a la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº 1, son también polinucleótidos similares al receptor de la lipoxina A_{4}. Se determina el porcentaje de identidad de la secuencia entre las secuencias de dos polinucleótidos usando programas de ordenador tales como ALIGN que emplea el algoritmo FASTA, usando un intervalo de búsqueda por afinidad con una penalización de intervalo abierto de -12 y una penalización de intervalo de extensión de -2. Las moléculas de ADN complementario (ADNc), especies homólogas, y variantes de los polinucleótidos similares al receptor de la lipoxina A_{4} que codifican los polinucleótidos similares al receptor de la lipoxina A_{4} activa son también polinucleótidos similares al receptor de la lipoxina A_{4}.

Identificación de variantes y homólogos de los polinucleótidos de polipéptidos similares al receptor de la lipoxina A_{4}

Las variantes y homólogos de los polinucleótidos similares al receptor de la lipoxina A_{4} descritos más arriba son también polinucleótidos similares al receptor de la lipoxina A_{4}. Normalmente, se pueden identificar las secuencias homólogas de los polinucleótidos similares al receptor de la lipoxina A_{4} mediante la hibridación de los polinucleótidos candidatos con los polinucleótidos conocidos similares al receptor de la lipoxina A_{4} bajo condiciones de restricción, tal como se conoce en la técnica. Por ejemplo, usando las siguientes condiciones de lavado -2X SSC (NaCl 0,3 M, citrato de sodio 0,03 M, pH 7,0), SDS al 0,1%, dos veces a temperatura ambiente, 30 minutos cada una; a continuación 2 X SSC, SDS al 0,1%, una vez a 50ºC, 30 minutos; a continuación 2X SSC, dos veces a temperatura ambiente, 10 minutos cada una - se pueden identificar las secuencias homólogas que contienen en su mayor parte aproximadamente un 25-30% de pares de bases desemparejadas. De manera más preferible, las cadenas homólogas de ácido nucleico contienen un 15-25% de pares de bases desemparejadas, incluso de manera más preferible un 5-15% de pares de bases desemparejadas.

Se pueden identificar también especies homólogas de los polinucleótidos similares al receptor de la lipoxina A_{4} que se describen en el presente documento fabricando sondas o cebadores adecuados y seleccionando librerías de expresión de ADNc procedente de otras especies, tales como ratones, monos, o levaduras. Se pueden identificar las variantes humanas de los polinucleótidos similares al receptor de la lipoxina A_{4}, por ejemplo, mediante la selección de librerías de expresión del ADNc humano. Es bien sabido que la T_{m} de un ADN de cadena doble disminuye en un 1-1,5ºC por cada 1% de disminución en la homología (Bonner y col., J. Mol. Biol. 81, 123 (1973). Se pueden identificar por tanto las variantes de los polinucleótidos similares al receptor de la lipoxina A_{4} humana de otras especies hibridando un polinucleótido homólogo pretendido similar al receptor de la lipoxina A_{4} con un polinucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEC DE ID Nº 1, o el complemento de la misma, para formar un híbrido de ensayo. Se compara la temperatura de fusión del híbrido de ensayo con la temperatura de fusión de un híbrido que comprende los polinucleótidos de la transformilasa que tienen secuencias de nucleótidos perfectamente complementarias, y se calcula el número o porcentaje de pares de bases desemparejadas dentro del híbrido de ensayo.

Las secuencias de nucleótidos que hibridan con los polinucleótidos de la transformilasa o sus complementos tras la hibridación en condiciones de restricción y/o de lavado son también polinucleótidos similares al receptor de la lipoxina A_{4}.Son bien conocidas y comprendidas en la técnica las condiciones de lavado con restricción y se describen, por ejemplo, en Sambrook y col., MOLECULAR CLONING; A LABORATORY MANUAL, 2d ed, 1989, en las páginas 9.50-9.51.

Las condiciones de lavado con restricción incluyen, por ejemplo, 4X SSC a 65ºC, o formamida al 50%, 4X SSC a 42ºC, o 0,5X SSC, SDS al 0,1% a 65ºC. Las condiciones de lavado altamente restrictivo incluyen, por ejemplo, 0,2X SSC a 65ºC.

Preparación de los polinucleótidos similares al receptor de la lipoxina A_{4}

Se puede aislar un polinucleótido similar al receptor de la lipoxina A_{4} libre de otros componentes celulares, proteínas y lípidos. Se pueden fabricar los polinucleótidos por una célula, y aislarse usando técnicas estándar de purificación de ácidos nucleicos, o sintetizarse usando una técnica de amplificación, tal como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), o usando un sintetizador automático. Los procedimientos para aislar polinucleótidos son rutinarios y se conocen en la técnica. Se puede usar cualquiera de dichas técnicas para obtener polinucleótidos aislados similares al receptor de la lipoxina A_{4}. Por ejemplo, se pueden usar enzimas de restricción y sondas para aislar fragmentos de polinucleótidos que comprendan secuencias de nucleótidos similares al receptor de la lipoxina A_{4}. Los polinucleótidos aislados están en preparaciones que están libres, o al menos libres en un 70, 80, o 90%, de otras moléculas.

Se pueden fabricar las moléculas de ADNc similares al receptor de la lipoxina A_{4} con técnicas estándar de biología molecular, usando ARNm similar al del receptor de la lipoxina A_{4} como uno similar al receptor de la lipoxina A_{4}. Se pueden por tanto replicar moléculas de ADNc similares al receptor de la lipoxina A_{4} usando técnicas de biología molecular conocidas en la técnica y descritas en manuales tales como Sambrook y col (1989). Se puede usar una técnica de amplificación, tal como la PCR, para obtener copias adicionales de los polinucleótidos de la invención, usando como plantilla ADN genómico o ADNc.

Se pueden usar técnicas de química sintética, de manera alternativa, para sintetizar polinucleótidos similares al receptor de la lipoxina A_{4}. La degeneración del código genético permite alternar las secuencias de nucleótidos que se van a sintetizar que codificarán un polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} que tenga, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC DE ID Nº 2, o una variante biológicamente activa de la misma.

Obtención de polipéptidos similares al receptor de la lipoxina A_{4}

Se pueden obtener polipéptidos similares al receptor de la lipoxina A_{4}, por ejemplo, mediante purificación a partir de células humanas, mediante la expresión de polinucleótidos similares al receptor de la lipoxina A_{4}, o mediante síntesis química directa.

Purificación de proteínas

Se pueden purificar polipéptidos similares al receptor de la lipoxina A_{4} a partir de cualquier célula humana que exprese el receptor, incluyendo cualquier célula huésped que se haya transfectado con un constructo de polinucleótido que exprese el polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4}. Se separa un polipéptido purificado similar al receptor de la lipoxina A_{4} de otros compuestos que se asocian normalmente con el polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} en la célula, tales como algunas proteínas, carbohidratos, o lípidos, usando procedimientos bien conocidos en la técnica. Tales procedimientos incluyen, pero no se limitan a, cromatografía de exclusión por tamaños, fraccionamiento en sulfato de amonio, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, y electroforesis preparativa en gel.

Se aísla de manera conveniente el polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} en forma de complejo con su proteína G asociada. Están disponibles una variedad de análogos similares al receptor de la lipoxina A_{4} y se pueden usar como ligandos para el enlace del receptor. Son particularmente útiles para este objetivo los análogos similares al receptor de la lipoxina A_{4}. Una preparación de polipéptidos purificados similares al receptor de la lipoxina A_{4} es pura en al menos un 80%; de manera preferible, las preparaciones son puras en un 90%, 95%, o 99%. Se puede evaluar la pureza de las preparaciones mediante cualquier medio conocido en la técnica, tal como la electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida.

Expresión de los polinucleótidos similares al receptor de la lipoxina A_{4}

Para expresar un polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4}, se puede insertar un polinucleótido similar al receptor de la lipoxina A_{4} en un vector de expresión que contiene los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia de codificación insertada.

Se pueden usar procedimientos que son bien conocidos por aquellas personas expertas en la técnica para construir vectores de expresión que contengan las secuencias que codifican los polipéptidos similares al receptor de la lipoxina A_{4} y los elementos de control transcripcional y traduccional apropiados. Estos procedimientos incluyen técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas, y la recombinación genética in vivo. Dichas técnicas se describen, por ejemplo, en Sambrook y col. (1989) y en Ausebel y col., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley y Sons, Nueva York, N. Y, 1989.

Se puede utilizar una variedad de sistemas vector de expresión / huésped para contener y expresar las secuencias que codifican un polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4}. Entre estos se incluyen, pero no se limitan a, microorganismos, tales como bacterias transformadas con bacteriófagos recombinantes, plásmidos, o vectores de expresión de ADN de cósmidos; levaduras transformadas con vectores de expresión de levaduras, sistemas de células de insectos infectados con vectores de expresión de virus (por ejemplo, baculovirus), sistemas de células de plantas transformados con vectores de expresión de virus (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco,
TMV), o con vectores de expresión de bacterias (por ejemplo, plásmidos Ti o pBR322), o sistemas de células animales.

Los elementos de control o secuencias reguladoras son aquellas regiones no traducidas del vector - mejoradores, promotores, regiones 5’ y 3’ no traducidas - que interactúan con las proteínas celulares del huésped para llevar a cabo la transcripción y la traducción. Dichos elementos pueden variar en su fuerza y especificidad. Dependiendo del sistema vector y el huésped utilizado, se puede usar cualquier número de elementos de transcripción y traducción adecuados, incluyendo promotores constitutivos e inducibles. Por ejemplo, cuando se clonan en sistemas bacterianos, se pueden usar promotores inducibles tales como el promotor lacZ híbrido del fagémido BLUESCRIPT (Stratagene, La Jolla, Calif.) o del plásmido pSPORT1 (Life Technologies) y similares. Se puede usar el promotor de la polihedrina de baculovirus en células de insectos. Se pueden clonar en el vector los promotores o mejoradores derivados de los genomas de células de plantas (por ejemplo, genes de choque térmico, RUBISCO, y proteínas de almacenamiento) o a partir de virus de plantas (por ejemplo, promotores víricos o secuencias líder). En los sistemas de células de mamíferos, son preferibles los promotores de genes de mamíferos o de virus de mamíferos. Si es necesario generar una línea de células que contenga copias múltiples de una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4}, se pueden usar vectores basados en SV40 o EBV con un marcador seleccionable apropiado.

Sistemas de expresión bacterianos y de levaduras

En los sistemas bacterianos, se pueden seleccionar numerosos vectores de expresión dependiendo del uso pretendido del polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4}. Por ejemplo, cuando se necesita una gran cantidad de polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} para la inducción de anticuerpos, se pueden usar vectores que promuevan un elevado nivel de expresión de las proteínas de fusión que se purifiquen fácilmente. Dichos vectores incluyen, pero no se limitan a, vectores de expresión y clonación de E. coli multifuncionales tales como BLUESCRIPT (Stratagene). En un vector BLUESCRIPT se puede ligar una secuencia que codifica el polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} en el vector en un marco con secuencias para el amino terminal Met y los 7 residuos posteriores de \beta-galactosidasa, de tal manera que se produzca una proteína híbrida. Se pueden usar también vectores pIN (Van Heeke y Schuster, J. Biol. Chem. 264, 5503-5509, 1989) o vectores pGEX (Promega, Madison, Wis) para expresar los polipéptidos anteriores en forma de proteínas de fusión con la glutatión S-transferasa (GST). En general, dichas proteínas de fusión son solubles y se pueden purificar fácilmente a partir de células lisadas mediante adsorción con perlas de glutatión-agarosa seguido por la elución en presencia de glutatión libre, Se pueden diseñar la proteínas fabricadas en dichos sistemas para incluir heparina, trombina, o los emplazamientos de rotura mediante proteasa del factor Xa de tal manera que se puede dosificar el polipéptido clonado de interés a voluntad desde el resto GST.

En la levadura Saccharomyces cerevisiae, se pueden usar numerosos vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles tales como el factor alfa, la alcohol oxidasa, y PGH. Para las revisiones, véase Ausebel y col. (1989) y Grant y col., Methods Enzymol. 153, 516-544, 1987.

Sistemas de expresión en plantas e insectos

Si se usan vectores de expresión de plantas, puede llevarse a cabo la expresión de las secuencias que codifican los polipéptidos similares al receptor de la lipoxina A_{4} por cualquiera de numerosos promotores. Se pueden usar, por ejemplo, promotores víricos tales como los promotores 35S y 19S de CaMV, sólos o en combinación con la secuencia líder omega procedente de TMV (Takamatsu EMBO J. 6, 307-311, 1987). De manera alternativa, se pueden usar promotores de plantas tales como la subunidad pequeña de RUBISCO o promotores del choque térmico (Coruzzi y col., EMBO J. 3, 1671-1680, 1984; Broglie y col., Science 224, 838-843, 1984; Winter y col., Results Probl. Cell Differ. 17, 85-105, 1991). Se pueden introducir estos constructos en las células de plantas mediante transformación directa del ADN o mediante transfección mediada por patógenos. Se describen dichas técnicas en numerosas revisiones generalmente disponibles (por ejemplo, Hobbs o Murry, en MCGRAW HILL YEARBOOK OF SCIENCE AND TECHNOLOGY, McGraw Hill, Nueva York, N. Y., pp 191-196, 1992).

Se puede usar también un sistema de insecto para expresar el polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4}. Por ejemplo, en uno de dichos sistemas se usa el virus de la polihedrosis nuclear Autographa californica (AcNPV) como vector para expresar los genes extraños en células de Spodoptera frugiperda o en las larvas de Trichoplusia. Se pueden clonar las secuencias que codifican los polipéptidos similares al receptor de la lipoxina A_{4} en una región no esencial del virus, tal como el gen de la polihedrina, y colocarlos bajo el control del promotor de la polihedrina, La inserción satisfactoria de los polipéptidos similares al receptor de la lipoxina A_{4} volverá inactivo el gen de la polihedrina y produce virus recombinantes que carecen de proteína de la cubierta. A continuación se pueden usar los virus recombinantes para infectar células de S. frugiperda o larvas de Trichoplusia en las que se pueden expresar los polipéptidos similares al receptor de la lipoxina A_{4} (Engelhard y col., Proc. Nat. Acad. Sci. 91, 3224-3227, 1994).

Sistemas de expresión en mamíferos

Se pueden usar numerosos sistemas de expresión basados en virus para expresar los polipéptidos similares al receptor de la lipoxina A_{4} en células huésped de mamíferos. Por ejemplo, si se usa un adenovirus como vector de expresión, se pueden ligar las secuencias que codifican los polipéptidos similares al receptor de la lipoxina A_{4} en un complejo de transcripción / traducción del adenovirus que comprende el promotor tardío y la secuencia líder tripartita. Se puede usar la inserción en una región E1 o E3 no esencial del genoma vírico para obtener un virus viable que sea capaz de expresar un polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} en células huésped infectadas (Logan y Sheik, Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 3655-3659, 1984). Si se desea, se pueden usar mejoradores de la transcripción tales como el mejorador del virus del sarcoma de Rous (RSV), para aumentar la expresión en las células huésped de mamíferos.

Se pueden usar también cromosomas artificiales humanos (HAC) para liberar fragmentos más grandes de ADN que se pueden contener y expresar en un plásmido. Se construyen HAC de 6M a 10M y se proporcionan a las células mediante procedimientos de liberación convencionales (por ejemplo, liposomas, amino polímeros policatiónicos, o vesículas).

Se pueden usar también señales específicas de iniciación para conseguir una traducción más eficiente de las secuencias que codifican los polipéptidos similares al receptor de la lipoxina A_{4}. Dichas señales incluyen el codón de iniciación ATG y las secuencias adyacentes. En los casos en los que las secuencias que codifican un polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4}, su codón de iniciación, y las secuencias corriente arriba, se insertan en el vector de expresión apropiado, sin necesitarse señales de control transcripcional o traduccional adicionales. Sin embargo, en los casos en los que únicamente se inserta la señal de codificación o un fragmento de la misma, deberán proporcionarse señales exógenas de control traduccional (que incluyen el codón de iniciación ATG). El codón de iniciación deberá estar en el marco de lectura correcto para asegurar la traducción del inserto completo. Los elementos traduccionales exógenos y los codones de iniciación pueden ser de diversos orígenes, tanto naturales como sintéticos. Se puede mejorar la eficiencia de expresión mediante la inclusión de mejoradores que sean apropiados para el sistema celular concreto que se usa (véase Scharf y col., Results Probl. Cell. Differ. 20, 125-162, 1994).

Células huésped

Se puede escoger una cepa de célula huésped por su capacidad para modular la expresión de las secuencias insertadas o para procesar el polipéptido expresado similar al receptor de la lipoxina A_{4} de la manera deseada. Dichas modificaciones del polipéptido incluyen, pero no se limitan a, acetilación, carboxilación, glicosilación, fosforilación, lipidación, y acilación. Se puede usar también el procesamiento post-traduccional que rompe una forma "prepro" del polipéptido para facilitar la inserción, el plegado y/o la función correcta. Están disponibles en la American Type Culture Collection (ATCC; 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209) diferentes células huésped que tienen la maquinaria celular específica y los mecanismos característicos para las actividades post-traduccionales (por ejemplo, CHO, HeLa, MDCK, HEK293, y WI38), y se pueden escoger para asegurar la modificación y procesamiento correctos de la proteína extraña.

Se prefiere la expresión estable para la producción a largo plazo con alto rendimiento de las proteínas recombinantes. Se pueden transformar, por ejemplo, las líneas celulares que expresan de manera estable los polipéptidos similares al receptor de la lipoxina A_{4} usando vectores de expresión que pueden contener orígenes víricos de la replicación y/o elementos de expresión endógena y un gen marcador seleccionable sobre el mismo o sobre un vector separado. Tras la introducción del vector, se puede dejar crecer a las células durante 1-2 días en un medio enriquecido antes de que se cambien a un medio selectivo. El objetivo del marcador seleccionable es conferir resistencia a la selección, y su presencia permite el crecimiento y recuperación de las células que expresan satisfactoriamente las secuencias introducidas similares al receptor de la lipoxina A_{4}. Pueden proliferar los clones resistentes de células transformadas estables usando técnicas apropiadas de cultivo de tejidos para el tipo de célula. Véase, por ejemplo, ANIMAL CELL CULTURE, R. I. Freshney, ed., 1986.

Se puede usar cualquier número de sistemas de selección para recuperar las líneas de células transformadas.

Entre estos se incluyen, pero no se limitan a, los genes de la timidina quinasa (Wigler y col., Cell II, 223-32, 1977) y la adenina fosforibosiltransferasa (Lowy y col., Cell 22, 817-23, 1980) del virus del herpes simple que se pueden emplear en las células tk o aprf, de manera respectiva. También, se puede usar como base para la selección antimetabolitos, antibióticos, o la resistencia a los herbicidas. Por ejemplo, dhfr confiere resistencia al metotrexato (Wigler y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 77, 3567-70, 1980), npt confiere resistencia a los aminoglicósidos, a la neomicina y a G-418 (Colbere-Garapin y col., J. Mol. Biol. 150, 1-14, 1981) y als y pat confieren resistencia al clorsulfuron y a la fosfinotricin acetiltransferasa, de manera respectiva (Murry, 1992, más arriba). Se han descrito genes seleccionables adicionales. Por ejemplo, trpB permite a las células utilizar indol en lugar de triptófano, o hisD, que permite a las células utilizar histinol en lugar de histidina (Hartman y Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 8047-51, 1988). Se pueden usar marcadores visibles tales como antocianinas, \beta-glucuronidasa y su sustrato GUS, y luciferasa y su sustrato luciferina, para identificar los transformantes y cuantificar la cantidad de la expresión de la proteína transitoria o estable atribuible a un sistema específico de vector (Rhodes y col., Methods Mol. Biol. 55, 121-131, 1995).

Detección de la expresión de los polipéptidos similares al receptor de la lipoxina A_{4}

Aunque la presencia de la expresión del gen marcador sugiere que está también presente el polinucleótido similar al receptor de la lipoxina A_{4}, puede necesitar confirmarse su presencia y expresión. Por ejemplo, si se inserta una secuencia que codifica un polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} dentro de una secuencia de gen marcador se pueden identificar las células transformadas que contienen las secuencias que codifican un polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} mediante la ausencia de función del gen marcador. De manera alternativa, se puede colocar un gen marcador en tándem con una secuencia que codifica un polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} bajo el control de un promotor único. La expresión del gen marcador en respuesta a la inducción o selección indica normalmente la expresión del polinucleótido similar al receptor de la lipoxina A_{4}.

De manera alternativa, se pueden expresar las células huésped que contienen un polinucleótido similar al receptor de la lipoxina A_{4} que expresan un polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} mediante una variedad de procedimientos conocidos por aquellas personas expertas en la técnica. Entre estos procedimientos se incluyen, pero no se limitan a, hibridaciones ADN-ADN o ADN-ARN y bioensayo de proteínas o técnicas de inmunoensayo que incluyen tecnologías de membrana, solución o basadas en chip para la detección y/o cuantificación del ácido nucleico o la proteína. Por ejemplo, se puede detectar la presencia de una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} mediante hibridación o amplificación ADN-ADN o ADN-ARN usando sondas o fragmentos o fragmentos de polinucleótidos que codifican un polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4}. Los ensayos basados en la amplificación del ácido nucleico implican el uso de oligonucleótidos seleccionados a partir de secuencias que codifican un polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} para detectar los transformantes que contienen un polinucleótido similar al receptor de la lipoxina A_{4}.

Se conocen en la técnica una variedad de protocolos para detectar y medir la expresión de un polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4}, usando anticuerpos tanto policlonales como monoclonales específicos del polipéptido, tal como se conoce en la técnica. Los ejemplos incluyen el ensayo inmunosorbente enlazado al enzima (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), y clasificación de células activada mediante fluorescencia (FACS). Se puede usar un inmunoensayo monoclonal de dos emplazamientos usando anticuerpos monoclonales reactivos a dos epitopos no interferentes sobre un polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4}, o se puede emplear un ensayo de enlace competitivo. Se describen estos y otros ensayos en Hampton y col., SEROLOGICAL METHODS: A LABORATORY MANUAL, APS Press, San Pablo, Minn., (1990) y Maddox y col., J. Exp. Med. 158, 1211-1216, (1983).

Se conocen una amplia variedad de técnicas de marcado y de conjugación por aquellas personas expertas en la técnica y se pueden usar en diversos ensayos de ácidos nucleicos y aminoácidos. Los medios para producir la hibridación marcada o las sondas PCR para detectar las secuencias relacionadas con los polinucleótidos que codifican los polipéptidos similares al receptor de la lipoxina A_{4} incluyen oligomarcado, traducción por cortes, marcado final, o amplificación mediante PCR usando un nucleótido marcado. De manera alternativa, se pueden clonar las secuencias que codifican un polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} en un vector para la producción de una sonda de ARNm. Se conocen dichos vectores en la técnica, están comercialmente disponibles, y se pueden usar para sintetizar sondas de ARN in vitro mediante la adición de nucleótidos marcados y una ARN polimerasa apropiada tal como T7, T3, o SP6. Se pueden llevar a cabo estos procedimientos usando una variedad de kits comercialmente disponibles (Amersham pharmacia Biotec, Promega y US Biochemical). Las moléculas o marcas indicadoras adecuadas que se pueden usar para la facilidad de la detección incluyen radionucleidos, enzimas, y agentes fluorescentes, quimioluminiscentes, o cromogénicos, así como sustratos, cofactores, inhibidores, partículas magnéticas, y similares.

Expresión y purificación de los polipéptidos similares al receptor de la lipoxina A_{4}

Se pueden cultivar células huésped transformadas con secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} bajo condiciones adecuadas para la expresión y recuperación de la proteína a partir del cultivo celular. El polipéptido producido mediante una célula transformada se puede segregar o contener intracelularmente dependiendo de la secuencia y/o el vector usado. Como aquellas personas expertas en la técnica comprenderán, se pueden diseñar vectores de expresión que contengan polinucleótidos que codifiquen los polipéptidos similares al receptor de la lipoxina A_{4} para contener secuencias señal con secreción directa de polipéptidos solubles similares al receptor de la lipoxina A_{4} a través de la membrana celular procariota o eucariota, o que dirijan la inserción de la membrana del polipéptido en el receptor de la lipoxina A_{4} enlazado con la membrana.

Tal como se ha descrito anteriormente, se pueden usar otras construcciones para unir una secuencia que codifica un polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} con una secuencia de nucleótido que codifica una región de polipéptido que facilitará la purificación de las proteínas solubles. Dichas regiones que facilitan las purificación incluyen, pero no se limita a, péptidos quelantes metálicos tales como los módulos de histidina-triptófano que permiten la purificación sobre metales inmovilizados, regiones de proteína A que permiten la purificación sobre inmunoglobulina inmovilizada, y la región utilizada en el sistema de purificación mediante extensión / afinidad FLAGS (Inmunex Corp., Seattle, Wash.). Se puede usar también la inclusión de secuencias ligantes rompibles tales como las específicas para el Factor Xa o la enteroquinasa (Invitrogen, San Diego, CA) entre la región de purificación y el polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} para facilitar la purificación. Uno de dichos vectores de expresión proporciona la expresión de una proteína de fusión que contiene un polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} y 6 residuos de histidina que preceden una tioredoxina o un emplazamiento de rotura de la enteroquinasa. Los residuos de histidina facilitan la purificación por IMAC (cromatografía de afinidad iónica mediante metal inmovilizado, tal como se describe en Porath y col., Prot. Exp. Purif. 3, 263-281, 1992), mientras que el emplazamiento de rotura de la enteroquinasa proporciona un medio para purificar el polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} de la proteína de fusión. Se describen los vectores que contienen proteínas de fusión en Kroll y col., DNA Cell. Biol. 12, 441-453,
1993.

Síntesis química

Se pueden sintetizar las secuencias que codifican un polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} usando procedimientos químicos bien conocidos en la técnica (véase Caruthers y col., Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 215-223, 1980; Horn y col. Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 225-232, 1980). De manera alternativa, el propio polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} se puede producir usando procedimientos químicos para sintetizar su secuencia de aminoácidos, tales como mediante la síntesis directa del péptido usando técnicas en fase sólida (Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154, 1963; Roberge y col., Science 269, 202-204, 1995). Se puede llevar a cabo la síntesis de proteínas usando técnicas manuales o mediante automatización. Se puede conseguir la síntesis automatizada, por ejemplo, usando el Applied Biosystems 431A Peptide Synthesizer (Perkin Elmer). De manera opcional, se pueden sintetizar de manera separada fragmentos de los polipéptidos similares al receptor de la lipoxina A_{4} y combinarse usando procedimientos químicos para producir una molécula de longitud completa.

Se puede purificar de manera sustancial el péptido sintetizado de nuevo mediante cromatografía líquida de alta resolución preparativa (por ejemplo, Creighton, PROTEINS: STRUCTURES AND MOLECULAR PRINCIPLES, WH Freeman y Co., Nueva York, N. Y., 1983). Se puede confirmar la composición de un polipéptido sintético similar al receptor de la lipoxina A_{4} mediante análisis o secuenciamiento de aminoácidos (por ejemplo, el procedimiento de degradación de Edman; véase Creighton, más arriba). De manera adicional, se puede alterar cualquier porción de la secuencia de aminoácidos del polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} durante la síntesis directa y/o combinarse usando procedimientos químicos con secuencias de otras proteínas para producir una variante de polipéptido o una proteína de fusión.

Producción de polipéptidos alterados similares al receptor de la lipoxina A_{4}

Como aquellas personas expertas en la técnica comprenderán, puede ser ventajoso producir secuencias de nucleótido que codifiquen el polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} que posean codones que no se produzcan naturalmente. Se pueden seleccionar por ejemplo, los codones preferidos por un huésped procariota o eucariota concreto para aumentar el índice de expresión de la proteína o para producir un transcripto de ARN que tenga las propiedades deseadas, tales como una vida media que sea más larga que la del transcripto generado a partir de la secuencia que se produce de manera natural.

Se pueden construir mediante ingeniería genética las secuencias de nucleótidos descritas en el presente documento usando los procedimientos generalmente conocidos en la técnica para alterar las secuencias que codifican el polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} por una variedad de razones, que incluyen pero no se limitan a, las alteraciones que modifican la clonación, procesamiento, y/o expresión del polipéptido o producto de ARNm. Se puede usar la mezcla de ADN mediante fragmentación aleatoria y reensamblado mediante PCR de los fragmentos del gen y los oligonucleótidos sintéticos para construir mediante ingeniería genética las secuencias de nucleótidos. Se puede usar, por ejemplo, la mutagénesis dirigida al emplazamiento para insertar nuevos emplazamientos de restricción, alterar los modelos de glicosilación, cambiar la preferencia del codón, producir variantes ayustadas, introducir mutaciones, y así sucesivamente.

Anticuerpos

Se puede generar cualquier tipo de anticuerpo conocido en la técnica para enlazar de manera específica con un epitopo de un polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4}. Tal como se usa en el presente documento "anticuerpo" incluye las moléculas intactas de inmunoglobulina, así como los fragmentos de las mismas, tales como Fab, F(ab’)_{2}, y Fv, que son capaces de enlazar un epitopo de un polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4}, Normalmente se requieren 6, 8, 10, o 12 aminoácidos contiguos para formar un epitopo. Sin embargo, los epitopos que impliquen aminoácidos no contiguos pueden necesitar más aminoácidos, al menos 15, 25, o 50.

Se puede usar terapéuticamente un anticuerpo que enlace de manera específica con un epitopo de un polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4}, así como en ensayos inmunoquímicos, tales como Western blots, ELISA, radioinmunoensayos, ensayos inmunohistoquímicos, inmunoprecipitaciones, u otros ensayos inmunoquímicos conocidos en la técnica. Se pueden usar diversos inmunoensayos para identificar los anticuerpos que tienen la especificidad deseada. Son bien conocidos en la técnica numerosos protocolos para los ensayos de enlace competitivo o inmunoradiométricos. Dichos inmunoensayos implican normalmente la medida de la formación del complejo entre un inmunógeno y un anticuerpo que enlaza de manera específica con el inmunógeno.

Normalmente, un anticuerpo que enlaza de manera específica con un polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} proporciona una señal de detección al menos 5-, 10-, o 20 veces mayor que una señal de detección proporcionada con otras proteínas cuando se usan en un ensayo inmunoquímico. De manera preferible, los anticuerpos que enlazan de manera específica con los polipéptidos similares al receptor de la lipoxina A_{4} no detectan otras proteínas en los ensayos inmunoquímicos y pueden inmunoprecipitar un polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} a partir de la solución.

Se pueden usar polipéptidos similares al receptor de la lipoxina A_{4} para inmunizar un mamífero, tal como un ratón, rata, conejo, cobaya, mono, o ser humano, para producir anticuerpos policlonales. Si se desea, se puede conjugar un polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} con una proteína vehículo, tal como albúmina de suero bovino, tiroglobulina, y hemocianina de lapa americana. Dependiendo de las especies huésped, se pueden usar diversos adyuvantes para aumentar la respuesta inmunológica. Dichos adyuvantes incluyen, pero no se limitan a, adyuvante de Freund, geles minerales (por ejemplo, hidróxido de aluminio), y sustancias tensioactivas (por ejemplo, lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones en aceite, hemocianina de lapa americana, y dinitrofenol). Entre los adyu-
vantes usados en seres humanos, son especialmente útiles BCG (bacilli Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum.

Se pueden preparar anticuerpos monoclonales que enlacen de manera específica con un polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} usando cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpo mediante líneas celulares continuas en el cultivo. Estas técnicas incluyen, pero no se limitan a, la técnica del hibridoma, la técnica del hibridoma de células B humanas, y la técnica del hibridoma de EBV (Kohler y col., Nature 256, 495-497, 1985; Kozbor y col., J. Immunol. Methods 81, 31-42, 1985; Cote y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 80, 2026-2030, 1983; Cole y col., Mol. Cell Biol. 62, 109-120, 1984).

De manera adicional, se pueden usar las técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos", el ayustamiento de los genes de anticuerpo de ratón con los genes de anticuerpo humano para obtener una molécula con especificidad y actividad biológica apropiada al antígeno (Morrison y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 6851-6855, 1984; Neuberger y col., Nature 312, 604-608, 1984; Takeda y col., Nature 314, 452-454, 1985). Se pueden también "humanizar" los anticuerpos monoclonales y otros anticuerpos para evitar que un paciente desencadene una respuesta inmune contra el anticuerpo cuando este se usa terapéuticamente. Dichos anticuerpos pueden ser suficientemente similares en la secuencia a los anticuerpos humanos que se van a usar directamente en la terapia o pueden requerir la alteración de unos pocos residuos clave. Se pueden minimizar las diferencias de secuencias entre los anticuerpos de roedores y las secuencias humanas mediante mutagénesis dirigida al emplazamiento de los residuos individuales o mediante injerto de las regiones que determinan la complementariedad completa. De manera alternativa, se pueden producir anticuerpos humanizados usando procedimientos recombinantes, tal como se describe en el Documento GB2188638B. Los anticuerpos que enlazan de manera específica con un polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} pueden contener emplazamientos de enlace con el antígeno que se humanizan parcial o completamente, tal como se describe en el Documento U. S. 5.565.332.

De manera alternativa, se pueden adaptar las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena única usando los procedimientos conocidos en la técnica para producir anticuerpos de cadena única que enlacen de manera específica con los polipéptidos similares al receptor de la lipoxina A_{4}. Se pueden generar anticuerpos con especificidad relacionada, pero de distinta composición idiotípica, mediante mezcla de cadenas procedentes de bibliotecas combinatorias aleatorias de inmunoglobina (Burton, Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 11120-23, 1991).

Se pueden construir anticuerpos de cadena única usando un procedimiento de amplificación del ADN, tal como la PCR, usando un ADNc de hibridoma como plantilla (Thirion y col., 1996. Eur. J. Cancer Prev. 5, 507-11). Los anticuerpos de cadena única pueden ser mono- o biespecíficos, y pueden ser bivalentes o tetravalentes. Se muestra la construcción de anticuerpos de cadena única biespecífica, tetravalente, por ejemplo, en Coloma y Morrison, 1997, Nat. Biotechnol. 15, 159-63. Se muestra la construcción de anticuerpos de cadena única biespecífica, bivalente en Mallender y Voss, 1994, J. Biol. Chem. 269, 199-206.

Se puede construir una secuencia de nucleótidos que codifique un anticuerpo de cadena única usando la síntesis de nucleótidos manual o automatizada, clonarse en un constructo de expresión usando los procedimientos estándar de ADN recombinante, e introducirse en una célula para expresar la secuencia de codificación, tal como se describe a continuación. De manera alternativa, se pueden producir anticuerpos de cadena única directamente usando, por ejemplo, la tecnología de fagos filamentosos (Verhaar y col., 1995, Int. J. Cancer 61, 497-501; Nicholls y col., 1993, J. Immunol. Meth. 165, 81-91).

Se pueden producir también anticuerpos que enlacen de manera específica con los polipéptidos similares al receptor de la lipoxina A_{4} induciendo la producción in vivo en la población de linfocitos o seleccionando bibliotecas de inmunoglobulina o paneles de reactivos de enlace altamente específicos tal como se describe en la bibliografía (Orlandi y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 86, 3833-3837, 1989; Winter y col., Nature 349, 293-299, 1991).

Se pueden construir otros tipos de anticuerpos y usarse terapéuticamente en los procedimientos de la invención. Por ejemplo, se pueden construir anticuerpos quiméricos tal como se describe en el Documento WO 93/03151. También se pueden preparar proteínas de enlace, que se deriven de las inmunoglobulinas y que sean multivalentes y multiespecíficas, tales como los "diacuerpos" descritos en el Documento WO 94/13804.

Se pueden purificar los anticuerpos de acuerdo con la invención mediante procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, pueden purificarse los anticuerpos por afinidad mediante el paso sobre una columna a la que se enlaza el polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4}. A continuación se pueden eluir los anticuerpos enlazados a partir de la columna usando un tampón con una elevada concentración de sal.

Oligonucleótidos de sentido contrario

Los oligonucleótidos de sentido contrario son secuencias de nucleótidos que son complementarias con una secuencia específica de ADN o ARN. Una vez introducidos en una célula, los nucleótidos complementarios se combinan con las secuencias naturales producidas por la célula para formar complejos y bloquear la transcripción o la traducción. De manera preferible, un oligonucleótido de sentido contrario tiene al menos 11 nucleótidos de longitud, pero pueden ser al menos 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, o 50 o más nucleótidos de longitud. Se pueden usar también secuencias más largas. Se pueden proveer moléculas de oligonucleótidos de sentido contrario en un constructo de ADN e introducirse en una célula para disminuir el nivel de los productos génicos de la proteína similares al receptor de la lipoxina A_{4} en la célula.

Los oligonucleótidos de sentido contrario pueden ser desoxiribonucleótidos, ribonucleótidos, o una combinación de ambos. Se pueden sintetizar los oligonucleótidos manualmente o mediante un sintetizador automatizado, mediante enlace covalente del extremo 5’ de un nucleótido con el extremo 3’ de otro nucleótido con enlaces internucleótidos no fosfodiéster tales como alquilfosfonatos, fosforotioatos, fosforoditioatos, alquilfosfonotioatos, alquilfosfonatos, fosforamidatos, ésteres fosfato, carbamatos, acetamidato, ésteres de carboximetilo, carbonatos, y triésteres de fosfato. Véase Brown, Meth. Mol. Biol 20, 1-8, 1994; Sonveaux, Meth. Mol. Biol. 26, 1-72, 1994; Uhlmann y col., Chem. Rev. 90, 543-583, 1990.

Se pueden obtener modificaciones de la expresión del gen de la proteína similar al receptor de la lipoxina A_{4} diseñando oligonucleótidos de sentido contrario que formarán dúplex en el control, 5’, o las regiones reguladoras del gen de la proteína similar al receptor de la lipoxina A_{4}. Se prefieren los oligonucleótidos derivados del emplazamiento de inicio de la transcripción, por ejemplo, entre las posiciones -10 y +10 a partir del emplazamiento de partida. De manera similar, se puede conseguir la inhibición usando la metodología de emparejamiento de bases de la "triple hélice". El emparejamiento de la triple hélice es útil debido a que produce la inhibición de la capacidad de la doble hélice de abrirse lo suficiente para el enlace con las polimerasas, los factores de transcripción, o los chaperones. Se han descrito en la bibliografía los avances terapéuticos usando ADN triplex (por ejemplo, Gee y col., en Huber y Carr, MOLECULAR ADN IMMUNOLOGIC APPROACHES, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, N. Y., 1994). Se puede diseñar también un oligonucleótido de sentido contrario para bloquear la traducción del ARNm para evitar que el transcripto se enlace con los ribosomas.

No se requiere complementariedad precisa para la formación satisfactoria del complejo entre un oligonucleótido de sentido contrario y la secuencia complementaria de un polinucleótido similar al receptor de la lipoxina A_{4}. Los oligonucleótidos de sentido contrario que comprenden, por ejemplo, 2, 3, 4, o 5 o más extensiones de nucleótidos contiguos que son precisamente complementarias con un polinucleótido similar al receptor de la lipoxina A_{4}, separadas cada una mediante una extensión de nucleótidos contiguos que no son complementarios con los nucleótidos adyacentes similares al receptor de la lipoxina A_{4}, pueden proporcionar suficiente especificidad para hacer diana al ARNm de la proteína similar al receptor de la lipoxina A_{4}. De manera preferible, cada extensión de nucleótidos contiguos complementarios tiene al menos 4, 5, 6, 7, u 8 o más nucleótidos de longitud. Las secuencias intervinientes no complementarias tienen de manera preferible 1, 2, 3, o 4 nucleótidos de longitud. Una persona experta en la técnica puede usar fácilmente el punto de fusión calculado de una pareja de sentido contrario-sentido directo para determinar el grado de desemparejamiento que se tolerará entre un oligonucleótido de sentido contrario concreto y una secuencia concreta de polinucleótido similar al receptor de la lipoxina A_{4}.

Se pueden modificar los oligonucleótidos de sentido contrario sin afectar a su capacidad para hibridarse con un polinucleótido similar al receptor de la lipoxina A_{4}. Estas modificaciones pueden ser internas o en uno o en ambos extremos de la molécula de sentido contrario. Por ejemplo, se pueden modificar los enlaces fosfato internucleósidos añadiendo restos de colesterol o diamina con números variables de residuos de carbono entre los grupos amino y la ribosa terminal. Se pueden emplear también bases modificadas y/o azúcares, tales como la arabinosa en vez de la ribosa, o un oligonucleótido 3’,5’ sustituido en el que se sustituyen el grupo 3’ hidroxilo o el grupo 5’ fosfato, en un oligonucleótido de sentido contrario modificado. Se pueden preparar estos oligonucleótidos modificados mediante los procedimientos bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Agrawal y col., Trends Biotechnol. 10, 152-158, 1992; Uhlmann y col., Chem. Rev. 90, 543-584, 1990; Uhlmann y col., Tetrahedron. Lett. 215, 3539-3542, 1987.

Ribozimas

Las ribozimas son moléculas de ARN con actividad catalítica. Véase, por ejemplo, Cech, Science 236, 1532-1539; 1987; Cech, Ann. Rev. Biochem. 59, 543-568; 1990, Cech, Curr. Opin. Struct. Biol. 2, 605-609; 1992, Couture y Stinchcomb, Trends Genet. 12, 510-515, 1996. Se pueden usar las ribozimas para inhibir la función del gen rompiendo una secuencia de ARN, tal como se conoce en la técnica (por ejemplo, Haseloff y col., Patente de los Estados Unidos 5.641.673). El mecanismo de acción de la ribozima implica la hibridación específica de la secuencia de la molécula de ribozima con el ARN diana complementario, seguida por la rotura endonucleolítica. Los ejemplos incluyen las moléculas de ribozima de cabeza de martillo construidas mediante ingeniería genética que pueden catalizar de manera específica y eficiente la rotura endonucleolítica de las secuencias específicas de nucleótidos.

Se puede usar la secuencia de codificación de un polinucleótido similar al receptor de la lipoxina A_{4} para generar ribozimas que enlazarán de manera específica con el ARNm transcrito a partir del polinucleótido similar al receptor de la lipoxina A_{4}. Se han desarrollado procedimientos de diseño y construcción de ribozimas que pueden romper otras moléculas de ARN en trans en una secuencia elevada de manera específica y se describen en la técnica (véase Haseloff y col., Nature 334, 585-591, 1988). Se puede dirigir, por ejemplo, la actividad de rotura de las ribozimas en ARN específicos construyendo mediante ingeniería genética una región de "hibridación" discreta en la ribozima. La región de hibridación contiene una secuencia complementaria con el ARN diana y de esta manera hibrida de manera específica con la diana (véase, por ejemplo, Gerlach y col., Documento EP 321.201).

Se pueden identificar los emplazamientos específicos de rotura de ribozimas dentro del ARN diana de la proteína similar al receptor de la lipoxina A_{4} escaneando la molécula diana buscando los emplazamientos de rotura de la ribozima que incluyen las siguientes secuencias: GUA, GUU, y GUC. Una vez identificadas, se pueden evaluar las secuencias cortas de ARN de entre 15 y 20 ribonucleótidos que corresponden a la región del ARN diana que contiene el emplazamiento de rotura para las características estructurales secundarias que pueden volver la diana inoperable. Se puede evaluar también la adecuabilidad de las dianas de ARN de la proteína candidata similar al receptor de la lipoxina A_{4} ensayando la accesibilidad a la hibridación con oligonucleótidos complementarios, usando ensayos de protección de la ribonucleasa. Se muestran en la SEC DE ID Nº 1 las secuencias del nucleótido y sus complementos proporcionan las fuentes de las secuencias adecuadas de la región de hibridación. Se pueden usar secuencias complementarias más largas para aumentar la afinidad de la secuencia de hibridación para la diana. Se pueden relacionar integralmente las regiones de hibridación y rotura de la ribozima de tal manera que tras la hibridación con el ARN diana a través de las regiones complementarias, la región catalítica de la ribozima puede romper la diana.

Se pueden introducir ribozimas en las células como parte de un constructo de ADN. Se pueden usar procedimientos mecánicos, tales como la microinyección, la transfección mediada por liposomas, la electroporación, o la precipitación con fosfato de calcio, para introducir en las células un constructo de ADN que contenga la ribozima en las que se desea disminuir la expresión de la proteína similar al receptor de la lipoxina A_{4}. De manera alternativa, si se desea que las células retengan de manera estable el constructo de ADN, se puede suministrar el constructo en un plásmido y mantenerse como un elemento separado o integrado en el genoma de las células, tal como se conoce en la técnica. Un constructo de ADN que codifique la ribozima puede incluir elementos reguladores transcripcionales, tales como un elemento promotor, un mejorador o un elemento UAS, y una señal terminadora transcripcional, para controlar la transcripción de las ribozimas en las células.

Como se muestra en Haseloff y col., Patente de los Estados Unidos 5.641.673, se pueden construir mediante ingeniería genética las ribozimas de tal manera que la expresión de la ribozima se producirá en respuesta a los factores que inducen la expresión de un gen diana. Se pueden construir también mediante ingeniería genética las ribozimas para proporcionar un nivel adicional de regulación, de tal manera que sólo se produce la destrucción del ARNm cuando se inducen en las células una ribozima y un gen diana.

Procedimientos de selección

Los ensayos descritos son para seleccionar los compuestos de ensayo que enlazan a o modulan la actividad de un polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} o a un polinucleótido similar al receptor de la lipoxina A_{4}. Un compuesto de ensayo enlaza de manera preferible con un polipéptido o polinucleótido similar al receptor de la lipoxina A_{4}. De manera más preferible, un compuesto de ensayo disminuye o aumenta la actividad de la proteína similar al receptor de la lipoxina A_{4} de un polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} o la expresión de un polinucleótido similar al receptor de la lipoxina A_{4} en al menos aproximadamente 10, de manera preferible aproximadamente 50, de manera más preferible aproximadamente 75, 90, o 100% en relación con la ausencia del compuesto de ensayo.

Compuestos de ensayo

Los compuestos de ensayo pueden ser agentes farmacológicos ya conocidos en la técnica o pueden ser compuestos anteriormente desconocidos por tener alguna actividad farmacológica. Se pueden producir de manera natural los compuestos o diseñarse en el laboratorio. Se pueden aislar a partir de microorganismos, animales, o plantas y se pueden producir de manera recombinante, o sintetizarse mediante procedimientos químicos conocidos en la técnica. Si se desea, se pueden obtener los compuestos de ensayo usando cualquiera de los numerosos procedimientos de bibliotecas combinatorias conocidos en la técnica, que incluyen pero no se limitan a, bibliotecas biológicas, bibliotecas direccionables espacialmente en paralelo en fase sólida o en fase solución, procedimientos de bibliotecas sintéticas, que requieren desconvolución, el procedimiento de biblioteca "una perla un compuesto" y los procedimientos de bibliotecas sintéticas que usan la selección mediante cromatografía de afinidad. La hipótesis de la biblioteca biológica se limita a las bibliotecas de polipéptidos, mientras que las otras cuatro soluciones son aplicables a las bibliotecas de polipéptidos, oligómeros no péptidos, o bibliotecas de compuestos de moléculas pequeñas. Véase Lam, Anticancer Drugs Des. 12, 145, 1997.

Se conocen bien en la técnica los procedimientos para la síntesis de bibliotecas moleculares (véase, por ejemplo, DeWitt y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90, 6909, 1993; Erb y col. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91, 1994; Zuckermann y col., J. Med. Chem. 37, 2678, 1994; Cho y col., Science 261, 1303, 1993; Carell y col., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2059, 1994; Carell y col., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2061; Gallop y col., J. Med. Chem. 37, 1233, 1994). Se pueden presentar las bibliotecas de compuestos en solución (véase, por ejemplo, Hougten, Biotechniques 13, 412-421, 1992), o en perlas (Lam, Nature 354, 82-84, 1991), chips (Fodor, Nature 364, 555-556, 1993), bacterias o esporas (Ladner, Patente de los Estados Unidos 5.223.409), plásmidos (Cull y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 1865-1869, 1992), o fagos (Scout y Smith, Science 249, 386-390, 1990; Devlin, Science 249, 404-406, 1990); Cwirla y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 97, 6378-6382, 1990; Felici, J. Mol. Biol. 222, 301-310, 1991; y Ladner, Patente de los Estados Unidos 5.223.409).

Selección de alto rendimiento

Se pueden seleccionar los compuestos de ensayo por la capacidad de enlazar con los polipéptidos o polinucleótidos similares al receptor de la lipoxina A_{4} o por afectar la actividad de la proteína similar al receptor de la lipoxina A_{4} o la expresión del gen de la proteína similar al receptor de la lipoxina A_{4} que usa la selección de alto rendimiento. Se pueden ensayar en paralelo muchos compuestos discretos, usando la selección de alto rendimiento, de tal manera que se pueden seleccionar rápidamente grandes números de compuestos de ensayo. Las técnicas más ampliamente establecidas utilizan placas de microvaloración de 96 pocillos. Los pocillos de las placas de microvaloración requieren normalmente volúmenes de ensayo que oscilan entre 50 y 500 \mul. De manera adicional a las placas, están comercialmente disponibles muchos instrumentos, materiales, pipeteadores, robots, lavadores de placas, y lectores de placas para ajustar el formato de 96 pocillos.

De manera alternativa, se pueden usar los "ensayos libres de formato" o ensayos que no tienen barreras físicas entre las muestras. Por ejemplo, se describe por Jayawickreme y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 19, 1614-18 (1994) un ensayo que usa células con pigmento (melanocitos) en un ensayo homogéneo simple para las bibliotecas de péptidos combinatorios. Se colocan las células bajo agarosa en placas petri, a continuación se colocan las perlas que transportan los compuestos combinatorios sobre la superficie de la agarosa. Se liberan parcialmente los compuestos combinatorios a partir de los compuestos de las perlas. Se pueden visualizar los compuestos activos como zonas de pigmentos oscuros debido a que los compuestos se difunden localmente en la matriz de gel, los compuestos activos producen en las células cambios de colores.

Se describe por Chelsky otro ensayo libre de formato, "Strategies for Screening Combinatorial Libraires: Novel and Tradicional Approaches", informado en la First Annual Conference de la Society for Biomolecular Screening en Filadelfia, PA. (Nov. 7-10, 1995). Chelsky colocó un enzima de ensayo homogéneo simple para la anhidrasa carbónica en el interior de un gel de agarosa de tal manera que el enzima en el gel podría producir un cambio de color a lo largo del gel. A partir de ahí, se colocaron las perlas que transportaban los compuestos combinatorios mediante un fotoligante en el interior del gel y se liberaron los compuestos parcialmente mediante luz UV. Se observaron los compuestos que inhibieron el enzima como zonas locales de inhibición que tenían un cambio de color inferior.

Se describe otro ejemplo aún por Salmon y col., Molecular Diversity 2, 57-63 (1996). En este ejemplo, se seleccionaron bibliotecas combinatorias para los compuestos que tenían efectos citotóxicos sobre las células cancerosas que crecían en agar.

Se describe en Beutel y col., Patente de los Estados Unidos 5.976.813, otro procedimiento de selección de alto rendimiento. En este procedimiento, se colocaron las muestras de ensayo en una matriz porosa. A continuación se colocaron uno o más componentes de ensayo en el interior, sobre la parte superior o en la parte inferior de una matriz tal como un gel, una lámina plástica, u otra forma de soporte sólido fácilmente manipulado. Cuando se introdujeron las muestras en la matriz porosa, se difundieron de manera suficientemente lenta, de tal manera que se llevaron a cabo los ensayos sin que las muestras se mezclaran entre sí.

Ensayos de enlace

Para los ensayos de enlace, el compuesto de ensayo es de manera preferible una molécula pequeña que enlaza con y ocupa el emplazamiento activo del polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4}, haciendo por tanto inaccesible al sustrato el emplazamiento de enlace del ligando, de tal manera que se evita la actividad biológica normal. Los ejemplos de dichas moléculas pequeñas incluyen, pero no se limitan a, péptidos pequeños o moléculas similares a péptidos. Los ligandos potenciales que enlazan con un polipéptido de la invención incluyen, pero no se limitan a, los ligandos naturales de las proteínas conocidas similares al receptor de la lipoxina A_{4}y los análogos o derivados de los mismos.

En los ensayos de enlace, el compuesto de ensayo o el polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} puede comprender una marca detectable, tal como una marca fluorescente, radioisotópica, quimioluminiscente, o enzimática, tal como peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, o luciferasa. A continuación se puede llevar a cabo la detección de un compuesto de ensayo que se enlaza con el polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4}, por ejemplo, mediante conteo directo de la emisión, mediante conteo por centelleo, o determinando la conversión de un sustrato apropiado en un producto detectable.

De manera alternativa, se puede determinar el enlace de un compuesto de ensayo con un polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} sin marcar ninguno de los interactuantes. Por ejemplo, se puede usar un microfisiómetro para detectar el enlace de un compuesto de ensayo con un polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4}. Un microfisiómetro (por ejemplo, Cytosensor^{TM}) es un instrumento analítico que mide la velocidad a la cual una célula acidifica su entorno usando un sensor potenciométrico dirigible por la luz (LAPS). Se pueden usar los cambios en esta velocidad de acidificación como un indicador de la interacción entre un compuesto de ensayo y un polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} (McConnell y col., Science 257, 1906-1912, 1992).

Se puede llevar también a cabo la determinación de la capacidad de un compuesto de ensayo para enlazar con un polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} usando una tecnología tal como el Análisis de Interacción Bimolecular en tiempo real (BIA) (Sjolander y Urbaniczky, Anal. Chem. 63, 2338-2345, 1991, y Szabo y col., Curr. Opin. Struct. Biol. 5, 699-705, 1995). BIA es una tecnología para estudiar las interacciones bioespecíficas en tiempo real, sin marcar ninguno de los interactuantes (por ejemplo, BIAcore^{TM}). Se pueden usar los cambios de resonancia en el plasmón superficial del fenómeno óptico (SPR) como una indicación de las reacciones en tiempo real entre las moléculas biológicas.

En otro aspecto más de la invención, se puede usar un polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} como una "proteína cebo" en un ensayo doble híbrido o ensayo triple híbrido (véase, por ejemplo Patente de los Estados Unidos 5.283.317; Zervos y col., Cell 72, 223-232, 1993; Madura y col., J. Biol. Chem. 268, 12046-12054, 1993; Bartel y col., Biotechniques 14, 920-924, 1993; Iwabuchi y col., Oncogene 8, 1693-1696, 1993; y Brent, Documento WO 94/10300), para identificar otras proteínas que enlazan a o interactúan con el polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} y modular su actividad.

El sistema doble híbrido se basa en la naturaleza modular de la mayor parte de los factores de transcripción que consiste en el enlace separable del ADN y las regiones de activación. De manera breve, el ensayo utiliza dos constructos de ADN diferentes. Por ejemplo, en un constructo, se puede fusionar el polinucleótido que codifica un polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} con un polinucleótido que codifica la región de enlace del ADN de un factor de transcripción conocido (por ejemplo, GAL-4). En el otro constructo, se puede fusionar una secuencia de ADN que codifica una proteína sin identificar ("presa" o "muestra") con un polinucleótido que codifica la región de activación del factor de transcripción conocido. Si las proteínas "cebo" y "presa" son capaces de interactuar in vivo para formar un complejo dependiente de la proteína, el enlace de ADN y las regiones de activación del factor de transcripción se presentan en proximidad cerrada. Esta proximidad permite la transcripción de un gen indicador (por ejemplo, LacZ) que está enlazado de manera operable a un emplazamiento regulador transcripcional sensible al factor de transcripción. Se puede detectar la expresión del gen indicador, y se pueden aislar las colonias de células que contienen el factor de transcripción funcional y usarse para obtener la secuencia de ADN que codifica la proteína que interactúa con el polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4}.

Puede ser deseable inmovilizar el polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} (o el polinucleótido) o el compuesto de ensayo para facilitar la separación del enlace de las formas no enlazadas de uno o ambos de los interactuantes, así como acomodar la automatización del ensayo. De esta manera, se pueden enlazar a un soporte sólido el polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} (o el polinucleótido) o el compuesto de ensayo. Los soportes sólidos adecuados incluyen, pero no se limitan a, portas de vidrio o plástico, placas de cultivo de tejido, pocillos de microvaloración, tubos, chips de silicio, o partículas tales como perlas (que incluyen, pero no se limitan a, látex, poliestireno, o perlas de vidrio). Se puede usar cualquier procedimiento conocido en la técnica para ligar el polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} (o el polinucleótido) o el compuesto de ensayo a un soporte sólido, que incluye el uso de enlaces covalentes y no covalentes, absorción pasiva, o parejas de restos de enlace ligadas de manera respectiva al polipéptido (o el polinucleótido) o al compuesto de ensayo y al soporte sólido. Los compuestos de ensayo se enlazan de manera preferible al soporte sólido en un orden, de tal manera que se puede rastrear la localización de los compuestos de ensayo individuales. Se puede llevar a cabo el enlace de un compuesto de ensayo a un polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} (o el polipéptido) en cualquier recipiente adecuado para contener los reactivos. Los ejemplos de dichos recipientes incluyen placas de microvaloración, tubos de ensayo, y tubos de microcentrífuga.

En una forma de realización, el polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} es una proteína de fusión que comprende una región que permite enlazarse el polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} a un soporte sólido. Pueden absorberse las proteínas de fusión de la glutatión-S-transferasa sobre perlas de glutatión sefarosa (Sigma Chemical, San Luis, Mo) o placas de microvaloración derivatizadas con glutatión, que se combinan a continuación con el compuesto de ensayo o el compuesto de ensayo y el polipéptido no absorbido similar al receptor de la lipoxina A_{4}; a continuación se incuba la mezcla bajo condiciones conductoras para la formación del complejo (por ejemplo, en condiciones fisiológicas para la sal y el pH). Tras la incubación, se lavan las perlas o los pocillos de las placas de microvaloración para eliminar cualquier componente no enlazado. Se puede determinar el enlace de los interactuantes directa o indirectamente, tal como se ha descrito anteriormente. De manera alternativa, se pueden disociar los complejos a partir del soporte sólido antes que se determine el enlace.

También se pueden usar otras técnicas para inmovilizar las proteínas o los polinucleótidos sobre un soporte sólido en el ensayo de selección de la invención. Por ejemplo, se pueden inmovilizar un polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} (o el polinucleótido) o un compuesto de ensayo utilizando la conjugación de la biotina y la estreptavidina. Se pueden preparar los polipéptidos biotinilados similares al receptor de la lipoxina A_{4} (o los polinucleótidos) o los compuestos de ensayo a partir de biotina-NSH (N-hidrosuccinimida) usando las técnicas bien conocidas en la técnica (por ejemplo, el kit de biotinilación, Pierce Chemicals, Rockford, III) e inmovilizarse en los pocillos de las placas de 96 pocillos recubiertos con estreptavidina (Pierce Chemical). De manera alternativa, se pueden derivatizar en los pocillos de la placa los anticuerpos que enlazan de manera específica con un polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4}, el polinucleótido, o un compuesto de ensayo, pero que no interfieren con un emplazamiento de enlace deseado, tal como el emplazamiento activo del polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4}. Se puede atrapar la diana no enlazada o la proteína en los pocillos mediante conjugación de los anticuerpos.

Los procedimientos para detectar dichos complejos, de manera adicional a aquellos descritos anteriormente para los complejos inmovilizados mediante GST, incluyen la inmunodetección de los complejos usando anticuerpos que enlazan de manera específica con el polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} o el compuesto de ensayo, los ensayos enlazados al enzima que se apoyan en detectar una actividad del polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4}, y la electroforesis en gel de SDS bajo condiciones no reductoras.

Se puede llevar también a cabo la selección de los compuestos de ensayo que enlazan con un polipéptido o polinucleótido similar al receptor de la lipoxina A_{4}, en una célula intacta. Se puede usar cualquier célula que comprenda un polipéptido o polinucleótido similar al receptor de la lipoxina A_{4} en un sistema de ensayo basado en células. Se puede producir de manera natural un polinucleótido similar al receptor de la lipoxina A_{4} en la célula o se puede introducir usando técnicas como aquellas descritas anteriormente. Se determina el enlace del compuesto de ensayo con un polipéptido o polinucleótido similar al receptor de la lipoxina A_{4} tal como se ha descrito anteriormente.

Ensayos de proteínas similares al receptor de la lipoxina A_{4}

Se pueden ensayar los compuestos de ensayo para la capacidad de aumentar o disminuir la señal de transducción mediada por un polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4}. Los ensayos funcionales incluyen el uso de células que expresan el receptor acoplado a la proteína G (por ejemplo, células CHO transfectadas) en un sistema que mide los cambios de pH extracelular producidos por la activación del receptor (véase, por ejemplo, Science 246, 181-296, 1989). Se pueden poner en contacto los compuestos, por ejemplo, con una célula que expresa el polipéptido receptor de la presente invención y una segunda respuesta del mensajero, se pueden medir, por ejemplo la señal de transducción o los cambios del pH, para determinar si el compuesto potencial activa o inhibe el receptor. Se pueden llevar a cabo ensayos funcionales tras poner en contacto un polipéptido purificado similar al receptor de la lipoxina A_{4}, una preparación de membrana celular, o una célula intacta con un compuesto de ensayo. Un compuesto de ensayo que disminuya la actividad de la proteína similar al receptor de la lipoxina A_{4} en al menos aproximadamente 10, de manera preferible aproximadamente 50, de manera más preferible aproximadamente 75, 90, o 100%, se identifica como un agente potencial para disminuir la actividad de la proteína similar al receptor de la lipoxina A_{4}. Un compuesto de ensayo que aumenta la actividad de la proteína similar al receptor de la lipoxina A_{4} en al menos aproximadamente 10, de manera preferible aproximadamente 50, de manera más preferible aproximadamente 75, 90, o 100%, se identifica como un agente potencial para aumentar la actividad de la proteína similar al receptor de la lipoxina A_{4}.

Otro procedimiento de selección implica el uso de melanóforos que se transfectan para expresar el receptor acoplado a la proteína G de la presente invención. Dicha técnica de selección se describe en el Documento WO 92/01810. De esta manera, por ejemplo, se puede emplear dicho ensayo para seleccionar un compuesto que inhiba la activación del polipéptido receptor de la presente invención poniendo en contacto las células melanóforas que codifican el receptor con el ligando receptor y un compuesto que se va a seleccionar. La inhibición de la señal generada por el ligando indica que un compuesto es un antagonista potencial para el receptor, es decir, inhibe la activación del receptor. Se puede emplear la selección para identificar un compuesto que activa el receptor poniendo en contacto dichas células con los compuestos que se van a seleccionar y determinar si cada compuesto genera una señal, es decir, activa el receptor.

Dicha otra técnica más de selección implica introducir el ARN que codifica un receptor acoplado a la proteína G en oocitos de Xenopus para expresar la transitoriedad del receptor. A continuación, se pueden poner en contacto los oocitos del receptor con el ligando del receptor y un compuesto que se va a seleccionar, seguido por la detección de la inhibición o la activación de una señal de calcio en el caso de la selección de los compuestos que se consideran para inhibir la activación del receptor.

Otra técnica de selección implica la expresión del receptor acoplado a la proteína G en las células en las que el receptor se enlaza con una fosfolipasa C o D. Dichas células incluyen las células endoteliales, las células del músculo liso, las células embriónicas de riñón, etc. Se puede llevar a cabo la selección tal como se ha descrito anteriormente cuantificando el grado de activación del receptor a partir de los cambios en la actividad de la fosfolipasa.

Se proporcionan en los ejemplos específicos a continuación ejemplos detallados de ensayos funcionales tales como aquellos descritos anteriormente.

Expresión del gen similar al receptor de la lipoxina A_{4}

En otra forma de realización, se identifican los compuestos de ensayo que aumentan o disminuyen la expresión del gen de la proteína similar al receptor de la lipoxina A_{4}. Se pone en contacto un polinucleótido similar al receptor de la lipoxina A_{4} con un compuesto de ensayo y se determina la expresión de un ARN o producto de polipéptido del polinucleótido similar al receptor de la lipoxina A_{4}. Se compara el nivel de expresión del ARNm o el polipéptido apropiado en presencia del compuesto de ensayo con el nivel de expresión del ARNm o el polipéptido en ausencia del compuesto de ensayo. A continuación se puede identificar el compuesto de ensayo como modulador de la expresión en función de esta comparación. Por ejemplo, cuando la expresión del ARNm o el polipéptido es mayor en presencia del compuesto de ensayo que en su ausencia, se identifica el compuesto de ensayo como un estimulador o mejorador de la expresión del ARNm o el polipéptido. De manera alternativa, cuando la expresión del ARNm o el polipéptido es menor en presencia del compuesto de ensayo que en su ausencia, se identifica el compuesto de ensayo como un inhibidor de la expresión del ARNm o el polipéptido.

Se puede determinar el nivel de expresión del ARNm o el polipéptido de la proteína similar al receptor de la lipoxina A_{4} mediante procedimientos bien conocidos en la técnica para detectar el ARNm o el polipéptido. Se pueden usar procedimientos cualitativos o cuantitativos. Se puede determinar, por ejemplo, la presencia de los productos del polipéptido de un polinucleótido similar al receptor de la lipoxina A_{4} usando una variedad de técnicas conocidas en la técnica, que incluyen procedimientos inmunoquímicos tales como el radioinmunoensayo, Western blotting, e inmunohistoquímicos. De manera alternativa, se puede determinar la síntesis del polipéptido in vivo, en un cultivo celular, o en un sistema de traducción in vitro, detectando la incorporación de aminoácidos marcados en un polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4}.

Se puede llevar a cabo dicha selección en un sistema de ensayo libre de células o en una célula intacta. Se puede usar cualquier célula que exprese un polinucleótido similar al receptor de la lipoxina A_{4} en un sistema de ensayo basado en células. Se puede producir el polinucleótido similar al receptor de la lipoxina A_{4} en la célula o se puede introducir usando técnicas tales como aquellas descritas anteriormente. Se puede usar un cultivo primario o una línea celular establecida, tal como CHO o las células 293 de riñón embriónico humano.

Indicaciones y procedimientos diagnósticos y terapéuticos

Los GPRC son ubicuos en mamíferos, incluyendo los seres humanos, y son responsables de muchas funciones biológicas, que incluyen muchas patologías. De acuerdo con esto, es deseable encontrar compuestos y fármacos que por una parte estimulen los GPCR y que por la otra puedan inhibir algunos GPRC. Por ejemplo, se pueden emplear compuestos que activan un GPCR con objetivos terapéuticos, tales como el tratamiento del asma, la enfermedad de Parkinson, el fracaso agudo de corazón, la retención urinaria, y la osteoporosis. De manera concreta, los compuestos que activan los receptores de la presente invención son útiles en el tratamiento de diversas enfermedades cardiovasculares, tales como las producidas por la carencia de flujo sanguíneo pulmonar o hipertensión. De manera adicional, se pueden usar también estos compuestos en el tratamiento de diversos transtornos fisiológicos relacionados con el control anormal del fluido y la homeostasis del electrolito y en las enfermedades asociadas con la secreción anormal de aldosterona inducida por angiotensina.

De manera general, se pueden emplear los compuestos que inhiben la activación de un GPCR para una variedad de objetivos terapéuticos, por ejemplo, para el tratamiento de la hipotensión y/o la hipertensión, angina de pecho, infarto de miocardio, úlceras, asma, alergias, hipertrofia prostática benigna, y transtornos psicóticos y neurológicos que incluyen la esquizofrenia, agitación maníaca, depresión, delirio, demencia o retraso mental grave, disquinesias, tales como la enfermedad de Huntington o el síndrome de Tourett, entre otros. Los compuestos que inhiben los GPCR han sido también útiles en la reversión de la anorexia endógena y en el control de la bulimia. De manera concreta, los compuestos que inhiben la activación de los receptores de la presente invención son útiles en el tratamiento de diversas enfermedades cardiovasculares tales como las producidas por el flujo sanguíneo pulmonar excesivo o hipotensión. De manera adicional, se pueden usar también estos compuestos en el tratamiento de diversos transtornos fisiológicos relacionados con el control anormal del fluido y la homeostasis del electrolito y en las enfermedades asociadas con la secreción anormal de aldosterona inducida por angiotensina.

Se puede usar, por ejemplo, la modulación del enlace de la proteína similar al receptor de la lipoxina A_{4} con su ligando natural en el control de la hemostasis, reactividad vascular, de manera especial la vasoconstricción, y las reacciones anafilácticas y alérgicas en mamíferos, de manera preferible en seres humanos (véase la Patente de los Estados Unidos 5.079.261). Se puede usar, por ejemplo, el bloqueo del enlace del ligando de la proteína similar al receptor de la lipoxina A_{4} con el receptor para reducir la respuesta inflamatoria de los neutrófilos. De manera alternativa, se pueden usar los agonistas de la proteína similar al receptor de la lipoxina A_{4} para inducir o mejorar esta respuesta inflamatoria.

Se puede usar los nuevos agentes identificados mediante los ensayos de selección descritos anteriormente para regular la actividad de la proteína humana similar al receptor de la lipoxina A_{4}. De acuerdo con esto, se describe el uso de un compuesto de ensayo identificado tal como se describe en el presente documento en un modelo animal apropiado. Se pueden usar, por ejemplo, un agente identificado tal como se describe en el presente documento (por ejemplo, un agente modulador, una molécula de ácido nucleico de sentido contrario, un anticuerpo específico, ribozima, o un compañero de enlace con proteína) en un modelo animal para determinar la eficacia, la toxicidad, o los efectos secundarios del tratamiento con dicho agente. De manera alternativa, se puede usar un agente identificado tal como se describe en el presente documento en un modelo animal para determinar el mecanismo de acción de dicho agente.

Se puede administrar un reactivo que afecte la actividad de la proteína similar al receptor de la lipoxina A_{4} a una célula humana, tanto in vitro como in vivo, para reducir la actividad de la proteína similar al receptor de la lipoxina A_{4}. El reactivo enlaza de manera preferible con un producto de expresión de un gen de la proteína similar al receptor de la lipoxina A_{4}. Si el producto de expresión es una proteína, el reactivo es de manera preferible un anticuerpo. Para el tratamiento de las células humanas ex vivo, se puede añadir un anticuerpo a una preparación de células madre que se han retirado del cuerpo. A continuación se pueden sustituir las células en el mismo u otro cuerpo humano, con o sin propagación clonal, tal como se conoce en la técnica.

Se puede dosificar el reactivo usando un liposoma. De manera preferible, el liposoma es estable en el animal en el que se ha administrado durante al menos aproximadamente 30 minutos, de manera más preferible durante al menos aproximadamente 1 hora, e incluso de manera más preferible durante al menos aproximadamente 24 horas. Un liposoma comprende una composición lípida que es capaz de dirigir un reactivo, de manera particular un polinucleótido, a un emplazamiento concreto en un animal, tal como un ser humano. De manera preferible, la composición lípida del liposoma es capaz de hacer diana en un órgano específico de un animal, tal como el pulmón, el hígado, el brazo, el corazón, el cerebro, los nódulos linfáticos, y la piel.

Un liposoma útil comprende una composición lípida que es capaz de fusionarse con la membrana plasmática de la célula diana para liberar sus contenidos en la célula. De manera preferible, la eficiencia de la transfección de un liposoma es aproximadamente de 5 \mug de ADN por 16 nmol de liposomas liberados en aproximadamente 10^{6} células, de manera más preferible aproximadamente 1,0 \mug de ADN por 16 nmol de liposomas liberados en aproximadamente 10^{6} células, e incluso de manera más preferible aproximadamente 2,0 \mug de ADN por 16 nmol de liposomas liberados en aproximadamente 10^{6} células. De manera preferible, un liposoma está entre aproximadamente 100 y 500 nm, de manera más preferible entre aproximadamente 150 y 450 nm, e incluso los más preferible, entre aproximadamente 200 y 400 nm de diámetro.

Los liposomas adecuados incluyen aquellos liposomas usados de manera habitual en, por ejemplo, los procedimientos de dosificación de genes conocidos por aquellas personas expertas en la técnica. Los liposomas más preferidos incluyen los liposomas que tienen una composición lípida policatiónica y/o los liposomas que tienen un esqueleto de colesterol conjugado con el polietilenglicol. De manera opcional, un liposoma comprende un compuesto capaz de dirigir el liposoma a una célula tumoral, tal como un ligando de la célula tumoral expuesto en la superficie externa del liposoma.

Se puede conseguir complejar un liposoma con un reactivo tal como un oligonucleótido de sentido contrario usando los procedimientos que son habituales en la técnica (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos 5.705.151). De manera preferible, se combinan entre aproximadamente 0,1 \mug y aproximadamente 10 \mug de polinucleótidos con aproximadamente 8 nmol de liposomas, de manera más preferible, se combinan entre aproximadamente 0,5 \mug y aproximadamente 5 \mug de polinucleótidos con aproximadamente 8 nmol de liposomas, e incluso de manera más preferible, se combinan aproximadamente 1,0 \mug de polinucleótidos con aproximadamente 8 nmol de liposomas.

Se pueden dosificar los anticuerpos en tejidos específicos in vivo usando la dosificación dirigida mediada por el receptor. Se muestran las técnicas de liberación del ADN mediadas por el receptor en, por ejemplo, Findeis y col. Trends in Biotechnol. 11, 202-05 (1993); Chiou y col., GENE THERAPEUTICS: METHODS AND APPLICATIONS OF DIRECT GENE TRANSFER (J. A. Wolff, ed) (1994); Wu y Wu, J. Biol. Chem. 263, 621-24 (1988); Wu y col., J. Biol. Chem. 269, 542-46 (1994); Zenke y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 87, 3655-59 (1990); Wu y col., J. Biol. Chem. 266, 338-42 (1991).

Determinación de la dosis terapéuticamente efectiva

La determinación de una dosis terapéuticamente efectiva está bien comprendida dentro de las capacidades de aquellas personas expertas en la técnica. Una dosis terapéuticamente efectiva se refiere a la cantidad de ingrediente activo que aumenta o disminuye la actividad de la proteína similar al receptor de la lipoxina A_{4} en relación con la actividad de la proteína similar al receptor de la lipoxina A_{4} que se produce en ausencia de la dosis terapéuticamente efectiva.

Se puede estimar inicialmente, para cualquier compuesto, la dosis terapéuticamente efectiva en ensayos de cultivos celulares o en modelos animales, normalmente ratones, conejos, perros, o cerdos. Se puede usar también el modelo animal para determinar el intervalo de concentración apropiada y la ruta de administración. A continuación se puede usar dicha información para determinar las dosis útiles y las rutas de administración en los seres humanos.

Se pueden determinar la eficacia terapéutica y la toxicidad, por ejemplo, la DE_{50} (la dosis terapéuticamente efectiva en el 50% de la población) y la DL_{50} (la dosis letal en el 50% de la población), mediante los procedimientos farmacéuticos habituales en cultivos celulares o animales experimentales. La relación de dosis entre efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico, y se puede expresar como la relación, DL_{50}/DE_{50}.

Se prefieren las composiciones farmacéuticas que presentan elevados índices terapéuticos. Se usan los datos obtenidos de los ensayos de cultivos celulares y los estudios animales en la formulación de un intervalo de dosificación para uso humano. La dosificación contenida en dichas composiciones está comprendida de manera preferible dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la DE_{50} con poca o nada de toxicidad. La dosificación varía dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada, la sensibilidad del paciente, y la ruta de administración.

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El médico determinará la dosificación exacta, a la luz de los factores relacionados con el sujeto que requiere tratamiento. Se ajustan la dosificación y la administración para proporcionar niveles suficientes del ingrediente activo o para mantener el efecto deseado. Los factores que se pueden tener en cuenta incluyen la gravedad del estado de la enfermedad, la salud general del sujeto, la edad, el peso, y el género del sujeto, la dieta, el tiempo y la frecuencia de la administración, la(s) combinación(es) del(os) fármaco(s), las sensibilidades a la reacción, y la tolerancia / respuesta a la terapia. Se puede administrar una composición farmacéutica que actúe a largo plazo cada 3 ó 4 días, cada semana, o una vez cada dos semanas dependiendo de la vida media y a la velocidad de aclaramiento de la formulación concreta.

Las cantidades normales de dosificación pueden variar entre 0,1 y 100.000 microgramos, hasta una dosis total de aproximadamente 1 g, dependiendo de la ruta de administración. Se proporcionan en la bibliografía tanto la directriz como las dosificaciones y procedimientos concretos de liberación y están generalmente disponibles para los médicos expertos en la técnica. Aquellas personas expertas en la técnica emplearán diferentes formulaciones para nucleótidos que para las proteínas o sus inhibidores. De manera similar, la liberación de los polinucleótidos o los polipéptidos será específica para células, dolencias, localizaciones concretas, etc.

Si el reactivo es un anticuerpo de cadena única, se pueden construir e introducir los polinucleótidos que codifican el anticuerpo en una célula, bien ex vivo o in vivo, usando técnicas bien establecidas que incluyen, pero no se limitan a, transferencia del ADN mediada por transferrina-policatión, transfección con ácidos nucleicos desnudos o encapsulados, fusión celular mediada por liposomas, transporte intracelular de perlas de látex recubiertas con ADN, fusión protoplástica, infección vírica, "pistola genética", y transfección mediada por calcio fosfato o DEAE.

Las dosificaciones efectivas in vivo de un anticuerpo están en el intervalo de entre aproximadamente 5 \mug y aproximadamente 50 \mug/kg, entre aproximadamente 50 \mug y aproximadamente 5 mg/kg, entre aproximadamente 100 \mug y aproximadamente 500 \mug (kg de peso corporal del paciente, y entre aproximadamente 200 y aproximadamente 250 \mug/kg de peso corporal del paciente. Para la administración de los polinucleótidos que codifican los anticuerpos de cadena única, las dosificaciones efectivas in vivo están en el intervalo entre aproximadamente 100 ng y aproximadamente 200 ng, entre 500 ng y aproximadamente 50 mg, entre aproximadamente 1 \mug y aproximadamente 2 mg, entre aproximadamente 5 \mug y aproximadamente 500 \mug, y entre aproximadamente 20 \mug y aproximadamente 100 \mug de ADN.

Si el producto de expresión es ARNm, el reactivo es de manera preferible un oligonucleótido de sentido contrario o una ribozima. Se pueden introducir en las células polinucleótidos que expresen los oligonucleótidos de sentido contrario o las ribozimas mediante una variedad de procedimientos, tal como se ha descrito anteriormente.

De manera preferible, un reactivo reduce la expresión de un gen de la proteína similar al receptor de la lipoxina A_{4} o la actividad de un polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} en al menos aproximadamente 10, de manera preferible aproximadamente 50, de manera más preferible aproximadamente 75, 90, o 100 en relación con la ausencia del reactivo. Se puede evaluar la efectividad del mecanismo escogido para disminuir el nivel de expresión de un gen de la proteína similar al receptor de la lipoxina A_{4} o la actividad de un polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} usando procedimientos bien conocidos en la técnica, tales como la hibridación de sondas de nucleótidos con ARNm específico de la proteína similar al receptor de la lipoxina A_{4}, RT-PCR cuantitativa, detección inmunológica de un polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4}, o la medida de la actividad de la proteína similar al receptor de la lipoxina A_{4}.

Se puede administrar cualquiera de las composiciones farmacéuticas de la invención en combinación con otros agentes terapéuticos apropiados. Una persona normalmente experta en la técnica puede hacer la selección de los agentes apropiados para uso en la terapia de combinación, de acuerdo con los principios farmacéuticos convencionales. La combinación de los agentes terapéuticos puede actuar de manera sinérgica para efectuar el tratamiento o la prevención de los diversos transtornos descritos anteriormente. Mediante esta hipótesis, se puede ser capaz de alcanzar la eficacia terapéutica con dosificaciones más bajas de cada agente, reduciendo de esta manera el potencial de los efectos secundarios adversos.

Se puede aplicar cualquiera de los procedimientos terapéuticos descritos anteriormente a cualquier sujeto que necesite de dicha terapia, incluyendo, por ejemplo, mamíferos tales como perros, gatos, vacas, caballos, conejos, monos, y lo más preferible, seres humanos.

Ejemplo 1 Detección de la actividad del receptor similar al de la lipoxina A_{4}

Se insertó el polinucleótido de la SEC DE ID Nº 1 en el vector de expresión pCEV4, y el vector de expresión pCEV4-polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} obtenido se transfectó en células 293 de riñón embriónico humano. Se fragmentaron las células en un matraz de cultivo en 5 ml de Tris HCl, EDTA 5 mM, pH 7,5, y se lisaron mediante sonicación. Se centrifugaron los lisados celulares a 1000 rpm durante 5 minutos a 4ºC. Se centrifugó el sobrenadante a 30.000 x g durante 20 minutos a 4ºC. Se suspendió el residuo en un tampón de enlace que contenía Tris HCl 50 mM, MgSO_{4} 5 mM, EDTA 1 mM, NaCl 100 mM, pH 7,5, suplementado con BSA al 0,1%, 2 \mug/ml de aprotinina, 0,5 mg/ml de leupeptina, y 10 \mug/ml de fosforamidón. Se añadieron las diluciones óptimas de la suspensión de membranas, definidas como las concentraciones requeridas de proteína para enlazar menos de un 10% de un radioligando añadido, es decir, lipoxina A_{4} marcada con ^{125}I, a las placas de microvaloración de polipropileno con 96 pocillos que contenían el ligando, los péptidos no marcados, y el tampón de enlace hasta un volumen final de 250 \mul.

En los ensayos de enlace de saturación en equilibrio se incubaron las preparaciones de membrana en presencia de concentraciones crecientes (0,1 nM a 4 nM) del ligando ^{125}I.

Se incubaron las mezclas de la reacción de enlace durante una hora a 30ºC. Se detuvo la reacción mediante filtración a través de filtros GF/B tratados con polietileneimina al 0,5%, usando un cosechador celular. Se midió la radioactividad mediante conteo por centelleo, y se analizaron los datos mediante un programa de regresión no lineal por ordenador. Se define el enlace no específico como la cantidad de radioactividad que permanece tras la incubación de la proteína de la membrana en presencia de 100 nM de péptido no marcado. Se midió la concentración de la proteína mediante el procedimiento de Bradford usando el Reactivo Bio-Rad, con albúmina de suero bovino como patrón. Se demostró la actividad similar al receptor de la lipoxina A_{4} del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC DE ID Nº 2.

Ejemplo 2 Ensayos de enlace del radioligando

Se fragmentaron células 293 de riñón embriónico humano con un polinucleótido que expresa la proteína similar al receptor de la lipoxina A_{4} en un matraz de cultivo en 5 ml de Tris HCl, EDTA 5 mM, pH 7,5, y se lisaron mediante sonicación. Se centrifugaron los lisados celulares a 1000 rpm durante 5 minutos a 4ºC. se centrifugó el sobrenadante a 30.000 x g durante 20 minutos a 4ºC. Se suspendió el residuo en tampón de enlace que contenía Tris HCl 50 mM, MgSO_{4} 5 mM, EDTA 1 mM, NaCl 100 mM, pH 7,5, suplementado con BSA al 0,1%, 2 \mug/ml de aprotinina, 0,5 mg/ml de leupeptina, y 10 g/ml de fosforamidón. Se añadieron las diluciones óptimas de la suspensión de membranas, definidas como la concentración de proteínas requerida para enlazar menos del 10% del radioligando añadido, es decir, la lipoxina A_{4} marcada con ^{125}I a las placas de microvaloración de polipropileno con 96 pocillos que contenían el ligando o el compuesto de ensayo, y el tampón de enlace hasta un volumen final de 250 \mul.

En los ensayos de enlace de saturación en equilibrio, se incubaron las preparaciones de membranas en presencia de concentraciones crecientes (0,1 nM a 4 nM) del ligando ^{125}I o el compuesto de ensayo (actividad específica 2200 Ci/mmol). Se determinaron las afinidades de enlace de los diferentes compuestos de ensayo en ensayos de enlace de competición en equilibrio, usando péptido ^{125}I 0,1 nM en presencia de doce concentraciones diferentes de cada compuesto de ensayo.

Se incubaron las mezclas de la reacción de enlace durante una hora a 30ºC. Se detuvo la reacción mediante filtración a través de filtros GF/B tratados con polietileneimina al 0,5%, usando un cosechador celular. Se midió la radioactividad mediante conteo por centelleo, y se analizaron los datos mediante un programa de regresión no lineal por ordenador.

Se define el enlace no específico como la cantidad de radioactividad que permanece tras la incubación de la proteína de la membrana en presencia 100 nM de péptido no marcado. Se midió la concentración de proteína mediante el procedimiento de Bradford usando el Reactivo Bio-Rad, con albúmina de suero bovino como estándar. Un compuesto de ensayo que aumenta la radioactividad de la proteína de membrana en al menos un 15% en relación con la radioactividad de la proteína de membrana que no se incubó con un compuesto de ensayo se identifica como un compuesto que enlaza un polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} humana.

Ejemplo 3 Efecto de un compuesto de ensayo sobre la formación de AMP cíclico mediada por la proteína similar al receptor de la lipoxina A_{4} humana

Se puede evaluar la inhibición de la formación de AMP cíclico mediada por el receptor en células LM(tk-) que expresan la proteína similar al receptor de la lipoxina A_{4}. Se plaquearon las células en placas de 96 pocillos y se incubaron en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (PBS) suplementada con HEPES 10 mM, teofilina 5 mM, 2 \mug/ml de aprotinina, 0,5 mg/ml de leupeptina, y 10 g/ml de fosforamidón durante 20 minutos a 37ºC en CO_{2} al 5%. Se añadió un compuesto de ensayo y se incubó durante 10 minutos más a 37ºC. Se aspiró el medio y se detuvo la reacción mediante la adición de 100 ml de HCl. Se almacenaron las placas a 4ºC durante 15 minutos. Se midió el contenido de AMPc en la solución de detención mediante radioinmunoensayo.

Se cuantificó la radioactividad usando un contador gamma equipado con software de reducción de datos. Se identifica un compuesto de ensayo que disminuye la radioactividad de los contenidos de un pocillo en relación con la radioactividad de los contenidos de un pocillo en ausencia del compuesto de ensayo como un inhibidor potencial de la formación de AMPc. Se identifica un compuesto de ensayo que aumenta la radioactividad de los contenidos de un pocillo en relación con la radioactividad de los contenidos de un pocillo en ausencia del compuesto de ensayo como un mejorador potencial de la formación de AMPc.

Ejemplo 4 Efecto de un compuesto de ensayo sobre la movilización del calcio intracelular

Se pudo medir la concentración de calcio libre intracelular mediante microespectrofluorometría usando el tinte indicador fluorescente Fura-2/AM (Bush y col., J. Neurochem. 57, 562-74, 1991). Se sembraron células transfectadas de manera estable en una placa de cultivo de 35 mm que contenía un inserto de porta de vidrio. Se lavaron las células con HBS, se incubaron con un compuesto de ensayo, y se cargaron con 100 \mul de Fura-2/AM (10 \muM) durante 20-40 minutos. Tras el lavado con HBS para eliminar la solución de Fura-2/AM, se equilibraron las células en HBS durante 10-20 minutos. A continuación se visualizaron las células bajo el objetivo de 40X de un microscopio Leitz Fluovert FS.

Se determinó la emisión de fluorescencia a 510 nM, con longitudes de onda de excitación que alternaban entre 340 nM y 380 nM. Se convirtieron los datos de fluorescencia pura en concentraciones de calcio usando curvas normalizadas de concentración de calcio y las técnicas de software de análisis. Se identifica un compuesto de ensayo que aumenta la fluorescencia en al menos un 15% en relación con la fluorescencia en ausencia de un compuesto de ensayo como un compuesto que moviliza el calcio intracelular.

Ejemplo 5 Efecto de un compuesto de ensayo sobre el metabolismo del fosfoionosítido

Se plaquearon células LM(tk-) que expresan de manera estable el ADNc de la proteína similar al receptor de la lipoxina A_{4} humana en placas de 96 pocillos y crecieron hasta confluencia. El día antes del ensayo se cambió el medio de crecimiento en 100 \mul de medio que contenía suero al 1% y 0,5 \muCi de ^{3}H-myinositol. Se incubaron las placas durante la noche en un incubador con CO_{2} (CO_{2} al 5% a 37ºC). Se retiró el medio inmediatamente antes del ensayo, y se sustituyó por 200 \mul de PBS que contenía Lic. 10 mM, y se equilibraron las células con el nuevo medio durante 20 minutos. Durante este intervalo, se equilibraron también las células con el antagonista, se añadieron como una alícuota de 10 \mul de una solución concentrada 20 veces en PBS.

Se inició la acumulación del fosfato de ^{3}H-inositol a partir del metabolismo del fosfolípido de inositol añadiendo 10 \mul de una solución que contenía un compuesto de ensayo. Se añadieron 10 \mul en el primer pocillo para medir la acumulación basal. Se evaluaron once concentraciones diferentes de compuestos de ensayo en los siguientes 11 pocillos de cada hilera de placas. Se llevaron a cabo todos los ensayos por duplicado repitiendo las mismas adiciones en dos hileras consecutivas de placas.

Se incubaron las placas en un incubador con CO_{2} durante una hora. Se finalizó la reacción añadiendo 15 \mul de ácido tricloroacético al 50% v/v (TCA), seguido por una incubación de 40 minutos a 4ºC. Tras la neutralización del TCA con 40 \mul de Tris 1 M, se transfirió el contenido de los pocillos a una placa con filtro Multiscreen HV (Millipore) que contenía Dowex AG1-X8 (malla de 200-400, en forma de formiato). Se prepararon las placas con filtro añadiendo a cada pocillo 200 \mul de suspensión de Dowex AG1-X8 (50% v/v, agua:resina). Se colocaron las placas con filtro en una tubería de vacío para lavar o eluir el lecho de resina. Se lavó cada pocillo 2 veces con 200 \mul de agua, seguido por 2 x 200 \mul de tetraborato de sodio 5 mM / formiato de amonio 60 mM.

Se eluyeron los ^{3}H-IP en placas vacías de 96 pocillos con 200 \mul de formiato de amonio 1,2 M / ácido fórmico 0,1. Se añadió el contenido de los pocillos a 3 ml del cóctel de centelleo y se determinó la radioactividad mediante conteo por centelleo líquido.

Ejemplo 6 Procedimientos de enlace del receptor

Ensayos de enlace normalizados. Se llevaron a cabo los ensayos de enlace en un tampón de enlace que contenía HEPES 50 mM, pH 7,4, BSA al 0,5%, y MgCl_{2} 5 mM. Se llevó a cabo el ensayo normalizado del enlace del radioligando (por ejemplo, ^{125}I-lipoxina A_{4}, -^{125}I-lipoxina A_{4}, análogo, o -compuesto de ensayo) con los fragmentos de membrana que comprendían los polipéptidos similares al receptor de la lipoxina A_{4} tal como sigue en placas de microvaloración de 96 pocillos (por ejemplo, placas Dynatech Immulon II Removawell). Se diluyó el radioligando en tampón de enlace + PMSF/Baci en los cpm deseados por 50 \mul, a continuación se añadieron alícuotas de 50 \mul a los pocillos. Para las muestras de enlace no específico se añadieron también 5 \mul de ligando frío 40 \muM por pocillo. Se inició el enlace añadiendo 150 \mul por pocillo de membrana diluida a la concentración deseada (10-30 \mug de proteína de membrana / pocillo) en tampón de enlace + PMSF/Baci. A continuación se cubrieron las placas con selladores de placa miliares Linbro (Flor Labs) y se colocaron en un Dynatech Microshaker II. Se dejó proceder el enlace a temperatura ambiente durante 1-2 horas y se detuvo centrifugando la placa durante 15 minutos a 2.000 x g. Se decantaron los sobrenadantes y se lavaron los residuos de membrana una vez mediante adición de tampón de enlace enfriado en hielo, breve agitación, y recentrifugación. Se colocaron los pocillos individuales en tubos de 12 x 75 mm y se contaron en un contador LKB Gammamaster (eficiencia del 78%). El enlace específico mediante este procedimiento es idéntico al que se midió cuando se eliminó el ligando libre mediante filtración rápida (3-5 segundos) y lavado en filtros de fibra de vidrio recubiertos con polietileneimina.

Se usaron también tres variaciones del ensayo de enlace normalizado.

1.: Se llevaron a cabo los ensayos competitivos de enlace del radioligando con un intervalo de concentración de ligando frío frente a ligando marcado con ^{125}I tal como se ha descrito anteriormente con una modificación. Se hicieron todas las diluciones de los ligandos que se estaban evaluando en 40X PMSF/Baci a una concentración 40X de la concentración final en el ensayo. A continuación se añadieron muestras de péptido (5 \mul cada una) por pocillo de microvaloración. Se diluyeron las membranas y el radioligando en el tampón de enlace sin inhibidores de la proteasa. Se añadió el radioligando y se mezcló con el ligando frío, y a continuación se inició el enlace mediante la adición de membranas.

2.: Se llevó a cabo el entrecruzamiento químico del radioligando con el receptor tras una etapa de enlace idéntica a la del ensayo normalizado. Sin embargo, se llevó a cabo la etapa de lavado con el tampón de enlace menos BSA para reducir la posibilidad del entrecruzamiento no específico del radioligando con el BSA: Se llevó a cabo la etapa de entrecruzamiento tal como se describe a continuación.

3.: Se llevaron también a cabo ensayos de enlace a más gran escala para obtener residuos de membrana para los estudios de solubilización del complejo receptor:ligando y para la purificación del receptor. Estos son idénticos a los ensayos normalizados excepto en que (a) se llevó a cabo el enlace en tubos de polipropileno de volúmenes entre 1-250 ml, (b) la concentración de la proteína de membrana es casi de 0,5 mg/ml, y (c) para la purificación del receptor, se redujo la concentración de BSA en el tampón de enlace a 0,25%, y se llevó a cabo la etapa de lavado con tampón de enlace sin BSA, lo que reduce la contaminación de BSA del receptor purificado.

Ejemplo 7 Entrecruzamiento químico del radioligando con el receptor

Tras una etapa de enlace del radioligando tal como se ha descrito anteriormente, se volvieron a suspender los residuos de las membranas en 200 \mul por pocillo de placa de microvaloración de tampón de enlace enfriado en hielo sin BSA. A continuación se añadieron 5 \mul por pocillo de N-5-azido-2-nitrobenzoiloxisuccinimida 4 mM (ANB-NOS, Pierce) en DMSO y se mezclaron. Se mantuvieron las muestras en hielo y se irradiaron con UV durante 10 minutos con una lámpara Mineralight R-52G (UVP Inc., San Gabriel, Calif.) a una distancia de 5-10 cm. A continuación se transfirieron las muestras a tubos de micrófuga Eppendorf, se aglutinaron las membranas mediante centrifugación, se eliminaron los sobrenadantes, y se solubilizaron las membranas en tampón de muestra Laemmli SDS para electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE). Se llevó a cabo PAGE tal como se describe a continuación. Se visualizaron las proteínas radiomarcadas mediante autoradiografía de los geles secos con película kodak XAR y selecciones del intensificador de imagen Dupont.

Ejemplo 8 Solubilización de la membrana

Se llevó a cabo la solubilización de la membrana en tampón que contenía Tris 25 mM, pH 8, glicerol al 10% (p/v) y
CaCl_{2} 0,2 mM (tampón de solubilización). Se fabricaron detergentes altamente solubles que incluían Triton X-100, desoxicolato, deosoxicolato:lisolecitina, CHAPS y zwittergentes en tampón de solubilización a concentraciones al 10%
y se almacenaron como alícuotas congeladas. Se fabricó lisolecitina fresca debido a la insolubilidad tras la congelación-descongelación y se fabricó digitonina fresca a concentraciones más bajas debido a su solubilidad más limitada.

Para solubilizar las membranas, se volvieron a suspender los residuos lavados tras la etapa de enlace, libres de partículas visibles pipeteando y sometiendo a vórtex en tampón de solubilización a 100.000 x g durante 30 minutos. Se retiraron los sobrenadantes y se mantuvieron en hielo y se descartaron los residuos.

Ejemplo 9 Ensayo de los receptores solubilizados

Tras el enlace de los ligandos ^{125}I y la solubilización de las membranas con detergente se puede evaluar el complejo R:L intacto mediante cuatro procedimientos diferentes. Se llevaron a cabo todos en hielo o en habitación enfriada a 4-10ºC.

1.: Cromatografía en columna (Knuhtsen y col., Biochem. J. 254, 641-647, 1988). Se equilibraron las columnas Sephadex G-50 (8 x 250 mm) con tampón de solubilización que contenía detergente a la concentración usada para solubilizar las membranas y 1 mg/ml de albúmina de suero bovino. Se aplicaron las muestras de las membranas solubilizadas (0,2-0,5 ml) a las columnas y se eluyeron a un caudal de aproximadamente 0,7 ml/minuto. Se recogieron las muestras (0,18 ml). Se determinó la radioactividad en un contador gamma. Se determinaron los volúmenes vacíos de las columnas mediante el volumen de elución del dextrano azul. Se consideró la radioactividad eluyente en el volumen vacío enlazada a la proteína. Se consideró no enlazada la radioactividad eluyente posterior, en el mismo volumen como ligandos libres de ^{125}I.

2.: Precipitación del polietilenglicol (Cuatrecasas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 318-322, 1972). Para una muestra de 100 \mul de membranas solubilizadas en un tubo de polipropileno de 12 x 75 mm, se añadieron 0,5 ml de gamma globulina bovina al 1% (p/v) (Sigma) en tampón de fosfato de sodio 0,1 M, seguido por 0,5 ml de polietilenglicol al 25% (p/v) (Sigma) y se mezclaron. Se mantuvo la mezcla en hielo durante 15 minutos. A continuación se añadieron por muestra 3 ml de fosfato de sodio 0,1 M, pH 7,4. Se filtraron rápidamente las muestras (1-3 segundos) sobre filtros de fibra de vidrio GF/B Whatman y se lavaron con 4 ml de tampón fosfato. Se determinó el complejo receptor precipitado mediante PEG : ^{125}I-Ligando, mediante conteo gamma de los filtros.

3.: Enlace del filtro GFB/PEI (Buns y col., Analytical Biochem. 132, 74-81, 1983). Se mojaron los filtros de fibra de vidrio GF/B Whatman en polietileneimina (PEI, Sigma) durante 3 horas. Se sustituyeron las muestras de las membranas solubilizadas (25-100 \mul) en tubos de polipropilénglicol de 12 x 75 mm. A continuación se añadieron 4 ml de tampón de solubilización por muestra y se filtraron las muestras inmediatamente a través de filtros GFB/PEI (1-3 segundos) y se lavaron con 4 ml de tampón de solubilización Se determinó el complejo CPM del receptor : ^{125}I-ligando adsorbido en los filtros mediante conteo gamma.

4.: Carbón activo/ Dextrano (Paul y Said, Peptides 7 [Suppl. 1], 147-149, 1986). Se disolvió dextrano T70 (0,5 g, Pharmacia) en 1 litro de agua. Se añadieron a continuación 5 g de carbón activo (Norit A, alcalino; Fisher Scientific). Se agitó la suspensión durante 10 minutos a temperatura ambiente y se almacenó a continuación a 4ºC hasta su uso. Para medir el complejo R:L, se añadieron 4 partes por volumen de suspensión de carbón / dextrano en 1 parte por volumen de membrana solubilizada. Se mezclaron las muestras y se mantuvieron en hielo durante 2 minutos y a continuación se centrifugaron durante 2 minutos a 11.000 x g en una microfuga Beckman. Se adsorbió el carbón / dextrano libre de radioligando y se descartó con el residuo. Los complejos Receptor : 125I-Ligando permanecieron en el sobrenadante y se determinaron mediante conteo gamma.

Ejemplo 10 Purificación del receptor

Se llevó a cabo el enlace del receptor biotinilado con las membranas GH_{4} Cl tal como se ha descrito anteriormente. Las incubaciones se realizaron durante 1 hora a temperatura ambiente. En el protocolo de purificación normalizado, las incubaciones del enlace contienen 10 nM de Bio-S29. Se añadió ligando marcado con ^{125}I como trazador a niveles de 5.000-100.000 cpm por mg de proteína de membrana. Las incubaciones control contienen 10 \mumol de ligando frío para saturar el receptor con el ligando no biotinilado.

Se llevó también a cabo la solubilización del complejo receptor:ligando tal como se ha descrito anteriormente, con desoxicolato al 0,15%:lisolecitina en tampón de solubilización que contenía MgCl_{2} 0,2 mM, para obtener 100.000 x g se sobrenadantes que contenían el complejo R:L solubilizado.

Se lavó la estreptavidina inmovilizada (estreptavidina entrecruzada con agarosa en forma de perlas al 6%, Pierce Chemical Co.; "SA-agarosa") en tampón de solubilización y se añadió a las membranas solubilizadas a 1/30 del volumen final. Se incubó esta mezcla con agitación constante mediante rotación extremo con extremo durante 4-5 horas a 4-10ºC. A continuación se aplicó la mezcla a una columna y se lavó mediante el material no enlazado. Se determinó el enlace del radioligando con la SA-agarosa comparando los cpm en los 100.000 x g del sobrenadante con los del efluente en la columna tras la adsorción de la SA-agarosa. Finalmente, se lavó la columna con 12-15 volúmenes de columna de tampón de solubilización + desoxicolato al 0,15%:lisolecitina + 1/500 (vol/vol) 100 x 4 pasos.

Se eluyó la columna de estreptavidina con tampón de solubilización + EDTA 0,1 mM + EGTA 0,1 mM + GTP 0,1 mM-gamma-S (Sigma)+ desoxicolato al 0,15% (p/vol):lisolecitina + 1/100 (vol/vol) 100 veces, 4 pases. En primer lugar, se pasó un volumen de columna de tampón de elución a través de la columna y se detuvo el flujo durante 20-30 minutos. A continuación se pasaron a través 3-4 más volúmenes de columna de tampón de elución. Se combinaron todos los eluatos.

Se incubaron los eluatos de la columna de estreptavidina durante la noche (12-15 horas) con aglutinina inmovilizada de gérmen de trigo (agarosa WGA, Vector Labs) para adsorber el receptor mediante la interacción del carbohidrato enlazado covalentemente con la lectina WGA; La relación (vol/vol) de agarosa WGA a eluato de la columna de estreptavidina es de manera general 1:400. Se puede usar también un intervalo entre 1:1000 y 1:200. Tras la etapa de enlace, se aglutino la resina mediante centrifugación, se retiró el sobrenadante y se guardó, y se lavó la resina 3 veces (aproximadamente 2 minutos cada vez) en tampón que contenía HEPES 50 mM, pH 8, MgCl_{2} 5 mM, y desoxicolato al 0,15%:lisolecitina. Para eluir el receptor enlazado con el WGA, se extrajo la resina tres veces mediante mezclado repetido (mezclador en vórtex de baja velocidad) durante un período de 15-30 minutos en hielo, con e columnas de resina cada vez, de N-N’-N’’-triacetilquitotriosa 10 mM en el mismo tampón HEPES usado para lavar la resina. Tras cada etapa de elución, se centrifugó la resina y se retiró cuidadosamente el sobrenadante, libre de residuos de agarosa WGA. Los tres eluatos combinados contienen el receptor purificado final. El material no enlazado con WGA contiene las subunidades de proteína G eluidas de manera específica a partir de la columna de estreptavidina, así como los contaminantes no específicos. Todas estas fracciones se almacenaron congeladas a -90ºC.

Ejemplo 11 Identificación de un compuesto de ensayo que enlaza con un polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4}

Se pusieron en contacto los polipéptidos purificados similares al receptor de la lipoxina A_{4} que comprendían una proteína glutatión-S-transferasa y se adsorbieron sobre placas de microvaloración de 96 pocillos derivatizadas con glutatión con los compuestos de ensayo procedentes de una biblioteca de moléculas pequeñas, a pH 7,0, en una solución de tampón fisiológico. Los polipéptidos similares al receptor de la lipoxina A_{4} comprenden la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC DE ID Nº 2. Los compuestos de ensayo comprenden una etiqueta fluorescente. Se incubaron las muestras durante 5 minutos a una hora. Se incubaron las muestras control en ausencia de un compuesto de ensayo.

Se eliminó por lavado de los pocillos la solución tampón que contenía los compuestos de ensayo. Se detectó el enlace de un compuesto de ensayo con un polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} mediante las medidas de fluorescencia de los contenidos de los pocillos. Se identificó un compuesto de ensayo un compuesto de ensayo que aumenta la fluorescencia en un pocillo en al menos un 15% en relación con la fluorescencia de un pocillo que el que no se incubó, como un compuesto que enlaza un polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4}.

Ejemplo 12 Identificación de un compuesto de ensayo que disminuye la expresión del gen de la proteína similar al receptor de la lipoxina A_{4}

Se administró un compuesto de ensayo a un cultivo de células CHO transfectadas con un polinucleótido similar al receptor de la lipoxina A_{4} y se incubó a 37ºC durante 10 a 45 minutos. Un cultivo del mismo tipo de células incubadas durante el mismo tiempo sin el compuesto de ensayo proporcionó un control negativo.

Se aisló ARN de los dos cultivos tal como se describe en Chirgwin y col., Biochem. 18, 5294-99, 1979. Se prepararon Northern blots usando 20 a 30 g de ARN total y se hibridaron con una sonda específica de proteína similar al receptor de la lipoxina A_{4} marcada con ^{32}P a 65ºC en Express-hyb (CLONTECH). La sonda comprende al menos 11 nucleótidos contiguos seleccionados entre el complemento de la SEC DE ID Nº 1. Se identificó un compuesto de ensayo que disminuye la señal específica de la proteína similar al receptor de la lipoxina A_{4} en relación con la señal obtenida en ausencia del compuesto de ensayo, como un inhibidor de la expresión del gen de la proteína similar al receptor de la lipoxina A_{4}.

Ejemplo 13 Tratamiento de la inflamación con un reactivo que enlaza de manera específica con un producto de gen de la proteína similar al receptor de la lipoxina A_{4}

Se llevó a cabo la síntesis de los oligonucleótidos de sentido contrario de la proteína similar al receptor de la lipoxina A_{4} que comprenden al menos 11 nucleótidos contiguos seleccionados entre el complemento de la SEC DE ID Nº 1 en un sintetizador de serie Pharmacia Gene Assembler usando el procedimiento de la fosforamidita (Uhlmann y col., Chem. Rev. 90, 534-83, 1990). Tras el ensamblaje y la desprotección, se precipitaron dos veces los oligonucleótidos con etanol, se secaron, y se suspendieron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a la concentración deseada. Se ensayó la pureza de estos oligonucleótidos mediante electroforesis capilar en gel y HPLC de intercambio iónico. Se determinaron los niveles de endotoxina en la preparación de oligonucleótidos usando el Ensayo del Amebocito Luminoso (Bang, Biol. Bull. (Woods Hole, Mass.) 105, 361-362, 1953).

Se inyectaron los oligonucleótidos de sentido contrario directamente en un tejido inflamado en un medio acuoso (una composición acuosa) a una concentración de 0,1-100 \muM con una aguja. Se colocó la aguja en el tejido y se retiró a la vez que se expresaba la composición acuosa en el interior del tejido.

Se monitorizó el tejido inflamado durante un período de días o semanas. Se pueden proporcionar inyecciones adicionales de los oligonucleótidos antisentido durante este tiempo. La inflamación en el tejido disminuyó gradualmente.

Ejemplo 14 Expresión específica del tejido del polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4}

El perfil de la expresión se basa en un análisis cuantitativo de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), denominado también análisis cinético, descrito en primer lugar en Higuchi y col., 1992 y en Higuchi y col., 1993. El principio es que en cualquier ciclo dado dentro de la fase exponencial de la PCR, la cantidad de producto es proporcional al número inicial de copias de la plantilla. Usando esta técnica, se midieron los niveles de expresión de genes concretos, que se transcribe a partir de los cromosomas como ARN mensajero (ARNm), haciendo en primer lugar una copia del ADN (ADNc) del ARNm, y a continuación llevando a cabo la PCR cuantitativa en el ADNc, un procedimiento denominado reacción en cadena de la polimerasa mediante transcripción inversa cuantitativa (RT-PCR cuantitativa).

Se llevó a cabo el análisis RT-PCR cuantitativa del ARN de diferentes tejidos humanos para investigar la distribución en el tejido del ARNm del polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4}. En la mayor parte de los casos, se usaron como plantilla 25 \mug del ARN total procedente de diversos tejidos (incluyendo el Panel I-V del ARN Total Humano, Clontech Laboratories, Palo Alto, CA, USA), para sintetizar el ADNc de la primera cadena usando el Sistema de Síntesis de la Primera Cadena SUPERSCRIPT^{TM} para la RT-PCR (Life Technologies, Rockville, MD, USA). Se llevó a cabo la síntesis del ADNc de la primera cadena de acuerdo con el protocolo del fabricante usando oligo (dT) para hibridar con las colas 3’ poli A del ARNm y preparar la reacción de síntesis. A continuación se usaron 10 ng del ADNc de la primera cadena como plantilla en una reacción en cadena de la polimerasa. En otros casos, se usaron como plantilla 10 ng de ADNc comercialmente disponible (Panel MTC de Sistema Inmune Humano y Panel MTC de Fracciones de Sangre Humana, Clontech Laboratories, Palo Alto, CA, USA) en una reacción en cadena de la polimerasa. Se llevó a cabo la reacción en cadena de la polimerasa en un LightCycler (Roche Molecular Biochemicals, Indianápolis, IN, USA), en presencia del tinte fluorescente de enlace con el ADN SYBR Verde I que enlaza con la ranura menor de la doble hélice de ADN, producida únicamente cuando se sintetiza satisfactoriamente el ADN de cadena doble en la reacción (Morrison y col., 1998). Tras el enlace con el ADN de cadena doble, se pudo medir cuantitativamente la luz que emite SYBR Verde I mediante el equipo LightCycler. Se llevó a cabo la reacción en cadena de la polimerasa usando los cebadores de oligonucleótido LBRI004-L4 (TCTGTGCCCAGTCCCTGTGATGAA) y LBRI004-R2 (TCTGTCTGCCCTGGGCTCTTTCAC) y se tomaron las medidas de la intensidad de la luz emitida tras cada ciclo de la reacción cuando la reacción había alcanzado una temperatura de 91 grados C. Se convirtieron las intensidades de luz emitida en números de copia del transcripto del gen por nanogramo de ADNc de la plantilla por comparación con los estándares que se hacen reaccionar simultáneamente de la concentración conocida.

Para corregir las diferencias en los niveles de transcripción por célula en los diversos tipos de tejidos, se llevó a cabo un procedimiento de normalización usando niveles de expresión similarmente calculados en los diversos tejidos de cinco diferentes genes domésticos: gliceraldehído-3-fosfatasa (G3PDH), hipoxantina guanina fosforibosil transferasa (HPRT), beta-actina, porfobilinógeno desaminasa (PBGD), y beta-2-microglobulina. Se consideró el nivel de expresión del gen doméstico por ser relativamente constante para todos los tejidos (Adams y col., 1993, Adams y col., 1995, Liew y col., 1994) y se usó por tanto como norma de medida para aproximar números relativos de células por \mug de ARN total usados en la etapa de síntesis del ADNc. Excepto para el uso de un conjunto ligeramente diferente de genes indicadores y el uso del sistema LightCycler para medir los niveles de expresión, el procedimiento de normalización fue esencialmente el mismo que el que se describe en el RNA master Blot User manual, Apéndice C (1997, Clontech Laboratories, Palo Alto, CA, USA). De manera breve, se midieron los niveles de expresión de los cinco genes domésticos en todas las muestras de tejido en tres reacciones independientes por gen usando el LightCycler y una cantidad constante (25 \mug) de ARN de partida. Se registraron los números de copia calculados para cada gen, derivados de la comparación con estándares que se hacen reaccionar simultáneamente de concentraciones conocidas y se convirtieron en un porcentaje de la suma de los números de copia del gen en todas las muestras de tejido. A continuación, se calculó para cada muestra de tejido, la suma de los valores del porcentaje para cada gen, y se calculó un factor de normalización dividiendo el valor del porcentaje de la suma para cada tejido por el valor del porcentaje de la suma de uno de los tejidos arbitrariamente seleccionados como estándar. Para normalizar un valor experimentalmente obtenido para la expresión de un gen concreto en una muestra de tejido, se multiplicó el valor obtenido por el factor de normalización para el tejido ensayado. Se usó este procedimiento de normalización para todos los tejidos excepto aquellos derivados del Panel MTC de Fracciones de Sangre Humana, que mostró una variación importante en algunos genes domésticos dependiendo de si se había activado el tejido o no. En estos tejidos, se llevó a cabo la normalización con un gen doméstico único, beta-2-microglobulina.

Se proporcionan a continuación los resultados, que muestran los números de copia experimentalmente obtenidos del ARNm por 10 ng de ADNc de primera cadena a la izquierda y los valores normalizados a la derecha. En las tablas 1 y 2 se muestran los ARN usados para la síntesis del ADNc, junto con su suministrador y los números del catálogo.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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Perfil de expresión del ARNm del polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4}, selección de cuerpo completo

1

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Perfil de expresión del ARNm del polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4}, selección de sangre / pulmón

2

TABLA 1 Selección de tejidos de cuerpo completo

3

TABLA 2 Selección de tejidos de sangre / pulmón

4

En resumen, el polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4} está muy expresado en el útero, hígado, placenta, y sistema gastrointestinal, y se encuentran niveles más bajos de expresión en el bazo, timo, y médula espinal. Presenta también elevada expresión en los leucocitos de la sangre periférica, en los que parece estar principalmente expresado en las células T y B. La activación mitógena de las células CD8^{+} T y las células CD19^{+} B parece infraregular la expresión del polipéptido similar al receptor de la lipoxina A_{4}, mientras que el efecto opuesto, la sobreregulación, se ve tras la activación mitógena de las células CD4^{+} T.

Referencias

Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, P. S. y Griffith, R. (1992) Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences. BioTechnology 10:413-417.

Higuchi, R., Fockler, C., Dollinger, G. y Watson, R. (1993) Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions. BioTechnology 11:1026-1030.

T. B. Morrison, J. J. Weis y C. T. Wittwer (1998) Quantification of low-copy transcripts by continuous SYBR Green I monitoring during amplification. BioTechniques 24:954-962.

Adams, M. D., Kerlavage, A. R., Fields, C. y Venter, C. (1993) 3.400 new expressed sequence tags identify diversity of transcripts in human brain. Nature Genet. 4:256-265.

Adams, M. D., et al. (1995) Initial assessment of human gene diversity and expression patterns based upon 83 million nucleotides of cDNA sequence. Nature 377 supp:3-174.

Liew, C. C., Hwang, D. M., Fung, Y. W., Laurenson, C., Cukerman, E., Tsui, S. y Lee, C. Y. (1994) A catalog of genes in the cardiovascular system as identified by expressed sequence tags. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10145-10649.

<110> Bayer AG

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<120> REGULACIÓN DE LA PROTEÍNA SIMILAR AL RECEPTOR DE LA LIPOXINA A4

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<130> REG. DEL RECEPTOR HUMANO DE LA LIPOXINA A4

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<140>

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<141>

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<150> 60/189.037

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<151> 2000-03-14

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<160> 2

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<170> PatentIn Ver. 2.0

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<210> 1

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<211> 2300

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<212> ADN

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<213> Humano

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<400> 1

5

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<210> 2

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<211> 470

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<212> PRT

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<213> Humano

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<400> 2

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Claims

1. El uso de un polipéptido seleccionado entre el grupo constituido por

(i): un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos idéntica en un 90% a la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 2;

(ii): un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 2

en la selección de los compuestos útiles en el tratamiento de una enfermedad asociada con procesos inflamatorios, en el que se pone en contacto un compuesto de ensayo con el polipéptido, se mide el enlace del compuesto de ensayo con el polipéptido y se selecciona un compuesto de ensayo que enlaza con el polipéptido como un compuesto útil en el tratamiento de una enfermedad asociada con procesos inflamatorios.

2. El uso de una célula biológica que comprende un polinucleótido seleccionado entre el grupo constituido por

(i): el polinucleótido de la SEC DE ID Nº: 1

(ii): un polinucleótido que hibrida bajo condiciones de restricción con el polinucleótido de la SEC DE ID Nº: 1 y codifica un polipéptido similar al receptor de la lipoxina A4.

en la selección de los compuestos útiles en el tratamiento de una enfermedad asociada con procesos inflamatorios, en el que la célula biológica es una célula T y/o se ha transformado con dicho polinucleótido, y en el que se pone en contacto un compuesto de ensayo con la célula biológica, se mide la cantidad de ARNm transcrito o el polipéptido expresado mediante dicho polinucleótido y se selecciona un compuesto de ensayo que altera la cantidad de ARNm transcrito o el polipéptido expresado mediante dicho polinucleótido como un compuesto útil en el tratamiento de una enfermedad asociada con procesos inflamatorios.