ES2198913T3 - Purificacion de proteinas mediante cromatografia de intercambio ionico. - Google Patents
Purificacion de proteinas mediante cromatografia de intercambio ionico.Info
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Abstract
Procedimiento para la purificación de un polipéptido de una composición que comprende el polipéptido y un contaminante, comprendiendo dicho procedimiento las siguientes etapas llevadas a cabo de manera secuencial: a)unión del polipéptido a un material de intercambio iónico utilizando un tampón de carga, en donde el tampón de carga está a una primera conductividad y pH; b) lavado del material de intercambio iónico con un tampón intermedio a una segunda conductividad y/o pH para que eluya el contaminante del material de intercambio iónico; c) lavado del material de intercambio iónico con un tampón de lavado que está a una tercera conductividad y/o pH, en donde el cambio de conductividad y/o pH del tampón intermedio al tampón de lavado está en dirección opuesta al cambio en la conductividad y/o pH del tampón de carga al tampón intermedio; d) lavado del material de intercambio iónico con un tampón de elución a una cuarta conductividad y/o pH para que eluya el polipéptido del material de intercambio iónico.
Description
Purificación de proteínas mediante cromatografía
de intercambio iónico.
La presente invención se refiere, de manera
general, a la purificación de proteínas. La invención se refiere,
en particular, a un procedimiento de purificación de un polipéptido
(p.e. un anticuerpo) de una composición que comprende el polipéptido
y por lo menos un contaminante, utilizando el procedimiento de
cromatografía de intercambio iónico.
La purificación a gran escala económica de
proteínas se está convirtiendo en un problema importante en la
industria biotecnológica. En general, las proteínas son producidas
en cultivos celulares, utilizando líneas celulares de mamíferos o
bacterias manipuladas genéticamente para producir la proteína de
interés, mediante la inserción de un plásmido recombinante que
contiene el gen para esa proteína. Puesto que las líneas celulares
utilizadas son organismos vivos, estos deben ser alimentados con un
medio de crecimiento complejo que contenga azúcares, aminoácidos y
factores de crecimiento, frecuentemente procedente de preparaciones
de suero animal. Es un gran reto la separación de la proteína
deseada de la mezcla de compuestos de alimento para las células y
de los subproductos de las células con una pureza suficiente para
ser utilizada como terapéutico humano.
Los procedimientos de purificación de proteínas
procedentes de debris celulares dependen inicialmente del lugar de
expresión de la proteína. Se pueden estimular algunas proteínas
para que se secreten, de manera directa, de la célula al medio de
crecimiento que la rodea; otras están producidas de manera
intracelular. Para estas últimas proteínas, la primera etapa de un
procedimiento de purificación implica la lisis de la célula, lo
cual se puede realizar mediante una serie de procedimientos,
incluyendo la agitación mecánica, el choque osmótico o tratamientos
enzimáticos. Dicho rompimiento libera los contenidos enteros de la
célula en el homogenado y, además, produce fragmentos subcelulares
que son difíciles de extraer debido a su pequeño tamaño. Estos se
eliminan, generalmente, mediante centrifugación diferencial o
filtración. El mismo problema se plantea, aunque a menor escala,
con las proteínas que se secretan directamente, debido a la muerte
natural de las células y a la liberación de las proteínas
intracelulares de la célula hospedadora en el curso de la
producción de la proteína.
Una vez se ha obtenido una solución clarificada
que contenga la proteína de interés, se consigue su separación de
las otras proteínas producidas por la célula utilizando, en
general, una combinación de diferentes técnicas cromatográficas.
Estas técnicas separan mezclas de proteínas basándose en su carga,
grado de hidrofobicidad o tamaño. Son asequibles varias resinas de
cromatografía diferentes para cada una de estas técnicas,
permitiendo una adaptación precisa del esquema de purificación para
una determinada proteína implicada. La esencia de cada uno de estos
procedimientos de separación es que se puede provocar que las
proteínas eluyan a diferentes velocidades a lo largo de la columna,
consiguiendo una separación física que aumenta a medida que pasan
por la columna, o una adhesión, de manera selectiva, al medio de
separación, siendo, a continuación, eluída, de manera diferencial,
mediante diferentes disolventes. En algunos casos, se separa la
proteína deseada de las impurezas cuando las impurezas se adhieren
de manera específica a la columna y la proteína de interés no, esto
es, la proteína de interés está presente en el "flujo
continuo".
La cromatografía de intercambio iónico es una
técnica cromatográfica que se utiliza frecuentemente para la
purificación de proteínas. En la cromatografía de intercambio
iónico, los parches cargados en la superficie del soluto son
atraídos por cargas contrarias de la matriz de cromatografía, con
la condición de que la fuerza iónica del tampón circundante sea
bajo. La elución se consigue, en general, incrementando la fuerza
iónica del tampón (p.e. conductividad) para que compita con el
soluto por los sitios cargados en la matriz de intercambio iónico.
Otra manera de conseguir la elución del soluto es cambiando el pH
y, por consiguiente, alterando la carga del soluto. El cambio en la
conductividad o pH puede ser gradual (elución por gradiente) o
escalonada (elución por etapas). En el pasado, estos cambios habían
sido progresivos; es decir, el pH o la conductividad aumentaba o
disminuía en una única dirección. La utilización de resinas de
intercambio iónico en la purificación de proteínas se describe en
Graf et al., Bioseparation 4:
7-20 (1994).
La presente invención proporciona un
procedimiento cromatográfico de intercambio iónico en donde un
polipéptido de interés se une al material de intercambio iónico a
una conductividad o pH inicial y, a continuación, se lava el
material de intercambio iónico con un tampón intermedio a una
conductividad o pH diferente, o ambas. En un momento determinado,
después del lavado intermedio, y contrariamente a la práctica
estándar en cromatografía de intercambio iónico, el material de
intercambio iónico se lava con un tampón de lavado donde el cambio
de conductividad o pH, o ambas, del tampón intermedio al tampón de
lavado es en una dirección opuesta al cambio de conductividad o pH,
o ambas, conseguido con las etapas anteriores. Solo después del
lavado con el tampón de lavado el material de intercambio iónico
está preparado para que la molécula polipeptídica de interés eluya
mediante la aplicación del tampón de elución que tiene una
conductividad o pH, o ambas, que difiere de la conductividad o pH, o
ambas, de los tampones utilizados en las etapas anteriores.
Esta nueva aproximación a la cromatografía de
intercambio iónico es particularmente útil en situaciones en las que
una molécula de producto debe ser separada de una molécula
contaminante relacionada muy cercana a escala completa de
fabricación, donde se desea tanto pureza como una elevada
recuperación del producto.
De acuerdo con esto, la invención proporciona un
procedimiento para la purificación de un polipéptido de una
composición que comprende el polipéptido y un contaminante,
comprendiendo dicho procedimiento las siguientes etapas llevadas a
cabo de manera secuencial:
a)unión del polipéptido a un material de
intercambio iónico utilizando un tampón de carga, en donde el tampón
de carga está a una primera conductividad y pH;
b) lavado del material de intercambio iónico con
un tampón intermedio a una segunda conductividad y/o pH para que
eluya el contaminante del material de intercambio iónico;
c) lavado del material de intercambio iónico con
un tampón de lavado que está a una tercera conductividad y/o pH, en
donde el cambio de conductividad y/o pH del tampón intermedio al
tampón de lavado está en dirección opuesta al cambio en la
conductividad y/o pH del tampón de carga al tampón intermedio;
d) lavado del material de intercambio iónico con
un tampón de elución a una cuarta conductividad y/o pH para que
eluya el polipéptido del material de intercambio iónico. La primera
conductividad y/o pH puede(n) ser igual(es) a la
tercera conductividad y/o pH.
Cuando el material de intercambio iónico
comprende una resina de intercambio catiónico, la conductividad y/o
pH del tampón intermedio es/son preferiblemente mayor(es) que
la conductividad y/o pH del tampón de carga; la conductividad y/o pH
del tampón de lavado es/son preferiblemente menor(es) que la
conductividad y/o pH del tampón intermedio; y la conductividad y/o
pH del tampón de elución es/son preferiblemente mayor(es) que
la conductividad y/o pH del tampón intermedio. Preferiblemente, la
conductividad y/o pH del tampón de lavado es/son aproximadamente
igual(es) a la conductividad y/o pH del tampón de carga.
Preferiblemente, la elución del contaminante y
del polipéptido se consigue mediante modificación de la
conductividad del tampón intermedio y del tampón de elución,
respectivamente, mientras se mantiene el pH de estos tampones
aproximadamente iguales.
La presente invención también proporciona un
procedimiento para la purificación de un polipéptido de una
composición que comprende el polipéptido y un contaminante,
comprendiendo dicho procedimiento las siguientes etapas llevadas a
cabo de manera secuencial:
a)unión del polipéptido a un material de
intercambio catiónico utilizando un tampón de carga, en donde el
tampón de carga está a una primera conductividad y pH;
b) lavado del material de intercambio catiónico
con un tampón intermedio a una segunda conductividad y/o pH que es
mayor que la(s) del tampón de carga para que eluya el
contaminante del material de intercambio iónico;
c) lavado del material de intercambio catiónico
con un tampón de lavado que está a una tercera conductividad y/o pH
que es(son) menor(es) que la(s) del tampón
intermedio;
d) lavado del material de intercambio catiónico
con un tampón de elución a una cuarta conductividad y/o pH que es
mayor que la(s) del tampón intermedio para que eluya el
polipéptido del material de intercambio iónico.
Además, la invención proporciona un procedimiento
para la purificación de un anticuerpo de una composición que
comprende el anticuerpo y un contaminante, comprendiendo dicho
procedimiento cargar la composición en una resina de intercambio
catiónico, en donde la cantidad de anticuerpo cargado en la resina
de intercambio iónico está entre aproximadamente 20 mg y 35 mg de
anticuerpo por mL de resina de intercambio catiónico y,
opcionalmente, comprende, además, eluir el anticuerpo de la resina
de intercambio catiónico. Preferiblemente, el procedimiento
comprende, además, una etapa de lavado intermedia para eluir uno o
más contaminantes de la resina de intercambio iónico. Esta etapa de
lavado intermedia normalmente precede la etapa de elución del
anticuerpo.
La invención proporciona, además, una composición
que comprende una mezcla de un anticuerpo anti-HER2
y una o más variantes acídicas del mismo, en donde la cantidad de
la(s) variante(s) acídica(s) en la composición
es inferior a aproximadamente un 25% y, preferiblemente, inferior a
aproximadamente un 20%, p.e. en el rango de entre aproximadamente un
1% a un 18%. Opcionalmente, la composición comprende, además, un
vehículo farmacéuticamente aceptable.
La Figura 1 es un diagrama de flujo que muestra
cómo se puede llevar a cabo una cromatografía de intercambio
catiónico alterando la conductividad (p.e. a las concentraciones de
NaCl del Ejemplo 1 de más abajo) o alterando el pH (p.e. a los
valores de pH que se muestran en el diagrama de flujo).
La Figura 2 es un diagrama de flujo que muestra
cómo se puede llevar a cabo una cromatografía de intercambio
aniónico alterando la conductividad (p.e. a las concentraciones de
NaCl que se describen en la figura) o alterando el pH (p.e. a los
valores de pH que se muestran).
La Figura 3 es una señal de absorbancia de una
cromatografía de intercambio catiónico del Ejemplo 1 a escala de
fabricación completa. Están marcados con flechas los puntos en los
que se lava la columna con los diferentes tampones descritos en el
presente documento.
La Figura 4 describe un anticuerpo monoclonal
recombinante humanizado anti-HER2 (rhuMAbHER2)
recuperado en cada fracción de la cromatografía (calculada como el
porcentaje del total de la suma de todas las fracciones de la
cromatografía pertinente).
Las fracciones de flujo continuo, etapas de
lavado y previas a la recolección "prepool" son todas
las muestras eluyentes recogidas desde el comienzo de la carga al
inicio de la recolección (en inglés "pooling"). La
fracción de recolección "pool" es la muestra de eluyente con un
volumen de cinco el de la columna en el inicio de la elución en el
punto de inflexión del saliente. La fracción de regeneración
contiene el efluyente capturado desde el final del "pooling"
hasta el final de la regeneración.
La Figura 5 muestra la cualidad de rhuMAbHER2 en
cada muestra pool de la cromatografía de intercambio catiónico
cuando se evalúa por Cromatografía líquida de alta presión de
intercambio catiónico carboxi sulfona (CSx HPIEX). Los picos a, b y
1 son formas desamidadas de rhuMAb HER2. El pico 3 es rhuMAb HER2 no
desamidada. El pico 4 es una combinación del
C-terminal que contiene lisina y las variantes
iso-aspartato de rhuMAb HER2.
La Figura 6 muestra los perfiles de absorbancia
(280 nm) de 0,025 M MES/0,070 M NaCl, pH 5,6 lavada para cada
cromatografía. La masa de rhuMAb HER2 aplicada a la resina de
intercambio catiónico afecta al nivel de absorbancia del pico al
ápice así como la cantidad de tampón requerida hasta alcanzar el
ápice. Debido a los pocos picos que aparecen (como mejor se ve en la
carga de 30 mg/mL) en este lavado, el ápice se define como los
niveles de absorbancia de por lo menos 0,5 unidades de absorbancia
(AU).
La Figura 7A y 7B muestran las secuencias
aminoacídicas de la cadena ligera humMAb4D5-8 (SEC.
ID Nº: 1) y de la cadena pesada humMAb4D5-8 (SEC ID.
Nº:2), respectivamente.
La "composición" a ser purificada, en el
presente documento, comprende el polipéptido de interés y uno o más
contaminantes. La composición puede estar "parcialmente
purificada" (es decir, que haya sido sometida a una o más etapas
de purificación, tales como la cromatografía de la proteína A en el
Ejemplo 1 de más abajo) o se puede obtener directamente de una
célula u organismo hospedador que produzca el polipéptido (p.e. la
composición puede comprender un fluido recogido de un cultivo
celular).
Tal y como se utiliza en el presente documento,
"polipéptido" se refiere, de manera general, a péptidos y
proteínas que tienen más de aproximadamente diez aminoácidos.
Preferiblemente, el polipéptido es una proteína de mamífero,
ejemplos de la cual incluyen renina; una hormona del crecimiento
incluyendo la hormona de crecimiento humana y la hormona de
crecimiento bovina; factor liberador de hormonas de crecimiento;
hormona paratiroide; hormona estimulante de tiroides; lipoproteínas;
alfa-1-antitripsina; cadena A de la
insulina; cadena B de la insulina; proinsulina; hormona estimulante
de folículo; calcitonina; hormona luteinizante; glucagón; factores
de coagulación tales como el factor VIIIC, factor IX, factor tisular
y factor von Willebrands; factores anticoagulación tales como la
proteína C; factor natriurético atrial; tensioactivo del pulmón;
activador de plasminógeno, tal como la uroquinasa o activador de
plasminógeno de tipo urina humana o tisular (t-PA);
bombesina; trombina; factor de crecimiento hematopoyético factor
alfa y beta de necrosis tumoral; enquefalinasa; RANTES (regulada en
la activación común de células T, expresada y secretada); proteína
inflamatoria de macrófago humana
(MIP-1-alfa); albúmina de suero tal
como albúmina de suero humano; sustancia inhibidora de Muellerian;
cadena A de la relaxina; cadena B de la relaxina; prorelaxina;
péptido asociado a gonadotropina de ratón; proteína microbiana, tal
como la beta-lactamasa; DNasa; IgE; antígeno
asociado a linfocito T citotóxico (CTLA), tal como
CTLA-1; inhibina; activina; factor de crecimiento
endotelial vascular (VEGF); receptores para hormonas o factores de
crecimiento; proteína A o D; factores reumatoides; factor
neurotrófico tal como factor neutrófico tal como el factor
neurotrófico derivado de hueso (BDNF),
neurotrofina-3, -4,-5 o -6 (NT-3,
NT-4, NT-5 o NT-6),
o un factor de crecimiento nervioso tal como
NGF-\beta; factor de crecimiento derivado de
plaquetas (PDGF); factor de crecimiento de fibroblasto tal como aFGF
y bFGF; factor de crecimiento epidérmico (EGF); factor de
crecimiento transformante (TGF) tal como el TGF-alfa
y TGF-beta, incluyendo TGF-\beta1,
TGF-\_\beta2, TGF-\_\beta3, TGF-\_\beta4 o TGF-\_\beta5;
factor de crecimiento I y II similar a insulina
(IGF-I y IGF-II);
des(1-3)-IGF-I
(IGF-1 del cerebro); factor de crecimiento similar a
insulina de unión a proteínas (IGFBPs); proteínas CD tales como CD3,
CD4, CD8, CD19 y CD20; eritropietina; factores osteoinductivos;
inmunotoxinas; proteína morfogenética de hueso (BMP); un interferón
tal como interferón-alfa, -beta y -gamma; factores
estimulantes de colonias (CSFs), p.e. M-CSF,
GM-CSF y G-CSF; interleuquinas
(ILs), p.e. IL-1 a IL-10; superóxido
dismutasa; receptores de células T; proteínas de superficie de
membrana; factor de aceleración de decaimiento; antígenos virales
tales como, por ejemplo, una porción de la envoltura del AIDS;
proteínas de transporte; receptores de "homing"; adresinas;
proteínas reguladoras; integrinas, tales como CD11a, CD11b, CD11c,
CD18, ICAM, VLA-4 y VCAM; antígeno asociado a tumor
tal como el receptor de HER2, HER3 o HER4; fragmentos y/o variantes
de cualquiera de los polipéptidos de la lista de más arriba. Más
preferido es un anticuerpo de longitud completa que se una a HER2
humana.
Un "contaminante" es un material que difiere
del producto polipeptídico deseado. El contaminante puede ser una
variante del polipéptido deseado (p.e. una variante desamidada o una
variante amino-aspartato del polipéptido deseado) u
otro polipéptido, ácido nucleico, endotoxina, etc.
Una "variante" o "variante de secuencia
aminoacídica" de un polipéptido de partida es un polipéptido que
comprende una secuencia aminoacídica diferente de la del polipéptido
de partida. En general, la variante poseerá por lo menos un 80% de
identidad de secuencia, preferiblemente por lo menos un 90% de
identidad de secuencia, más preferiblemente por lo menos un 95% de
identidad de secuencia y, más preferiblemente por lo menos un 98% de
identidad de secuencia con el polipéptido nativo. El porcentaje de
identidad de secuencia se determina, por ejemplo, mediante Fitch
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:
1382-1386 (1983), versión del algoritmo descrito por
Needleman et al., J. Mol. Biol.
48:443-453 (1970), después del alineamiento de las
secuencias para dar la máxima homología. Las variantes de secuencia
aminoacídica de un polipéptido se pueden preparar introduciendo los
cambios de nucleótidos apropiados en el DNA codificante del
polipéptido o por síntesis peptídica. Dichas variantes incluyen, por
ejemplo, deleciones de, y/o inserciones en y/o sustituciones de,
residuos en la secuencia aminoacídica del polipéptido de interés.
Cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución se
realiza para llegar a la construcción final, con tal de que la
construcción final posea las características deseadas. Los cambios
aminoacídicos también pueden alterar los procesos
post-traduccionales del polipéptido, tal como
cambiar el número o posición de sitios de glicosilación.
Procedimientos para generar variantes de secuencias aminoacídicas de
polipéptidos, se describen en la patente US Nº 5.534.615, que se
incluye aquí por referencia, por ejemplo.
Una "variante acídica" es una variante de un
polipéptido de interés que es más acídico (p.e. cuando se determina
mediante cromatografía de intercambio catiónico) que el polipéptido
de interés. Un ejemplo de variante acídica es una variante
desamidada.
Una variante "desamidada" de una molécula
polipeptídica es un polipéptido en donde uno o más residuo(s)
de asparagina del polipéptido original se ha(n) convertido en
aspartato, es decir, la cadena lateral amida neutra se ha convertido
en un residuo con un carácter completamente acídico. El anticuerpo
humMAb4D5 desamidado del Ejemplo de más abajo tiene Asn30 en CDR1,
en cualquiera o ambas regiones V_{L} de la misma, convertida en
aspartato. El término "DNasa humana desamidada" tal y como se
utiliza en el presente documento significa Dnasa humana que está
desamidada en el residuo de asparagina que se encuentra en la
posición 74 de la secuencia aminoacídica de la DNasa humana nativa
madura (patente US 5.279.823; incorporada expresamente aquí por
referencia).
El término "mezcla" tal y como se utiliza en
el presente documento, en referencia a una composición que comprende
un anticuerpo anti-HER2, significa la presencia de
tanto el anticuerpo anti-HER2 deseado como de una o
más variantes acídicas del mismo. Las variantes acídicas pueden
comprender predominantemente un anticuerpo anti-HER2
desamidado, con cantidades mínimas de otra(s)
variante(s) acídica(s). Se ha encontrado, por ejemplo,
que en las preparaciones de anticuerpo anti-HER2,
obtenidas de la expresión recombinante, se desamidada tanto como
aproximadamente un 25% del anticuerpo anti-HER2.
En realizaciones preferidas de la invención, el
polipéptido es un polipéptido recombinante. Un "polipéptido
recombinante" es uno que ha sido producido en una célula
hospedadora que ha sido transformada o transfectada con el ácido
nucleico codificante del polipéptido, o produce el polipéptido como
resultado de la recombinación homóloga. "Transformación" y
"transfección" se utilizan de manera intercambiable para
referirse al procedimiento de introducción del ácido nucleico en una
célula. Después de la transformación o transfección, el ácido
nucleico puede integrarse en el genoma de la célula hospedadora o
puede existir como un elemento extracromosomal. La "célula
hospedadora" incluye una célula en un cultivo celular in
vitro así como una célula en un animal hospedador. En la patente
US 5.534.615, incorporada expresamente aquí por referencia, se
describen, por ejemplo, procedimientos para la producción
recombinante de polipéptidos.
El término "anticuerpo" se utiliza en el
sentido más amplio y cubre específicamente anticuerpos monoclonales
(incluyendo los anticuerpos monoclonales de longitud completa),
anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (p.e.
anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpos tan largos
como para que exhiban la actividad biológica deseada.
El anticuerpo aquí descrito se dirige contra un
"antígeno" de interés. Preferiblemente, el antígeno es un
polipéptido biológicamente importante y la administración del
anticuerpo a un mamífero que sufra de una enfermedad o alteración
puede resultar en un beneficio terapéutico al mamífero. Sin embargo,
también se contemplan los anticuerpos dirigidos contra antígenos no
polipeptídicos (tales como antígenos glicolípidos asociados a tumor;
véase patente US 5.091.178). Cuando el anticuerpo es un polipéptido,
este puede ser una molécula transmembrana (p.e. un receptor) o un
ligando tal como un factor de crecimiento. Antígenos ejemplificantes
incluyen los polipéptidos discutidos más arriba. Objetivos
moleculares preferidos para los anticuerpos comprendidos en la
presente invención incluyen los polipéptidos CD tales como CD3, CD4,
CD8, CD19, CD20 y CD34; miembros de la familia de receptores de HER
tales como el receptor de EGF, HER2, HER3 o HER4; moléculas de
adhesión celular tales como LFA-1, Mac1, p150.95,
VLA-4, ICAM-1, VCAM y la integrina
av/b3, incluyendo las subunidades a o b del mismo (p.e. anticuerpos
anti-CD 11a, anti-CD 18 o
anti-CD 11b); factores de crecimiento tal como VEGF;
IgE; antígenos de grupos sanguíneos; receptor flk2/flt3; receptor de
la obesidad (OB); receptor mpl; CTLA-4;
polipéptido C, etc. Se pueden utilizar antígenos o fragmentos de los
mismos solubles como inmunógenos, opcionalmente conjugados a otras
moléculas para generar anticuerpos. Para las moléculas
transmembrana, dichos receptores, fragmentos de estos (pe. El
dominio extracelular de un receptor). Alternativamente, las células
que expresan la molécula transmembrana se pueden utilizar como
inmunógeno. Dichas células pueden derivar de una fuente natural
(p.e. líneas celulares cancerígenas) o pueden ser células que se han
transformado mediante técnicas recombinantes para expresar la
molécula transmembrana.
El término "anticuerpo monoclonal" tal y
como se utiliza en el presente documento, se refiere a un anticuerpo
obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea,
es decir, anticuerpos individuales que comprenden la población son
idénticos excepto en las mutaciones que se pueden dar de manera
natural que pueden estar presentes en cantidades menores. Los
anticuerpos monoclonales son altamente específicos, estando
dirigidos contra un único sitio antigénico. Además, en contraste con
las preparaciones de anticuerpos (policlonales) convencionales que
típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra
diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal está
dirigido contra un único determinante en el antígeno. El modificador
"monoclonal" indica el carácter del anticuerpo, por ser
obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea y
que no es para ser construido cuando se requiere la producción del
anticuerpo mediante cualquier procedimiento determinado. Por
ejemplo, los anticuerpos monoclonales a ser utilizados de acuerdo
con la presente invención se pueden preparar mediante el primer
procedimiento de hibridoma descrito primero por Kohler et
al., Nature 256:495(1975), o se pueden preparar
mediante procedimientos de DNA recombinantes (véase, p.e. patente US
4.816.567). En otra realización, se pueden aislar los "anticuerpos
monoclonales" de librerías de fagos generadas utilizando las
técnicas descritas en McCafferty et al., Nature,
348:552-554 (1990). Claxon et al.,
Nature, 352: 624-628 (1991) y Marks et
al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)
describen el asilamiento de anticuerpos de murina y humanos,
respectivamente, utilizando librerías de fagos. Publicaciones
posteriores describen la producción de anticuerpos humanos de
elevada afinidad (rango de nM) mediante "chain
shuffling" (Marks et al., Biol. Technology,
10:779-783 (1992)), así como la infección
combinatoria y la recombinación in vivo como estrategia para
la construcción de librerías de fagos muy amplias (Waterhouse et
al., Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266
(1993)). De esta manera, estas técnicas son alternativas viables a
las técnicas de hibridoma de anticuerpos monoclonales tradicionales
para el aislamiento de anticuerpos monoclonales. De manera
alternativa, ahora es posible producir animales transgénicos (p.e.
ratones) que son capaces, en la inmunización, de producir un
repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción
de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la
deleción homocigoto del gen de la región de unión de cadena pesada
del anticuerpo (J_{H}) en ratones quiméricos y mutantes en la
línea germinal resulta en una inhibición completa de la producción
endógena de anticuerpos. La transferencia del gen de la
inmunoglobulina de la línea germinal humana se basa en que dichos
ratones mutantes en la línea germinal resultará en la producción de
anticuerpos humanos en el reto del antígeno. Véase, pe., Jakobovits
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993);
Jakobovits et al., Nature, 362:
255-258 (1993); Bruggermann et al., Year
in Immuno., 7:33 (1993); y Duchosal et al., Nature
355: 258 (1992).
Los anticuerpos monoclonales aquí especificados
incluyen, de manera específica, anticuerpos "quiméricos"
(inmunoglobulinas) en los que una región de la cadena pesada y/o
ligera es idéntica a u homóloga a las secuencias correspondientes en
anticuerpos procedentes de un especie determinada o perteneciente a
una clase o subclase de anticuerpos determinados, mientras que
la(s) cadena(s) restante(s) es(son)
idéntica(s) a, o homóloga(s) a, las secuencias
correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies o
pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos, así como
fragmentos de dichos anticuerpos, de manera que exhiban la actividad
biológica deseada (patente US 4.816.567; y Morrison et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855
(1984)).
El término "región hipervariable" cuando se
utiliza en el presente documento, se refiere a los residuos de
aminoácidos de un anticuerpo que son responsables de la unión a
antígeno. La región hipervariable comprende residuos de aminoácidos
de una "región determinante de complementariedad" o "CDR"
(p.e. residuos 24-34 (L1), 50.56 (L2) y
89-97 (L3) en el dominio variable de la cadena
ligera y 31-35 (H1), 50-65 (H2) y
95-102 (H3) en el dominio variable de la cadena
pesada; Kabat et al., Sequences of Polypeptides of
Immunological Interest, 5th Edition Public Health Service,
National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1991)) y/o aquellos
residuos de un "bucle hipervariable" (p.e. residuos
26-32 (L1), 50-52 (L2) y
91-96 (L3) en el dominio variable de la cadena
ligera y 26-32 (H1), 53-55 (H2) y
96-101 (H3) en el dominio variable de la cadena
pesada; Chothia and Lesk J. Mol. Biol.
196:901-917 (1987)). Los residuos de sostén (en
inglés "framework") o "FR" son aquellos residuos del
dominio variable diferentes de los residuos de la región
hipervariable, tal y como se han definido en el presente documento.
Los residuos CDR y FR del anticuerpo rhuMAb HER2 del ejemplo de más
abajo (humAb4D5-8) se identifican en Carter et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)).
Formas "no humanizadas" de anticuerpos no
humanos (p.e. murina) son anticuerpos quiméricos que contienen una
secuencia mínima procedente de una inmunoglobulina no humana. En la
mayoría de casos, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas
humanas (anticuerpos receptores) en los que los residuos de las
regiones hipervariables del receptor se han sustituido por residuos
de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo
donante) como ratón, rata, conejo o un primate no humano que tenga
la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos,
los residuos de sostén (FR) de la región (F_{V})de
inmunoglobulina humana se sustituyen por los correspondientes
residuos no humanos. Además, los anticuerpos humanizados pueden
comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o
en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se realizan para
refinar más la función del anticuerpo. En general, el anticuerpo
humanizado comprenderá sustancialmente todo de por lo menos uno, y
generalmente dos, dominios variables, en los que todos o
prácticamente todos los bucles hipervariables corresponden a los de
una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las
regiones FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El
anticuerpo humanizado también comprenderá, opcionalmente, por lo
menos una parte de una región constante de la inmunoglobulina (Fc),
en general de una inmunoglobulina humana.
La elección de dominios variables humanos, tanto
de cadena ligera como pesada, para ser utilizados en la preparación
de anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la
antigenicidad. De acuerdo con el denominado procedimiento de
"best-fit", la secuencia del dominio variable
de un anticuerpo de roedor se criba en la librería completa de
secuencias de dominios variables humanas conocidas. La secuencia
humana que está más cercana a la del roedor es, a continuación,
aceptada como la sostén humana (FR) para el anticuerpo humanizado
(Sims et al., J.
Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al, J. Mol.
Biol., 196:901 (1987)).
Otro procedimiento utiliza un framework
determinado procedente de la secuencia consenso de todos los
anticuerpos humanos de un determinado subgrupo de cadenas ligeras o
pesadas. El mismo framework se puede utilizar para varios
anticuerpos humanizados diferentes (Carter et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al.,
J. Immunol., 151:2623 (1993)).
Es además importante que los anticuerpos sean
humanizados con retención de una elevada afinidad por el antígeno y
otras propiedades biológicas favorables. Para conseguir este
objetivo, de acuerdo con un procedimiento preferido, los anticuerpos
humanizados se preparan mediante un procedimiento de análisis de
secuencias parenterales y varios productos humanizados conceptuales,
utilizando modelos tridimensionales de las secuencias parenterales y
humanizadas. Los modelos de inmunoglobulina tridimensionales son
comúnmente asequibles y familiares para aquellos expertos en la
materia. Los programas de ordenador son asequibles, ilustran y
exhiben estructuras conformacionales tridimensionales probables de
secuencias de inmunoglobulinas candidatas seleccionadas. La
inspección de estas exhibiciones permiten el análisis del papel
similar de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de
inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de residuos que
influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata a unirse a
su antígeno.
De esta manera, los residuos de FR se pueden
seleccionar y combinar del receptor e importar las secuencias de tal
manera que se consiga la característica deseada del anticuerpo, tal
como un incremento de la afinidad para el(los)
antígeno(s) objetivo. En general, los residuos CDR están
implicados de manera directa y muy sustancialmente en influenciar la
unión a antígeno.
Los "fragmentos de anticuerpos" comprenden
una parte de un anticuerpo de longitud completa, generalmente la
región de unión a antígeno o variable, del mismo. Ejemplos de
fragmentos de anticuerpos incluyen los fragmentos Fab, Fab',
F(ab')_{2} y F_{v}; homodímeros bivalentes (en inglés
"diabodies"); anticuerpos lineales; moléculas de
anticuerpo de cadena sencilla; y anticuerpos multiespecíficos
formados por fragmentos de anticuerpos. Se han desarrollado varias
técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos.
Tradicionalmente, estos fragmentos proceden de la digestión
proteolítica de anticuerpos intactos (véase p.e. Morimoto et
al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods
24:107-117 (1992) y Brennan et al.,
Science, 229:81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos se
pueden producir ahora, de manera directa, mediante células
hospedadoras recombinantes. Por ejemplo, los fragmentos de
anticuerpos se pueden aislar de las librerías de fagos de
anticuerpos discutidas más arriba. De manera alternativa, los
fragmentos Fab'-SH se pueden recuperar,
directamente, de E. coli y unirse, químicamente, para formar
fragmentos F(ab')_{2} (Carter et al.,
Bio/Technology 10:163-167 (1992)). En otra
realización, el F(ab')_{2} se forma utilizando la
cremallera de leucinas GCN4 para promover el ensamblaje de la
molécula F(ab')_{2}. De acuerdo con otra aproximación, se
pueden aislar directamente los fragmentos de F(ab')_{2} del
cultivo de células hospedadoras recombinantes. Otras técnicas para
la producción de fragmentos de anticuerpos serán evidentes para los
practicantes expertos.
En otras realizaciones, el anticuerpo de elección
es un fragmento F_{v} de cadena sencilla (scFv). Véase WO
93/16185. El "Fv de cadena sencilla" o los "fragmentos de
anticuerpos scFv" comprenden los dominios V_{H} y V_{L} del
anticuerpo, en donde estos dominios están presentes en una cadena
polipeptídica sencilla. En general, el polipéptido F_{v}
comprende, además, un engarce polipeptídico entre los dominios
V_{H} y V_{L} que permite que sFv forme la estructura deseada
para la unión a antígeno. Para una revisión de sFv véase Pluckthun
en Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg
and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pág.
269-315 (1994).
El término "homodímeros bivalentes" se
refiere a fragmentos de anticuerpos pequeños con dos sitios de unión
a antígeno, comprendiendo estos fragmentos un dominio variable de
cadena pesada (V_{H}) conectado a un dominio variable de cadena
ligera (V_{L}) en la misma cadena polipeptídica
(V_{H}-V_{L}). Utilizando un engarce que sea
demasiado corto para dejar que se emparejen los dos dominios en la
misma cadena, se fuerzan los dominios a emparejarse con los dominios
complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión a
antígeno. Los homodímeros bivalentes se describen, con más detalle
en, por ejemplo, EP 404.097, WO 93/11161; y Hollinger et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448
(1993).
La expresión "anticuerpos lineales" cuando
se utiliza en esta solicitud, se refiere a los anticuerpos descritos
en Zapata et al., Polypeptide Eng.
8(10):1057-1062 (1995). Brevemente, estos
anticuerpos comprenden un par de segmentos tándem Fd
(V_{H}-C_{H}1-V_{H}-C_{H}1)
que forman un par de regiones de unión a antígeno. Los anticuerpos
lineales pueden ser biespecíficos o monoespecíficos.
Los "anticuerpos multiespecíficos" tienen
especificidades de unión para, por lo menos, dos epítopos
diferentes, en donde los epítopos son, normalmente, de antígenos
diferentes. Mientras que tales moléculas normalmente se unirán solo
a dos antígenos (es decir, anticuerpos biespecíficos, BsAbs),
anticuerpos con especificidades adicionales tales como los
anticuerpos triespecíficos, se engloban dentro de la expresión
cuando es utilizada en el presente documento. Ejemplos de BsAbs
incluyen aquellos con un brazo dirigido contra un antígeno de célula
tumoral y el otro brazo dirigido contra una molécula citotóxica
inductora tal como
anti-Fc\gammaRI/anti-CD15,
anti-p185^{HER2}/Fc\gammaRIII
(CD16), anti-CD3/anti-célula B
maligna (1D10),
anti-CD3/anti-p185^{HER2},
anti-CD3/anti-p97,
anti-CD3/anti-célula renal de
carcinoma,
anti-CD3/anti-OVCAR-3,
anti-CD3/L-D1
(anti-carcinoma de colon); anti-CD3/
análogo de la hormona anti-melanocitoestimuladora,
receptor anti-EGF/anti-CD3,
anti-CD3/anti-CAMA1,
anti-CD3/anti-CD19,
anti-CD3/MoV 18, anti-molécula de
adhesión de una célula neuronal (NCAM)/anti-CD3;
proteína de unión anti-folato
(FBP)/anti-CD3; antígeno asociado a carcinoma
anti-pan
(AMOC-31)/ANTI-CD3, BsAbs con un
brazo que se une específicamente a un antígeno tumoral y un brazo
que se une a una toxina tal como
anti-saporina/anti-Id-1,
anti-CD22/anti-saporina,
anti-CD7/anti-saporina,
anti-CD38/anti-saporina,
anti-CEA/cadena A de anti-ricina,
anti-interferón \alpha
(IFN-\alpha)/idiotipo
anti-hibridoma, anti-CEA/alcaloide
anti-vinca; BsAbs para la conversión de profármacos
activados por enzima tales como
anti-CD30/anti-fosfatasa alcalina,
(que cataliza la conversión del fármaco fosfato de mitomicina en el
alcohol mitomicina); BsAbs que se pueden utilizar como agentes
fibrinolíticos tales como
anti-fibrina/anti-activador tisular
de plasminógeno (tPA),
anti-fibrina/anti-activador de
plasminógeno del tipo uroquinasa (uPA); BsAbs para la designación de
complejos inmunes a receptores de superficie celular tales como
anti-lipoproteínas de baja densidad
(LDL)/anti-receptor Fc (p.e. Fc\gammaRI o
Fc\gammaIII); BsAbs para utilizar en la terapia de enfermedades
infecciosas tales como
anti-CD3/anti-virus del herpes
simple (HSV), anti-receptor de célula T; complejo
CD3/anti-gripe,
anti-Fc\gammaR/anti-HIV; BsAbs
para la detección de tumores in vitro o in vivo tales
como anti-CEA/anti-EOTUBE,
anti-CEA/anti-DPTA,
anti-p185^{HER2}/anti-hapteno;
BsAbs como adyuvantes de vacunas; y BsAbs como herramientas de
diagnóstico, tales como anti-IgG de
conejo/anti-ferritina,
anti-peroxidasa de rábano
(HRP)/anti-hormona,
anti-somatostatina/anti-sustancia P,
anti-HRP/anti-FITC,
anti-CEA/anti-\beta-galactosidasa.
Ejemplos de anticuerpos triespecíficos incluyen
anti-CD3/anti-CD4/anti-CD37,
anti-CD3/anti-CD5/anti-CD37
y
anti-CD3/anti-CD8/anti-CD37.
Los anticuerpos biespecíficos se pueden preparar como anticuerpos
de longitud completa o fragmentos de anticuerpos (p.e. anticuerpos
biespecíficos F(ab')2).
En el estado de la técnica se conocen
procedimientos para la preparación de anticuerpos biespecíficos. La
producción tradicional de anticuerpos biespecíficos de longitud
completa se basa en la coexpresión de dos pares de cadena
pesada-cadena ligera de inmunoglobulinas, en donde
las dos cadenas tienen diferentes especificidades (Millstein et
al., Nature, 305:537-539 (1983)). Debido
a la variedad aleatoria de cadenas de inmunoglobulinas pesadas y
ligeras, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial
de 10 moléculas de anticuerpo diferentes, de las cuales sólo una
tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la
molécula correcta, que se realiza frecuentemente por etapas de
cromatografía de afinidad, es bastante engorrosa y los rendimientos
de producto son bajos. Procedimientos similares se describen en WO
93/08829 y en Traunecker et al., EMBO J.,
10:3655-3659 (1991)).
De acuerdo con una aproximación diferente, los
dominios variables de los anticuerpos con las especificidades de
unión deseadas (sitios de combinación
anticuerpo-antígeno) se fusionan con las secuencias
del dominio constante de la inmunoglobulina. Preferiblemente, la
fusión tiene lugar con un dominio constante de la cadena pesada de
la inmunoglobulina, comprendiendo, por lo menos, parte de las
regiones bisagra, CH2 y CH3. Es preferido tener la primera región
constante de la cadena pesada (CH1) conteniendo el sitio necesario
para la unión de la cadena ligera, presente en por lo menos una de
las fusiones. Los DNAs codificantes de las fusiones de cadenas
pesadas de inmunoglobulinas y, si se desea, de cadenas ligeras de
inmunoglobulinas se insertan en vectores de expresión separados y
son co-transfectados en un organismo hospedador
adecuado. Esto da lugar a una gran flexibilidad en el ajuste de las
proporciones mutuas de los tres fragmentos de polipéptidos en
realizaciones donde las proporciones no igualadas de las tres
cadenas polipeptídicas utilizadas en la construcción, proporciona
los rendimientos óptimos. Es posible, sin embargo, insertar las
secuencias codificantes para dos o las tres cadenas polipeptídicas
en un vector de expresión cuando la expresión de por lo menos dos
cadenas polipeptídicas en relaciones iguales resulta en unos
rendimientos mayores o cuando las relaciones no son especialmente
significativas.
En una realización preferida de esta
aproximación, los anticuerpos biespecíficos están compuestos por una
cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera
especificidad de unión en un brazo y un par de cadena
ligera-cadena ligera de una inmunoglobulina híbrida
(proporcionando una segunda especificidad) en el otro brazo. Se
encontró que la estructura asimétrica facilita la separación del
compuesto biespecífico deseado de las combinaciones de cadenas de
inmunoglobulinas no deseadas, así como la presencia de una cadena
ligera de inmunoglobulina en sólo una mitad de la molécula
biespecífica proporciona una manera sencilla de separación. Esta
aproximación se describe en WO94/04690. Para más detalles de la
generación de anticuerpos biespecíficos, véase, por ejemplo, Suresh
et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).
De acuerdo con otra aproximación descrita en
WO96/27011, se puede manipular genéticamente la interfase entre un
par de moléculas de anticuerpo para maximizar el porcentaje de
heterodímeros que se recuperan del cultivo celular recombinante. La
interfase preferida comprende por lo menos una parte del dominio CH3
de un dominio constante de un anticuerpo. En este procedimiento, una
o más cadenas laterales pequeñas de aminoácidos de la interfase de
la primera molécula de anticuerpo se sustituyen por cadenas de
tamaño mayor (p.e. tirosina o triptófano). Se crean "cavidades"
compensatorias de tamaño idéntico o similar a la(s)
cadena(s) lateral(es) grande(s) en la interfase
de la segunda molécula de anticuerpo mediante sustitución de cadenas
laterales de aminoácidos grandes por otras más pequeñas (p.e.
alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para aumentar el
rendimiento del heterodímero respecto otros productos finales no
deseados tales como homodímeros.
Anticuerpos biespecíficos incluyen los
anticuerpos reticulados o "heteroconjugados". Por ejemplo, uno
de los anticuerpos en el heteroconjugado se puede acoplar a avidina,
el otro a biotina. Dichos anticuerpos han sido propuestos, por
ejemplo, para designar células del sistema inmune hacia células no
deseadas (patente US Nº 4.676.980) y para el tratamiento de la
infección por HIV (WO 91/00360, WO 92/200373 y EP 03089). Los
anticuerpos heteroconjugados se pueden preparar utilizando
cualquiera de los procedimientos de reticulación adecuados. Son bien
conocidos en el estado de la técnica agentes de reticulación
adecuados y se describen en la patente US Nº 4.676.980 junto con una
serie de técnicas de reticulación.
También se han descrito en la literatura técnicas
para la generación de anticuerpos biespecíficos a partir de
fragmentos de anticuerpos. Por ejemplo, se pueden preparar los
anticuerpos biespecíficos utilizando engarces químicos. Brennan
et al., Science, 229: 81 (1985) describe un
procedimiento en donde los anticuerpos intactos se cortan
proteolíticamente para generar fragmentos F(ab')2. Estos
fragmentos se reducen en presencia del agente complejante ditiol
arsenito sódico para estabilizar los ditioles vicinales y prevenir
la formación de disulfuros intermoleculares. Los fragmentos Fab'
generados se convierten, a continuación, en derivados del
tionitrobenzoato (TNB). Uno de los derivados
Fab'-TNB se reconvierte, a continuación, en el
Fab'-tiol mediante reducción con mercaptoetilamina y
se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado
Fab'-TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los
anticuerpos biespecíficos producidos se pueden utilizar como agentes
para la inmovilización selectiva de enzimas.
Un progreso reciente ha facilitado la
recuperación directa de fragmentos Fab'-SH
procedentes de E. coli, los cuales se pueden acoplar
químicamente para formar anticuerpos biespecíficos. Shalaby et
al., J. Exp. Med., 175:217-225 (1992)
describen la producción de una molécula de anticuerpo
F(ab')_{2} biespecífico completamente humanizado. Cada
fragmento Fab' se secreta separadamente de E. coli y se
somete al acoplamiento químico dirigido in vitro para formar
el anticuerpo biespecífico.
También se han descrito diversas técnicas para
preparar y aislar directamente fragmentos de anticuerpos
biespecíficos de un cultivo celular recombinante. Por ejemplo, se
han producido anticuerpos biespecíficos utilizando cremalleras de
leucina. Kostelny et al., J. Immunol.,
148(5):1547-1553 (1992). Los péptidos de la
cremallera de leucina procedentes de proteínas Fos y Jun se unen a
regiones de Fab' de dos anticuerpos diferentes mediante fusión
génica. Los homodímeros de anticuerpos se reducen a la región
bisagra para formar monómeros y, a continuación, se vuelven a oxidar
para formar los heterodímeros de anticuerpos. Este procedimiento se
puede utilizar para la producción de homodímeros de anticuerpos. La
tecnología del homodímero bivalente descrita por Hollinger et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo
alternativo para la preparación de anticuerpos biespecíficos. Los
fragmentos comprenden un dominio variable de la cadena pesada
(V_{H}) conectado a un dominio variable de la cadena ligera
(V_{L}) mediante un engarce que es demasiado corto para dejar que
se emparejen los dos dominios en la misma cadena. De acuerdo con
esto, los dominios V_{H} y V_{L} de un fragmento se fuerzan para
que se emparejen con los dominios complementarios V_{L} y V_{H}
del otro fragmento, formando, de este modo, dos sitios de unión a
antígeno. También ha sido publicada otra estrategia para la
preparación de fragmentos de anticuerpos biespecíficos mediante el
uso de dímeros de cadena sencilla Fv (sFV). Véase Gruber et
al., J. Immnuol., 152:5368 (1994).
Se contemplan anticuerpos con más de dos
valencias. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos
triespecíficos. Tutt et al., J. Immunol. 147:60
(1991).
La frase "material de intercambio iónico" se
refiere a una fase sólida que está cargada negativamente (es decir,
resina de intercambio catiónico) o cargada positivamente (es decir,
una resina de intercambio aniónico). La carga se puede proporcionar
mediante la unión de uno o más ligandos cargados a la fase sólida,
p.e., mediante unión covalente. De manera alternativa, o además, la
carga puede ser una propiedad inherente de la fase sólida (p.e. es
el caso de la sílice que tiene una carga neta negativa).
Por "fase sólida" se entiende una matriz no
acuosa a la que se pueden adherir uno o más ligandos cargados. La
fase sólida puede ser una columna de purificación, una fase
discontínua de partículas discretas, una membrana, un filtro, etc.
Ejemplos de materiales para formar la fase sólida incluyen
polisacáridos (tales como agarosa y celulosa); y otras matrices
estables mecánicamente tales como ela sílice (p.e. cristal de poro
controlado), poli(estirendivinil)benceno,
poliacrilamida, partículas de cerámica y derivados de cualquiera de
lo anterior.
Una "resina de intercambio catiónico" se
refiere a una fase sólida que está cargada negativamente y que,
además, tiene cationes libres para el intercambio con cationes en
una solución acuosa pasada por o través de una fase sólida. Un
ligando cargado negativamente unido a la fase sólida para formar la
resina de intercambio catiónico, puede ser p.e. un carboxilato o
sulfonato. Resinas de intercambio catiónico comercialmente
disponibles incluyen carboximetilcelulosa, BAKERBOND ABX™,
sulfopropil(SP) inmovilizado en agarosa (p.e.
SP-SEPHAROSE FAST FLOW™ o
SP-SEPHAROSE HIGH PERFORMANCE™, de Pharmacia) y
sulfonil inmovilizada en agarosa (p.e. S-SEPHAROSE
FAST FLOW™ de Pharmacia).
El término "resina de intercambio aniónico"
se utiliza aquí para referirse a una fase sólida que está cargada
positivamente, p.e. teniendo uno o más ligandos cargados
positivamente, tales como grupos amonio cuaternarios, unidos a los
mismos. Resinas de intercambio aniónico disponibles comercialmente
incluyen DEAE celulosa, QAE SEPHADEX™ y FAST Q SEPHAROSE™
(Pharmacia).
Un "tampón" se una solución que resiste
cambios de pH por la acción de componentes conjugados
ácido-base. Se pueden utilizar diferentes tampones
que dependiendo de, por ejemplo, el pH deseado del tampón, se
describen en Buffers. A Guide for the Preparation and Use of
Buffers in Biological Systems, Gueffroy, D., ED. Calbiochem
Corporation (1975). En una realización, el tampón tiene un pH en el
rango de aproximadamente 5 a aproximadamente 7 (p.e. como en el
Ejemplo 1 de más abajo). Ejemplos de tampones que controlarán el pH
en este rango incluyen los tampones MES, MOPS, MOPSO, fosfato,
acetato, citrato, succinato y amonio, así como combinaciones de
estos.
El "tampón de carga" es aquel que se utiliza
para cargar la composición que comprende la molécula polipeptídica
de interés y uno o más contaminantes en la resina de intercambio
iónico. El tampón de carga tiene una conductividad y/o pH tal que la
molécula polipeptídica de interés (y generalmente uno o más
contaminantes) se une(n) a la resina de intercambio
iónico.
EL "tampón intermedio" se utiliza para eluir
uno o más contaminantes de la resina de intercambio iónico, antes de
la elución de la molécula polipeptídica de interés. La conductividad
y/o pH del tampón intermedio es/son tal(es) que el
contaminante eluye de la resina de intercambio iónico pero no en
cantidades significativas del polipéptido de interés.
El "tampón de lavado" cuando se utiliza en
el presente documento se refiere a un tampón utilizado para lavar o
volver a equilibrar la resina de intercambio iónico, antes de la
elución de la molécula polipeptídica de interés. Convenientemente,
el tampón de lavado y de carga pueden ser el mismo, pero esto no es
un requisito.
El "tampón de elución" se utiliza para eluir
el polipéptido de interés de la fase sólida. La conductividad y/o pH
del tampón de elución es/son tal(es) que el polipéptido de
interés eluye de la resina de intercambio iónico. Un "tampón de
regeneración" se puede utilizar para regenerar la resina de
intercambio iónico de tal manera que puede volverse a utilizar. El
tampón de regeneración tiene una conductividad y/o pH requerido para
eliminar sustancialmente todos los contaminantes y el polipéptido de
interés de la resina de intercambio iónico.
El término "conductividad" se refiere a la
capacidad de una solución acuosa a conducir una corriente eléctrica
entre dos electrodos. En solución, la corriente fluye mediante un
transporte iónico. De esta manera, con un incremento de la cantidad
de iones presentes en la solución acuosa, la solución tendrá una
mayor conductividad. La unidad de medición de la conductividad es
mmhos (mS/cm) y se puede medir utilizando un medidor de
conductividad vendido, p.e., por Orion. La conductividad de una
solución se puede alterar cambiando la concentración de iones en la
misma. Por ejemplo, la concentración de un agente tamponante y/o
concentración de una sal (p.e. NaCl o KCl) en la solución se pueden
alterar con el fin de conseguir la conductividad deseada.
Preferiblemente, la concentración de sal de los diversos tampones se
modifica para conseguir la conductividad deseada como en el Ejemplo
de más abajo.
Por "purificar" un polipéptido de una
composición que comprende el polipéptido y uno o más contaminantes
se entiende incrementar el grado de pureza del polipéptido en la
composición mediante eliminación (completa o parcial) de por lo
menos un contaminante de la composición. Una "etapa de
purificación" puede ser parte de todo el proceso de purificación
que resulte en una composición "homogénea", que se utiliza en
el presente documento para referirse a una composición que comprende
por lo menos un 70% en peso del polipéptido de interés, basado en el
peso total de la composición, preferiblemente por lo menos
aproximadamente un 80% en peso.
A no ser que se indique lo contrario, cuando se
utiliza en el presente documento el término "HER2", se refiere
a la proteína HER2 humana (el factor receptor 2 de crecimiento
epidérmico humano) y "HER2" se refiere al gen
HER2 humano. El gen HER2 y la proteína HER2 humanas se
describen en Semba et al., PNAS (USA)
82:6497-6501 (1985) y Yamamoto et al.,
Nature 319:230-234 (1986) (Número de Acceso
en Genebank X03363), por ejemplo.
El término "humMAb4D5-8"
(anticuerpo monoclonal humanizado 4D5-8) cuando se
utiliza en el presente documento se refiere a un anticuerpo
anti-HER2 humanizado que comprende la secuencia
aminoacídica de la cadena ligera de la SEC ID Nº:1 y la secuencia
aminoacídica de la cadena pesada de SEC ID Nº:2 o variantes de
secuencia aminoacídica de las mismas que retienen la capacidad de
unir HER2 e inhibir el crecimiento de células tumorales que
sobreexpresen HER2 (véase la patente US Nº 5.677.171).
El "pI" o "punto isoeléctrico" de un
polipéptido se refiere al pH al cual la carga positiva del
polipéptido se equilibra con su carga negativa. El pI se puede
calcular a partir de la carga neta de los residuos de aminoácidos
del polipéptido o se puede determinar mediante enfoque isoeléctrico
(p.e. utilizando la cromatografía CSx como en el Ejemplo de más
abajo).
Por "unión" de una molécula a un material de
intercambio iónico se entiende exponer la molécula al material de
intercambio iónico en condiciones apropiadas (pH/conductividad) de
tal manera que la molécula se inmoviliza de manera reversible en o
dentro del material de intercambio iónico en virtud de las
interacciones iónicas entre la molécula y un grupo cargado o grupos
cargados del material de intercambio iónico.
Por "lavado" del material de intercambio
iónico se entiende hacer pasar un tampón adecuado a través o por
encima del material de intercambio iónico.
Para "eluir" una molécula (p.e. un
polipéptido o contaminante) de un material de intercambio iónico se
entiende extraer la molécula de ahí, alterando la fuerza iónica del
tampón que circunda el material de intercambio iónico de manera que
el tampón compite con la molécula por los sitios cargados en el
material de intercambio iónico.
"Tratamiento" se refiere a tanto el
tratamiento terapéutico como el profiláctico o medidas preventivas.
Aquellas necesarias de tratamiento incluyen las ya asociadas con
alteraciones así como en aquellas en las que se previene la
alteración. Una "alteración" es cualquier condición que se
beneficiaría del tratamiento con el polipéptido purificado tal y
como se describe en el presente documento. Esto incluye alteraciones
o desórdenes crónicos y agudos que incluyen aquellas condiciones
patológicas que predisponen al mamífero a la alteración en
cuestión.
La palabra "marcador" cuando se utiliza en
el presente documento se refiere a un compuesto o composición
detectable que está conjugado de manera directa o indirecta al
polipéptido. El marcador puede ser por sí mismo detectable (p.e.
marcadores radioisótopos o marcajes fluorescentes) o, en el caso de
un marcador enzimático, puede catalizar una alteración química de un
compuesto o composición sustrato que sea detectable.
El término "agente citotóxico" cuando se
utiliza en el presente documento se refiere a una sustancia que
inhibe o previene la función de las células y/o causas de
destrucción celular. El término intenta incluir isótopos radiactivos
(p.e. I^{131}, I^{125}, Y^{90} y Re^{186}), agentes
quimioterapéuticos y toxinas tales como las toxinas enzimáticamente
activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o
fragmentos de los mismos.
Un "agente quimioterapéutico" es un
compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Ejemplos de
agentes quimioterapéuticos incluyen la adriamicina, doxorubicina,
epirubicina, 5-fluoruracil, citosinarabinósido
("Ara-C"), ciclofosfamida, tiotepa, busulfán,
citoxina, taxoides, p.e. paclitaxel (TAXOLTM,
Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) y
doxetaxel, toxoteto, metotrexato, cisplatín, melfalán, vinblastina,
bleomicina, etoposida, ifosfamida, mitomicina C, mitoxantrona,
vincristina, vinorelbina, carboplatin, teniposida, daunomicina,
carminomicina, aminopterina, dactinomicina, mitomicinas,
esperamicinas (véase patente US Nº 4.675.187), melfalán y otros
mostazas de nitrógeno relacionados. También están incluidos en esta
definición los agentes hormonales que actúan para regular o inhibir
la acción hormonal en tumores, tales como tamoxifen y
onapristona.
La invención del presente documento proporciona
un procedimiento para la purificación de un polipéptido de una
composición (p.e. una solución acuosa) que comprende el polipéptido
y uno o más contaminantes. La composición es una que resulta,
generalmente, de la producción recombinante del polipéptido, pero
puede ser que resulte de la producción del polipéptido mediante
síntesis peptídica (u otros medios sintéticos) o se puede purificar
el polipéptido de una fuente nativa del polipéptido.
Preferiblemente, el polipéptido es un anticuerpo, p.e., uno que se
una al antígeno HER2.
Para la producción recombinante del polipéptido,
se aísla el ácido nucleico codificante y se inserta en un vector
replicable para la posterior clonación (amplificación del DNA) o
expresión. El DNA codificante del polipéptido se aísla y se
secuencia fácilmente utilizando procedimientos convencionales (p.e.
cuando el polipéptido sea un anticuerpo mediante la utilización de
sondas de oligonucleótidos que sean capaces de unirse a
específicamente a genes codificantes de cadenas pesadas y ligeras
del anticuerpo). Muchos vectores son asequibles. Los componentes del
vector incluyen, generalmente, pero no se limitan a, uno o más de lo
siguiente: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más
marcadores genéticos, un elemento intensificador, un promotor y una
secuencia de finalización de la transcripción (p.e. según se
describe en la patente US 5.534.615).
Células hospedadoras adecuadas para la clonación
o expresión del DNA en los vectores del presente documento son las
células procariotas, levaduras o células eucariotas superiores
descritas más arriba. Procariotas adecuados para este fin incluyen
eubacterias, tales como organismos Gram-negativo o
Gram-positivo, por ejemplo,
Enterobacteriaceae como Escherichia, p.e. E. coli,
Enterobacter, Erwinia, Klebsiella,
Proteus, Salmonella, e.g. Salmonella
typhimurium, Serratia, p.e., Serratia marcescans y
Shigella, así como Bacilli, tales como B.
subtilis y B. licheniformis (p.e. B. licheniformis 41P
descrito en DD 266.710 publicado el 12 de Abril de 1989),
Pseudomonas tales como P. aeruginosa y Streptomyces.
Un hospedador de E. coli preferido para la clonación es E.
coli 294 (ATCC 31.446) aunque son adecuadas otras cepas tales
como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31.537) y E.
coli W3110 (ATCC 27.325). Estos ejemplos son ilustrativos más
que limitativos.
Otros microbios procariotas y eucariotas tales
como hongos filamentosos o levaduras son hospedadores apropiados
para la clonación o expresión de vectores codificantes de
polipéptidos. Saccharomyces cerevisiae, o la levadura de pan
común, es la más comúnmente utilizada entre los microorganismos
hospedadores inferiores. Sin embargo, son asequibles y útiles, en el
presente documento, una serie de otros géneros, especies y cepas,
tales como los hospedadores Schizosaccharomycespombe;
Kluyveromyces, tales como, p.e., K. lactis, K.
fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045),
K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500),
K. drosophilarum (ATCC 36.906), K. thermotolerans y
K. marxianus; yarrowia (EP 402.226); Pichia
pasloris (EP 183.070); Candida; Trichoderma reesia
(EP 244.234); Neurospora crassa; Schwanniomyces tales
como Schwanniomyces occidentalis; y hongos filamentosos tales
como, p.e., Neurospora, Penicillium,
Tolypocladium y hospedadores Aspergillus tales como
A. nidulans y A. níger.
Células hospedadoras adecuadas para la expresión
de polipéptidos glicosilados proceden de organismos multicelulares.
Ejemplos de células invertebradas incluyen las células de plantas e
insectos. Han sido identificadas numerosas cepas de baculovirus y
variantes y las células hospedadoras de insectos permisivas
correspondientes procedentes de hospedadores tales como
Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegypti
(mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila
melanogaster (mosca de la fruta) y Brombyx mori. Están
disponibles públicamente una variedad de cepas virales para la
transfección, p.e. la variante L-1 de Autographa
californica NPV y la cepa Bm-5 de Bombyx
mori NPV, y dichos virus se pueden utilizar aquí como el virus
de acuerdo con la presente invención, en particular para la
transfección de células de Spodoptera frugiperda. También se
pueden utilizar como hospedadores cultivos celulares vegetales de
algodón, maíz, patata, soja, petunia, tomate y tabaco.
Sin embargo, el interés ha sido mayor en células
de vertebrados y la propagación de células de vertebrados en cultivo
(cultivo tisular) se ha vuelto un procedimiento rutinario. Ejemplos
de líneas de células hospedadoras de mamíferos útiles son la línea
CV1 de riñón de mono transformada con SV40 (COS-7,
ATCC CRL 1651); línea de riñón embriónica humana (293 o células 293
subclonadas para el crecimiento en un cultivo en suspensión, Graham
et al., J. Gen. Virol. 36:59 (1977)); células de riñón
de cría de hámster (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster
chino/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 77:4216 (1980)); células de Sartoli de ratón (TM4,
Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980));
células de riñón de mono (CV1 ATCC CCL70); células de riñón de mono
verde africano (VERO-76, ATCC
CRL-1587); células de carcinoma cervical humano
(HELA, ATCC CCL2); células de riñón caninas (MDCK, ATCC CCL 34);
células de hígado de rata bufalo (BRL 3A, ATCC CRL 2); células de
pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2,
HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células
TRI (Mather et al., Annals N. Y. Acad. Sci.
383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; y una
línea de hepatoma humana (Hep G2).
Las células hospedadoras se transforman con los
vectores de expresión o clonación más arriba descritos para la
producción del polipéptido y se cultivan en medios de nutrientes
convencionales modificados de manera apropiada para inducir a los
promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes
codificantes de las secuencias deseadas.
Las células hospedadoras utilizadas para producir
el polipéptido de esta invención se puede cultivar en una variedad
de medios. Medios comercialmente disponibles tales como Ham's 10
(Sigma), Medio Esencial Mínimo (MEM), (Sigma),
RPMI-1640 (Sigma) y Medio Eagle Modificado por
Dulbecco ((DMEM), Sigma) son adecuados para cultivar las células
hospedadoras. Además, cualquiera de los medios descritos en Ham
et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al.,
Anal. Biochem. 102:255 (1980), Patentes US Nº 4.767.704;
4.657.866; 4.927.762; 4.560.655; o 5.122.469; WO 90/03430; WO
87/00195; o patente US Re. 30.985 se pueden utilizar como medios de
cultivo para las células hospedadoras. Cualquiera de estos medios se
puede suplementar cuando sea necesario con hormonas y/o otros
factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina, o factor
de crecimiento epidérmico), sales (tales como cloruro de sodio,
calcio, magnesio y fosfato), tampones (tal como el HEPES),
nucleótidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos (tales
como el fármaco GENTAMYCIN™), elementos traza (definidos como
compuestos inorgánicos presentes normalmente en concentraciones
finales en el rango de micromolar) y glucosa o una fuente
equivalente de energía. Se puede incluir cualquier otro suplemento
necesario en las concentraciones adecuadas que sean conocidas para
los expertos en la materia. Las condiciones de cultivo, tales como
la temperatura, pH y similares son las utilizadas previamente con la
célula hospedadora seleccionada para la expresión y serán evidentes
para un técnico especialista ordinario.
Cuando se utilizan técnicas recombinantes, el
polipéptido se puede producir intracelularmente, en el espacio
periplásmico, o secretado directamente al medio. Si el polipéptido
se produce intracelularmente, como primera etapa, el debris
particulado, ya sea de células hospedadoras o células lisadas (p.e.
resultantes de la homogeneización) se extrae, por ejemplo, mediante
centrifugación o ultrafiltración. Cuando el polipéptido se secreta
al medio, los sobrenadantes de dichos sistemas de expresión se
concentran, generalmente, primero utilizando un filtro de
concentración de proteína disponible comercialmente, por ejemplo,
una unidad de ultrafiltración de Amicon o Millipore Pellicon.
El polipéptido se somete, a continuación, a una o
más etapas de purificación, incluyendo el procedimiento de
cromatografía de intercambio iónico según se reivindica en el
presente documento. Ejemplos de procedimientos de purificación
adicionales que se pueden ejecutar antes de, durante o después del
procedimiento de intercambio iónico incluye el fraccionamiento en
una cromatografía de interacción hidrofóbica (p.e. en fenil
sefarosa), precipitación con etanol, enfoque isoeléctrico, HPLC de
fase reversa, cromatografía en sílice, cromatografía en HEPARIN
SEPHAROSETM, además de la cromatografía de intercambio aniónico y/o
adicionales cromatografías de intercambio catiónico, cromatoenfoque,
SDS-PAGE, precipitación con sulfato de amonio,
cromatografía con hidroxiapatita, electroforesis en gel, diálisis y
cromatografía de afinidad (p.e. utilizando proteína A, proteína G,
un anticuerpo, un sustrato específico, ligando o antígeno como
reactivo de captura).
La cromatografía de intercambio iónico se lleva a
cabo según se reivindica aquí. Se toma una primera decisión sobre si
se utiliza una resina de intercambio catiónico o aniónico. En
general, se puede utilizar una resina de intercambio catiónico para
polipéptidos con pI superior a aproximadamente 7 y se puede utilizar
una resina de intercambio aniónico para polipéptidos con pI inferior
a aproximadamente 7.
La resina de intercambio aniónico o catiónico se
prepara de acuerdo con procedimientos conocidos. Frecuentemente, se
pasa un tampón de equilibrio a través de la resina de intercambio
iónico antes de cargar la composición que comprende el polipéptido y
uno o más contaminantes en la resina. De manera conveniente, el
tampón de equilibrio es el mismo que el tampón de carga, pero no es
un requisito.
Los diversos tampones utilizados para la
cromatografía dependen de, por ejemplo, si se utiliza una resina de
intercambio aniónico o catiónico. Esto se muestra más claramente en
el diagrama de flujo de las Figuras 1 y 2.
Con especial referencia a la Figura 1, que
muestra las etapas ejemplificadas para llevar a cabo cuando se
utiliza una resina de intercambio catiónico, el pH y/o la
conductividad de cada tampón se incrementa(n) respecto al
tampón anterior, excepto para el tampón de lavado donde la
conductividad y/ pH es/son inferior(es) a la conductividad
y/o pH del tampón intermedio anterior. La solución acuosa que
comprende el polipéptido de interés y contaminante(s)
cargado(s) en la resina de intercambio catiónico utilizando
el tampón de carga que está a un pH y/o conductividad de manera que
el polipéptido y el contaminante se unen a la resina de intercambio
catiónico. Como en el ejemplo de más abajo, el tampón de carga puede
estar a una primera conductividad baja (p.e. de aproximadamente 5,2
a aproximadamente 6,6 mmhos). Un pH ejemplificante para el tampón de
carga puede ser aproximadamente 5,0 (véase Figura 1). De
aproximadamente 20 mg/mL a aproximadamente 35 mg/mL del polipéptido
(p.e. un anticuerpo de longitud completa) se puede cargar, por
ejemplo, en la resina de intercambio iónico.
La resina de intercambio catiónico se lava, a
continuación, con un tampón intermedio que está a una segunda
conductividad y/o pH con el fin de eluir esencialmente el
contaminante y no una cantidad sustancial del polipéptido de
interés. Esto se puede conseguir incrementando la conductividad o
pH, o ambas, del tampón intermedio. El cambio del tampón de carga al
tampón intermedio puede ser escalonado o gradual, según se desee. En
el Ejemplo del presente documento, el tampón intermedio tenía una
conductividad mayor que la del tampón de carga (es decir, la
conductividad del tampón intermedio estaba en el rango de
aproximadamente 7,3 a aproximadamente 8,4 mmhos). Alternativamente,
como se muestra en la Figura 1, el pH del tampón intermedio puede
exceder el del tampón de carga en esta realización de la invención,
donde se utiliza una resina de intercambio catiónico. Por ejemplo,
el tampón intermedio puede tener un pH de aproximadamente 5,4.
Después del lavado con el tampón intermedio, la
resina de intercambio catiónico se lava o se vuelve a equilibrar con
el tampón de lavado que tiene una conductividad o pH, o ambas, que
es/son inferior(es) a la del tampón intermedio (es decir, la
conductividad, o pH, o ambas, se cambia(n) en dirección
opuesta, es decir, inversa, a la etapa anterior, a diferencia de las
etapas de cromatografía de intercambio iónico de la literatura). En
el Ejemplo de más abajo, el tampón de lavado tenía aproximadamente
la misma conductividad que la del tampón de carga (es decir, en el
rango de aproximadamente 5,2 a aproximadamente 6,6 mmhos) y su
conductividad era, por tanto, inferior a la del tampón intermedio.
En otra realización, uno puede reducir la conductividad del tampón
de lavado a una conductividad que sea inferior a, o mayor a, la del
tampón de carga, con la condición de que la conductividad del tampón
de lavado sea inferior a la del tampón intermedio. En otra
realización, el pH del tampón de lavado puede ser inferior al pH del
tampón intermedio (p.e. el pH del tampón de lavado puede ser
aproximadamente 5,0). El cambio en la conductividad y/o pH del
tampón de lavado comparado con el del tampón intermedio se puede
conseguir mediante cambio gradual o escalonado de cualquiera o todos
estos parámetros.
Después de la etapa de lavado del párrafo
anterior, la resina de intercambio catiónico se prepara para la
elución de la molécula polipeptídica deseada. Esto se consigue
utilizando un tampón de elución que tenga un pH y/o conductividad
tal que el polipéptido deseado no se una más a la resina de
intercambio catiónico y, de esta manera, eluya. El pH y/o
conductividad del tampón de elución excede, generalmente, el pH y/o
conductividad del tampón de carga, el tampón intermedio y el tampón
de lavado utilizados en las etapas previas. En el Ejemplo de más
abajo, la conductividad del tampón de elución estaba en el rango de
aproximadamente 10,0 a aproximadamente 11,0 mmhos. Alternativamente,
o además, el pH del tampón de elución se puede incrementar respecto
al tampón de lavado y al tampón intermedio (por ejemplo, el pH del
tampón de elución puede ser aproximadamente 6,0). El cambio de
conductividad y/o pH puede ser escalonado o gradual, según se desee.
De esta manera, se recupera el polipéptido deseado de la resina de
intercambio catiónico en esta etapa del procedimiento.
En una realización alternativa, el material de
intercambio iónico comprende una resina de intercambio aniónico.
Esta realización de la realización se describe en la Figura 2. Como
se ilustra en esta figura, los cambios en la conductividad son, en
general, como los descritos más arriba respecto a una resina de
intercambio catiónico. Sin embargo, la dirección del cambio del pH
es diferente para una resina de intercambio aniónico. Por ejemplo,
si se consigue la elución del contaminante(s) y el
polipéptido alterando el pH, el tampón de carga tiene un primer pH y
en el tampón intermedio se disminuye el pH con el fin de eluir el
contaminante o los contaminantes. En la tercera etapa, la columna se
lava/vuelve a equilibrar con el tampón de lavado y el cambio en la
conductividad o pH, o ambas, es en la dirección contraria a la de la
etapa anterior. De esta manera, el pH se puede incrementar con el
tampón de lavado, comparado con el tampón intermedio. Después de
esta etapa, el polipéptido de interés se eluye de la resina de
intercambio aniónico utilizando un tampón de elución a una cuarta
conductividad y/o pH. Si se altera el pH, este será, normalmente,
menor al pH del tampón de carga, el tampón intermedio y el tampón de
lavado. El cambio en el pH y/o conductividad en los tampones
sucesivos puede ser, como se ha explicado anteriormente, escalonado
o gradual.
En la realización preferida de la invención, se
cambia un solo parámetro (es decir, conductividad o pH) para
conseguir la elución de tanto el polipéptido como el contaminante,
mientras que el otro parámetro (es decir, el pH o conductividad,
respectivamente) permanece casi constante. Por ejemplo, mientras que
la conductividad de los diferentes tampones (tampón de carga, tampón
intermedio, tampón de lavado y/o tampón de elución) pueden diferir,
los pH de los mismos pueden ser esencialmente iguales.
En una realización opcional de la invención, la
resina de intercambio iónico se regenera con un tampón de
regeneración después de la elución del polipéptido, de manera que la
columna pueda ser reutilizada. Generalmente, la conductividad y/o pH
del tampón de regeneración es/son de tal manera que prácticamente
todos los contaminantes y el polipéptido de interés eluyen de la
resina de intercambio iónico. Generalmente, el tampón de
regeneración tiene una muy elevada conductividad para eluir los
contaminantes y el polipéptido de la resina de intercambio
iónico.
El procedimiento del presente documento es
particularmente útil para resolver una molécula polipeptídica de
interés de por lo menos un contaminante, donde el contaminante y la
molécula polipeptídica de interés difieran sólo ligeramente en la
carga iónica. Por ejemplo, los pI del polipéptido y contaminante
pueden ser solo "ligeramente diferentes", por ejemplo, pueden
diferir en aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,2 unidades de
pI. En el Ejemplo de más abajo, este procedimiento se podría
utilizar para resolver un anticuerpo anti-HER2 que
tenga un pI de 8,87, de, únicamente, una variante desamidada de la
misma que tenga un pI de 8,79. Alternativamente, el procedimiento se
puede utilizar para resolver una DNasa desamidada, por ejemplo, de
una DNasa no desamidada. En otra realización, el procedimiento se
puede utilizar para resolver un polipéptido de una variante de
glicosilación de la misma, p.e., para resolver una variante de un
polipéptido que tenga una distribución diferente del ácido siálico
comparada con el polipéptido no variante.
La preparación del polipéptido obtenida de
acuerdo con el procedimiento de cromatografía de intercambio iónico
del presente documento, se puede someter a etapas de purificación
adicionales, si es necesario. Etapas de purificación adicionales
ejemplificativas se han discutido más arriba.
Opcionalmente, el polipéptido se conjuga a una o
más moléculas heterólogas cuando se desee. La molécula heteróloga
puede ser una que , por ejemplo, incremente el tiempo de vida media
del polipéptido en suero (p.e. polietilenglicol, PEG) o puede ser un
marcador (p.e. un enzima, un marcador fluorescente y/o radionuclido)
o una molécula citotóxica (p.e. una toxina, fármaco
quimioterapéutico o isótopo radiactivo, etc.).
Se puede preparar una formulación terapéutica que
comprenda el polipéptido, opcionalmente conjugado con una molécula
heteróloga, mezclando el polipéptido que tiene el grado de pureza
deseado con vehículos farmacéuticamente aceptables opcionales,
excipientes o estabilizantes (Remington's Pharnmaceutical
Sciences 16th Edition, Osol, A. Ed. (1980)), en forma de
formulaciones liofilizadas o disoluciones acuosas. Vehículos
"farmacéuticamente aceptables", excipientes o estabilizantes no
son tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones
utilizadas e incluyen tampones tales como fosfato, citrato y otros
ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen el ácido ascórbico y la
metionina; conservantes (tales como el cloruro de octadecildimetil
bencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio;
cloruro de bencetonio; fenol; alcohol butílico o fenílico; alquil
parabenos como el metil o propil paraben; catecol; resorcinol;
ciclohexanol; 3-pentanol; y
m-cresol); polipéptido de bajo peso molecular
(inferior a aproximadamente 10 residuos); proteínas tales como la
albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros
hidrofílicos como la polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como
glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina;
monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen
glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes como EDTA; azúcares
como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; sales formadoras de
contraiones como el sodio; complejos metálicos (p.e. complejos
Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos como
TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG). El anticuerpo
humMAb4D5-8, de particular interés en el presente
documento, se puede preparar como una formulación liofilizada, p.e.
según se describe en WO 97/04801; incorporada expresamente aquí por
referencia.
La formulación del presente documento puede
también contener más de un compuesto activo, si es necesario, para
la indicación a ser tratada, preferiblemente aquellas con
actividades complementarias que no se afectan adversamente entre
ellas. Tales moléculas se presentan adecuadamente en combinación, en
cantidades que son efectivas para un determinado propósito. Por
ejemplo, para un anticuerpo anti-HER2, se puede
añadir a la formulación un agente quimioterapéutico, tal como
taxoide o tamoxifén.
Los ingredientes activos se pueden también
entrampar en una microcápsula preparada, por ejemplo, mediante
técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por
ejemplo, una microcápsula de hidroximetilcelulosa o de gelatina y
microcápsulas de poli(metilmetacrilato), respectivamente, en
sistemas de liberación de fármacos coloidales (por ejemplo,
liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas
y nanocápsulas) o en microemulsiones. Dichas técnicas se describen
en Remington's Pharmaceutical Sciences 16th Edition, Osol, A.
Ed. (1980).
La formulación a ser utilizada en la
administración in vivo debe ser estéril. Esto se cumple
fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración
estériles.
Se pueden preparar preparaciones de liberación
sostenidas. Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación
sostenidas incluyen matrices semipermeables de polímeros sólidos
hidrofóbicos que contienen la variante polipeptídica, estando estas
matrices en forma de artículos moldeados, p.e. películas o
microcápsulas. Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen
poliésteres, hidrogeles, (por ejemplo,
poli(2-hidroxietil-metacrilato)
o poli(vinilalcohol)), poliláctidos (patente US Nº 3.773.919)
copolímeros de ácido L-glutámico y
\gamma-etil-L-glutamato,
etilenvinil acetato no degradable, copolímeros degradables de ácido
láctico-ácido glicólico como el LUPRON DEPOT™ (microesferas
inyectables compuestas de copolímeros de ácido láctico-ácido
glicólico y acetato leuprólido) y ácido
poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.
El polipéptido purificado tal y como se ha
descrito aquí o la composición que comprende el polipéptido y un
vehículo farmacéuticamente aceptable se utilizan, a continuación,
para diversos usos de diagnóstico, terapéutico u otros conocidos
para dichos polipéptidos y composiciones. Por ejemplo, el
polipéptido se puede utilizar para tratar un trastorno en un animal
mediante la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva
del polipéptido a un mamífero.
Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo
ilustrativo y no a modo limitativo. Las descripciones de todas las
citas de la descripción se incorporan expresamente aquí por
referencia.
La IgG rhuMAb HER2 humana de longitud completa
(humAb4D5-8 en Carter et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. 89: 4285-4289 (1992) que comprende la
secuencia aminoacídica de la cadena ligera de la SEC ID Nº: 1 y la
secuencia aminoacídica de la cadena pesada de la SEC ID Nº: 2) se
produjo de manera recombinante en células CHO. Después de la
producción de la proteína y la secreción al medio de cultivo
celular, se separaron las células COS del medio de cultivo celular
mediante filtración de flujo tangencial (PROSTACK™). A continuación,
se llevó a cabo una cromatografía de Proteína A aplicando
directamente el fluido del cultivo celular recogido (HCCF) de las
células CHO a una columna PROSEP A™ equilibrada (Bioprocessing,
Ltd).
Después de la cromatografía de Proteína A, se
llevó a cabo la cromatografía de intercambio catiónico utilizando
una columna de sulfopropil (SP)-SEPHAROSE FAST FLOW™
(SPSFF) (Pharmacia) para separar, además, la molécula de anticuerpo
anti-HER2 deseado. La operación de cromatografía se
llevó a cabo en el modo de unión y elución.
La columna SPSFF se preparó para cargar, mediante
lavados secuenciales con tampón de regeneración (0,025 M MES/1,0 M
NaCl, pH 5,6) seguido del tampón de equilibrio (0,025 M MES/50 mM
NaCl, pH 5,6). La columna se cargó, a continuación, con el
pool de Proteína A ajustado a un pH de 5,60 \pm 0,05 y una
conductividad de 5,8 \pm 0,2 mmhos. Antes de la elución, la
columna se lavó en tres etapas: (1) tampón de carga (0,025 M
MES/50mM, pH 5,6) por un volumen mínimo de una columna; (2) tampón
intermedio (0,025 M MES/70 mM NaCl, pH 5,6) hasta que se alcanza un
ápice de un pico de 280 nm y; (3) tampón de lavado (0,025 M MES/50
mM NaCl, pH 5,6) para un mínimo de 1,2 volúmenes de columna. A
continuación, se eluye de la columna rhuMAb HER2 con un tampón de
elución (0,025 M MES/95 mM NaCl pH 5,6). El perfil de elución a 280
nm tiene un saliente en el borde frontal (Figura 3). En el punto de
inflexión de este saliente, empieza la agrupación y continúa durante
5 volúmenes más de columna. La columna, a continuación, se regeneró
con un tampón de regeneración (0,0025 M MES/1,0 M NaCl, pH 5,6).
Se empaquetó una columna SPSFF a escala reducida.
Las dimensiones eran: volumen de
27,0 mL, diámetro de 1,0 cm altura del lecho de 34,5 cm. Se tituló
el pH de una alícuota del pool de Proteína A a 5,6 con base
Tris 1,5 M. La conductividad del pool se redujo mediante la
adición de un volumen igual de agua estéril para la inyección
(SWFI).
La cromatografía para este estudio se llevó a
cabo con el sistema FPLC de UNICORN™. Las etapas de equilibrio,
carga y lavado inicial se llevaron a cabo a una velocidad de flujo
lineal de 200 cm/h. Todas las etapas de cromatografía se llevaron a
cabo a una velocidad de flujo lineal de 100 cm/h. La secuencia de
etapas de cromatografía se definen en la Tabla 1. Se llevaron un
total de seis cromatografías con densidades de carga de 15, 20, 25,
30, 35 y 40 mg de rhuMAb HER2 por mL de resina SPSFF.
| Etapas^{1} de la Cromatografía | ||
| Etapa de Cromatografía | Tampón | Punto final |
| aproximado | ||
| Equilibrio: Parte 1 | 0,025M MES/1,0M NaCl, | 2CV^{2} |
| pH 5,6 | ||
| Equilibrio: Parte 2 | 0,025M MES/0,05M | PH: 5,6 \pm 0,1 |
| NaCl, pH 5,6 | ||
| Cond.: 5,8 \pm 0,2 | ||
| mmhos | ||
| Carga | Ajustar Pool de | Según se requiera |
| Proteína A | ||
| Lavado 1 | 0,025M MES/0,05M | 1,5 CV |
| NaCl, pH 5,6 | ||
| Lavado 2 | 0,025M MES/0,07M | Ápice del pico |
| NaCl, pH 5,6 | ||
| Lavado 3 | 0,025M MES/0,05M | 2CV |
| NaCl, pH 5,6 | ||
| Elución: "Prepool" | 0,025M MES/0,095M | Hasta el saliente |
| NaCl, pH 5,6 | en el borde | |
| frontal (-1,2 CV) | ||
| Elución: pool | 0,025M MES/0,095M | |
| NaCl, pH 5,6 | 5 CV | |
| Regeneración | 0,025M MES/1,0M | |
| NaCl, pH 5,6 | 2 CV | |
| 1. El equilibrio de la resina se llevó a cabo de manera manual; las | ||
| etapas restantes se ejecutaron a partir de un Programa Pharmacia | ||
| Unicorn. | ||
| 2. CV= Volumen(es) de columna. |
La concentración de proteína de cada fracción
cromatográfica (flujo continuo, etapas de lavado, elución, de
"prepool", "pool" de elución y regeneración) se determinó
por escaneados espectrofotométricos de cada muestra. Los resultados
se utilizaron para calcular los rendimientos de recuperación de
producto. El coeficiente de extinción para rhuMAb HER2 es 1,45. Los
cálculos utilizados para derivar los resultados (Figura 4) son:
Concentración de Proteína (mg/mL)= \frac{280
nm}{1,45} x factor de dilución
Masa de Proteína (mg) en cada fracción =
Concentración de Proteína (mg/mL) x Volumen de Fracción (mL)
Rendimiento (%) = \frac{Masa
\de
\Fracción
\(mg)}{Masa
\Total
\(mg)}x 100
La columna de cromatografía de SPSFF de rhuMAb
HER2 resuelve las variantes del anticuerpo. Se analizaron las
fracciones de cada una de las cromatografías en estudio se ensayó
por la cantidad relativa de anticuerpo variante por cromatografía
CSxHPIEX. Se hizo correr una columna BAKERBOND
WIDE-PORE™ CSx HPIEX (4,6 x 250 mm) a 1 mL/min a
55ºC. La fase móvil se formó a partir de un gradiente terciario
(Tabla 2).
| Esquema de Gradiente | |||
| Tiempo (min) | % A | % B | % C |
| 0- Condiciones inciales | 49 | 1 | 50 |
| 10,0 | 40 | 10 | 50 |
| 50,0 | 33 | 17 | 50 |
| 50,2 | 49 | 1 | 50 |
| 70,0 | 49 | 1 | 50 |
La columna se hace correr a 1mL/min a 55ºC.
El tampón A era MES 0,025M, pH 5,9; el tampón B
era acetato de amonio 1M, pH 7,0; y al disolución C era agua estéril
para la inyección. La columna se equilibró con las condiciones
iniciales de gradiente (49% A; 1% B; y 50% C) y se inyectaron
200\mul de muestra, diluidos con SWFI y que contenía <300
\mug de proteína. Cada cromatograma resultante se integró para
determinar el porcentaje de área de cada pico para cada fracción
(Tabla 3 y Figura 5).
| Análisis CSxHPIEX de rhuMAb HER2 | |
| CSx Pico | Variante rhuMAb HER2 |
| A \textamp b | Cadena Ligera: Asn-Asp^{30} desamidación |
| -y- | |
| 1 | Otra variación no identificable en el mapa |
| tríptico | |
| Cadena Ligera: Asn-Asp^{30} desamidación | |
| 3 | Anticuerpo procesado completamente |
| 4 | Cadena Pesada: Asp-Iso-Asp^{102} |
| -y/o- | |
| Pico CSx | Variante de rhuMAb HER2 |
| Cadena Pesada: una Lys^{450} adicional | |
| Cadena Pesada: Asp-Succinimida^{102} | |
| Otros | -y/o- |
| Permutaciones múltiples encontrados en los picos | |
| 1 y 4 |
Los valores de absorbancia (AU 280 nm) para cada
archivo de cromatografía se exportó a Unicorn en el formato ASCII.
Los valores del lavado con 0,025 M MES/ 0,07 M NaCl, pH 5,6 se
tradujo al formato Excel y se copió en KALEIDAGRAPH™. Utilizando
KALEIDAGRAPHTM, los perfiles de lavado se cubren (Figura 6) y se
compararon con cada uno.
La variantes desamidadas y otras acídicas de
rhuMAb HER2 se produjeron cuando el anticuerpo se preparó mediante
tecnología recombinante de DNA (véase, por ejemplo, CSx picos a, b y
1 en la Figura 5). Las variantes desamidadas y otras acídicas
constituían aproximadamente un 25% (calculado como el área bajo la
curva integrada o el perfil obtenido por cromatografía CSx) de la
composición obtenida de la etapa de cromatografía inicial de
Proteína A. Se descubrió que el procedimiento de intercambio iónico
descrito en el presente documento se podría utilizar para reducir,
de manera sustancial, la cantidad de variantes desamidadas y otras
variantes acídicas en la composición anti-HER2, es
decir, hasta aproximadamente un 13% o menos (es decir, la cantidad
de variantes acídicas en la preparación sometida a la cromatografía
de intercambio catiónico según se ha descrito aquí disminuyó en por
lo menos aproximadamente un 50% o más).
El trazado de absorbancia de la columna de
intercambio catiónico ejecutada según se ha descrito más arriba se
muestra en la Figura 3. Este procedimiento resolvía una variante
desamidada del anticuerpo anti-HER2 que solo difería
ligeramente del anticuerpo anti-HER2 no desamidado.
El incremento en la conductividad de las condiciones iniciales hasta
el lavado intermedio empezó a eluir el anticuerpo
anti-HER2 desamidado. Sin embargo, el lavado
continuado a esta conductividad hizo eluir el anticuerpo
anti-HER2 no desamidado, resultando en una pérdida
de producto. Procediendo directamente del tampón intermedio al
tampón de elución se observó que resultaba en una extracción
inaceptablemente baja del anticuerpo anti-HER2
desamidado del producto si la recolección "pooling"
empezaba pronto o rendimientos inaceptablemente bajos del producto
anticuerpo anti-HER2 si la recolección
"pooling" decaía hasta que se reducía el anticuerpo
anti-HER2 desamidado. Se descubrió que volviendo a
una conductividad más baja como la utilizada inicialmente, la
elución del anticuerpo anti-HER2 desamidado
continuó, sin la elución significativa del producto anticuerpo
anti-HER2.
Se evaluó el efecto de cargar rhuMAb HER2 en (a)
requisitos del tampón, (b) recuperación del producto en el pool y
(c) la cualidad del producto en el pool.
A densidades de carga de 15mg/mL hasta 35 mg/mL,
el rendimiento de producto en el pool de elución es aproximadamente
del 75%. Para la densidad de carga de 40 mg/mL, el rendimiento de
producto en el pool disminuyó hasta un 65% (Figura 4). La
recuperación reducida en el pool se atribuye ampliamente a un
incremento del anticuerpo en las dos etapas de lavado (a 70 mM NaCl
y 50 mM NaCl, respectivamente).
La cualidad de rhuMAb HER2 en todos los pools de
elución es equivalente cuando se determina mediante análisis de CSx
HPIEX (Figura 5). Comparado al material de carga: existe un
enriquecimiento del anticuerpo no desamidado (pico 3), no existe un
cambio en la cantidad de anticuerpo con
Iso-Asp^{102} o Lys^{450} (pico 4) y una
reducción de la cantidad del anticuerpo desamidado en Asp^{30}
(picos a, b y 1).
La cualidad en estos pools catiónicos de rhuMAb
HER2 se mejora mediante la etapa intermedia de lavado. Según se
incremente la masa de rhuMAb HER2 unido a la resina, se reduce el
consumo en volumen de tampón intermedio necesario para alcanzar el
ápice en el pico a 280 nm. El volumen de tampón requerido para una
densidad de carga de 40 mg/mL es aproximadamente de 2,5 volúmenes de
columna. El volumen de tampón requerido para una densidad de carga
de 15 mg/mL es aproximadamente 15 volúmenes de columna. El
incremento exacto del tampón requerido no es lineal con los cambios
incrementados de 5 mg/mL entre estos dos extremos. El incremento
mayor se observa entre las densidades de carga de 20 mg/mL y 15
mg/mL. Aquí el requerimiento dobla los 7,5 volúmenes de columna a
los previamente mencionados 15 volúmenes de columna de tampón. Si se
alcanza el ápice del pico de lavado con 70mM de NaCl, sin embargo,
la cualidad del producto es equivalente para cualquiera de las
densidades de carga examinadas.
Este estudio determinó cuánto rhuMAb se puede
cargar en la resina SPSFF. Entre los rangos de 15 a 40 mg de
anticuerpo por mL de resina, no existe diferencia en la cualidad del
rhuMAb HER2 recuperado en el pool de elución. La cantidad de rhuMAb
HER2 recuperada, sin embargo, se reduce en aproximadamente un 10%
cuando se carga la resina con más de 35mg/mL. Para rendimientos
consistentes se recomienda que 35mg/mL sea la carga máxima para la
fabricación de rhuMAb HER2. Además, debido al incremento sustancial
en el requerimiento de volumen de lavado a 70mM NaCl entre 20 y 15
mg/mL, se recomienda que 20mg/mL sea la carga mínima para la
fabricación de rhuMAb HER2.
Claims (22)
1. Procedimiento para la purificación de un
polipéptido de una composición que comprende el polipéptido y un
contaminante, comprendiendo dicho procedimiento las siguientes
etapas llevadas a cabo de manera secuencial:
a)unión del polipéptido a un material de
intercambio iónico utilizando un tampón de carga, en donde el tampón
de carga está a una primera conductividad y pH;
b) lavado del material de intercambio iónico con
un tampón intermedio a una segunda conductividad y/o pH para que
eluya el contaminante del material de intercambio iónico;
c) lavado del material de intercambio iónico con
un tampón de lavado que está a una tercera conductividad y/o pH, en
donde el cambio de conductividad y/o pH del tampón intermedio al
tampón de lavado está en dirección opuesta al cambio en la
conductividad y/o pH del tampón de carga al tampón intermedio;
d) lavado del material de intercambio iónico con
un tampón de elución a una cuarta conductividad y/o pH para que
eluya el polipéptido del material de intercambio iónico.
2. Procedimiento de la reivindicación 1 en donde
el material de intercambio iónico comprende una resina de
intercambio catiónico.
3. Procedimiento de la reivindicación 1 en donde
el material de intercambio iónico comprende una resina de
intercambio aniónico.
4. Procedimiento de la reivindicación 2 en donde
la conductividad y/o pH del tampón intermedio es/son
mayor(es) que la conductividad y/o pH del tampón de carga y
la conductividad y/o pH del tampón de lavado es/son
inferior(es) a la conductividad y/o pH del tampón
intermedio.
5. Procedimiento de la reivindicación 1 en donde
la conductividad y/o pH del tampón de lavado es/son aproximadamente
igual(es) a la conductividad y/o pH del tampón de carga.
6. Procedimiento de la reivindicación 2 en donde
la conductividad y/o pH del tampón de elución es/son
superior(es) a la conductividad y/o pH del tampón
intermedio.
7. Procedimiento de la reivindicación 1 en donde
la elución del contaminante y del polipéptido se consigue mediante
modificación de la conductividad del tampón intermedio y del tampón
de elución, respectivamente.
8. Procedimiento de la reivindicación 7 en donde
el pH permanece aproximadamente constante durante cada una de las
etapas (a)-(d).
9. Procedimiento de la reivindicación 1 en donde
el polipéptido y el contaminante tienen pI que difieren en
aproximadamente de 0,05 a 0,2 unidades de pI.
10. Procedimiento de la reivindicación 1 en donde
el contaminante es una variante desamidada del polipéptido.
11. Procedimiento de la reivindicación 7 en donde
la conductividad del tampón intermedio y del tampón de elución se
modifica mediante el cambio de la concentración de sal en la
misma.
12. Procedimiento de la reivindicación 11 en
donde la conductividad del tampón intermedio y del tampón de elución
se modifica mediante el cambio de la concentración de NaCl en la
misma.
13. Procedimiento de la reivindicación 1 que
además comprende el lavado del material de intercambio iónico con un
tampón de regeneración después de la etapa (d).
14. Procedimiento de la reivindicación 2 en donde
la resina de intercambio catiónico comprende sulfopropil
inmovilizado en agarosa.
15. Procedimiento de la reivindicación 1 en donde
el polipéptido es un anticuerpo.
16. Procedimiento de la reivindicación 15 en
donde el anticuerpo se une a HER2.
17. Procedimiento de la reivindicación 1 en donde
el contaminante es una variante desamidada del polipéptido.
18. Procedimiento de la reivindicación 1 que
comprende además someter la composición que comprende el polipéptido
a una o más etapas de purificación ya sean antes, durante o después
del procedimiento de cromatografía de intercambio iónico así como
para obtener una preparación homogénea del polipéptido.
19. Procedimiento de la reivindicación 18 que
comprende además la conjugación del polipéptido purificado con una
molécula heteróloga.
20. Procedimiento de la reivindicación 19 en
donde la molécula heteróloga es polietilenglicol, un marcador o un
agente citotóxico.
21. Procedimiento de la reivindicación 18 que
comprende además la preparación de una composición farmacéutica
mediante la combinación de la preparación homogénea del polipéptido
con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
22. Procedimiento para la purificación de un
anticuerpo de una composición que comprende el anticuerpo y un
contaminante, comprendiendo dicho procedimiento las siguientes
etapas llevadas a cabo de manera secuencial:
a)unión del polipéptido a un material de
intercambio catiónico utilizando un tampón de carga, en donde el
tampón de carga está a una primera conductividad y pH;
b) lavado del material de intercambio catiónico
con un tampón intermedio a una segunda conductividad y/o pH que es
mayor que la(s) del tampón de carga para que eluya el
contaminante del material de intercambio iónico;
c) lavado del material de intercambio catiónico
con un tampón de lavado que está a una tercera conductividad y/o pH
que es menor que la del tampón intermedio;
d) lavado del material de intercambio catiónico
con un tampón de elución a una cuarta conductividad y/o pH que es
mayor que la del tampón intermedio con el fin de que eluya el
polipéptido del material de intercambio iónico.
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