ES2240774T3

ES2240774T3 - Eurotinona y sus derivados, procedimiento para su fabricacion y uso de los mismos.

Info

Publication number: ES2240774T3
Application number: ES02751052T
Authority: ES
Inventors: Claudia Eder; Herbert Kogler; Luigi Toti
Original assignee: Aventis Pharma Deutschland GmbH
Current assignee: Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Priority date: 2001-06-27
Filing date: 2002-06-20
Publication date: 2005-10-16
Anticipated expiration: 2022-06-20
Also published as: EP1404663B1; US20030125375A1; PE20030154A1; DE10130890A1; ATE294788T1; AR036110A1; JP4109625B2; DK1404663T3; PT1404663E; CA2451230C; JP2005503363A; EP1404663A1; AU2002352606B2; IL159561A0; CA2451230A1; IL159561A; US6818667B2; DE50203014D1; MXPA03011608A; WO2003002549A1

Abstract

Compuesto de la fórmula general I en la que R(1), R(2), R(3) y R(4) significan, independientemente entre sí, hidrógeno, alquilo (C1-C6), alquenilo (C2-C6), alquinilo (C2-C6); cicloalquilo C3-C6 o alquil (C1-C3)-cicloalquilo (C3-C6), restos alquilo que eventualmente pueden estar sustituidos con uno o varios restos, en todas sus formas estereoquímicas y mezclas de estas formas en cualquier proporción, así como sus sales fisiológicamente tolerables.

Description

Eurotinona y sus derivados, procedimiento para su fabricación y uso de los mismos.

La presente invención se refiere a nuevos compuestos de la fórmula general I

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en la que R(1), R(2), R(3) y R(4) representan, independientemente entre sí, hidrógeno o un resto alquilo. Los compuestos de fórmula I son inhibidores de la KDR-quinasa y, a causa de su acción antiangiogenética, son adecuados para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades malignas. Los compuestos de fórmula I son obtenibles mediante fermentación del microorganismo Eurotium echinulatum Delacroix (DSM 13872) o por derivatización química de los compuestos obtenidos por la fermentación del microorganismo citado. La invención se refiere por tanto también a un procedimiento para la preparación de los compuestos de fórmula I, a la utilización de los compuestos de fórmula I para la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades malignas y de enfermedades que se pueden tratar inhibiendo la KDR-quinasa, así como a preparados farmacéuticos que contienen como mínimo un compuesto de la fórmula I.

El cáncer es una enfermedad del hombre y de los animales, con desenlace mortal en la mayoría de los casos, que está causada por el crecimiento descontrolado de células del cuerpo. Cáncer es la expresión de la formación de nódulos malignos (malignomas), de neoplasmas (tumores o carcinomas) o de la degeneración maligna así como de la perturbación de la maduración de células blancas (leucemia, cáncer de la sangre). Las células cancerosas o tumorales se forman por transformación de células del cuerpo. La malignidad de las células cancerosas se expresa en la autonomía del crecimiento, esto es, en su capacidad de crecer sin impedimento y desordenadamente fuera del plan de desarrollo de los órganos, infiltrándose. Una señal segura de la malignidad es la formación de colonias (metástasis) alejadas del tumor después de una invasión hematógena o linfógena de células tumorales. El cáncer es una de las causas más frecuentes de la muerte del hombre y, por tanto, existe una gran necesidad de métodos y medios para la curación o el tratamiento de degeneraciones malignas.

La posibilidad de una terapia de tumores malignos comprende, junto a la extirpación -si es posible, radical- del tumor, la terapia radiológica con rayos X, radiación \alpha, \beta, \gamma, la inmunoterapia y la quimioterapia. La inmunoterapia es por ahora sólo aplicable de forma limitada. Por quimioterapia de tumores se entiende la administración de venenos de las células (citostáticos) para el tratamiento de tumores y de células tumorales que quedan después de un tratamiento quirúrgico o radiológico tópico. Estas sustancias atacan específicamente determinados procesos de la división celular, de manera que reaccionan más sensiblemente los tejidos con una proporción alta de células que se dividen, como los tejidos tumorales que crecen rápidamente. Se usan al efecto compuestos de alquilación como, por ejemplo, ciclofosfamida (The Merck Index, 12ª edic., pág. 463), antimetabolitos como el metotrexato (The Merck Index, 12ª ed., página 1025), alcaloides como vincristina (The Merck Index, 12ª ed., página 1704) y antibióticos como daunomicina (The Merck Index, 12ª ed., página 479) sí como adriamicina (The Merck Index, 12ª ed., páginas 581-582). Todos estos agentes tienen grandes inconvenientes debido a sus masivos efectos secundarios, por lo que con ellos se demora la muerte del enfermo, pero no se evita. Además, en células degeneradas (cancerosas) se presentan resistencias frente a los agentes aplicados, por lo que los medicamentos actuales no actúan citostáticamente, sino como tóxicos a causa de los efectos secundarios. Ha de decirse al respecto, que se ha visto que una aplicación combinada o secuencial de citostáticos supera la eficacia de un citostático individual (monoterapia) y por ello es posible en la poliquimioterapia no sumar los considerables efectos secundarios. Por esta razón, se necesitan urgentemente nuevos agentes quimioterapéuticos, cuya búsqueda es universal.

El crecimiento de tumores supone un suministro suficiente de oxígeno al tumor, que sólo está garantizado por un riego sanguíneo suficiente (vascularización) del tumor. Los tumores no son capaces de formar nuevos vasos sanguíneos (=angiogénesis), sino que deben ocasionar la angiogénesis del tejido conjuntivo del entorno.

La formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de un sistema vascular ya existente tiene una importancia central para el desarrollo embrionario y el desarrollo de órganos. Una angiogénesis anormal incrementada se observa, entre otras dolencias, en la artritis reumatoide, la retinopatía diabética y el crecimiento de tumores (Folkman 1995, Nat. Med., 1, 27-31). La angiogénesis es un proceso complejo de etapas múltiples que incluye activación, migración, proliferación y supervivencia de células endoteliales.

En combinación con otros sistemas de señalización específicos del endotelio, los denominados factores del crecimiento endotelial vascular (VEGFRs) presentan señales para la migración celular endotelial, proliferación y supervivencia de las células. La familia de VEGFR comprende los subtipos VEGFR-1 (Flt-1), VEGFR-2 (KDR) y VEGFR-3 (Flt-4). Mientras que VEGFR-1 y VEGFR-2 actúan como reguladores universales de células endoteliales, el VEGFR-3 controla principalmente el crecimiento del sistema vascular linfático. Los VEGFR juegan un papel clave en tales etapas del proceso angiogenético.

Estudios extensivos en el campo de la angiogénesis tumoral durante los últimos 20 años han descrito un gran número de potenciales dianas terapéuticas, por ejemplo quinasas, proteasas e integrina. Esto condujo al descubrimiento de nuevos agentes antiangiogenéticos, de los que algunos están ya en fase de ensayos clínicos (Jekunen y otros, 1997, Cancer Treatment Rev., 23, 263-286). Los inhibidores de la angiogénesis podrían utilizarse tanto para la monoterapia como también la terapia de combinación con otros citostáticos en el marco de un tratamiento quimioterapéutico de tumores. Además, puede pensarse en el uso para la prevención de un renovado crecimiento de un tumor después de haber realizado la terapia.

La inhibición, o la regulación, de VEGFR-2 (KDR) es un mecanismo de reacción que ofrece un nuevo enfoque para el tratamiento de una multiplicidad de tumores sólidos. Así, la activación de este receptor de tirosinaquinasa es decisiva para el crecimiento celular endotelial y la nueva formación de vasos en la angiogénesis y, por ello, tiene influencia sobre el crecimiento tumoral y la formación de matástasis. Además, hay nuevos datos en cuanto a que la expresión de VEGF contribuye a la supervivencia de células tumorales después de terapia radiactiva o quimioterapia (Lee, C.G., Heijn, M. y otros, 2000, Cancer Research, 60 (19), 5565-70). Esto subraya la importancia de un posible efecto sinérgico de inhibidores de KDR con los citostáticos conocidos hasta ahora.

Se ha encontrado, sorprendentemente, que el microorganismo Eurotium echinulatum Delacroix (DSM 13872) es capaz de formar una sustancia activa que presenta una acusada acción inhibidora sobre la KDR-quinasa y, por ello, representa un eficaz inhibidor de la angiogénesis. El nuevo compuesto se denominará eurotinona en lo que sigue, y es, junto con derivados de eurotinona, objeto de la invención.

La presente invención se refiere, por tanto, a compuestos de la fórmula general I

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en la que

R(1), R(2), R(3) y R(4) representan, independientemente entre sí, en cada caso, hidrógeno o alquilo (C_{1}-C_{6}), alquenilo (C_{2}-C_{6}), alquinilo (C_{2}-C_{6}), cicloalquilo (C_{3}-C_{6}) o alquil (C_{1}-C_{3})-cicloalquilo (C_{3}-C_{6}), en todas sus formas estereoquímicas y mezclas de estas formas en cualquier proporción, así como sus sales fisiológicamente tolerables.

Alquilo C_{1}-C_{6} puede significar alquilo de cadena lineal o ramificada con 1 a 6 átomos de C como, por ejemplo, metilo, etilo, i-propilo, t-butilo y hexilo;

alquenilo C_{2}-C_{6} puede significar alquenilo de cadena lineal o ramificada con 2 a 6 átomos de C como, por ejemplo, alilo, crotilo o pentenilo;

alquinilo C_{2}-C_{6} puede significar alquinilo de cadena lineal o ramificada con 2 a 6 átomos de C como, por ejemplo, propinilo, butinilo y pentinilo.

Son ejemplos de cicloalquilo (C_{3}-C_{6}) ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo o ciclohexilo.

Los mencionados restos alquilo pueden estar sustituidos con uno o más restos. Éstos pueden ser, por ejemplo, halógeno como cloro, bromo, flúor; hidroxi; alcoxi con 1 a 4 átomos de C, en especial metoxi, y/o trifluoro-metilo.

Preferiblemente, en la fórmula I, R(1) a R(4) representan, cada uno de ellos independientemente, hidrógeno o alquilo (C_{1}-C_{6}).

Son especialmente preferidos compuestos de la fórmula I en los que

(a) R(1) a R(4) son hidrógeno (=eurotinona);

(b) R(1) a R(3) son hidrógeno y R(4) es alquilo (C_{1}-C_{6}), en especial, metilo;

(c) R(1), R(2) son hidrógeno y R(3), R(4) son alquilo (C_{1}-C_{6}), en especial metilo; en todas sus formas estereoquímicas y mezclas de estas formas en cualquier proporción, así como sus sales fisiológicamente tolerables.

La invención concierne, por tanto, en especial a la eurotinona de fórmula

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así como a sus sales fisiológicamente tolerables.

La invención concierne también a la 2,12-dimetileurotinona de la fórmula

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y la 2-metileurotinona de fórmula

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así como sus sales fisiológicamente tolerables.

De acuerdo con la invención, los compuestos de la fórmula I son obtenibles por fermentación del microorganismo Eurotium echinulatum Delacroix (DSM 13872) o sus variantes o mutantes en condiciones adecuadas. Por aislamiento posterior de los compuestos y eventual conversión en derivados químicos, así como sus sales fisiológicamente tolerables, se obtienen las eurotinonas.

La invención se refiere, además, a un procedimiento para la preparación de un compuesto de fórmula I, caracterizado porque se hace fermentar el microorganismo Eurotium echinulatum Delacroix (DSM 13872) o sus variantes o mutantes en condiciones adecuadas en un medio de cultivo, hasta que la eurotinona se acumula en el medio de cultivo o en el microorganismo, y seguidamente se aísla del medio de cultivo o el microorganismo y, eventualmente, se convierte en derivados químicos y/ sales fisiológicamente tolerables.

En la bibliografía se describen muchas reacciones para la alquilación de fenoles. La alquilación de los grupos OH fenólicos de los presentes compuestos puede, por tanto, realizarse conforme a reacciones químicas en sí conocidas. Por ejemplo, una derivatización a los derivados alquilados de la eurotinona puede realizarse, por ejemplo, por reacción con halogenuros alquílicos tales como bromuros de alquilo o yoduros de alquilo, ésteres de ácidos alquilsulfónicos tales como mesilatos, tosilatos o triflatos, así como diazoalcanos como diazometileno o trimetilsilil-diazometano.

En lo que sigue se describirá detalladamente la invención, en especial en sus formas de realización preferentes.

Las eurotinonas de acuerdo con la invención se producen mediante el hongo Eurotium echinulatum, preferentemente mediante Eurotium echinulatum Delacroix DSM 13872.

El hongo Eurotium posee un micelio sustrato amarillo/pardo y poco micelio aéreo. Forma en cultivo los cuerpos fructíferos característicos de Eurotium, los peritecios. Las ascosporas son bolas esféricas aplanadas. Tienen una típica armila ecuatorial. El hongo es ubicuo y prefiere ambientes secos. Como sinónimo se usa también la designación Aspergillus echinulatus.

Se depositó en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) (Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos de Células), Mascheroder Weg 1B, 38124 Braunschweig, Alemania, de conformidad con las reglas del Tratado de Budapest de 15.11.2000, un aislado de Eurotium echinulatus Delacroix, bajo el siguiente número: DSM 13872.

En un medio de cultivo sólido o líquido que contiene una fuente de carbono y una fuente de nitrógeno así como las sales inorgánicas corrientes, Eurotium echinulatum Delacroix DSM 13872 produce la eurotinona conforme a la invención.

En vez de la cepa Eurotium echinulatum Delacroix DSM 13872 pueden emplearse también sus mutantes y variantes, que sintetizan igualmente la eurotinona de acuerdo con la invención.

Tales mutantes pueden generarse de forma en sí conocida por medios físicos, por ejemplo irradiación con rayos ultravioleta o rayos X, o por mutágenos químicos como, por ejemplo, metanosulfonato de etilo (EMS), 2-hidroxi-4-metoxi-benzo-fenona (MOB) o N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG), o por aplicación de métodos de ingeniería genética.

Las condiciones de fermentación que se describen seguidamente son válidas para Eurotium echinulatum, el aislado de Eurotium echinulatium Delacroix DSM 13872 depositado, así como para sus mutantes y variantes.

El procedimiento de acuerdo con la invención puede utilizarse para la fermentación a escala de laboratorio (en el intervalo de mililitros a litros) y a escala industrial (escala de metros cúbicos). Todos los porcentajes son en peso a no ser que se indique lo contrario. Las proporciones de mezcla en líquidos se refieren al volumen si no se hace cualquier indicación diferente.

El procedimiento conforme a la invención abarca el cultivo de Eurotium echinulatum Delacroix, DSM 13872, sus mutantes y/o variantes en condiciones aeróbicas en un medio de cultivo que contiene una fuente de carbono y una fuente de nitrógeno, sales inorgánicas y, eventualmente, oligoelementos. La cepa Eurotium echinulatum Delacroix DSM 13872 forma la eurotinona en soluciones nutrientes que contienen glucosa, almidón, copos de avena o glicerina.

Como fuentes preferentes de carbono para la fermentación son adecuados hidratos de carbono y alcoholes de azúcares asimilables, como glucosa, lactosa, sacarosa o d-manitol, así como productos naturales que contienen hidratos de carbono como, por ejemplo, extracto de malta o extracto de levadura. Como sustancias nutrientes que contienen nitrógeno se consideran: aminoácidos, péptidos y proteínas, así como sus productos de degradación, como caseína, peptona o triptona, además de extractos de carne, extractos de levadura, semillas molidas, por ejemplo de maíz, trigo, habas, soja o del algodón, residuos de destilación de la obtención de alcoholes, harinas de carne o extractos de levaduras, pero también sales amónicas y nitratos, pero en especial también péptidos obtenidos por vía sintética o biosintética. Como sales inorgánicas, la solución nutriente puede contener, por ejemplo, cloruros, carbonatos, sulfatos o fosfatos de metales alcalinos o alcalinotérreos, hierro, zinc, cobalto y manganeso.

La formación de la eurotinona de acuerdo con la invención se desarrolla especialmente bien, por ejemplo, en una solución nutriente que contiene aproximadamente 0,05 a 5%, preferiblemente 1 a 2% de extracto de malta, aproximadamente 0,05 a 3%, preferiblemente 0,05 a 1% de extracto de levadura y 0,2 a 5%, preferiblemente 0,5 a 2% de glucosa, 0,5 a 3%, preferiblemente 1,5 a 3% de copos de avena. Los porcentajes se refieren en cada caso al peso de la totalidad de la solución nutriente.

El cultivo del microorganismo se efectúa aeróbicamente, por ejemplo sumergido, con sacudidas o agitación en matraces de sacudida, o en fermentadores o sobre un medio sólido, eventualmente con aportación de aire u oxígeno. Se puede efectuar en un intervalo de temperaturas de aproximadamente 15 a 35ºC, preferentemente a aproximadamente 20 hasta 35ºC, en especial a 25-30ºC. El intervalo de pH debería estar entre 3 y 10, preferiblemente entre 6,5 y 7,5. Por lo general, en estas condiciones se cultiva el microorganismo en un período de tiempo de 48 a 720 horas, preferiblemente de 72 a 720 horas. Es ventajoso el cultivo en varias etapas, esto es, se producen primeramente uno o varios precultivos en un medio nutriente líquido, que luego se inocula en el medio de producción propiamente dicho, el cultivo principal, por ejemplo en una proporción en volumen de 1:10-1:100. El cultivo previo se obtiene, por ejemplo, sobreinoculando el micelio en una solución nutriente y dejando crecer durante aproximadamente 20 a 120 horas, preferiblemente 48 a 72 horas. El micelio se puede obtener, por ejemplo, dejando crecer la cepa durante aproximadamente 1 a 40 días, preferiblemente durante 15 a 20 días, en un medio nutriente sólido o líquido, por ejemplo levadura-malta-agar, copos de avena-agar o dextrosa de patata-agar.

El hongo Eurotium echinulatum Delacroix DSM 13782 puede formar el compuesto eurotinona en un cultivo superficial o fijo sobre medios nutrientes sólidos. Los medios nutrientes sólidos se obtienen añadiendo, por ejemplo, agar o gelatina a medios nutrientes acuosos. Sin embargo, también es posible obtener la eurotinona por fermentación del hongo Eurotium echinulatum Delacroix, DSM 13872, por el procedimiento de inmersión, esto es, en suspensión acuosa. La eurotinona puede presentarse tanto en el micelio como en el filtrado del cultivo, usualmente la mayor cantidad se encuentra en el filtrado del cultivo. Si se trata de un cultivo en medio líquido, entonces primeramente se separa el micelio del caldo de cultivo por el procedimiento habitual y, seguidamente, se extrae la eurotinona de la masa celular con un disolvente orgánico, eventualmente miscible con agua. La fase del disolvente orgánico contiene el producto natural de acuerdo con la invención, eventualmente, se concentra en vacío y se purifica como se describe más adelante.

El filtrado del cultivo se combina en algunos casos con el concentrado del extracto de micelio y se somete a extracción con un disolvente orgánico adecuado, no miscible con agua, por ejemplo, con n-butanol. La fase orgánica separada se concentra a continuación eventualmente en vacío. Se prefiere separar directamente por cromatografía el filtrado del cultivo, como se describe posteriormente.

De manera conveniente se liofiliza primeramente el cultivo superficial y, seguidamente, se somete a extracción con metanol o 2-propanol, pero pueden utilizarse también otros disolventes. Posteriormente se liofiliza el extracto obtenido.

La posterior purificación de la eurotinona de acuerdo con la invención se realiza por cromatografía en materiales adecuados, por ejemplo en tamices moleculares, en soportes de fase normales como, por ejemplo, gel de sílice, óxido de aluminio, en intercambiadores de iones, pero preferentemente en resinas adsorbentes y en fases invertidas (RP). La eurotinona se aísla con ayuda de esta cromatografía. La cromatografía se realiza con soluciones acuosas tamponadas o mezclas de soluciones acuosas y orgánicas.

Por mezclas de soluciones acuosas u orgánicas se entienden todos los disolventes orgánicos mezclables con agua, preferentemente metanol, 2-propanol y acetonitrilo, en una concentración de 10 a 80% de disolvente, preferiblemente de 15 a 55% de disolvente, y también todas las soluciones acuosas tamponadas que son mezclables con los disolventes orgánicos.

Por soluciones acuosas tamponadas o acidificadas se entiende, por ejemplo, agua, tampón de fosfato, acetato amónico, tampón de citrato en una concentración de 1 mM a 0,5 M, así como ácido fórmico, ácido acético, ácido trifluoroacético o todos los ácidos comercialmente corrientes, conocidos por los expertos, preferiblemente en una concentración de 0,01 a 3%, en especial de 0,1%.

Se cromatografía con un gradiente que comienza con 100% de tampón acuoso y finaliza con 100% de disolvente, preferiblemente 2-propanol o acetonitrilo. Para purificar la eurotinona de acuerdo con la invención, preferiblemente se trabaja con un gradiente lineal de 10 a 60% de acetonitrilo en solución acuosa tamponada.

La eurotinona y sus derivados químicos de fórmula I pueden convertirse en las correspondientes sales fisiológicamente tolerables por métodos conocidos por los expertos.

Por sales fisiológicamente tolerables de los compuestos de las fórmulas I y II se entienden tanto sus sales orgánicas como inorgánicas según se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences (17ª edición, página 1418 (1985)). A causa de su estabilidad física y química y de su solubilidad, para grupos ácidos se prefieren, entre otras, sales sódicas, potásicas, cálcicas y amónicas; para grupos de caráceter básico, se prefieren, entre otras, sales de los ácidos clorhídrico, sulfúrico, fosfórico, o los ácidos carboxílicos o sulfónicos como, por ejemplo, ácido acético, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico y ácido p-toluenosulfónico.

La presente invención abarca todas las formas estereoisómeras de los compuestos de fórmula I. Los centros de asimetría contenidos en los compuestos de la fórmula I pueden presentar, todos independientemente entre sí, la configuración S o la configuración R. A la invención pertenecen todos los posibles enantiómeros o diastereómeros, así como mezclas de dos o más formas estereoisómeras, por ejemplo mezclas de enantiómeros y/o diastereómeros, en todas las proporciones. Son objeto de la invención, por tanto, los enantiómeros en forma enantioméricamente pura, antípodas tanto levógiros como dextrógiros, con configuraciones R y S, en forma de modificación racémica y en forma de mezclas de los dos enantiómeros en todas las proporciones. Cuando se presenta una isomería cis/trans, son objeto de la invención tanto la forma cis como también la forma trans y mezclas de estas formas en todas proporciones.

Ensayos para la determinación de las actividades biológicas de eurotinonas

El receptor KDR de la tirosina-quinasa representa la diana de ensayo. El KDR juega un papel clave en el crecimiento del endotelio y en la angiogénesis y, por ello, participa también en la formación de tumores. Así, el KDR es una molécula diana terapéuticamente importante para las enfermedades cancerosas y otras enfermedades proliferativas. En el ensayo se mide la actividad de la KDR-quinasa basándose en la fosforilación de un sustrato peptídico específico. Junto a la actividad inhibidora sobre las quinasas citadas, la eurotinona inhibe también otras quinasas que participan asimismo en la generación de cáncer o en la cascada de inflamación.

En razón a sus valiosas propiedades farmacológicas, los compuestos de acuerdo con la invención son apropiados para su aplicación específica como medicamentos en medicina humana y veterinaria. Los compuestos de acuerdo con la invención pueden utilizarse en enfermedades cancerosas, en especial como agentes quimioterapéuticos. A causa de sus propiedades antiangiogenéticas y de la actividad antitumoral ligada a ellas, pueden emplearse especialmente como agentes frente a la degeneración maligna tanto en el hombre como en animales.

Además, es previsible una utilización preventiva para impedir un crecimiento renovado de un tumor después de efectuada la terapia. Las eurotinonas de fórmula I de acuerdo con la invención pueden usarse tanto en monoterapia como en terapia de combinación con otros citostáticos en el marco de un tratamiento quimioterapéutico de tumores. A causa de los diferentes puntos de ataque de los citostáticos e inhibidores de la angiogénesis, la terapia de combinación puede conducir a un efecto sinérgico de los inhibidores de KDR con los citostáticos conocidos hasta ahora.

La invención concierne también a preparados farmacéuticos que contienen una o varias de las eurotinonas de fórmula I de acuerdo con la invención, así como, eventualmente, eventualmente, también un citostático como sustancia activa adicional. Se prefiere la utilización en mezclas con adecuados coadyuvantes o vehículos. Como vehículos pueden utilizarse en el hombre todos los vehículos y/o coadyuvantes fisiológicamente tolerables.

La invención se refiera también a un procedimiento para la preparación de un medicamento de acuerdo con la invención, caracterizado porque contiene en una forma de administración adecuada como mínimo uno de los compuestos de acuerdo con la invención con un vehículo farmacéutica y fisiológicamente adecuado y, en su caso, otras sustancias activas, aditivos o coadyuvantes.

Por lo general, los medicamentos de acuerdo con la invención se administran por vía oral, local o parenteral, aunque en principio también es posible una administración rectal. Son formas sólidas o líquidas adecuadas de preparados galénicos, por ejemplo, granulados, polvos, comprimidos, grageas, (micro)cápsulas, supositorios, jarabes, emulsiones, suspensiones, aerosoles, gotas o soluciones inyectables en ampollas, así como preparados con liberación retardada del principio activo, en cuya preparación se emplean habitualmente vehículos y aditivos y/o coadyuvantes tales como dispersivos, aglomerantes, agentes de revestimiento, agentes de expansión, agentes de deslizamiento o lubricantes, saboreadores, edulcorantes o agentes solubilizantes. Como vehículos o coadyuvantes frecuentemente utilizados se citan, por ejemplo, carbonato magnésico, dióxido de titanio, lactosa, manitol y otros azúcares, talco, albúmina, gelatina, almidón, vitaminas, celulosa y sus derivados, aceites animales o vegetales, poletilenglicoles y disolventes tales como, por ejemplo, agua esterilizada, alcoholes, glicerina y alcoholes polivalentes.

Eventualmente pueden microencapsularse las unidades de dosificación para administración oral, con el fin de demorar el suministro o alargar la liberación en el tiempo como, por ejemplo, revistiendo la sustancia activa, o incrustándola en forma de partículas en polímeros adecuados, ceras o similares.

Preferentemente, los preparados farmacéuticos se producen y administran en unidades de dosificación, conteniendo cada unidad, como componente activo, una dosis determinada de uno o varios compuestos de las eurotinonas de fórmula I de acuerdo con la invención. En el caso de unidades de dosificación sólidas tales como comprimidos, cápsulas y supositorios, esta dosis puede ser de hasta aproximadamente 500 mg, pero con preferencia aproximadamente 0,1 a 200 mg, y para soluciones inyectables en forma de ampollas, la dosis puede ser de hasta aproximadamente 500 mg, pero preferiblemente de aproximadamente 0,1 a 100 mg, por día.

La dosis a administrar diariamente depende del peso corporal, la edad, el sexo y el estado del paciente. En ciertas circunstancias, sin embargo, pueden administrarse también dosis más altas o más bajas. La administración de la dosis diaria puede hacerse tanto en forma de una sola toma de la unidad de dosificación como de varias unidades de dosis más pequeñas, pero también en varias tomas de dosis divididas a determinados intervalos.

La invención se ilustra con los Ejemplos que siguen. Los porcentajes son en peso. Las proporciones de las mezclas, cuando se trata de líquidos, se refieren a volúmenes si no se indica lo contrario.

Ejemplos Ejemplo 1 Preparación de un cultivo en glicerina de Eurotium echinulatum Delacroix DSM 13872

30 ml de una solución nutriente (extracto de malta 2,0%, extracto de levadura 0,2%, glucosa 1,0%, (NH_{4})_{2}HPO_{4} 0,05%, pH 6,0) en un matraz erlenmeyer estéril de 100 ml se inoculan con la cepa Eurotium echinulatum Delacroix, DSM 13872, y se incuba durante 6 días a 25ºC y 140 rpm en una máquina de sacudidas rotatoria. Seguidamente se diluyen 1,5 ml de este cultivo con 2,5 ml de glicerina al 80% y se almacenan a -135ºC.

Ejemplo 2 Preparación en un matraz erlenmeyer de un precultivo de Eurotium echinulatum Delacroix DSM 13872

100 ml de una solución nutriente (extracto de malta 2,0%, extracto de levadura 0,2%, glucosa 1,0%, (NH_{4})_{2}HPO_{4} 0,05%, pH 6,0) en un matraz erlenmeyer estéril de 300 ml se inoculan con la cepa Eurotium echinulatum Delacroix DSM 13872 y se incuba durante 7 días a 25ºC y 140 rpm en una máquina de sacudidas rotatoria. Se utilizan 2 ml de este precultivo para la preparación de los cultivos principales.

Ejemplo 3 Preparación de un cultivo principal de Eurotium echinulatum Delacroix, DSM 13872, en placas en medio sólido

Sobre 30 placas estériles de 25 x 25 cm se vierten 200 ml de la siguiente solución nutriente: 20 g/l de extracto de malta, 20 g/l de copos de avena, 2% de agar, pH 7,0. Estas placas se inoculan con 2 ml de un precultivo y se incuban a 25ºC. La producción máxima de la eurotinona de acuerdo con la invención se alcanza después de aproximadamente 360 horas.

Ejemplo 4 Preparación de un cultivo principal líquido de Eurotium echinulatum, Delacroix DSM, 13872

Un matraz erlenmeyer estéril de 300 ml con 100 ml de la siguiente solución nutriente, extracto de malta 2,0%, extracto de levadura 0,2%, glucosa 1,0%, (NH_{4})_{2}PO_{4} 0,05%, pH 6, se inocula con un cultivo crecido en un tubito inclinado (con igual solución nutriente, pero con 2% de agar) o con 2 ml de un precultivo (véase el Ejemplo 2) y se incuba en una máquina de sacudidas a 140 rpm y 25ºC. La producción máxima de la eurotinona de acuerdo con la invención se alcanza después de aproximadamente 360 horas. Para inocular de 10 a 200 l de fermentadores basta un cultivo sumergido con una vida de 96 a 144 horas (cantidad para inocular aproximadamente 10%) de la misma solución nutriente. Las condiciones para estos fermentadores son:

Temperatura: 25ºC

Velocidad de agitación: 200 rpm

Aireación: 15 l min^{-1}.

La formación de espuma puede deprimirse añadiendo repetidamente solución etanólica de poliol. El máximo de producción se alcanza después de aproximadamente 96 a 144 horas.

Ejemplo 5 Aislamiento de la eurotinona de una fermentación en medio sólido

Se liofilizaron 150 placas con medio sólido incubadas según el Ejemplo 3 y seguidamente el liofilizado se sometió a extracción con metanol (20-30 l). El extracto metanólico se redujo a un volumen de 10 l en vacío y se diluyó con agua a un contenido de metanol de 10%. El extracto diluido se llevó seguidamente a una columna de vidrio preparada (BPG 100, volumen interior de 4 l, de la firma Pharmacia Biotech) que estaba llena con aproximadamente 2 litros del material MCl-Gel® CHP-20 P (resina adsorbente de la firma Mitsubishi Chemicals, Japón). Se eluyó con un gradiente de 100% de agua a 100% de alcohol isopropílico. El caudal de paso de la columna (1 litro/6 min) se recogió fraccionadamente (cada fracción, 1 l). Todas las fracciones se ensayaron según las pruebas de KDR y se combinaron las fracciones activas (fracciones 6-14). Éstas se redujeron en vacío a un volumen de aproximadamente 10 l y esta solución se diluyó de nuevo con agua hasta un contenido de 10% de la solución de partida. La solución resultante se llevó nuevamente a una columna (véase lo indicado antes) que estaba llena con aproximadamente 1,5 litros del material MCl-Gel® CHP-20P. Se eluyó con un gradiente de 100% de agua a 100% de acetonitrilo. El caudal de paso de la columna (1 l/6 min) se recogió fraccionadamente (cada fracción, 1 l) y se combinaron nuevamente las fracciones activas en el ensayo (fracciones 4-11). Por concentración en vacío y posterior liofilización se obtuvieron aproximadamente 16 g de un polvo pardo.

Ejemplo 6 Purificación de la eurotinona por cromatografía

Se cargaron aproximadamente 2 g del polvo obtenido según el Ejemplo 5 en una columna LUNA® 10\mu C18 (2) (tamaño: 50 mm x 250 mm, de la firma Phenomenex, Alemania) con una columna previa LUNA® 10\mu C18 (2) (tamaño: 21,2 mm x 60 mm) y se cromatografió con un gradiente de 10% hasta 40% de acetonitrilo en agua con 0,1% de acetato amónico durante 40 minutos. El caudal del eluyente era de 125 ml/min, el tamaño de la fracción 125 ml. La eurotinona se encontraba en las fracciones 14 y 15. La liofilización de las fracciones mencionadas dió aproximadamente 320 mg de eurotinona enriquecida. Una etapa posterior de purificación mediante HPLC en la misma columna RP-18 se realizó con un gradiente de 20% a 30% en 30 minutos. Se combinaron las fracciones que contenían eurotinona, se eliminaron las sales y se liofilizaron. Se obtuvieron así 210 mg de eurotinona (Compuesto 1) (pureza > 95%). También aquí se sometieron al ensayo de actividad biológica todas las fracciones de cada una de las etapas de separación.

Ejemplo 7 Metilación de la eurotinona

Se disolvieron en MeOH (5 ml) 35 mg (=0,12 mmol) de la eurotinona obtenida de conformidad con el Ejemplo 6 y se mezclaron con trimetilsilildiazometano en un exceso 6 veces molar. La mezcla de reacción se agitó durante 30 minutos a temperatura ambiente y seguidamente se concentró a sequedad. La mezcla obtenida se separó cromatográficamente en una columna LUNA® 5 \mu C18 (2) (tamaño: 10 mm x 250 mm). Se eluyó con un gradiente de 20% hacia 60% de acetonitrilo en agua, al que se había añadido 0,1% de acetato amónico, durante 50 min a un caudal de 6,5 ml/min. El caudal de paso de la columna se recogió fraccionadamente (cada fracción, 6,5 ml). Las fracciones 19-22 contenían 7,5 mg del derivado dimetílico, 2,12-dimetileurotinona (Compuesto 2) y las fracciones 23-25 contenían 6 mg del derivado monometílico, 2-metileurotinona (Compuesto 3).

Ejemplo 8 Caracterización de la eurotinona (Compuesto 1)

Las propiedades físicoquímicas así como espectroscópicas de la eurotinona pueden compendiarse como sigue:

Fórmula elemental: C_{15}H_{12}O_{6}

Fórmula estructural:

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6

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Peso molecular: 288

Máximos en UV: 200, 262, 330 nm

RMN ^{1}H y RMN ^{13}C: véase la Tabla 1.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1 RMN, desplazamientos químicos de la eurotinona, c = 4,5 mg/ml, DMSO-d_{6} a 300 K

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7

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Ejemplo 9

Caracterización de la 2,12-dimetileurotinona (Compuesto 2)

Las propiedades fisicoquímicas así como espectroscópicas de la 2,12-dimetileurotinona pueden compendiarse como sigue:

Fórmula elemental: C_{17}H_{16}O_{6}

Fórmula estructural:

8

Peso molecular: 316

Máximos de UV: 200, 262, 330 nm

RMN ^{1}H y RMN ^{13}C: véase la Tabla 2.

TABLA 2 RMN, desplazamientos químicos de la 2,12-dimetileurotinona, c = 2,5 mg/ml, DMSO-d_{6} a 300 K

9

Ejemplo 10 Caracterización de la 2-metileurotinona (Compuesto 3)

Fórmula elemental: C_{16}H_{14}O_{6}

Fórmula estructural:

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10

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Peso molecular: 302

Máximos de UV: 200, 262, 330 nm

RMN ^{1}H y RMN ^{13}C: véase la Tabla 3.

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(Tabla pasa a páginma siguiente)

TABLA 3 RMN, desplazamientos químicos de la 2-metileurotinona, c = 2,5 mg/ml, DMSO d_{6} a 300 K

11

Ejemplo 11 Determinación de la actividad de la KDR-quinasa

Para la determinación de la KDR-quinasa se trata una enzima purificada en placas de microtitulación, de 384 pocillos (placas rápidas revestidas NEN Life Science). Los actividades de las enzimas se determinaron mediante la fosforilación de un sustrato peptídico específico. Se aporta a las tandas de ensayo con pipeta una serie de dilución previamente preparada de las eurotinonas con concentraciones de 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125, 1,5625, 0,7813, 0,3906, 0,195, 0,094, 0,047 y 0 \muM, secuencialmente en el orden de la serie. Seguidamente se añade la mezcla de reacción (ATP marcado radiactivamente, solución tampón de pH 7,4 y soluciones de enzimas) y se incuba durante 1 h a temperatura ambiente.

Descripción de los ensayos de KDR Material y métodos

Placas: placas rápidas de 384 pocillos de NEN Life Science.

Lector: Contador Wallac MicroBeta Trilux

Reactivos:

Sustrato peptídico: PLC\gamma1

Enzima: KDR-quinasa (receptor VEGF)

Tampón quinasa:

MOPS 50 mM, pH 7,4, MgCl_{2} 10 mM, DTT 2 mM, EDTA 2,5 mM, \beta-glicerolfosfato 10 mM, ortovanadato 1 mM y fluoruro de sodio 1 mM.

Solución para revestimientos:

20 \mug/ml de sustrato peptídico en tampón PBS (exento de Mg^{2+}, exento de Ca^{2+}).

Solución de ATP: 25\muCi/ml de ^{33}P-\gamma-ATP y ATP 12,5 \muM frío

Solución de enzima KDR: 3,5 \mug/ml en tampón quinasa.

Solución de lavado: PBS (exento de Mg^{2+}, exento de Ca^{2+}).

Placas rápidas de 384 pocillos se revistieron a 4ºC durante la noche con 60 \mul (1,2 \mug/pocillo) del sustrato peptídico y se lavaron 3 veces, en cada caso con 80 \mul de PBS. Las placas revestidas de esta manera pueden almacenarse durante un tiempo corto a 4ºC y durante un período de tiempo más prolongado a -20ºC.

Reacción: en un volumen final de 50 \mul, la prueba contiene 10 \mul de solución diluida de eurotinona, 20 \mul de solución de enzima de una concentración de 3,5 \mug/ml (70 ng/pocillo), 20 \mul de solución de ATP (concentración final 0,5 \muCi de ATP caliente/pocillo y 5 \muM de ATP frío/pocillo). La mezcla de reacción se deja en reposo durante 1 hora a temperatura ambiente. Seguidamente se lavan las placas 3 veces, en cada caso con 75 \mul de solución de lavado y se mide la radiactividad con un contador MicroBeta (Wallac) durante 30 segundos.

Todas las muestras se ensayan por duplicado a una concentración final de 1:30. En cada placa se emplean 16 pocillos para comprobar la actividad enzimática total (=controles enzimáticos). Otros 16 pocillos se revisten con 4 \mug/pocillo de caseína sin sustrato para ensayar la inhibición no específica.

La actividad de la KDR-quinasa se mide mediante la incorporación de fosfato radiactivo en el sustrato de ATP y a partir de ella se calcula el efecto inhibidor de la eurotinona (IC_{50}).

La inhibición se calcula como:

[1-(prueba CPM-CPM no específica)/(enzima CPM-control-CPM no específica)] x 100 (%)

Valores IC_{50} [\muM]:
Eurotinona (Compuesto 1):	22
2,12-dimetileurotinona (Compuesto 2)	155
2-metileurotinona (Compuesto 3)	18

Claims

1. Compuesto de la fórmula general I

12

en la que R(1), R(2), R(3) y R(4) significan, independientemente entre sí, hidrógeno, alquilo (C_{1}-C_{6}), alquenilo (C_{2}-C_{6}), alquinilo (C_{2}-C_{6});

cicloalquilo C_{3}-C_{6} o alquil (C_{1}-C_{3})-cicloalquilo (C_{3}-C_{6}), restos alquilo que eventualmente pueden estar sustituidos con uno o varios restos,

en todas sus formas estereoquímicas y mezclas de estas formas en cualquier proporción, así como sus sales fisiológicamente tolerables.

2. Compuesto de la fórmula I de acuerdo con la reivindicación 1, en la que R(1), R(2), R(3) y R(4) significan, independientemente entre sí, hidrógeno o alquilo (C_{1}-C_{6}),

3. Compuesto de la fórmula I de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 2, en la que R(1), R(2), R(3) y R(4), significan, independientemente entre sí, hidrógeno o metilo, así como sus sales fisiológicamente tolerables.

4. Compuesto de la fórmula I de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 3, en la que R(1), R(2), R(3) y R(4) significan hidrógeno,

así como sus sales fisiológicamente tolerables.

5. Compuesto de la fórmula

13

así como sus sales fisiológicamente tolerables.

6. Compuesto de la fórmula

14

así como sus sales fisiológicamente tolerables.

7. Compuesto de la fórmula I o una de sus sales fisiológicamente tolerables de acuerdo con una o varias de la reivindicaciones 1 - 6, que se puede preparar mediante fermentación del microorganismo Eurotium echinulatum Delacroix (DSM 13782) o una de sus variantes o mutantes en condiciones adecuadas en un medio de cultivo, hasta que se acumulen uno o varios compuestos de la fórmula I y, seguidamente, éstos se aíslan del medio de cultivo y, eventualmente, se convierten en un derivado de la fórmula I o en sales fisiológicamente tolerables.

8. Procedimiento para la preparación de un compuesto de la fórmula I o una de sus sales fisiológicamente tolerables de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 1 - 6, caracterizado porque se fermenta el microorganismo Eurotium echinulatum Delacroix (DSM 13872) o una de sus variantes o mutantes en condiciones adecuadas en un medio de cultivo hasta que se acumulen uno o varios compuestos de la fórmula I en el medio de cultivo y, eventualmente, se aíslan del medio de cultivo y, en algunos casos, se convierten en un derivado de la fórmula I o en sales fisiológicamente tolerables.

9. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizado porque la fermentación se realiza en condiciones aeróbicas a una temperatura entre 20 y 35ºC y a un pH entre 6,5 y 7,5.

10. Eurotium echinulatum Delacroix (DSM 13872).

11. Compuesto de la fórmula I o una de sus sales fisiológicamente tolerables de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 1 - 6 para su utilización como medicamento.

12. Compuesto de la fórmula I o una de sus sales fisiológicamente tolerables de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 1 - 6 para su utilización como medicamento para la inhibición de la KDR-quinasa.

13. Compuesto de la fórmula I o una de sus sales fisiológicamente tolerables de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 1 - 6 para su utilización como medicamento para la inhibición de la angiogénesis.

14. Preparado farmacéutico con un contenido de al menos un compuesto de la fórmula I o una de sus sales fisiológicamente tolerable de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 1 - 6.

15. Preparado farmacéutico de acuerdo con la reivindicación 14, que además contiene un citostático.

16. Procedimiento para la producción de preparados farmacéuticos de acuerdo con la reivindicación 14, caracterizado porque se incorpora al menos un compuesto de la fórmula I o una de sus sales fisiológicamente tolerables de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 1 - 6, junto con coadyuvantes y/o vehículos, en una forma de administración adecuada.

17. Preparado farmacéutico de acuerdo con las reivindicaciones 14 y 15 para su aplicación para el tratamiento de enfermedades malignas.

18. Uso de Eurotium echinulatum Delacroix (DSM 13782) para la obtención de inhibidores de KDR-quinasa.