ES2179640T5 - Procedimiento para el incremento selectivo de los glucosinolatos anticarcinogénicos de la especie Brassica. - Google Patents
Procedimiento para el incremento selectivo de los glucosinolatos anticarcinogénicos de la especie Brassica. Download PDFInfo
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Description
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Procedimiento para el incremento selectivo de los glucosinolatos anticarcinogenicos de la especie Brassica.
CAMPO DE LA INVENCION
La presente invencion se refiere a la especie Brassica con niveles elevados de derivados de los glucosinolatos anticarcinogenicos y en particular a las hortalizas comestibles Brassica con niveles elevados de los derivados de glucosinolato anticarcinogenicos 4-metilsulfinilbutil isotiocianato y/o 3-metilsulfinilpropil isotiocianato.
ANTECEDENTES DE LA TECNICA
La presente invencion proporciona hortalizas Brassica con niveles elevados de glucosinolatos especfficos y sus derivados. En particular la invencion proporciona hortalizas Brassica con niveles elevados de 3-metilsulfinilpropil y/o 4- metilsulfinilbutil glucosinolatos. Dichos glucosinolatos son convertidos mediante la actividad del enzima mirosinasa en derivados isotiocianato que han demostrado ser potentes inductores de los enzimas detoxificantes de fase II, la elevada actividad de los cuales esta asociada a una susceptibilidad reducida a los efectos neoplasicos de los carcinogenos. La invencion proporciona combinaciones geneticas que 1) exhiben niveles elevados de 4- metilsulfinilbutil glucosinolato y/o 3-metilsulfinilpropil glucosinolato, y 2) exhiben baja actividad del alelo GSL-ALK que codifica una actividad capaz de convertir dichos glucosinolatos en derivados alquenilo, que no poseen las propiedades anticarcinogenicas de los derivados isotiocianato de dichos glucosinolatos, y 3) una actividad mirosinasa adecuada capaz de producir derivados isotiocianato de dichos glucosinolatos. En consecuencia, dichas combinaciones geneticas proporcionan niveles elevados de glucosinolatos especfficos, una produccion reducida de derivados alquenilo de dichos glucosinolatos y favorecen la produccion de los derivados isotiocianato de dichos glucosinolatos.
Se conoce que una dieta con un elevado contenido en verduras esta asociada a una reduccion en el riesgo de ciertos tipos de cancer y es por tanto deseable incluir una cantidad significativa de verduras en la dieta humana. La actividad anticarcinogenica de las verduras se ha asociado a la presencia de varias clases de metabolitos secundarios. Aumentan las pruebas de que algunos de estos metabolitos secundarios estan implicados en la reduccion del riesgo de ciertos tipos de cancer y por ello se consideran anticarcinogenicos. En consecuencia, el incremento de los niveles de los metabolitos anticarcinogenicos proporciona una estrategia util para reducir el riesgo de cancer, complementado con el consejo dietetico de incrementar el consumo de verduras.
El mecanismo preciso por el cual las verduras proporcionan una disminucion en el riesgo de muchos tipos de cancer no se conoce con certeza, pero existen muchas lfneas de evidencia que apoyan la implicacion de las verduras en la prevencion del cancer. En particular, el papel de las verduras crucfferas en la prevencion del cancer esta ampliamente apoyado por estudios epidemiologicos y mas recientemente por estudios bioqufmicos. Una clase de metabolito secundario que esta implicado en los efectos beneficiosos de las verduras crucfferas son los derivados isotiocianato de ciertos glucosinolatos. Cuatro piezas complementarias de evidencia sugieren que los isotiocianatos derivados de la hidrolisis de los metilsulfinilalquil glucosinolatos que se encuentran en las crucfferas pueden ser importantes en la dieta humana para reducir el riesgo del cancer. (1) La provision dietetica de verduras crucfferas protege a los roedores contra los canceres inducidos qufmicamente (Wattenberg, L.M. Cancer Res., 45:1-8 (1985)). (2) Se conoce que los metilsulfinilalquil isotiocianatos son potentes inductores de los enzimas detoxificantes de fase II en las celulas de hepatoma murino Hepa 1c1c7 en cultivo (Zhang, Y., Talalay, P., Cho, C. G., and Posner, G. H. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:2399-2403 y Tawfiq, N., Heaney, R. K., Plumb, J. A., Fenwick, G. R., Musk, S. R. R., & Williamson, G., (1995) Carcinogenesis 16:1191-1194), que estan asociados con una susceptibilidad reducida de los mamfferos y de las celulas de los mamfferos en cultivo a los efectos toxicos y neoplasicos de los carcinogenos. (3) El sulforafane (4-metilsulfinilbutil isotiocianato) bloquea la formacion de tumores mamarios en ratas Sprague-Dawley tratadas con 9,10-dimetil-1,2-benzantraceno (Zhang, Y., Kensler, T. W., Cho, C. -G., Posner, G. H., & Talalay, P. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:3147-3150). (4) Los estudios epidemiologicos muestran que la gente con niveles elevados de verduras en la dieta son menos susceptibles al cancer (Block, G., Patterson, B., & Suber, A. (1992) Nutr. And Cancer 18:1-19). En consecuencia los efectos beneficos de una dieta elevada en ciertos glucosinolatos pueden incluir una reduccion en el riesgo de cancer. Sin embargo, parece ser que los principales responsables de los efectos beneficos son solamente ciertos glucosinolatos y mas precisamente, ciertos derivados de glucosinolatos especfficos.
En las plantas crucfferas existen numerosos glucosinolatos individuales. Carlson et al., (1987) J. Amer. Soc. Hort. Sci., 112:173-178 determino la concentracion relativa de 13 glucosinolatos en las partes comestibles de 30 cultivos. Los glucosinolatos tienen una porcion glicona comun y una cadena lateral de aglicona variable. La estructura de la cadena lateral de los glucosinolatos varfa en longitud y composicion qufmica.
Los glucosinolatos se forman por la accion de un numero de enzimas, codificados por un pequeno numero de alelos biosinteticos de los glicosinolatos (alelos GSL). En la senda del glucosinolato, la metionina es convertida en homo- metionina y dihomo-metionina por la accion del alelo GSL-ELONG. La homometionina es eventualmente convertida en 3-metiltiopropil glucosinolato seguido por la conversion a 3-metilsulfinilpropil glucosinolato por la actividad del alelo GSL-OXID y finalmente es convertida en 2-propenil glucosinolato por la actividad del alelo GSL-ALK. La dihomo- metionina es convertida en 4-metiltiobutil glucosinolato, despues en 4-metilsulfinilbutil glucosinolato por la actividad del
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alelo GSL-OXID, despues en 3-butenil glucosinolato por la actividad del alelo GSL-ALK y finalmente se convierte en 2- hidroxi-3-butenil glucosinolato por la actividad del alelo GSL-OH.
En general, los 3-metilsulfinilpropil glucosinolatos y los 4-metiltiobutil glucosinolatos producen isotiocianatos no volatiles y en consecuencia dichos glucosinolatos en particular tienen poca contribucion al sabor. Por el contrario, los derivados alquenilo volatiles pueden contribuir al sabor, tanto positiva como negativamente, lo que depende de la especie de planta y del derivado de glucosinolato en particular.
En las hortalizas B. oleracea, los glucosinolatos tienen cadenas laterales de 3 o 4 carbonos. Los glucosinolatos se pueden hidrolizar por la accion de la mirosinasa que es frecuentemente inducida por el dano al tejido. Muchas plantas tienen alquenil (2-propenil y 3-butenil) glucosinolatos que resultan en la produccion de productos volatiles cuando son hidrolizados por la accion de la mirosinasa. Algunas hortalizas contienen un 2-hidroxi-3-butenil glucosinolato llamado progoitrina. Dicho glucosinolato produce un isotiocianato inestable que se cicla de forma espontanea produciendo oxazolidona-2-tionas, que debido a sus propiedades goitrogenicas son indeseables en la dieta. Los isotiocianatos derivados de los alquenil e hidroxialquenil glucosinolatos pueden presentar tanto efectos positivos como negativos en el sabor.
El brocoli acumula niveles bajos de glucosinolatos con cadenas laterales de 4-metilsulfinilbutilo y 3-metilsulfinilpropilo debido a que en el brocoli esta muy reducida la actividad de los alelos GSL-ALK, que son responsables de la conversion de los glucosinolatos en derivados alquenilo. Se cree que la popularidad del brocoli como hortaliza es debida en parte a la contribucion relativamente modesta que hacen al sabor los derivados 4-metilsulfonilbutil y 3- metilsulfinilpropil glucosinolatos en contraste con el fuerte sabor producido por otros glucosinolatos, en particular los derivados volatiles de los glucosinolatos.
En consecuencia, los procedimientos para aumentar la cantidad dietetica de derivados especfficos de isotiocianato de ciertos glucosinolatos puede proporcionar hortalizas con propiedades anticarcinogenicas incrementadas sin alterar el sabor y/o la palatabilidad de las hortalizas. Sin embargo, la tecnica no proporciona medios para aumentar convenientemente los niveles de glucosinolatos especfficos en las crucfferas. Ademas, la tecnica no proporciona una forma conveniente para asegurar que dichos glucosinolatos no son convertidos en los derivados alquenilo, sino en los derivados isotiocianato que tienen propiedades anticarcinogenicas. De entre los numerosos glucosinolatos que pueden producir las verduras del genero Brassica, el 4-metilsulfinilbutil glucosinolato y el 3-metilsulfinilpropil glucosinolato han sido identificados como los precursores de los derivados de los isotiocianatos anticarcinogenicos mas potentes. La tecnica no proporciona medios convenientes para aumentar de forma especffica dichos glucosinolatos en particular evitando a la vez la formacion de otros glucosinolatos o derivados de los glucosinolatos que puedan tener caracterfsticas de sabor indeseables.
Los glucosinolatos 4-metilsulfinilbutil glucosinolato y el 3-metilsulfinilpropil glucosinolato se encuentran en varias de las verduras crucfferas, pero son mas abundantes en las variedades de brocoli (sin. Calabrese: Brassica oleracea L. var. italica) que no tiene un alelo funcional del locus GSL-ALK. La presencia de un alelo funcional de GSL-ALK convierte dichos glucosinolatos en sus homologos alquenilo, que son malos inductores de los enzimas de fase II (Tawfiq, N., Heaney, R. K., Plumb, J. A., Fenwick, G. R., Musk, S. R. R., & Williamson, G., (1995) Carcinogenesis, 76.i191-1194). En consecuencia la presencia de un alelo funcional de GSL-ALK evita la posibilidad de producir una variedad con niveles elevados de dichos isotiocianatos anticarcinogenicos ya que los glucosinolatos seran convertidos en derivados de alquenilo. Ademas la produccion de isotiocianatos a partir de los glucosinolatos necesita la actividad del enzima mirosinasa. De ahf que una produccion elevada de dichos isotiocianatos especfficos depende tanto de los niveles de glicosinolatos precursores (que estan influenciados por la actividad codificada en el alelo GSL-ALK) como de los niveles de actividad de la mirosinasa que produce los derivados de isotiocianato de los glicosinolatos.
En consecuencia, resulta deseable una combinacion genetica que especifique la produccion de niveles elevados de 4- metilsulfinilbutil glucosinolato y/o 3-metilsulfinilpropil glucosinolato, pero la produccion de los derivados de isotiocianato anticarcinogenicos de dichos glicosinolatos necesita combinaciones geneticas adicionales. Asf pues los procedimientos para conseguir dichas composiciones geneticas proporcionan nuevas composiciones de materia que en la actualidad no se encuentran en las verduras crucfferas cultivadas comercialmente.
Los niveles de glucosinolatos en el brocoli cultivado comercialmente son relativamente bajos comparados con los que se encuentran en los cultivos de hortalizas tales como la rucula (Eruca sativa), que acumula 4-metiltiobutil glucosinolato, y el berro (Rorippa nasturtium-aquaticum), que acumula fenetil glucosinolato (Fenwick, G. R., Henney, R. K., & Mullin, W. J. (1983) Crit. Rev. Food Sci. Nutr., 78/123-201). Es de esperar que, cuando ingeridos, la exposicion a los niveles elevados de 4-metilsulfinilbutil glucosinolato y/o 3-metilsulfinilpropil glucosinolato del brocoli incremente la potencia de la induccion de los enzimas de fase II. En consecuencia el brocoli con niveles incrementados de los 4- metilsulfinilbutil isotiocianatos y/o 3-metilsulfinilpropil isotiocianatos anticarcinogenicos serfa una valiosa adicion a la dieta disenada para disminuir el riesgo de cancer. Ademas, es poco probable que dichos cambios conduzcan a una reduccion de la palatabilidad ya que los metilsulfinilalquil glucosinolatos no son volatiles y producen una contribucion al sabor relativamente pequena, contrariamente a la mayorfa de los demas isotiocianatos que se encuentran en los cultivos de verduras y lechugas (Fenwick, G. R., Heaney, R. K., & Mullin, W. J. (1983) Crit. Rev. Food Sci. Nutr., 78.123-201). En consecuencia la alteracion de los niveles de dichos glucosinolatos especfficos no cambiarfa el sabor de las verduras crucfferas portadoras de las combinaciones geneticas que codifican el caracter.
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Muchos de los miembros silvestres del complejo de especies de Brassica oleracea (numero de cromosomas n = 9) tienen niveles elevados de los glucosinolatos alifaticos individuales (Mithen, R., Lewis, B. G. and Fenwick, G. R., (1987) Phytochemistry 26/1969-1973 y Giamoustaris, A. and Mithen, R., (1996) Theor. Appl. Genet., 93/1006-1010). Los estudios de la genetica de los glucosinolatos en esta taxa han sido instrumentales para el descubrimiento de la senda genetica para la biosfntesis de los glucosinolatos. Es evidente que ciertas especies en dicha taxa pueden ser valiosas para los programas de mejora genetica de Brassica disenados para incrementar de forma especffica los 4- metilsulfinilbutil glucosinolatos y/o los 3-metilsulfinilpropil glucosinolatos, a la vez que se incrementa el potencial anticarcinogenico de la planta. Sin embargo, la tecnica no proporciona procedimientos para incrementar la concentracion de 4-metilsulfinilbutil glucosinolato y/o 3-metilsulfinilpropil glucosinolato por combinaciones geneticas ni proporciona medios adecuados para poder determinar las propiedades anticarcinogenicas de las verduras que contienen dichas combinaciones geneticas. La presente invencion proporciona plantas con estas combinaciones geneticas.
Principalmente entre estas se encuentran combinaciones geneticas que incorporan los genes de los miembros del complejo de B. villosa-rupestris de Sicilia, que posee un alelo de GSL-ALK no funcional y que podrfan ser los progenitores silvestres del brocoli que se cultiva. En consecuencia, se utilizaron parientes silvestres y progenitores del brocoli comercial como fuentes de los genes necesarios para producir una combinacion genetica capaz de producir niveles elevados de 4-metilsulfinilbutil y/o 3-metilsulfinilpropil glucosinolato y la combinacion genetica que favorece la produccion de los derivados de isotiocianato de dichos glucosinolatos en lugar de los derivados alquenilo.
El 4-metilsulfinilbutil isotiocianato (tambien referido como sulforafano), derivado del correspondiente glucosinolato que se encuentra en algunas de las especies de Brassica, ha sido identificado como un potente inductor de los enzimas detoxificantes de fase II (p.ej., QR,; quinona reductasa [NADP(H)]: aceptor de quinona oxidoreductasa) en las celulas del hepatoma murino Hepa 1c1c7. De forma semejante, el 3-metilsulfinilpropil isotiocianato es un inductor fuerte de los enzimas de fase II. La medida de la induccion de QR en las celulas de hepatoma murino Hepa 1c1c7 proporciona un indicador rapido y fiable de la capacidad de los extractos vegetales para inducir los enzimas de fase II en las celulas de los mamfferos (Prochaska, H. J., Santamarfa, A. B., and Talalay, P., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89/2394-2398) y por consiguiente de la actividad putativa anticarcinogenica. Dicho ensayo ha sido utilizado para determinar el potencial de los isotiocianatos sinteticos (Zhang, Y., Talalay, P., Cho, C. -G., and Posner, G. H., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89/2399-2403 y Talalay, P., De Long, M. J., and Prochaska, H. J., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85/8261- 8265), los extractos de las verduras crucfferas (Tawfiq, N., Wanigatunga, S., Heaney, R. K., Musk, S. R. R., Williamson, G., and Fenwick, G. R., (1994) Exp. J. Cancer Prev., 3/285-292) y los glucosinolatos tratados con mirosinasa (Tawfiq, N., Heaney, R. K., Plumb, J. A., Fenwick, G. R., Musk, S. R. R., and Williamson, G., (1995) Carcinogenesis, 76/1191- 1194). Sin embargo, el contenido de glucosinolato/isotiocianato de los extractos vegetales no ha sido dado a conocer en general ni tampoco el potencial anticarcinogenico relativo de varias de las verduras crucfferas.
En la presente invencion, se ha utilizado dicho ensayo para determinar la relacion entre la capacidad para inducir actividad QR (potencial anticarcinogenico) y el contenido en glucosinolato de tres miembros silvestres del complejo B. oleracea, que tienen un elevado nivel de 3-metiltiopropil (B. drepanensis) 3-metilsulfinilpropil (B. villosa) y 2-propenil (B. atlantica) glucosinolatos respectivamente, cuando se combinan con cultivos de brocoli comercial mediante cruces convencionales e hfbridos entre el ascendente silvestre y lfneas comerciales de brocoli doble haploide para la reproduccion. En cosnecuencia se han derivado procedimientos y composiciones que identifican las composiciones geneticas necesarias para la produccion estable de glucosinolatos especfficos (p.ej. de 4-metilsulfinilbutil y/o 3- metilsulfinilpropil glucosinolato) y la produccion de los correspondientes derivados de isotiocianato. Dichas
combinaciones geneticas proporcionan lfneas para la mejora genetica para producir variedades comerciales de brocoli y otras verduras crucfferas con niveles de dichos compuestos anticarcinogenicos 10 a 100 veces superiores a los encontrados en las variedades cultivadas comercialmente.
Se ha encontrado, por ejemplo, que se obtiene un incremento de 10 veces en el nivel de 4-metilsulfinilbutil glucosinolato cruzando los cultivos de brocoli con taxas silvestres seleccionadas del complejo de Brassica oleracea (numero de cromosomas n = 9). De forma similar se observan incrementos en los niveles de 3-metilsulfinilpropil glucosinolato. El tejido de estos hfbridos muestra un incremento de 100 veces en la capacidad para inducir la quinona reductasa en las celulas Hepa 1c1c7 sobre la de los cultivos de brocoli cultivados comercialmente debido tanto al aumento en los glucosinolatos de 4-metilsulfinilbutilo y/o 3-metilsulfinilpropilo como al incremento en la conversion del 4-metilsulfinilbutil glucosinolato a sulforafano. En consecuencia la invencion proporciona verduras crucfferas comercialmente valiosas que contienen niveles elevados de metabolitos secundarios anticarcinogenicos. La invencion contempla ademas el desarrollo de lfneas de brocoli para reproduccion con actividad anticarcinogencia incrementada.
La seleccion de lfneas para la reproduccion con niveles elevados de compuestos anticarcinogenicos esta ademas facilitada por la utilizacion de marcadores moleculares para establecer la localizacion cromosomica de los genes para la biosfntesis de los glucosinolatos y para ayudar en la seleccion de lfneas para retrocruce que contienen la composicion genetica de mayor utilidad para incrementar el nivel de los compuestos anticarcinogenicos en el brocoli.
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SUMARIO DE LA INVENCION
La presente invencion proporciona una planta de Brassica comestible producida segun un procedimiento para la produccion de Brassica oleracea con niveles elevados de 4-metilsulfinilbutil glucosinolatos o 3-metilsulfinilpropil glucosinolatos, o ambos, que comprende:
a) cruzar especies silvestres de Brassica oleracea seleccionadas del grupo constituido por Brassica villosa y Brassica drepanensis con lfneas de brocoli doble haploide para la reproduccion;
b) seleccionar los hfbridos con niveles de 4-metilsulfinilbutil glucosinolatos o 3-metilsulfinilpropil glucosinolatos, o ambos, por encima de los inicialmente encontrados en las lfneas de brocoli doble haploide para la reproduccion;
c) retrocruzar y seleccionar las plantas con la combinacion genetica que codifica la expresion de niveles elevados de 4- metilsulfinilbutil glucosinolatos o 3-metilsulfinilpropil glucosinolatos, o ambos; y
d) seleccionar una lfnea de brocoli con niveles elevados de 4-metilsulfinilbutil glucosinolatos o 3-metilsulfinilpropil glucosinolatos, o ambos, capaz de provocar una induccion fuerte de los enzimas de fase II,
donde se utilizan los marcadores moleculares en los pasos (b) y (c) para seleccionar los hfbridos con la combinacion genetica que codifica la expresion de niveles elevados de 4-metilsulfinilbutil glucosinolatos o 3-metilsulfinilpropil glucosinolatos, o ambos, capaz de provocar una induccion fuerte de los enzimas de fase II.
La presente invencion proporciona ademas una porcion comestible de una planta de brocoli producida segun un procedimiento para la produccion de Brassica oleracea con niveles elevados de 4-metilsulfinilbutil glucosinolatos o 3- metilsulfinilpropil glucosinolatos, o ambos, que comprende:
a) cruzar especies silvestres de Brassica oleracea seleccionadas del grupo constituido por Brassica villosa y Brassica drepanensis con lfneas de brocoli doble haploide para la reproduccion;
b) seleccionar los hfbridos con niveles de 4-metilsulfinilbutil glucosinolatos o 3-metilsulfinilpropil glucosinolatos, o ambos, por encima de los inicialmente encontrados en las lfneas de brocoli doble haploide para la reproduccion;
c) retrocruzar y seleccionar las plantas con la combinacion genetica que codifica la expresion de niveles elevados de 4- metilsulfinilbutil glucosinolatos o 3-metilsulfinilpropil glucosinolatos, o ambos; y
d) seleccionar una lfnea de brocoli con niveles elevados de 4-metilsulfinilbutil glucosinolatos o 3-metilsulfinilpropil glucosinolatos, o ambos, capaz de provocar una induccion fuerte de los enzimas de fase II,
donde se utilizan los marcadores moleculares en los pasos (b) y (c) para seleccionar los hfbridos con la combinacion genetica que codifica la expresion de niveles elevados de 4-metilsulfinilbutil glucosinolatos o 3-metilsulfinilpropil glucosinolatos, o ambos, capaz de provocar una induccion fuerte de los enzimas de fase II.
La presente invencion tambien proporciona una semilla de una planta de brocoli producida segun un procedimiento para la produccion de Brassica oleracea con niveles elevados de 4-metilsulfinilbutil glucosinolatos o 3-metilsulfinilpropil glucosinolatos, o ambos, que comprende:
a) cruzar especies silvestres de Brassica oleracea seleccionadas del grupo constituido por Brassica villosa y Brassica drepanensis con lfneas de brocoli doble haploide para la reproduccion;
b) seleccionar los hfbridos con niveles de 4-metilsulfinilbutil glucosinolatos o 3-metilsulfinilpropil glucosinolatos, o ambos, por encima de los inicialmente encontrados en las lfneas de brocoli doble haploide para la reproduccion;
c) retrocruzar y seleccionar las plantas con la combinacion genetica que codifica la expresion de niveles elevados de 4- metilsulfinilbutil glucosinolatos o 3-metilsulfinilpropil glucosinolatos, o ambos; y
d) seleccionar una lfnea de brocoli con niveles elevados de 4-metilsulfinilbutil glucosinolatos o 3-metilsulfinilpropil glucosinolatos, o ambos, capaz de provocar una induccion fuerte de los enzimas de fase II,
donde se utilizan los marcadores moleculares en los pasos (b) y (c) para seleccionar los hfbridos con la combinacion genetica que codifica la expresion de niveles elevados de 4-metilsulfinilbutil glucosinolatos o 3-metilsulfinilpropil glucosinolatos, o ambos, capaz de provocar una induccion fuerte de los enzimas de fase II.
En una realizacion adicional, la invencion proporciona una planta de brocoli que tiene niveles elevados de 3- metilsulfinilpropil glucosinolatos o 4-metilsulfinilbutil glucosinolatos, o ambos, donde la planta de brocoli es una planta hfbrida despues de cruzar lfneas de brocoli doble haploide para la reproduccion con especies silvestres de Brassica oleracea seleccionadas del grupo constituido por Brassica villosa y Brassica drepanensis y los niveles de 3-
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metilsulfinilpropil glucosinolatos o 4-metilsulfinilbutil glucosinolatos, o ambos, estan entre 10 y 100 pmoles por gramo de peso seco de dicha planta.
Como alternativa, la invencion proporciona inflorescencia de brocoli que tiene niveles elevados de 3-metilsulfinilpropil glucosinolatos o 4-metilsulfinilbutil glucosinolatos, o ambos, donde la inflorescencia de brocoli se obtienen de una planta hfbrida despues de cruzar lfneas de brocoli doble haploide para la reproduccion con especies silvestres de Brassica oleracea seleccionada del grupo constituido por Brassica villosa y Brassica drepanensis y los niveles de 3- metilsulfinilpropil glucosinolatos o 4-metilsulfinilbutil glucosinolatos, o ambos, estan entre 10 y 100 pmoles por gramo de peso seco de la inflorescencia.
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS
Figura 1. Modelo genetico de la biosfntesis de glucosinolato alifatico en Brassica.
Figura 2. Induccion de la actividad QR (enzimas de fase II) en las celulas de hepatoma murino Hepa 1c1c7 utilizando extractos del cultivo Marathon y sulforafano sintetico (4-metilsulfinilbutil isotiocianato).
Figura 3. Efecto de los extractos de B. drepanensis; B. villosa y B. atlantica en la induccion de QR (enzimas de fase II) en celulas de hepatoma murino Hepa 1c1c7.
Figura 4. El efecto de los extractos del cultivo GD DH y los hfbridos recobrados de los cruces con las especies silvestres (GD DH x B. drepanensis); (GD DH x B. villosa) y (GD DH x B. atlantica), en la induccion de QR (enzimas de fase II) en las celulas de hepatoma murino Hepa 1c1c7.
Figura 5. Perfiles de cromatograffa de gases de los glucosinolatos de un extracto derivado del hfbrido (GD DH x B. drepanensis).
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION
El objetivo de la presente invencion es proporcionar una verdura comestible del genero crucffera con niveles elevados de los compuestos anticarcinogenicos, es decir 4-metilsulfinilbutil isotiocianato y/o 3-metilsulfinilpropil isotiocianato.
Estas plantas se obtienen utilizando procedimientos para el incremento selectivo de los derivados de glucosinolato anticarcinogenicos en las especies de Brassica, que proporcionan especies de Brassica con niveles incrementados de los derivados de glucosinolatos anticarcinogenicos y en particular verduras comestibles del genero Brassica con niveles elevados de los derivados de glucosinolato anticarcinogenicos 4-metilsulfinilbutil isotiocianato y/o 3- metilsulfinilpropil isotiocianato.
La seleccion de brocoli con niveles elevados de los glucosinolatos anticarcinogencios no es posible sobre el fondo genetico comercial actual utilizado para desarrollar cultivos comerciales de brocoli. Con base en el modelo genetico de la biosfntesis de glucosinolatos mostrado en la Figura 1, la produccion de 4-metilsulfinilbutil y/o 3-metilsulifinilpropil glucosinolato depende de un numero de factores geneticos. Estos incluyen una baja actividad del alelo GSL-ALK y niveles adecuados de la actividad codificada por el alelo GSL-OXID y otros alelos responsables de la produccion de los precursores del glucosinolato. Se cree que el sabor relativamente suave del brocoli esta asociado con niveles relativamente bajos de glucosinolatos en general y en particular de los glucosinolatos volatiles. Esto es evidente cuando se compara el perfil total de glucosinolato del brocoli comercial con el de sus parientes silvestres.
Por consiguiente los procedimientos para producir brocoli con las caracterfsticas de sabor y los niveles elevados de glucosinolatos anticarcinogenicos deben comprender la seleccion de lfneas con las combinaciones geneticas apropiadas que no producen glucosinolatos alquenilados con un fuerte sabor. Tambien es deseable mantener un nivel bajo de otros glucosinolatos para evitar la produccion de sabores extranos. En consecuencia los procedimientos para lograr el incremento de 4-metilsulfinilbutil y/o 3-metilsulfinilpropil glucosinolatos no deben resultar en una produccion generalizada de glucosinolatos o produccion de alquenil glucosinolatos.
En las condiciones normales de campo, se cree que es poco probable que la B. oleracea silvestre se cruce con la B. oleracea cultivada. Se cree que los caracteres de compatibilidad estan inhibidos cuando florecen los cultivos.
Los marcadores geneticos facilitan la seleccion de las lfneas que contienen las combinaciones geneticas deseadas. La utilizacion de marcadores RFLP, o de sondas de ADN que se segregan con caracteres especfficos es bien conocida en la tecnica, sin embargo las sondas de ADN especfficas que han demostrado ser utiles para la seleccion de combinaciones geneticas que conducen a niveles elevados de 4-metilsulfinilbutil y/o 3-metilsulfinilpropil glucosinolatos en Brassica oleracea no se conocfan. Ademas, el analisis por RFLP proporciona un medio util para valorar la fraccion del genoma de la planta hfbrida que proviene del brocoli o de la especie silvestre. En consecuencia, la utilizacion de RFLP o de sondas de ADN encuentra utilidad para la seleccion rapida de plantas que contienen la proporcion deseada de genoma de la especie silvestre y de brocoli. En consecuencia, la seleccion de brocoli con niveles elevados de 4- metilsulfinilbutil y/o 3-metilsulfinilpropil glucosinolatos que incluye un porcentaje elevado del genoma comercial deseado
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se ve facilitado en gran medida por el uso de marcadores de ADN para analizar plantas hfbridas despues de cruzar brocoli con especies silvestres.
Se describen procedimientos para valorar las propiedades anticarcinogenicas del brocoli que contiene niveles elevados de 4-metilsulfinilbutil y/o 3-metilsulfinilpropil glucosinolatos mediante el ensayo de la induccion de enzimas de fase II. Aunque los efectos anticarcinogenicos a largo plazo de derivados de 4-metilsulfinilbutil y/o 3-metilsulfinilpropil glucosinolatos especfficos no se pueden determinar con precision y ademas dependeran de muchos factores adicionales, dieteticos y otros, la utilizacion del ensayo de induccion proporciona pruebas convincentes de los efectos anticarcinogenicos de los derivados isotiocianato de los glucosinolatos especfficos.
Se describen procedimientos que permiten la seleccion de Brassica sp. con niveles elevados de 4-metilsulfinilbutil y/o 3-metilsulfinilpropil glucosinolatos, procedimientos para valorar los efectos anticarcinogenicos de dichas especies vegetales y procedimientos y composiciones que permiten la obtencion de lfneas de brocoli con propiedades anticarcinogenicas.
Un procedimiento que se puede utilizar para seleccionar lfneas de brocoli con niveles elevados de glucosinolatos especfficos comprende:
I) Cruzar especies silvestres con lfneas de brocoli doblemente haploides para la reproduccion;
II) Analizar los hfbridos F1, seleccionando los hfbridos con los niveles mas elevados de 4-metilsulfinilbutil y/o 3- metilsulfinilpropil glucosinolatos y retrocruzar con las lfneas de brocoli para la reproduccion;
III) Analisis de los glucosinolatos en plantas individuales de la generacion B1 (retrocruce 1);
IV) Uno o dos ciclos mas de retrocruces (B2, B3) con seleccion de las plantas con los niveles mas elevados de 4-metilsulfinilbutil y/o 3-metilsulfinilpropil glucosinolatos, escrutinio de la capacidad anticarcinogenica de los individuos seleccionados por induccion de los enzimas de fase II;
V) Analisis de las poblaciones B3 (Retrocruce 3) con seleccion de las plantas con los niveles mas elevados de 4-metilsulfinilbutil y/o 3-metilsulfinilpropil glucosinolatos, escrutinio anticarcinogenico de los individuos seleccionados por induccion de los enzimas de fase II;
VI) Seleccion de una lfnea de brocoli con niveles elevados de 4-metilsulfinilbutil y/o 3-metilsulfinilpropil glucosinolatos portadores de los caracteres anticarcinogenicos capaces de producir una fuerte induccion de los enzimas de fase II.
En consecuencia el procedimiento permite la seleccion de lfneas de brocoli con niveles elevados de 4-metilsulfinilbutil y/o 3-metilsulfinilpropil glucosinolatos. Los niveles elevados de dichos glucosinolatos especfficos se correlacionan con la propiedad anticarcinogenica por evaluacion de la induccion de los enzimas de fase II. Debido al uso de retrocruces, se generan combinaciones geneticas que comprenden el caracter anticarcinogenico en el fondo genetico que se encuentra en el brocoli comercial. Consecuentemente se logra la produccion de 4-metilsulfinilbutil y/o 3- metilsulfinilpropil glucosinolatos en los cultivos comerciales de brocoli, dando lugar a una nueva y valiosa composicion de brocoli.
En otra forma de realizacion de la presente invencion, la capacidad anticarcinogenica de las lfneas se combina ademas con alelos especfficos de autoincompatibilidad que son utiles para las estrategias en la produccion de semilla. Se conoce que ciertas especies de crucfferas son portadoras de multiples alelos de autoincompatibilidad y dichos alelos se utilizan frecuentemente para la produccion de semillas hfbridas. De este modo se puede producir un brocoli hfbrido portador de las combinaciones geneticas que producen niveles elevados de 4-metilsulfinilbutil y/o 3-metilsulfinilpropil glucosinolatos. Otro objetivo de la presente invencion es seleccionar lfneas de brocoli con niveles elevados de 4- metilsulfinilbutil y/o 3-metilsulfinilpropil glucosinolatos y una combinacion especffica de alelos de autoincompatibilidad (SI). En algunos casos, se puede utilizar una sonda molecular para identificar los alelos SI, tal como la sonda pW150 (disponible del Dr. Tom Osborne, Department of Agronomy, University of Wisconson, Madison, WI, 53706, descrita ademas en Toroser et al., Theoretical and Applied Genetics, 91:802-808 (1995)) o el analisis de la propia protefna SI puede proporcionar la seleccion del alelo SI deseado.
Un procedimiento que se puede utilizar para seleccionar lfneas de brocoli con niveles elevados de glucosinolatos especfficos y alelos SI comprende:
I) Cruzar especies silvestres con lfneas doble haploides de brocoli para la reproduccion que contienen alelos SI especfficos;
II) Analizar los hfbridos F1, seleccionando los hfbridos con los niveles mas elevados de 4-metilsulfinilbutil y/o 3- metilsulfinilpropil glucosinolatos y retrocruzando con las lfneas de brocoli para la reproduccion, escrutinizando los alelos Si con marcadores rFlP, seleccionando los individuos con las combinaciones deseadas de alelos SI contrastantes;
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III) Analizar los glucosinolatos en plantas individuales de la generacion B1 (Retrocruce 1);
IV) Uno o dos ciclos mas de retrocruces con seleccion de las plantas con el nivel mas elevado de 4- metilsulfinilbutil y/o 3-metilsulfinilpropil glucosinolatos, escrutinio de los alelos SI adecuados con marcadores RFLP, escrutinio de la anticarcinogenicidad en los individuos seleccionados por induccion de los enzimas de fase II;
V) Analisis de la poblacion B3 (Retrocruce 3) con seleccion de las plantas con el nivel mas elevado de 4- metilsulfinilbutil y/o 3-metilsulfinilpropil glucosinolatos, escrutinio de la anticarcinogenicidad de los individuos seleccionados por induccion de los enzimas de fase II;
VI) Seleccion de una lfnea de brocoli con niveles elevados de 4-metilsulfinilbutil y/o 3-metilsulfinilpropil glucosinolatos y los alelos SI adecuados que porta el caracter anticarcinogenico capaz de producir una fuerte induccion de los enzimas de fase II;
En consecuencia se producen lfneas de brocoli portadoras de alelos SI especfficos utiles para hacer cruces en un esquema de produccion de semillas hfbridas. Consecuentemente por cruce con el padre adecuado se puede producir semilla de brocoli hfbrido portadora de combinaciones geneticas para niveles elevados de 4-metilsulfinilbutil y/o 3- metilsulfinilpropil glucosinolatos. Dicha semilla es valiosa ya que el brocoli hfbrido tambien es portador de muchas combinaciones geneticas importantes para el rendimiento agronomico.
Se describe otro procedimiento que utiliza marcadores de ADN que se segregan con perfiles especfficos de glucosinolatos. En dicho procedimiento, la utilizacion de marcadores de ADN, o mas especfficamente los marcadores conocidos como QTLs (loci de caracteres cuantitativos) se utilizan para seleccionar las combinaciones geneticas del brocoli que conducen a niveles elevados de 4-metilsulfinilbutil y/o 3-metilsulfinilpropil glucosinolatos. En particular se describe la utilizacion de los marcadores conocidos como pW176, pW207 y pW141, localizados en el cromosoma 2 y los marcadores conocidos como pW224, pW114, pw145, pW123, pW138, pW197, pW228, pW106 localizados en el cromosoma 5 (disponibles del Dr. Tom Osborne, Department of Agronomy, University of Wisconson, Madison, WI, 53706 y descritos en Toroser et al., Theoretical and Applied Genetics, 91:802-808 (1995) y descritos en Ferreira et al., Theoretical and applied Genetics, 89:615-621 (1994)).
Se ha encontrado que dos regiones del genoma (encontradas en los cromosomas 2 y 5) de Brassica oleracea silvestre son necesarias para la expresion de niveles elevados de 4-metilsulfinilbutil y/o 3-metilsulfinilpropil glucosinolatos. La utilizacion de los marcadores facilita considerablemente la seleccion de las lfneas de los hfbridos y los retrocruces entre el brocoli y las especies silvestres que contienen las combinaciones geneticas responsables de la produccion de niveles elevados de 4-metilsulfinilbutil y/o 3-metilsulfinilpropil glucosinolatos. Ademas, se ha encontrado que el QTL localizado en el cromosoma 5 regula especfficamente los niveles de 3-metilsulfinilpropil glucosinolato y tiene poco efecto en los niveles de 4-metilsulfinilbutil glucosinolato. En consecuencia es posible manipular los niveles de 3- metilsulfinilpropil glucosinolato y de 4-metilsulfinilbutil glucosinolato independientemente utilizando sondas moleculares ademas de la simple seleccion de lfneas.
En consecuencia, un procedimiento para la produccion de brocoli con niveles elevados de 4-metilsulfinilbutil y/o 3- metilsulfinilpropil glucosinolatos comprende:
I) Cruzar la especie silvestre con lfneas de brocoli doble haploide para la reproduccion;
II) Analizar los hfbridos F1 y seleccionar los hfbridos con los niveles mas elevados de 4-metilsulfinilbutil y/o 3- metilsulfinilpropil glucosinolatos por escrutinio con sondas RFLP asociadas a la produccion de 4- metilsulfinilbutil y/o 3-metilsulfinilpropil glucosinolatos y retrocruce de las lfneas seleccionadas con las lineas de brocoli para la reproduccion;
III) Analisis de los glucosinolatos en plantas individuales de la generacion B1 (Retrocruce 1);
IV) Uno o dos ciclos mas de retrocruces con seleccion de las plantas con los niveles mas elevados de 4- metilsulfinilbutil y/o 3-metilsulfinilpropil glucosinolatos por escrutinio con sondas de RFLP asociadas a la produccion de 4-metilsulfinilbutil y/o 3-metilsulfinilpropil glucosinolatos, escrutinio de la anticarcinogenicidad de los individuos seleccionados por induccion de los enzimas de fase II;
V) Analisis de la poblacion B3 (Retrocruce 3) con seleccion de las plantas con los niveles mas elevados de 4- metilsulfinilbutil y/o 3-metilsulfinilpropil glucosinolatos por escrutinio con sondas de RFLP asociadas a la produccion de 4-metilsulfinilbutil y/o 3-metilsulfinilpropil glucosinolatos y analisis de los perfiles de glucosinolatos, escrutinio de la anticarcinogenicidad de los individuos seleccionados por induccion de los enzimas de fase II;
VI) Seleccion de una lfnea de brocoli con niveles elevados de 4-metilsulfinilbutil y/o 3-metilsulfinilpropil glucosinolatos portadora del caracter anticarcinogenico capaz de causar una induccion fuerte de los enzimas de fase II.
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En consecuencia la utilizacion de las sondas de RFLP para identificar las regiones especfficas del genoma de Brassica oleracea silvestre (p.ej. los denominados QTLs) responsables de la produccion de niveles elevados de 4- metilsulfinilbutil y/o 3-metilsulfinilpropil glucosinolatos facilita considerablemente la produccion de brocoli comestible con propiedades anticarcinogenicas.
Las anteriores formas de realizacion permiten la seleccion de lfneas de brocoli con niveles elevados de 4- metilsulfinilbutil y/o 3-metilsulfinilpropil glucosinolatos, preferiblemente brocoli con una composicion que comprende concentraciones de 4-metilsulfinilbutil y/o 3-metilsulfinilpropil glucosinolatos entre 10 y 100 pmoles/g de peso seco. Ademas, las formas de realizacion anteriores permiten la seleccion de lfneas de brocoli con niveles elevados de 4- metilsulfinilbutil y/o 3-metilsulfinilpropil glucosinolatos capaces de producir un incremento de 10 a 100 veces en la induccion de los enzimas de fase II en comparacion con los cultivos de brocoli utilizados comunmente en el comercio.
Los expertos en la tecnica contemplaran que los procedimientos descritos en la presente memoria tambien se pueden utilizar para obtener otras hortalizas crucfferas B. oleracea ademas del brocoli, incluyendo el repollo tal como el repollo blanco, repollo verde tal como el Savoy, coliflor, coles de Bruselas, col rizada, colirrabano y semejantes. Se contempla ademas que el colinabo (B. napus) y el nabo (B. rapa) tambien se pueden manipular segun el procedimiento y las combinaciones geneticas de la presente invencion.
Ejemplo 1.- Procedimientos para la medicion del contenido de glucosinolatos en especies silvestres y comerciales de la especie Brassica e hfbridos de estas.
Una lfnea doble haploide de brocoli para la reproduccion derivada del cultivo Green Duke (referido como GD DH; Bouhuon, E. J. R., Keith, D. J., Parkin, I. A. P., Sharpe, A. G., and Lydiate, D. J., (1996) Theor. Appl. Genet., 93:833839), tres cultivos comerciales (Trixie, Green Comet y Marathon) y tres especies silvestres de Brassica: B. drepanensis Caruel (sin. B. villosa Biv. subsp drepanensis), B. Villosa Biv. y B. atlantica (coss.) O. E. Schultz, fueron cultivadas en un invernadero en condiciones estandar tal como se describio previamente (Magrath, R., Herron, C., Giamuoustaris, A. and Mithen, R., (1993) Pant Breed.,111:55-72). Se cruzo cada una de las especies silvestres con la lfnea para reproduccion GD DH, se obtuvieron semillas F1 y se cultivaron en condiciones estandar. El 11 de febrero de 1999 se hizo un deposito de las semillas del cultivo derivado de GD DH en la National Collection of Industrial and Marine Bacteria Limited (NCIMB) en Aberdeen, Escocia y se asigno al deposito el n° NCIMB 41008. Despues de 8 -12 semanas se cosecharon las inflorescencias de los cultivos y las de los hfbridos despues de 12 a 16 semanas, se congelaron inmediatamente en nitrogeno lfquido y se liofilizaron. El sulforafano sintetico fue generosamente proporcionado por el profesor P. Talalay, The John Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD.
Se extrajeron los glucosinolatos del material liofilizado, se convirtieron en desulfoglucosinolatos y se analizaron por HPLC tal como se describio previamente (Magrath, R., Herron, C., Giamoustaris, A., and Mithen, R., (1993) Plant Breed., 111:55-72) utilizando como estandar interno benzil glucosinolato.
Los extractos del material liofilizado se valoraron para determinar su actividad inductora en celulas del hepatoma murino Hepa 1c1c7. Se humedecieron aproximadamente 0,1 g de material liofilizado molido anadiendo agua (2 ml), se homogeneizo y se dejo a temperatura ambiente durante 1 hora con mezclado ocasional. Se anadio metanol caliente (3 ml) al 70 % (vol/vol) y se mezclo completamente antes de incubar durante 15 minutos a 70 °C. Se enfriaron los homogeneizados a temperatura ambiente y se centrifugaron durante 5 minutos a 3000 r.p.m. Se recogieron los sobrenadantes y se redujo el volumen hasta un quinto del volumen inicial en una centrffuga al vacfo. Los concentrados resultantes se filtraron a traves de un filtro esteril no pirogenico (0,22 mm) y se guardaron a -70 °C antes de ser ensayados. La concentraciones de cada extracto se expresaron como peso seco del material original por ml de medio de cultivo.
La induccion se midio segun los procedimientos publicados (Tawfiq, N., Heaney, R. K., Plumb, J. A., Fenwick, G. R., Musk, S. R. R., and Williamson, G., (1995) Carcinogenesis, 16:1191-1194, Prochaska, H. J., and Santamarfa, A. B., (1988) Anal. Biochem. 169:328-336, Williamson, G., Plumb, G. W., Uda, Y., Price, K. R., and Rhodes, M. J. C., (1996) Carcinogenesis, 17:2385-2387) con las siguientes modificaciones. Cada muestra fue analizada a ocho concentraciones utilizando cuatro replicas por cada concentracion. Se utilizo b-naftoflavona como control positivo a una concentracion de 0,2 mM. Esto tfpicamente produjo una induccion de tres veces (CD; 0,02 mM) y fue comparable a determinaciones anteriores. Cada cultivo/hfbrido fue extrafdo en tres ocasiones y se analizo por separado.
Los componentes no volatiles y volatiles de los productos de degradacion hidrolftica de los cultivos, de las especies silvestres y de los hfbridos fueron analizados por GC-MS utilizando una HP Chemstation GP800A equipada con una columna HP1 de metilsilano entrelazado de 30 m x 0,25 mm (Hewlett Packard Co. Palo Alto, CA. USA). Tfpicamente, la columna se calento desde 60 °C hasta 250 °C a 20 °C/min y el barrido del espectrograma de masas fue desde 35 hasta 250 m/z. Se humedecieron en agua aproximadamente 0,1 g del material liofilizado, se mezclo exhaustivamente y se incubo durante 1 hora con mezclado ocasional. Los productos de hidrolisis no volatiles se extrajeron de las muestras con cloruro de metileno y se filtraron antes del analisis. Para analizar los productos volatiles, se humedecio en agua (0,5 ml) el material liofilizado (0,1 g), se sello el vial de vidrio inmediatamente y los productos volatiles se recogieron del espacio superior del vial con una sonda de extraccion de matriz de fase solida (SPME) (Supelco Inc., Bellefonte, PA, USA).
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Ejemplo 2. Contenido en glucosinolato de las lineas de Brassica
La Tabla 1 a continuacion, muestra los contenidos en glucosinolato de los cultivos comerciales de brocoli Green Comet, Marathon y Trixie, la especie B. oleracea silvestre y los hfbridos entre una lineas doble haploide del cultivo comercial Green Duke y las especies silvestres de Brassica.
TABLA 1
Contenido individual y total en glucosinolato alifatico ( pmoles/g materia seca + 1 error estandar) de los cultivos de brocoli, especies silvestres de Brassica e hfbridos producto de los cruces entre GD DH y las especies silvestres de Brassica.
- MSP* MSB PROP BUT MTP OH-BUT TOTAL
- Gree Comet
- 0,1 + 0,1 0,8 + 0,5 0,2 + 0,1 0,0 2,7 + 0,5 0,5 + 0,3 4,3 + 0,5
- GD DH
- 0,2 + 0,2 4,6 + 1,1 0,0 0,0 2,3 + 0,6 0,0 7,1 + 1,1
- Marathon
- 1,0 + 0,3 5,4 + 1,1 0,2 + 0,1 0,0 4,1+ 0,7 0,0 10,7 + 1,8
- Trixie
- 0,4 + 0,2 11,1 + 2,1 0,2 + 0,1 0,0 4,9 + 1,2 0,0 16,6 + 2,6
- B. atlantica
- 0,9 + 0,7 0,0 92,8 + 25,4 0,5 + 0,3 1,1 + 1,0 0,0 95,3 + 26,6
- B.drepanensis
- 11.0 + 1,7 0,0 0,0 0,0 51,6 + 9,3 0,0 62,6 + 10,9
- B. villosa
- 119 + 18 1,4 + 0,2 0,0 0,1 + 0,1 3,4 + 0,9 0,1 + 0,1 124 + 19
- GD! x B.atlantica
- 2,2 + 0,8 5,3 + 1,4 76,9 + 20,8 23,6 + 6,3 2,0 + 0,7 43,7 + 6,7 154 + 30
- GD x B.drepanensis
- 26,2 + 2,9 76,5 + 8,9 0,0 0,0 1,9 + 0,4 0,0 105 + 12
- GD x B.villosa
- 26,4 + 2,7 81,8 + 5,0 0,0 0,0 1,0 + 0,3 0,0 109 + 7
*MSP: 3-metilsulfinilpropil, MSB: 4-metilsulfinilbutil, PROP: 2-propenil, BUT: 3-butenil, MTP: 3-metiltiopropil, OH- BUT: 2-hidroxi-3-butenil, ! GD: GD DH
Los niveles de 4-metilsulfinilbutil glucosinolatos en los cultivos de brocoli fueron semejantes a los previamente reportados (Carlson, D. G., Daxenbichler, M. E., van Etten, C. H., Kwolek, W. F., and Williams, P. H., (1987) J. Amer. Soc. Hort. Sci., 112:173-178). Las especies silvestres tuvieron aproximadamente un nivel diez veces superior de glucosinolatos alifaticos que los cultivos. B. villosa, B. drepanensis y B. atlantica tuvieron predominantemente 3- metilsulifinilpropil, 3-metiltiopropil y 2-propenil glucosinolatos. Las diferencias en perfiles de glucosinolato se atribuyeron a diferencias en los alelos en el locus de la GSL-OXID y de la GSL-ALK (Giamoustaris, A. and Mithen, R. (1996) Theor. Appl. Gennet., 93:1006-1010). En los hfbridos de [GD DH x B. drepanensis] y [GD DH x B. villosa] el 4- metilsulifinibutil fue el glucosinolato mas abundante debido a la naturaleza dominante de los alelos GSL-ELONG y GSL- OXID que se encuentran en GD DH y al alelo nulo de GSL-ALK en ambos padres. En el hfbrido [GD DH x B. atlantica], el 3-butenil glucosinolato fue el glucosinolato predominante. El 2-hidroxi-3-butenil glicosinolato tambien se encontro debido a la accion de un alelo GSL-OH funcional que se encuentra en la lfnea GD DH (observacion no publicada), que normalmente no es evidente debido a que el alelo nulo GSL-ALK evita la biosfntesis de 3-butenil glucosinolato.
Ejemplo 3. Induccion de los enzimas de fase II.
Se utilizo sulforafano sintetico como control positivo para cuantificar la induccion de QR en celulas Hepa 1c1c7. Fue un inductor potente y produjo una induccion de 3 veces a 1,6 mM (CD; 0,4 mM), comparable con determinaciones anteriores. No se observo citotoxicidad en ninguna de las muestras ni a ninguna de las concentraciones ensayadas. Los extractos de todos los cultivos fueron inductores debiles en el rango de concentraciones de 0,001 mg/ml a 0,125 mg/ml. Sin embargo, la induccion fue menor que la esperada si el 100 % de los glucosinolatos se hubiesen convertido en isotiocianatos y no en otros productos tales como tiocianatos o derivados de nitrilo (Fenwick, G. R., Heaney, R. K., and Mullin, W. J., (1983) Crit. Rev. Food Sci. Nutr, 18:123-201).
Por ejemplo, Marathon contuvo 5,4 mmoles de 4-metilsulfinilbutil glucosinolato/g de materia seca (Tabla 1). En consecuencia, un extracto que contiene 75 mg/ml de Marathon se esperarfa que tuviese una concentracion de 4- metilsulfinilbutil isotiocianato de 0,4 mM que podrfa resultar en una induccion de dos veces. Sin embargo, no se observo una induccion significativa a dicha concentracion. Desde luego, se necesitaron 2,5 mg/ml de extracto de Marathon para una induccion de dos veces, que si se convirtiese el 100 % de los glucosinolatos a isotiocianatos, habrfa sido equivalente a 13,5 mM de 4-metilsulfinilbutil isotiocianato. En consecuencia, o se ha convertido solo una pequena proporcion del glucosinolato en 4-metilsulfinilbutil isotiocianato o la induccion de la actividad QR se redujo debido a la presencia de otros componentes en el extracto vegetal.
Para determinar la presencia de un inhibidor, un extracto de Marathon (0,125 mg/ml) fue mezclado con sulforafano sintetico antes de ser aplicado a las celulas Hepa 1c1c7. La induccion observada fue similar a la del sulforafano puro por si solo (Figura 2), lo que demostro que no se produjeron efectos inhibidores debidos a otros componentes del extracto. En la Figura 2, se muestra la induccion de QR en las celulas Hepa 1c1c7 utilizando sulforafano (A); extracto de Marathon (0,125 mg/ml) con sulforafano anadido (■) o extracto de Marathon (0,001 mg/ml a 0,125 mg/ml), (o). La concentracion estimada de isotiocianato del extracto de Marathon esta basada en el supuesto de que el 100 % del
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50
55
glucosinolato parental se convierta en isotiocianato. Por consiguiente, el extracto de Marathon (1 mg/ml) es equivalente a 5,4 pM de 4-metilsulfinilbutil isotiocianato. Los resultados de Marathon (0,125 mg/ml) con sulforafano anadido se ha indicado graficamente solo con respecto a la concentracion de sulforafano sintetico anadido, ya que el extracto de Marathon solo no tiene un efecto significativo sobre la induccion de actividad. En consecuencia, es posible que en Marathon (y tambien en otros cultivos) solamente una fraccion del glucosinolato haya sido convertida en isotiocianato.
Los extractos de B. villosa y de B. drepanensis fueron potentes inductores de la actividad QR. Por el contrario, los extractos de B. atlantica no indujeron la actividad QR, a pesar del elevado contenido en glucosinolato (Figura 3). En la Figura 3, se muestran los efectos de los extractos de: B. drepanensis (■); B. villosa (♦) y B. atlantica (□) sobre la induccion de QR en las celulas de hepatoma murino Hepa 1c1c7. Si asume que el 100 % de los glucosinolatos en dichas taxas ha sido convertido en isotiocianato y no en otros productos de degradacion hidrolftica posibles (tiocianato y derivados de nitrilo), los valores CD aparentes para el 3-metiltiopropil isotiocianato y 3-metilsulfinilpropil isotiocianato son 1,6 mM y 0,5 mM respectivamente. Dichos valores son ambos inferiores a los reportados para los isotiocianatos sinteticos a 3,5 mM y 2,4 mM, tal como se ilustra en la Tabla 2. Desde luego, si se hubiese convertido menos del glucosinolato a isotiocianato el valor CD aparente habrfa sido todavfa inferior. La Tabla 2 a continuacion, ilustra la induccion por los extractos vegetales de actividad QR (enzimas de fase II) en las celulas Hepa 1c1c7.
TABLA 2
Potencia de la induccion de QR en celulas murinas Hepa 1c1c7 por los extractos vegetales
- Isotiocianato Predominante Valor CD aparente* (pM) Valor CD para el isotiocianato sintetico (pM) (ver Zhang (2))
- B. drepanensis
- 3-metiltiopropil 1,6+ 3,5
- B. villosa
- 3-metilsulfinilpropil 0,5+ 2,4
- GD ^ x B. drepanensis
- 4-metilsulfinilbutil 0,3+ 0,4 - 0,8
- GD x B. villosa
- 4-metilsulfinilbutil 0,3+ 0,4 - 0,8
- Sulforafano sintetico
- 4-metilsulfinilbutil 0,3 0,4 - 0,8&
* Valo CD: concentracion del glucosinolato parental necesaria para duplicar la actividad inductora de QR. + Los valores indicados se calcularon asumiendo una conversion del 100 % de los glucosinolatos parentales a los isotiocianatos correspondientes. ^ GD: GD DH.
& Otros estudios han indicado un valor CD de 0,2 pM. Ver Prochaska (10).
La diferencia en potencia podrfa ser consecuencia de diferencias qufmicas entre los isotiocianatos naturales y sinteticos (p.ej. la naturaleza de los estereoisomeros) o de otros factores en los extractos de las plantas que podrfan incluir efectos sinergicos debidos a niveles bajos de otros isotiocianatos. La falta de actividad de los extractos de B. atlantica acentua la importancia de la estructura de las cadenas laterales de los glucosinolatos.
Tanto los extractos de [GD DH x B. villosa] como los de [GD DH x B. drepanensis] fueron inductores potentes de la actividad QR (Figura 4). En la Figura 4, se muestran los efectos de los extractos del cultivo GD DH (•); y de los cruces hfbridos [GD Dh x B. drepanensis] (■); [GD DH x B. villosa] (0) y [GD DH x B. atlantica] (A); en la induccion de QR en las celulas del hepatoma murino Hepa 1c1c7. Con base en una conversion del 100 % de los glucosinolatos a isotiocianatos, los valores aparentes de CD de ambos extractos fueron de 0,3 mM (equivalente de 4-metilsulfinilbutil glucosinolato), lo que es similar al del sulforafano puro (anterior) y al reportado en estudios anteriores. En consecuencia, mientras que hubo un aumento de aproximadamente 10 veces en el nivel de 4-metilsulfinilbutil glucosinolato en [GD DH x B. villosa] y [GD DH x B. drepanensis] en comparacion con Marathon y GD DH, hubo una diferencia de mas de 100 veces en la capacidad para inducir actividad Qr (es decir, hace falta por lo menos una cantidad 100 veces superior de tejido de Marathon para inducir una actividad Qr equivalente en comparacion con los hfbridos GD DH).
Para examinar la composicion y la naturaleza de los productos de hidrolisis, se analizaron los extractos por GC-MS (Figura 5). En la Figura 5, se muestra el perfil de cromatograffa de gases de un extracto de [GD DH x B. drepanensis]. La espectroscopia de masas confirmo los picos como (1), 3-metilsulfinilpropil nitrilo; (2), 4-metilsufinilbutil nitrilo; (3), 3- metilsulfinilpropil isotiocianato; (4), 4-metilsulfinilbutil isotiocianato. La hidratacion de las hojas liofilizadas de B. drepanensis y B. atlantica condujo a la produccion de grandes cantidades de 3-metiltiopropil y 2-propenil isotiocianatos volatiles. Se detecto 3-metilsulfinilpropil isotiocianato en los extractos de cloruro de metileno de B. villosa, lo que fue consistente con los perfiles de glucosinolato. En los extractos de [GD DH x B. villosa] y [GD DH x B. drepanensis], el isotiocianato dominante fue 4-metilsulfinilbutil isotiocianato tal como se esperaba. Tambien se detectaron niveles relativamente bajos de 3-metilsulfinilpropil isotiocianato y los derivados nitrilo. Por el contrario, en los cultivos solamente se encontraron trazas de 4-metilsulfinilbutil isotiocianato. Esto indica que la diferencia de 100 veces en la capacidad para inducir actividad QR entre los dos hfbridos y los cultivos se debe tanto al aumento en 4-metilsulfinilbutil glucosinolato como a la mayor conversion a isotiocianato.
Claims (5)
- 51015202530354045505560651. Una planta de Brassica comestible producida segun un procedimiento para la produccion de Brassica oleracea con niveles elevados de 4-metilsulfinilbutil glucosinolatos, o 3-metilsulfinilpropil glucosinolatos, o ambos, que comprende:(a) cruzar especies silvestres de Brassica oleracea seleccionadas del grupo constituido por Brassica villosa y Brassica drepanensis con lfneas de brocoli doble haploide para la reproduccion;(b) seleccionar los hfbridos con niveles de 4-metilsulfinilbutil glucosinolatos o 3-metilsulfinilpropil glucosinolatos, o ambos, por encima de los inicialmente encontrados en las lfneas de brocoli doble haploide para la reproduccion;c) retrocruzar y seleccionar las plantas con la combinacion genetica que codifica la expresion de niveles elevados de 4- metilsulfinilbutil glucosinolatos o 3-metilsulfinilpropil glucosinolatos, o ambos; yd) seleccionar una lfnea de brocoli con niveles elevados de 4-metilsulfinilbutil glucosinolatos o 3-metilsulfinilpropil glucosinolatos, o ambos, capaz de provocar una induccion fuerte de los enzimas de fase II,donde se utilizan los marcadores moleculares en los pasos (b) y (c) para seleccionar los hfbridos con la combinacion genetica que codifica la expresion de niveles elevados de 4-metilsulfinilbutil glucosinolatos o 3-metilsulfinilpropil glucosinolatos, o ambos, capaz de provocar una induccion fuerte de los enzimas de fase II.
- 2. Una porcion comestible de una planta de brocoli producida segun un procedimiento para la produccion de Brassica oleracea con niveles elevados de 4-metilsulfinilbutil glucosinolatos o 3-metilsulfinilpropil glucosinolatos, o ambos, que comprende:a) cruzar especies silvestres de Brassica oleracea seleccionadas del grupo constituido por Brassica villosa y Brassica drepanensis con lfneas de brocoli doble haploide para la reproduccion;b) seleccionar los hfbridos con niveles de 4-metilsulfinilbutil glucosinolatos o 3-metilsulfinilpropil glucosinolatos, o ambos, por encima de los inicialmente encontrados en las lfneas de brocoli doble haploide para la reproduccion;c) retrocruzar y seleccionar las plantas con la combinacion genetica que codifica la expresion de niveles elevados de 4- metilsulfinilbutil glucosinolatos o 3-metilsulfinilpropil glucosinolatos, o ambos; yd) seleccionar una lfnea de brocoli con niveles elevados de 4-metilsulfinilbutil glucosinolatos o 3-metilsulfinilpropil glucosinolatos, o ambos, capaz de provocar una induccion fuerte de los enzimas de fase II,donde se utilizan los marcadores moleculares en los pasos (b) y (c) para seleccionar los hfbridos con la combinacion genetica que codifica la expresion de niveles elevados de 4-metilsulfinilbutil glucosinolatos o 3-metilsulfinilpropil glucosinolatos, o ambos, capaz de provocar una induccion fuerte de los enzimas de fase II.
- 3. Una semilla de una planta de brocoli producida segun un procedimiento para la produccion de Brassica oleracea con niveles elevados de 4-metilsulfinilbutil glucosinolatos o 3-metilsulfinilpropil glucosinolatos, o ambos, que comprende:a) cruzar especies silvestres de Brassica oleracea seleccionadas del grupo constituido por Brassica villosa y Brassica drepanensis con lfneas de brocoli doble haploide para la reproduccion;b) seleccionar los hfbridos con niveles de 4-metilsulfinilbutil glucosinolatos o 3-metilsulfinilpropil glucosinolatos, o ambos, por encima de los inicialmente encontrados en las lfneas de brocoli doble haploide para la reproduccion;c) retrocruzar y seleccionar las plantas con la combinacion genetica que codifica la expresion de niveles elevados de 4- metilsulfinilbutil glucosinolatos o 3-metilsulfinilpropil glucosinolatos, o ambos; yd) seleccionar una lfnea de brocoli con niveles elevados de 4-metilsulfinilbutil glucosinolatos o 3-metilsulfinilpropil glucosinolatos, o ambos, capaz de provocar una induccion fuerte de los enzimas de fase II,donde se utilizan los marcadores moleculares en los pasos (b) y (c) para seleccionar los hfbridos con la combinacion genetica que codifica la expresion de niveles elevados de 4-metilsulfinilbutil glucosinolatos o 3-metilsulfinilpropil glucosinolatos, o ambos, capaz de provocar una induccion fuerte de los enzimas de fase II.
- 4. Una planta de brocoli que tiene niveles elevados de 3-metilsulfinilpropil glucosinolatos o 4-metilsulfinilbutil glucosinolatos o ambos; en la que la planta de brocoli es una planta hfbrida despues de cruzar lfneas de brocoli doble haploide para la reproduccion con especies silvestres de Brassica oleracea seleccionadas del grupo constituido por Brassica villosa y Brassica drepanensis y, los niveles de 4-metilsulfinilbutil glucosinolatos o 3-metilsulfinilpropil glucosinolatos o ambos, estan comprendidos entre 10 y 100 pmoles por gramo en peso seco de dicho planta.
- 5. Una inflorescencia de brocoli que tiene niveles elevados de 3-metilsulfinilpropil glucosinolatos, o 4-metilsulfinilbutil glucosinolatos o ambos; en la que la inflorescencia de brocoli se obtiene a partir de una planta hnbrida despues del cruce de lmeas de brocoli doble haploide para la reproduccion con especies silvestres de Brassica oleracea 5 seleccionadas del grupo constituido por Brassica villosa y Brassica drepanensis y los niveles de 4-metilsulfinilbutil glucosinolatos o 3-metilsulfinilpropil glucosinolatos o ambos, estan comprendidos entre 10 y 100 pmoles por gramo en peso seco de la influorescencia.
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