NL1023179C2

NL1023179C2 - Brassica varianten met hoge gehaltes aan anti-carcinogene glucosinolaten.

Info

Publication number: NL1023179C2
Application number: NL1023179A
Authority: NL
Inventors: Piet Barten
Original assignee: Bejo Zaden Bv
Priority date: 2003-04-14
Filing date: 2003-04-14
Publication date: 2004-10-18
Also published as: US20070033675A1; US8921644B2; WO2004089065A1

Description

*

BRAS SI CA VARIANTEN MET HOGE GEHALTES AAN ANTI -CARCINOGENE

GLUCOSINOLATEN

De onderhavige uitvinding betreft een werkwijze voor 5 het verschaffen van planten welke behoren tot de familie van de Brassicaceae met hoge gehaltes aan anti-carcinogene glucosinolaten. De uitvinding heeft verder betrekking op Brassica planten welke verkrijgbaar zijn met de methode volgens de onderhavige uitvinding en evenzo hun zaden en 10 plantdelen. Daarnaast betreft de uitvinding het gebruik van de Brassica planten voor de bereiding van voedselproducten en/of farmaceutische samenstellingen welke gebruikt worden voor de profylaxis en/of behandeling van kanker.

Tot de familie van de Brassicaceae behoort een groot 15 aantal belangrijke tuinbouwgewassen zoals bijvoorbeeld bloemkool (Brassica oleracea convar. botrvtis var. botrvtis); romanesco (Brassica oleracea convar. botrvtis var. botrvtis); broccoli (Brassica oleracea convar. botrvtis var. cvmosa); spruitbroccoli (Brassica oleracea convar.

20 botrvtis var. asparacroides); spruitkool (Brassica oleracea convar. oleracea var. oemmifera); witte kool (Brassica oleracea convar. capitata var. alba); spitskool (Brassica oleracea convar. capitata var. alba); rode kool (Brassica oleracea convar. capitata var. rubra); savooiekool (Brassica 25 oleracea convar. capitata var. sabauda); koolrabi (Brassica oleracea convar. acephala var. aonavloides); boerenkool (Brassica oleracea convar. acephala var. sabellica); en Portugese kool (Brassica oleracea var. tronchuda syn. costata).

30 De familie van de Brassicaceae wordt gekenmerkt door de aanwezigheid van typerende secundaire metabolieten welke een rol spelen bij de geur, de smaak, de voedingswaarde en de resistentie tegen pathogenen.

1023179 2

Tot deze metabolieten behoren de wateroplosbare chemische verbindingen welke worden aangeduid met de algemene term glucosinolaten. Glucosinolaten kunnen worden onderscheiden in de alifatische glucosinolaten (afgeleid van 5 het aminozuur methionine), de indolylglucosinolaten (afgeleid van isoleucine of threonine) en de aromatische glucosinolaten (afgeleid van fenylalanine).

De algemene chemische structuur van glucosinolaten wordt schematisch weergeven door de volgende chemische 10 formule: R—C—S—glucose N-0S03" 15

Formule 1: algemene chemische structuur van glucosinolaten waarbij R methionine, isoleucine, threonine, of fenylalanine is, optioneel gemodificeerd of verlengd.

20 De syntheseroute van glucosinolaten in planten is volledig opgehelderd. Een belangrijke rol in de synthese van glucosinolaten speelt het enzym elongase, dat gecodeerd wordt door het gen BoGSL-ELONG. Dit enzym katalyseert de stapsgewijze ketenverlenging van de glucosinolaten. Een 25 voorbeeld van de in vivo synthese van alifatische glucosinolaten wordt beschreven in figuur 1.

Figuur 1 toont dat het aminozuur methionine omgezet wordt in homomethionine. Met de verbinding homomethionine als uitgangspunt zijn diverse syntheseroutes mogelijk.

30 Rechtstreekse aldoxime vorming leidt bijvoorbeeld tot glucosinolaten met een zij keten van 3 koolstofatomen. Indien elongase voorafgaand aan de aldoxime reactie één of twee “S /*A Λ - 3 extra verlengingen van de methionine katalyseert ontstaan er glucosinolaten met zij ketens van respectievelijk 4 of 5 koolstofatomen. De enzymen betrokken bij de synthese van de glucosinolaten zijn in figuur 1 weergeven als nummers welke 5 verder worden aangeduid beneden de figuur.

Door als uitgangspunt verschillende aminozuren te gebruiken in combinatie met diverse ketenverlengingen en zij keten modificerende stappen kunnen er een groot aantal verschillende glucosinolaten worden verschaft zoals 10 bijvoorbeeld: glucoiberine (3-methylsulfinylpropylglucosinolaat (3MSPG)), progoitrine, sinigrine, glucorafanine (4-methylsulfinylbutylglucosinolaat (4MSBG)), progoitrine, 4-hydroxybrassicine, glucobrassicine, 4-methoxyglucobrassicine en neoglucobrassicine.

15 Bij digestie van de planten van de familie van de

Brassicaceae door mens en dier worden de glucosinolaten in het maag-darm kanaal hydrolytisch afgebroken door het enzym myrosinase (mede uitgescheiden door de darmflora) tot een veelvoud van verbindingen zoals bijvoorbeeld nitrilen, 20 isothiocyanaten, indolen, aminen, en thiocyanaten welke vervolgens worden opgenomen in het lichaam.

Van een aantal van deze afbraakproducten, en met name van de indolen, de isothiocyanaten en de thiocyanaten, is bekend dat zij gezondheidsbevorderende eigenschappen 25 bezitten en met name anti-carcinogene eigenschappen. In de literatuur is bijvoorbeeld beschreven dat isothiocyanaten de activiteit van fase II enzymen induceren waarvan bekend is dat zij betrokken zijn bij de detoxificatie en uitscheiding van schadelijke verbindingen. Daarnaast is bekend dat de 30 isothiocyanaten een "programmed cell death" kunnen induceren in carcinoma's. Ook is bekend uit de literatuur dat verhoogde concentraties van indolen en thiocyanaten in consumptiegewassen gecorreleerd zijn met een verlaagde kans • .' 3 1 7 7 H tot het ontwikkelen van onder andere darmkanker. Vanwege het gezondheidsbevorderende karakter heeft het gehalte en de soort glucosinolaten in Brassica gewassen al langere tijd de I aandacht.

I 5 Van twee glucosinolaten is met name bekend dat zij, H en met name hun afbraakproducten, sterke anti-carcinogene I eigenschappen bezitten. Deze glucosinolaten worden in het algemeen aangeduid als glucoiberine (3-methylsulfinylpropylglucosinolaat (3MSPG)) en I 10 glucorafanine (4-methylsulfinylbutylglucosinolaat (4MSBG)).

In de tot nu toe bekende literatuur zijn voorbeelden I beschreven waarin getracht wordt de gehaltes aan glucosinolaten en met name glucoiberine ( I 3-methylsulfinylpropylglucosinolaat (3MSPG)) en I 15 glucorafanine (4-methylsulfinylbutylglucosinolaat (4MSBG)) I te verhogen.

H In het Amerikaanse octrooischrift ÜS 6.340.784 wordt I bijvoorbeeld beschreven het gebruik van het verhoogde I gehalte glucoiberine (3-methylsulfinylpropylglucosinolaat I 20 (3MSPG)) en glucorafanine (4- I methylsulfinylbutylglucosinolaat (4MSBG)) waargenomen in de niet-gecultiveerde "wilde" Brassica variëteiten Brassica I villosa en B. dreoanensis. In dit octrooischrift wordt I getracht om deze eigenschappen door middel van kruisingen te I 25 introduceren in de gecultiveerde "eetbare" Brassica variëteiten.

I Echter het gebruik van deze niet-gecultiveerde I "wilde" Brassica variëteiten heeft de volgende belangrijke I nadelen: I 30 1) Door het gebruik van niet-gecultiveerde I "wilde" variëteiten kunnen ook niet-gewenste soorten glucosinolaten worden ingebracht in I de uiteindelijk verkregen voedingsgewassen.

5

Hierbij kan het bijvoorbeeld gaan om smaakbepalende glucosinolaten, glucosinolaten , met een sterke anti-nutritieve eigenschap, toxische glucosinolaten, enzovoort.

5 2) Naast de introductie van ongewenste glucosinolaten via de niet-gecultiveerde "wilde" Brassica variëteiten in de gecultiveerde "eetbare" Brassica variëteiten kunnen ook andere niet met glucosinolaten 10 geassocieerde en meestal niet bekende eigenschappen worden geïntroduceerd zoals bijvoorbeeld toxinen, verhoogde ontvankelijkheid voor pathogenen, verminderde vruchtbaarheid, een verlaagde opbrengst aan 15 eetbare delen enzovoort.

3) Het gebruik van Brassica villosa en B. dreoanensis vereist door de relatief grote genetische afstand ten opzichte van de cultuurvariëteiten een zeer langdurig (veelal 20 jaren of zelf decennia) en dus uitermate kostbaar programma van (terug-)kruisingen, selecties, en analyses voor het opnieuw verkrijgen van cultuurwaarde van een Brassica gewas.

25 4) De niet-gecultiveerde "wilde" variëteiten bezitten vaak voor de consument onaantrekkelijke morfologische kenmerken zoals bijvoorbeeld een behaard blad, een onaantrekkelijke kleur, afwijkende niet 30 herkenbare eetbare plantdelen, enzovoort.

In het kader van de introductie van ongewenste eigenschappen uit niet-gecultiveerde "wilde" Brassica variëteiten in gecultiveerde "eetbare" variëteiten is het 1 023179 6 interessant om te wijzen op de praktijk van de Brassica napus veredeling waar een verlaging van bepaalde schadelijke glucosinolaten een doel op zich is met betrekking tot het verkrijgen van cultuurgewassen.

5 Dit geldt het sterkst voor gewassen die bedoeld zijn als veevoeder. Indien grote hoeveelheden van dergelijke schadelijke glucosinolaten opgenomen worden in het dier treden er schadelijke bijwerkingen op zoals bijvoorbeeld in de schildklier. Accumulatie van glucosinolaten in de 10 schildklier interfereert met de synthese van het schildklierhormoon. Daarnaast remmen de thiocyanaten de opname van jodium verbindingen door de schildklier.

Het is daarom een doel van de onderhavige uitvinding gecultiveerde "eetbare" planten te verschaffen welke behoren 15 tot de familie van de Brassicaceae met hoge gehaltes aan anti-carcinogene glucosinolaten zonder de hierboven beschreven nadelen.

Dit doel wordt volgens de uitvinding bereikt met de Brassica planten welke worden verschaft door de werkwijze 20 zoals beschreven is in conclusie 1. Conclusie 1 beschrijft een werkwijze, welke omvat: a) het verschaffen van een Brassica oleracea plant met een verhoogde hoeveelheid anti-carcinogene glucosinolaten in de eetbare delen van de 25 Brassica oleracea plant; b) het gebruik van de onder a) verschafte Brassica oleracea plant als uitgangsmateriaal voor de veredeling van Brassica variëteiten met hoge gehaltes aan anti-carcinogene glucosinolaten.

30 Van planten welke behoren tot de Brassica oleracea groep is bekend dat zij veilig zijn voor de consumptie ("safe use") door mens en dier. Dit betekent in de praktijk dat algemeen wordt aangenomen dat deze planten geen voor 7 mens en dier schadelijke verbindingen bevatten. Door het gebruik gedurende vele eeuwen van deze plantengroep is ook bekend dat zij zelfs bij langdurige consumptie (vele decennia) nog steeds geen schadelijke bijwerkingen 5 veroorzaken. Hierdoor wordt de kans op de introductie van niet gewenste eigenschappen zoals bijvoorbeeld andere schadelijke of ongewenste glucosinolaten of toxinen tot een minimum beperkt en zelfs waarschijnlijk tot nul gereduceerd..

Veel groentegewassen welke behoren tot de 10 Brassicaceae familie behoren tot de Brassica oleracea groep. Door de relatief kleine of zelfs bijna geheel afwezige genetische afstand van de verschafte Brassica oleracea plant volgens de onderhavige uitvinding ten opzichte van de verkregen gecultiveerde "eetbare" Brassica oleracea planten 15 met hoge gehaltes aan anti-carcinogene glucosinolaten kunnen deze laatste eenvoudig worden verkregen volgens stap b) waarbij via kruisingen genetisch materiaal wordt uitgewisseld.

Ook levert het gebruik van een plant behorende tot de 20 Brassica oleracea groep geen door de consument als onaangenaam ervaren "eetbare" planten of plantdelen op.

Het verschaffen van een Brassica oleracea plant met een verhoogde hoeveelheid anti-carcinogene glucosinolaten in de eetbare delen kan op vele manieren geschieden.

25 Een dergelijke plant kan bijvoorbeeld worden verschaft door gebruik te maken van moleculaire markers (hybridisatie, "restriction fragment length polymorphism" (RFLP), PCR) en in het bijzonder door gebruik te maken van moleculaire markers welke geassocieerd zijn met genen welke 30 coderen voor enzymen welke betrokken zijn bij de synthese van glucosinolaten met een anti-carcinogene werking. Dergelijke enzymen zijn bekend aan de gemiddeld geschoolde 1 { i ' ' . ' i V ·...· H vakman omdat de syntheseroute van glucosinolaten geheel is opgehelderd (zie ook figuur 1).

Een andere mogelijkheid voor het verschaffen van een

Brassica oleracea plant volgens de onderhavige uitvinding is I 5 een analyse van de expressieniveau's van genen en met name van die genen welke coderen voor enzymen welke betrokken zijn bij de synthese van glucosinolaten. Een verlaagde of I verhoogde expressie van een specifiek gen kan indicatief I zijn voor de verhoogde concentratie van glucosinolaten met I 10 een anti-carcinogene werking. Er zijn vele werkwijzen I beschikbaar in het vakgebied, zoals bijvoorbeeld "real-time I PCR", "Northern Blot analyse", "quantitative PCR" enzovoort, I welke allen behoren tot de praktische vaardigheden en de I kennis van een gemiddeld geschoolde vakman.

I 15 Het is ook mogelijk om een Brassica oleracea plant I volgens a) te verschaffen door middel van een biochemische I bepaling van de concentratie anti-carcinogene glucosinolaten. Een voorbeeld van een dergelijke biochemische bepaling is "High Performance Liquid I 20 Chromatography" kortweg aangeduid als HPLC. De concentratie I en de aard van de glucosinolaten aanwezig in een specifieke

Brassica oleracea plant kunnen eenvoudig bepaald worden met I behulp van het chromatogram welke de gedetecteerde gegevens I van de HPLC grafisch weergeeft. Andere biochemische I 25 werkwijzen zijn bijvoorbeeld kleuring van specifieke I glucosinolaten, immunologische werkwijzen welke specifieke glucosinolaten zichtbaar maken in weefselmonsters, massaspectrometrie, NMR, infraroodabsorptie analyse I enzovoort.

30 Een Brassica oleracea plant volgens de onderhavige I uitvinding kan ook worden verschaft door gebruik te maken I van moderne moleculair biologische werkwijzen. Deze I werkwijzen kunnen bijvoorbeeld gebruikt worden voor de in 9 vivo beïnvloeding van de expressie van genen welke coderen voor enzymen welke betrokken zijn bij de biosynthese van glucosinolaten. Voorbeelden van dergelijke werkwijzen zijn "knock-out", "knock-in", "RNA silencing", "anti-sense" mRNA 5 enzovoort.

Na het verschaffen van de Brassica oleracea plant met een verhoogde hoeveelheid anti-carcinogene glucosinolaten kan deze gebruikt worden voor het introduceren van deze eigenschap in planten welke behoren tot de familie van de 10 Brassicaceae. Mogelijke veredelingswerkwijzen zijn bijvoorbeeld kruisingen, antherencultuur, microsporencultuur, protoplastenfusie, en genetische modificatie, deze zijn algemeen bekend in het vakgebied zodat de gemiddelde geschoolde vakman eenvoudig een keuze 15 kan maken met betrekking tot de meest efficiënte werkwijze.

Volgens één uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding zijn de glucosinolaten met een anti-carcinogene werking de glucosinolaten glucoiberine (3-methylsulfinylpropylglucosinolaat (3MSPG)) en/of 20 glucorafanine (4-methylsulfinylbutylglucosinolaat (4MSBG)). Deze glucosinolaten bezitten een zeer krachtige anti-carcinogene werking en zijn dus met name geschikt om gebruikt te worden volgens de onderhavige uitvinding.

Voor het verhogen van de kans tot het verschaffen van 25 een plant behorende tot de Brassicaceae familie met hoge gehaltes aan anti-carcinogene glucosinolaten is de hoeveelheid glucoiberine (3- methylsulfinylpropylglucosinolaat (3MSPG)) per 100 gram versgewicht eetbaar deel bij voorkeur hoger dan 100 30 micromol, meer de voorkeur geniet hoger dan 280 micromol, en meest de voorkeur geniet hoger dan 390 micromol. Immers, er bestaat altijd een kans dat tijdens de hierboven genoemde 1023179 H stap b) een deel van de oorspronkelijk verschafte hoge gehaltes aan anti-carcinogene glucosinolaten wordt verloren.

Dit geldt ook met betrekking tot glucorafanine I (methylsulfinylbutylglucosinolaat (4MSBG)). Volgens de I 5 onderhavige uitvinding is de hoeveelheid glucorafanine I (4-methylsulfinylbutylglucosinolaat (4MSBG)) per 100 gram versgewicht eetbaar deel bij voorkeur hoger dan 50 micromol, meer de voorkeur geniet hoger dan 120 micromol, en meest de voorkeur geniet hoger dan 140 micromol.

I 10 Een aantal Brassica oleracea rassen zijn met name I geschikt om gebruikt te worden in de werkwijze volgens de onderhavige uitvinding. Dit zijn de savooiekool (Brassica oleracea convar. capitata var. sabauda). de broccoli ((Brassica oleracea convar. botrvtis var. cvmosa), en de I 15 spruitbroccoli (Brassica oleracea convar. botrvtis var.

asparaaoides) van deze rassen is bijzonder geschikt I spruitbroccoli (Brassica oleracea convar. botrvtis var.

asparaaoides).

De consument heeft een voorkeur voor de consumptie I 20 van verse groenten. Hierdoor verschaft het gebruik I spruitbroccoli een voorkeur omdat dit ras een zeer goede koude tolerantie bezit waardoor het ras gedurende het gehele I jaar gekweekt kan worden. Hierdoor wordt verschaft een constante (gedurende het hele jaar) aanvoer van verse I 25 groenten. Bovendien geniet voor de consument spuitbroccoli I de voorkeur door zijn bekende morfologie.

I Specifiek de voorkeur genieten de respectievelijke I variëteiten van de rassen Wirosa (savooiekool, bijlage 1), I Belstar (broccoli, bijlage 2), Coronado (broccoli, bijlage I 30 3) en Bordeaux (spruitbroccoli, bijlage 4). Deze rassen I worden gekarakteriseerd volgens de bijbehorende I beschrijvingen van deze variëteiten volgens artikel 11, 11 paragraaf 2 van de vegetatieve zaad richtlijn van de Europese Gemeenschap (70/458/CEE).

De werkwijze volgens de onderhavige uitvinding is met name geschikt voor het verschaffen van planten welke behoren 5 tot de Brassicaceae familie welke planten worden gekozen uit de groep welke bestaat uit bloemkool (Brassica oleracea convar. botrvtis var. botrytis); romanesco (Brassica oleracea convar. botrvtis var. botrvtis); broccoli (Brassica oleracea convar. botrvtis var. cvmosa); spruitbroccoli 10 (Brassica oleracea convar. botrvtis var. asparaaoides); spruitkool (Brassica oleracea convar. oleracea var. qemmifera); witte kool (Brassica oleracea convar. capitata var. alba); spitskool (Brassica oleracea convar. capitata var. alba); rode kool (Brassica oleracea convar. capitata 15 var. rubra); savooiekool (Brassica oleracea convar. capitata var. sabauda); koolrabi (Brassica oleracea convar. acephala var. aonovloides); boerenkool (Brassica oleracea convar. acephala var. sabellica); en Portugese kool (Brassica oleracea var. tronchuda syn. costata).

20 De Brassica planten welke worden verschaft door de werkwijze volgens de onderhavige uitvinding hebben bijzonder gewenste eigenschappen ten opzichte van planten die bekend zijn uit de stand van de techniek en met name gelet op hun hoge gehaltes aan anti-carcinogene glucosinolaten. De 25 onderhavige uitvinding heeft daarom ook betrekking op planten, zaden en plantdelen welke verkrijgbaar zijn volgens de werkwijze zoals hierboven beschreven is.

Door hun anti-carcinogene eigenschappen zijn de planten volgens de onderhavige uitvinding met name geschikt 30 om gebruikt te worden voor de bereiding van een voedselproduct of farmaceutische samenstelling voor de profylaxis en/of behandeling van kanker. Hierbij kan gedacht worden aan bijvoorbeeld voedselproducten in de vorm van ! v ' . i. . . · l' «fci 12 salades, sap, repen, maaltijden, snacks, enzovoort. Voor farmaceutische samenstellingen kunnen de planten bijvoorbeeld verwerkt worden in tabletten, injecteerbare vloeistoffen, zetpillen, capsules, suspensies, dragers, "sustained release" 5 dragers, enzovoort.

De onderhavige uitvinding zal hierna verder worden toegelicht aan de hand van voorbeelden welke geenszins zijn bedoeld om de uitvinding op enigerlei wijze te beperken en slechts dienen om mogelijke uitvoeringsvormen van de 10 onderhavige uitvinding te illustreren.

VOORBEELDEN

Voorbeeld 1. uitgangsmateriaal: 15 Planten van de verschillende Brassica oleracea genotypen (zie tabel 1) zijn allen op hetzelfde veld opgegroeid en dus onder dezelfde weersomstandigheden en een gelijk voedingsregime. Alle planten ontvingen dezelfde hoeveelheid kunstmatige bemesting (zie tabel 2). In totaal 20 werden 41 verschillende Brassica oleracea genotypen gebruikt.

13 TABEL 1. Gebruikte Brassica oleracea genotypen

Zaaidatum Plantdatum Monstemame witte kool 5 Almanac 20 maart 13 mei 23 oktober

Krautman 20 maart 13 mei 23 oktober

Mentor 20 maart 13 mei 23 oktober

Mandy 20 maart 13 mei 23 oktober

Lennox 20 maart 14 mei 23 oktober 10 Deense 11-2 20 maart 14 mei 23 oktober rode kool

Integro 1 mei 4 juni 2 oktober

Azurro 13 maart 13 mei 23 oktober

Huzaro 14 maart 13 mei 23 oktober 15 Buscaro 13 maart 13 mei 23 oktober

Pesaro 13 maart 13 mei 23 oktober

Spitskool

Bejo 2574 14 juni 15 juli 2 oktober

Bejo 2575 28 juni 29 juli 2 oktober 20 Capricorn 14 juni 15 juli 2 oktober koolrabi

Kolibri 12 juli 13 augustus 8 oktober

Korist 12 juli 13 augustus 8 oktober broccoli 25 Lucky 21 juni 25 juli 2 oktober

Alborada 21 juni 25 juli 2 oktober

Belstar 21 juni 25 juli 2 oktober

Surveyor 21 juni 25 juli 2 oktober

Coronado 21 juni 25 juli 8 oktober 30 Bordeaux 14 juni 16 juli 14 november bloemkool

Jerez 7 juni 9 juli 2 oktober

Cassius 7 juni 9 juli 2 oktober

Encanto 7 juni 9 juli 2 oktober 35 Skywalker 31 mei 4 juli 2 oktober

Panther 7 juni 8 juli 2 oktober 1023179 H Zaaidatum Plan tda turn Mons terriame romanesco I Bejo 1955 7 juni 8 juli 2 oktober I Veronica 7 juni 8 juli 2 oktober

Amfora 7 juni 8 juli 2 oktober 5 boerenkool

Ripbor 17 mei 13 juni 23 oktober I Redbor 17 mei 13 juni 23 oktober spruitkool I Franklin 1 maart 24 april 8 oktober I 10 Nautic 1 maart 24 april 23 oktober I Maximus 1 maart 24 april 23 oktober

Glenroy 1 maart 24 april 23 oktober

Doric 1 maart 24 april 23 oktober

Dominator 1 maart 24 april 14 november 15 Revenge 1 maart 24 april 14 november savooiekool I Ovasa 3 mei 5 juni 2 oktober I Wirosa 3 mei 5 juni 2 oktober 20 TABEL 2. bemestinggegevens I Op 21 maart 2002 is een stikstofmonstér genomen; het perceel I waar de Brassica planten geplant zijn heeft een eigen I voorraad van 70 kg zuivere stikstof.

25 Element Zuivere meststof Kunstmestsoort Hoeveelheid I magnesium 25 kg/ha kieseriet 100 kg/ha I fosfaat 300 kg/ha tripelsuperfosfaat 700 kg/ha I kalium 300 kg/ha patentkali 1000 kg/ha stikstof 200 kg/ha kalkammonsalpeter 500 kg/ha I 30

Voorbeeld 2. bemonstering I Van iedere opgegroeide variëteit volgens tabel 1 I werden van 5 verschillende planten of plantendelen (blad, spruiten, bloemkroon) geoogst. Hierbij is vermeden de planten I 35 van de buitenste rij te nemen om randeffecten te vermijden.

15

Van de witte kool variëteiten werden 3 hele kolen geoogst. Van iedere kool werden twee tegenover elkaar gelegen gedeeltes genomen, elk ter grootte van 1/8 deel van de kool. Bij de broccoli variëteiten werden van de verschillende 5 planten 3 roosjes uit het midden en de rand gesneden. Bij spruiten zijn telkens twee tegenoverliggende kwarten als monster genomen.

De monsters werden vervolgens met behulp van vloeibare stikstof ingevroren en tot poeder vermalen. Dit 10 poeder werd opgeslagen bij -20° C voor verdere bewerking en analyse.

Voorbeeld 3. Extractie van crlucosinolaten.

5 gram poeder van het poeder verkregen in voorbeeld 2 15 werd afgewogen en overgebracht in 50 ml centrifugebuizen en deze werden in een waterbad verwarmd tot 75°C. Hierna werd aan de buizen toegevoegd 12 ml kokende methanol (100%) en de suspensie werd gemengd. Daarnaast werd onmiddellijk toegevoegd 1.0 ml 3mM glucotropaeoline als interne standaard. 20 Het monster werd geëxtraheerd gedurende minimaal 20 minuten in een waterbad van 75°C en regelmatig geschud.

Hierna werden de vaste delen gepelleteerd door middel van centrifugatie (10 minuten, 5000x g) bij kamertemperatuur en het supernatant werd overgebrachte naar een schone centrifuge 25 buis. De hierboven extractie werkwijze werd nog tweemaal uitgevoerd op het verkregen supernatant met telkens een 10 ml kokende oplossing van methanol (70%). Het verkregen extract werd opgeslagen bij -20°C.

30 Voorbeeld 4. Desulfateren van olucosinolaten 10 gram DEAE Sephadex A-25 poeder werd afgewogen en hieraan werd toegevoegd 80 ml 2M azijnzuur waarna de suspensie overnacht werd weggezet zonder roering bij -'* : / Θ 16 kamertemperatuur. Het volume van de suspensie werd hierna verdubbeld door de toevoeging van 2 M azijnzuur. Een 2 ml injectiespuit werd aan de onderkant afgesloten met een prop van glaswol. Hierin werd voorzichtig de DEAE Sephadex 5 suspensie gebracht totdat er een kolom van circa 1,5 ml was gevormd. De gevulde injectiespuit werd vervolgens overgebracht in een 10 ml reageerbuis. De kolom werd hierin tweemaal gewassen met 1 ml water.

Op de verkregen kolom werd doorgevoerd circa 2 ml van 10 het supernatant verkregen volgens voorbeeld 3. Vervolgens werd de kolom tweemaal gewassen met 1 ml 20 mM NaAc-oplossing (pH 4.0). De kolom werd overgebracht in een schone buis en 75 μΐ verse sulfatase oplossing (25 mg Sulfatase type H-l (Sigma S-9626)/ml bidest) werd doorgevoerd door de kolom. Men 15 liet dit enzym gedurende een nacht inwerken bij kamertemperatuur. Vervolgens werden de gedesulfateerde glucosinolaten geëlueerd met 3 x 0,5 ml bidest en de gecombineerde fracties werden gefiltreerd over een 0,45 μια filter (13mm, Alltech) 20

Voorbeeld 5. HPLC analyse

Voor High Performance Liquid Chromatography (HPLC) analyse werd gebruik gemaakt van apparatuur welke de mogelijkheid heeft voor een gradiënt-elutie. Gekoppeld aan 25 dit apparaat is een ÜV-detector met een gebruikte golflengte van 229 nm. Als voorkolom werd gebruikt een Alltech Optiguard® 1 mm reversed phase C18 reversed phase kolom. Als scheidingskolom werd gebruikt een Novapak C18 kolom.

De gebruikte eluentia voor de kolom waren als volgt 30 samengesteld: 1) Eluent A: 0,05% Tetramethylammoniumchloride (Merck).

17 2) Eluent B: 0,05% Tetramethylammoniumchloride in H20/Acetonitril (80/20 v/v).

Het injectievolume was 20 μΐ en de totale doorstroomsnelheid werd constant gehouden op 1,0 ml/min. Het gradiëntprofiel 5 waarmee de eluentia door de kolom passeerden was als volgt:

Tijd (min)__Eluent A (%)__Eluent B (%) 0 100 0 1 100 0 10 21 0 100 26 100 0 _31__100__0_

Na passeren van het eluent door de kolom werd de E229 gemeten 15 met behulp van een ÜV detector.

Voorbeeld 6. gebruikte referentiemonsters

Voor interne referentie werden de volgende interne standaarden gebruikt.

20 a) Glucotropaeoline (KLV, Denemarken) b) Sinigrine c) Gluconasturtiin d) Spruit (Cyrus) e) Koolzaad (Colza; BCR referentiemonster; No. 367R) 25

Voorbeeld 7. bepaling van het olucosinolaatgehalte

De bepaling van het gehalte aan glucosinolaten (GLS) werd uitgevoerd ten opzichte van de interne standaard (IS) en wordt uitgedrukt in micromol/100 gram vers gewicht. De 30 relatieve respons factor (RRF) ten opzichte van glucotropaeoline van de gemeten stoffen werd bepaald. Deze gegevens worden samengevat in tabel 3. Hierna werd de concentratie glucosinolaten in elk monster bepaald waarbij 1023179 18 gecorrigeerd werd met de gevonden relatieve responsfactor. De resultaten worden weergegeven in Tabel 4.

TABEL 3 De relatieve responsfactoren ten opzichte van 5 glucotropaeoline

DESULPOGLUCOSINOLAAT GLUCOTROPAEOLINE

glucoiberin 1,126 progoitrin 1,147 10 sinigrin 1,053 glucoalyssin 1,13 glucoraphanin 1,126 gluconapoleiferin 1,00 gluconapin 1,168 15 4-hydroxyglucobrassicin 0,295 glucotropaeolin glucobrassicin 0,526 glucosturtiin 1,00 4-methoxyglucobrassicin 0,26 20 neoglucobrassicin 0,21 TABEL 4 Gemeten glucosinolaten gehaltes in geteste Brassica oleracea genotypen.

25 Alle waarden zijn in duplo gemeten en uitgedrukt als micromol glucosinolaten per 100 gram vers gewicht. In de literatuur wordt het glucosinolaten gehalte vaak weergegeven als micromol/gram drooggewicht. De gemeten waarden en de waarden gevonden in de literatuur, kunnen tot elkaar herleid worden 30 met de volgende omrekenfactor: kool heeft een droge stof gehalte van 7-15%; gemiddeld 10%. 100 gram versgewicht komt dus (gemiddeld) overeen met 10 gram drooggewicht; de waarden in de tabel moet dus door 10 gedeeld om met literatuurwaarden te vergelijken.

35 19 glucoiberine 3MSPG glucorafanine 4MSBG overige totaal (3MSPG) (%) (4MSBG) (%) glucosino- glucosino- laten laten

Witte kool

Almanac 24,8 19,5% 18,9 14,9% 83,2 126,9

Krautman 67,7 39,2% 1,9 1,1% 102,9 172,5 5 Mentor 57,6 23, 9% 3,1 1,3% 180,3 241,0

Mandy 100,0 42,9% 28,3 12,1% 105,0 233,3

Lennox 109,0 53,7% 18,8 9,3% 75,3 203,1

Deense 11-2 60,7 31,5% 3,8 2,0% 127,9 192,4

Rode kool 10 Integro 19,3 12,5% 33,9 22,0% 100,6 153,8

Azurro 13,8 14,8% 7,2 7,7% 72,0 93,0

Huzaro 13,1 7,7% 61,8 36,4% 94,9 169,8

Buscaro 36,4 15,1% 38,9 16,2% 165,0 240,3

Pesaro 31,2 14,6% 43,5 20,4% 138,9 213,6 15 Spitskool

Bejo 2574 28,1 20, 6% 0,7 0,5% 107,9 136,7

Bejo 2575 72,0 43,6% 9,2 5,6% 84,1 165,3

Capricorn 31,2 36,8% 5,0 5,9% 48,6 84,8

Koolrabi 20 Kolibri 12,8 23,3% 28,8 52,4% 13,4 55,0

Korist 6, 4 46,0% 0,0 0,0% 7,5 13,9

Broccoli

Lucky 20,6 21,3% 35,8 37,0% 40,4 96,8 25 Alborada 2578 18,1% 6970 48,4% 47,7 142,5

Belstar 26,1 11,2% 129,7 55,5% 77,9 233,7

Surveyor 26,1 18,8% 57,8 41,7% 54,7 138,6

Coronado 52,1 19,7% 140,7 53,1% 72,1 264,9

Bordeaux 395,6 74,2% 26,7 5,0% 110,9 533,2 3 0 Bloemkool

Jerez 16, 8 36,5% 2,8 6,1% 26,4 46,0

Cassius 7, 6 24,4% 0,7 2,3% 22,8 31,1

Encanto 10,5 25,2% 0,0 0,0% 31,1 41,6

Skywalker 10,2 31,4% 0,0 0,0% 22,3 32,5 35 Panther 34,2 57, 8% 7,9 13,3% 17,1 59,2

Romanesco

Bejo 1955 25,4 54,9% 2,1 4,5% 18,8 46,3

Veronica 15,9 32,9% 12,4 25,6% 20,1 48,4

Amfora 13 24,4% 16,0 30,1% 24,2 53,2 i 0,-:. I v j I 20 H glucoiberine 3MSP6 glucorafanine 4MSBG overige totaal H (3MSPG) (%) (4MSBG) (%) glucosino- glucosino- laten laten H Boerenkool I Ripbor 35 35,0% 1,7 1,7% 63,4 100,1 I Redbor 23,4 14,6% 0,0 0,0% 136,4 159,8

Spruitkool I 5 Franklin 51,1 9,9% 28,9 5,6% 437,3 517,3

Nautic 37 11,5% 41,8 13,0% 243,2 322,0 I Maximus 91,5 31,9% 22,8 8,0% 172,2 286,5 I Glenroy 43,6 12,9% 11,7 3,5% 283,1 338,4 I Doric 38,2 6,7% 26,4 4, 6% 504,1 568,7 I 10 Dominator 83,3 13,3% 9,2 1,5% 532,4 624,9 I Revenge 47,5 9,9% 8,5 1,8% 422,9 478,9

Savooiekool I Ovasa 55 54,3% 0,7 0,7% 45,8 101,5

Wirosa 284,8 59,7% 7,8 1,6% 183,8 476,4 I 15 I Uit tabel 4 blijkt duidelijk het hoge gehalte aan I glucoiberine (3-methylsulfinylpropylglucosinolaat (3MSPG)) in I de Bordeaux (spruitbroccoli), de Lennox (witte kool), de I Mandy (witte kool) en de Wirosa (savooie kool), I 20 respectievelijk 395,6 micromol, 284,8 micromol, 109,0 I micromol, en 100,0 micromol. Een hoog gehalte aan glucorafanine (4-methylsulfinylbutylglucosinolaat (4MSBG)) is I aanwezig in de variëteiten Coronado (broccoli), Belstar I (broccoli), Alborada (broccoli), en Huzaro (rode kool), I 25 respectievelijk 140,7 micromol, 129,7 micromol, 69,0 micromol I en 61,8 micromol.

21

Bijlage I Wirosa

NEDERLAND FORM II

Ministerie van Landbouw, Natuurbeheer en Visserij - Bezuidenhoutseweg 73 · Den Haag SUBJECT: Information according co article 11 par. 2 of the vegetable «eed directive (70/458/CEE):

ADMISSION OF A NEW VARIETY

1. Species: Brassica oleracea L. convar. caplcaca <L.) Alef. var. sabavda DC· - Savooienkool 2. Variety: Uirosa 3. Kaincainer : NL 0 Bejo laden B.V.

4. Dace of admission: 3. Indication of the variety: b 6. Short description of the variety: UPOV richtlijn: TC/48/6 UPOV nr Kennerk Klasse Code Opaerkiagen

Kieaplant: anthocyaan kleuring hypocotyl aanwezig 9 1 Plant: hoogte laag tot gealddeld 4 2 Plant: maxisum diaaeter (incl. cabled) · 3 Plant: lengte uitwendige stronk kort tot geaiddeld 4 4 Plant: houding omblad halfopgericht 5 3 Omblad: grootte - · 6 Omblad: vorm schijf rond 3 tot br.omgekeerd eivoraig 7 Omblad: profiel bovenzijde schijf koavoraig 1 swak 5 Omblad: bobbeling geaiddeld tot sterk 6 fijn 9 Omblad: bobbelgrootte klein 3 10 Oablad: plooiing 11 Oablad: kleur (met waslaag) grijsgroen 3 12 Oablad: klturinttositeit donker 7 14 Omblad: waslaag sterk 7 15 Omblad: golving rand zwak 3 ld Oablad: insnijding bladrand 17 Oablad: ombuiging bladrand

Kool: grootte klein tot geaiddeld 4 18 C Kool: vorm lengtedoorsnede plstrond 2 tot rond 19 Kool: vora basis 20 Kool: lengco kort 3 tot middellang 21 Kool: diaaeter klein tot geaiddeld 4 22 Kool: plaats gtootsto diameter boven midden 1 tot op hec midden 23 Kool: sluiting halfgesloten 2 24 Kool: bobbeling dekbled gemiddeld 3 25 Kool: ombuiging dekblad 24 Kool: kleur dekblad groen 2 27 Kool: intensiteit kleur dekblad lieht tot geaiddeld 4 28 Kool: anthoeyaan op dekblad zwak 3 29 Kool: inwendige kleur 31 Kool: vastheid vast 7 32 Kooi: inwendige structuur 33 Kool: lengte inwendige stronk lang 7 34 C Oogstrijpheid laat 7 3$ Barsten kool na oogstrijpheid - · 3$ fusariua oxysporum f. ep. conglutinans fysio - -

Onderscheidbaarheid: Lijke het «eest op Hiversa, maar heefe een kortere stronk.

een vlakkere bladstand en een vroegere koolvorminc.

7. Der.rmir.Aciar. in trials: Vircsa 1023179 H Bijlage II Bordeaux

I NEDERLAND FORM II

H Ministerie van Landbouw, Natuurbeheer en Visserij - Bezuidenhoutseweg 73 - Den Haag SUBJECT: Information according co article 11 pat. 2 of eho vegetable seed directive (70/458/CEE):

ADMISSION OF A NEW VARIETT

1. Specie»; Brassiea oleracea L. convar. botrytia (L) Alef. var. cynosa Duch.

H - Broccoli H 2. Variety: BeUcar I 3. Maintainor s NL 8 B Bojo 2adan B.V.

H 4, Data of admission: 17/08/2000 3. Indication of the variety: b Η 4. Shore description of tbs variety: UPOV richtlijn: TC/151/3 UPOV nr Kennerk Elataa Code Opaerkingen 1 Plane: aancal «tengels 46n 1 2 Plane: hoogte gemiddeld 3 3 Blad: houding halfopgerlcht 3 4 Blad: iengce geniddeld 3 3 Blad: breedte geniddeld 3

Blad: von· ellipCisch 3 6 Blad: aantal lobben weinig 3 7 Bladsehijf: kleur grijsgroen 2 8 Bladsehijf: kleurintensiteit geniddeld 3

Blad: wallaag ganiddald 3 9 Bladsehijf: anthocyaankleuring afwezig 1 10 Bladsehijf: golving rand zwak 3 H 11 Bladsehijf: tanding rand tear ondiep tot ondiep 2 12 Bladsehijf: bobbeling zwak 3 H Bladsehijf: bobbelgrootce geniddeld toe groot 6 H 13 Bladsteel: aaehoeyaankleuriag afwasig 1 14 Bladsteel: leagea geniddeld $ H 13 Bloemhoofd: longto vertakkingen aan basia korc 3 16 Bloeahoofd: grootte ganiddald 5 H 17 Bloenhoofd: vorm rond 1 tot platrond H 18 C Bloemhoofd: kleur grijsgroen 3 19 Bloemhoofd: kleurintensiteit geniddeld 3 20 Bloemhoofd: anthocyaankleuring afwezig 1 21 Bloemhoofd: intensiteit anthocyaankleuring · .

I 22 Bloemhoofd: bonkigheid fijn tot gemiddeld 4 23 Bloemhoofd: korreligheid fijn tot geniddeld 4 H 24 Bloeahoofd: vastheid vase 7 H 23 Bloeahoofd: braeeettin afwezig 1 26 Plant: secundaire bloemhoofden aanwezig 9 H 27 Plant: nata van secundaire bloemhoofden zeer zwak tot zwak 2 28 Bloem: kleur geel 2 29 Bloem: intensitait geslkleur gemiddeld toe donker 6 30 Oogstrijpheid laat 7 tot geniddeld H 31 Begin bloei gemiddeld tot laat 6

Type eenjarig 1

Ondsracheidbaarheid: Staat op zichzelf. Het ras wordt gekenaerkt door het zwak H gelobde blad» het middelgrijsgroene bloenhoofd nee fijne H tot gemiddelde korreligheid en de tamelijk late oogstrijp~ H 7, Denomination in trials: Bejo 18*8 23

Bijlage III Belstar

NEDERLAND FORM II

Ministerie van Landbouw, Natuurbeheer en Visserij - Bezuidenhoutseweg 73 - Den Haag SUBJECT: Information according co article 11 par. 2 of th· vegecable «etd directive (70/45B/CEE):

ADMISSION OF A HEW VARIETY

1. Spaciaa: Brassica oleraeea L. convar. bocrytis (L) Alef. var· cynosa Doch· - Broccoli 2. Variety: Coronado 3. Maintainor : HL β B Bejo Zaden B-V.

4. Date of admission: 30/04/1997 5. Indication of the variety: b 6. Short description of the variety: UPOV richtlijn: TC/131/3 UPOV nr Kenmerk. KUsse Coda Opmerkingen 1 Plane: aantal ftengels één 1 2 Plant: hoogee gemiddeld 5 3 Blad: houding halfopgerlebt 3 4 Blad: lengte gemiddeld 5 5 Blad: breedee gemiddeld tot breed é

Blad: vorm elliptisch eot breed elliptisch 6 6 Blad: aantal lobben gemiddeld 3 7 Bladsehijf: kleur grijsgroen 2 B Bladsehijf: kleurintenelteie gemiddeld tot donker 6

Blad: vaslaag stark 7 9 Bladsehijf: anthoeyaankleuring afvesig 1 10 Bladsehijf: golving rand seer xvak tot zwak 2 11 Bladsehijf: tending rand ondiep 3 12 Bladsehijf: bobbaling ζ··τ svak tot zvak 2

Bladsehijf: bobbalgrootte geaiddeld 5 13 Bladsteel: anthoeyaankleuring afvesig 1 14 Bladsteel: lengee kort tot gemiddeld 4 13 Bloemhoofd: lengte vertakkingen aan basis kort 3 16 Bloemhoofd: grootte geaiddeld 5 17 Bloemhoofd: vorm rond 1 18 G Bloemhoofd: kleur grijsgroen 3 19 Bloemhoofd: kleurintensiceit gemiddeld tot donker 6 ZO Bloemhoofd: anthoeyaenkleuring afvesig 1 21 Bloemhoofd: intensiteit anthoeyaankleuring 22 Bloemhoofd: bonkigheid gemiddeld $ 23 Bloemhoofd: korreligheid fijn tot gemiddeld 4 24 Bloemhoofd: vastheid gemiddeld 5 23 Bloemhoofd: brecteain afvesig 1 26 Plant: secundairs bloemhoofden afvesig 1 27 Plent: mate van secundaire bloemhoofden 28 Bloem: kleur fed 2 29 Bloem: intensiteit geslkleur licht tot gemiddeld 4 30 Oogstrijpheid reet Uat 9 tot laat 31 Begin bloei fusarium oxysporua f» sp. conglutinans fysio resistent 9 l

Onderseheidbasrheid: Staat op siehself. Hat ras vorde gekenmerkt door het halfopgerichce» seer svak gebobbelde blad mat sterke vaslaag* het ronde* grijsgroene» middelvaste bloemhoofd en de seer late toe late oogstrijpheid.

ï. dencainatlon in trials: Bejo 1744 24

Bijlage IV: Coronado

NEDERLAND FORM II

Ministerie van Landbouw, Natuurbeheer en Visserij · Bezuidenhoutseweg 73 · Den Haag SUBJECT: Information according co arciel· 11 par. 2 of tb· vegetable rood direccive (70/4S8/C££):

ADMISSION OF A NEW VARIETY

1« Species; Brassiea oleraeea L. c onver. botrytis (L) Alef. var. cjaoïa Ducb.

- Broccoli 2· Variety: Bordeaux 3. Maintain*!· : NL Sc H Bejo Zadan B.V./Elao t. Data of adaission: 17/08/2000 3· Indication of the variety: b 6. Short deactiptioo of the variety: VFOV richtlijn: TC/151/3 UPOV nr Kcnnerk KI·#*· Code Opmerkingen 1 Plane: aantal ac«ngala 66a 1 2 Plant: hoogte teer boog 9 3 Blad: houding opgerieht tot halfopgericht 2 4 Blad: lengte geniddeld 5 3 Blad: breedte «mal 3

Blad: vore mal elliptisch 3 6 Blad: aantal lobben zeer veel 9 7 Bladsehijf: kleur blauwgroen 3 8 Bladsehijf: kleurinttnsieaie zeer donker 9

Blad: wetlaag zeer sterk 9 9 Bladsehijf: anthoeyaankleuring afwezig 1 10 Bladsehijf: golving rand geniddeld 5 11 Bladsehijf: tending rand ondiep 3 12 Bladsehijf: bobbeling zeer zwak tot zwak 2

Bladsehijf: bobbelgrootte zeer klein tot klein 2 13 Bladsteel: anthoeyaankleuring aanwezig 9 14 Bladsteel: lengte kort 3 15 Bloenhoofd: lengte vertakkingen ean basis zeer lang 9 16 Bloenhoofd: grootte zeer klein 1 17 Bloenhoofd: von 18 C Bloenhoofd: kleur violet 5 19 Bloenhoofd: kleurintensitelt gemiddeld 5 20 Bloenhoofd: anthoeyaankleuring aanwezig 9 21 Bloenhoofd: intensiteit anthoeyaankleuring ster scerk 9 22 Bloenhoofd: bonklgheid - * 23 Bloenhoofd: korreligheid 24 Bloenhoofd: vastheid seer loa 1 25 Bloenhoofd: braetettin 26 Plane: secundaire bloemhoofden aanwezig 9 27 Plant: nate van secundaire bloemhoofden zeer sterk 9 28 Bloen: kleur $"*1 2 29 Bloen: intensiteit geelkleur 30 Oogstrijpheld zeer laat 9 31 Begin bloei zeer laat 9

Type eenjarig 1

Onderscheidbaarheid: Staat op zichzelf. Ree ras wordt gekemerkt door de zeer hoge plant* het zèer donkerblauvgroene, zeer sterk gelobde, zoalle blad net zeer kleine, paarse bloemhoofdjes (type purple sprouting broccoli).

7. Denomination in trial*: BE 1891

Claims

1. Werkwijze voor het verschaffen van een plant, behorende tot de Brassica familie met hoge gehaltes aan anti- 5 carcinogene glucosinolaten welke werkwijze omvat: a) het verschaffen van een gecultiveerde Brassica oleracea plant met een verhoogd gehalte aan anti-carcinogene glucosinolaten in de eetbare delen van de Brassica oleracea 10 plant; b) het gebruik van de onder a) verschafte Brassica oleracea plant als uitgangsmateriaal voor de veredeling van Brassica variëteiten met hoge gehaltes aan anti-carcinogene 15 glucosinolaten, waarbij de anti-carcinogene glucosinolaten ten minste glucoiberine (3-methylsulfinylpropylglucosinolaat (3MSPG)) en/of glucorafanine (4-methylsulfinylbutylglucosinolaat (4MSBG)) omvatten, en waarbij de hoeveelheid 3MSPG per 100 20 gram versgewicht eetbaar deel hoger is dan 100 micromol en de hoeveelheid 4MSBG per 100 gram versgewicht eetbaar deel hoger is dan 50 micromol.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij de 25 hoeveelheid 3MSPG per 100 gram versgewicht eetbaar deel hoger is dan 280 micromol.

3. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, waarbij de hoeveelheid 3MSPG per 100 gram versgewicht eetbaar deel hoger 30 is dan 390 micromol. 1023179- I 26

4. Werkwijze volgens conclusie 1, 2 of 3, waarbij de I hoeveelheid 3MSPG per 100 gram versgewicht eetbaar deel hoger is dan 790 micromol.

5. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij de I hoeveelheid 4MSBG per 100 gram versgewicht eetbaar deel hoger I is dan 120 micromol.

6. Werkwijze volgens conclusie 5, waarbij de I 10 hoeveelheid 4MSBG per 100 gram versgewicht eetbaar deel hoger I is dan 140 micromol.

7. Werkwijze volgens een van de conclusies 1-6, I waarbij de gecultiveerde Brassica oleracea plant I 15 spruitbroccoli (Brassica oleracea convar. botrvtis var. asparaaoides) is.

8. Werkwijze volgens conclusie 7, waarbij de spruitbroccoli (Brassica oleracea convar. botrvtis var. 20 asparaaoides) variëteit Bordeaux is.

9. Werkwijze volgens een van de conclusies 1-6, waarbij de gecultiveerde Brassica oleracea plant savooiekool I (Brassica oleracea convar. capitata var. sabauda) is. I 25

10. Werkwijze volgens conclusie 9, waarbij de savooiekool (Brassica oleracea convar. capitata var. sabauda) I variëteit Wirosa is. I 30

11. Werkwijze volgens een van de conclusies 1-6, I waarbij de gecultiveerde Brassica oleracea plant broccoli (Brassica oleracea convar. botrvtis var. cvmosa) is.

12. Werkwijze volgens conclusie 11, waarbij de broccoli (Brassica oleracea convar. botrvtis var. cvmosa) variëteit Belstar of Coronado is.

13. Werkwijze volgens conclusies 1-12, waarbij de plant behorende tot de Brassica familie wordt gekozen uit de groep welke bestaat uit bloemkool of romanesco(Brassica oleracea convar. botrvtis var. botrvtis); broccoli (Brassica oleracea convar. botrvtis var. cvmosa); spruitbroccoli 10 (Brassica oleracea convar. botrvtis var. asparaaoides); spruitkool (Brassica oleracea convar. oleracea var. qemmifera); witte kool of spitskool (Brassica oleracea convar. capitata var. alba); rode kool (Brassica oleracea convar. capitata var. rubra); savooiekool (Brassica oleracea 15 convar. capitata var. sabauda); koolrabi (Brassica oleracea convar. acephala var. cronavloides) ; boerenkool (Brassica oleracea convar. acephala var. sabellica); eh Portugese kool (Brassica oleracea var. tronchuda syn. costata).

14. Plant behorende tot de Brassica familie verkrijgbaar volgens de werkwijze van één van de conclusies 1-13.

15. Zaden van een plant behorende tot de Brassica 25 familie verkrijgbaar volgens de werkwijze van één van de conclusies 1-13.

16. Plantdelen van een plant behorende tot de Brassica familie verkrijgbaar volgens de werkwijze van één 30 van de conclusies 1-13. 1023179-

17. Het gebruik van de plant, zaden of plantdelen volgens één van de conclusies 14-16 voor de bereiding van een voedselproduct en/of farmaceutische samenstelling voor de profylaxis en/of behandeling van kanker. 1023179-