DE19858447A1 - Verfahren zur Isolierung von kurz- und langkettigen Nukleinsäuren - Google Patents
Verfahren zur Isolierung von kurz- und langkettigen NukleinsäurenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein einfaches und extrem schnelles Verfahren zur Isolierung und
Reinigung großer Mengen von kurz- und langkettigen Nukleinsäuren aus
unterschiedlichen biologischen und anderen Ausgangsmaterialien. Es ist für eine Vielzahl
von biologisch-, molekularbiologisch-, forensisch-, medizinisch- analytisch- sowie
biochemisch arbeitenden Laboratorien von großer Bedeutung. Damit sind
Anwendungsgebiete der Erfindung die forensische Medizin, medizinische Diagnostik,
Molekularbiologie, Biochemie, Gentechnik und alle anderen angrenzenden Gebiete.
Alle kommerziell verfügbaren Kits basieren auf dem hinlänglich bekannten Prinzip der
Bindung von Nukleinsäuren an mineralische Träger unter Anwesenheit von Lösungen
unterschiedlicher chaotroper Salze und verwenden als Trägermaterialien Suspensionen
feingemahlener Glaspulver (z. B. Glasmilk, BIO 101, La Jolla, CA), Diatomenerden
(Fa. Sigma) oder auch Silicagele. (Diagen, DE 41 39 664 A1).
Ein für eine Vielzahl unterschiedlicher Anwendungen praktikables Verfahren zur
Isolierung von Nukleinsäuren ist in US 5,234,809 (Boom) dargestellt. Dort ist ein
Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus nukleinsäurehaltigen
Ausgangsmaterialien durch die Inkubation des Ausgangsmaterials mit einem chaotropen
Puffer und einer DNA-bindenden festen Phase beschrieben. Die chaotropen Puffer
realisieren sowohl die Lyse des Ausgangsmaterials wie auch die Bindung der
Nukleinsäuren an die feste Phase. Das Verfahren ist gut geeignet, um Nukleinsäuren aus
kleinen Probenmengen zu Isolieren und findet speziell im Bereich der Isolierung viraler
Nukleinsäuren seine praktische Anwendung.
Die Aufgabe der Erfindung bestand darin, ein Verfahren zur Isolierung von
Nukleinsäuren zu entwickeln, insbesondere von Plasmid-DNS, vorzugsweise aus
unterschiedlichsten Ausgangsmengen, welches zu isolierten Nukleinsäuren führt, die den
hohen Qualitätsparametern nachfolgender Applikationen gerecht werden, extrem einfach
in der Durchführung, schnell und kostengünstig ist.
Die Aufgabe wurde gemäß den Ansprüchen realisiert, erfindungsgemäß durch ein
kombiniertes Batch-Säulenverfahren, indem die Nukleinsäurebindung an mineralische
Trägermaterialien als Batch-Verfahren erfolgt und man die gebundenen Nukleinsäuren
danach chromatographisch aufbereitet.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Isolierung und Reinigung von kurz- und
langkettigen Nukleinsäuren aus unterschiedlichen biologischen und anderen
Ausgangsmaterialien ist gekennzeichnet durch
- - Lyse von Nukleinsäuren enthaltenden Materialien,
- - Inkubation mit einem mineralischen Trägermaterial,
- - Aufbringen auf Membranen, die eine Porengröße aufweisen, die größer ist, als die Partikelgröße der Trägermaterialien,
- - Abtrennung der Nukleinsäuren vom Trägermaterial durch Elution, wobei die Trägerpartikel überraschend auf der Membran zurückbleiben.
Als bevorzugte Ausgangsmaterialien, die Nukleinsäuren enthalten, kommen komplexe
biologische Systeme, wie z. B. Blut, Gewebe, Urin oder Stuhlproben, die gegebenenfalls
an festen Materialien gebunden sind, in Frage. Das erfindungsgemäße Verfahren ist
jedoch auch für die Isolierung und Reinigung von kurz- und langkettigen Nukleinsäuren
aus anderen Ausgangsmaterialien geeignet, wie z. B. aus bakteriellen Lysaten,
pflanzlichen Komponenten, von DNS-Fragmenten aus PCR-Ansätzen oder aus
Agarosegelen.
Bevorzugte Trägermaterialien sind Siliziumverbindungen, wie z. B. Siliciumdioxid,
Kieselsäuren oder Silicagele. Die erfindungsgemäß eingesetzten Siliciumverbindungen
weisen eine durchschnittliche Teilchengröße von 7 nm bis 5000 nm, vorzugsweise 7-40 nm
oder 500-5000 nm, auf.
Die Lyse der Ausgangsstoffe und die anschließende Inkubation mit den Trägermaterialien
erfolgt in einem Puffersystem, das chaotrope Salze aufweist. Chaotrope Salze sind z. B.
Guanidinisothiocyanat, Guanidinhydrochlorid, Lithiumchlorid, Natriumperchlorat,
Natriumjodid und/oder Harnstoff- vorzugsweise in Konzentrationen 1 bis 10 M.
Als die Lyse fördernde Komponenten werden Detergentien wie z. B. TritonX-100, Tween,
N-Lauryl-Sarcosyl, SDS und/oder CTAB, ggf. Protein-abbauende Enzyme, wie z. B.
Proteinasen eingesetzt.
Erfindungsgemäß werden zur Separierung der verwendeten mineralischen
Trägermaterialien Membranen verwendet, die eine Porengröße aufweisen, die größer ist,
als die der eingesetzten Trägermaterialien, vorzugsweise in Zentrifugationskartuschen,
wobei man die Porengröße der Membranen in Abhängigkeit der durchschnittlichen
Partikelgröße des eingesetzten Trägermaterials spezifiziert. Bevorzugt werden gemäß der
Erfindung Nylon- oder Polysulfonmembranen eingesetzt.
Die Träger mit den fixierten Nukleinsäuren werden vor oder nach ihrem Aufbringen auf
die Membran gewaschen. Die anschließende Elution der Nukleinsäure vom Träger wird
fachgemäß mit Puffern geringer Ionenstärke durchgeführt.
Es ist allgemein naheliegend, daß die für Nukleinsäurereinigungen effektiv nutzbaren
Zentrifugationsmembranen eine Porengröße aufweisen müssen, die kleiner ist, als die der
eingesetzten Trägermatrices, da mineralische Partikel, welche kleinere
Partikeldurchmesser als die Poren von den Zentrifugationsmembranen haben, während
eines Zentrifugationsschrittes immer durch die Poren zentrifugiert werden.
Die Erfindung beruht auf der überraschenden Feststellung, daß ein kombiniertes Batch-
Säulen-Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren unter Einbeziehung von
mineralischen Trägerpartikeln, die sogar sehr viel kleiner als die Porendurchmesser
kommerziell verfügbarer Zentrifugationssäulen sein können, möglich ist.
Überraschenderweise kann ein solches Kombinationsverfahren sogar mit mineralischen
Trägermaterialien kleiner 50 nm realisiert werden, wodurch der Vorteil der extrem hohen
Bindungsoberflächen solcher Partikeln ausgenutzt werden kann.
Das erfindungsgemäße Verfahren der Kombination eines Batch- mit einem
Säulenverfahren ist durch die Verwendung beliebiger mineralischer Trägermaterialien,
auch sehr kleiner mineralischer Trägerpartikel und deren extrem großen spezifischen
Oberflächen, hinsichtlich der Volumina der Ausgangsmaterialien nicht limitiert.
Das bedeutet, notwendige Ausgangslösungen, welche in Abhängigkeit von der Menge des
Ausgangsmaterials (z. B. bakterielle Lysate) ansonsten erhöht werden müssen, sind nicht
mehr limitiert, da die Schritte der Bindung der Plasmid-DNA an die verwendeten
Trägerpartikel nicht innerhalb einer Säule erfolgen müssen.
Das Verfahren liefert sehr hohe Ausbeuten an hochreiner DNA und ist außerdem sehr
einfach in der Durchführung und kann im Vergleich zu weitverbreiteten
Anionenaustauschersystemen z. B. bei der Isolierung von Plasmid-DNA in einer sehr viel
kürzeren Zeit realisiert werden.
Die Erfindung soll nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen dargestellt werden.
2 ml einer bakteriellen Übernachtkultur werden in ein 2 ml Eppendorf-Reaktionsgefäß
überführt und für 1 min bei 12.000 rpm zentrifugiert. Das Zellpellet wird anschließend mit
100 µl Solution I (Tris-HCl, EDTA; Glucose) resuspendiert. Die Zellyse erfolgt durch
Zugabe von 300 µl Solution II (NaOH; SDS) durch kurzes vorsichtiges Schwenken des
Reaktionsgefäßes. Durch Zugabe von 300 µl Solution III (Natriumacetat;
Guanidiniumhydrochlorid) erfolgt die notwendige Neutralisationsreaktion. Chromosomale
DNA und Proteine werden nachfolgend durch einen 5minutigen Zentrifugationsschritt bei
14.000 rpm sedimentiert und der klarzentrifugierte Überstand wird nachfolgend mit 20 µl
einer Suspension aus einem mineralischen Trägermaterial bestehend aus Silica-
Nanopartikeln (durchschnittliche Teilchengröße 40 nm) inkubiert. Die Lösung wird
anschließend auf eine Minizentrifugationssäule (z. B. Micro Spin Nylon oder Micro Spin
PSE; Fa. LIDA) überführt. Die Trägerpartikel mit der gebundenen Plasmid-DNA werden
durch Zentrifugation für 1 Minute bei bei 12.000 rpm an die Oberfläche der Filtermembran
verbracht und dort durch Zugabe einer Waschlösung (60% Ethanol; NaCl) und einem
erneutem Zentrifugationsschritt gewaschen. Der Waschschritt wird ein weiteres Mal
wiederholt. Durch Zentrifugation bei 12.000 rpm für 2 min wird der restliche Ethanol
abschließend vom Trägermaterial entfernt. Das Ablösen der gebundenen Plasmid-DNA
erfolgt durch die Zugabe von 100 µl eines Niedrigsalzpuffers (z. B. 10 mM Tris-HCl) bei
70°C und nachfolgender Zentrifugation für 1 Minute bei 12.000 rpm. Das Zentrifugat
enthält die isolierte Plasmid-DNA.
Die gelelektrophoretische Darstellung isolierter Plasmid-DNA (Miniprep) aus individuellen
Einzelzellkolonien ist in Abb. 1 dargestellt.
25 ml einer bakteriellen Übernachtkultur werden in ein 50 ml Flacon-Reaktionsgefäß
überführt und für 10 min bei 5.000 rpm zentrifugiert. Das Zellpellet wird anschließend mit 1
ml Solution I (Tris-HCl, EDTA; Glucose) resuspendiert. Die Zellyse erfolgt durch Zugabe
von 1,8 ml Solution II (NaOH; SDS) durch kurzes vorsichtiges Schwenken des
Reaktionsgefäßes und Inkubation für 5 min. . Durch Zugabe von 1,8 ml Solution III
(Natriumacetat; Guanidiniumhydrochlorid) und nachfolgender Inkubation für 10 min auf
Eis erfolgt die notwendige Neutralisationsreaktion. Chromosomale DNA und Proteine
werden nachfolgend durch einen 10minütigen Zentrifugationsschritt bei 5000 rpm
sedimentiert und der klarzentrifugierte Überstand wird nachfolgend mit 150 µl einer
Suspension aus einem mineralischen Trägermaterial bestehend aus Silica-Nanopartikeln
(durchschnittliche Teilchengröße 40 nm) inkubiert. Die Lösung wird anschließend auf eine
Zentrifugationssäule (z. B. Macro Spin Nylon; Fa. LIDA) überführt. Die Trägerpartikel mit
der gebundenen Plasmid-DNA werden durch Zentrifugation für 5 Minuten bei 5000 rpm an
die Oberfläche der Filtermembran verbracht und dort durch Zugabe einer Waschlösung
(60% Ethanol; NaCl) und einem erneutem Zentrifugationsschritt gewaschen. Der
Waschschritt wird ein weiteres Mal wiederholt. Durch Zentrifugation bei 5000 rpm für 10 min
oder durch die Inkubation der Zentrifugationssäule bei 37°C für 10 min wird der
restliche Ethanol abschließend vom Trägermaterial entfernt. Das Ablösen der gebundenen
Plasmid-DNA erfolgt durch die Zugabe von 200 µl-300 µl eines Niedrigsalzpuffers (z. B.
10 mM Tris-HCl) bei 70°C und nachfolgender Zentrifugation für 5 Minuten bei 5000 rpm.
Das Zentrifugat enthält die isolierte Plasmid-DNA.
Die gelelektrophoretische Darstellung isolierter Plasmid-DNA (Midipreparation) aus
individuellen Einzelzellkolonien ist in Abb. 2 dargestellt.
Claims (11)
1. Verfahren zur Isolierung und Reinigung von kurz- und langkettigen Nukleinsäuren
aus unterschiedlichen biologischen und anderen Ausgangsmaterialien durch
- - Lyse von Nukleinsäuren enthaltenden Materialien,
- - Inkubation mit einem mineralischen Trägermaterial,
- - Aufbringen auf Membranen, die eine Porengröße aufweisen, die größer ist, als die Partikelgröße der Trägermaterialien,
- - Abtrennung der Nukleinsäuren vom Trägermaterial durch Elution, wobei die Trägerpartikel auf der Membran zurückbleiben.
2. Verfahren nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß
Ausgangsmaterialien komplexe biologische Systeme, wie z. B. Blut, Gewebe, Urin,
Stuhl, die ggf. an festen Materialien gebunden sind, bakterielle Lysate, pflanzliche
Komponenten, DNS-Fragmente aus PCR-Ansätzen oder Agarosegele sind.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet, daß
als Trägermaterialien Siliziumverbindungen, wie, z. B. Siliciumdioxid, Kieselsäuren,
Silicagele eingesetzt werden.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3,
dadurch gekennzeichnet, daß
die eingesetzten Siliciumverbindungen eine durchschnittliche Teilchengröße von 7 nm
bis 5000 nm, vorzugsweise 7-40 nm oder 500-5000 nm, aufweisen.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4,
dadurch gekennzeichnet, daß
die Lyse der Nukleinsäuren und ihre Bindung an das mineralische Trägermaterial mit
chaotropen Salzlösungen in Kombination mit lysierenden Komponenten erfolgt.
6. Verfahren nach Anspruch 5,
dadurch gekennzeichnet, daß
als chaotrope Salze Guanidinisothiocyanat, Guanidinhydrochlorid, Lithiumchlorid,
Natriumperchlorat, Natriumjodid und/oder Harnstoff eingesetzt werden.
7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6,
dadurch gekennzeichnet, daß
als lysierende Komponenten Detergentien und/oder protein-abbauende Enzyme
eingesetzt werden.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7,
dadurch gekennzeichnet, daß
als Membranen Nylon- oder Polysulfonmembranen eingesetzt werden.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8,
dadurch gekennzeichnet, daß
man die Porengröße der Membranen in Abhängigkeit der durchschnittlichen
Partikelgröße des eingesetzten Trägermaterials spezifiziert.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9,
dadurch gekennzeichnet, daß
man die Träger fixierten Nukleinsäuren vor oder nach ihrem Aufbringen auf die
Membran wäscht.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10,
dadurch gekennzeichnet, daß
man die Elution der Nukleinsäure vom Träger mit Puffern geringer Ionenstärke
durchführt.
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