ES2199367T3

ES2199367T3 - Utilizacion de sangre autogena modificada para el tratamiento de enfermedades autoinmunes.

Info

Publication number: ES2199367T3
Application number: ES97935400T
Authority: ES
Inventors: Anthony E. Bolton
Original assignee: Vasogen Ireland Ltd
Current assignee: Vasogen Ireland Ltd
Priority date: 1996-08-22
Filing date: 1997-08-11
Publication date: 2004-02-16
Anticipated expiration: 2017-08-11
Also published as: WO1998007436A1; CA2263911C; DE69721006T2; JP2000517302A; ATE237339T1; AU3844297A; EP0920322A1; PT920322E; DK0920322T3; US5980954A; JP3883013B2; DE69721006D1; US6569467B1; CA2263911A1; AU724265B2; EP0920322B9; NZ334635A; EP0920322B1

Abstract

SE PROPORCIONA UNA VACUNA AUTOINMUNE PARA ADMINISTRACION A PACIENTES HUMANOS, A FIN DE ALIVIAR LOS SINTOMAS DE ENFERMEDADES AUTOINMUNES TALES COMO LA ARTRITIS REUMATOIDE. LA VACUNA COMPRENDE UNA ALICUOTA DE LA SANGRE DEL PACIENTE, QUE CONTIENE, INTER ALIA, LEUCOCITOS CON EXPRESION REGULADA AL ALZA DE DIVERSOS MARCADORES DE LA SUPERFICIE CELULAR Y LINFOCITOS QUE CONTIENEN CANTIDADES REDUCIDAS DE DETERMINADAS PROTEINAS DEL ESTRES. SE PRODUCE SOMETIENDO EXTRACORPOREAMENTE LA ALICUOTA DE SANGRE A CIERTOS ESTRESANTES, CONCRETAMENTE AGENTES OXIDANTES, RADIACION UV Y TEMPERATURA ELEVADA.

Description

Utilización de sangre autógena modificada para el tratamiento de enfermedades autoinmunes.

Ámbito de la invención

La presente invención se refiere a vacunas, su preparación y utilización en tratamientos médicos. Más particularmente, se refiere a tratamientos para mitigar las enfermedades autoinmunes y sus síntomas, a una vacuna de utilidad al respecto, así como a procesos para preparar y utilizar dicha vacuna.

Antecedentes de la invención

Las enfermedades autoinmunes incluyen la artritis reumatoide, la enfermedad injerto-contra-huésped, el lupus eritomatoso sistémico (LES), la esclerodermia, la esclerosis múltiple, la diabetes, la enfermedad intestinal inflamatoria, la psoriasis y otras afecciones. El rechazo del órgano transplantado es también un proceso que tiene semejanzas patológicas con la enfermedad autoinmune. Las enfermedades autoinmunes se pueden dividir en dos tipos generales, es decir: enfermedades autoinmunes del tejido conjuntivo (cuyos ejemplos son la artritis, el lupus y la esclerodermia), y las insuficiencias de órganos específicos (como por ejemplo la esclerosis múltiple y la diabetes).

En términos generales, un sistema inmune que funciona normalmente distingue entre los antígenos de organismos exteriores, invasores (no propios) y tejidos naturales de su propio cuerpo (propios), proporcionando una defensa contra los organismos extraños. Por consiguiente, lo fundamental para el funcionamiento correcto del sistema inmune es la capacidad del sistema para discriminar entre propio y no propio. Cuando el sistema inmune de un paciente no discrimina entre propio y no propio y empieza a reaccionar contra antígenos propios, entonces se produce un trastorno autoinmune.

Las causas responsables de la reacción del sistema inmune de una persona afectada contra sí mismo no se entienden del todo y se han apuntado diversas teorías diferentes. La respuesta inmune a un antígeno es activada por la interacción del antígeno con receptores de especificidad predeterminada en ciertos linfocitos. Se cree que, en una etapa inicial en el desarrollo del sistema inmune, los linfocitos con receptores que reconocen los antígenos propios son reconocidos y eliminados del sistema corporal por un proceso de eliminación. Alternativamente, o además, dichos linfocitos auto reactivos pueden ser controlados suprimiendo sus actividades. Probablemente se producen ambos mecanismos.

El sistema inmune de personas normales sanas puede identificar y reaccionar contra una familia de proteínas altamente conservada en la naturaleza (es decir que tienen una estructura similar en todos los organismos vivos). Esta familia de proteínas recibe el nombre de proteínas de estrés o de choque térmico (HSP), y se agrupan según sus pesos moleculares aproximados. Entre los miembros de la familia HSP, se encuentra el grupo HSP60 y, entre otros, unas proteínas cuyos pesos moleculares están comprendidos entre 50 y 100 kilodaltons. El aumento en la producción de HSP se identificó primero con una respuesta al estrés térmico, aunque esto parece ahora ser parte de una respuesta general a una variedad de estrés celular. Los HSP están normalmente situados en el interior de células y su función parece ser la estabilización de la estructura de diversas proteínas en células estresadas, con el objeto de proteger la célula de los efectos desnaturalizadores de la proteína de varios factores estresantes. Sin embargo, es probable que los HSP tengan otras muchas funciones que en la actualidad no se comprenden del todo. Las proteínas de choque térmico HSP, se tratan de forma bastante detallada en un artículo del "Scientific American", mayo de 1993, página 56, de William J. Welch (Investigación y Ciencia, julio de 1993, página 22).

Un grupo de la familia de los HSP, el grupo HSP 60 contiene proteínas que muestran aproximadamente una identidad del 50% entre las células bacterianas y las células humanas. La infección con bacterias que contienen HSP 65 tiene como resultado una respuesta inmune, en personas sanas, contra el HSP 65 bacteriano, que se traduce en la producción de anticuerpos anti-HSP65. Por consiguiente, un sistema inmune sano parece estar en condiciones de identificar y reaccionar contra antígenos parecidos a los propios (self-like).

En algunas patologías, por ejemplo en muchas enfermedades autoinmunes, como la artritis reumatoide y la esclerodermia, los pacientes también muestran la presencia de anticuerpos HSP65. En el pasado, las conclusiones que se extraían era que las enfermedades autoinmunes eran el resultado de infección bacteriana. En la actualidad, parece probable que las enfermedades autoinmunes se pueden asociar, por lo menos en algunos casos, con un control inadecuado de la respuesta autoinmune. En otras palabras, es posible que los anticuerpos de HSP65 sean el resultado de una reacción autoinmune iniciada contra HSPs del mismo cuerpo, pero que ha sido controlada indebidamente. En estos casos, per consiguiente, debería ser posible controlar una respuesta autoinmune inadecuada, estimulando el mecanismo de control inmunitario natural del cuerpo, utilizando un método particular y específico de vacuna.

Para estimular la respuesta inmune del cuerpo, se requiere una vacuna que permita, una vez inyectada en el cuerpo anfitrión, al sistema inmune anfitrión presentar los antígenos contenidos en la vacuna a las células del sistema inmune anfitrión. La presentación de antígenos se realiza por medio de células que presentan antígenos.

Una vacuna para tratar las enfermedades autoinmunes deberá contener antígenos o fragmentos de los mismos (péptidos) que activen los mecanismos de control inmunitario del cuerpo. Además, los antígenos (péptidos) deberán estar presentes en una forma que pueda ser reconocida por el sistema inmune anfitrión, cuando se introduce la vacuna en el anfitrión. Algunos de los antígenos pueden estar presentes en células intactas. El objetivo de dicha vacuna es activar las rutas inmunes reguladoras, particularmente aquellas que controlan las respuestas autoinmunes, reduciendo por lo tanto la respuesta autoinmune.

Los antígenos particulares que activarán los mecanismos de control de un sistema autoinmune de mamífero no se entienden del todo. Se reconoce sin embargo que pueden incluir antígenos derivados de linfocitos receptores, que pueden funcionar para estimular mecanismos de control, para inhibir aquellos linfocitos que causan respuestas patológicas autoinmunes en el paciente. También pueden incluir HSPs, como el grupo HSP 60 de proteínas, y moléculas de superficie de leucocito, como aquellas del Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC), inclusive moléculas MHC de clase 1 y clase 2. Las moléculas de MHC de clase 2 funcionan fisiológicamente para presentar péptidos a las células que presentan antígenos, como parte de la respuesta inmune.

Es importante que los linfocito - receptores y otras moléculas derivadas de célula para la vacunación de un paciente con enfermedad autoinmune sean derivados de células obtenidas del mismo paciente, ya que este sistema contendrá la especificidad autoinmune requerida para estimular una respuesta inmune reguladora. Los receptores en otros leucocitos en la sangre pueden ser, alternativa o adicionalmente, importantes en el proceso de vacunación propuesto. La utilización de un sistema de este tipo como base de una vacuna puede considerarse como análoga a la utilización de un antígeno viral particular como vacuna para tratar y prevenir la enfermedad causada por dicho virus. Una vacuna para tratar una enfermedad autoinmune deberá prepararse por lo tanto a partir de una muestra de la propia sangre del paciente. Dicha vacuna puede recibir el nombre de autovacuna.

Para que los antígenos sean eficaces en la estimulación (o inhibición) del sistema inmunitario, los antígenos deberán presentarse a células inmunes del sistema anfitrión por medio de células presentadoras de antígenos, naturalmente presentes en el cuerpo.

Muchas de las células que presentan antígenos son fagocitos, que se adhieren a los antígenos, los tragan por fagocitosis y los rompen o procesan. La preparación de una autovacuna de este tipo deberá incluir un proceso, en el que los linfocitos y otros leucocitos en la vacuna, que pueden ser una fuente de antígenos, se encuentran en una forma en la que existe la probabilidad de que puedan ser fagocitados por células fagocíticas que presentan antígenos, en cuanto se reinyectan en el paciente, de forma que los antígenos o residuos eficaces de los mismos se presentan en la superficie de una célula que presenta antígenos. Pueden efectuar entonces un mecanismo de control sobre el sistema inmune, inhibidor o estimulador.

Durante el período de crecimiento normal de un cuerpo mamífero, los tejidos se reorganizan, eliminándose zonas de las células. Esto se realiza al sufrir las células un proceso denominado muerte celular programada o apoptosis, desintegrándose las células apópticas, que son fagocitadas sin liberar sus contenidos.

La patente US 4.968.483 Mueller et al describe un aparato para oxigenar la sangre, tratando una parte de sangre de un paciente, extracorporalmente, con una mezcla de oxígeno / ozono y luz ultravioleta, a una temperatura controlada. El aparato se propone para utilizarlo en la terapia de oxidación hematológica.

La patente US 5.052.382 Wainwright describe un aparato para la generación controlada y la administración de ozono. El aparato incluye un generador para generar ozono, un monitor para controlar la producción de ozono, un dispositivo de dosificación para proporcionar una cantidad predeterminada de administración de ozono, y un dispositivo de control informático para controlar el funcionamiento del aparato. La patente indica además que la administración de ozono a pacientes ya se conoce para el tratamiento de infecciones virales o bacterianas, así como para el tratamiento de llagas y heridas externas.

Resumen de la invención

Uno de los objetos de la presente invención es ofrecer una autovacuna nueva, que resulte útil para mitigar los síntomas de por lo menos una enfermedad autoinmune.

Otro de los objetos de la presente invención es presentar un proceso nuevo para la preparación de dicha autovacuna.

Otro objeto más específico de la presente invención consiste en ofrecer un tratamiento nuevo para mitigar los síntomas de por lo menos una enfermedad autoinmune en un paciente humano que la padece.

Por consiguiente, la presente invención ofrece, en un primer aspecto, una autovacuna para el tratamiento de una enfermedad autoinmune en un paciente mamífero, y derivada de una parte de la propia sangre del paciente autoinmune. La autovacuna se caracteriza por la presencia en la misma, en comparación con la sangre no tratada de la circulación del paciente autoinmune, de por lo menos una de las siguientes características distintivas:

- mayor número de linfocitos que presentan una vacuolación intracelular condensada, apop-aumentada, según se puede apreciar en microscopia electrónica y una topografía superficial anormalmente lisa, según se puede ver por microscopia de barrido;

- una liberación de proteínas específicas de la superficie celular de los leucocitos de la sangre, que incluyen la molécula HLA-DR MHC Clase II, con el resultado de una reducción en el número de células que expresan dichas proteínas superficiales;

- un aumento en la expresión de ciertos marcadores de superficie celular, por ejemplo CD-11 b, un componente del ligando para la molécula de adhesión celular ICAM-1;

- una menor capacidad de los linfocitos para proliferar en respuesta a estímulos exógenos;

- menor capacidad de los neutrófilos para fagocitar y recibir la respuesta oxidativa brusca.

Hay un aumento en el número de linfocitos morfológicamente alterados y otros leucocitos en la autovacuna según la invención. Estas células pueden ser fagocitadas preferentemente al reinyectar en el cuerpo anfitrión.

Existe cierto número de tipos diferentes de células fagocíticas, por ejemplo en el cuerpo de un mamífero, inclusive varias células y neutrófilos, que presentan antígeno. Con el fin de facilitar la fagocitosis por células que presentan antígenos, y no por otros fagocitos, los linfocitos y otros leucocitos presentes en la autovacuna de la invención se tratan de forma que pueden interactuar de preferencia con células fagocíticas que presentan antígenos. Las células se adhieren entre sí mediante ciertos mecanismos que incluyen la expresión de moléculas de adhesión celular. Las moléculas de adhesión celular, presentes en un tipo de célula, interactúan con ligandos específicos de moléculas de adhesión particulares presentes en el tipo de célula adhesiva. La presente invención puede dar como resultado una interacción preferencial de células en la autovacuna, con células que presentan antígenos en el cuerpo anfitrión, aumentando, en la superficie de las células en la autovacuna, la expresión del ligando para las moléculas de adhesión que se encuentran en las células que presentan antígenos en el cuerpo anfitrión. Las células que presentan antígenos expresan un número de moléculas de adhesión celular, inclusive ICAM-1, uno de los ligandos para los cuales está CD-11b. Una forma de que el proceso de la invención pueda cambiar la fagocitosis preferencial de las células alteradas morfológicamente consiste en aumentar las moléculas de adhesión que incluyen CD-11b.

La preparación de la autovacuna según la presente invención comprende la extracción, del paciente que padece una enfermedad autoinmune, de una parte de sangre de un volumen aproximado de 0,01 ml a 400 ml, y la puesta en contacto de la parte de sangre, extracorporalmente, con una cantidad eficaz, estimulante del sistema inmune, de gas ozono y radiación ultravioleta. La cantidad de sangre extraída del paciente tiene una o más características que la caracterizan como sangre de un paciente que tiene un estado autoinmune, y la distingue de la sangre de personas sanas, normales y de la sangre de pacientes que padecen otras anomalías y estados patológicos. Estas características pueden ser una tasa de sedimentación de eritrocitos aumentada, un nivel mayor de factor reumatoide, un mayor nivel de proteína reactiva C, la presencia de anticuerpos para HSP 65, y combinaciones de dos o más de estos factores. Se conocen otros factores característicos de un estado específico autoinmune y, por consiguiente, presentes en la sangre de las personas que padecen dicho estado, que constituyen la base de las pruebas normalizadas de diagnóstico de la sangre para el estado específico.

El tratamiento para mitigar los síntomas de por lo menos una enfermedad autoinmune en un paciente humano que la padece, de acuerdo con la presente invención, comprende la extracción, de una parte de sangre del paciente, de un volumen aproximado de 0,001 a 400 ml, la puesta en contacto de la parte de sangre, extracorporalmente, con una cantidad, estimulante del sistema inmune, de gas ozono y radiación ultravioleta, seguido de la administración de la parte de sangre tratada al paciente humano.

Breve referencia a las figuras

La figura 1 adjunta es una presentación gráfica de los resultados del ejemplo 2 indicado a continuación.

Descripción de las realizaciones preferidas

Cuando se inyecta la autovacuna según la presente invención en el paciente autoinmune, se experimenta una notable mitigación del estado autoinmune del paciente, tal como se expone en las realizaciones específicas de la invención que se describe a continuación. En la actualidad, no se entiende del todo exactamente cómo funciona la vacuna tras esta reinyección. Se ofrecen las siguientes explicaciones, a modo de intento, para una mejor y más completa descripción de la invención, aunque no se tienen que considerar vinculantes o limitadoras.

Las células T, que son un tipo de linfocito y que desempeñan una función importante en el control del sistema inmune, incluyen las células CD-8, que se pueden subdividir en células supresoras y células citóxicas; y las células CD-4 conocidas también como linfocitos T cooperadores, que se pueden subdividir además en células TH1 y TH2. Las células TH1 secretan citocinas proinflamatorias, como interferones gamma. Las células TH2 son consideradas como células reguladoras y secretan citocinas reguladoras, como interleucina-4. En una persona normal, sana, la relación entre las células TH1 y las células TH2 es de aproximadamente 3:1. En condiciones autoinmunes, existe por lo general un desequilibrio de los tipos de célula TH, a menudo con un incremento de las células TH1 comparado con el de las células TH2, es decir que se produce un cambio en la relación entre las mismas, con el consiguiente desarrollo de un estado inflamatorio, frecuentemente observado en la enfermedad autoinmune. Un número de componentes de la autovacuna de la presente invención, inclusive HSP60 perdida desde dentro de los linfocitos al plasma, HLA-DR y/o otros antígenos MHC liberados de las superficies de la célula del leucocito y quizás también la expresión aumentada del marcador de superficie celular B7.2, puede conducir a un incremento en, o a un aumento de las células TH2 o a una disminución en las células TH1 en la sangre del paciente. Esto traslada el equilibrio hacia el aumento de la secreción de citocinas reguladoras, y/o el aumento de las células supresoras para estimular una ruta inhibidora para la enfermedad autoinmune y mitigar e incluso desconectar la ruta de respuesta autoinmune.

Se suele aceptar también que, mientras algunas personas pueden tener poblaciones notables de células T autoreactivas, en pacientes con enfermedad autoinmune esto es una característica en el control de estas células autoreactivas y es parcialmente responsable de la enfermedad autoinmune. La capacidad del paciente que padece una enfermedad autoinmune para regular estas células T autoreactivas queda comprometida. La autovacuna de la invención restablece el sistema a un estado inmune normal.

La autovacuna se prepara exponiendo la parte de sangre a por lo menos un factor estresante, en cantidades controladas, eligiéndose el factor estresante entre agentes de oxidación, como el ozono, la radiación ultravioleta y una temperatura elevada, y una combinación de dos o más de estos factores estresantes. La parte de sangre resultante, tras este tratamiento, sirve de autovacuna y se puede reinyectar en el paciente autoinmune. Tras una tanda de estos tratamientos, se reducen notablemente los signos y síntomas de la persona que padece una enfermedad autoinmune, como la artritis reumatoide, la esclerodermia y similares. Los informes subjetivos de mitigación de síntomas de artritis reumatoide coinciden con las medidas objetivas de las tasas de sedimentación relativa de eritrocitos, una prueba objetiva aceptada como significativa en la medida de la progresión de una enfermedad autoinmune como la artritis reumatoide, por el American College of Rheumatology.

Al preparar la autovacuna según la invención, modificando una parte de sangre extraída del paciente, que tiene características derivadas del estado autoinmune del paciente, se estresan las células sanguíneas. Esto afecta a las proteínas de choque térmico, HSP, contenidas en la célula. Se reducen los niveles HSP-60 en las células mononucleares y se incrementan en el plasma. Además el nivel de HSP-72, presente en las células mononucleares, se reduce. Asimismo, como resultado del proceso de la invención, ciertas proteínas superficiales (membrana) en los linfocitos, por ejemplo HLA-DR, son reducidas, mientras que otras, como CD-3, no cambian o incluso otras, como CD-11b, en neutrófilos, aumentan. Por consiguiente, no es, al parecer, un cambio de membrana no específico lo que se produce, ni una destrucción celular. Se trata de un proceso activo complejo.

La visualización microscópica de la autovacuna según la presente invención muestra unas células con características superficiales alteradas y un mayor grado de vacuolación intracelular. Esto sugiere la presencia, en la autovacuna, de números mayores de células alteradas morfológicamente, que pueden ser fagocitadas preferentemente al realizarse la reinyección, para una presentación adecuada de los antígenos de la enfermedad autoinmune.

En una autovacuna no acorde con la presente invención, el número de células mononucleares o leucocitos que muestran la presencia de HSP-60 en las mismas, se reduce, al igual que ocurre con la cantidad de HSP-60 en cada célula, si se compara con la sangre periférica normal, no tratada, del paciente original. Mientras el paciente tiene normalmente un 30% aproximadamente de células mononucleares, con presencia de HSP-60 en las mismas (medido por citometría de flujo intracelular de toda la sangre), la autovacuna sólo tiene 12-20%. En estudios experimentales, se ha comprobado que el número se reduce de 29,3% a 15,5%, que es la media de seis pruebas.

De preferencia también, el número de leucocitos que presentan HSP-72, que es aproximadamente un 50% en la sangre no tratada del paciente original, se reduce a 25-35% en una autovacuna no perteneciente a la presente invención. En estudios experimentales, este número de HSP-72 se redujo de 49,4% en sangre no tratada a 30,2% en la autovacuna, promedio de 6 pruebas, medidas de forma similar.

El número de células que expresan la proteína específica superficial celular HLA-DR, en la autovacuna preferida de la presente invención, se reduce si se compara con la sangre no tratada del paciente, posiblemente como resultado de su liberación de la superficie celular. Por lo general, el número de células que expresa HLA-DR se reduce desde aproximadamente 23% a aproximadamente 8-12%, medido por citrometría de flujo sanguíneo total. En estudios experimentales, esta cifra se redujo de 23,3% a 10,3%, promedio de 5 experimentos.

El aumento del marcador superficial CD-11b en la autovacuna preferida de la presente invención se puede expresar como un aumento del porcentaje de neutrófilos en la autovacuna, cuya prueba de CD-11b es positiva, comparado con la sangre original del paciente. Por lo general, el aumento es de aproximadamente 10% hasta 70-95% aproximadamente. En estudios experimentales, se obtuvo un aumento de 10,3% a 84%, promedio de seis pruebas.

Una característica notable de la presente invención consiste en que el origen de la sangre, a partir de la cual se prepara la autovacuna para un paciente específico que padece una enfermedad autoinmune es el mismo paciente. La sangre del paciente tiene características derivadas de la enfermedad autoinmune. Los antígenos que constituyen la base de la autovacuna tienen su origen en la propia sangre del paciente. No se añade ningún antígeno extraño; los antígenos eficaces están presentes en la sangre del paciente, y/o han sido liberados, modificados por el proceso de preparación de la autovacuna utilizando la propia sangre del paciente como material original. Además, en muchos casos, parece ser irrelevante cuál es la enfermedad autoinmune precisa que padece el paciente. Los antígenos para la autovacuna de la enfermedad están presentes en, o son desarrollados por el tratamiento de, la sangre del propio paciente.

De preferencia, los factores estresantes a los que se someten los leucocitos en la parte de sangre extraída son el estrés térmico (temperatura de la sangre por encima de la temperatura del cuerpo), entorno oxidativo, como por ejemplo una mezcla de ozono y oxígeno borboteado a través de la parte de sangre, y radiación ultravioleta, simultánea o sucesivamente, aunque de preferencia, de forma simultánea.

La presente invención ofrece un método para mitigar los síntomas de una enfermedad autoinmune en un ser humano, que comprende:

(a): poner en contacto aproximadamente 0,01 ml a aproximadamente 400 ml de sangre con una cantidad eficaz modificadora del sistema inmune, de gas ozono y radiación ultravioleta; y

(b): administrar la sangre tratada en la etapa (a) a un ser humano.

Por lo general, se puede tratar según la invención entre 0,01 ml aproximadamente y 400 ml aproximadamente de sangre. Las cantidades preferidas oscilan entre 0,1 ml y 200 ml aproximadamente. Todavía mejor, la parte para el tratamiento tiene un volumen comprendido entre 0,1 y 100 ml, de preferencia 1 y 50 ml y todavía mejor de 5 a 15 ml. El método óptimo consiste en tratar una parte de aproximadamente 10 ml de sangre con gas ozono y radiación ultravioleta y volver a administrar la sangre tratada al paciente por inyección intramuscular.

Como se ha indicado, se prefiere, según la invención, aplicar los tres factores estresantes antes citados de forma simultánea a la parte bajo tratamiento. Habrá que tener cuidado de no utilizar un nivel excesivo de los factores estresantes, hasta el punto de que se puedan desorganizar las membranas celulares de los leucocitos.

El factor estresante "temperatura" tiene que mantener la parte en fase líquida, es decir entre 0°C y 56°C aproximadamente y no deberá calentar por encima de 55°C. Se puede utilizar cualquier fuente de calor conocida en el estado de la técnica para calentar la sangre, de preferencia una o más lámparas infrarrojas. De preferencia, el factor estresante "temperatura" calienta la parte que se está tratando hasta una temperatura por encima de la temperatura normal del cuerpo, es decir, hasta aproximadamente 37-55°C, y todavía mejor 37-43°C aproximadamente, por ejemplo 42,5°C aproximadamente. De preferencia, la temperatura de la parte de sangre se mantiene a este nivel elevado durante el tratamiento con UV/ozono. Alternativamente, la muestra de sangre se calienta mientras se somete a radiación UV, hasta que la sangre alcanza una temperatura predeterminada (de preferencia aproximadamente 42,5°C), en cuyo punto se empieza a borbotear gas ozono a través de la sangre. El tratamiento concurrente UV/ozono se mantiene entonces durante un período de tiempo determinado, de preferencia aproximadamente 3 minutos.

Otro método alternativo supone someter la sangre a UV/ozono mientras se calienta hasta a una temperatura predeterminada (de preferencia 42,5°C aproximadamente), finalizando entonces el tratamiento una vez alcanza la temperatura predeterminada o continuando el tratamiento UV/ozono durante otro período de tiempo, de preferencia, aproximadamente 3 minutos.

La aplicación de los factores estresantes oxidativos supone, de preferencia, exponer la parte a una mezcla de oxígeno de calidad médica y gas ozono, todavía mejor haciendo borbotear a través de la parte, a la temperatura antes citada, la corriente de gas oxígeno de calidad médica que contiene ozono en cantidad reducida. El gas ozono puede ser proporcionado por una fuente convencional en el estado de la técnica. La corriente de gas tiene convenientemente un contenido de ozono entre 1,0 y 100 \mug/ml, de preferencia 3-70 \mug/ml y todavía mejor 5-50 \mug/ml, aproximadamente. La corriente de gas se lleva a la parte, a una velocidad de aproximadamente 0,1 - 2,0 litros por minuto, de preferencia 0,1-1,0 litros por minuto y todavía mejor 0,18 litros por minutos aproximadamente (STP).

El factor estresante "radiación ultravioleta" se aplica convenientemente irradiando la parte bajo tratamiento desde una fuente adecuada de radiación UV, mientras se mantiene la parte a la temperatura antes citada y se va haciendo borbotear a través de la parte la mezcla gaseosa de oxígeno/ozono. La radiación ultravioleta puede ser proporcionada por cualquier fuente convencional conocida en el estado de la técnica, por ejemplo una pluralidad de lámparas ultravioletas de baja presión. El método de la invención utiliza, de preferencia, una fuente UV-C standard de radiación ultravioleta, es decir unas lámparas UV, que emiten en la longitud de ondas de banda C, es decir a longitudes de onda inferiores a 280 nm aproximadamente. También se puede utilizar radiación ultravioleta correspondiente a fuentes UV-A y
UV-B standard. Se utilizan, de preferencia, lámparas ultravioletas de baja presión que generan un espectro de líneas, en el que por lo menos el 90% de la radiación tiene una longitud aproximada de 253,7 nm. Se obtiene una dosificación apropiada de esta radiación UV, aplicada simultáneamente con los factores estresantes antes citados de temperatura y entorno oxidativo, a partir de lámparas con una potencia de salida de aproximadamente 15 a 25 vatios, a la longitud de onda UV elegida, dispuestas para rodear el contenedor de muestras que sujeta la parte, proporcionando cada lámpara una intensidad, a una distancia de un metro, de aproximadamente 45-65 mW/cm^{2}. Se pueden utilizar ventajosamente varias de estas lámparas que rodean la botella de muestra, con una potencia combinada de salida a 253,7 nm de 15-25 vatios, a una intensidad máxima. En la superficie incidente de la sangre, la energía UV suministrada es de 0,2-0,25 julios por cm^{2}. Este tratamiento proporciona una parte de sangre modificada adecuadamente según la invención, para crear la autovacuna descrita anteriormente, lista para reinyectar al paciente.

El tiempo durante el cual la parte se somete a los factores estresantes puede ser de unos pocos segundos, hasta aproximadamente 60 minutos. Por lo general, entre 0,5 y 60 minutos aproximadamente. Esto depende, en alguna medida, de la intensidad elegida de la radiación UV, la temperatura y la concentración así como la velocidad a la que se suministra a la parte el agente oxidante. Cuanto más intensos son los factores estresantes aplicados a la parte, más corto es, por lo general, el tiempo durante el cual se tienen que aplicar. Podrá ser necesario realizar algún experimento para establecer los tiempos óptimos por parte del operario, una vez que se han fijado los niveles de los demás factores estresantes. En condiciones muy estresantes, los tiempos preferidos oscilarán entre aproximadamente 0,5 y 10 minutos, de preferencia 2 a 5 minutos y normalmente, en torno a 3 minutos. La temperatura inicial de la sangre y la velocidad a la que se puede calentar o enfriar, hasta llegar a una temperatura predeterminada, tiende a variar de un paciente a otro.

En la práctica del proceso preferido de la presente invención, la parte de sangre (o las fracciones celulares separadas de la sangre, o mezclas de las células separadas, inclusive plaquetas, estas diversas combinaciones que contienen leucocitos, junto con sangre total reciben el nombre colectivo de "parte") se puede tratar con los factores estresantes, utilizando un aparato del tipo descrito en la patente US 4.968.483 Mueller. La parte se coloca en un contenedor adecuado, estéril, transmisivo de radiación UV, que se acomoda entonces en la máquina. La temperatura de la parte se ajusta al valor predeterminado, por ejemplo 42,5°C, utilizando una fuente de calor adecuada, como por ejemplo una lámpara IR, y se conectan las lámparas UV durante un período de tiempo fijo, antes de aplicar el flujo de gas a la parte, proporcionando el estrés oxidativo, para permitir que se estabilice la salida de las lámparas UV. Entonces, se aplica a la parte la mezcla de gas oxígeno / ozono, de composición conocida y caudal controlado, durante el período predeterminado de 0,5 a 60 minutos, de preferencia 2 a 5 minutos y todavía mejor, en torno a unos 3 minutos, según se indicó anteriormente, de forma que la parte experimente los tres factores estresantes de forma simultánea. De este modo, la parte de sangre queda adecuadamente modificada para producir una autovacuna según la presente invención, suficiente para lograr los efectos deseados.

El ejemplo 4, dado a continuación, confirma el hallazgo de que el método de tratamiento de la sangre según la invención tiene un efecto modificador inmune. En particular, el tratamiento de sangre con UV / ozono incrementa, según se ha podido comprobar, la expresión de los marcadores de activación sobre la superficie de los linfocitos y los monocitos (véase ejemplo 4).

Por consiguiente, la invención también ofrece un método para modificar el sistema inmune en un ser humano, poniendo en contacto aproximadamente 0,01 ml a 400 ml de sangre de un ser humano con una cantidad eficaz que modifica el sistema inmune de gas ozono y radiación ultravioleta, seguido de la administración de la sangre tratada a un ser humano. De forma similar, la invención contempla un método para tratar un trastorno del sistema inmune en un ser humano, poniendo en contacto aproximadamente 0,01 ml a 400 ml de sangre de un ser humano con una cantidad eficaz, modificadora del sistema inmune, de gas ozono y radiación ultravioleta, seguido de la administración de la sangre tratada a un ser humano.

Los trastornos del sistema inmune que se pueden tratar con este método pueden ser: estados alérgicos, estados autoinmunes e inflamatorios. Entre los trastornos del sistema inmune específicos, que se pueden tratar según la invención se encuentran: artritis reumatoide, esclerodermia, enfermedad transplante - contra - anfitrión, diabetes mellitus, rechazo de órgano, aborto, lupus eritomatoso sistémico, esclerosis múltiple, enfermedad inflamatoria del intestino, psoriasis y otros trastornos inflamatorios. Los descubrimientos de la presente invención también se pueden aplicar para tratar enfermedades autoinmunes, cuya manifestación es la esterilidad, y que incluye la endometriosis.

La invención se describe además con fines ilustrativos, con referencia a unos ejemplos específicos de uso clínico de la misma, así como a los resultados objetivos y subjetivos de dichas utilizaciones clínicas.

Ejemplo 1

Se trató, con el proceso preferido según la presente invención, a 30 pacientes con artritis reumatoide activa, 21 mujeres y 9 hombres. La edad de los pacientes oscilaba entre 26 y 72 años, siendo la media de edad de 52,2 años, al comienzo del estudio. Cada paciente recibió entre 30 y 60 tratamientos individuales (promedio de 48,3 tratamientos) durante un período de tiempo de 62 semanas (promedio 20,6 semanas). Cada tratamiento individual consistió en tomar una parte de sangre de 10 ml, tratar la parte de sangre simultáneamente con una mezcla gaseosa de oxígeno / ozono y radiación ultravioleta a temperatura elevada, utilizando un aparato descrito en la patente US antes citada 4.968.483 Mueller et al.

La composición de la mezcla de gas era de 14-15 \mug/ml de ozono / oxígeno de calidad médica. La mezcla de gas se hizo pasar por la parte, a una velocidad aproximada de 200 ml/minuto, durante un período de 3 minutos. La temperatura de la parte se mantuvo constante a 42,5°C. La radiación UV tenía una longitud de ondas de 253,7 nm.

Se realizaron medidas posteriores al tratamiento, de 1 día a 9 meses después del tratamiento final de cada paciente (promedio 12,4 semanas). Se tomaron muestras de sangre y se analizaron los leucocitos, la tasa de sedimentación de eritrocitos, el factor reumatoide y la proteína C-reactiva, utilizando procedimientos de prueba standard. La tasa de sedimentación de eritrocitos y la proteína reactiva C son elevadas en la mayoría de los estados inflamatorios, inclusive la artritis reumatoide, y el factor reumatoide es elevado en la mayoría de los casos de artritis reumatoide, así como en algunos casos de algunas otras enfermedades autoinmunes. La cifra de leucocitos, la tasa de sedimentación de eritrocitos, el factor reumatoide y la proteína C-reactiva mostraron todos ellos una notable reducción después de la tanda de tratamientos. Particularmente notable es la considerable reducción de la tasa de sedimentación de eritrocitos, indicador de mejora de la artritis reumatoide, aceptado por el American College of Rheumatology.

Además, los pacientes fueron evaluados subjetivamente por personal médico, estableciéndose la gravedad aparente de sus síntomas de artritis reumatoide antes y después de las tandas de tratamientos, estableciéndose una escala de 5 (muy mal) a 1 (excelente). Nuevamente se observó una notable mejora en cada caso.

Los resultados medios y de pruebas t asociadas, en las que se comparan niveles antes y después del tratamiento de las personas, se reflejan en la tabla siguiente.

TABLA

Medidas clínicas	Intervalos	(Promedio antes del	(Promedio posterior al	Prueba T
	normales	tratamiento \pm SD)	tratamiento \pm SD)	asociada
Evaluación del síntoma		3,9 \pm 0,9	2,6 \pm 0,6	P<0,0001
Leucocitos 10^{9}/L	4,0-10,0	11,68 \pm 2,84	8,70 \pm 1,02	P<0,0001
Tasa de sedimentación de
eritrocitos 1 hora (mm)	0-20	50,1 \pm 22,9	28,1 \pm 13,7	P<0,0001
Factor reumatoide iu	<100	117,0 \pm 76,1	91,7 \pm 67,4	P<0,02
Proteína C-reactiva mg/I	<1,0	5,28 \pm 3,62	3,73 \pm 3,44	P<0,009
SD =desviación estándar

Ejemplo comparativo 2

Se sometió a 4 pacientes con enfermedad primaria de Raynaud a una tanda de terapia según la invención, en una prueba clínica abierta, realizada en el St. Bartholomew's Hospital de Londres, en condiciones adecuadamente controladas y supervisadas.

La investigación de un componente autoinmune de la enfermedad en estos pacientes mostró niveles elevados de anticuerpos específicos de HSP-60 y HSP-65 en un paciente. Los niveles de estos anticuerpos en este paciente se muestran en la figura adjunta, en la que se puede apreciar que los niveles se redujeron notablemente tras una tanda de terapias. La primera tanda de tratamientos, señalada "1" en la figura, consistió en 9 tratamientos realizados a lo largo de 14 días. Además, los niveles de estos auto-anticuerpos empezó a aumentar nuevamente, algunas semanas después y volvieron a reducirse tras una segunda tanda de terapia. La segunda tanda de tratamiento, indicada "2" en la figura, consistió en 5 tratamientos realizados durante un período de 10 días. Estos datos sugieren que la terapia con sangre tratada según la invención, es decir la autovacuna descrita aquí, puede reducir una respuesta autoinmune, como muestra la reducción de anticuerpos HSP en un paciente tratado.

Ejemplo 3

Los subconjuntos linfocito T cooperador TH1 y TH2 se midieron en 13 controles normales de voluntarios y en dos pacientes que padecían la enfermedad autoinmune de esclerodermia. La relación TH1:TH2 en los controles, medida por citrometría de flujo de la citosina intracelular resultó ser de 3,029 +/- 0,39 (promedio +/- desviación standard). Los pacientes con esclerodermia tenían relaciones TH1:TH2 de 5,0 y 4,58 respectivamente, que indicaban muy probablemente un aumento en la población de TH1 con respecto a la población de TH2. En patologías inflamatorias, como muchas enfermedades autoinmunes, se da un incremento relativo de las células TH1; por consiguiente era de esperar que esta relación fuera mayor en estos pacientes que en las personas de control sanas.

Tras una tanda de terapia con sangre tratada según la invención (es decir la autovacuna descrita aquí), las relaciones TH1:TH2 en estos pacientes era de 3,29 y 3,13 respectivamente, es decir que la relación se acercaba al intervalo normal. Estos datos sugieren que la terapia con sangre tratada según la presente invención puede reducir una respuesta autoinmune, como lo muestra un incremento relativo de las células TH2.

Ejemplo 4 Coloración de marcadores de activación

Este ejemplo ilustra una aproximación experimental, que indica que el tratamiento de la sangre con UV/ozono según la invención tiene un efecto inmuno-estimulante sobre la sangre humana, como lo muestra el aumento en ciertos marcadores de activación en la superficie de las células mononucleares tratadas.

Se tomaron de algunas personas muestras (20 ml) de sangre periférica. Cada muestra se dividió en dos partes. La primera parte se trató según la técnica de la invención, como se indica a continuación:

La parte de 10 ml se trató in vivo durante 3 minutos con gas ozono (concentración de ozono variable de 5-50 \mug/ml) y luz ultravioleta (253,7 nm), a una temperatura de 42,5°C. Se utilizó un aparato similar al descrito en la patente US n°. 4.968.483 para realizar el tratamiento de la muestra de sangre.

La segunda parte de 10 ml de cada muestra sirvió de control no tratado.

Cada muestra de sangre se coloreó para ciertos marcadores de activación de T-linfocitos y monocitos, utilizando técnicas convencionales de anticuerpos monoclonales. La proporción de las células totales que se colorearon positivamente para los marcadores individuales se cuantificó por microscopia. Los resultados son los siguientes.

Marcador	Control	Tratado Ozono/UV
CD25 (IL-2 receptor)	1%	26%
CD2 (E-roseta receptor)	3%	33%

Los datos anteriores de este ejemplo son todos ellos medias de duplicados, e indican que el tratamiento con UV/ozono según la invención da como resultado la activación de T-linfocitos y monocitos.

Claims

1. Autovacuna para mitigar los síntomas de una enfermedad autoinmune en un paciente mamífero que padece la misma, que comprende una parte de sangre modificada del paciente que tiene una enfermedad autoinmune, parte de sangre modificada caracterizada por presentar, en comparación con una parte en volumen igual de dicha sangre no modificada del paciente, por lo menos una de las características distintivas siguientes:

(a): mayor número de leucocitos que presentan una mayor vacuolación intracelular y una topografía superficial anormalmente lisa;

(b): reducción del número de leucocitos que expresan la proteína específica de la superficie del leucocito HLA-DR MHC Clase II;

(c): expresión aumentada en leucocitos del marcador de superficie celular CD-11b;

(d): menor aptitud de proliferación de los linfocitos en respuesta a estímulos exógenos;

(e): menor aptitud de los neutrófilos de fagocitar y de recibir una respuesta oxidativa brusca.

2. La autovacuna de la reivindicación 1, donde el número de células que expresan HLA-DR es aproximadamente de 8-12%.

3. La autovacuna de la reivindicación 1 ó 2, donde el porcentaje de neutrófilos capaces de fagocitosis llega hasta 60%, y los que pueden recibir la respuesta oxidativa brusca es de hasta 40%.

4. Vacuna según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que ha sido preparada sometiendo una parte de sangre del paciente que tiene la enfermedad autoinmune, de forma extracorporal, a una cantidad, modificadora del sistema inmune, de gas ozono y radiación ultravioleta.

5. Autovacuna según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que ha sido preparada sometiendo una parte de sangre del paciente que tiene la enfermedad autoinmune, de forma extracorporal, a los efectos de hacer borbotear el gas ozono a través de la parte y someter dicha parte a radiación ultravioleta.

6. Autovacuna según la reivindicación 5, preparada sometiendo la parte de sangre a radiación ultravioleta y haciendo borbotear simultáneamente el gas ozono a través de la parte de sangre.

7. Autovacuna según la reivindicación 6, preparada por radiación simultánea con radiación ultravioleta y borboteo de una mezcla de gas ozono - oxígeno a través de la misma, a una temperatura de 37-43°C.

8. Proceso de preparación de una vacuna para administrar a un paciente mamífero que padece una enfermedad autoinmune, para mitigar los síntomas de la enfermedad autoinmune del paciente, caracterizado porque dicha vacuna se obtiene, tras extraer una parte de sangre del paciente, mediante el siguiente proceso:

Modificando la parte de sangre extraída extracorporalmente, sometiéndola a una cantidad de ozono y a radiación ultravioleta que modifica el sistema inmune, con el objeto de crear, en la parte de la sangre, en comparación con una parte en volumen igual de dicha sangre no modificada del paciente, por lo menos unas de las características distintivas siguientes:

(c): expresión aumentada en leucocitos de por lo menos un marcador de superficie celular, elegido dentro del grupo formado por CD-11b; B-7.2; y CTLA-4;

9. El proceso de la reivindicación 8, donde el tamaño de la parte es de aproximadamente 0,01-400 ml.

10. El proceso de la reivindicación 9, donde el tamaño de la parte es de aproximadamente 1-50 ml.

11. El proceso de la reivindicación 8, 9 ó 10, donde el gas ozono y la radiación ultravioleta se aplican a la parte de la sangre, de forma simultánea, a una temperatura de 37 a 55°C.

12. El proceso de la reivindicación 11, donde el ozono se administra como una corriente de gas mezclada con oxígeno de calidad médica, siendo el contenido de ozono en la misma de 1,0-100 \mug/ml, a una velocidad de 0,01-2,0 litros por minuto (STP), durante un período de 0,5-60 minutos.

13. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 8-12, donde la radiación ultravioleta es suministrada por lo menos por una lámpara ultravioleta, que emite en la longitud de ondas de banda C.

14. El proceso de la reivindicación 13, donde la radiación ultravioleta se obtiene de lámparas ultravioletas que emiten por lo menos aproximadamente el 90% de radiación ultravioleta de una longitud de onda de aproximadamente 253,7 nm.

15. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 8-14, donde la parte de sangre se trata con ozono y radiación ultravioleta, a una temperatura aproximada de 37 a 43°C, durante un período aproximado de 2 a 5 minutos, suministrándose la mezcla de ozono / oxígeno a una velocidad de 0,1-1,0 litros por minuto, con un contenido de ozono de aproximadamente 5-50 \mug/ml.

16. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 8-15, donde el paciente padece artritis.

17. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15, donde el paciente padece artritis reumatoide.

18. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15, donde el paciente padece esclerodermia.

19. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15, donde el paciente padece psoriasis.

20. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15, donde el paciente padece enfermedad inflamatoria del intestino.

21. Proceso de preparación de una autovacuna para administrar a un paciente mamífero que padece una enfermedad autoinmune, para mitigar los síntomas de la enfermedad autoinmune del paciente, caracterizado porque dicha vacuna se obtiene, después de extraer una parte de sangre del paciente, mediante el siguiente proceso.

Sometiendo la parte de sangre a una cantidad de gas ozono y de radiación ultravioleta que modifica el sistema inmune, haciendo borbotear el gas a través de la parte mientras se irradia la parte con radiación ultravioleta.

22. El proceso de la reivindicación 21, donde la parte tiene un volumen de 1-50 ml, y se somete a la acción simultánea de borboteo del gas a través de la misma y de radiación ultravioleta, mientras se mantiene a una temperatura que oscila entre 37 y 43°C aproximadamente.

23. Utilización en la preparación de una vacuna para administrar, a un paciente que padece una enfermedad autoinmune, con el objeto de aliviar los síntomas de la misma, una parte de sangre obtenida del mismo paciente, y modificada según un proceso como el indicado en cualquiera de las reivindicaciones 8-22.

24. Utilización como en la reivindicación 23, donde el paciente padece artritis.

25. Utilización como en la reivindicación 23, donde el paciente padece artritis reumatoide.

26. Utilización como en la reivindicación 23, donde el paciente padece esclerodermia.

27. Utilización como en la reivindicación 23, donde el paciente padece psoriasis.

28. Utilización como en la reivindicación 23, donde el paciente padece enfermedad inflamatoria del intestino.