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EP3596215A1 - Verfahren zur anreicherung von zellen aus einer probe und der nachfolgenden nukleinsäureisolierung aus diesen zellen - Google Patents

Verfahren zur anreicherung von zellen aus einer probe und der nachfolgenden nukleinsäureisolierung aus diesen zellen

Info

Publication number
EP3596215A1
EP3596215A1 EP18716517.0A EP18716517A EP3596215A1 EP 3596215 A1 EP3596215 A1 EP 3596215A1 EP 18716517 A EP18716517 A EP 18716517A EP 3596215 A1 EP3596215 A1 EP 3596215A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
cells
sample
nucleic acid
nucleic acids
solid phase
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP18716517.0A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Timo Hillebrand
Monique BRENDEL
Kristin WESSEL
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
AJ Innuscreen GmbH
Original Assignee
AJ Innuscreen GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by AJ Innuscreen GmbH filed Critical AJ Innuscreen GmbH
Publication of EP3596215A1 publication Critical patent/EP3596215A1/de
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/28—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties
    • B01J20/28054—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties characterised by their surface properties or porosity

Definitions

  • the invention relates to a novel and highly simplified method which allows to enrich biological cells from a sample and to remove from the sample, then release the nucleic acids contained in the cells and isolate the way that the same means, which was used for the accumulation of cells, is also used for the isolation of nucleic acids.
  • the method can be carried out manually or fully automated. In particular, it simplifies the isolation of nucleic acids from larger sample volumes and in this context also reduces the use of necessary ones
  • nucleic acid-containing starting materials under strongly denaturing and reducing conditions, partially using protein-degrading enzymes, digested and purified the exiting nucleic acid fractions via phenol / chloroform extraction steps and the nucleic acids by means of
  • the "new" methods are based on a method developed and first described by Vogelstein and Gillespie (Proc Natl Acad., USA, 1979, 76, 615-619) for the preparative and analytical purification of DNA fragments from agarose gels combines the dissolution of an agarose containing the DNA band to be isolated in a saturated solution of a chaotropic Salt (NaJ) with a binding of the DNA to glass particles.
  • the DNA fixed to the glass particles is then washed with a washing solution (20 mM Tris HCl [pH 7.2], 200 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50% v / v ethanol) and then removed from the carrier particles.
  • This method has undergone a number of modifications to date and is currently used for different methods of extracting and purifying nucleic acids of various origins (Marko, MA, Chipperfield, R. and Birnboim, HG, 1982, Anal. Biochem. 121, 382-387).
  • kits are based on the well-known principle of binding nucleic acids to mineral carriers in the presence of solutions of different chaotropic salts and use as carrier materials
  • Finely ground glass powder e.g., Glasmilk, BIO 101, La Jolla, CA
  • Diatomaceous earth (Sigma) or silica gel. (Diagen, DE 41 39 664 AI).
  • the method is well suited for isolating nucleic acids from small sample quantities and finds its practical application especially in the field of isolation of viral nucleic acids.
  • nucleic acids to solid support materials, especially mineral support materials based on silicon or even to magnetic or paramagnetic silicate support materials or magnetic or paramagnetic materials that carry functional groups, the same function as silicate materials, to bind, to subsequently wash and to detach the nucleic acids from the substrate again.
  • the materials are as membranes (resp.
  • Binding mediation of the nucleic acids to the carrier materials are both so-called.
  • chaotropic salts as well as so-called.
  • a solution variant for the isolation of DNA from larger amounts of blood (> 200 ⁇ ) based on the fact that the sample is mixed in the usual way with a larger volume of lysis buffer, subsequently adding a binding buffer and the approach, for example by means of a "funnel device" successively via a filter membrane for connecting the
  • Nucleic acid passes. Such commercially available kits allow the use of more than 1 ml samples for the isolation of nucleic acid. However, these processes require a significantly higher proportion of extraction reagents and are expensive to carry out.
  • Viral antigen in urine samples In this case, 1.5 ml of sample can be used.
  • the method uses magnetic beads which are coupled to a protein (ApoH). These beads serve to bind virus antigen from the sample. Incubation of sample with beads is 2h. Thereafter, the beads are separated and washed several times. Subsequently, the lysis of the virus is carried out by means of a lysis buffer. The lysis buffer is then placed on a filter column and the nucleic acid bound in a conventional manner to the filter column, washed and subsequently isolated the viral nucleic acid. This process is again expensive and expensive to work with.
  • cells from a sample bind to a solid phase.
  • This solid phase is provided with a nonspecific capture ligand.
  • This coating consists of carbohydrates or carbohydrate derivatives. Preferably, microorganisms bind.
  • the solid phase is magnetic particles. After binding, the solid phase is removed from the sample and the cells are lysed.
  • Nucleic acids or extraction chemistry used for the isolation of the nucleic acids corresponds exactly to the state of the art.
  • these methods are an improvement, since the particles used for cell binding in a further function also allows the isolation of nucleic acids of the bound and separated cells.
  • the disadvantage is the use of magnetic particles. Since they are all nano- or microparticles, the separation of these particles is difficult and very time-consuming, especially with viscous samples.
  • the present invention solves the problem of the combined accumulation of cells and subsequent isolation of the nucleic acids in a surprisingly simple manner.
  • the invention was based on the following surprising observation.
  • a sample containing cells e.g., a blood sample
  • a plastic material having a rough surface e.g., roughened polypropylene
  • the cells bind to the plastic material.
  • rough surface should be understood to mean that it is not smooth by touching or by viewing the surface, but it may also be a surface having a structure (eg grooves).
  • This structure eliminates the smoothness of the surface, even though the structure, ie, the grooves, itself may be smooth, and according to the invention such surfaces are referred to as "structured surfaces". If, by viewing or touching the surface, it is not possible to detect whether a surface is smooth or rough, a test may be performed by directing a laser beam at that surface. With a smooth surface, the laser is only in
  • the cells After fixation of the cells to the surface, the cells can be removed with the surface of the sample.
  • the object of the invention the isolation of the nucleic acids contained in the fixed cells using the same agent, is achieved by lysing the cells with a lysis buffer and thus releases the nucleic acids.
  • nucleic acids these can also be isolated with the same surface, which was used for the fixation of the cells.
  • the inventive method combines for the first time the adsorption of cells of a sample to a material with a "structured surface" with the
  • the process can be carried out as a “single-tube process” or in the form of an automated “walk-away process”. The used
  • Carrier material with a "structured surface” is inexpensive and, in contrast to used nanoparticles, harmless.
  • the process sequence is simple, extremely fast and extremely efficient and combines according to the invention an accumulation of cells with the subsequent extraction of the nucleic acid.
  • the invention relates to the disclosed methods and means of the publications DE 10 2015 216 558, DE 10 2015 211 394 and DE 10 2015 211 393.
  • the invention is based on the properties described therein, that nucleic acids on rough or
  • the present invention shows that such a material is not only suitable for isolating nucleic acids, but also suitable for binding cells from a sample, thus resulting in the method according to the invention of such a material in one Dual function combined to use.
  • the essence of the invention is thus that cells of a sample to a "Structured surface” adsorb and subsequently the liberated nucleic acids are in an aqueous environment whose polarity is adjusted by organic substances so that the solubility of the nucleic acid is reduced and subsequently precipitated on the "structured surface” and subsequently the precipitated DNA of the "structured” gray surface is replaced again and is available.
  • the precipitated on the rough surface nucleic acid can also be washed and replaced after washing steps.
  • This lysis buffer may contain chaotropic salts or non-chaotropic salts or mixtures of these two groups.
  • this buffer may contain other components such as chelating agents, Tris buffer, wetting and dispersing agents, etc.
  • the method also works with buffers which contain no salts and e.g. consist only of a detergent, Tris and EDTA.
  • proteolytic enzymes can also be used.
  • nucleic acid of the sample precipitates to the same structured one
  • the agent according to the invention can also be in a device for extracting nucleic acids, comprising a hollow body through which a liquid is passed, wherein in this hollow body a material with rough
  • a pipette tip acts as a hollow body
  • the rough or "textured surface” material has a size such that it can not escape from the pipette tip at the bottom can and thus differs from the magnetic particles described in the prior art (WO 01/05510 Al).
  • the used in the pipette tip materials for cell adsorption and subsequent attachment of nucleic acids can be extremely different. It can be used modified plastic materials whose surface is not smooth, but rough or textured. These include so-called composite materials containing blends of polymers and e.g. organic components as well as inorganic components. Essential is only the provision of a roughened or
  • “Structured surface” (no smooth surface) or the transfer of material into the pipette tip, which leads to the formation of a two / three-dimensional network, whereby the nucleic acids then precipitate on this structure.
  • the architecture of the material is also not limiting (round, rectangular , etc.), which can also be multiple materials (eg several granules).
  • a pipette tip can be used, in which (made of a molded injection molded part) that binding material is already and this no longer needs to be spent in the top. Also advantageous is the use of rough or structured material, which additionally has magnetic or paramagnetic properties. Such a material is then also suitable for manual sample processing in which it is added separately to the sample and is not located in a hollow body.
  • the sample with the contained cells is "pipetted" by means of pipetting operations on the material according to the invention introduced into the pipette tip, the cells adsorb onto the material
  • calcium chloride may also be added to the sample containing the cells After cell attachment, the pipette tip is immersed in a cavity containing a lysis buffer and possibly also a proteolytic enzyme, lysis of the cells and release of the nucleic acids. The cells are thus no longer on
  • the conditions necessary for the precipitation of the nucleic acids are set so that the nucleic acid can precipitate on the material that is being dispensed in the pipette tips.
  • the approach is by means of pipetting vertically in the
  • wash buffer may optionally be "pipetted” past the nucleic acid binding material, followed by a drying step (e.g., frequent pipetting up and down) Finally, the eluent is again “pipetted” past the vertically arranged nucleic acid binding material, thereby peeling off the bound nucleic acid.
  • the nucleic acid is now available for necessary downstream application. The process is extremely fast and easy to carry out and allows isolation of nucleic acids in extremely high yield and purity.
  • the present invention in addition to the simplicity of the implementation of another enormous advantage. Contains a biological sample large amounts of cells containing nucleic acids, so by means of the method according to the invention and the
  • Materials of the invention are extracted an extremely large amount of nucleic acids.
  • the method is also ideally suited for the processing of large sample volumes.
  • Example 1 Enrichment of cells from an aqueous solution combined with the subsequent extraction of the nucleic acid contained in the cells using a modified pipette tip and using a commercially available extraction machine
  • the automated extraction was carried out with the InnuPure C16 extraction machine (Analytik Jena AG).
  • the pipette tips were changed so that they correspond to the agent according to the invention.
  • a roughened plastic granulate (4 granules with a diameter of about 2 mm - 4 mm, polypropylene) was loosely placed in the lower third of the pipette tips. The granules do not close the lumen of the pipette tip. This preserves the pipetting function of the pipette tips.
  • the reagents required for the procedure were in a pre-filled deep well plate. In the first well of the deep well plate, the aqueous cell suspension was spent.
  • the pipette tip with the material according to the invention was retracted into the cavity.
  • the cell binding is done by pipetting up and down (100 repetitions).
  • the cells adsorb to the material of the invention contained in the tip.
  • the tip was moved out of the cavity.
  • the cells are located on the material inside the tip.
  • the tip was subsequently retracted into a second well of the deep well plate.
  • This cavity contains a commercially available lysis buffer as well as Proteinase K (Lysis Solution CBV, InnuPREP Blood DNA K PC16, Analytik Jena AG).
  • the lysis of the cells located on the material was carried out by pipetting up and down the lysis buffer (200
  • the cavity was additionally heated. At the end of the process, the released nucleic acid of the cells is in the lysis buffer. The cells are no longer on the material according to the invention.
  • the sample was now drawn into the pipette tip and dispensed into another cavity of the deep well plate. This cavity is prefilled with an alcohol (isopropanol). This solution was then again pipetted up and down by means of the pipette tip. Again, so that the solution flows past the granules (100
  • the tip of the invention and the granules contained in it were dried by pipetting air and thus the residual ethanol removed.
  • the elution of the nucleic acids from the granules was carried out in another well of the deep well plate, in which 200 ⁇ water were contained as eluent.
  • the nucleic acid was removed from the granules by pipetting up and down the water (120
  • the method is extremely simple and fast and shows that commercially available extraction machines for carrying out the method according to the invention in the combination of cell binding and removal of cells from the initial sample and subsequent extraction of the nucleic acid contained in the cells with the corresponding inventive Means can be used.
  • the detection of the isolated nucleic acid was carried out by spectrophotometric measurement and gel electrophoresis.
  • FIG. 1 A gel electrophoretic analysis of the isolated nucleic acid is shown in FIG. 1.
  • Example 2 Enrichment of nucleated cells from different volumes of whole blood samples combined with the subsequent extraction of the nucleic acid contained in the nucleated cells using a modified pipette tip and using a commercially available extraction machine
  • the reagents required for the procedure were in a pre-filled deep well plate. Different amounts of blood (200 ⁇ , 300 ⁇ , 400 ⁇ and 500 ⁇ ) were spilled into the first well of the deep well plate. In each case, 800 ⁇ l of a commercially available erythrocyte lysis buffer (Ery Lysis Solution A, Analytik Jena AG) were used for these blood samples. In addition, 200 ⁇ of a 1 M calcium chloride solution was added.
  • the pipette tip with the material according to the invention was retracted into the cavity.
  • the cell binding is done by pipetting up and down (100 repetitions).
  • the nucleated cells adsorb to the material of the invention contained in the tip.
  • the tip was moved out of the cavity.
  • the cells are located on the material inside the tip.
  • the cells were separated from the actual sample and thus also of inhibitory substances such as hemoglobin. This considerably facilitates the subsequent successful extraction of the nucleic acid.
  • the tip was subsequently inserted into a second well of the deep well. Retracted plate.
  • This cavity contains a commercially available lysis buffer as well as Proteinase K (Lysis Solution CBV, InnuPREP Blood DNA K PC16, Analytik Jena AG).
  • the lysis of the cells located on the material was carried out by pipetting up and down the lysis buffer (200 repeats). The cavity was additionally heated. At the end of the process, the released nucleic acid of the cells is in the lysis buffer. The cells are no longer on the material according to the invention.
  • the sample was now drawn into the tip of the beeper and released into another cavity of the deep well plate. This cavity is prefilled with an alcohol (isopropanol).
  • Wash buffer filled. was washed by pipetting up and down the wash buffer (jeticianl 10 repetitions.
  • the tip of the invention and the material contained in it were dried by pipetting air, thereby removing the residual ethanol.
  • the elution of the nucleic acids from the granules was carried out in another well of the deep well plate, in which 200 ⁇ water were contained as eluent.
  • the nucleic acid was removed from the granules by pipetting up and down the water (120
  • the detection of the isolated nucleic acid was carried out by means of spectrophotometric measurement and gel electrophoresis. It turns out that increasing the amount of blood also increases the yield of nucleic acid. Thus, the method is also excellent for the processing of larger sample volumes.
  • FIG. 2 shows a gel electrophoresis analysis of the isolated nucleic acid.
  • the nucleic acid which has been electrophoretically separated in a 0.8% agarose gel and isolated by means of the method according to the invention is shown. The samples were applied from left to right beginning with sample 1. Lane 9 contains a DNA ladder.
  • Example 3 Enrichment of the nucleated cells from whole blood samples combined with the subsequent extraction of the nucleic acid contained in the nucleated cells using three differently modified pipette tips and using a commercially available extraction machine. The automated extraction was again carried out with the InnuPure C16 extraction machine (Analytik Jena AG).
  • pipette tips were changed so that they correspond to the agent according to the invention.
  • pipette tips were modified as follows:
  • Polypropylene (4 granules with a diameter of approx. 2 mm - 4 mm) filled loosely
  • Polypropylene (5 granules with a diameter of approx. 2 mm - 4 mm) loosely filled 3. Pipette tips in the lower third vertically filled with a spiral plastic polyethylene material of a length of 1, 5 cm (as an example of a structured material).
  • the reagents required for the procedure were in a pre-filled deep well plate.
  • a whole blood sample 500 ⁇ was placed in the first well of the deep well plate.
  • 800 ⁇ of a commercially available erythrocyte lysis buffer (Ery Lysis Solution A, Analytik Jena AG) were transferred to this blood sample.
  • 200 ⁇ of a 1 M calcium chloride solution was added.
  • the pipette tip with the material according to the invention was introduced into the cavity.
  • the cell binding is done by pipetting up and down (100 repetitions).
  • the nucleated cells adsorb to the material of the invention contained in the tip.
  • the tip was moved out of the cavity.
  • the cells are located on the material inside the tip.
  • the cells were separated from the actual sample and thus also of inhibitory substances such as hemoglobin. This considerably facilitates the subsequent successful extraction of the nucleic acid.
  • the tip was subsequently retracted into a second well of the deep well plate.
  • This cavity contains a commercially available lysis buffer as well as Proteinase K (Lysis Solution CBV, InnuPREP Blood DNA K PC16, Analytik Jena AG).
  • the lysis of the cells located on the material was carried out by pipetting up and down the lysis buffer (200 repeats). The cavity was additionally heated. At the end of the process, the released nucleic acid of the cells is in the lysis buffer. The cells are no longer on the material according to the invention. The sample was now in the lysis buffer (200 repeats). The cavity was additionally heated. At the end of the process, the released nucleic acid of the cells is in the lysis buffer. The cells are no longer on the material according to the invention. The sample was now in the
  • the tip of the beeper is drawn up and transferred to another cavity of the deep well plate. This cavity is prefilled with an alcohol (isopropanol).
  • the tip of the invention and the material contained in it were dried by pipetting air, thereby removing the residual ethanol.
  • the elution of the nucleic acids from the granules was carried out in another Deep well plate well containing 200 ⁇ of water as eluent.
  • the nucleic acid was detached from the granules by pipetting up and down the water (120 repetitions).
  • the detection of the isolated nucleic acid was carried out by means of spectrophotometric measurement and gel electrophoresis. It turns out that increasing the amount of blood also increases the yield of nucleic acid. Thus, the method is also excellent for the processing of larger sample volumes.
  • FIG. 3 A gel electrophoretic analysis of the isolated nucleic acid is shown in FIG. 3.

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Abstract

Die Erfindung betrifft die Anreicherung und Isolierung von biologischen Zellen aus einer Probe und / oder die Anreicherung von biologischen Zellen aus einer Probe und der nachfolgenden Nukleinsäureisolierung aus diesen Zellen, wobei die Probe mit einer festen Phase in Kontakt gebracht wird, die eine raue bzw. strukturierte Oberfläche ausweist.

Description

VERFAHREN ZUR ANREICHERUNG VON ZELLEN AUS EINER PROBE UND DER NACHFOLGENDEN NUKLEINSÄUREISOLIERUNG AUS DIESEN ZELLEN
Beschreibung
[0001] Gegenstand der Erfindung ist ein neuartiges und stark vereinfachtes Verfahren, welches es erlaubt, biologische Zellen aus einer Probe anzureichern und aus der Probe zu entfernen, danach die in den Zellen enthaltenen Nukleinsäuren freizusetzen und zu isolieren, der Art, dass dasselbe Mittel, welches für die Anreicherung der Zellen verwendet wurde, auch für die Isolierung der Nukleinsäuren genutzt wird.
[0002] Das Verfahren kann dabei manuell oder vollautomatisiert durchgeführt werden. Es vereinfacht insbesondere die Isolierung von Nukleinsäuren aus größeren Probenvolumen und verringert in diesem Zusammenhang auch den Einsatz von notwendigen
Extraktionsreagenzien.
[0003] Unter klassischen Bedingungen erfolgt die Isolierung von DNA aus Zellen und Geweben dadurch, dass die Nukleinsäuren enthaltenden Ausgangsmaterialien unter stark denaturierenden und reduzierenden Bedingungen, teilweise auch unter Verwendung von proteinabbauenden Enzymen, aufgeschlossen und die austretenden Nukleinsäurefraktionen über Phenol-/ Chloroform- Extraktionsschritte gereinigt und die Nukleinsäuren mittels
Dialyse oder Ethanolpräzipitation aus der wässrigen Phase gewonnen werden (Sambrook, J., Fritsch, E.F. und Maniatis, T., 1989, CSH, "Molecular Cloning" ).
[0004] Diese "klassischen Verfahren" zur Isolierung von Nukleinsäuren aus Zellen und besonders aus Geweben sind sehr zeitaufwendig (teilweise länger als 48 h), erfordern einen erheblichen apparativen Aufwand und sind darüber hinaus auch nicht unter Feldbedingungen realisierbar. Außerdem sind solche Methoden auf Grund der verwendeten Chemikalien wie Phenol und Chloroform in einem nicht geringen Maße gesundheitsgefährdend.
[0005] Die klassische Methodik der Isolierung von Nukleinsäuren wurde in den
zurückliegenden Jahren deutlich verbessert. Die„neuen" Verfahren basieren auf einer von Vogelstein und Gillespie (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1979, 76, 615-619) entwickelten und erstmals beschriebenen Methode zur präparativen und analytischen Reinigung von DNA- Fragmenten aus Agarosegelen. Die Methode kombiniert die Auflösung einer die zu isolierende DNA- Bande enthaltenden Agarose in einer gesättigten Lösung eines chaotropen Salzes (NaJ) mit einer Bindung der DNA an Glaspartikel. Die an die Glaspartikel fixierte DNA wird anschließend mit einer Waschlösung (20 mM Tris HCl [pH 7,2]; 200mM NaCl; 2 mM EDTA; 50% v/v Ethanol) gewaschen und danach von den Trägerpartikeln abgelöst. [0006] Diese Methode erfuhr bis heute eine Reihe von Modifikationen und wird zum gegenwärtigen Zeitpunkt für unterschiedliche Verfahren der Extraktion und Reinigung von Nukleinsäuren unterschiedlichster Herkunft angewendet (Marko, M. A., Chipperfield, R. und Birnboim, H. G., 1982, Anal. Biochem., 121, 382-387).
[0007] Darüber hinaus existieren heute weltweit auch eine Vielzahl von Reagenziensystemen zur Reinigung von DNA- Fragmenten aus Agarosegelen und für die Isolierung von Plasmid- DNA aus bakteriellen Lysaten, aber auch für die Isolierung von längerkettigen Nukleinsäuren (genomische DNA, zelluläre Gesamt- RNA) aus Blut, Geweben oder auch Zellkulturen.
[0008] Alle diese kommerziell verfügbaren Kits basieren auf dem hinlänglich bekannten Prinzip der Bindung von Nukleinsäuren an mineralische Träger unter Anwesenheit von Lösungen unterschiedlicher chaotroper Salze und verwenden als Trägermaterialien
Suspensionen feingemahlener Glaspulver (z.B. Glasmilk , BIO 101, La Jolla, CA),
Diatomenerden (Fa. Sigma) oder auch Silicagele. (Diagen, DE 41 39 664 AI).
[0009] Ein für eine Vielzahl unterschiedlicher Anwendungen praktikables Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren ist in US 5,234,809 (Boom) dargestellt. Dort ist ein Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus nukleinsäurehaltigen Ausgangsmaterialien durch die Inkubation des Ausgangsmaterials mit einem chaotropen Puffer und einer DNA- bindenden festen Phase beschrieben. Die chaotropen Puffer realisieren sowohl die Lyse des
Ausgangsmaterials als auch die Bindung der Nukleinsäuren an die feste Phase. Das Verfahren ist gut geeignet, um Nukleinsäuren aus kleinen Probenmengen zu isolieren und findet speziell im Bereich der Isolierung viraler Nukleinsäuren seine praktische Anwendung.
[0010] Spezifische Modifikationen dieser Verfahren betreffen den Einsatz von neuartigen Trägermaterialien, welche für bestimmte Fragestellungen applikative Vorteile zeigen (WO-A 95/34569). Weitere verbesserte Extraktionsvarianten betreffen den Einsatz von neuartigen Lyse-/ Bindungspuffern.
[0011] Die Patentschriften EP 1135479 offenbart, dass für die Adsorption von Nukleinsäuren an die dem Fachmann bekannten und eingesetzten silikatischen Materialien auch sogenannte antichaotrope Salze als Bestandteil von Lyse-/ Bindungspuffer- Systemen sehr effizient und erfolgreich eingesetzt werden können. Vorteil dieses Verfahrens ist, dass durch die
Umgehung der Verwendung von chaotropen Salzen eine deutlich geringere gesundheitliche Gefährdung von den Extraktionssystemen ausgeht. Allerdings werden für eine effiziente Isolierung von Nukleinsäuren aus einer komplexen biologischen Probe insbesondere in Hinblick auf eine möglichst ausbeutestarke Nukleinsäure- Gewinnung im Lysepuffer wiederum hohe Salzkonzentrationen (> 1.5 M) benötigt. So offenbart die Patentschrift, dass die Verwendung findenden Lysepuffer Salzkonzentrationen zwischen 1 ,5 M - 3 M enthalten. In der Patentschrift DE 4321904 wird ein Verfahren beschrieben, dass bei Kombination von chaotropen Hochsalzpuffern mit alkoholischen Komponenten eine effiziente Isolierung von Nukleinsäuren möglich ist.
[0012] Die Analyse des Standes der Technik verdeutlicht eindrucksvoll, dass eine Vielzahl von Möglichkeiten existiert, Nukleinsäuren an feste Trägermaterialien, insbesondere mineralische Trägermaterialien auf Siliziumbasis oder aber auch an magnetische oder paramagnetische silikatische Trägermaterialien bzw. magnetische oder paramagnetische Materialien, welche funktionale Gruppen tragen, die derselben Funktion wie silikatische Materialien entsprechen, zu binden, nachfolgend zu waschen und die Nukleinsäuren vom Trägermaterial wieder abzulösen. Dabei liegen die Materialien als Membranen (bzw.
Glasfaserfiiese) vor bzw. in Form von Mikro- oder Nanomaterialien. Für die
Bindungsvermittlung der Nukleinsäuren an die Trägermaterialien werden sowohl sog.
chaotrope Salze als auch sog. antichaotrope Salze oder Mischungen aus diesen eingesetzt. Alle diese Verfahren arbeiten dabei unabhängig der für die Anbindung der Nukleinsäuren eingesetzten mineralischen Trägermaterialien nach dem gleichen Prozessablauf:
1. Lyse der Probe
2. Optional Zugabe des für die Anbindung der Nukleinsäure notwendigen Bindungspuffers
3. Inkontaktbringen des Reaktionsansatzes mit einer nukleinsäurebindenden festen Phase (Trägermaterial) und nachfolgende Anbindung der Nukleinsäure an dieses Material)
4. Waschen der am Trägermaterial gebundenen Nukleinsäure
5. Ablösen der gebundenen Nukleinsäure vom Trägermaterial
[0013] Der Stand der Technik offenbart, dass Verfahren für die Isolierung von Nukleinsäuren aus kleinvo lumigen Proben sehr effizient funktionieren. Sollen dagegen große
Probenvolumina bearbeitet werden, dann verlieren diese Verfahren deutlich an Effizienz und werden darüber hinaus auch in ihrer Durchführung zunehmend kompliziert und aufwendig. Dies betrifft vor allem die Isolierung von Nukleinsäuren aus Vollblutproben.
[0014] Eine Lösungsvariante für die Isolierung von DNA aus größeren Blutmengen (> 200 μΐ) basiert darauf, dass man die Probe in gewohnter Weise mit einem größeren Volumen an Lysepuffer versetzt, nachfolgend einen Bindungspuffer zugibt und den Ansatz z.B. mittels einer„Trichtervorrichtung" sukzessive über eine Filtermembran zur Anbindung der
Nukleinsäure leitet. Solche kommerziell erhältlichen Kits erlauben es, Proben von mehr als 1 ml zur Isolierung von Nukleinsäure einzusetzen. Diese Verfahren benötigen aber einen deutlich höheren Anteil an Extraktionsreagenzien und sind aufwendig in der Durchführung.
[0015] Eine weitere weit verbreitete Lösungsvariante für die Isolierung von Nukleinsäuren aus großvolumigen Blutproben basiert darauf, dass man in ersten Verfahrensschritten die Erythrocyten selektiv zerstört und die kernhaltigen Zellen dann mittels Zentrifugation pelletiert. Damit wird das Probenvolumen drastisch reduziert. Weiter gearbeitet wird mit den gewonnenen kernhaltigen Zellen. Nachteilig an einem solchen Verfahren sind die
durchzuführenden Verfahrensschritte der Lyse der Erythrocyten und der Pelletierung der kernhaltigen Zellen. Eine Automatisierung dieser Schritte benötigt eine Zentrifuge. Es ist bekannt, dass die technische Implementierung einer Zentrifuge in einen automatisierten Prozess zur Isolierung von Nukleinsäuren aufwendig und teuer ist.
[0016] Weitere Möglichkeiten zur Bearbeitung größerer Probenvolumina mit dem Ziel der Isolierung von Nukleinsäuren insbesondere aus pathogenen Mikroorganismen basieren auf dem Einsatz sog. immunomagnetischer Verfahren. Diese Verfahren basieren auf dem Einsatz von z.B. magnetischen Beads, welche mit einem Fängermolekül gekoppelt sind (z.B. mit einem targetspezifischen Antikörper). Diese Beads werden mit der biologischen Probe in Kontakt gebracht und für mehrere Stunden inkubiert. Dabei soll das Target spezifisch an den Antikörper binden. Die Beads werden nachfolgend separiert und gewaschen. Dann erfolgt das Ablösen der gebundenen Targets. Im Falle der geplanten Isolierung von Nukleinsäuren aus den gebundenen Analyten lysiert man den gebundenen Analyten und führt nachfolgend eine bekannte Nukleinsäureisolierung durch.
[0017] Diese Verfahren sind aufwendig und extrem teuer, da sie immer auf Verwendung von an magnetische Beads gekoppelte Antikörper basieren. Darüber hinaus sind solche Verfahren auch nicht robust, da die Beads mit den gekoppelten Antikörpern immer gekühlt werden müssen. Ein weiteres diesbezügliches Verfahren findet man im Journal of Virology (Vol. 83, No.10; 2009). Dabei handelt es sich um die immunomagnetische Anreicherung von
Virusantigen in Urinproben. Dabei können 1.5 ml Probe eingesetzt werden. Das Verfahren nutzt magnetische Beads, welche mit einem Protein (ApoH) gekoppelt sind. Diese Beads dienen der Bindung von Virusantigen aus der Probe. Die Inkubation von Probe mit Beads beträgt 2h. Danach werden die Beads separiert und mehrmals gewaschen. Nachfolgend erfolgt die Lyse der Viren mittels eines Lysepuffers. Der Lysepuffer wird dann auf eine Filtersäule gegeben und die Nukleinsäure in an sich bekannter Weise an der Filtersäule gebunden, gewaschen und nachfolgend die virale Nukleinsäure isoliert. Auch dieses Verfahren ist wieder teuer und aufwendig in der Bearbeitung.
[0018] Diese Verfahren zeigen, dass es möglich ist, größere Probenvolumina zu bearbeiten. Es zeigt sich aber auch, dass es sich bei der Anreicherung der Zellen und der Isolierung der Nukleinsäuren aus diesen Zellen um zwei getrennte Verfahrensabläufe handelt und das die Mittel, welche für die Anreicherung der Zellen verwendet werden, nicht für die Isolierung der Nukleinsäuren genommen werden können.
[0019] Die Patentschrift US 7,964,364 offenbart ein anderes Verfahren. Hier wird
beschrieben, dass Zellen aus einer Probe an einer festen Phase binden. Dabei ist diese feste Phase mit einem unspezifischen Fängerliganden versehen. Diese Beschichtung besteht aus Kohlenhydraten bzw. Kohlenhydrat - Derivaten. Vorzugsweise binden Mikroorganismen. Bei der festen Phase handelt es sich um magnetische Partikel. Nach der Bindung wird die feste Phase von der Probe entfernt und die Zellen werden lysiert. Nachfolgend werden
Bedingungen eingestellt, dass die freigesetzte Nukleinsäure an die magnetischen Partikel binden kann. Nach Waschschritten wird die DNA eluiert. Damit dienen die
oberflächenmodifizierten magnetischen Partikel zum einen der Adsorption von Zellen aus einer Probe und nachfolgend zur Isolierung der Nukleinsäure aus den zuvor separierten Zellen. Ähnlich sind auch die in der Patentschrift US 7,776,580 sowie in der
Offenlegungsschrift DE 10 2010 031 401 offenbarten Verfahren und Mittel. Zellen oder zelluläre Komponenten werden an magnetische Partikel gebunden und aus der Probe separiert, die Zellen werden lysiert und die freigesetzte Nukleinsäure wird an dieselben magnetischen Partikel gebunden und nachfolgend isoliert. Die für die Anbindung der
Nukleinsäuren bzw. für die Isolierung der Nukleinsäuren eingesetzte Extraktionschemie entspricht dabei wieder exakt dem Stand der Technik. Damit handelt es sich bei diesen Verfahren um eine Verbesserung, da das für die Zellbindung eingesetzte Partikel in einer weiteren Funktion auch die Isolierung von Nukleinsäuren der gebundenen und separierten Zellen erlaubt. Nachteilig ist aber die Verwendung von magnetischen Partikeln. Da es sich ausnahmslos um Nano- bzw. Mikropartikel handelt, ist die Separation dieser Partikel schwierig und insbesondere bei viskosen Proben sehr zeitaufwändig.
[0020] Damit werden diese Verfahren aufwendig und bedürfen immer einer Hardware- Lösung, die eine magnetische Separation ermöglicht. Darüber hinaus zeigt sich, dass magnetische Mikro- bzw. Nanopartikel eine nur sehr begrenzte Bindungskapazität für Nukleinsäuren besitzen. Zusätzlich müssen die Oberflächen der Partikel oftmals noch chemisch modifiziert werden, was einen Mehraufwand an Zeit und Kosten bedeutet. Ganz wichtig ist ebenfalls zu erwähnen, dass möglicherweise von Nanomaterialien erhebliche gesundheitliche Risiken ausgehen.
[0021] Die vorliegende Erfindung löst die Problemstellung der kombinierten Anreicherung von Zellen und nachfolgender Isolierung der Nukleinsäuren in einer überraschend einfachen Weise.
[0022] Der Erfindung lag folgende überraschende Beobachtung zu Grunde. Wenn man eine Probe, die Zellen enthält (z.B. eine Blutprobe) mit einem Plastikmaterial mit einer rauen Oberfläche (beispielsweise angerautes Polypropylen) in Kontakt bringt, binden die Zellen an das Plastikmaterial. Auf dem Material befinden sich keine Fängerliganden, wie dies aus dem Stand der Technik bekannt ist.
[0023] Der Begriff„raue Oberfläche" ist so zu verstehen, dass durch Berühren oder durch Ansicht der Oberfläche erkennbar ist, dass diese nicht glatt ist. Dabei kann es sich aber auch um eine Oberfläche handeln, die eine Struktur aufweist (z.B. Rillen). Durch diese Struktur ist die Glattheit der Oberfläche aufgehoben, auch wenn die Struktur, also die Rillen, selbst glatt sein kann. Erfindungsgemäß werden solche Oberflächen als„strukturierte Oberflächen" bezeichnet. Falls durch Ansicht oder Berühren der Oberfläche nicht erkennbar ist, ob eine Oberfläche glatt oder rau ist, kann ein Test durchgeführt werden, bei dem ein Laserstrahl auf diese Oberfläche gerichtet wird. Bei einer glatten Oberfläche wird der Laser nur in
Hauptrichtung an der Oberfläche reflektiert. Bei rauen Oberflächen erfolgt eine Streuung in alle Raumrichtungen. Ein solcher Test ist auf der Web-Seite der Universität Kiel beschrieben worden (http://www.tf.uni- kield(^matwis amat semitech_cn ka^
[0024] Für einen Fachmann ist es leicht herauszufinden, ob eine Oberfläche die notwendige Rauheit für eine Anbindung von Zellen bzw. Nukleinsäuren hat. Er muss nur einen entsprechenden Versuch mit der zu prüfenden Oberfläche machen, indem er eine wässrige Lösung mit biologischen Zellen mit dieser Oberfläche in Kontakt bringt und prüft, ob die Zellen angebunden werden.
[0025] Nach erfolgter Fixierung der Zellen an die Oberfläche können die Zellen mit der Oberfläche aus der Probe entfernt werden. [0026] Die Zielstellung der Erfindung, die Isolierung von den in den fixierten Zellen enthaltenen Nukleinsäuren unter Nutzung desselben Mittels, wird dadurch erreicht, dass man die Zellen mit einem Lysepuffer lysiert und damit die Nukleinsäuren freisetzt. Nach
Freisetzung der Nukleinsäuren können diese mit derselben Oberfläche, welche für die Fixierung der Zellen eingesetzt wurde, auch isoliert werden.
[0027] Das erfindungsgemäße Verfahren kombiniert dabei erstmalig die Adsorption von Zellen einer Probe an ein Material mit einer„strukturierten Oberfläche" mit der
nachfolgenden Isolierung und Aufreinigung von Nukleinsäuren unter Verwendung derselben Oberfläche. Dabei kann das Verfahren als„Single- Tube- Prozess" oder auch in Form eines automatisierten„Walk- Away- Verfahrens" durchgeführt werden. Das eingesetzte
Trägermaterial mit einer„strukturierten Oberfläche" ist preiswert und im Gegensatz zu eingesetzten Nanopartikeln ungefährlich.
[0028] Es gibt keine wirkliche Limitation des Verfahrens in bezug auf das Volumen der Probe und auch nicht in Bezug auf die Art der Probe. Gerade der letzte Punkt ist mit einem entscheidenden Vorteil behaftet, da damit auch Proben effizient bearbeitet werden können, die mit den bekannten Methoden der Nukleinsäureisolierung nur aufwendig bearbeitet werden können, insbesondere Proben mit hohem inhibitorischen Potenzial. Der Vorteil begründet sich im erfindungsgemäßen Verfahren. Im ersten Verfahrensschritt werden die Zellen aus einer Probe an die„strukturierte" oder raue Oberfläche adsorbiert. Damit kann die Probe verworfen werden und in diesem Zusammenhang auch die inhibitorischen Matrixkomponenten. Die an der„strukturierten Oberfläche" befindlichen Zellen können darüber hinaus auch mit Wasser gewaschen werden. Für die nachfolgende Nukleinsäureisolierung hat man dann bereits saubere Zellen. Dies ist u.a. auch bei der Isolierung von DNA aus Blutproben wesentlich.
[0029] Der Prozessablauf ist einfach, extrem schnell und überaus effizient und kombiniert erfindungsgemäß einer Anreicherung von Zellen mit der nachfolgenden Extraktion der Nukleinsäure. Die Erfindung hat Bezug zu den offenbarten Verfahren und Mitteln der Schriften DE 10 2015 216 558, DE 10 2015 211 394 und DE 10 2015 211 393. Die Erfindung basiert auf den dort beschriebenen Eigenschaften, dass Nukleinsäuren an rauen bzw.
„strukturierten Oberflächen" isoliert werden können. Überaschenderweise zeigt die vorliegende Erfindung, dass ein solches Material nicht nur geeignet ist Nukleinsäuren zu isolieren, sondern auch geeignet ist, Zellen aus einer Probe zu binden. Damit ergibt sich der erfindungsgemäße Verfahrensansatz, ein solches Material in einer Dualfunktion kombiniert einsetzen zu können.
[0030] Der Kern der Erfindung besteht somit darin, dass Zellen einer Probe an eine „strukturierte Oberfläche" adsorbieren und sich nachfolgend die durch Lyse freigesetzten Nukleinsäuren in einer wässrigen Umgebung befinden, deren Polarität mittels organischer Substanzen so eingestellt ist, dass sich die Löslichkeit der Nukleinsäure reduziert und nachfolgend an der„strukturierten Oberfläche" präzipitiert und nachfolgend die präzipitierte DNA von der„strukturierten'Vrauen Oberfläche wieder abgelöst wird und zur Verfügung steht. Optional kann die an der rauen Oberfläche präzipitierte Nukleinsäure auch gewaschen und nach Waschschritten abgelöst werden.
[0031] Das Verfahren ist extrem einfach und schnell in der Durchführung. Es kann allgemein in folgenden Schritten durchgeführt werden:
1. Inkontaktbringen einer Probe, welche Zellen enthält, mit einem Material mit einer
„strukturierten Oberfläche" und nachfolgend Adsorption der in der Probe enthaltenen Zellen an diese Oberfläche. Ggf. wird der Probe zusätzlich eine Lösung, die
Kalziumchlorid enthält, zugegeben. Dies kann die Effizienz der Adsorption von Zellen noch erhöhen. Entfernen der Oberfläche aus der Probe und ggf. Waschen der adsorbierten Zellen an der Oberfläche.
2. Lysieren der Zellen mit einem Lysepuffer. Dieser Lysepuffer kann chaotrope Salze oder nichtchaotrope Salze oder Mischungen dieser beiden Gruppen enthalten. Darüber hinaus kann dieser Puffer weitere Komponenten enthalten wie Chelatbildner, Trispuffer, Netz- und Dispergiermittel etc. Das Verfahren funktioniert aber auch mit Puffern, welche keine Salze enthalten und z.B. nur aus einem Detergenz, Tris und EDTA bestehen. Zusätzlich können auch noch proteolytische Enzyme eingesetzt werden.
3. Zugabe eines Bindungspuffers, welcher eine alkoholische Komponente und weitere
Zusätze enthält oder Zugabe eines Alkohols allein oder auch Zugabe von Aceton oder Benzin. Damit präzipitiert die Nukleinsäure der Probe an dieselbe strukturierte
Oberfläche, an welche zuvor die Zellen adsorbiert wurden.
4. Ggf. Waschen und nachfolgend Trocknen der„strukturierten Oberfläche"
5. Finales Ablösen der Nukleinsäure vom Material mit einem Elutionspuffer
(Niedrigsalzpuffer oder Wasser).
[0032] Alle diese Verfahrensschritte von der Zelladsorption, der Lyse der Zellen, dem Binden der Nukleinsäuren, dem Waschen der gebundenen Nukleinsäuren und dem finalen Ablösen der Nukleinsäuren erfolgen dadurch, dass die„strukturierte Oberfläche" durch Schütteln oder durch Pipettieren mit den jeweiligen Komponenten in Kontakt gebracht wird. [0033] Das Verfahren ist universell einsetzbar und kann sowohl automatisiert als auch manuell durchgeführt werden.
[0034] Vorzugsweise, insbesondere für einen automatisierten Ablauf unter Verwendung beliebiger Liquidhandling Stationen, kann sich das erfindungsgemäße Mittel auch in einer Vorrichtung zur Extraktion von Nukleinsäuren befinden, umfassend einen Hohlkörper, durch den eine Flüssigkeit geleitet wird, wobei in diesem Hohlkörper ein Material mit rauer oder „strukturierter Oberfläche" so angeordnet ist, dass es von einer Flüssigkeit umspült werden kann. In einer bevorzugten Ausführungsform fungiert als Hohlkörper eine Pipettenspitze. Das Material mit rauer oder„strukturierter Oberfläche" hat eine solche Größe, dass es aus der Pipettenspitze unten nicht herausgelangen kann und unterscheidet sich damit von den im Stand der Technik beschriebenen magnetischen Partikeln (WO 01/05510 AI). In Summe ist es notwendig, dass innerhalb der Pipettenspitze durch das verbrachte Material eine zwei/dreidimensionale Struktur entsteht, an welche zuerst Zellen und nachfolgend nach Lyse der Zellen die freigesetzten Nukleinsäuren adsorbieren können.
[0035] Die einzusetzenden in die Pipettenspitze verbrachten Materialien zur Zelladsorption und nachfolgenden Anbindung von Nukleinsäuren können extrem unterschiedlich sein. Es können modifizierte Plastikmaterialien eingesetzt werden, deren Oberfläche nicht glatt, sondern rau oder strukturiert sind. Dazu zählen auch sogenannte Kompositmaterialien, die Mischungen aus Polymeren und z.B. organischen Komponenten als auch anorganische Komponenten sind. Wesentlich ist nur die Bereitstellung einer angerauten bzw.
„strukturierten Oberfläche" (keine glatte Oberfläche) bzw. die Verbringung von Material in die Pipettenspitze, das zur Ausbildung eines zwei/dreidimensionalen Netzwerkes führt, wobei die Nukleinsäuren dann an diese Struktur präzipitieren. Die Architektur des Materials ist ebenfalls nicht limitierend (rund, rechteckig, etc.). Dabei kann es sich auch um mehrere Materialien handeln (z.B. mehrere Granulate).
[0036] Wichtig ist, dass das Material, welches in eine Pipettenspitze verbracht wird, jederzeit von einer Flüssigkeit umspült werden kann, ohne dass die Flüssigkeit durch das eingebrachte Material hindurch muss. Auch kann eine Pipettenspitze eingesetzt werden, in welcher sich (aus einem Spritz gussteil gefertigt) dass Bindungsmaterial schon befindet und dieses nicht mehr in die Spitze verbracht werden muss. Vorteilhaft ist auch die Verwendung von rauem oder strukturiertem Material, was zusätzlich magnetische oder paramagnetische Eigenschaften besitzt. Ein solches Material eignet sich dann auch für eine manuelle Probenbearbeitung, bei welcher es separat in die Probe gegeben wird und sich nicht in einem Hohlkörper befindet. [0037] Die Probe mit den enthaltenen Zellen wird mittels Pipettiervorgängen am in der Pipettenspitze verbrachten erfindungsgemäßen Material„vorbei pipettiert". Die Zellen adsorbieren an das Material. In einer bevorzugten Ausführungsform kann der die Zellen enthaltenen Probe auch noch Kalziumchlorid zugesetzt werden. Dies scheint die Effizienz der Zellanhaftung an das erfindungsgemäße Material zu beschleunigen bzw. zu verstärken. Nach Zellanheftung wird die Pipettenspitze in eine Kavität getaucht, in welcher sich ein Lysepuffer und ggf. auch ein proteolytisches Enzym befindet. Jetzt erfolgt die Lyse der Zellen und die Freisetzung der Nukleinsäuren. Die Zellen befinden sich damit nicht mehr am
erfindungsgemäßen Material. Gemäß der Erfindung dienen die nachfolgenden
Verfahrensschritte jetzt der Anbindung der freigesetzten Nukleinsäuren an dasselbe erfindungsgemäße Material, an welchem sich zuvor die Zellen befanden. Nach erfolgter Lyse der Zellen befindet sich die zu isolierende Nukleinsäure in einer wässrigen Form.
Nachfolgend werden die für die Präzipitation der Nukleinsäuren notwendigen Bedingungen eingestellt, damit die Nukleinsäure an das in der Pipettenspitzen verbrachte Material präzipitieren kann. Der Ansatz wird mittels Pipettiervorgängen am vertikal in der
Pipettenspitze verbrachten nukleinsäurebindenden Material„vorbei pipettiert". Die
Nukleinsäuren präzipitieren an das Material. Nachfolgend können optional Waschpuffer ebenfalls am nukleinsäurebindenden Material„vorbei pipettiert" werden. Danach erfolgt ein Trocknungsschritt (z.B. häufiges Auf-und Abpipettieren). Final wird das Elutionsmittel wiederum mehrmals am vertikal angeordneten nukleinsäurebindenden Material„vorbei pipettiert" und dabei die gebundene Nukleinsäure abgelöst. Die Nukleinsäure liegt nun für notwendige downstream- Applikation vor. Das Verfahren ist extrem schnell und einfach in der Durchführung und erlaubt die Isolierung von Nukleinsäuren in einer extrem hohen Ausbeute und Reinheit.
[0038] Die vorliegende Erfindung zeigt neben der Einfachheit der Durchführung einen weiteren enormen Vorteil. Enthält eine biologische Probe große Mengen an Nukleinsäuren enthaltenden Zellen, so kann mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens und der
erfindungsgemäßen Materialien eine extrem große Menge an Nukleinsäuren extrahiert werden. Damit ist das Verfahren auch ideal für die Bearbeitung von großen Probenvolumina geeignet.
[0039] Die Erfindung soll nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert werden. Die Ausführungsbeispiele stellen dabei keine Limitierung der Erfindung dar. Ausführungsbeispiele
Beispiel 1: Anreicherung von Zellen aus einer wässrigen Lösung kombiniert mit der nachfolgenden Extraktion der in den Zellen enthaltenen Nukleinsäure unter Verwendung einer modifizierten Pipettenspitze sowie unter Verwendung eines kommerziell verfügbaren Extraktionsautomaten
[0040] Die automatisierte Extraktion wurde mit dem Extraktionsautomaten InnuPure C16 (Analytik Jena AG) durchgeführt.
[0041] Für die Durchführung einer Nukleinsäureextraktion nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wurden die Pipettenspitzen so geändert, dass sie dem erfindungsgemäßen Mittel entsprechen. In die Pipettenspitzen wurde in das untere Drittel vertikal ein angerautes Plastik- Granulat (4 Granulate mit einem Durchmesser von ca. 2 mm - 4 mm; Polypropylen) lose eingebracht. Das Granulat verschließt dabei das Lumen der Pipettenspitze nicht. Damit bleibt die Pipettierfunktion der Pipettenspitzen erhalten.
[0042] Das erfindungsgemäße Verfahren wurde dann auf dem Automaten InnuPure C16 wie folgt umgesetzt:
Die für das Verfahren benötigen Reagenzien lagen in einer vorbefüllten Deep Well-Platte vor. In die erste Kavität der Deep Well-Platte wurde die wässrige Zellsuspension verbracht.
[0043] Die Pipettenspitze mit dem erfindungsgemäßen Material wurde in die Kavität eingefahren. Die Zellbindung erfolgt durch auf- und abpipettieren (100 Wiederholungen). Bei diesem Vorgang adsorbieren die Zellen an das in der Spitze enthaltene erfindungsgemäße Material. Nach Beendigung des Pipettiervorganges wurde die Spitze aus der Kavität herausgefahren. Die Zellen befinden sich am Material innerhalb der Spitze. Die Spitze wurde nachfolgend in eine zweite Kavität der Deep Well-Platte eingefahren. In dieser Kavität befindet sich ein kommerziell verfügbarer Lysepuffer sowie Proteinase K (LysisSolution CBV; innuPREP Blood DNA K PC16; Analytik Jena AG). Die Lyse der am Material befindlichen Zellen erfolgte durch auf-und abpipettieren des Lysepuffers (200
Wiederholungen). Die Kavität wurde zusätzlich beheizt. Am Ende des Vorganges befindet sich die freigesetzte Nukleinsäure der Zellen im Lysepuffer. Die Zellen befinden sich nicht mehr am erfindungsgemäßen Material. Die Probe wurde jetzt in die Pipettenspitze aufgezogen und in eine weitere Kavität der Deep Well-Platte abgegeben. Diese Kavität ist vorbefüllt mit einem Alkohol (Isopropanol). [0044] Diese Lösung wurde daraufhin mittels der Pipettenspitze wiederum auf-und abpipettiert. Wiederum derart, dass die Lösung am Granulat vorbeiströmt (100
Wiederholungen). Jetzt erfolgte die Bindung der freigesetzten Nukleinsäure an das erfindungsgemäße Material, mit welchem zuvor schon die Zellen aus der Probe adsorbiert wurden. Nach Bindung der Nukleinsäure an das Granulat folgten noch Waschschritte.
[0045] Dazu waren weitere 3 Kavitäten der Deep Well-Platte mit einem alkoholischen Waschpuffer befüllt. Gewaschen wurde durch auf-und abpipettieren der Waschpuffer (jeweils 10 Wiederholungen).
[0046] Im Anschluss an den letzten Waschschritt wurde die erfindungsgemäße Spitze und das in ihr enthaltene Granulat durch pipettieren von Luft getrocknet und damit das restliche Ethanol entfernt. Die Elution der Nukleinsäuren vom Granulat erfolgte in einer weiteren Kavität der Deep Well-Platte, in welcher als Elutionsmittel 200 μΐ Wasser enthalten waren. Die Nukleinsäure wurde vom Granulat durch auf-und abpipettieren des Wassers (120
Wiederholungen) abgelöst.
[0047] Das Verfahren ist extrem einfach und schnell und zeigt, dass kommerziell verfügbare Extraktionsautomaten für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens in der Kombination von Zellbindung und Entfernung der Zellen aus der initialen Probe und nachfolgender Extraktion der in den Zellen enthaltenen Nukleinsäure mit dem dazu korrespondierenden erfindungsgemäßen Mittel eingesetzt werden können.
[0048] Der Nachweis der isolierten Nukleinsäure erfolgte mittels spektrophotometrischer Messung und Gelelektrophorese.
[0049] Ergebnisse der spektrophotometrischen Vermessung
[0050] Eine gelelektrophoretische Analyse der isolierten Nukleinsäure zeigt Figur 1.
[0051] Dargestellt ist die in einem 0,8 %igen Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennte Nukleinsäure, die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens isoliert wurde. Die Proben wurden von links nach rechts, beginnend mit Probe 1 , aufgetragen. Spur 1 enthält eine DNA Leiter.
Beispiel 2: Anreicherung von kernhaltigen Zellen aus unterschiedlichen Volumen von Vollblutproben kombiniert mit der nachfolgenden Extraktion der in den kernhaltigen Zellen enthaltenen Nukleinsäure unter Verwendung einer modifizierten Pipettenspitze sowie unter Verwendung eines kommerziell verfügbaren Extraktionsautomaten
[0052] Die automatisierte Extraktion wurde wiederum mit dem Extraktionsautomaten
InnuPure C16 (Analytik Jena AG) durchgeführt.
Für die Durchführung einer Nuklemsäureextraktion nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wurden die Pipettenspitzen so geändert, dass sie dem erfindungsgemäßen Mittel entsprechen.
In die Pipettenspitzen wurde in das untere Drittel vertikal ein angerautes Plastik- Granulat (4
Granulate mit einem Durchmesser von ca. 2 mm - 4 mm; Polypropylen) lose eingebracht. Damit bleibt die Pipettierfunktion der Pipettenspitzen erhalten.
Das erfindungsgemäße Verfahren wurde dann auf dem Automaten InnuPure C16 wie folgt umgesetzt.
Die für das Verfahren benötigen Reagenzien lagen in einer vorbefüllten Deep Well-Platte vor. In die erste Kavität der Deep Well Platte wurden unterschiedliche Blutmengen (200 μΐ, 300 μΐ, 400 μΐ und 500 μΐ) verbracht. Zu diesen Blutproben wurden jeweils 800 μΐ eines kommerziell verfügbaren Erythrozyten Lysepuffers (Ery Lysis Solution A; Analytik Jena AG) verbracht. Darüber hinaus wurden noch 200 μΐ einer 1 M Kalziumchloridlösung zugegeben.
[0053] Die Pipettenspitze mit dem erfindungsgemäßen Material wurde in die Kavität eingefahren. Die Zellbindung erfolgt durch auf- und abpipettieren (100 Wiederholungen). Bei diesem Vorgang adsorbieren die kernhaltigen Zellen an das in der Spitze enthaltenen erfindungsgemäße Material. Nach Beendigung des Pipettiervorganges wurde die Spitze aus der Kavität herausgefahren. Die Zellen befinden sich am Material innerhalb der Spitze. Damit wurden die Zellen von der eigentlichen Probe getrennt und damit auch von inhibitorischen Stoffen wie Hämoglobin. Dies erleichtert die nachfolgende erfolgreiche Extraktion der Nukleinsäure erheblich. Die Spitze wurde nachfolgend in eine zweite Kavität der Deep Well- Platte eingefahren. In dieser Kavität befindet sich ein kommerziell verfügbarer Lysepuffer sowie Proteinase K (LysisSolution CBV; innuPREP Blood DNA K PC16; Analytik Jena AG). Die Lyse der am Material befindlichen Zellen erfolgte durch auf-und abpipettieren des Lysepuffers (200 Wiederholungen). Die Kavität wurde zusätzlich beheizt. Am Ende des Vorganges befindet sich die freigesetzte Nukleinsäure der Zellen im Lysepuffer. Die Zellen befinden sich nicht mehr am erfindungsgemäßen Material. Die Probe wurde jetzt in die Piepttenspitze aufgezogen und in eine weitere Kavität der Deep Well-Platte abgegeben. Diese Kavität ist vorbefüllt mit einem Alkohol (Isopropanol).
[0054] Diese Lösung wurde daraufhin mittels der Pipettenspitze wiederum derart auf-und abpipettiert, dass die Lösung am befüllten Material vorbeiströmt (100 Wiederholungen). Jetzt erfolgte die Bindung der freigesetzten Nukleinsäure an das erfindungsgemäße Material, mit welchem zuvor schon die Zellen aus der Probe adsorbiert wurden. Nach Bindung der
Nukleinsäure an das Granulat folgten noch Waschschritte.
[0055] Dazu waren weitere 3 Kavitäten der Deep Well-Platte mit die alkoholischen
Waschpuffer befüllt. Gewaschen wurde durch auf-und abpipettieren der Waschpuffer (jeweisl 10 Wiederholungen.
[0056] Im Anschluss an den letzten Waschschritt wurde die erfindungsgemäße Spitze und das in ihr enthaltene Material durch Pipettieren von Luft getrocknet und damit das restliche Ethanol entfernt. Die Elution der Nukleinsäuren vom Granulat erfolgte in einer weiteren Kavität der Deep Well-Platte, in welcher als Elutionsmittel 200 μΐ Wasser enthalten waren. Die Nukleinsäure wurde vom Granulat durch auf-und abpipettieren des Wassers (120
Wiederholungen) abgelöst.
[0057] Der Nachweis der isolierten Nukleinsäure erfolgte mittels spektrophotometrischer Messung und Gelelektrophorese. Es zeigt sich, dass durch die Erhöhung der Blutmenge auch die Ausbeute an Nukleinsäure steigt. Damit eignet sich das Verfahren exzellent auch für die Bearbeitung von größeren Probenvolumen.
[0058] Ergebnisse der spektrophotometrischen Vermessung
Blutprobe 1 (300 μΐ) 51,5 10,3 1,7 2,3
Blutprobe 1 (400 μΐ) 72,5 14,5 1,7 2,3
Blutprobe 1 (400 μΐ) 58 11,6 1,7 2,2
Blutprobe 1 (500 μΐ) 75,5 15,1 1,7 2,1
Blutprobe 1 (500 μΐ) 69,5 12,9 1,7 2,1
[0059] Eine gelelektrophoretische Analyse der isolierten Nukleinsäure zeigt Figur 2. [0060] Dargestellt ist die in einem 0,8 %igen Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennte Nukleinsäure, die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens isoliert wurde. Die Proben wurden von links nach rechts, beginnend mit Probe 1 , aufgetragen. Spur 9 enthält eine DNA Leiter. Beispiel 3: Anreicherung der kernhaltigen Zellen aus Vollblutproben kombiniert mit der nachfolgenden Extraktion der in den kernhaltigen Zellen enthaltenen Nukleinsäure unter Verwendung von drei unterschiedlich modifizierten Pipettenspitzen sowie unter Verwendung eines kommerziell verfügbaren Extraktionsautomaten [0061] Die automatisierte Extraktion wurde wiederum mit dem Extraktionsautomaten InnuPure C16 (Analytik Jena AG) durchgeführt.
Für die Durchführung einer Nuklemsäureextraktion nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wurden die Pipettenspitzen so geändert, dass sie dem erfindungsgemäßen Mittel entsprechen. Dazu wurden Pipettenspitzen wie folgt modifiziert:
1. Pipettenspitzen im unteren Drittel vertikal mit angerautem Plastik- Granulat aus
Polypropylen (4 Granulate mit einem Durchmesser von ca. 2 mm - 4 mm) lose befüllt
2. Pipettenspitzen im unteren Drittel vertikal mit angerautem Plastik- Granulat aus
Polypropylen ( 5 Granulate mit einem Durchmesser von ca. 2 mm - 4 mm) lose befüllt 3. Pipettenspitzen im unteren Drittel vertikal mit einem spiralförmigen Plastikmaterial aus Polyethylen von einer Länge von 1, 5 cm befüllt (als Beispiel für ein strukturiertes Material).
[0062] Die Materialien befanden sich locker in der Pipettenspitze, damit die Pipettierfunktion der Pipettenspitzen vollständig erhalten blieb. Die zu pipettierenden Flüssigkeiten bewegten sich erfindungsgemäß immer am Material vorbei.
[0063] Das erfindungsgemäße Verfahren wurde dann auf dem Automaten InnuPure C16 wie folgt umgesetzt:
Die für das Verfahren benötigen Reagenzien lagen in einer vorbefüllten Deep Well-Platte vor. In die erste Kavität der Deep Well-Platte wurde eine Vollblutprobe (500 μΐ) verbracht. Zu dieser Blutprobe wurden jeweils 800 μΐ eins kommerziell verfügbaren Erythrozyten- Lysepuffers (Ery Lysis Solution A; Analytik Jena AG) verbracht. Darüber hinaus wurden noch 200 μΐ einer 1 M Kalziumchloridlösung zugegeben.
[0064] Die Pipettenspitze mit dem erfindungsgemäßen Material wurde in die Kavität eingefahren. Die Zellbindung erfolgt durch auf- und abpipettieren (100 Wiederholungen). Bei diesem Vorgang adsorbieren die kernhaltigen Zellen an das in der Spitze enthaltene erfindungsgemäße Material. Nach Beendigung des Pipettiervorganges wurde die Spitze aus der Kavität herausgefahren. Die Zellen befinden sich am Material innerhalb der Spitze. Damit wurden die Zellen von der eigentlichen Probe getrennt und damit auch von inhibitorischen Stoffen wie Hämoglobin. Dies erleichtert die nachfolgende erfolgreiche Extraktion der Nukleinsäure erheblich. Die Spitze wurde nachfolgend in eine zweite Kavität der Deep Well- Platte eingefahren. In dieser Kavität befindet sich ein kommerziell verfügbarer Lysepuffer sowie Proteinase K (LysisSolution CBV; innuPREP Blood DNA K PC16; Analytik Jena AG). Die Lyse der am Material befindlichen Zellen erfolgte durch auf-und abpipettieren des Lysepuffers (200 Wiederholungen). Die Kavität wurde zusätzlich beheizt. Am Ende des Vorganges befindet sich die freigesetzte Nukleinsäure der Zellen im Lysepuffer. Die Zellen befinden sich nicht mehr am erfindungsgemäßen Material. Die Probe wurde jetzt in die
Piepttenspitze aufgezogen und in eine weitere Kavität der Deep Well-Platte abgegeben. Diese Kavität ist vorbefüllt mit einem Alkohol (Isopropanol).
[0065] Diese Lösung wurde daraufhin mittels der Pipettenspitze wiederum auf-und abpipettiert. Wiederum derart, dass die Lösung am befüllten Material vorbeiströmt (100 Wiederholungen). Jetzt erfolgte die Bindung der freigesetzten Nukleinsäure an das erfindungsgemäße Material, mit welchem zuvor schon die Zellen aus der Probe adsorbiert wurden. Nach Bindung der Nukleinsäure an das Granulat folgten noch Waschschritte.
[0066] Dazu waren weitere 3 Kavitäten der Deep Well-Platte mit alkoholischem Waschpuffer befüllt. Gewaschen wurde durch auf-und abpipettieren der Waschpuffer (jeweils 10
Wiederho lungen) .
[0067] Im Anschluss an den letzten Waschschritt wurde die erfindungsgemäße Spitze und das in ihr enthaltene Material durch Pipettieren von Luft getrocknet und damit das restliche Ethanol entfernt. Die Elution der Nukleinsäuren vom Granulat erfolgte in einer weiteren Kavität der Deep Well-Platte, in welcher als Elutionsmittel 200 μΐ Wasser enthalten waren. Die Nukleinsäure wurde vom Granulat durch auf-und abpipettieren des Wassers (120 Wiederholungen) abgelöst.
[0068] Der Nachweis der isolierten Nukleinsäure erfolgte mittels spektrophotometrischer Messung und Gelelektrophorese. Es zeigt sich, dass durch die Erhöhung der Blutmenge auch die Ausbeute an Nukleinsäure steigt. Damit eignet sich das Verfahren exzellent auch für die Bearbeitung von größeren Probenvolumen.
[0069] Ergebnisse der spektrophotometrischen Vermessung
[0070] Eine gelelektrophoretische Analyse der isolierten Nukleinsäure zeigt Figur 3.
[0071] Dargestellt ist die in einem 0,8 %igen Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennte Nukleinsäure, die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens isoliert wurde. Die Proben wurden von links nach rechts, beginnend mit Probe 1 , aufgetragen. Spur 1 enthält eine DNA Leiter.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Anreicherung und Isolierung von biologischen Zellen aus einer Probe, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe mit einer festen Phase in Kontakt gebracht wird, die eine raue bzw. strukturierte Oberfläche ausweist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Probe vor dem
Inkontaktbringen ein Salz eines zwei- oder dreiwertigen Kations, vorzugsweise
Kalziumchlorid, zugegeben wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der rauen Oberfläche um eine nicht-glatte Kunststoff- oder Gummi-Oberfläche handelt.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die nicht-glatte Kunststoff- Oberfläche durch einen 3D-Druck oder durch Aufrauen eines Kunststoffs erzeugt wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass raue
Kompositmaterialien als feste Phase Verwendung finden.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass als feste
Phase angeraute Pipettenspitzen eingesetzt werden, vorzugsweise solche, die zusätzlich magnetische oder paramagnetische Eigenschaften aufweisen.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass in einen oder auf einen glatten Hohlkörper, vorzugsweise eine Pipettenspitze, eine feste Phase mit rauer bzw. strukturierte Oberfläche eingebracht oder aufgesteckt wird, wobei es sich bei der aufgesteckten festen Phase vorzugsweise um einen Ring oder eine Hülse handelt.
8. Verfahren zur Anreicherung von biologischen Zellen aus einer Probe und der nachfolgenden Nuklemsäureisolierung aus diesen Zellen, gekennzeichnet durch folgende
Schritte: a) Inkontaktbringen einer Probe, welche biologische Zellen enthält, gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7
b) Lysieren der Zellen
c) Anbinden der durch die Lyse freigesetzten Nukleinsäuren aus den Zellen an dasselbe Material, an dem gemäß den Ansprüchen 1 bis 7 die Zellen angebunden waren d) Ggf. Waschen und nachfolgend Trocknen der festen Phase
e) Finales Ablösen der Nukleinsäure vom Material mit einem Elutionspuffer, vorzugsweise mit einem Niedrigsalzpuffer oder Wasser.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass es manuell oder vollautomatisiert, als„Single- Tube-Prozess" oder auch in Form eines automatisierten
„Walk- Away- Verfahrens" durchgeführt wird.
10. Verwendung von festen Phasen, vorzugsweise Pipettenspitzen die eine raue bzw. strukturierte Oberfläche aufweisen, zur Anreicherung und Isolierung von biologischen Zellen aus einer Probe und / oder zur Anreicherung von biologischen Zellen aus einer Probe und der nachfolgenden Nukleinsäureisolierung aus diesen Zellen.
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