DE69905602T2

DE69905602T2 - Arzneimittel zur vermeidung und umkehrung der atherosklerose bei säugetieren

Info

Publication number: DE69905602T2
Application number: DE69905602T
Authority: DE
Inventors: J. Stewart
Original assignee: Vasogen Ireland Ltd
Current assignee: Vasogen Ireland Ltd
Priority date: 1998-11-13
Filing date: 1999-11-15
Publication date: 2003-10-09
Anticipated expiration: 2019-11-16
Also published as: CN1230182C; ATE233093T1; NO20012311D0; EA200100543A1; NO20012311L; EP1128837B1; EA003421B1; CA2348599A1; CN1330549A; WO2000029003A2; AU768300B2; AU1145000A; JP2002529510A; DK1128837T3; CZ20011642A3; MXPA01004801A; WO2000029003A3; BR9915270A; ES2192885T3; DE69905602D1

Description

Diese Erfindung betrifft die Verwendung von behandeltem, modifiziertem Blut in Verbindung mit bestimmten abnormen physischen Zuständen und Erkrankungszuständen von Säugern. Genauer betrifft sie modifiziertes Säugerblut und seine Verwendung bei der Behandlung von Atherosklerose und kardiovaskulären Erkrankungen, die damit in Zusammenhang stehen oder daraus resultieren.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Atherosklerose, der Aufbau von Fettpiaqueablagerungen in den Wänden von Blutgefäßen, ist der Grund der meisten Arten von kardiovaskulären Erkrankungen. Der Hauptmechanismus, durch den Atherosklerose zu Morbidität und Mortalität führt, beruht auf der Produktion atherosklerotischer Plaques, die signifikante Gefäßverstopfung bewirken können, aber die, noch wichtiger, die Stelle der Thrombusbildung sind, was Herzanfälle und die meisten Schlaganfälle verursacht.
Die Pathogenese von Atherosklerose ist komplex und hängt zusammen mit einer Reihe von Risikofaktoren, einschließlich Hyperlipämie, Bluthochdruck, Fettleibigkeit, Rauchen, Diabetes und Streß. Hyperlipämie, wie etwa Hypercholesterinämie und erhöhte Serum-Triglyceridspiegel, sind unter den potentesten Risikofaktoren bei der Verursachung von Atherosklerose. Es ist zum Beispiel bekannt, daß hohe Spiegel von Serumcholesterin, gebunden an low-density-Lipoprotein (LDL), intermediate-density- Lipoprotein (IDL) oder very-low-density-Lipoprotein (VLDL), stark mit dem Auftreten von Atherosklerose bei Menschen korrelieren. Ebenso sind niedrige Spiegel von high- density-Lipoproteinen (HDL) ein bekannter Atherosklerose-Risikofaktor. Insbesondere glaubt man, daß es, je höher die Kreislaufspiegel von Cholesterin in Form von LDL-, IDL- und VLDL-Cholesterin sind und je höher die Kreislaufspiegel anderer Lipide, wie etwa Triglyceride, sind, umso wahrscheinlicher ist, daß Cholesterin und Lipide sich in der Blutgefäßwand ablagern und Atherosklerose bewirken oder dazu beitragen werden. Es ist jedoch wichtig anzumerken, daß weniger als 50% von Herzanfall-Patienten erhöhte Blutlipidspiegel haben, woraus geschlossen werden kann, daß andere Faktoren, einschließlich der Dysfunktion des Gefäßendothels, wichtig bei der Pathogenese von Atherosklerose sind.
Man glaubt, daß das Ausgesetztsein gegenüber diesen Risikofaktoren zu lokalisierter Schädigung an den Endothelzellen rühren kann, die Blutgefäßwände auskleiden. Endothelzellen, die einer Verletzung ausgesetzt sind, werden durch Hochregulierung von Adhäsionsmolekülen "klebrig", was bewirkt, daß Leukozyten anhaften und durch das Endothel zu den Geweben wandern, ein Prozeß, der begleitet ist von der Freisetzung von Entzündungs-Zytokinen und anderen Entzündungs-Mediatoren, die weitere Endothel-Dysfunktion hervorrufen, was das Endothel durchlässiger für die Lipidteilchen macht. Man glaubt, daß dieser Prozeß zum allmählichen Aufbau von Plaqueablagerungen in der Blutgefäßwand beiträgt, was zur Verengung des Lumens des Gefäßes, beeinträchtigtem Blutdurchfluß und Thrombusbildung führt.
Gegenwärtige Therapien für Atherosklerose bestehen hauptsächlich aus Veränderungen des Lebenswandels, einschließlich Risikofaktormodifikation, Diät (wenig Fett) und lipidsenkenden Arzneimitteln, die im Falle von sowohl hyper- als normolipiden Patienten gezeigt haben, daß sie das Auftreten anschließender kardiatischer und zerebrovaskulärer Ereignisse signifikant verringern. Ebenso haben diese Therapien gezeigt, daß sie das Fortschreiten von Atherosklerose verzögern und bis zu einem gewissen Maße die Regression der Plaques bewirken. Es ist jedoch klar, das weitere Maßnahmen, die direkt auf die Verbesserung der Endothelfunktion und/oder die Hemmung der Entzündungsprozesse, die die Erkrankung vorantreiben, die gleichwirksam oder wirksamer sein werden, erforderlich sind.
Es ist auch wichtig anzumerken, daß Plaquestabilität, beruhend auf Plaquearchitektur und Lipidgehalt sowie Qualität der Endothelfunktion, der Schlüsselfaktor bei der Bestimmung der Neigung zu Thrombusbildung ist, die ihrerseits üblicherweise zu Gewebeinfarkt führt. Somit werden, zusätzlich zu den lipidsenkenden Mitteln, Therapien, die die Endothelfunktion verbessern, nicht nur das Fortschreiten von Atherosklerose hemmen und Regression bewirken, sondern auch die Raten kardiovaskulärer Ereignisse verringern.
U.S. Patent Nr. 4,831,268 (Fisch et al.) stellt ein Verfahren zur Bestrahlung von Körperblut zur Verfügung, um mit Atherosklerose zusammenhängende Herz- und Gefäßerkrankungen zu verhindern, wodurch Störungen im Fettaustausch verursacht werden. Das offenbarte Verfahren umfaßt das Bestrahlen des Blutes in dem blutrührenden Schlauch mit Bestrahlung, die eine Intensität von 1 mWcm&supmin;² bis 10 mWcm&supmin;² in einem Wellenlängenbereich von etwa 320 nm bis 600 nm besitzt.
Die Internationale Veröffentlichung Nr. WO 93/15778 (Bolton) stellt ein Verfahren zur Behandlung von Blut zur Verfügung, das die Aggregation von Blutplättchen in einem menschlichen Patienten verhindert. Das von Bolton offenbarte Verfahren umfaßt das Inkontaktbringen eines Blut-Aliquots mit einer Blutplättchenaggregation verhindernden Menge an Ozongas und ultravioletter Strahlung.
Bolton offenbart, daß derartiges behandeltes Blut bei der Behandlung von peripherer Gefäßerkrankung, thrombozytischen Erkrankungen, wie etwa Kranzgefäßthrombose und Lungenthrombose, Schlaganfall, Eklampsie und Präeklampsie verwendet werden kann.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung überwindet wenigstens einiger der obengenannten und weitere Nachteile von gegenwärtig bekannten Therapien zur Behandlung von kardiovaskulärer Erkrankung, insbesondere Atherosklerose, durch Ermöglichen eines Ver fahrens zur Verhinderung und Bewirkung der Regression von Atherosklerose, bei dem ein Aliquot von Säugerblut ex vivo behandelt und anschließend in den Körper eines Säugerpatienten eingeführt wird.
Das Blut-Aliquot wird behandelt, indem es zwei oder mehr Stressoren unterworfen wird, von denen festgestellt worden ist, daß sie das Blut modifizieren. Gemäß der vorliegenden Erfindung kann das Blut-Aliquot modifiziert werden, indem das Blut, oder abgetrennte zelluläre oder nicht-zelluläre Fraktionen des Blutes, oder Mischungen der abgetrennten Zellen und/oder nicht-zellulärer Fraktionen des Blutes, Stressoren unterworfen werden, die ausgewählt sind aus Temperaturstressoren, elektromagnetischen Emissionen und oxidativen Umgebungen oder irgendeiner Kombination solcher Stressoren, gleichzeitig oder aufeinanderfolgend.
Die beobachteten Wirkungen des modifizierten Blutes oder der modifizierten Blutkomponenten der vorliegenden Erfindung, wenn eingebracht in den Körper eines Säugerpatienten, sind vielfältig. Erstens zeigen Säugerpatienten, die gemäß der vorliegenden Erfindung behandelt worden sind, eine beträchtlich verringerte Entwicklung von Plaque, wie widergespiegelt durch verringerte Ablagerung von Lipiden in Blutgefaßwänden, verglichen mit nicht-behandelten Patienten. Ebenso wie das Verzögern des Fortschreitens der Plaqueabscheidung hat es sich gezeigt, daß die Verwendung der Erfindung bewirkt, daß existierende Plaques regredieren. Genauer sind Verringerungen in der Plaqueablagerung von so viel wie etwa 75% bei Patienten beobachtet worden, die mit dem gemäß der Erfindung hergestellten Arzneimittel behandelt worden sind.
Zweitens ist eine Verringerung der Gesamt-Serum-Cholesterinspiegel bei einigen Experimenten beobachtet worden, primär aufgrund einer Verringerung der LDL- und VLDL-Cholesterinspiegel. Spiegel von günstigem HDL-Cholesterin werden nicht verringert. Verringerungen der Cholesterinspiegel von so viel wie etwa 40%, verglichen mit Patienten, die nicht-behandeltes Blut als ein Placebo erhielten, sind beobachtet worden. Drittens ist auch eine Verringerung der Serum-Triglyceridspiegel beobachtet worden. Man würde erwarten, daß solche Verringerungen in Serum- Cholesterin und Triglyceriden das Auftreten von Atherosklerose und das Voranschreiten derselben aufgrund von Hyperlipämie verzögert.
Man glaubt, daß die günstige Wirkung der Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung zusammenhängt mit einer direkten Wirkung auf das Endothel, die es widerstandsfähiger gegenüber Lipidabscheidung macht, und/oder einer Verringerung der Entzündungsreaktion auf das oxidierte Lipid. Eine Reduktion der Lipidspiegel, die nicht immer beobachtet wird, wenn Patienten gemäß der Erfindung behandelt werden, könnte immer noch eine Rolle bei der Verringerung von Atherosklerose spielen.
Der Anmelder glaubt, daß Blut oder Blutkomponenten, das/die gemäß der vorliegenden Erfindung modifiziert ist/sind, wenn eingerührt in den Körper eines Patienten, die Wirkung hat/haben, daß die Entzündungsimmunreaktionen, die bei der Atherogenese betroffen sind, herunter reguliert werden. Genauer glaubt der Anmelder, daß das Blut, das gemäß der Erfindung modifiziert worden ist, die Aktivität der TH1-Komponente der im Blut vorhandenen T-Zellen, die verantwortlich sind für die Sekretion von Entzündungscytokinen, wie etwa IL-2, IL-6, IL-8, IFN-γ und TNF-α, herunterreguliert und/oder die TH-2-Komponente von T-Zellen, die verantwortlich sind für die Sekretion von entzündungshemmenden Cytokinen, z. B. IL-10 und IL-4, herauf reguliert. Man glaubt auch, daß die beanspruchte medizinische Verwendung zur Hemmung des Aktivationszustandes von zirkulierenden Leukozyten, zu einer Verringerung der Klebrigkeit des Endothels oder zu einer Kombination von beiden führen kann, was Endothel-Verletzung verringert. Überdies glaubt man, daß, durch Herunterregeln der Entzündungsimmunreaktion, die beanspruchte medizinische Verwendung die Wirkung hat, atherosklerotische Plaques zu stabilisieren, wovon man erwarten würde, daß es das Auftreten von Thrombusbildung verringert.
Obgleich der obige Mechanismus erklären kann, wie die beanspruchte Verwendung die Atherogenese beeinflußt, erklärt er nicht vollständig die Beobachtung, daß sie eine signifikante Regression existierender Plaqueablagerungen erreicht.
Demgemäß stellt vorliegende Erfindung in einem Aspekt ein Arzneimittel zur Verwendung bei der Verhinderung der Progression und Bewirkung der Regression von Atherosklerose in einem Säuger zur Verfügung, welches ein Aliquot von Säugerblut umfaßt, das extrakorporal einer elektromagnetischen Emission und einer oxidativen Umgebung ausgesetzt worden ist.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Die Erfindung wird nunmehr vollständig, nur beispielhaft, unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben werden, in denen:
Fig. 1 Fotografien von zwei Aorten in voller Länge umfaßt, erhalten aus Mäusen mit LDL-Rezeptor-Mangel, die die Studie, die in Beispiel 1 beschrieben ist, durchlaufen haben, wobei die mit 1 bezeichnete Aorta erhalten wurde von einem Tier, das eine Diät mit hohem Cholesteringehalt und Schembehandlungen erhielt, und die mit 2 bezeichnete Aorta erhalten wurde von einem Tier, das eine Diät mit hohem Cholesteringehalt erhielt und gemäß einem bevorzugten Verfahren der vorliegenden Erfindung behandelt wurde, wobei Aorta-Lipidabscheidung sichtbar gemacht wurde durch Anfärben der Aorten mit Ölrot O; und
Fig. 2 bis 4 Fotografien von Aorta-Querschnitten umfassen, die erhalten wurden aus Mäusen mit LDL-Rezeptor-Mangel, die die Studie, die in Beispiel 1 beschrieben ist, durchlaufen haben, wobei die in Fig. 2 dargestellte Aorta erhalten wurde von einem Tier, das normale Diät erhielt, die Aorta von Fig. 3 erhalten wurde von einem Tier, das die Diät mit hohem Cholesteringehalt und Scheinbehandlungen erhielt, und die Aorta von Fig. 4 erhalten wurde von einem Tier, das eine Diät mit hohem Cholesteringehalt erhielt und gemäß einem bevorzugten Verfahren der vorliegenden Erfindung behandelt wurde, wobei das Vorhandensein von Makrophagen in den Aortaplaqueabscheidungen sichtbar gemacht wurde durch Immunanfärbung der Aorten.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG VON BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Gemäß einem bevorzugten Verfahren der vorliegenden Erfindung wird ein Blut-Aliquot aus einem Säugerpatienten, vorzugsweise einem Menschen, extrahiert und das Blut- Aliquot wird ex vivo mit bestimmten Stressoren behandelt, die unten detaillierter beschrieben sind. Die Begriffe "Aliquot", "Blut-Aliquot" und ähnliche Begriffe, die hierin verwendet werden, schließen Vollblut, abgetrennte zelluläre Fraktionen des Blutes, einschließlich Thrombozyten, abgetrennte nicht-zelluläre Fraktionen des Blutes, einschließlich Plasma, und Kombinationen derselben ein. Die Wirkung der Stressoren ist, das Blut und/oder die zellulären oder nicht-zellulären Fraktionen derselben, das/die im Aliquot enthalten ist/sind, zu modifizieren. Das modifizierte Aliquot kann anschließend mit einem beliebigen Verfahren, das zur Impfung geeignet ist, vorzugsweise ausgewählt aus intraarterieller Injektion, intramuskulärer Injektion, intravenöser Injektion, subkutaner Injektion, intraperitonaler Injektion und oraler, nasaler oder rektaler Verabreichung, wieder in den Körper des Patienten eingebracht werden.
Die Stressoren, denen das Blut-Aliquot ex vivo gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung unterworfen wird, sind ausgewählt aus einer oxidativen Umgebung und einer elektromagnetischen Emission, fakultativ in Kombination mit Temperaturstress (Bluttemperatur oberhalb oder unterhalb Körpertemperatur), gleichzeitig oder aufeinanderfolgend. Geeigneterweise besitzt das Aliquot, bei menschlichen Patienten, ein ausreichendes Volumen, daß, wenn wieder eingeführt in den Körper des Patienten, eine Verringerung der Serum-Lipidgehalte, eine Verzögerung des Voranschreitens oder eine Regression von atherosklerotischer Plaquebildung und/oder erhöhte Stabilität atherosklerotischer Plaque im Patienten erreicht wird. Vorzugsweise beträgt das Volumen des Aliquots bis zu etwa 400 ml, vorzugsweise von etwa 0,1 bis etwa 100 ml, bevorzugter von etwa 5 bis etwa 15 ml, noch bevorzugter von etwa 8 bis etwa 12 ml, und am bevorzugtesten etwa 10 ml.
Es ist erfindungsgemäß bevorzugt, alle drei der obengenannten Stressoren gleichzeitig auf das Aliquot unter Behandlung anzuwenden, um die geeignete Modifikation des Blutes sicherzustellen. Sorgfalt muß angewandt werden, daß ein ausreichendes Niveau der Stressoren angewendet wird, um dadurch das Blut wirksam zu modifizieren, um eine signifikante Verringerung der atherosklerotischen Plaque im Patienten zu erreichen oder eine Stabilisierung der atherosklerotischen Plaque im Patienten zu erreichen.
Der Temperaturstressor erwärmt das zu behandelnde Aliquot auf eine Temperatur oberhalb normaler Körpertemperatur oder kühlt das Aliquot auf unterhalb normaler Körpertemperatur ab. Die Temperatur wird so ausgewählt, daß der Temperaturstressor keine übermäßige Hämolyse im Blut, das im Aliquot enthalten ist, bewirkt und daß, wenn das behandelte Aliquot einem Patienten injiziert wird, eine Lipidverringerung und/oder eine Verzögerung des Voranschreitens oder Regression der Bildung von atherosklerotischer Plaque erreicht werden wird. Vorzugsweise wird der Temperaturstressor so angewendet, daß die Temperatur des gesamten Aliquots oder eines Teils davon bei etwa 55ºC liegt und bevorzugter im Bereich von etwa -5ºC bis etwa 55ºC.
In einigen bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung wird die Temperatur des Aliquots auf oberhalb normaler Körpertemperatur angehoben, so daß die mittlere Temperatur des Aliquots eine Temperatur von etwa 55ºC, bevorzugt von etwa 40ºC bis etwa 50ºC, noch bevorzugter von etwa 40ºC bis etwa 44ºC und am bevorzugtesten von etwa 42,5 ± 1ºC nicht übersteigt.
In anderen bevorzugten Ausführungsformen wird das Aliquot auf unterhalb normaler Körpertemperatur abgekühlt, so daß die mittlere Temperatur des Aliquots im Bereich von etwa -5ºC bis etwa 36,5ºC liegt, bevorzugter von etwa 10ºC bis etwa 30ºC und noch bevorzugter von etwa 15ºC bis etwa 25ºC.
Der Stressor oxidative Umgebung kann das Anwenden von festen, flüssigen oder gasförmigen Oxidationsmitteln auf das Aliquot sein. Vorzugsweise umfaßt er das Einwirken einer Mischung aus medizinischem Sauerstoff- und Ozongas auf das Aliquot, am bevorzugtesten durch Hindurchleiten durch das Aliquot, im vorgenannten Temperaturbereich, wobei ein Strom aus medizinischem Sauerstoffgas Ozon als eine geringfügige Komponente darin aufweist. Der Ozongehalt des Gasstromes und die Durchflußrate des Gasstromes werden vorzugsweise so ausgewählt, daß die in das Blut- Aliquot eingeführte Menge Ozon, entweder für sich oder in Kombination mit anderen Stressoren, nicht zu übermäßigen Niveaus von Zellschädigung führt, so daß die Therapie wirkungslos gemacht wird. Geeigneterweise besitzt der Gasstrom einen Ozongehalt von bis zu etwa 300 ug/ml, vorzugsweise bis zu etwa 100 ug/ml, bevorzugter etwa 30 ug/ml, noch bevorzugter bis zu etwa 20 ug/ml, besonders bevorzugt von etwa 10 ug/ml bis etwa 20 ug/ml und am bevorzugtesten etwa 14,5 ± 1,0 ug/ml. Der Gasstrom wird geeigneterweise dem Aliquot mit einer Rate von bis zu etwa 2,0 l/min. vorzugsweise bis zu etwa 0,5 l/min. bevorzugter bis zu etwa 0,4 l/min. noch bevorzugter bis zu etwa 0,33 l/min und am bevorzugtesten etwa 0,24 ± 0,024 l/min zugeführt. Die untere Grenze der Durchflußrate des Gasstromes ist vorzugsweise nicht niedriger als 0,01 l/min. bevorzugter nicht niedriger als 0,1 l/min und noch bevorzugter nicht niedriger als 0,2 l/min.
Der Stressor elektromagnetische Emission wird geeigneterweise angewendet durch Bestrahlen des Aliquots unter Behandlung aus einer Quelle einer elektromagnetischen Emission, während das Aliquot bei der vorgenannten Temperatur gehalten wird und während die Sauerstoff/Ozongasmischung durch das Aliquot hindurchgeleitet wird. Bevorzugte elektromagnetische Emissionen sind ausgewählt aus Photonenstrahlung, bevorzugter UV-, sichtbares und Infrarot-Licht und noch bevorzugter UV-Licht. Die bevorzugtesten UV-Quellen sind UV-Lampen, die primär UV-C-Band-Wellenlängen emittieren, d. h. Wellenlängen, die kürzer sind als etwa 280 nm. Solche Lampen können auch Mengen von sichtbarem und Infrarot-Licht emittieren. Ultraviolettes Licht, das Standard-UV-A-Quellen (Wellenlängen von etwa 315 bis 400 nm) und UV-B-Quellen (Wellenlängen von etwa 280 bis 315 nm) entspricht, kann ebenfalls verwendet werden. Zum Beispiel kann eine geeignete Dosis solchen UV-Lichts, gleichzeitig angewendet mit den vorgenannten Stressoren Temperatur und oxidative Umgebung, aus bis zu acht Lampen erhalten werden, die so angeordnet sind, daß sie den Probenbehälter, der das Aliquot hält, umgeben, betrieben mit einer Intensität, um eine Gesamt-UV-Lichtenergie an der Oberfläche des Blutes von etwa 0,025 bis etwa 10 Joules/cm², vorzugsweise von etwa 0,1 bis 3,0 Joules/cm², zu liefern, und vorteilhafterweise verwendet werden. Vorzugsweise werden vier solche Lampen verwendet.
Die Zeit, für die das Aliquot den Stressoren unterworfen wird, liegt normalerweise im Zeitbereich von bis zu etwa 60 Minuten. Die Zeit hängt in gewissem Maße von der gewählten Intensität der elektromagnetischen Emission, der Temperatur, der Konzentration des Oxidationsmittels und der Rate, mit der er dem Aliquot zugeführt wird, ab. Einige Experimente, um optimale Zeiten zu bestimmen, können auf seifen des Betreibers notwendig sein, wenn die anderen Stressor-Niveaus erst einmal festgesetzt worden sind. Unter den meisten Stressor-Bedingungen werden bevorzugte Zeiten im ungefähren Bereich von etwa 2 bis etwa 5 Minuten, bevorzugt etwa 3 Minuten liegen. Die Anfangstemperatur des Blutes und die Rate, mit der es auf eine vorbestimmte Temperatur erwärmt oder abgekühlt wird, variiert üblicherweise von Patient zu Patient. Solch eine Behandlung liefert ein modifiziertes Blut-Aliquot, das zur Injektion in den Patienten fertig ist.
In der Praxis des bevorzugten Verfahrens der vorliegenden Erfindung kann das Blut- Aliquot mit den Stressoren unter Verwendung eines Apparats von dem Typ behandelt werden, der in U.S.-Patent Nr. 4,968,483 (Mueller) beschrieben ist. Das Aliquot wird in einen geeigneten, sterilen, gegenüber UV-Licht durchlässigen Behälter gegeben, der in die Maschine eingesetzt wird. Die UV-Lampen werden für einen festen Zeitraum eingeschaltet, bevor das Aliquot mit dem Gasstrom beaufschlagt wird, der den oxidativen Streß liefert, um zu ermöglichen, daß sich der Output der UV-Lampen stabilisiert. Die UV-Lampen sind typischerweise an, während die Temperatur des Aliquots auf den vorbestimmten Wert, z. B. 42,5 ± 1ºC, eingestellt wird. Anschließend wird das Aliquot mit der Sauerstoff-Ozon-Gasmischung, mit bekannter Zusammensetzung und kontrollierter Durchflußrate, für die vorbestimmte Dauer von bis zu etwa 60 Minuten, vorzugsweise 2 bis 5 Minuten und am bevorzugtesten etwa 3 Minuten, wie oben diskutiert, beaufschlagt, so daß das Aliquot allen drei Stressoren gleichzeitig unterliegt. Auf diese Weise wird Blut in angemessener Weise gemäß der vorliegenden Erfindung modifiziert, um die gewünschten Wirkungen zu erzielen.
Ein Patient kann die Blut-Aliquots in einem Ablauf täglicher Verabreichung für eine Reihe von aufeinanderfolgenden Tagen erhalten oder in einem ersten Ablauf von täglichen Aliquots für einen festgelegten Zeitraum, gefolgt von einer Unterbrechung, und anschließend einen oder mehreren zusätzliche Abläufe täglicher Verabreichung. In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt jeder Ablauf die Verabreichung von 4 bis 6 täglichen Aliquots. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfaßt das bevorzugte Dosisregime die Verabreichung von 2 bis 4 Aliquots behandeltes Blut, wobei die Verabreichung jedes Paares von aufeinanderfolgenden Aliquots entweder an aufeinanderfolgenden Tagen erfolgt oder durch einen Restzeitraum von 1 bis 21 Tagen getrennt ist, an denen dem Patienten keine Aliquots verabreicht werden, wobei der Restzeitraum, der ein ausgewähltes Paar von aufeinanderfolgenden Aliquots trennt, bei etwa 3 bis 15 Tagen liegt. Ein spezifischeres, bevorzugtes Dosisregime wären insgesamt drei Aliquots, wobei das erste und das zweite Aliquot an aufeinanderfolgenden Tagen verabreicht würden und ein Restzeitraum von 11 Tagen vorgegeben würde, zwischen der Verabreichung des zweiten und des dritten Aliquots. Vorzugsweise werden aufeinanderfolgende Behandlungsabläufe durch einen Zeitraum von wenigstens etwa drei Wochen getrennt, während derer dem Patienten kein behandeltes Blut verabreicht wird. Der Abstand zwischen aufeinanderfolgenden Behandlungsabläufen sollte derart sein, daß die positiven Wirkungen der medizinischen Verwendung der Erfindung aufrechterhalten werden. In ähnlicher Weise sollte die Anzahl von Verabreichungsabläufen derart sein, daß die Wirkungen aufrechterhalten werden, und können auf der Grundlage der beobachteten Reaktion an einzelnen Patienten bestimmt werden.
Die Erfindung wird weiter veranschaulicht und beschrieben unter Bezugnahme auf die folgenden spezifischen Beispiele.

BEISPIEL 1

Tierstudien

Modell

Das Ziel des Experimentes ist, die Wirkungen der Behandlung, die mit der vorliegenden Erfindung möglich gemacht wird, auf die Entwicklung von Atherosklerose im Modell mit Mäusen mit LDL-Rezeptor(LDL-R)-Mangel zu bestimmen, einem in weitem Umfang verwendeten transgenen Atherosklerose-Modell, das durch gezielte Zerstörung des LDL-Rezeptors geschaffen wird. Dieses Tiermodell ist analog zu Familien- Hypercholerestinämie, einem ererbten Zustand, bei dem eine Mutation zum vollständigen Fehlen von funktionellem LDL-R führt. Bei der Humanerkrankung zeigen homozygote Personen einen merklichen Anstieg in Serumcholesterin und entwickeln schwere vorzeitige Atherosklerose, wobei sie dieser Erkrankung in einem frühen Alter erliegen. Bei Patienten mit dieser Erkrankung haben gegenwärtig verwendete lipidsenkende Mittel keine signifikante Wirkung im Hinblick auf die Senkung der Cholesterinspiegel.
Das Modell mit Mäusen mit LDL-R-Mangel zeigt Intoleranz gegenüber Cholesterin- Fütterung und entwickelt weit gestreute atherosklerotische Veränderungen, die bis zu reifen fibrösen Läsionen voranschreiten, die morphologisch nicht-unterscheidbar von etablierter menschlicher Atherosklerose sind. Abgesehen von der definierten genetischen Abnormität, die Prädisposition für Atherosklerose bewirkt, hat dieses Modell den Vorteil einer raschen Entwicklung von weit gestreuter Atherosklerose innerhalb von 6 bis 8 Wochen im Anschluß an den Beginn der Cholesterin-Fütterung.

Protokoll

Mäuse mit LDL-R-Mangel wurden erworben von Jackson Laboratories. Insgesamt 20 Mäuse wurden im Alter von 22 Wochen in die Studie gegeben und 15 Mäuse vollendeten die Studie. Die Länge der Studie betrug 8 Wochen. Die Mäuse wurden bei einem Zyklus mit 12 Stunden Dunkelheit/12 Stunden Licht mit freiem Zugang zu Futter und Wasser gehalten und wurden mit einer spezifizierten Diät gefüttert, wie folgt. Eine Kontrollgruppe umfaßte 5 Tiere, die alle die Studie abschlössen und eine normale Diät erhielten. Die Gruppe mit hohem Cholesterin, die 15 Tiere umfaßte, von denen 10 die Studie abschlossen, wurden mit einer Diät gefüttert, die 1,25% Cholesterin, 7,5% Kakaobutter, 7,5% Casein und 0,5% Natriumcholat enthielt. Um richtige Futteraufhahme sicherzustellen, wurden Futterverzehr und Tiergewicht auf einer wöchentlichen Basis überwacht. In früheren Experimenten wurde gezeigt, daß 8 Wochen Fütterung mit der Diät mit hohem Cholesteringehalt zu beträchtlicher Atheroskleroseentwicklung führt, insbesondere in dem Aortabogen und der absteigenden Thoraxaorta.

Behandlung

Zehn der Tiere, die mit der Diät mit hohem Cholesteringehalt gefüttert wurden, wurden per Zufallsprinzip ausgewählt, um einen Behandlungsablauf mit der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung zu durchlaufen. Sechs der behandelten Tiere schlossen die Studie ab. Es ist anzumerken, daß die vier Todesfälle in dieser Gruppe in keiner Weise mit der Behandlung zusammenhingen, sondern frühzeitig in der Studie als ein Ergebnis von Kämpfen zwischen Tieren auftraten, die während der Studie zusammen untergebracht waren. Die anderen fünf Tiere auf Diät mit hohem Cholesteringehalt durchliefen einen Ablauf von Scheinbehandlungen und vier überlebten das Protokoll.
Die Behandlungen begannen vier Wochen nach Beginn der Studie, wobei jedes der Tiere auf der Diät mit hohem Cholesteringehalt insgesamt 10 Behandlungen erhielten (2 Behandlungsabläufe mit 1 Injektion pro Tag für 5 Tage, wobei die 2 Behandlungsabläufe getrennt wurden durch zwei Tage, d. h. 10 Injektionen über einen Zeitraum von 12 Tagen). Jede einzelne Behandlung, die den Tieren verabreicht wurde, bestand aus dem Sammeln von 10 ml Blut von genetisch kompatiblen Spendertieren, die mit einer normalen Diät gefüttert wurden, wobei das Blut in Natriumcitrat-Antikoagulans hineingesammelt wurde. Um jeweils 10 ml Blut-Aliquot zu sammeln, wurde 1 ml Blut von jedem von 10 Tieren abgenommen. Das Blut wurde durch Herzpunktur abgenommen, wobei die Tiere unter vollständiger Xylazin/Ketamin-Anästhesie während des Blutabnahmevorganges standen und ihnen unmittelbar im Anschluß an die Abnahme T- 61 gegeben wurde. Das Blut-Aliquot wurde in ein steriles Wegwerfgefäß aus low- density-Polyethylen für ex vivo-Behandlung überführt und wurde anschließend gleichzeitig mit einer gasförmigen Sauerstoff/Ozon-Mischung und ultraviolettem Licht bei erhöhter Temperatur unter Verwendung eines Apparates behandelt, wie allgemein beschrieben im vorgenannten U.S.-Patent Nr. 4,968,483 (Mueller et al).
Die Zusammensetzung der Gasmischung betrug 14,5 ± 1,0 ug Ozon/ml, wobei der Rest der Mischung medizinischen Sauerstoff umfaßte. Die Gasmischung wurde durch das Aliquot mit einer Rate von 240 ± 24 ml/min für einen Zeitraum von 3 Minuten hindurchgeleitet. Die Temperatur des Aliquots wurde stabil bei 42,5 ± 1,0ºC gehalten. Das UV-Licht lag innerhalb des UV-C-Bandes und schloß eine Wellenlänge von 253,7 nm ein.
Nach Behandlung mit der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurden 30 ul des behandelten Blutes intramuskulär in jedes Tier re-injiziert.
Bei den Scheinbehandlungen wurden 30 ul unbehandeltes Blut intramuskulär in jedes der restlichen fünf Tiere auf der Diät mit hohem Cholesteringehalt injiziert.

Bestimmung von Atherosklerose

Bei der Opferung wurden die Tiere mit Zylaxin/Ketamin anästhesiert und das Herz wurde freigelegt. Nach Abklemmen der Vena cava, um Blutproben zu erhalten, wurden den Tieren über Ventrikularpunktur Perfusionen verabreicht, zunächst mit PBS, um das Blut auszuspülen, und anschließend mit 10% neutral gepuffertem Formalin für 3 Minuten, um die Aorta zu fixieren. Die Thoraxaorta wurde aus dem Thorax en bloc herausseziert und in 10% Formalin bei 4ºC aufbewahrt. Druckfixierte (10% Formalin) Aorten wurden en bloc entfernt und geöffnet, um eine Längsinversion in voller Länge zu ermöglichen. Die Aorten wurden anschließend, innen freigelegt, auf Glasobjektträgem befestigt und mit Ölrot 0 angefärbt. Die hellrote Anfärbung (die Lipidablagerung anzeigt) wurde anschließend unter Verwendung eines computergestützten morphometrischen Systems quantifiziert und ausgedrückt als Atherosklerose-Index (Verhältnis von atherosklerotischer zu normaler Aortaoberfläche).

Plasma-Lipid- und -Lipoprotein-Analyse

Lipoprotein-Profile wurden mittels Schnellphasenflüssigchromatografie mit einer Superose-6B-Säule erhalten. 200-ul-Aliquote von thrombozytenarmen Plasma von jedem Tier wurden auf die Säule geladen und mit TSE-Puffer bei einer konstanten Durchflußrate von 0,35 ml/min eluiert. Ein Aliquot von 80 ul aus jeder Fraktion wurde für die Messung von Gesamtcholesterin minus verestertem Cholesterin verwendet. Gesamtcholesterin und Triglyceride in Plasmaproben und Säulenfraktionen für 11 repräsentative Tier wurden mit einem enzymatischen Verfahren gemessen, das in der Lipid-Forschungsgruppe am St. Michaels Hospital, Toronto, entwickelt wurde.

Statistische Analyse

Kontinuierliche Variablen werden als Mittelwert ± SD angegeben. Unterschiede in Cholesterinspiegeln und Triglyceridspiegeln unter Gruppen wurden in dem Student-t- Test getestet. Unterschiede im atherosklerotischen Verletzungsbereich unter den Gruppen wurden unter Verwendung des Einweg-ANOVA-Tests in Verbindung mit der Bonferroni-Korrektur getestet.

Ergebnisse

Fig. 1 stellt zwei Aorten in voller Länge dar, die mit Ölrot O angefärbt sind, um Lipidablagerung und Plaquebildung innerhalb der Arterie nachzuweisen. Die Tiere, die die Diät mit hohem Cholesteringehalt und die Scheinbehandlungen erhielten, zeigten substantielle Aorta-Lipidablagerung (Aorta 1 in Fig. 1), wobei das Verhältnis von atherosklerotischer Fläche (AA) zu Gesamtfläche (TA) 0,16 ± 0,1 betrug. Im Vergleich zeigten diejenigen Tiere, die mit dem bevorzugten Verfahren der vorliegenden Erfindung behandelt wurden, ein stark verringertes Niveau von Aorta-Lipidabscheidung (Aorta 2 in Fig. 1), wobei AA/TA bei 0,04 ± 0,02 lag. Diese Verhältnisse sind signifikant unterschiedlich, mit p < 0,05. Bei den Tieren, die die normale Diät erhielten, wurden keine signifikanten atherosklerotischen Veränderungen beobachtet.
Zusätzlich wurde beobachtet, daß die Tiere, die gemäß dem bevorzugten Verfahren der vorliegenden Erfindung behandelt wurden, ein besseres allgemeines Erscheinungsbild, verringerte Hautxanthomatose (Augenlider, Nase und Pfoten), verringerte Gliederschwellung und besseren Appetit zeigten als die unbehandelten Tiere, die die Diät mit hohem Cholesteringehalt erhielten.
Um die Wirkungen der medizinischen Verwendung der vorliegenden Erfindung weiter zu veranschaulichen, wurden Schnitte von Aorten, die erhalten wurden von Tieren in diesem Beispiel, für MOMA-2, einen Marker zu Entzündungs-Monozyten/Makrophagen, immun gefärbt. Diese Ergebnisse sind in den Fig. 2 (normale Diät), 3 (Diät mit hohem Cholesteringehalt - keine Behandlung) und 4 (Diät mit hohem Cholesteringehalt - behandelt) dargestellt. Keine Anfärbung ist in Fig. 2 zu sehen. Anfärbung ist in sowohl Fig. 3 als auch 4 sichtbar, was daraufhinweist, daß die Mehrzahl von Zellen in der Neointima der Tiere, die die Diät mit hohem Cholesteringehalt erhielten, Monozyten/Makrophagen waren. Wie man jedoch durch Vergleich der Fig. 3 und 4 sehen kann, zeigten Tiere, die die Blut-Aliquote gemäß der beanspruchten medizinischen Verwendung erhalten hatten, eine merkbare Verringerung der Menge an Plaqueabscheidung und zeigen daher auch eine Abnahme in der Gesamtzahl von Monozyten/Makrophagen. Dies weist auf eine Verringerung von Entzündungsprozessen in der Plaque von behandelten im Vergleich mit Kontrolltieren hin. Überdies glaubt man, daß Entzündungszellen, die in der Plaque vorhanden sind, im großen Maße verantwortlich sind für Plaqueinstabilität, von der man glaubt, daß sie der hauptsächliche Grund für Thrombusbildung sind. Es wird erwartet, daß die erhöhte Plaquestabilität, die durch das Verfahren der Erfindung erzeugt wird, eine entsprechende Abnahme der Raten von kardiovaskulären Ereignissen mit sich bringen wird.
Die Messung der Cholesterinspiegel unter den verschiedenen Gruppen von Tieren zeigte, daß der Gesamt-Serumcholesterinspiegel sind eigentlich nicht signifikant bei den Tieren veränderte, die die normale Diät erhielten, aber merkbar erhöht war bei den Tieren, die die Diät mit hohem Cholesteringehalt erhielten. Dieser merkbare Anstieg trat sowohl in der scheinbehandelten Gruppe als auch, in einem geringeren Umfang, in der Gruppe auf, die die Behandlungen gemäß dem bevorzugten Verfahren der vorliegenden Erfindung erhielten.
Die gemessenen Triglyceridspiegel waren ebenfalls höher bei den Tieren, die die Diät mit hohem Cholesteringehalt erhielten, verglichen mit den Tieren, die die normale Diät erhielten. Unter den Tieren, die die Diät mit hohem Cholesteringehalt erhielten, war jedoch der Anstieg der Triglyceridspiegel sehr viel größer in der scheinbehandelten Gruppe als in der Gruppe, die gemäß dem bevorzugten Verfahren der vorliegenden Erfindung behandelt wurde.
Die gemessenen Cholesterin(Gesamt und HDL)- und Triglyceridspiegel und mittleren Cholesterin- und Triglyceridspiegel für jede Gruppe sind unten in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1
In Tabelle 1 erhielt die "behandelt"-Gruppe von Tieren die Diät mit hohem Cholesteringehalt und wurde gemäß dem bevorzugten Verfahren der vorliegenden Erfindung behandelt. Die "Kontroll"-Tiere erhielten die normale Diät und keine Behandlung und die "HC-Diät"-Tiere erhielten Diät mit hohem Cholesteringehalt und die Scheinbehandlung.

BEISPIEL 2

Humanstudien

Die Verringerung der Triglyceridspiegel, die in den Tierstudien beobachtet wurde, ist konsistent mit Ergebnissen, die in zwei Humanstudien erhalten wurden, deren Ergebnisse unten dargestellt sind.

Humanstudie A

Insgesamt 94 gesunde menschliche Freiwillige, von denen 57 männlich waren und 37 weiblich waren, wurden einer Behandlung mit sechs Aliquots gemäß der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung über einen zweiwöchigen Zeitraum unterzogen. Serumtriglyceridspiegel wurden vor und nach den Behandlungsabläufen gemessen und die Mittelwertmessungen sind unten in Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2

Humanstudie B

Insgesamt 49 Patienten aus einer Hausarztpraxis wurden verschiedenen Verabreichungsschemata gemäß den bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung unterzogen. Die Schemata umfaßten 5 bis 40 Injektionen pro Patient. Serumtriglyceridspiegel von jedem Patienten wurden vor und nach dem Therapieablauf gemessen und die Mittelwertmessungen sind unten in Tabelle 3 dargestellt. Tabelle 3
Aus den obigen Humanstudien kann geschlossen werden, daß die medizinische Verwendung gemäß der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eine signifikante Verringerung der Gesamt-Serumtriglyceridspiegel in menschlichen Patienten erreicht.

BEISPIEL 3

Tierstudien

In dieser Studie wurden Mäuse mit LDL-R-Mangel in Gruppen aufgeteilt und unter Verwendung des folgenden Protokolls untersucht:
Gruppe A (Kontrolle) - gefüttert mit einer normalen Diät wie in Beispiel 1;
Gruppe B1 - gefüttert mit einer Diät mit hohem Cholesteringehalt, wie beschrieben in Beispiel 1, für 8 Wochen;
Gruppe B2 - gefüttert mit einer Diät mit hohem Cholesteringehalt, wie beschrieben in Beispiel 1, für 12 Wochen;
Gruppe C1 - gefüttert mit einer Diät mit hohem Cholesteringehalt, wie beschrieben in Beispiel 1, für 8 Wochen und behandelt mit dem bevorzugten Verfahren der vorliegenden Erfindung, wie beschrieben in Beispiel 1, nach 4 Wochen Ernährungsintervention; und
Gruppe C2 - gefüttert mit einer Diät mit hohem Cholesteringehalt, wie beschrieben in Beispiel 1, für 12 Wochen und behandelt mit dem bevorzugten Verfahren der vorliegenden Erfindung, wie beschrieben in Beispiel 1, nach 8 Wochen Emährungsintervention.
Für jede Gruppe von Tieren wurde der Atherosklerose-Index nach entweder 8 oder 12 Wochen gemäß der in Beispiel 1 unter der Überschrift "Bestimmung von Atherosklerose" beschriebenen Methode bestimmt. Wie gezeigt durch Messung der atherosklerotischen Fläche, zeigten die Tiere von Gruppe B (nur Diät mit hohem Cholesteringehalt) substantielle Aorta-Lipidabscheidung, wobei Gruppe B1-Tiere einen Atherosklerose-Index von 0,16 ± 0,1 nach acht Wochen besaßen und Gruppe B2-Tiere einen Index von 0,17 ± 0,1 nach 12 Wochen Emährungsintervention besaßen, und Gegensatz dazu zeigten die Tiere von Gruppe C (Diät mit hohem Cholesteringehalt mit Behandlung gemäß der Erfindung) stark verringerte Lipidabscheidung, wobei die Gruppe-C1-Tiere einen Index von 0,04 ± 0,02 (p < 0,05) nach acht Wochen Emährungsintervention besaßen und Gruppe-C2-Tiere Niveaus von 0,04 ± 0,02 (p < 0,01) nach zwölf Wochen Emährungsintervention besaßen.
Die Tiere von Gruppe C zeigten auch bemerkbare Verringerung von Xanthelasmen und Gliederschwellung, verglichen mit Tieren von Gruppe B.
Gesamtlipoprotein-Profile wurden gemessen wie in Beispiel 1 mit Schnellphasenflüssigkeitschromatographie und einem enzymverknüpften Assay. Die Ergebnisse dieser Analyse zeigten, daß die Tiere von Gruppe B (nur Diät mit hohem Cholesteringehalt) merkbar erhöhte Spiegel von Gesamtserumcholesterin besaßen (CHO 46,71 ± 3,61 mM), verglichen mit Kontrollgruppe A (CHO 5,1 ± 0,7 mM). Die Tiere von Gruppe C zeigten keine signifikante Verringerung des Cholesterins (CHO 44,7 ± 2,8 mM; p = 0,27 für B gegenüber C), verglichen mit den Tieren von Gruppe B.
Wie gezeigt in den obigen Beispielen, hemmte die beanspruchte medizinische Verwendung die Entwicklung von Atherosklerose in einem Mäusemodell für Human-Familienhypercholerestinämie beträchtlich. Zusätzlich zur wesentlichen Verringerung der Entwicklung von Atherosklerose in einem frühen Stadium und Hemmung des Voranschreitens etablierter atherosklerotischer Läsionen wurde gezeigt, daß besagte Verwendung Regression existierender atherosklerotischer Läsionen bewirkt. Die kann man zum Beispiel durch Vergleich der Ergebnisse für die Tiere der Untergruppen B1 und C2 in Beispiel 3 sehen, die zeigen, daß existierende Plaqueablagerungen in Woche 8 einer Diät mit hohem Cholesteringehalt um etwa 75% verringert sind, wenn die Tiere in Woche 8 gemäß der vorliegenden Erfindung behandelt werden. Diese Verbesserungen der kardiovaskulären Gesundheit wurde begleitet durch Verbesserungen der allgemeinen Gesamterscheinung der Tiere und deren Appetit.
Wie oben diskutiert, hat Atherosklerose eine signifikante immunmodulierte Entzündungskomponente. Man glaubt daher, daß die Fähigkeit des Verfahrens der Erfindung, Atherosklerose zu verhindern und zu behandeln, wenigstens teilweise auf ihrer entzündungshemmenden Wirkung beruht, und insbesondere ihrer Fähigkeit, einen Anstieg in den TH2- Zellen und/oder eine Abnahme in TH1-Zellen im Blut von behandelten Patienten zu erzeugen.

Claims

1. Verwendung bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Verhinderung des Fortschreitens von Atherosklerose bei einem Säuger eines Aliquots des Säugerblutes, das extrakorporal einer elektromagnetischen Emission und einer oxidativen Umgebung unterworfen worden ist.

2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die oxidative Umgebung das Beaufschlagen des Aliquots mit einem Oxidationsmittel umfaßt.

3. Verwendung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Oxidationsmittel Ozongas enthält und das Ozongas in das Blutaliquot in einer Menge eingebracht wird, die nicht zu unangemessen hohen Mutagenitätsniveaus führt.

4. Verwendung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Oxidationsmittel eine Mischung aus Ozongas und Sauerstoff medizinischer Qualität umfaßt, wobei das Ozongas in der Mischung in einer Konzentration von bis zu 300 ug/ml enthalten ist.

5. Verwendung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Ozongas in der Mischung in einer Konzentration von bis zu 30 ug/ml enthalten ist.

6. Verwendung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Aliquot mit der Mischung mit einer Durchflußrate von bis zu 0,33 Litern/min beaufschlagt wird.

7. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die elektromagnetische Emission ultraviolettes Licht mit einer oder mehreren Wellenlängen im UV-C-Band umfaßt.

8. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Aliquot weiter einem Temperaturstressor unterworfen wird, wobei besagter Temperaturstressor eine Temperatur oberhalb oder unterhalb Körpertemperatur umfaßt, die nicht zu wesentlicher Hämolyse des Blutes im Aliquot führt.

9. Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Temperaturstressor so angewendet wird, daß die Temperatur wenigstens eines Teils des Aliquots im Bereich von -5ºC bis 55ºC liegt.

10. Verwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die mittlere Temperatur des Blutes im Aliquot im Bereich von 37ºC bis 44ºC liegt.

11. Verwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die mittlere Temperatur des Blutes im Aliquot im Bereich von 0ºC bis 36, 5ºC liegt.

12. Verwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die mittlere Temperatur des Blutes im Aliquot im Bereich von 10ºC bis 30ºC liegt.

13. Verwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die mittlere Temperatur des Blutes im Aliquot im Bereich von 37ºC bis 55ºC liegt.

14. Verwendung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Temperatur 42,5 ± 1ºC beträgt.

15. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Aliquot ein Volumen von bis zu 400 ml hat.

16. Verwendung von Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Volumen des Aliquots 10 ml beträgt.

17. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Aliquot der elektromagnetischen Emission und der oxidativen Umgebung für einen Zeitraum von bis zu 60 Minuten unterworfen wird.

18. Verwendung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß das Aliquot der elektromagnetischen Emission und der oxidativen Umgebung für einen Zeitraum von 3 Minuten unterworfen wird.

19. Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Aliquot gleichzeitig der elektromagnetischen Emission, der oxidativen Umgebung und dem Temperaturstressor unterworfen wird.

20. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Aliquot gleichzeitig der elektromagnetischen Emission und der oxidativen Umgebung unterworfen wird.