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EP3320321A1 - Système de concentration, préconcentration par empilement d'échantillon et/ou purification pour analyse - Google Patents

Système de concentration, préconcentration par empilement d'échantillon et/ou purification pour analyse

Info

Publication number
EP3320321A1
EP3320321A1 EP16763885.7A EP16763885A EP3320321A1 EP 3320321 A1 EP3320321 A1 EP 3320321A1 EP 16763885 A EP16763885 A EP 16763885A EP 3320321 A1 EP3320321 A1 EP 3320321A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
concentration
molecules
electric field
flow
zone
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
EP16763885.7A
Other languages
German (de)
English (en)
Other versions
EP3320321B1 (fr
Inventor
Frédéric Ginot
Comtet-Louis ANDRIAMANAMPISOA
Vincent PICOT
Audrey BOUTONNET
Aurélien BANCAUD
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Adelis
Original Assignee
Picometrics Technologies SAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Picometrics Technologies SAS filed Critical Picometrics Technologies SAS
Publication of EP3320321A1 publication Critical patent/EP3320321A1/fr
Application granted granted Critical
Publication of EP3320321B1 publication Critical patent/EP3320321B1/fr
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/40—Concentrating samples
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G01N27/44704—Details; Accessories
    • G01N27/44743—Introducing samples
    • G—PHYSICS
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G01N27/44756—Apparatus specially adapted therefor
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    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G01N27/44756—Apparatus specially adapted therefor
    • G01N27/44791—Microapparatus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N30/0005—Field flow fractionation
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    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/40—Concentrating samples
    • G01N2001/4038—Concentrating samples electric methods, e.g. electromigration, electrophoresis, ionisation
    • G—PHYSICS
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    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/0005—Field flow fractionation
    • G01N2030/004—Field flow fractionation characterised by opposing force

Definitions

  • the present invention relates to a concentration system, sample stacking preconcentration ("stacking") and / or purification for analysis or for preparation of chemical or biological samples. It applies, in particular, to concentration, preconcentration ("stacking") and on-line purification upstream of analytical preparation instruments or analytical instruments, for example by capillary electrophoresis.
  • capillary electrophoresis analysis requires sufficiently pure and concentrated samples.
  • Capillary electrophoresis is an analytical technique that allows high separation efficiency on small and large molecules.
  • the capillary electrophoresis instrument is composed of a fused silica capillary with detection window, a high voltage source, two electrodes, two buffer reservoirs and an optical absorbance or fluorescence detector.
  • the sample is injected at the inlet of the capillary.
  • a voltage is applied across the capillary.
  • the molecules are then separated according to an electroosmotic and electrophoretic flow.
  • LIF laser-induced fluorescence
  • LEDIF light-emitting diode
  • this method is also a low-pass filter: all the molecules below a certain size or a certain charge pass freely through the channels.
  • the purity and concentration of biochemical or biological products is also a problem encountered in bio-production of active products for health.
  • a large volume of product for example a volume of cells, containing the product of interest, suspended in their culture medium, and one wants to obtain at the end of the process the extremely pure therapeutic product. in a volume typically 100 to 1000 times lower than the starting volume.
  • the process is generally composed of several steps, which depend on the therapeutic product to be purified. Very often, the first steps include one or more chromatographies that both purify and partially concentrate the product. Very often too, the last step is an ultra-filtration to concentrate the purified product. In these processes, the efficiency and speed of each step are key control criteria for the development of the industrial process.
  • charged molecules or particles of the sample which are in solution or suspended in an aqueous medium, are placed in an electric field. They migrate under the force induced by the electric field, at a speed that depends on both their load and size. After a certain migration time, and therefore a certain migration distance, the molecules are separated and can be detected in a distinct manner.
  • the electrophoresis can be miniaturized. However, this miniaturization is not possible when one wants to isolate by electrophoresis a large amount of analyte. In this case, the biochemist is forced to use cumbersome and slow systems. There are few preparatory systems based on electrophoresis, and those that exist are systems limited to a laboratory scale; there is no preparation of molecules by electrophoresis on a truly industrial scale.
  • Chromatography techniques are numerous, based on different principles of separation.
  • Size exclusion chromatography like electrophoresis, relies on a difference in the migration speed of the molecules, or particles, in a column filled with immobile and porous particles, called the chromatographic support; the larger analytes, larger than the pores of the support, carried by the flux, progress without being able to enter the particles of the support, in the dead volume of the column.
  • smaller analytes enter the carrier particles, and follow more tortuous paths than large analytes, with a slower hydrodynamic flow. They migrate less quickly along the column.
  • a detector placed downstream of the column thus passes first the large analytes, then the small ones. There are many different detectors: light, UV or visible absorption, light scattering, refractive index, fluorescence, conductivity, and even mass spectrometry.
  • the ion exchange or reverse phase chromatography techniques are based on a difference in adsorption of the analytes on the chromatographic support.
  • the molecules, or particles, of the sample are put in a solution which causes their adsorption on the particles of the chromatographic support; this adsorption is of electrostatic origin in ion exchange chromatography, and of hydrophobic origin in reverse phase chromatography.
  • a time gradient of elution solvent is generally applied which will differentially detach the analytes; the weakest analytes hanging on the support will come off first, and come out first of the chromatography column.
  • the applied gradient is a solvent polarity gradient for the reverse phases, and a pH or salt gradient for the ion exchanges.
  • the present invention aims to remedy all or part of these disadvantages.
  • the present invention is directed to a system and method for separating molecules or particles for analysis or for preparing chemical or biological samples. It is in the field of separative sciences, whether for analytical purposes, for the purpose of sample preparation, or for the industrial production of molecules or particles.
  • the separation system and method that is the subject of the present invention aims to overcome the problem of compromise between the length of the separation device and the analysis time, and to accept solid impurities in the sample well above a few microns. . It is thus possible to obtain rapid separations, with a compact device, on an analytical scale as well as on a preparative scale, for a sample containing debris, for example cellular debris.
  • the present invention aims at a system for treating molecules or particles of interest conveyed by a viscoelastic liquid, which system comprises:
  • the particles or molecules of the sample are concentrated in the concentration zone upstream of the parallel channels, possibly with a separation according to the size and the electric charge, along lines of isocution (this is ie equal shears).
  • the modulating means is configured to control the electric field applying means for applying a decreasing electric field in time.
  • the molecules retained in the concentration zone during the concentration phase are continuously separated according to their types, charge or size.
  • the system further includes pressure modulating means for applying, after the concentration phase, a pressure different from the pressure applied during the concentration phase.
  • the concentration zone includes an open diaphragm perpendicular to the central axis of flow of the viscoelastic fluid in the concentration zone.
  • the concentration zone comprises a plurality of lumens or capillaries parallel to the central axis of flow of the viscoelastic fluid in the concentration zone.
  • the concentration zone includes an angle, the central axis of flow of the viscoelastic fluid along said angle as it passes through the concentration zone.
  • the system which is the subject of the present invention comprises a valve for orienting the viscoelastic fluid issuing from the concentration zone in two directions, one of the said directions leading to an instrument and / or a fraction collector. .
  • the present invention provides a system for treating molecules or particles of interest conveyed by a viscoelastic liquid, which system comprises:
  • the section of the arrival channel and the number of passes in the concentration zone are increased, which makes it possible to increase the concentration phenomenon and the volume of the treated sample, compared to what is described in FR 3,024,544.
  • the treatment systems that are the subject of the present invention which comprise a plurality of channels, are easily amenable to a change of scale, to pass from a capillary to a millimeter pipe or pipe, or even to bigger pipes.
  • An ultrafiltration device with microfiltration pores is thus obtained, thus with potentially higher flow rates and less clogging.
  • the single-channel device described comprises a progressive restriction of the section of the channel, so that there may be a separation of the molecules or analytes to be concentrated along the the section restriction.
  • flow and electric field conditions are set such that the molecules, in the outlet channels of the concentration zone, are plated so close to the wall that the electrophoresis force is stronger than the entrainment by the flow.
  • the molecules present in the channel up the flow along the wall. If the flow has a Poiseuille profile to the entrance of the channel, the molecules leave the channel, and concentrate upstream of the channels, in the concentration zone of larger section. If the flow has perturbations of the Poiseuille profile at the entrance of the channel, the molecules concentrate in this zone of disturbance at the entrance of the channel.
  • complexes which can include many small molecules, such as pollutants, steroids, etc.
  • nanoparticles especially those used as a drug delivery vector by the pharmaceutical industry
  • DRIE cronym for Deep Reactive Ion Etching
  • micro-precision machining to obtain holes whose diameter is of the order of a few microns to a few tens of microns.
  • the output channels are sized such that the average shear in these channels is strictly greater than the average shear present in the arrival channel of said device.
  • the average shear ratio between the inlet channel and each of the outlet channels of the concentration zone must be less than 0.01.
  • the system which is the subject of the present invention comprises a multi-capillary having linear channels, the concentration zone being on one side of this multi-capillary.
  • a multi-capillary is a capillary having several channels, or channels. To insert it into the device, it can be cut and glued between the inlet channel and the outlet pipe.
  • Multi-capillaries exist as optical fibers with photonic crystals. Multi-capillaries can also be manufactured by assembling a bundle of individual capillaries, and filling the interstices between capillaries with a resin.
  • the concentration zone comprises a plurality of cones formed in a diaphragm perpendicular to the central axis of fluid flow at the outlet of the concentration zone.
  • the electric field application means is configured to apply a progressive decay of the electric field after the concentration phase, to separate the previously concentrated molecules.
  • the present invention provides a kit for operating the system object of the present invention, which comprises the viscoelastic liquid.
  • kits object of the present invention can be combined in one kit.
  • one or the other of these kits object of the present invention may comprise, in addition:
  • FIGS. 1, 2 and 3 show, schematically and in section, particular embodiments of a concentration device for the system that is the subject of the present invention
  • FIG. 5 represents a particular embodiment of the system that is the subject of the present invention
  • FIG. 8 represents a variant of the device illustrated in FIG. 3,
  • FIG. 9 schematically represents a monocapillary concentration device
  • FIG. 10 schematically represents a multi-capillary device, embodiment of the invention
  • FIG. 12 is a scanning electron microscope image of the multicapillary illustrated in FIGS. 10 and 11,
  • FIG. 13 is a pair of photographs taken during the concentration, at the beginning and at the end of concentration
  • FIG. 14 represents curves of evolution of the fluorescence intensity during the concentration
  • FIG. 15 represents, schematically and in section, a first particular embodiment of the system which is the subject of the present invention.
  • FIGS. 16A to 16E represent, in section, a part of the system illustrated in FIG. 15 during five operating phases of this system
  • FIG. 17 shows coupling curves showing the influence of the electric field on the speed of DNA fragments
  • FIGS. 18A to 18E represent, in section, a part of one of the systems illustrated in FIGS. 15 to 16E, during a succession of steps of separation of molecules or particles of interest,
  • Figures 19 to 22 show, schematically and in section, particular embodiments of a concentration device for the system object of the present invention
  • Figures 25 and 26 show, in the form of DNA migration plots, the effects of the implementation of the present invention.
  • a plurality of channels are used in which a viscoelastic fluid flows by applying a pressure difference between the two ends of the channels.
  • FIG. 1 shows part 100 of a first embodiment of the concentration, stacking and / or purification device for analysis.
  • This part 100 comprises an arrival channel 105, a concentration zone 1 10 at the input of parallel output channels 135 and an outlet duct 1 15.
  • a hydrodynamic or electrokinetic injection of a sample 130 is first performed, according to conventional methods in capillary electrophoresis or in chromatography.
  • the arrival channel 105, the concentration zone 1 10 and the outlet line 1 15 have been filled beforehand with the viscoelastic fluid.
  • the sample 130 has also been diluted in this viscoelastic fluid.
  • the concentrated molecules are then migrated by simple pressure, with a zero electric field, as illustrated in FIG. 2.
  • the concentrate is thus transferred from the concentration zone to the outlet pipe 1 15.
  • the concentrated molecules can be migrated by electrophoresis.
  • the flow is stopped, and an electric field is applied bringing the molecules to the output of the device 100.
  • a second mode of use of the device it is desired to recover only a part of the molecules or particles that have been concentrated. For example, one is interested in recovering a given nucleic acid size, eliminating shorter fragments and fragments longer than this size. It can be the same for proteins, particles, cells, ...
  • a separation phase is carried out between the concentration phase and the collection phase.
  • the separation can take place by simple electrophoresis in the outlet line 1 15.
  • a neutral polymer is chosen to make the liquid viscoelastic, so that the viscoelastic fluid also constitutes an electrophoretic separation matrix of the molecules or particles of interest.
  • the separation can also take place as described above and in the patent application FR 2,994,103; in this embodiment, the outlet channels 135 of the concentration zone 1 10 are elongated beyond what is necessary for the single concentration phase, and can moreover substitute for the outlet pipe 1 15. Opposite pressure and tension are then applied, and the particles or molecules separate in a distribution. They eventually pass in front of the optional detector 120, to be detected and analyzed.
  • the collection of the molecules or particles of interest then takes place at the outlet of the multi-capillary 135, possibly extended by an outlet pipe 1 15, by the means of the state of the art, for example using a fraction collector or a suitable valve.
  • the detector 120 may advantageously be used to control the collection function of the molecules or particles of interest, for example to control the start and the end of the collection as a function of the measured migration times.
  • the separation is carried out by configuring the application means of the electric field to apply a progressive decay of the electric field E after the concentration phase, to separate the molecules.
  • the separation thus takes place by decreasing progressively, or in stages, the electric field E applied during the concentration. It is noted that if, after the concentration phase, the intensity of the electric field E is gradually reduced, for example according to a decreasing linear function, this has the effect of causing the molecules or particles of interest to pass through the channels 135. defining the concentration zone 1 10, then in the outlet pipe 1 and the detector 120 (if it exists), successively according to their sizes and electrical charges.
  • a concentration zone 1 having a plurality of cones (see FIG. 8) formed in a diaphragm perpendicular to the central flow axis. fluid at the outlet of the concentration zone 1 10.
  • the angle formed by the inlet walls of the channels with the axis common to the channels has an effect on the concentration.
  • An important angle, giving a short cone, generates steep force gradients and a pickup zone 1 10.
  • a small angle, corresponding to an elongated cone generates weaker force gradients and a larger area of concentration.
  • An advantage of the embodiments in which the channels 135 have entry cones, particularly with respect to the embodiments in which the channels 135 open perpendicularly to the wall, is that the concentration device operates at the same time a certain degree of separation among the molecules or concentrated particles.
  • the smallest or least charged molecules or particles are located closest to the neck of the cones of the concentration zone 1 10. During the possible separation and detection step, they remain in front of the slower molecules or particles and therefore do not need to double them.
  • sample volume 130 can be injected into the device than is possible in conventional capillary electrophoresis or with a single-channel concentration device 135.
  • sample 130 undergoes purification: the molecules or particles that are not loaded or charged in opposite sign of the molecules or particles of interest are eliminated from the sample. Molecules or charged particles of the same sign as the molecules or particles of interest but too small or insufficiently charged are also removed from the sample. In particular, the salts contained in the sample are removed during the concentration. This purification increases the quality of separation, in degree of purity of the molecules or particles after collection.
  • DRIE cronym for Deep Reactive Ion Etching
  • conical holes called "typing" in laser machining.
  • a multi-capillary 410 having linear output channels 415 separates two channels 405 and 420 with the same inner and outer sections.
  • This embodiment may, for example, be achieved by sleeving or gluing or welding of its constituents.
  • the outlet pipe 420 may have an internal section different from that of the arrival channel 405.
  • a multi-capillary 410 is a capillary having several channels, or channels. To insert it into the device, it is cut and glued between the channels 405 and 420. Compared with the embodiment illustrated in FIGS. 1 and 2, expensive machining is avoided and channels or channels of any kind can be avoided. desired lengths. Multi-capillaries exist as photonic crystal optical fibers, for example under the trademark NKT Photonics.
  • a minority or at least partial flow goes into the outlet capillaries 530, so the concentration is not 100%.
  • a concentration close to 100% can be obtained.
  • the sum of the sections of the parallel channels may be equal to or greater than the section of the arrival channel and / or the outlet duct.
  • the hydrodynamic resistance of a set of capillaries is much greater than the hydrodynamic resistance of a cylindrical channel of section equal to the sum of the sections of the capillaries.
  • concentration, stacking or separation device described with reference to FIGS. 1, 2, 3 and 4 functions for the analysis of macromolecules and nanoparticles for the life sciences, therefore in aqueous solution, as well as for organic solutions and microparticles.
  • the device 705 is any of the devices described with reference to FIGS. 1 to 4. It comprises:
  • means 725 for applying an electric field between the input and the output of the concentration zone, the action of the electric field on the molecules or particles of interest being, in the concentration zone, opposite to the said flow and causing the retention of molecules or particles of interest at least in the concentration zone and
  • the electric field has an intensity less than or equal to the electric field applied during the concentration phase, for example according to a linear decreasing slope or by step or a zero intensity immediately after the end.
  • the application of the concentration phase It can also be in the opposite direction to that used for the concentration, and strong or weak depending on the characteristics of the electrophoresis that is applied then.
  • a simple detector for example optical (absorbance, fluorescence, refraction), conductimetric, electrochemical, ...
  • a valve system for collecting only the molecules or particles selected by the concentration and separation device is provided.
  • FIGS. 6 and 7 show a multicapillary 800 comprising, in a cylinder 805, parallel cylindrical channels 810.
  • a sleeve 815 may be added to assist the assembly of the multicapillary 800 with a means 715 for laminar flow of the liquid .
  • state-of-the-art multi-physics modeling tools such as COMSOL software, can find the necessary dimensioning, solving by finite elements the Navier-Stokes equations.
  • the arrival channel in the concentration zone is a cylindrical pipe of radius Ri
  • the plurality of outlet channels of the concentration zone consists of n identical cylindrical channels of radius R2.
  • Equation 2 dz ⁇ 3 ⁇ 4 , dz being an infinitesimal unit of length.
  • the rate Q is identical in the arrival channel and in the plurality of the output channels. From where :
  • Equation 3 dx. dz, indices 1 and 2 referring to the arrival channel and the plurality of output channels respectively.
  • Equation 4 with the velocity of the fluid at any point situated at the distance r from the axis of the pipe, and E * o the maximum velocity of the fluid, at the center of the pipe.
  • Equation 5 " xax *
  • the shear stress is defined by definition:
  • Equation 6 - dr, ⁇ dynamic viscosity of the fluid.
  • Equation 8 ⁇ TM *> ' ⁇ ⁇
  • Equation 9 a nR A , L length of the pipe. So, per unit length:
  • Equation 10 d ⁇ m
  • Equation 1 3 ⁇ 4 ⁇ 2 ⁇
  • Equation 1 1 Equation 1 1 becomes:
  • Equation 13 ? ⁇ £?> N
  • the number of the output channels is at least 10000, then a shear ratio greater than or equal to 100 can be obtained, while the sum of the sections of the output channels is equal to the input section. The greater the number of channels, the more that is possible.
  • Poiseuille equations used above are true for a Newtonian liquid, whereas the implementation of the present invention requires a viscoelastic liquid.
  • the Poiseuille equations are true when the viscosity ⁇ is independent of the shear.
  • the viscosity of a fluid is a property distinct from its elastic properties, and there are polymers that make the liquid viscoelastic, while the viscosity remains constant over a wide range of shear.
  • the developer of a device does not have a viscoelastic fluid allowing the concentration of molecules or particles of interest under conditions where the viscosity of the fluid is constant
  • the developer uses a multiphysical simulation as mentioned above, in using the most general form of the Navier-Stokes equations, which involves a tensor of viscous stresses, and experimentally determining the parameters of this tensor.
  • the ratio of the shears to be implemented between the arrival channel and the outlet channels of the concentration zone depends on the intended application and the time that is given for the desired concentration. If the sample to be concentrated consists of a population of molecules or particles strictly identical, the shear ratio does not necessarily need to be important; it is sufficient to regulate the flow velocity and the electric field in such a way that the molecule to be concentrated advances with the flow in the arrival channel, and recedes by electrophoresis along the walls in the outlet channels, as explained above. above.
  • the molecules to be concentrated are quite strongly plated towards the walls in the arrival channel, and they only advance slowly in this channel, limiting the speed of concentration.
  • it is advantageous to increase the shear ratio so that the molecules are little pressed to the walls, and therefore not slowed down, in the flow of the inlet channel.
  • the shear must be adjusted so that the most small and / or least charged, which are the most difficult to stop in the flow, recede by electrophoresis into the outlet channels, while the larger and / or more charged molecules, which undergo veneering to the wall most important, move fast enough in the arrival channel.
  • the shear ratio to be used depends on the heterogeneity of the molecules to be concentrated. For DNA fragments between 0.1 and 1.5 kb, or between 0.5 and 50 kb, a shear ratio greater than 100 is preferably used.
  • FIGS. 9 to 14 an experimental demonstration of a concentration of DNA using a section of multi-capillaries is given.
  • Figure 9 shows a diagram of a monocapillary concentration device.
  • Fig. 10 shows a multi-capillary device diagram according to aspects of the invention. These schematic diagrams illustrate the concentration of DNA in a simple system (capillary fitting, FIG. 9) and in the case of a multi-capillary device.
  • the multi-capillary device of FIG. 10 was made by inserting a multicapillary 605 of length 3 cm and having 61 capillaries of 40 ⁇ m diameter in two hematocrit tubes 610 and 615 of length 60 cm and internal diameter 1.1 mm (FIG. 1 and 12), located on both sides of the multi-capillary.
  • a voltage is applied across the device thereby creating an electric field in the multicapillary 605 between 45 and 270V / cm, electric field exerting on the DNA a force opposite to the hydrodynamic flow.
  • the electric field is applied for one minute.
  • the DNA is then mainly concentrated at the entrance of the channels of the multicapillary 605. Then the pressure is cut off, while the electric field is still applied.
  • the DNA migrates by electrophoresis from right to left, and the concentrate is observed in the hematocrit tube at the start of this electrophoresis (FIG. 13).
  • the volumes treated are between 10 and 30 ⁇ .
  • the concentration step we observe an increase in fluorescence intensity at the junction between the multicapillary and the hematocrit tube ( Figure 14).
  • Figure 1 1 Photograph of the multi-capillary concentration device
  • Figure 12 scanning electron microscope image of the multicapillary 605 having been used to make the device
  • Figure 13 Photographs taken during the concentration, that of the top at the beginning of concentration, that of the bottom at the end of concentration
  • Figure 14 Evolution of the fluorescence intensity during the concentration for a pressure of 1 OOmBar and different voltages. The cessation of the concentration takes place at the time of about 60 seconds.
  • FIG. 15 shows a portion 1100 of an embodiment of the concentration, stacking and / or purification device for the purpose of the present invention.
  • This portion 1 100 comprises an injection capillary 1 105, for example with a diameter of 250 ⁇ , a concentration zone 1 1 10 a separation capillary January 1, for example with a diameter of between 50 ⁇ and 75 ⁇ , a detector 1,120 optional and an output 1,125.
  • the concentration zone 11 may be conical, straight or have a plurality of channels. Electrodes 1 106 and 1 107 brought to different electrical potentials, generate an electric field in the whole of the fluid present in the part 1 100. A means 1 108 of modulation of this electric field makes, according to the present invention, vary the potential difference between the electrodes 1 106 and 1 107, as explained below.
  • a hydrodynamic or electrokinetic injection of a sample 1130 is first performed according to conventional methods in electrophoresis. capillary.
  • the injection capillary 1 105, the concentration zone 11 and the separation capillary 11 were filled beforehand with the viscoelastic fluid.
  • the sample 1 130 has also been diluted in this viscoelastic fluid.
  • the inlet of the injection capillary 1 105 is placed in the vial containing the fluid or viscoelastic buffer and a pressure differential and an electric voltage differential are applied between the inlet of the injection capillary 1 105 and the outlet 1 125 of the separation capillary 1 1 15.
  • the action of the electric field is opposite to the flow of viscoelastic buffer, the direction of the electric field depending on the sign of the charge of the molecule / particle to focus.
  • the particles or molecules 1,135 of the sample 1,130 concentrate in the concentration zone 11 with a separation according to the size and the electric charge, along lines of isocussing (c '). that is, equal shears).
  • the implementation of the concentrate for the separation 1 140 is then carried out.
  • the differential pressure and electrical voltage are eliminated.
  • the molecules or particles concentrated from the end of the concentration zone 1 1 to the beginning of the separation capillary 1 1 are migrated by simple electrophoresis.
  • This separation plug has a length independent of the initial volume of the injection plug. .
  • the concentrated molecules are migrated by simple pressure, with a zero electric field.
  • the concentrate is transferred from the concentration zone to the starting zone for analysis (“injection plug") or simply for the collection of concentrated and purified molecules.
  • an additional separation by modulation of the applied electric field, and detection is then optionally carried out.
  • the separation can take place either by simple electrophoresis or by separation as disclosed in the patent application FR 2 994 103, by applying pressure and tension in opposite directions.
  • a detector 1 120 when the particles or molecules 1 135 separated according to the distribution 1 145 thus obtained, pass in front of this detector 1120, they are detected and analyzed.
  • the angle formed by the walls of the concentration zone 11 with the central axis common to the capillaries 1 105 and 1 1 has an effect on the concentration.
  • a large angle, giving a short cone, generates abrupt force gradients and a pickup area 1 1 10.
  • a small angle, corresponding to an elongated cone generates weaker force gradients and a larger area of concentration.
  • An advantage of this embodiment is that the fastest molecules or particles are closest to the neck of the concentration zone 1 1 10. During the separation and detection step ( Figure 16E), they stay in front of slower molecules or particles and do not need to double them.
  • a sample volume 1130 can be injected into the device much higher than is possible in conventional capillary electrophoresis. Indeed, in conventional capillary electrophoresis, it is necessary to keep a reasonable size of the injection plug, otherwise lose in analysis resolution.
  • sample 1130 undergoes purification; the molecules or particles that are not loaded or charged in opposite sign of the molecules or particles of interest are eliminated from the sample. Molecules or charged particles of the same sign as the molecules or particles of interest but too small or insufficiently charged are also removed from the sample. In particular, the salts contained in the sample are removed during the concentration. This purification increases the quality of separation.
  • Figure 1 shows, for a single capillary, without concentration, with a fixed detector, located 12 cm from the entrance, coupling curves showing the influence of the electric field on the speed of DNA fragments.
  • a mixture of different sizes is introduced at the inlet of the capillary, then pressure and electric field are applied in opposition.
  • Curves 1101 to 1158 correspond to DNA fragments of size 0.5 kb, 1 kb, 1.5 kb, 2 kb, 3 kb, 5 kb, 10 kb and 48.5 kb, respectively.
  • the curves 1 151 to 1 158 are obtained in buffer TBE + PVP 1%.
  • the applied voltage varies from 0 to 4 kV (electric field from 0 to 40 V / cm).
  • the arresting electric field depends on the size of the DNA fragments. So, for some fields, the smaller fragments (1 kb) will not be stopped, while the larger fragments are stopped (or go back).
  • the fluid velocity at which these curves are acquired may be the velocity at the neck of the concentrator. So we see that, depending on the electric field, some fragments pass the neck, and others do not.
  • FIGS. 18A to 18E show an improvement of the concentration device, for increasing the separation of the particles and molecules retained in the concentration zone, for their analysis.
  • FIGS. 18A to 18E there is an injection capillary 1205, a concentration zone 1210 and a separation capillary 1215.
  • the applied electric field has been represented by the arrows 1220 to 1240, respectively in FIGS. 18A to 18E. .
  • the length of these arrows is representative of the intensity of the applied electric field.
  • the molecules and particles of interest are retained in the concentration zone 1210, and disposed at a distance from the neck of junction between this concentration zone 1210 and the capillary 1215, which is a function of their electrical sizes and charges and the intensity of the electric field 1220.
  • the applied electric field is reduced, for example by 10%, as illustrated by the arrow 1225 in FIG. 18B.
  • the molecules and particles of interest closest to the neck then cross the neck and enter the separation capillary 1215 while the other molecules and particles of interest remain in the concentration zone 1210. If the electric field 1225 is maintained, the particles which have already penetrated into the separation capillary 1215 are entrained by the viscoelastic fluid in laminar displacement and reach the detector placed downstream of the neck.
  • the intensity of the electric field is continued to be reduced, for example according to a decreasing linear function. This has the effect of passing the molecules or particles of interest in the neck successively according to their sizes and electrical charges.
  • the separation between two detection peaks of molecules or particles can be adjusted by modulating the rate of decrease of the intensity of the electric field. It is possible, for example, to carry out bearings, which leads to the formation of size and charge bearings of the molecules and particles passing in front of the detector.
  • This stepwise mode of operation is particularly well suited for preparing DNA fractions per size range, or fractions of other analytes depending on their types, sizes or charges. This stepwise mode of operation is illustrated in Figures 36 and 37 described below.
  • the system that is the subject of the present invention comprises a modulation means configured to control the means for applying the electric field to apply, after the concentration phase, an electric field of intensity that is non-zero and less than the intensity. the electric field applied during the concentration phase.
  • the velocity of the viscoelastic fluid is also modified to achieve the output of the concentrated sample.
  • microfluidic chips are used whose vein height is fixed and low, for example 10 ⁇ .
  • the width of the channel is decreased, without modifying its height.
  • These embodiments have the advantage that the molecules to be retained have very little way to go to reach their stopping position near the wall. It is thus possible to achieve larger differences in width.
  • devices 1250 as shown in FIG. 19 in which the width of the injection capillary 1255 is between 300 and 1000 ⁇ , in particular 600 ⁇ , and the width of the neck 1260 is 10 to 20 ⁇ , and angle formed between the side walls of the concentration zone with the central axis of the channel from 10 ° to 45 °.
  • the concentration zone is followed by a symmetrical zone 1265, the separation capillary 1270 having the same width as the injection capillary 1255.
  • At least a portion of the concentration of molecules or particles of interest is downstream of the neck separating the restriction zone of the separation capillary.
  • the modulation means, or electric valve, of the device of the present invention also functions in these cases where it is concentrated downstream of the neck or collars of the concentrator ("inertial" concentrator).
  • FIG. 21 represents an alternative embodiment of the devices illustrated in FIGS. 15 to 20.
  • the concentration zone 1315 has an angle of 90 ° with the central axis of the injection and separation capillaries 1305 and 1320.
  • These capillaries have the same external diameter but channels 1310 and 1325 of different internal diameters. This change in internal diameter constitutes a diaphragm perpendicular to the central axis of the flow of the viscoelastic liquid.
  • the advantage of this embodiment is that it can be achieved by bonding two capillaries with constant outer sections, so also by sleeve.
  • the concentration volume is greater than in configurations having a beveled portion or cone. This increases the capacity of the system and thus reduces the effects of wall adsorption.
  • the concentrated molecules or particles are not separated according to their type, size or charge during the concentration phase.
  • FIG. 22 shows an embodiment consisting of the joining of two capillaries 1505 and 1515, the intersection 1510 of these capillaries forming an angle, here a right angle. At this intersection 1510 is the zone of concentration of the molecules or particles of interest. It is noted that the capillary 1505 can be replaced by a tank, or directly constitute the sample tank.
  • the concentration, stacking or separation device described with reference to FIGS. 15 to 22 functions on capillary electrophoresis, the analysis of macromolecules and nanoparticles for the life sciences, therefore in aqueous solution, as well as for organic solutions and the microparticles.
  • Fig. 23 shows an improvement applicable to all embodiments. This improvement consists in positioning a valve 1620 between, on the one hand, a device 1600 comprising an injection capillary 1605, a concentration zone 1610 and a separation or outlet capillary 1615 and, on the other hand, a capillary of rejection 1625 or input capillary 1630 of an analytical instrument or analytical preparation instrument or simply a collection container.
  • the valve 1620 is, for example, a rotary valve of HPLC type (high performance liquid chromatography).
  • the rotary valve 1620 evacuates the viscoelastic fluid and the molecules and particles not retained in the concentration zone towards the rejection capillary. In contrast, for analysis or collection, the rotary valve 1620 directs the viscoelastic fluid and the molecules or particles of interest to the detector or instrument.
  • the device When the device is used for preparative purpose on a laboratory scale, it is coupled to a fraction collector as conventionally used in chromatography techniques.
  • the process for treating molecules or particles of interest conveyed by a viscoelastic liquid comprises:
  • a step 1950 of laminar flow, during at least one so-called “concentration phase", of the viscoelastic liquid in a concentration, stacking and / or purification device said device comprising a concentration zone having, in the direction said flow, an inlet section surface greater than the sectional area of each outlet channel,
  • Figures 25 and 26 demonstrate the electric valve effect achieved by the practice of the present invention.
  • a bearing at 5 kV allows to pass what is lower than 300 bp, and to retain 300 bp and all that is higher than 300 bp.
  • the pressure is increased to 7 bar, leaving the voltage at 15 kV for 1 minute, voltage used during the concentration phase.
  • Figure 26 Separation by applying the 2020 electric field gradient, which is identical to that applied to obtain the curve of FIG. 25, except that a 2020 step at 5 kV of the minute 2 was added to 7. By applying this voltage gradient 2020, the electropherogram 2025 is obtained.
  • the present invention also provides a kit for implementing the system object of the present invention or for the operation of the system object of the present invention, which comprises the viscoelastic liquid.
  • the present invention also aims at a kit for implementing the system which is the subject of the present invention or for the operation of the system which is the subject of the present invention, which comprises the device for concentration, stacking and / or purification, said device having a concentration zone having, in a direction of flow, at least one outlet channel, each channel preferably being dimensioned so that the average shear in that channel is much greater, at least twice, than the average shear present in the arrival channel of said device.
  • kits object of the present invention can be combined in one kit.
  • one or the other of these kits object of the present invention may comprise, in addition:

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Abstract

Le système (700) de traitement de molécules ou particules d'intérêt véhiculées par un liquide viscoélastique, comporte: -un moyen (715) de mise en écoulement laminaire, pendant au moins une partie, dite «phase de concentration», de la durée de fonctionnement du système, du liquide viscoélastique dans un dispositif (705) de concentration, stacking et/ou de purification, ledit dispositif comportant une zone de concentration présentant, dans le sens dudit écoulement, une surface de section en entrée supérieure à la surface de section de chaque canal en sortie et -un moyen (725) d'application d'un champ électrique entre l'entrée et la sortie de la zone de concentration pendant la phase de concentration, l'action du champ électrique sur les molécules ou particules d'intérêt étant, dans la zone de concentration, opposée au sens dudit écoulement et provoquant la retenue de molécules ou particules d'intérêt au moins dans la zone de concentration; qui comporte, de plus, un moyen (730) de modulation configuré pour commander le moyen d'application du champ électrique pour appliquer, après la phase de concentration,un champ électrique d'intensité non nulle et inférieure à l'intensité du champ électrique appliqué pendant la phase de concentration.

Description

SYSTÈME DE CONCENTRATION, PRÉCONCENTRATION PAR EMPILEMENT D'ÉCHANTILLON ET/OU PURIFICATION POUR ANALYSE
DOMAINE TECHNIQUE DE L'INVENTION
La présente invention vise un système de concentration, préconcentration par empilement d'échantillon (« stacking ») et/ou de purification pour analyse ou pour préparation d'échantillons chimiques ou biologiques. Elle s'applique, en particulier, à la concentration, à la préconcentration (« stacking ») et à la purification en ligne en amont d'instruments de préparation d'analyses ou d'instruments d'analyse, par exemple par électrophorèse capillaire.
ETAT DE LA TECHNIQUE
En chimie analytique, ou en analyse biologique in vitro, il est très fréquent de devoir concentrer et purifier un échantillon avant de l'analyser.
Ainsi, une analyse par électrophorèse capillaire nécessite des échantillons suffisamment purs et concentrés. L'électrophorèse capillaire est une technique analytique qui permet une haute efficacité de séparation sur les petites et grosses molécules. L'instrument d'électrophorèse capillaire est composé d'un capillaire de silice fondue avec fenêtre de détection, une source de haute tension, deux électrodes, deux réservoirs de tampon et un détecteur optique d'absorbance ou de fluorescence.
Après avoir rempli le capillaire de solution tampon, on injecte l'échantillon à l'entrée du capillaire. Une tension est appliquée aux bornes du capillaire. Les molécules sont alors séparées selon un flux électroosmotique et électrophorétique.
Pour augmenter la sensibilité de l'analyse, on utilise souvent une détection à fluorescence induite par laser (LIF) ou diode électroluminescente (LEDIF), dans laquelle l'analyte est marqué par un fluorochrome qui est détecté et/ou quantifié par fluorescence induite. Cette technique de détection est plus sensible et plus sélective que la détection classique par absorbance de lumière UV. En effet, seules les molécules qui fluorescent naturellement ou dérivées chimiquement sont détectées.
Une autre façon d'augmenter la sensibilité de l'analyse, avec ou sans détection de fluorescence induite par laser ou diode électroluminescente, est d'utiliser des techniques de pré-concentration en ligne, encore appelée « stacking ». La technique de la préconcentration par empilement d'échantillon (plus connue de l'homme du métier sous le terme anglais de « stacking » et ci-après désignée par « stacking ») la plus fréquemment utilisée (Field- Amplified Sample Stacking) est basée sur une différence de conductivité entre le tampon d'analyse et l'échantillon. Le fait de diluer l'échantillon dans l'eau avant injection plutôt que dans du tampon entraîne une accumulation frontale de l'échantillon et contribue à obtenir des pics plus hauts et plus fins, donc une meilleure sensibilité d'analyse et une meilleure résolution. D'autres techniques de pré-concentration en ligne existent pour l'électrophorèse capillaire. Elles nécessitent presque toutes de pouvoir maîtriser finement le contenu en ions de l'échantillon et du tampon d'analyse, ce qui peut obliger à devoir purifier préalablement l'échantillon.
Le document US 2008/0087546 expose une technique de concentration et de séparation en ligne d'analytes électriquement chargés. Cette technique repose sur une focalisation des molécules là où une force électrique et un flux hydrodynamique s'équilibrent dans un gradient de champ provoqué par une variation de section le long de l'axe d'écoulement. Dans cette technique, il faut que le gradient de champ électrique et le gradient de flux hydrodynamique soient différents pour que les molécules d'intérêt s'accumulent au point d'équilibre. Or, dans un canal formé de parois solides et isolantes, si l'on applique une pression et une tension aux deux extrémités du canal remplit d'un électrolyte, la vitesse du flux hydrodynamique et le champ électrique, donc la force électrique appliquée sur la molécule, varient tous les deux proportionnellement à l'inverse de la section du canal. Pour introduire une différence entre ces deux gradients de force, l'invention introduit une chambre d'électrodes séparée de la chambre de concentration/séparation par une membrane semi- perméable, qui permet, grâce au pilotage individuel d'électrodes, d'appliquer un gradient de champ électrique différent du gradient de flux hydrodynamique dans la chambre de concentration/séparation. Alternativement, les électrodes sont placées directement dans la chambre de concentration/séparation. Cette technique est élégante, mais elle complique considérablement la fabrication du dispositif et le problème d'évacuation des bulles formées aux électrodes lors de l'application du champ électrique.
Le document US 2005/0034990 décrit également une méthode de concentration d'analytes chargés par équilibre entre une force électrique motrice de l'analyte, et un contre- flux hydrodynamique, contre-flux lui-même induit indirectement par le champ électrique appliqué grâce au phénomène d'électroosmose. Le canal d'écoulement doit donc contenir au moins une paroi chargée de même signe que l'analyte pour provoquer cet écoulement. De façon à obtenir un gradient de flux hydrodynamique, le dispositif de concentration est constitué d'un canal d'écoulement passant d'une grande section à une petite section. L'analyte avance sous la force électrique dans le canal de grande section, mais est bloqué par l'écoulement hydrodynamique rapide sortant du canal de petite section. Le document ne décrit cependant pas de moyen clair pour faire varier différemment le gradient de flux hydrodynamique et le gradient de champ électrique selon la section de l'écoulement, comme expliqué plus haut. Le phénomène de concentration est donc instable, difficile à maîtriser et nécessite, pour des raisons physiques mal comprises, l'utilisation de très petits canaux, inférieurs à 5 μηη, de préférence inférieurs à 1 μηη. Le document FR 3 024 544 propose également une méthode de concentration en ligne fondée sur un équilibre entre un entraînement hydrodynamique et une contre-force électrique. Cette méthode doit nécessairement prendre place dans un canal suffisamment fin pour que l'écoulement soit laminaire et avec un cisaillement significatif à l'échelle des molécules ou des particules à concentrer. De plus, le fluide porteur doit être viscoélastique. Les molécules à analyser se trouvent dans cet écoulement. Lorsqu'un champ électrique est appliqué qui génère une force opposée à la direction de l'écoulement, les molécules chargées électriquement subissent une contre-électrophorèse et se déplacent à une vitesse plus lente que celle du fluide qui les entoure. De ce fait, les molécules déforment l'écoulement à leur voisinage. A cause du cisaillement non négligeable à l'échelle des macromolécules et à cause des propriétés viscoélastiques du fluide, l'écoulement exerce une contre-réaction sur les molécules, perpendiculaire à l'écoulement, qui repousse les molécules vers les parois. L'intensité de la force dépend de la nature du fluide, du taux de cisaillement, de la taille de la molécule et de l'intensité de la force d'électrophorèse et donc du champ électrique appliqué. Dans un canal de section constante, les molécules se répartissent donc le long d'un axe transverse à l'écoulement, selon leur taille. Dans un flux laminaire, la vitesse de l'écoulement dépend de la position. Les molécules sont donc poussées par l'écoulement à des vitesses différentes et sont donc séparées selon leur taille. Cette technique de séparation a été appliquée notamment à la séparation de fragments d'ADN.
En choisissant la géométrie de l'écoulement laminaire, on peut créer par ailleurs des conditions où les molécules d'intérêt sont arrêtées en un point précis du dispositif, alors même que l'écoulement de l'échantillon est toujours présent. On peut ainsi concentrer en ligne ces molécules pour ensuite les analyser ou les purifier. L'analyse se fait ainsi avec une très haute sensibilité du fait de la concentration réalisée par le dispositif.
Par exemple, pour un canal présentant un cône d'entrée, formant un goulet d'étranglement, avec une réduction linéaire de la plus grande dimension de la section perpendiculaire à la direction d'écoulement, la restriction progressive génère une accélération du fluide et donc du cisaillement, ainsi qu'une augmentation du champ électrique opposé à l'écoulement. Il y a donc, dans le sens où la section du canal décroît, un accroissement de la force transverse au fur et à mesure de l'avancée vers la restriction. Quand les molécules se trouvent à une distance de la paroi telle que leur vitesse liée à l'écoulement est égale à leur vitesse d'électrophorèse en direction contraire, les molécules s'arrêtent, alors même que l'écoulement est toujours présent. Il y a donc accumulation des molécules à cet endroit, et donc concentration. On note que le mouvement brownien provoque une répartition aléatoire dans le profil parabolique de l'écoulement. La force transverse d'origine viscoélastique modifie le barycentre du nuage de points, en tassant les molécules vers la paroi.
On note que cette méthode permet non seulement de concentrer les molécules, mais aussi éventuellement de les séparer. La séparation dépend de la géométrie de restriction de chaque canal : un cône long, avec un angle faible, répartit les molécules selon leur taille sur une plus grande longueur qu'un cône court présentant un angle élevé.
On note aussi que cette méthode constitue aussi un filtre passe-bas : toutes les molécules en dessous d'une certaine taille ou d'une certaine charge passent librement dans les canaux.
Mais comme dit ci-dessus, cette méthode a nécessairement lieu dans un canal d'assez petite dimension, ce qui limite le volume d'échantillon que l'on peut traiter. De plus, le pouvoir séparateur de cette méthode est médiocre, car il est limité par la longueur sur laquelle a lieu la restriction de section du canal.
Les techniques d'augmentation de la sensibilité de l'analyse de l'état de l'art ne sont pas toujours suffisantes pour éviter de devoir concentrer l'échantillon au préalable d'une analyse. Le chimiste ou le biologiste doit alors concentrer l'échantillon en amont de l'analyse, souvent manuellement. Ainsi, en biologie moléculaire, ou en immunologie, il existe de nombreux kits manuels permettant de purifier et de concentrer son échantillon avant analyse. Ces étapes off-line de purification et de concentration sont longues et fastidieuses, parfois coûteuses, et comportent un risque de perdre ou de détériorer l'échantillon au cours des opérations.
Cette problématique de pureté des échantillons et de leur concentration est une problématique générale de l'analyse en chimie ou en biologie. Elle est présente pour toutes les analyses, comme l'électrophorèse en gel, les chromatographies, les analyses optiques (spectrales, chirales, de fluorescence, d'absorption, de turbidité,...), les spectrométries de masse, les tests homogènes de binding comme les immunoanalyses, les tests électrochimiques, le séquençage de l'ADN, etc. Quelles que soient les analyses, il est souvent intéressant de disposer d'une méthode de pré-concentration en ligne des échantillons, qui fonctionne même avec des échantillons non ou faiblement purifiés. Dans le cas contraire, l'opérateur doit mettre en œuvre des méthodes de purification et/ou de concentration en amont de l'analyse, avec les inconvénients déjà cités ci-dessus dans le cas de l'électrophorèse capillaire.
La pureté et la concentration des produits biochimiques ou biologiques est aussi une problématique que l'on rencontre en bio-production de produits actifs pour la santé. Dans ce type de production, on part d'un grand volume de produit, par exemple un volume de cellules, contenant le produit d'intérêt, suspendues dans leur milieu de culture, et on veut obtenir en fin de processus le produit thérapeutique extrêmement pur dans un volume typiquement 100 à 1000 fois plus faible que le volume de départ. Le processus est composé en général de plusieurs étapes, qui dépendent du produit thérapeutique à purifier. Très souvent, les premières étapes comportent une ou plusieurs chromatographies qui permettent à la fois de purifier et de concentrer en partie le produit. Très souvent aussi, la dernière étape est une ultra-filtration pour concentrer le produit purifié. Dans ces procédés, le rendement et la vitesse de chaque étape sont des critères clés de pilotage pour le développement du processus industriel. Multiplier les étapes permet souvent d'obtenir de très bonnes puretés de produit, mais augmente les coûts directs et indirects de production, d'autant plus que cette multiplication d'étapes diminue les rendements. Il est donc avantageux de disposer de procédés permettant à la fois de purifier et de concentrer dans un temps court, donc avec un fort débit.
Il faut aussi noter ici que le compromis entre longueur du système de séparation et pouvoir séparateur de la technique séparative est un problème récurrent dans le domaine de la chimie analytique, surtout à l'échelle préparative qui demande à traiter de grands volumes d'échantillons. En chimie analytique, ou en analyse biologique in vitro, les techniques séparatives les plus utilisées sont les techniques d'électrophorèse et les techniques de chromatographie.
Dans les techniques d'électrophorèse, les molécules ou particules chargées de l'échantillon, qui sont en solution ou en suspension dans un milieu aqueux, sont placées dans un champ électrique. Elles migrent alors sous la force induite par le champ électrique, à une vitesse qui dépend à la fois de leur charge et de leur taille. Au bout d'un certain temps de migration, et donc d'une certaine distance de migration, les molécules sont séparées et peuvent être détectées de façon bien distincte.
Pour les analytes, molécules ou particules, d'une taille élevée par rapport à la longueur de Debye, qui est l'épaisseur de la couche ionique entourant l'analyte chargé pour assurer l'électroneutralité de la solution, c'est uniquement la densité de charge qui conditionne la vitesse de migration des analytes en solution libre. Pour pouvoir séparer des molécules de même nature chimique, donc de même densité de charge, mais de taille différente, il faut introduire une matrice, en général sous la forme d'un gel d'un polymère hydrophile neutre, qui sert de tamis moléculaire. C'est ainsi que l'on peut séparer des molécules d'ADN de différente taille, ou des protéines. Là encore, la séparation a lieu après un certain temps et une certaine de distance de migration.
On comprend bien que, dans ces techniques, il y a un compromis à trouver entre temps de migration, distance de migration, et résolution de la séparation entre les différents analytes de l'échantillon. Pour diminuer la taille des instruments et les temps d'analyse, on peut miniaturiser les électrophorèses. Cependant, cette miniaturisation n'est pas possible quand on veut isoler par électrophorèse une grande quantité d'analyte. Dans ce cas, le biochimiste est contraint d'utiliser des systèmes encombrants et lents. Il existe d'ailleurs peu de systèmes préparatifs basés sur l'électrophorèse, et ceux qui existent sont des systèmes limités à une échelle de laboratoire ; il n'y a pas de préparation de molécules par électrophorèse à une échelle réellement industrielle.
Les techniques de chromatographie sont nombreuses, qui reposent sur des principes de séparation différents.
La chromatographie par exclusion de taille repose, comme l'électrophorèse, sur une différence de vitesse de migration des molécules, ou particules, dans une colonne remplie de particules immobiles et poreuses, appelées le support de chromatographie ; les analytes les plus gros, d'une taille supérieure aux pores du support, emportés par le flux, progressent sans pouvoir entrer dans les particules du support, dans le volume mort de la colonne. En revanche, les analytes plus petits entrent dans les particules du support, et y suivent des chemins plus tortueux que les gros analytes, avec un flux hydrodynamique plus lent. Ils migrent donc moins vite le long de la colonne. Un détecteur placé en aval de la colonne voit donc passer d'abord les grands analytes, puis les petits. Il existe de nombreux détecteurs différents : absorption de lumière, UV ou visible, diffusion de lumière, indice de réfraction, fluorescence, conductivité, voire spectrométrie de masse.
Dans la chromatographie d'exclusion de taille, on retrouve les inconvénients de longueur de migration et de temps d'analyse déjà cités pour les techniques d'électrophorèse. Un autre inconvénient de la méthode est qu'il faut trouver un support de chromatographie inerte, qui n'ait aucune interaction moléculaire avec les analytes de l'échantillon, ce qui n'est pas toujours possible. Enfin, les impuretés solides de l'échantillon doivent être d'une taille très inférieure au diamètre des particules du support de chromatographie, pour éviter le colmatage. Or il est intéressant de diminuer au maximum la taille de ces supports, pour améliorer le rendement de la colonne, et diminuer sa longueur et son volume. Il existe néanmoins des installations industrielles basées sur cette chromatographie, par exemple pour la purification d'anticorps thérapeutique dans l'industrie pharmaceutique.
Les techniques de chromatographie par échange d'ion, ou en phase inverse, reposent sur une différence d'adsorption des analytes sur le support de chromatographie. Les molécules, ou particules, de l'échantillon sont mises dans une solution qui provoquent leur adsorption sur les particules du support de chromatographie ; cette adsorption est d'origine électrostatique dans les chromatographies par échange d'ions, et d'origine hydrophobe dans les chromatographies en phase inverse. Une fois les analytes entièrement adsorbés dans la colonne de chromatographie, on applique en général un gradient temporel de solvant d'élution qui va détacher de façon différentielle les analytes ; les analytes les plus faiblement accrochés au support vont se détacher en premier, et sortiront en premier de la colonne de chromatographie. Le gradient appliqué est un gradient de polarité du solvant pour les phases inverses, et un gradient de pH ou de sels pour les échanges d'ion.
Dans ces techniques, on retrouve indirectement le compromis à trouver entre longueur de la colonne, temps d'analyse, et résolution. Pour maximaliser la résolution, il faut que, lors de l'application du gradient, l'entrée et la sortie de la colonne soient dans des conditions d'élution similaires ; autrement, les molécules à l'entrée de la colonne se détachent avant celles situées à la sortie, ce qui réduit le pouvoir de séparation de la colonne de chromatographie. Il faut donc soit un gradient lent, soit une colonne courte. Mais si la colonne est courte, la quantité de support peut ne pas être suffisante pour adsorber la totalité des analytes de l'échantillon. Aussi, plus la colonne est courte, et plus le débit de l'échantillon lors de l'adsorption doit être lent, de façon à ce que les analytes aient le temps de s'adsorber sur le support. Ces techniques de chromatographie ont aussi les mêmes inconvénients de colmatage que la technique de chromatographie par exclusion de taille, et la même difficulté à trouver des supports sur lesquels les analytes ne s'adsorbent que par un seul mécanisme d'interaction moléculaire.
OBJET DE L'INVENTION
La présente invention vise à remédier à tout ou partie de ces inconvénients.
A cet effet, la présente invention vise un système et un procédé de séparation de molécules ou de particules, pour analyse ou pour préparation d'échantillons chimiques ou biologiques. Elle se situe dans le domaine des sciences séparatives, que ce soit à des fins d'analyse, à des fins de préparation d'échantillons, ou à des fins de production industrielle de molécules ou particules.
Le système et le procédé de séparation objets de la présente invention visent à s'affranchir de la problématique de compromis entre longueur du dispositif de séparation et temps d'analyse, et d'accepter des impuretés solides dans l'échantillon bien supérieures à quelques micromètres. Il est ainsi possible d'obtenir des séparations rapides, avec un dispositif compact, à l'échelle analytique comme à l'échelle préparative, pour un échantillon contenant des débris, par exemple des débris cellulaires.
Selon un premier aspect, la présente invention vise un système de traitement de molécules ou particules d'intérêt véhiculées par un liquide viscoélastique, système qui comporte :
- un moyen de mise en écoulement laminaire, pendant au moins une partie, dite « phase de concentration », de la durée de fonctionnement du système, du liquide viscoélastique dans un dispositif de concentration, stacking et/ou de purification, ledit dispositif comportant une zone de concentration présentant, dans le sens dudit écoulement, une surface de section en entrée supérieure à la surface de section de chaque canal en sortie,
- un moyen d'application d'un champ électrique entre l'entrée et la sortie de la zone de concentration pendant la phase de concentration, l'action du champ électrique sur les molécules ou particules d'intérêt étant, dans la zone de concentration, opposée au sens dudit écoulement et provoquant la retenue de molécules ou particules d'intérêt au moins dans la zone de concentration et
- un moyen de modulation configuré pour commander le moyen d'application du champ électrique pour appliquer, après la phase de concentration, un champ électrique d'intensité non nulle et inférieure à l'intensité du champ électrique appliqué pendant la phase de concentration.
Grâce à ces dispositions, les molécules ou particules d'intérêt sont, d'abord, concentrées dans la zone de concentration, puis transférées, après la phase de concentration : une partie des molécules ou particules d'intérêt retenues dans la zone de concentration restent retenues pendant qu'une autre partie est transférée à un instrument de préparation d'analyse ou d'analyse, ou simplement vers un détecteur de l'état de l'art. Les molécules ou particules d'intérêts sont ainsi séparées selon leurs types, charge ou taille.
Dans des modes de réalisation, la zone de concentration comporte un canal d'entrée et au moins un canal de sortie, le cisaillement moyen présent dans chaque canal de sortie étant au moins le double du cisaillement moyen présent dans le canal d'arrivée.
Grâce à ces dispositions, les particules ou molécules de l'échantillon se concentrent dans la zone de concentration en amont des canaux parallèles, avec éventuellement, une séparation selon la taille et la charge électrique, le long de lignes d'isocisaillement (c'est-à-dire de cisaillements égaux).
Dans des modes de réalisation, le moyen de modulation est configuré pour commander le moyen d'application du champ électrique pour appliquer un champ électrique décroissant dans le temps. Ainsi, les molécules retenues dans la zone de concentration pendant la phase de concentration sont continûment séparées selon leurs types, charge ou taille.
Dans des modes de réalisation, le système comporte, de plus, un moyen de modulation de la pression pour appliquer, après la phase de concentration une pression différente de la pression appliquée pendant la phase de concentration.
Dans des modes de réalisation, le moyen de modulation de la pression est configuré pour appliquer, après la phase de concentration, une pression supérieure à la pression appliquée pendant la phase de concentration.
On obtient ainsi une séparation plus rapide. Dans des modes de réalisation, la zone de concentration comporte un diaphragme ouvert perpendiculaire à l'axe central d'écoulement du fluide viscoélastique dans la zone de concentration.
Ces modes de réalisation sont faciles à réaliser, par exemple par collage de deux capillaires présentant des voies ou canaux de différents diamètres.
Dans des modes de réalisation, la zone de concentration comporte une multitude de lumières ou capillaires parallèles à l'axe central d'écoulement du fluide viscoélastique dans la zone de concentration.
Ces modes de réalisation ont l'intérêt de présenter un débit plus élevé. Ils peuvent être mis en œuvre avec des échantillons plus volumineux.
Dans des modes de réalisation, la zone de concentration comporte un angle, l'axe central d'écoulement du fluide viscoélastique suivant ledit angle lors de la traversée de la zone de concentration.
Dans des modes de réalisation, le système objet de la présente invention comporte une vanne pour orienter le fluide viscoélastique sortant de la zone de concentration au choix dans deux directions, l'une des dites directions menant à un instrument et/ou un collecteur de fraction.
Ces modes de réalisation permettent de rejeter les molécules et particules sans intérêt et donc de purifier l'échantillon.
Selon un deuxième aspect, la présente invention vise un procédé de traitement de molécules ou particules d'intérêt véhiculées par un liquide viscoélastique, procédé qui comporte :
- une étape de mise en écoulement laminaire, pendant au moins une partie dite « phase de concentration », de la durée de fonctionnement du système, du liquide viscoélastique dans un dispositif de concentration, stacking et/ou de purification ledit dispositif comportant une zone de concentration présentant, dans le sens dudit écoulement, une surface de section en entrée supérieure à la surface de section de chaque canal en sortie,
- au moins pendant la phase de concentration, une étape d'application d'un champ électrique entre l'entrée et la sortie de la zone de concentration, l'action du champ électrique sur les molécules ou particules d'intérêt étant, dans la zone de concentration, opposée au sens dudit écoulement et provoquant la retenue de molécules ou particules d'intérêt au moins dans la zone de concentration et
- une étape de modulation du champ électrique pour appliquer, après la phase de concentration, un champ électrique d'intensité non nulle et inférieure à l'intensité du champ électrique appliqué pendant la phase de concentration. Les avantages, buts et caractéristiques particulières de ce procédé étant similaires à ceux du système objet de la présente invention, ils ne sont pas rappelés ici.
Selon un troisième aspect, la présente invention vise un système de traitement de molécules ou particules d'intérêt véhiculées par un liquide viscoélastique, système qui comporte :
- un moyen de mise en écoulement laminaire, pendant au moins une partie, dite « phase de concentration », de la durée de fonctionnement du système, du liquide dans un dispositif de concentration, préconcentration par empilement d'échantillon (stacking) et/ou de purification, ledit dispositif comportant une zone de concentration présentant, dans le sens dudit écoulement, un canal d'arrivée et une pluralité de canaux de sortie et
- un moyen d'application d'un champ électrique entre l'entrée et la sortie de la zone de concentration pendant la phase de concentration, l'action du champ électrique sur les molécules ou particules d'intérêt étant, dans la zone de concentration, opposée au sens dudit écoulement et provoquant la retenue de molécules ou particules d'intérêt au moins dans la zone de concentration.
Grâce à ces dispositions, on augmente la section du canal d'arrivée et le nombre de cols de la zone de concentration, ce qui permet d'accroître le phénomène de concentration et le volume de l'échantillon traité, par rapport à ce qui est décrit en FR 3 024 544. Ainsi, les systèmes de traitement objets de la présente invention, qui comportent une pluralité de canaux, se prêtent facilement à un changement d'échelle, pour passer d'un capillaire à une canalisation ou tuyau millimétrique, voire à des conduites plus grosses. On obtient alors un dispositif d'ultrafiltration avec des pores de microfiltration, donc avec des débits potentiellement plus élevés et moins de colmatage. Des calculs simples montrent qu'une plaque de cinq mm d'épaisseur percée de trous de 7,5 μηη de diamètre au pas carré de 20 μηη présenterait un débit sous 1 bar de 2500 L/heure.m2, performance bien supérieure aux membranes d'ultrafiltration utilisées dans les laboratoires. De tels dispositifs devraient donc trouver des applications dans les procédés avals de purification/concentration en bioproduction (« DownStream Processes »).
Les systèmes de traitement objets de la présente invention peuvent fournir des systèmes de concentration et de purification, notamment à l'échelle du laboratoire, par exemple pour la purification d'anticorps, de nanoparticules, ou d'acides nucléiques, où l'opérateur manie de l'ordre du microgramme de produit.
On note que, dans la méthode divulguée en FR 3 024 544, le dispositif mono-canal décrit comprend une restriction progressive de la section du canal, de sorte qu'il peut y avoir une séparation des molécules ou des analytes à concentrer le long de la restriction de section. Mais il est aussi possible d'arrêter les molécules ou les particules d'intérêt avec de simples canaux droits. Pour cela, on fixe des conditions d'écoulement et de champ électrique telles que les molécules, dans les canaux de sortie de la zone de concentration, sont plaquées si proches de la paroi que la force d'électrophorèse est plus forte que l'entraînement par l'écoulement. Dans ce cas, les molécules présentes dans le canal remontent l'écoulement le long de la paroi. Si l'écoulement présente un profil de Poiseuille jusqu'à l'entrée du canal, les molécules sortent du canal, et se concentrent en amont des canaux, dans la zone de concentration de plus grande section. Si l'écoulement présente des perturbations du profil de Poiseuille à l'entrée du canal, les molécules se concentrent dans cette zone de perturbation à l'entrée du canal.
La mise en œuvre du système concentre les molécules ou particules de grandes tailles et charges électriques et laisse passer les molécules ou particules plus petites ou moins chargées. Cette caractéristique est mise à profit pour purifier et concentrer un échantillon avant analyse.
Cette technique de concentration en ligne s'adapte à tout type de nano-objets ou de micro-objets, tels que :
- des fragments d'ADN,
- d'autres macromolécules, comme des protéines ou des glucides,
- des complexes, qui peuvent comprendre beaucoup de petites molécules, comme des polluants, des stéroïdes, ...
- des nanoparticules, notamment celles utilisées comme vecteur de délivrance de médicaments par l'industrie pharmaceutique,
- des particules virales ou bactériennes.
On note que l'on peut réaliser la plaque dotée de la pluralité de canaux par usinage laser, par DRIE (acronyme de Deep Reactive Ion Etching) ou une autre méthode d'usinage de micro-précision, pour obtenir des perçages dont le diamètre est de l'ordre de quelques microns à quelques dizaines de microns.
Dans des modes de réalisation, les canaux de sortie sont dimensionnés de telle sorte que le cisaillement moyen dans ces canaux est strictement supérieur au cisaillement moyen présent dans le canal d'arrivée dudit dispositif.
Typiquement, le rapport de cisaillement moyen entre le canal d'arrivée et chacun des canaux de sortie de la zone de concentration doit être inférieur à 0,01 .
Dans des modes de réalisation, le système objet de la présente invention comporte un multi-capillaire présentant des canaux linéaires, la zone de concentration se trouvant d'un côté de ce multi-capillaire. On rappelle qu'un multi-capillaire est un capillaire présentant plusieurs canaux, ou voies. Pour l'insérer dans le dispositif, on peut le couper et le coller entre le canal d'arrivée et la conduite de sortie.
Ces modes de réalisation peuvent, par exemple, être réalisés par manchonnage ou collage ou soudage de leurs constituants. On évite ainsi un usinage coûteux et on peut avoir des canaux ou voies de toutes longueurs souhaitées. Des multi-capillaires existent comme fibres optiques à cristaux photoniques. On peut également fabriquer des multi-capillaires par assemblage d'un faisceau de capillaires individuels, et en remplissant les interstices entre capillaires à l'aide d'une résine.
Dans des modes de réalisation, la zone de concentration comporte une pluralité de cônes formés dans un diaphragme perpendiculaire à l'axe central d'écoulement du fluide en sortie de la zone de concentration.
En usinage laser d'une plaque de silice, on obtient plus facilement une telle disposition à cônes parallèles plutôt qu'une disposition à cylindres parallèles.
Dans des modes de réalisation, le moyen d'application du champ électrique est configuré pour appliquer une décroissance progressive du champ électrique après la phase de concentration, pour séparer les molécules concentrées au préalable.
Selon un quatrième aspect, la présente invention vise un kit pour le fonctionnement du système objet de la présente invention, qui comporte le liquide viscoélastique.
Selon un cinquième aspect, la présente invention vise un kit pour le fonctionnement du système objet de la présente invention, qui comporte le dispositif de concentration, préconcentration par empilement d'échantillon (stacking) et/ou de purification, ledit dispositif comportant une zone de concentration présentant, dans un sens d'écoulement, une pluralité de canaux de sortie.
Dans des modes de réalisation du kit objet de la présente invention, les canaux de la pluralité de canaux de sortie sont dimensionnés de telle sorte que le cisaillement moyen dans ces canaux est très supérieur (au moins double) au cisaillement moyen présent dans le canal d'arrivée dudit dispositif.
Ces kits objets de la présente invention peuvent être combinés en un seul kit. On note que l'un ou l'autre de ces kits objets de la présente invention peut comporter, de plus :
- d'autres réactifs, selon l'application visée par exemple un échantillon de contrôle pour vérifier le bon fonctionnement,
- un standard de poids moléculaire,
- un standard de masse et/ou
- un loading buffer à ajouter dans l'échantillon.
Les avantages, buts et caractéristiques particulières de ces kits étant similaires à ceux du système objet de la présente invention, ils ne sont pas rappelés ici.
BREVE DESCRIPTION DES FIGURES
D'autres avantages, buts et caractéristiques particulières de l'invention ressortiront de la description non limitative qui suit d'au moins un mode de réalisation particulier des dispositifs et du procédé objets de la présente invention, en regard des dessins annexés, dans lesquels : les figures 1 , 2 et 3 représentent, schématiquement et en coupe, des modes de réalisation particuliers d'un dispositif de concentration pour le système objet de la présente invention,
la figure 4 représente, schématiquement et en coupe, un mode de réalisation particulier d'un dispositif de concentration pour le système objet de la présente invention,
la figure 5 représente un mode de réalisation particulier du système objet de la présente invention,
les figures 6 et 7 représentent, en vue en coupe axiale et en vue longitudinale, respectivement, un multicapillaire,
la figure 8 représente une variante du dispositif illustré en figure 3,
la figure 9 représente schématiquement un dispositif monocapillaire de concentration, la figure 10 représente schématiquement un dispositif multi-capillaires, mode de réalisation de l'invention,
la figure 1 1 est une photographie du dispositif multi-capillaire de concentration schématisé en figure 10,
la figure 12 est une image faite au microscope électronique à balayage du multicapillaire illustré en figures 10 et 1 1 ,
la figure 13 est un couple de photographies réalisées durant la concentration, en début et en fin de concentration,
la figure 14 représente des courbes d'évolution de l'intensité de fluorescence durant la concentration,
la figure 15 représente, schématiquement et en coupe, un premier mode de réalisation particulier du système objet de la présente invention,
les figures 16A à 16E représentent, en coupe, une partie du système illustré en figure 15 au cours de cinq phases de fonctionnement de ce système,
la figure 17 représente des courbes de couplage montrant l'influence du champ électrique sur la vitesse de fragments d'ADN,
les figures 18A à 18E représentent, en coupe, une partie de l'un des systèmes illustrés en figures 15 à 16E, au cours d'une succession d'étapes de séparation de molécules ou particules d'intérêt,
les figures 19 à 22 représentent, schématiquement et en coupe, des modes de réalisation particuliers d'un dispositif de concentration pour le système objet de la présente invention,
la figure 23 représente, schématiquement et en coupe, une vanne pour le système objet de la présente invention, la figure 24 représente, sous forme d'un logigramme, des étapes d'un mode de réalisation particulier d'un procédé objet de la présente invention et
les figures 25 et 26 montrent, sous forme de tracés de migration d'ADN, les effets de la mise en œuvre de la présente invention.
DESCRIPTION D'EXEMPLES DE REALISATION DE L'INVENTION
On note, dès à présent, que les figures ne sont pas à l'échelle.
Dans les modes de réalisation illustrés en regard des figures 1 à 4 et 6 à 14, on utilise une pluralité de canaux dans lesquels s'écoule un fluide viscoélastique grâce à l'application d'une différence de pression entre les deux extrémités des canaux.
On observe, en figure 1 , une partie 100 d'un premier mode de réalisation du dispositif de concentration, stacking et/ou de purification pour analyse. Cette partie 100 comporte un canal d'arrivée 105, une zone de concentration 1 10 en entrée de canaux de sortie parallèles 135 et une conduite de sortie 1 15.
Comme illustré en figure 1 , pour mettre en œuvre le premier mode de réalisation du dispositif, on réalise, d'abord, une injection hydrodynamique ou électrocinétique d'un échantillon 130, selon des méthodes classiques en électrophorèse capillaire ou en chromatographie. On note cependant que, du fait du diamètre du canal d'arrivée 105, qui peut être grand, on peut injecter ici un volume beaucoup plus important qu'en électrophorèse capillaire classique, par exemple entre 0,01 et 10 ml pour une échelle de préparation d'échantillons de laboratoire, voire un à plusieurs litres pour une échelle pilote ou industrielle. Le canal d'arrivée 105, la zone de concentration 1 10 et la conduite de sortie 1 15 ont été remplis au préalable du fluide viscoélastique. Préférentiellement, l'échantillon 130 a également été dilué dans ce fluide viscoélastique.
Comme illustré en figure 1 , après l'injection, l'entrée du canal d'arrivée 105 étant mise en communication avec un flacon (non représenté) contenant le fluide ou tampon viscoélastique, on applique un différentiel de pression et un différentiel de tension électrique entre l'entrée du canal d'arrivée 105 et la sortie 125 de la conduite de sortie 1 15. L'action du champ électrique E est opposée au flux F de tampon viscoélastique, la direction du champ électrique E dépendant du signe de la charge de la molécule/particule à concentrer. Comme expliqué ci-dessus, les particules ou molécules de l'échantillon 130 se concentrent dans la zone de concentration 1 10 en amont des canaux parallèles, avec éventuellement, une séparation selon la taille et la charge électrique, le long de lignes d'isocisaillement (c'est-à- dire de cisaillements égaux).
Une fois que tout l'échantillon 130 est passé dans la zone de concentration 1 10, il y reste les particules ou molécules concentrées et éventuellement séparées. On effectue alors un lavage en faisant passer un excès de fluide viscoélastique. Ainsi, les molécules ou particules non retenues dans la zone de concentration 1 10 sont entraînées hors du dispositif de concentration, par la conduite de sortie 1 15 et ne gênent donc pas la détection ultérieure des molécules ou particules d'intérêt. Cela permet aussi de purifier les molécules ou particules d'intérêt avant de les collecter en aval du dispositif de concentration.
On fait alors migrer les molécules concentrées par simple pression, avec un champ électrique nul, comme illustré en figure 2. On transfère ainsi le concentrât de la zone de concentration à la conduite de sortie 1 15.
On note qu'il n'y a pas de stacking lors de ce transfert : c'est l'étape de concentration qui a joué le rôle de stacking, qui fait que le plug de molécules ou particules concentrées a un volume en sortie de la zone de concentration 1 10 qui est indépendant du volume initial de l'échantillon.
Alternativement, on peut faire migrer les molécules concentrées par électrophorèse. Dans ce cas, on arrête l'écoulement, et on applique un champ électrique emmenant les molécules vers la sortie du dispositif 100.
Dans un premier mode d'utilisation du dispositif, on veut récupérer l'ensemble des molécules ou particules qui ont été concentrées. Il suffit alors de collecter l'échantillon en aval du dispositif, selon les méthodes de l'état de l'art, par exemple en utilisant un collecteur de fraction, ou une vanne adéquate.
Dans un second mode d'utilisation du dispositif, on veut récupérer seulement une partie des molécules ou particules qui ont été concentrées. Par exemple, on est intéressé par récupérer une taille d'acides nucléiques donnée, en éliminant les fragments plus courts et les fragments plus longs que cette taille. Il peut en être de même pour des protéines, des particules, des cellules,...
Dans ce second mode d'utilisation, on réalise une phase de séparation entre la phase de concentration et la phase de collecte.
La séparation peut avoir lieu par électrophorèse simple, dans la conduite de sortie 1 15. Dans ce cas, on choisit un polymère neutre pour rendre le liquide viscoélastique, de telle sorte que le fluide viscoélastique constitue aussi une matrice de séparation par électrophorèse des molécules ou particules d'intérêt.
La séparation peut aussi avoir lieu comme exposée ci-dessus et dans la demande de brevet FR 2 994 103 ; dans ce mode de réalisation, les canaux de sortie 135 de la zone de concentration 1 10 sont allongés au-delà de ce qui est nécessaire pour la seule phase de concentration, et peuvent d'ailleurs se substituer à la conduite de sortie 1 15. On applique alors des pressions et tension en sens opposés, et les particules ou molécules se séparent selon une distribution. Elles passent éventuellement devant le détecteur 120 optionnel, pour y être détectées et analysées. La collecte des molécules ou particules d'intérêt a alors lieu en sortie du multi-capillaire 135, éventuellement prolongé par une conduite de sortie 1 15, par les moyens de l'état de l'art, par exemple à l'aide d'un collecteur de fraction ou d'une vanne adéquate. Le détecteur 120 peut avantageusement être utilisé pour piloter la fonction de collecte des molécules ou particules d'intérêt, par exemple pour commander le démarrage et la fin de la collecte en fonction des temps de migration mesurées.
Dans des modes privilégiés de réalisation, on réalise la séparation en configurant le moyen d'application du champ électrique pour faire appliquer une décroissance progressive du champ électrique E après la phase de concentration, pour séparer les molécules.
La séparation a ainsi lieu en diminuant progressivement, ou par paliers, le champ électrique E appliqué pendant la concentration. On note en effet que si, après la phase de concentration, on réduit progressivement l'intensité du champ électrique E, par exemple selon une fonction linéaire décroissante, cela a pour effet de faire passer les molécules ou particules d'intérêt dans les canaux 135 définissant la zone de concentration 1 10, puis dans la conduite de sortie 1 15 et le détecteur 120 (s'il existe), successivement en fonction de leurs tailles et charges électriques.
On réalise ainsi une séparation ordonnée des molécules ou particules d'intérêt qui passent devant le détecteur optionnel 120, et qui peuvent être collectées par les moyens de l'état de l'art.
On note que l'on a intérêt à mettre le détecteur 120 et les moyens de collecte le plus près possible de la zone de concentration 1 10, pour réduire au maximum les effets de diffusions axiale, brownienne ou liée au profil parabolique de l'écoulement laminaire, qui risquent de re-mélanger les molécules et particules d'intérêt de différentes charges et tailles.
On note que, selon cette invention, on peut ajuster la séparation entre deux pics de détection de molécules ou particules en modulant la vitesse de diminution de l'intensité du champ électrique E. On peut, par exemple, réaliser des paliers, ce qui conduit à la formation de paliers de tailles et charges des molécules et particules passant devant le détecteur 120 et étant collectées.
L'invention présente des avantages complémentaires :
il n'est pas nécessaire de prévoir un long canal de séparation et conduite de sortie 1 15 ; les dimensions du dispositif sont donc réduites ;
le problème de pollution éventuelle de la conduite de sortie 1 15 par les impuretés non concentrées étant proportionnel à la longueur de cette conduite de sortie 1 15, il est grandement résolu par la très petite longueur de cette conduite de sortie 1 15.
On note que l'ensemble de ces modes d'utilisation et de réalisation du dispositif peut être réalisé avec une zone de concentration 1 10 comportant une pluralité de cônes (voir figure 8) formés dans un diaphragme perpendiculaire à l'axe central d'écoulement du fluide en sortie de la zone de concentration 1 10. L'angle formé par les parois d'entrée des canaux avec l'axe commun aux canaux a un effet sur la concentration. Un angle important, donnant un cône court, génère des gradients de force abrupts et une zone de concentration 1 10 ramassée. Au contraire, un angle faible, correspondant à un cône allongé, génère des gradients de force plus faibles et une zone de concentration 1 10 plus étendue.
Un avantage des modes de réalisation dans lesquels les canaux 135 présentent des cônes d'entrée, notamment par rapport aux modes de réalisation dans lesquels les canaux 135 débouchent perpendiculairement à la paroi, tient en ce que le dispositif de concentration opère en même temps un certain degré de séparation parmi les molécules ou particules concentrées. Les molécules ou particules les plus petites ou les moins chargées se trouvent les plus proches du col des cônes de la zone de concentration 1 10. Lors de l'éventuelle étape de séparation et de détection, elles restent devant les molécules ou particules plus lentes et n'ont donc pas besoin de les doubler.
Ainsi, on peut injecter un volume d'échantillon 130 dans le dispositif bien supérieur à ce qui est possible en électrophorèse capillaire classique ou avec un dispositif de concentration formé d'un seul canal 135.
Un autre avantage est que l'échantillon 130 subit une purification : les molécules ou particules non chargées ou chargées en signe opposé des molécules ou particules d'intérêt sont éliminées de l'échantillon. Les molécules ou particules chargées de même signe que les molécules ou particules d'intérêt mais trop petites ou insuffisamment chargées sont également éliminées de l'échantillon. En particulier, les sels contenus dans l'échantillon sont éliminés lors de la concentration. Cette purification fait gagner en qualité de séparation, en degré de pureté des molécules ou particules après collecte.
Dans le dispositif 100 illustré partiellement en figures 1 et 2, une plaque 140 présentant des perçages traversant linéaires, ou lumières, 135 sépare deux canaux 105 et 1 15 de mêmes sections intérieures et extérieures. Ce mode de réalisation peut, par exemple, être réalisé par manchonnage ou collage ou soudage de ses constituants. Ce mode de réalisation a l'avantage d'augmenter le nombre de cols de la zone de concentration, ce qui peut permettre d'accroître le phénomène de concentration et le volume de l'échantillon traité. On note que la conduite de sortie 1 15 peut avoir une section interne différente de celle du canal d'arrivée 105.
On note que l'on peut réaliser la plaque 140 par usinage conventionnel, par usinage laser, DRIE (acronyme de Deep Reactive Ion Etching) ou une autre méthode d'usinage de micro-précision, pour obtenir des perçages dont le diamètre est de l'ordre de quelques microns à quelques dizaines de microns. On note aussi que l'on peut utiliser des perçages coniques, appelés « taper » en usinage laser.
On note aussi qu'il est plus avantageux pour la fabrication de réaliser une pluralité de canaux parallèles en sortie de la zone de concentration 1 10. Mais le parallélisme n'est pas nécessaire au bon fonctionnement du système. Dans le dispositif 400 illustré partiellement en figure 3, un multi-capillaire 410 présentant des canaux de sortie linéaires 415 sépare deux canaux 405 et 420 de mêmes sections intérieures et extérieures. Ce mode de réalisation peut, par exemple, être réalisé par manchonnage ou collage ou soudage de ses constituants. On note que la conduite de sortie 420 peut avoir une section interne différente de celle du canal d'arrivée 405.
On note qu'un multi-capillaire 410 est un capillaire présentant plusieurs canaux, ou voies. Pour l'insérer dans le dispositif, on le coupe et on le colle entre les canaux 405 et 420. Par rapport au mode de réalisation illustré en figures 1 et 2, on évite un usinage coûteux et on peut avoir des canaux ou voies de toutes longueurs souhaitées. Des multi-capillaires existent comme fibres optiques à cristaux photoniques, par exemple sous la marque déposée NKT Photonics.
En ce qui concerne les dispositifs à plusieurs capillaires montés en parallèle, tels que ceux illustrés en figures 1 , 2 et 3, on note que des cônes peuvent remplacer les capillaires cylindriques, avec les effets expliqués ci-dessus pour la partie conique. De plus, en usinage laser d'une plaque de silice, on obtient plus facilement une telle disposition à cônes parallèles plutôt qu'une disposition à cylindres parallèles.
Le schéma illustré en figures 1 , 2 et 3 se prête facilement à un changement d'échelle, pour passer d'un capillaire à une canalisation ou tuyau millimétrique, voire à des conduites plus grosses. On obtient alors un dispositif d'ultrafiltration avec des pores de microfiltration, donc avec des débits potentiellement plus élevés et moins de colmatage.
Des calculs simples montrent qu'une plaque de cinq mm d'épaisseur percée de trous de 7,5 μηη de diamètre au pas carré de 20 μηη présenterait un débit sous 1 bar de 2500 L/heure.m2, performance bien supérieure aux membranes d'ultrafiltration utilisées dans les laboratoires (par exemple le système Vivaflow de Sartorius, ou le système Pellicon de Millipore, marques déposées).
De tels dispositifs devraient donc trouver des applications dans les procédés avals de purification/concentration en bioproduction (« DownStream Processes » dans le vocabulaire de cette communauté).
On observe, en figure 4, un mode de réalisation 500 du dispositif de concentration, constitué d'un canal d'arrivée 520 débouchant sur des capillaires de sortie 530 de concentration parallèles entre eux et formant, chacun, un angle avec le canal d'arrivée. La zone de concentration 525 se trouve là où le canal 520 débouche sur les capillaires 530 et/ou dans les entrées des capillaires 530.
Dans le mode de réalisation illustré en figure 4, un écoulement minoritaire, ou tout au moins partiel, va dans les capillaires de sortie 530, donc la concentration n'est pas de 100%. Cependant, en faisant circuler l'échantillon en circuit fermé, on peut obtenir une concentration proche de 100%. On note que la somme des sections des canaux parallèles peut être égale ou supérieure à la section du canal d'arrivée et/ou de la conduite de sortie. En effet, la résistance hydrodynamique d'un ensemble de capillaires est bien supérieure à la résistance hydrodynamique d'un canal cylindrique de section égale à la somme des sections des capillaires. On obtient bien un accroissement du gradient de pression, et donc du cisaillement, sans qu'il y ait réduction de section.
Le dispositif de concentration, stacking ou séparation décrit en regard des figures 1 , 2, 3 et 4 fonctionne pour l'analyse de macromolécules et de nanoparticules pour les sciences de la vie, donc en solution aqueuse, ainsi que pour des solutions organiques et les microparticules.
On observe, en figure 5, un système 700 comportant un dispositif de concentration, stacking et/ou de purification 705 et un instrument optionnel de préparation d'analyse et/ou d'analyse 710.
Le dispositif 705 est n'importe lequel des dispositifs décrits en regard des figures 1 à 4. Il comporte :
- un moyen 715 de mise en écoulement laminaire, pendant au moins une partie, dite « phase de concentration », de la durée de fonctionnement du système, du liquide viscoélastique, dans un dispositif de concentration, stacking et/ou de purification ledit dispositif comportant une zone de concentration 720 présentant, dans le sens dudit écoulement, une pluralité de canaux de sortie dimensionnés de telle sorte que le cisaillement moyen dans ces canaux est très supérieur, au moins double, au cisaillement moyen présent dans le canal d'arrivée dudit dispositif,
- un moyen 725 d'application d'un champ électrique entre l'entrée et la sortie de la zone de concentration, l'action du champ électrique sur les molécules ou particules d'intérêt étant, dans la zone de concentration, opposée au sens dudit écoulement et provoquant la retenue de molécules ou particules d'intérêt au moins dans la zone de concentration et
- un moyen 730 de transfert de l'échantillon concentré depuis la zone de concentration 720 vers la sortie.
Comme exposé ci-dessus, après la phase de concentration, le champ électrique présente une intensité inférieure ou égale au champ électrique appliqué pendant la phase de concentration, par exemple selon une pente décroissante linéaire ou par pallier ou encore une intensité nulle immédiatement après la fin de l'application de la phase de concentration. Il peut aussi être en direction inverse de celle utilisée pour la concentration, et fort ou faible selon les caractéristiques de l'électrophorèse qu'on applique alors.
Parmi les types d'instruments d'analyse 710 optionnels, on cite notamment :
l'électrophorèse capillaire, auquel cas, il est avantageux d'utiliser l'alimentation électrique de l'électrophorèse capillaire comme moyen 725 d'application du champ électrique, et le générateur de pression de l'électrophorèse capillaire comme moyen 715 de mise en écoulement capillaire,
- le spectromètre de masse,
le gel filtration ou chromatographie d'exclusion de taille,
- les spectromètres et
la chromatographie liquide, sous toutes ses formes (LC, HPLC, UPLC, micro-LC, nano-LC).
- un simple détecteur, par exemple optique (absorbance, fluorescence, réfraction), conductimétrique, électrochimique,...
Un collecteur de fraction,
Un système de vannes permettant de collecter uniquement les molécules ou particules sélectionnées par le dispositif de concentration et de séparation.
On observe, en figures 6 et 7, un multicapillaire 800 comportant, dans un cylindre 805, des canaux parallèles cylindriques 810. Un manchon 815 peut être ajouté pour aider l'assemblage du multicapillaire 800 à un moyen 715 de mise en écoulement laminaire du liquide.
On observe, en figure 8, un dispositif de concentration 900 comportant un multicapillaire 910 présentant des canaux de sortie linéaires 915 sépare deux canaux 405 et 420 de mêmes sections intérieures et extérieures. Les canaux de sortie 915 comportent, chacun, un cône d'entrée 920. Ces cônes 920 et les canaux de sortie 915 sont, par exemple, formés dans un diaphragme perpendiculaire à l'axe central d'écoulement du fluide en sortie de la zone de concentration.
On donne, ci-dessous, un complément de description pour le dimensionnement des canaux de sortie de la zone de concentration et, notamment, des explications sur le calcul du dimensionnement
L'homme de l'art sait dimensionner le nombre et la section des canaux de telle sorte que le cisaillement dans les canaux de sortie de la zone de concentration dépasse le cisaillement dans le canal d'entrée.
Si tous les canaux sont cylindriques, et pour des écoulements laminaires d'un liquide incompressible, il est possible d'avoir une résolution analytique du problème, comme nous le montrons ci-dessous (équations de Poiseuille).
Si les canaux sont des canaux plans, avec une hauteur très petite devant leur largeur, une solution analytique au problème existe également (équations de Poiseuille plan).
Enfin, pour d'autres formes de section des canaux, les outils de modélisation multi physique de l'état de l'art, comme le logiciel COMSOL, permettent de trouver le dimensionnement nécessaire, en résolvant par éléments finis les équations de Navier- Stokes.
Considérons le cas de base, où le canal d'arrivée dans la zone de concentration est une conduite cylindrique de rayon Ri, et où la pluralité de canaux de sortie de la zone de concentration est constituée de n canaux cylindriques identiques de rayon R2.
D'une façon générale, dans un écoulement laminaire dans une conduite, on a la relation :
Équation 1 : ΔΡ = fffc X $ ,
avec ΔΡ chute de pression aux bornes de la conduite, Rh résistance hydraulique de la conduite, et Q le débit de l'écoulement.
Par unité de longueur de la conduite, on a :
dP dRk ^
Équation 2 : dz â∑ ¾ , dz étant une unité infinitésimale de longueur.
Le débit Q est identique dans le canal d'arrivée et dans la pluralité des canaux de sortie. D'où :
Équation 3 : dx. dz , les indices 1 et 2 se référant au canal d'arrivée et à la pluralité des canaux de sortie respectivement.
Pour un écoulement laminaire d'un fluide newtonien dans une conduite cylindrique, on a, selon les équations de Poiseuille, que l'on trouve par exemple dans l'article Wikipedia correspondant (https://fr.wikipedia.org/wiki/%C ent_de_Poiseuille):
Équation 4 : avec la vitesse du fluide en tout point situé à la distance r de l'axe de la conduite, et E *o la vitesse maximale du fluide, au centre de la conduite.
; s'exprime aussi simplement de façon analytique :
_ ff * dP
Équation 5 : "xax *
La contrainte de cisaillement vaut par définition :
Équation 6 : - dr , μ viscosité dynamique du fluide. En dérivant Équation 4, en reportant àr dans l'Équation 6, et en reportant également l'expression de ^irax 0 de l'Équation 5, on obtient :
r âP
o trJ = -—
Equation 7 : 2 ΩΖ
A mi-rayon de la conduite, le cisaillement moyen vaut donc :
_ R àP
Équation 8 : ΰ™*>' ~ ¥
tlF
Ceci donne la valeur de à∑ que l'on peut reporter dans Équation 3.
De la même façon, les équations de Poiseuille donnent la valeur de Rh : , - _—
Équation 9 : a nRA , L longueur de la conduite. Donc, par unité de longueur :
Equation 10 : d∑ m
Nous avons donc, en reportant Équation 8 et Équation 10 dans Équation 3 :
Q =— ' x—— =
Équation 1 1 : ¾ Β 2β
Puisque les n canaux de sortie sont identiques, on a Q=n 92, q2 étant le débit dans chacun des canaux de sortie.
Les équations précédentes s'appliquent pour chaque canal de sortie, et l'Équation 1 1 devient :
Q = = :
Équation 12 :
On en déduit que le rapport des cisaillements moyen dans le système vaut :
Équation 13 : ?τΐ£?> n
Ainsi, si on conçoit un dispositif avec un canal d'arrivée de rayon 1 ,5 mm, et 1000 canaux de sortie de rayon 25 μηη, on obtient un rapport des cisaillements moyens de (Équation 13) : * » = 21*
On note qu'il est plus facile d'obtenir un fort cisaillement dans les canaux de sortie si la somme des sections de ces canaux est très inférieure à la section du canal d'arrivée.
Cependant, si le nombre des canaux de sortie est au moins égal à 10000, alors on peut obtenir un rapport de cisaillement supérieur ou égal à 100, alors que la somme des sections des canaux de sortie est égale à la section d'entrée. Plus le nombre de canaux est grand, et plus cela est possible.
Ainsi, si on conçoit un dispositif avec un canal d'arrivée de rayon 1 ,5 mm, et 10000 canaux de sortie de rayon de 15 μηη, on obtient un rapport des cisaillements moyens de (Équation 13) :
alors que la section du canal d'arrivée et la section totale des canaux de sortie sont égales et valent 7,07 mm2.
Enfin, il faut noter que les équations de Poiseuille utilisées ci-dessus sont vraies pour un liquide newtonien, alors que la mise en œuvre de la présente invention requiert un liquide viscoélastique. En fait, les équations de Poiseuille sont vraies quand la viscosité μ est indépendante du cisaillement. La viscosité d'un fluide est une propriété distincte de ses propriétés élastiques, et il existe des polymères qui rendent le liquide viscoélastique, alors que la viscosité reste constante sur une large gamme de cisaillement. L'article de Del Giudice et al., 2015, Lab Chip 15, 783-792 montre ainsi que des solutions aqueuses contenant du Poly Ethylene Oxide (PEO) jusqu'à 0,3%, ou du polyacrylamide (PAM) jusqu'à 0,1 %, ont une viscosité constante pour des taux de cisaillement allant de 0 (fluide au repos) à 200 s-1, qui sont des valeurs de cisaillement très suffisantes pour faire fonctionner le système objet de la présente invention. Il en est de même avec des solutions de Polyvinylpyrrolidone 8% (PVP), selon Romeo et al., 2013, 13, 2802-2807.
Au cas où le développeur d'un dispositif ne dispose pas d'un fluide viscoélastique permettant la concentration de molécules ou particules d'intérêt dans des conditions où la viscosité du fluide est constante, le développeur utilise une simulation multiphysique comme mentionnée plus haut, en utilisant la forme la plus générale des équations de Navier-Stokes, qui fait intervenir un tenseur de contraintes visqueuses, et en déterminant expérimentalement les paramètres de ce tenseur.
Le rapport des cisaillements à mettre en œuvre entre le canal d'arrivée et les canaux de sortie de la zone de concentration dépend de l'application visée, et du temps que l'on se donne pour la concentration voulue. Si l'échantillon à concentrer est constitué d'une population de molécules ou particules strictement identiques, le rapport des cisaillements n'a pas nécessairement besoin d'être important ; il suffit de régler la vitesse de flux et le champ électrique de telle façon que la molécule à concentrer avance avec l'écoulement dans le canal d'arrivée, et recule par électrophorèse le long des parois dans les canaux de sortie, comme expliqué ci-dessus.
Toutefois, si le rapport des ratios est faible, les molécules à concentrer sont assez fortement plaquées vers les parois dans le canal d'arrivée, et elles avancent seulement lentement dans ce canal, limitant la vitesse de concentration. Pour aller plus vite, on a intérêt à augmenter le rapport des cisaillements, de façon à ce que les molécules soient peu plaquées vers les parois, et donc peu ralenties, dans l'écoulement du canal d'entrée. En pratique, on a intérêt à avoir un rapport de cisaillement d'au moins 2, et préférentiellement d'au moins 10, entre le canal d'entrée et les canaux de sortie.
Si maintenant l'échantillon à concentrer est constitué d'une population hétérogène de molécules ou particules, qui subissent donc une force différente de placage à la paroi selon leur taille et leur charge, il faut régler le cisaillement de telle façon que les molécules les plus petites et/ou les moins chargées, qui sont les plus difficiles à arrêter dans l'écoulement, reculent par électrophorèse dans les canaux de sortie, pendant que les molécules les plus grosses et/ou les plus chargées, qui subissent le placage vers la paroi le plus important, avancent suffisamment vite dans le canal d'arrivée. Dans ces cas, le ratio des cisaillements à mettre en œuvre dépend donc de l'hétérogénéité des molécules à concentrer. Pour des fragments d'ADN compris entre 0,1 et 1 ,5 kb, ou entre 0,5 et 50 kb, on utilise préférentiellement un ratio de cisaillement supérieur à 100.
On donne, en regard des figures 9 à 14, une démonstration expérimentale d'une concentration d'ADN à l'aide d'un tronçon de multi-capillaires. La figure 9 montre un schéma de dispositif monocapillaire de concentration. La figure 10 montre un schéma de dispositif multi-capillaires conforme à des aspects de l'invention. Ces schémas de principe illustrent la concentration de l'ADN dans un système simple (emmanchement de capillaires, figure 9) et dans le cas d'un dispositif multi-capillaires.
Le dispositif multi-capillaire de la figure 10 a été réalisé en emmanchant un multicapillaire 605 de longueur 3 cm et présentant 61 capillaires de 40 μηη de diamètre dans deux tubes à hématocrite 610 et 615 de longueur 60cm et de diamètre interne 1.1 mm (figure 1 1 et 12), situés de part et d'autre du multi-capillaire.
Une solution, composée de TBE1x+PVP360 1 %, et contenant l'échantillon d'ADN (kb ladder Extended à O.^g/mL marqué au YoYo ; New England Biolabs, référence N3239S), est injectée en continu dans le dispositif illustré en figure 10, de la gauche vers la droite selon le schéma de la figure 10. Des pressions comprises entre 50 et 150 mBar sont appliquées, ce qui génère des débits compris entre 10 et 30 μΙ_Ληίη (v=2.2-6.7mm/s dans le multicapillaire 605).
Afin de concentrer l'échantillon, une tension est appliquée aux bornes du dispositif permettant ainsi de créer un champ électrique dans le multicapillaire 605 compris entre 45 et 270V/cm, champ électrique exerçant sur l'ADN une force opposée au flux hydrodynamique.
Pour une pression fixée, le champ électrique est appliqué pendant une minute. L'ADN se concentre alors majoritairement à l'entrée des canaux du multicapillaire 605. Puis la pression est coupée, alors que le champ électrique est toujours appliqué. L'ADN migre alors par électrophorèse de la droite vers la gauche, et le concentrât est observé dans le tube hématocrite au démarrage de cette électrophorèse (figure 13).
Dans ces conditions expérimentales, les volumes traités sont compris entre 10 et 30 μΙ. Pendant l'étape de concentration, nous observons une augmentation de l'intensité de fluorescence à la jonction entre le multicapillaire et le tube à hématocrite (figure 14).
Ces premiers résultats nous ont donc permis de démontrer la faisabilité de concentrer de l'ADN à l'aide d'un multi-capillaire avec un débit de 10 à 30 μΙ/min, débit bien plus fort que ce qui est atteignable avec un dispositif monocapillaire.
Figure 1 1 : Photographie du dispositif multi-capillaire de concentration ; Figure 12 : image au microscope électronique à balayage du multicapillaire 605 ayant été utilisé pour réaliser le dispositif ; Figure 13 : Photographies réalisées durant la concentration, celle du dessus en début de concentration, celle du dessous en fin de concentration ; Figure 14 : Evolution de l'intensité de fluorescence durant la concentration pour une pression de l OOmBar et différentes tensions. L'arrêt de la concentration a lieu au temps d'environ 60 secondes.
On observe, en figure 15, une partie 1 100 d'un mode de réalisation du dispositif de concentration, stacking et/ou de purification pour analyse objet de la présente invention. Cette partie 1 100 comporte un capillaire d'injection 1 105, par exemple de diamètre de 250 μηη, une zone de concentration 1 1 10 un capillaire de séparation 1 1 15, par exemple de diamètre compris entre 50 μηη et 75 μηη, un détecteur 1 120 optionnel et une sortie 1 125.
La zone de concentration 1 1 10 peut être conique, droite ou comporter une pluralité de canaux. Des électrodes 1 106 et 1 107 portées à des potentiels électriques différents, génèrent un champ électrique dans l'ensemble du fluide présent dans la partie 1 100. Un moyen 1 108 de modulation de ce champ électrique fait, conformément à la présente invention, varier la différence de potentiels entre les électrodes 1 106 et 1 107, comme exposé plus loin.
Comme illustré en figure 16A, pour mettre en œuvre le mode de réalisation du dispositif illustré en figure 15, on réalise, d'abord, une injection hydrodynamique ou électrocinétique d'un échantillon 1 130, selon des méthodes classiques en électrophorèse capillaire. On note cependant que, du fait du diamètre du capillaire d'injection 1 105, on peut injecter ici un volume beaucoup plus important qu'en électrophorèse capillaire classique, par exemple entre 0,1 et 10 μΙ. Le capillaire d'injection 1 105, la zone de concentration 1 1 10 et le capillaire de séparation 1 1 15 ont été remplis au préalable du fluide viscoélastique. Préférentiellement, l'échantillon 1 130 a également été dilué dans ce fluide viscoélastique.
Comme illustré en figure 16B, après l'injection, l'entrée du capillaire d'injection 1 105 est mise dans le flacon contenant le fluide ou tampon viscoélastique et on applique un différentiel de pression et un différentiel de tension électrique entre l'entrée du capillaire d'injection 1 105 et la sortie 1 125 du capillaire de séparation 1 1 15. L'action du champ électrique est opposée au flux de tampon viscoélastique, la direction du champ électrique dépendant du signe de la charge de la molécule/particule à concentrer. Comme expliqué, ci- dessus, les particules ou molécules 1 135 de l'échantillon 1 130 se concentrent dans la zone de concentration 1 1 10 avec une séparation selon la taille et la charge électrique, le long de lignes d'isocisaillement (c'est-à-dire de cisaillements égaux).
Comme illustré en figure 16C, une fois que tout l'échantillon 1 130 est passé dans la zone de concentration 1 1 10, il y reste les particules ou molécules 1 135 concentrées et séparées. On effectue alors un lavage en faisant passer un excès de fluide viscoélastique. Ainsi, les molécules ou particules non retenues dans la zone de concentration 1 1 10 sont entraînées hors du capillaire de séparation 1 1 15 et ne gênent donc pas la détection. Les particules ou molécules 1 135 sont ainsi purifiées.
Comme illustré en figure 16D, on réalise alors la mise en place du concentrât destiné à la séparation 1 140, appelé, par la suite « plug ». A cet effet, on élimine les différentiels de pression et de tension électrique. Puis on fait migrer par électrophorèse simple les molécules ou particules concentrées de la fin de la zone de concentration 1 1 10 vers le début du capillaire de séparation 1 1 15. Ce plug de séparation a une longueur indépendante du volume initial du plug d'injection. Dans un autre mode de réalisation de la sortie après concentration, on fait migrer les molécules concentrées par simple pression, avec un champ électrique nul. On transfère le concentrât de la zone de concentration à la zone de départ pour l'analyse (« plug d'injection ») ou simplement pour la collecte des molécules concentrées et purifiées.
On note qu'il n'y a pas de stacking lors de cette sortie : c'est l'étape de concentration qui a joué le rôle de stacking, qui fait que le plug de séparation a un volume indépendant du volume initial de l'échantillon.
Comme illustré en figure 16E, on réalise ensuite éventuellement une séparation supplémentaire, par modulation du champ électrique appliqué, et la détection. La séparation peut avoir lieu soit par électrophorèse simple, soit par séparation comme exposée dans la demande de brevet FR 2 994 103, en appliquant des pressions et tension en sens opposés. Dans les modes de réalisation comportant un détecteur 1 120, lorsque les particules ou molécules 1 135 séparées selon la distribution 1 145 ainsi obtenue, passent devant ce détecteur 1 120, elles y sont détectées et analysées.
On note que l'angle formé par les parois de la zone de concentration 1 1 10 avec l'axe central commun aux capillaires 1 105 et 1 1 15 a un effet sur la concentration. Un angle important, donnant un cône court, génère des gradients de force abrupts et une zone de concentration 1 1 10 ramassée. Au contraire, un angle faible, correspondant à un cône allongé, génère des gradients de force plus faibles et une zone de concentration 1 1 10 plus étendue.
Un avantage de ce mode de réalisation, tient en ce que les molécules ou particules les plus rapides se trouvent les plus proches du col de la zone de concentration 1 1 10. Lors de l'étape de séparation et de détection (figure 16E), elles restent devant les molécules ou particules plus lentes et n'ont donc pas besoin de les doubler.
Grâce à la mise en œuvre de la présente invention, on peut injecter un volume d'échantillon 1 130 dans le dispositif bien supérieur à ce qui est possible en électrophorèse capillaire classique. En effet, en électrophorèse capillaire classique, il faut conserver une taille raisonnable du plug d'injection, sous peine de perdre en résolution d'analyse.
Un autre avantage de la mise en œuvre de la présente invention est que l'échantillon 1 130 subit une purification ; les molécules ou particules non chargées ou chargées en signe opposé des molécules ou particules d'intérêt sont éliminées de l'échantillon. Les molécules ou particules chargées de même signe que les molécules ou particules d'intérêt mais trop petites ou insuffisamment chargées sont également éliminées de l'échantillon. En particulier, les sels contenus dans l'échantillon sont éliminés lors de la concentration. Cette purification fait gagner en qualité de séparation.
La figure 1 montre, pour un capillaire simple, sans concentration, avec un détecteur fixe, situé à 12 cm de l'entrée, des courbes de couplage montrant l'influence du champ électrique sur la vitesse de fragments d'ADN. On introduit à l'entrée du capillaire un mélange de différentes tailles, puis on applique pression et champ électrique en opposition.
Les courbes 1 151 à 1 158 correspondent à des fragments d'ADN de taille, respectivement 0,5 kb, 1 kb, 1 ,5 kb, 2 kb, 3 kb, 5 kb, 10 kb et 48,5 kb.
Les courbes 1 151 à 1 158 sont obtenues en tampon TBE + PVP 1 %. Capillaire de 25 μηη de diamètre, 1 m de long. Détecteur LIF à 12 cm de l'entrée. Pression : 2 bars. La tension appliquée varie de 0 à 4 kV (champ électrique de 0 à 40 V/cm).
Pour un champ électrique donné (sur l'axe des x), on voit que les fragments d'ADN ont une vitesse différente selon leur taille. Le détecteur les voit donc passer à des instants différents : il y a séparation. On peut extrapoler ces courbes pour déterminer quand est-ce qu'elles coupent l'axe des x à une valeur définissant un point d'arrêt et donc en tirer les conditions de concentration pour une vitesse fluidique donnée.
On observe que le champ électrique d'arrêt dépend de la taille des fragments d'ADN. Donc, pour certains champs, les fragments les plus petits (1 kb) ne seront pas arrêtés, alors que les fragments les plus grands sont à l'arrêt (ou repartent en arrière). La vitesse fluidique à laquelle ces courbes sont acquises peut être la vitesse au col du concentrateur. On voit donc que, en fonction du champ électrique, certains fragments passent le col, et d'autres non.
Les figures 18A à 18E représentent un perfectionnement du dispositif de concentration, pour augmenter la séparation des particules et molécules retenues dans la zone de concentration, en vue de leur analyse.
On retrouve, dans ces figures 18A à 18E, un capillaire d'injection 1205, une zone de concentration 1210 et un capillaire de séparation 1215. Le champ électrique appliqué a été représenté par les flèches 1220 à 1240, respectivement dans les figures 18A à 18E. La longueur de ces flèches est représentative de l'intensité du champ électrique appliqué.
Comme illustré en figure 18A, à la fin de l'étape de lavage, les molécules et particules d'intérêts sont retenues dans la zone de concentration 1210, et disposées à une distance du col de jonction entre cette zone de concentration 1210 et le capillaire de séparation 1215, qui est fonction de leurs tailles et charges électriques et de l'intensité du champ électrique 1220.
Puis, on réduit le champ électrique appliqué, par exemple de 10 %, comme illustré par la flèche 1225 en figure 18B. Les molécules et particules d'intérêt les plus proches du col franchissent alors ce col et pénètrent dans le capillaire de séparation 1215 pendant que les autres molécules et particules d'intérêt restent dans la zone de concentration 1210. Si on maintient le champ électrique 1225, les particules qui ont déjà pénétré dans le capillaire de séparation 1215 sont entraînées par le fluide viscoélastique en déplacement laminaire et atteignent le détecteur placé en aval du col.
Ici, comme illustré en figures 18C à 18E, on continue de réduire l'intensité du champ électrique, par exemple selon une fonction linéaire décroissante. Ce qui a pour effet de faire passer les molécules ou particules d'intérêt dans le col successivement en fonction de leurs tailles et charges électriques.
On réalise ainsi une séparation ordonnée des molécules ou particules d'intérêt à transférer.
On note que, dans les modes de réalisation comportant un détecteur, on a intérêt à mettre ce détecteur le plus près possible du col, pour réduire au maximum les effets de diffusions axiale, brownienne ou liée au profil parabolique de l'écoulement laminaire, qui risquent de re-mélanger les molécules et particules d'intérêt de différentes charges et tailles. On note que, selon le perfectionnement exposé en regard des figures 18A à 18E, on peut ajuster la séparation entre deux pics de détection de molécules ou particules en modulant la vitesse de diminution de l'intensité du champ électrique. On peut, par exemple, réaliser des paliers, ce qui conduit à la formation de paliers de tailles et charges des molécules et particules passant devant le détecteur. Ce mode de fonctionnement par palier est particulièrement bien adapté pour préparer des fractions d'ADN par tranche de taille, ou des fractions d'autres analytes selon leurs types, tailles ou charges. Ce mode de fonctionnement par palier est illustré dans les figures 36 et 37 décrites plus loin.
Ce perfectionnement présente des avantages complémentaires :
il n'est plus nécessaire de prévoir un long capillaire de séparation ; les dimensions du dispositif objet de la présente invention sont donc réduites ;
- le problème de pollution évoqué plus haut étant proportionnel à la longueur du
capillaire de séparation, il est grandement résolu par la très petite longueur de ce capillaire.
Ainsi, préférentiellement, le système objet de la présente invention comporte un moyen de modulation configuré pour commander le moyen d'application du champ électrique pour appliquer, après la phase de concentration, un champ électrique d'intensité non nulle et inférieure à l'intensité du champ électrique appliqué pendant la phase de concentration.
Optionnellement, après la phase de concentration, on modifie aussi la vitesse du fluide viscoélastique pour réaliser la sortie de l'échantillon concentré.
Dans des modes de réalisation, on utilise des puces microfluidiques dont la hauteur de la veine est fixe et faible, par exemple de 10 μηη. Pour réaliser le biseau de la zone de concentration, on diminue la largeur du canal, sans modifier sa hauteur. Ces modes de réalisation ont l'avantage que les molécules à retenir ont très peu de chemin à parcourir pour atteindre leur position d'arrêt près de la paroi. On peut ainsi réaliser des différences de largeur plus importantes. On peut par exemple réaliser des dispositifs 1250 tels que représenté en figure 19 dans lesquels la largeur du capillaire d'injection 1255 est entre 300 et 1000 μηη, notamment de 600 μηη et la largeur du col 1260 est de 10 à 20 μηη, et l'angle formé entre les parois latérales de la zone de concentration avec l'axe central du canal de 10° à 45°. Dans la figure 19, la zone de concentration est suivie d'une zone symétrique 1265, le capillaire de séparation 1270 ayant la même largeur que le capillaire d'injection 1255.
Dans les modes de réalisation basés sur des capillaires cylindriques à section circulaire, il arrive que des molécules ou particules d'intérêt, emportées par le flux et éloignées des parois à l'entrée de la zone de concentration, traversent la zone de concentration sans avoir le temps d'atteindre leur position d'arrêt proche de la paroi. Ces particules ou molécules franchissent alors le col et arrivent dans le capillaire de séparation, où elles rencontrent des conditions d'écoulement, de cisaillement et de tension électrique qui les font repartir en arrière vers le col. Si le dispositif est conçu et fabriqué de telle façon qu'un profil de Poiseuille, qui décrit l'écoulement laminaire d'un liquide visqueux dans une conduite cylindrique, est maintenu tout au long de la transition entre la zone de concentration et le capillaire de séparation, les molécules ou particules d'intérêt qui ont franchi le col repartent en arrière, refranchissent le col en sens inverse et trouvent leur position d'équilibre dans la zone de concentration.
Cependant, dans une géométrie avec des cassures, bourrelets ou autres imperfections, l'écoulement laminaire est perturbé et le profil parabolique de Poiseuille n'est pas présent à l'entrée du capillaire de séparation 1215. Dans ce cas, une partie 1245 des molécules et particules d'intérêt ne peuvent pas retourner dans la zone de concentration 1210 et elles restent concentrées en entrée du capillaire de séparation 1215, comme illustré en figure 20.
Dans ces cas, au moins une partie de la concentration de molécules ou de particules d'intérêt se trouve en aval du col séparant la zone de restriction du capillaire de séparation.
Le moyen de modulation, ou vanne électrique, du dispositif de la présente invention fonctionne aussi dans ces cas où on concentre en aval du col ou des cols du concentrateur (concentrateur « inertiel »).
La figure 21 représente une variante de réalisation des dispositifs illustrés en figures 15 à 20.
Dans le dispositif 1300 illustré partiellement en figure 21 , la zone de concentration 1315 présente un angle de 90° avec l'axe central des capillaires d'injection 1305 et de séparation 1320. Ces capillaires présentent le même diamètre externe mais des canaux 1310 et 1325 de diamètres internes différents. Ce changement de diamètre interne constitue un diaphragme perpendiculaire à l'axe central du flux du liquide viscoélastique. L'avantage de ce mode de réalisation est qu'il peut être réalisé par collage de deux capillaires à sections externes constantes, donc aussi par manchonnage.
On note que, dans ce type de configuration présentant un angle droit, le volume de concentration est plus important que dans les configurations présentant une partie en biseau ou en cône. On augmente ainsi la capacité du système et on réduit ainsi les effets liés à l'adsorption aux parois. En revanche, les molécules ou particules concentrées ne sont pas séparées selon leur type, taille ou charge pendant la phase de concentration.
On observe, en figure 22, un mode de réalisation constitué de la réunion de deux capillaires 1505 et 1515, l'intersection 1510 de ces capillaires formant un angle, ici un angle droit. A cette intersection 1510 se trouve la zone de concentration des molécules ou particules d'intérêt. On note que le capillaire 1505 peut être remplacé par une cuve, ou constituer directement la cuve échantillon.
Le dispositif de concentration, stacking ou séparation décrit en regard des figures 15 à 22 fonctionne sur l'électrophorèse capillaire, l'analyse de macromolécules et de nanoparticules pour les sciences de la vie, donc en solution aqueuse, ainsi que pour des solutions organiques et les microparticules.
La figure 23 montre un perfectionnement applicable à tous les modes de réalisation. Ce perfectionnement consiste à positionner une vanne 1620 entre, d'une part, un dispositif 1600 comportant un capillaire d'injection 1605, une zone de concentration 1610 et un capillaire de séparation ou de sortie 1615 et, d'autre part, un capillaire de rejet 1625 ou un capillaire 1630 d'entrée d'un instrument d'analyse ou d'un instrument de préparation d'analyse ou simplement d'un récipient de collecte. La vanne 1620 est, par exemple, une vanne rotative de type HPLC (Chromatographie en phase liquide à haute performance).
Au cours des étapes de concentration et de lavage, la vanne rotative 1620 évacue le fluide viscoélastique et les molécules et particules non retenues dans la zone de concentration vers le capillaire de rejet. Au contraire, pour l'analyse ou la collecte, la vanne rotative 1620 oriente le fluide viscoélastique et les molécules ou particules d'intérêt vers le détecteur ou l'instrument.
Lorsqu'on utilise le dispositif dans un but préparatif à l'échelle du laboratoire, on le couple à un collecteur de fractions, tel qu'on en utilise classiquement dans les techniques de chromatographie.
Comme illustré en figure 24, le procédé de traitement de molécules ou particules d'intérêt véhiculées par un liquide viscoélastique comporte :
- une étape 1950 de mise en écoulement laminaire, pendant au moins une partie dite « phase de concentration », du liquide viscoélastique dans un dispositif de concentration, stacking et/ou de purification, ledit dispositif comportant une zone de concentration présentant, dans le sens dudit écoulement, une surface de section en entrée supérieure à la surface de section de chaque canal en sortie,
- au moins pendant la phase de concentration, une étape 1955 d'application d'un champ électrique entre l'entrée et la sortie de la zone de concentration, l'action du champ électrique sur les molécules ou particules d'intérêt étant, dans la zone de concentration, opposée au sens dudit écoulement et provoquant la retenue de molécules ou particules d'intérêt au moins dans la zone de concentration,
- une étape 1960 de modulation de modulation du champ électrique pour appliquer, après la phase de concentration, un champ électrique d'intensité non nulle et inférieure à l'intensité du champ électrique appliqué pendant la phase de concentration. Les figures 25 et 26 démontrent l'effet de vanne électrique obtenu par la mise en œuvre de la présente invention. Dans le montage utilisé, un palier à 5 kV permet de laisser passer ce qui est plus bas que 300 pb, et de retenir 300 pb et tout ce qui est plus haut que 300 pb.
Méthode:
Tampon TBE 0,5X + PVP 5%
Lavage : 6 bar, 15 min tampon
Injection 4 bar, 1 ,7 min (100 bp ladder, 100 ng/mL)
Concentration: 2 bar, 15 kV pendant 5min
Figure 25 : Séparation en appliquant le gradient de tension 2010
A T0, la pression est augmentée à 7 bars, en laissant le voltage à 15 kV pendant 1 minute, voltage utilisé pendant la phase de concentration.
De t=1 minute à t=2 minute, la tension appliquée décroit rapidement et linéairement de 15 kV à 5 kV.
De t=2 minute à t=3 minute, la tension appliquée décroit plus lentement et linéairement de 5 kV à 0,5 kV.
De t=3 minute à t=12 minute, la tension appliquée décroit encore plus lentement, de 0,5 kV à 0,2 kV.
Pour t>12 minute, tension constante de 0,2 kV.
En appliquant ce gradient de tension 2010, on obtient l'électrophérogramme
2015.
Figure 26 : Séparation en appliquant le gradient de champ électrique 2020, qui est identique à celui appliqué pour obtenir la courbe de la figure 25, si ce n'est que l'on a ajouté un palier 2020 à 5 kV de la minute 2 à la minute 7. En appliquant ce gradient de tension 2020, on obtient l'électrophérogramme 2025.
On voit clairement, en comparant les figures 25 et 26 :
que le pic de 100 pb, qui sort avant la minute 2, n'est pas affecté par cette différence,
que le pic de 200 pb est retardé, et sort pendant le palier à 5 kV et
que les pics de 300 pb et plus haut sont retardés exactement du temps du palier. Ils sont restés dans le concentrateur pendant les 7 premières minutes.
La présente invention vise aussi un kit pour mettre en œuvre le système objet de la présente invention ou pour le fonctionnement du système objet de la présente invention, qui comporte le liquide viscoélastique.
La présente invention vise aussi un kit pour mettre en œuvre le système objet de la présente invention ou pour le fonctionnement du système objet de la présente invention, qui comporte le dispositif de concentration, stacking et/ou de purification, ledit dispositif comportant une zone de concentration présentant, dans un sens d'écoulement, au moins un canal de sortie, chaque canal étant préférentiellement dimensionnés de telle sorte que le cisaillement moyen dans ce canal est très supérieur, au moins double, au cisaillement moyen présent dans le canal d'arrivée dudit dispositif.
Ces kits objets de la présente invention peuvent être combinés en un seul kit. On note que l'un ou l'autre de ces kits objets de la présente invention peut comporter, de plus :
- d'autres réactifs, selon l'application visée par exemple un échantillon de contrôle pour vérifier le bon fonctionnement,
- un standard de poids moléculaire,
- un standard de masse,
- un loading buffer à ajouter dans l'échantillon.

Claims

REVENDICATIONS
1 . Système (700) de traitement de molécules ou particules d'intérêt véhiculées par un liquide viscoélastique, système qui comporte :
- un moyen (715) de mise en écoulement laminaire, pendant au moins une partie, dite « phase de concentration », de la durée de fonctionnement du système, du liquide viscoélastique dans un dispositif (705) de concentration, stacking et/ou de purification, ledit dispositif comportant une zone de concentration (1 10, 160, 210, 525) présentant, dans le sens dudit écoulement, une surface de section en entrée supérieure à la surface de section de chaque canal en sortie et
- un moyen (725) d'application d'un champ électrique entre l'entrée et la sortie de la zone de concentration pendant la phase de concentration, l'action du champ électrique sur les molécules ou particules d'intérêt étant, dans la zone de concentration, opposée au sens dudit écoulement et provoquant la retenue de molécules ou particules d'intérêt au moins dans la zone de concentration ;
caractérisé en ce qu'il comporte, de plus, un moyen (730) de modulation configuré pour commander le moyen d'application du champ électrique pour appliquer, après la phase de concentration, un champ électrique d'intensité non nulle et inférieure à l'intensité du champ électrique appliqué pendant la phase de concentration.
2. Système selon la revendication 1 , dans lequel, la zone de concentration (1 10, 160, 210, 525) comporte un canal d'entrée et au moins un canal de sortie (135, 530), le cisaillement moyen présent dans chaque canal de sortie étant au moins le double du cisaillement moyen présent dans le canal d'arrivée.
3. Système (700) selon l'une des revendications 1 ou 2, dans lequel le moyen (730) de modulation est configuré pour commander le moyen d'application du champ électrique pour appliquer un champ électrique décroissant dans le temps.
4. Système (700) selon l'une des revendications 1 à 3, qui comporte, de plus, un moyen (735) de modulation de la pression configuré pour appliquer, après la phase de concentration, une pression différente de la pression appliquée pendant la phase de concentration.
5. Système selon la revendication 4, dans lequel le moyen (735) de modulation de la pression est configuré pour appliquer, après la phase de concentration, une pression supérieure à la pression appliquée pendant la phase de concentration.
6. Système (700) selon l'une des revendications 1 à 5, dans lequel la zone de concentration comporte un diaphragme ouvert perpendiculaire à l'axe central d'écoulement du fluide viscoélastique dans la zone de concentration.
7. Système (700) selon l'une des revendications 1 à 6, dans lequel la zone de concentration comporte une multitude de lumières ou capillaires parallèles à l'axe central d'écoulement du fluide viscoélastique dans la zone de concentration.
8. Système (700) selon l'une des revendications 1 à 7, dans lequel la zone de concentration comporte un angle, l'axe central d'écoulement du fluide viscoélastique suivant ledit angle lors de la traversée de la zone de concentration.
9. Système (700) selon l'une des revendications 1 à 8, qui une vanne (620) pour orienter le fluide viscoélastique sortant de la zone de concentration au choix dans deux directions, l'une des dites directions menant à un instrument et/ou un collecteur de fraction.
10. Système (770) selon l'une des revendications 1 à 9, dans lequel le dispositif (100, 400, 500, 705) de concentration, préconcentration par empilement d'échantillon et/ou de purification, comporte une zone de concentration (1 10, 525) présentant, dans le sens dudit écoulement, un canal d'arrivée (105) et une pluralité de canaux de sortie (135, 530).
1 1 . Système selon la revendication 10, dans lequel les canaux de sortie (135, 530) sont dimensionnés de telle sorte que le cisaillement moyen dans les canaux de sortie est strictement supérieur au cisaillement moyen présent dans le canal d'arrivée (105) dudit dispositif.
12. Système selon la revendication 1 1 , dans lequel le rapport de cisaillement moyen entre le canal d'arrivée (105) et chacun des canaux de sortie (135, 530) de la zone de concentration (1 10) est inférieur à 0,01.
13. Système selon l'une des revendications 10 à 12, qui comporte un multi-capillaire (135) présentant des canaux linéaires, la zone de concentration (1 10) se trouvant d'un côté de ce multi-capillaire.
14. Système selon l'une des revendications 1 à 13, dans lequel la zone de concentration (1 10, 525) comporte une pluralité de cônes formés dans un diaphragme perpendiculaire à l'axe central d'écoulement du fluide en sortie de la zone de concentration.
15. Système selon l'une des revendications 1 à 14, dans lequel le moyen d'application du champ électrique (E) est configuré pour appliquer une décroissance progressive du champ électrique après la phase de concentration, pour séparer les molécules concentrées au préalable.
16. Kit pour le fonctionnement du système selon l'une des revendications 1 à 15, qui comporte le liquide viscoélastique.
17. Kit pour le fonctionnement du système selon l'une des revendications 10 à 15, qui comporte le dispositif (100, 400, 500) de concentration, préconcentration par empilement d'échantillon et/ou de purification, ledit dispositif comportant une zone de concentration (1 10, 525) présentant, dans un sens d'écoulement, une pluralité de canaux de sortie (135, 530).
18. Kit selon la revendication 17, dans lequel les canaux (135, 530) de la pluralité de canaux de sortie sont dimensionnés de telle sorte que le cisaillement moyen dans ces canaux est au moins le double du cisaillement moyen présent dans le canal d'arrivée (105) dudit dispositif (100).
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