EP1733050A2 - Verfahren zur erkennung von signaturen in komplexen genexpressionsprofilen - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erkennung von Signaturen in komplexen Genexpressionsprofilen, das die Schritte umfasst von: a) zur Verfügung stellen einer zu unter­suchenden biologischen Probe, b) zur Verfügung stellen mindestens eines geeigneten Expres­sionsprofils, wobei das mindestens eine Expressionsprofil einen oder mehrere Marker umfasst, die ausschliesslich für das Expressionsprofil typisch sind, c) Bestimmen des komplexen Ex­pressionsprofils d er b iologischen Probe, d) Bestimmen der quantitativen zellulären Z usam­mensetzung der biologischen Probe mittels der in den Schritten b) und c) bestimmten Expres­sionsprofile. Weiterhin kann das erfindungsgemässe Verfahren die Schritte von e) Berechnung eines virtuellen Signals, das aufgrund der bestimmten Zusammensetzung der Expressionspro­file erwartet wird, f) Berechnung der Differenz aus dem tatsächlichem gemessenem komple­xen Expressionsprofils und dem virtuellen Signal, und g) Bestimmen der quantitativen Zu­sammensetzung des komplexen Expressionsprofils auf Basis der ermittelten Differenzen um­fassen. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die Anwendung des erfindungsgemässen Verfahrens in der Diagnose, Prognose und/oder Verfolgung einer Erkrankung. Schliesslich werden entsprechende Computersysteme, Computerprogramme, computerlesbare Datenträ­germedien und Laborroboter oder Auswertegeräte für molekulare Nachweismethoden offenbart.

Description

Verfahren zur Erkennung von Signaturen in komplexen Genexpressionsprofilen

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Nerfahren zur Erkennung von Signaturen in komplexen Genexpressionsprofilen, das die Schritte umfaßt von: a) zur Verfügung stellen einer zu untersuchenden biologischen Probe, b) zur Verfügung stellen mindestens eines geeigneten Expressionsprofils, wobei das mindestens eine Expressionsprofil einen oder mehrere Marker umfaßt, die ausschließlich für das Expressionsprofil typisch sind, c) Bestimmen des komplexen Expressionsprofils d er b iologischen P robe, d) Bestimmen der quantitativen zellulären Zusammensetzung der biologischen Probe mittels der in den Schritten b) und c) bestimmten Expres- sionsprofile, e) Berechnung eines virtuellen Signals, das aufgrund der bestimmten Zusammensetzung der Expressionsprofile erwartet wird, f) Berechnung der Differenz aus dem tatsächlichem gemessenem komplexen Expressionsprofils und dem virtuellen Signal, und g) Bestimmen der quantitativen Zusammensetzung des komplexen Expressionsprofils auf Basis der ermittelten Differenzen. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens in der Diagnose, Prognose und/oder Verfolgung einer Erkrankung. Schließlich werden entsprechende Computersysteme, Computerprogramme, computerlesbare Datenträgermedien und Laborroboter oder Auswertegeräte für molekulare Νachweis- methoden offenbart.

Einleitung

Die Expression von bestimmten Genen zu bestimmten Zeiten im Lebenszyklus der Zelle bestimmt letztendlich ihren Phänotyp. Die Analyse der Genexpression insbesondere bei der Diagnose und Behandlung ist von besonderer Bedeutung bei erkrankten und/oder entarteten Zellen und letztendlich Geweben, die besondere insbesondere komplexe, d.h. unbekannte Gemische an Expressionsprofilen verschiedener Zelltypen aufweisen können.

Die im Stand der Technik bekannten Hochdurchsatz- Verfahren wie die DNA- und Protein- Array Technologie, die Massenspektrometrie oder Verfahren zu epigenetischen Untersuchungen erlauben quantitative Bestimmung von komplexen molekularen Profilen. Mit DNA-Array Untersuchungen wird z.B. die Aktivität von Genen über die Expression der mRNA gemessen. Auch die Proteinexpression wird zunehmend im Hochdurchsatzverfahren verfügbar über entsprechende Array-Technologien oder die Massenspektrometrie. Epigenetisache Analysen erheben Profile zum DNA-Methylierungszustand von Genen und erlauben Rückschlüsse auf eine hiaktivierung bzw. die Aktivierbarkeit von Genen. Diese Methoden lassen weit reichende Entwicklungen für die molekulare Diagnostik erwarten. Es besteht die Hoffnung, daß verschiede molekulare Profile mit besonderen klinischen Merkmalen assoziiert sein können, durch molekulare Merkmale Krankheiten in Untergruppen einteilbar werden und Interpretationsmöglichkeiten entwickelt werden können, die für Therapie und Krankheitsverlauf prognostische Informationen liefern. Ferner könnten aus den molekularen Profilen bzw. deren Interpretation auf Einzelfaktorebene Pathomechanismen ableitbar werden, die gezielte therapeutische Beeinflussung ermöglichen.

Die zu untersuchenden Proben tragen viele verschiedene molekulare Informationen. Zahlreiche Gene können bei einer veränderten Expression sowohl mit einer Verschiebung der zellulären Zusammensetzung der Probe (Einwanderung von Zellen) als auch einer Aktivierung einzelner oder mehrerer Stoffwechselwege verbunden sein.

Beide Informationen bilden sich im Expressionsmuster oder auch -Profil überlappend ab. Derzeitige bioinformatische Analysemethoden erlauben keine Unterscheidung zwischen diesen beiden Ursachen. Die Interpretation der Array Daten ist somit stark eingeschränkt. Um die Genregulationen in Zellpopulationen zu erkennen, ist heute vor der Array-Analyse eine Aufreinigung der Zellen erforderlich oder eine histologische Untersuchung von Geweben mit immunhistologischer Zuordnung zu Zelltypen. Zellaufreinigungen können aber zu artifiziel- len V eränderungen d er Genexpressionsmuster führen u nd h istologische M öglichkeiten s ind auf wenige Gene beschränkt.

Die nachteilige Bedeutung dieser Vermischung von Ursachen und Wirkungen wird um so eindrücklicher, als regulierte Gene normalerweise keiner Ein-/ Aus-Aktivität unterliegen, sondern meist eine Grundaktivität (konstitutive Expression) aufweisen. Ferner können sie in verschiedenen Zelltypen und auch Stoffwechselwegen unterschiedlich aktiv sein.

Es fällt somit der Großteil der differentiell exprimierten Gene in diese ursächlich nicht eindeutig zuordenbare Gruppe. Es sind derzeit also für die meisten Gene weiterführende Unter- suchungen erforderlich, um zu klären, ob eine Verschiebung in der Zellzusammensetzung oder eine Genregulation aufgetreten ist.

Haviv et al (Haviv I, Campbell IG. DNA microarrays for assessing ovarian cancer gene expression. Mol Cell Endocrinol. 2002 May 31;191(l):121-6.) beschreiben die gleichzeitige Expressionsanalyse von Genen innerhalb einer gegebenen Population mittels Array- Technologien. Danach kann die Expression von normalen und malignen Zellen verglichen werden und Gene identifiziert werden, die unterschiedlich reguliert werden. Vallat et al (Val- lat L, Magdelenat H, Merle-Beral H, Masdehors P, Potocki de Montalk G, Davi F, Kruhoffer M, Sabatier L, Omtoft TF, Delic J. The resistance of B-CLL cells to DNA damage-induced apoptosis defined by DNA microarrays. Blood. 2003 Jun 1 ; 101(11):4598-606. Epub 2003 Feb 13.) beschreiben den Vergleich von getrennten B-Zell chronischer lymphoider Leukämie (BCLL)-Zellproben. Dabei werden 16 unterschiedlich exprimierte Gene identifiziert, so unter anderem Nuclear orphan receptor TR3, major histocompatibility complex (MHC) Class II glycoprotein HLA-DQA1, mtmrό, c-myc, c-rel, c-IAPl, mat2A und finod, MIPla/GOS19-l homolog, statl, blk, hsp27, und echl.

Vasseli et al (Vasselli JR, Shih JH, lyengar SR, Maranchie J, Riss J, Worrell R, Torres-Cabala C, Tabios R, Mariotti A, Stearman R, Merino M, Walther MM, Simon R, Klausner RD, Linehan W M. P redicting s urvival i n p atients w ith m etastatic k idney c ancer by gene-expression profiling in the primary tumor. Proc Natl Acad S ci U S A. 2003 Jun 1 0;100(12):6958-63. Epub 2003 May 30.) beschreiben die Analyse von verschiedenen Geweben auf der Suche nach potentiellen molekularen Determinanten der Tumorbiologie und möglichem klinischen Ausgang in Nierenkrebs. Suzuki et al (Suzuki S, Asamoto M, Tsujimura K, Shirai T. Specific differences in gene expression profile revealed by cDNA microarray analysis of glutathione S-transferase placental form (GST-P) immunohistochemically positive rat liver foci and sur- rounding tissue. Carcinogenesis. 2004 Mar;25(3):439-43. Epub 2003 Dec 04.) beschreiben das Genexpressionsprofil in GST-P positiven Foci im Vergleich mit der Umgebung des Tumors. Die GST-P positiven Foci wurden durch Laser ausgeschnitten und mittels cDNA Mi- croarrayassays getestet.

Favier et al (Favier J, Plouin PF, Corvol P, Gase JM. Angiogenesis and vascular architecture in pheochromocytomas: distinetive traits in malignant tumors. Am J Pathol. 2002 Oct; 161(4): 1235-46.) beschreiben die Untersuchung von Genexpressionsprofilen im Rahmen der Angiogenese in Tumoren.

Pession et al (Pession A, Libri V, Sartini R, Conforti R, Magrini E, Bernardi L, Fronza R, Olivotto E , P rete A , T onelli R , P aolucci G . R eal-time R T-PCR o ft yrosine h ydroxylase t o detect bone marrow involvement in advanced neuroblastoma. Oncol Rep. 2003 Mar- Apr;10(2):357-62.) beschreiben TH mRNA Expression als eine spezifischen Tumormarker und dessen Analyse in verschiedenen Geweben.

Sabek et al (Sabek O, Dorak MT, Kotb M, Gaber AO, Gaber L. Quantitative detection of T- cell activation markers by real-time PCR in renal transplant rejection and correlation with histopathologic evaluation. Transplantation. 2002 Sep 15;74(5):701-7.) beschreiben ein einschritt RT-PCR Verfahren im Rahmen der Abstoßung von Transplantaten, die mit T- Zellmarkern einhergeh, z.B. Granzym B und Perforin

Schließlich beschreiben Hoffmann et al (Hoffmann R, Seidl T, Dugas M. Profound effect of normalization on detection of differentially expressed genes in oligonucleotide microarray data analysis. Genome Biol. 2002 Jun 14;3(7):RESEARCH0033.) die Normalisierung von Arraysignalen mittels drei verschiedener statistischer Algorithmen zum Nachweis verschieden exprimierter Gene.

Ähnliche Analysen sind z. B. in Schadt EE, Li C, Ellis B, Wong WH. Feature extraction and normalization algorithms for high-density oligonucleotide gene expression array data. J Cell Biochem Suppl. 2001;Suppl 37:120-5; 3: Dozmorov I, Centola M. An associative analysis of gene expression array data. Bioinfo matics. 2003 Jan 22;19(2):204-11; Workman C, Jensen LJ, Jarmer H, Berka R, Gautier L, Nielser HB, Saxild HH, Nielsen C, Brunak S, Knudsen S. A new non-linear normalization method for reducing variability in DNA microarray experi- ments. Genome Biol. 2002 Aug 30;3(9):research0048; Reiner A, Yekutieli D, Benjamini Y. Identifying differentially expressed genes using false discovery rate Controlling procedures. Bioinformatics. 2003 Feb 12 19(3):368-75; Troyanskaya OG, Garber ME, Brown PO, Botstein D, Altman RB. Nonparametric methods for identifying differentially expressed genes in microarray data. Bioinformatics. 2002 Nov;18(ll):1454-61 und Park PJ, Pagano M, Bonetti M. A nonparametric scoring algorithm for identifying informative genes from microarray data. Pac Symp Biocomput. 2001;:52-63 beschrieben. Die molekularen Profile bilden verschiedene Veränderungen ab, die sich in den individuellen Messpunkten (das heißt einer spezifischen mRNA, einem Protein, einem Metaboliten, der Methylierung einer spezifischen DNA-Sequenz) häufig überlagern und deshalb aus dem Gesamtwert eines Messpunktes nicht als Teilkomponenten erkennbar sind.

Am Beispiel der DNA- Array- Analyse soll dies v eranschaulicht werden. Veränderungen im Genexpressionsprofil können durch Verschiebungen der zellulären Zusammensetzung der Probe (Einwanderung von Zellen) als auch Aktivierungen einzelner oder mehrerer Gene verursacht sein. Es treten z.B. Veränderungen in der zellulären Zusammensetzung bei jeder Entzündung auf und sind deshalb nicht spezifisch für eine bestimmte Erkrankung. Dagegen können Aktivierungen einzelner oder mehrerer Gene typisch oder sogar spezifisch für einen bestimmten Krankheitsprozeß sein. Beide Veränderungen, die der zellulären Zusammensetzung und die der Regulationen von Gene, bilden sich in der Hybridisierung jedoch miteinander ab, ohne daß derzeitige bioinformatische Analysemethoden eine Zuordnung zu den beiden möglichen Ursachen erlauben. Die Interpretation der Array Daten ist somit stark eingeschränkt.

Vergleichbare zur Genexpression treten diese Probleme auch bei der Abbildung von Proteinexpressionsmustern auf. Werden ganze Gewebe untersucht, überlappen sich Veränderungen in der zellulären Zusammensetzung mit Veränderungen in der der Proteinexpression einzelner Zelltypen. Vergleichbar kann die Bestimmimg von DNA-Methylierungszuständen, die sich zwischen verschiedenen Zelltypen unterscheiden, bei variabler zelluläre Zusammensetzung unterschiedliche Ergebnisse liefern und eine krankheitsspezifische Veränderung in einem einzelnen Zelltyp verschleiern. Wird hingegen Serum oder eine andere Körperflüssigkeit untersucht, so können Veränderungen, die durch eine bestimmte Erkrankung ausgelöst werden, von anderen Einflüssen wie einer diabetischen Stoffwechsellage, einer Niereninsuffizienz oder einer bestimmten Therapie überlagert werden und eine Beurteilung erschweren oder gar unmöglich machen.

Um Genregulationen in Zellpopulationen zu erkennen, ist heute vor der Array- Analyse eine Aufreinigung der Zellen erforderlich oder eine histologische Untersuchung von Geweben mit immunhistologischer Zuordnung von Genen zu Zelltypen. Zellaufreinigungen können zu arti- fiziellen V eränderungen d er G enexpressionsmuster führen u nd h istologische M öglichkeiten sind auf wenige Gene beschränkt. Ferner sind Aufreinigungsschritte mit einem größeren tech- nischen und damit auch Kostenaufwand verbunden. Hauptziel für eine Routineanwendung ist die Untersuchung von möglichst einfach zugängigen Proben und möglichst unkomplizierter Weiterverarbeitung. D ie g roßte A ttraktivität für eine R outineanwendung b esitzt h ierf r d as Blut. Insbesondere das Blut unterliegt bei vielen Erkrankungen zum Teil erheblichen Schwankungen in der zellulären Zusammensetzung und erschwert deshalb die Interpretation von komplexen molekularen Profilen aus dieser Probenart.

Die Bedeutung dieser Vermischung von Ursachen und Wirkungen wird in Figur 5 dargestellt. Dies wird um so deutlicher, als die meisten regulierten Gene keiner Ein-/ Aus-Aktivität unterliegen sondern meist eine Grundaktivität aufweisen. Ferner können sie nicht nur in einem sondern in verschiedenen Zelltypen und auch Stoffwechselwegen unterschiedlich aktiv sein. Es fällt somit der Großteil der differentiell exprimierten Gene in diese ursächlich nicht eindeutig zuordenbare Gruppe. Es sind derzeit also für die meisten Gene weiterführende Untersuchungen erforderlich, um zu klären, ob eine Verschiebung in der Zellzusammensetzung oder eine Genregulation aufgetreten ist.

Prinzipiell ist dieses Problem genereller Natur und trifft auch für Profile der Protemexpression und Proteinmodifikation oder epigenetische Profile (d.h. unterschiedliche Methylierungsprofi- le der DNA aus verschiedenen Zelltypen oder komplexen Proben) zu.

Es ist somit eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein verbessertes Verfahren zur Verfügung zu stellen, das zur Aufschlüsselung der genannten komplexen Informationen z.B. aus Array-Analysen verwendet werden kann. Das Verfahren soll die schnelle und in der Hochdurchsatz-Technik anwendbare Analyse von komplexen Expressionsprofilen ermöglichen, ohne das besondere Aufreinigungsschritte erforderlich sind. Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein für das erfindungsgemäß Verfahren geeignetes bioinformatisches Rechenprogramm zur Verfügung zu stellen. Zuletzt sollen geeignete verbesserte Vorrichtungen zur Verfügung gestellt werden.

Eine dieser Aufgaben wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung und qualitativen Charakterisierung eines komplexen Expressionsprofils in einer biologischen Probe gelöst, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt von a) zur Verfügung stellen einer zu untersuchenden biologischen Probe, b) zur Verfügung stellen mindestens eines geeigneten Expressionsprofils, wobei das mindestens e ine E xpressionsprofil e inen o der m ehrere Marker u mfaßt, d ie a usschließlich für d as Expressionsprofil typisch sind, c) Bestimmen des komplexen Expressionsprofils der biologischen Probe, und d) Bestimmen der quantitativen zellulären Zusammensetzung der biologischen Probe mittels der in den Schritten b) und c) bestimmten Expressionsprofile.

In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt das erfindungsgemäße Verfahren zur quantitativen Bestimmung und qualitativen Charakterisierung eines komplexen Expressionsprofils in einer biologischen Probe die weiteren Schritte von e) Berechnung eines virtuellen Signals, das aufgrund der bestimmten Zusammensetzung der Expressionsprofile erwartet wird, f) Berechnung der Differenz aus dem tatsächlichem gemessenem komplexen Expressionsprofils und dem virtuellen Signal, und g) Bestimmen der quantitativen Zusammensetzung des komplexen Expressionsprofils auf Basis der ermittelten Differenzen.

Die vorliegende Erfindung zeigt hier ein Verfaliren auf, das zur Aufschlüsselung komplexer Informationen aus Array-Analysen beiträgt. Dieses Verfahren gliedert sich erfindungsgemäß in mehrere Schritte.

Es werden zunächst folgende Profile für die Auftrennung der Einflüsse benötigt: a) ein Expressionsprofil, das zum Beispiel den Normalzustand darstellt, b) weitere definierte oder spezifische Expressionspro file, die z.B. definierte Einflüsse oder Zustände einer Zelle oder Zellpopulation charakterisieren, und c) d as z u u ntersuchende k omplexe E xpressionsprofil d er b iologischen P robe, z um B eispiel des Erkrankungszustandes.

Die typischen „Expressionsprofile" oder „Profile" von definierten Einflüssen und/oder Zuständen werden nachfolgend auch „Signaturen" oder „Fingerprints" genannt. Für die Erkennung der Zellzusammensetzung sind Signaturen für die verschiedenen Zelltypen erforderlich, z.B. für Monozyten, für T-Zellen, für Granulozyten usw. Vergleichbar dazu kann auch eine sogenannte „funktionelle" und /oder „charakterisierende" Signatur, wie sie durch eine bestimmte Zytokineinwirkung entsteht, eine Signatur im Sinne der vorliegenden Erfindung darstellen. Für jeden Einfluß, der erkannt und von anderen molekularen Informationen abgetrennt werden soll, müssen Markergene definiert werden. Diese lassen den Anteil einer Signatur am Gesamtprofil quantitativ abschätzen. Für die Erkennung unterschiedlicher zellulärer Zusammensetzungen werden also z.B. Markergene für Monozyten, T-Zellen oder Granulozyten identifiziert. Diese spiegeln den Anteil der jeweiligen Zellpopulation in einer gemischten Probe wieder. Für die zelluläre Zusammensetzung einer Probe könnten alternativ auch andere Meßverfahren, wie z. B. das Differentialblutbild oder eine FACS-Analyse verwendet werden.

Allerdings können zwischen molekular charakterisiertem Anteil und mit anderen Methoden gemessenem Anteil unterschiedliche Relationen auftreten, die nachfolgend zu einer fehlerhaften Berechnung führen können. Es ist daher anzustreben, daß die Grundlagen für die nachfolgenden Berechnung dem gleichen Meßverfahren entstammen.

Mit Hilfe der molekularen Signaturen von Zellpopulationen (bzw. Einflüsse) und deren quantitativen Beteiligung am Gesamtprofil kann ein virtuelles Signal berechnet werden, das aufgrund der Zusammensetzung erwartet wird. Die Differenz aus tatsächlichem gemessenem Signal und dem erwartenden Signal läßt erkennen, ob sich die Unterschiede lediglich durch die Mischung der verschiedenen Populationen (Einflüsse) erklären (keine Differenz) oder eine Aktivierung (positive Differenz) bzw. eine Unterdrückung (negative Differenz) der Genaktivität stattgefunden hat. Angewand auf alle mit dem Array gemessenen Gene können die Profile virtuell in Teilkomponenten zerlegt werden.

Über Unterschiede i n d er V erteilung d er v erschiedenen K omponenten i st z u e rwarten, d aß Kriterien für eine Einteilung in unterschiedliche Gruppen definiert werden können. Gene, deren Expressionsverhalten keiner bekannten Teilkomponente zugeführt werden können, sind von besonderem Interesse für die weitere Abklärung und Suche nach noch unbekannten Teilkomponenten.

Bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren zur quantitativen Bestimmung und qualitativen Charakterisierung eines komplexen Expressionsprofils in einer biologischen Probe, wobei das Bestimmen des geeigneten Expressionsprofils das Bestimmen eines RNA- Expressionsprofils, Protein-Expressionsprofils, -Sekretionsprofils, DNA-Methylierungsprofils und/oder Metabolitenprofil umfaßt. Natürlich können auch Kombinationen davon bestimmt werden, was die Auswertung jedoch erschwert.

Weiter bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren zur quantitativen Bestimmung und qualitativen Charakterisierung eines komplexen Expressionsprofils in einer biologischen Probe, wobei das Bestimmen eines Expressionsprofils eine molekulare Nachweismethode, wie z. B. ein Genarray, Proteinarray, Peptidarray und/oder PCR- Array oder die Erstellung eines Differentialblutbilds oder eine FACS-Analyse umfaßt. Die vorliegende Erfindung ist somit nicht nur auf Nukleinsäure-Arrays beschränkt. Zudem können auch Expressionsprofile aus Gelanalysen (z. B. 2D), Massenspektrometrie und/oder enzymatischem Verdau (Nuklease- oder Pro- tease-Pattern) verwendet werden.

Noch weiter bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren zur quantitativen Bestimmung und qualitativen Charakterisierung eines komplexen Expressionsprofils in einer biologischen Probe, wobei die oben in Schritt b) des Verfahrens bestimmten Expressionsprofile ausgewählt sind aus der Gruppe von Expressionsprofilen, die funktionelle Einflüsse oder Zustände charakterisieren, wie z.B. Expressionsprofile, die die Aktivität von bestimmten Botenstoffen, der Signaltransduktion oder der Genregulation charakterisieren. Weiterhin können diese die Ausprägung bestimmter molekularer Vorgänge charakterisieren, wie z.B. der Apoptose, Zellteilung, Zelldifferenzierung, Gewebeentwicklung, Entzündung, Infektion, Tumorgenese, Meta- stasierung, Gefäßiieubildung, Invasion, Zerstörung, Regeneration, Autoimmunreaktion, Immunkompatibilität, Wundheilung, Allergie, Vergiftung und/oder der Sepsis. Auch können diese die Ausprägung bestimmter klinischer Zustände charakterisieren, wie z.B. des Erkrankungsstatus oder der Wirkung von Medikamenten. Die Wahl der Expressionsprofile hängt vom Ursprung der zu untersuchenden biologischen Probe ab, sowie deren Zusammensetzung und/oder erwarteten Zusammensetzung. Gegebenenfalls müssen die Profile im Vorgang zu der Messung definiert und geeignet bestimmt werden, oder lassen sich aus öffentlichen Expressions-Datenbanken entnehmen.

Noch weiter bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren zur quantitativen Bestimmung und qualitativen Charakterisierung eines komplexen Expressionsprofils in einer biologischen Probe, wobei die Berechnung der Gesamtkonzentration aus den Anteilen A_i der verschiedenen Zelltypen bzw. Einflüssen (z.B. eingewanderte Zelltypen) i mit ihren unterschiedlichen Konzentrationen K. mittels der Beziehung K_prob =K A_I +K₂ - A₂ + ... = ∑(K_i - A,) mit i e N (Gleichung 3) i=l erfolgt.

Immer noch weiter bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren zur quantitativen Bestimmung und qualitativen Charakterisierung eines komplexen Expressionsprofils in einer biologischen Probe, wobei der SLR- Wert eines Markergens mittels der Formel

A_Zelltv = 2 χ^k (^SLR (Gleichung (14)

bestimmt wird. Für jeden Einfluß, der erkannt und von anderen molekularen hiformationen abgetrennt werden soll, müssen Markergene definiert werden. Diese lassen den Anteil einer Signatur am Gesamtprofil quantitativ abschätzen. Für die Erkennung unterschiedlicher zellulärer Zusammensetzungen werden also z.B. Markergene für Monozyten, T-Zellen oder Granulozyten identifiziert. Diese spiegeln den Anteil der jeweiligen Zellpopulation in einer gemischten Probe wieder.

Bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren zur quantitativen Bestimmung und qualitativen Charakterisierung eines komplexen Expressionsprofils in einer biologischen Probe, wobei der Marker ausgewählt ist aus den in Tabelle 2 unten angegebenen Markern. Diese Marker sind jedoch nur beispielhaft für die dort angegebenen Zelltypen und können mittel der hier offenbarten Lehre leicht auch für andere Gewebe entsprechend ermittelt werden.

Weiter bevorzugt ist ein erfmdungsgemäßes Verfahren zur quantitativen Bestimmung und qualitativen Charakterisierung eines komplexen Expressionsprofils in einer biologischen Probe, umfassend die beispielhafte qualitative und/oder quantitative Erkennung von Expressionsprofilen eines T-Zell-, Monozyten- und/oder Granulozyten-Expressionsprofils.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung und qualitativen Charakterisierung eines komplexen Expressionsprofils in einer biologischen Probe, wobei das Bestimmen der quantitativen Zusammensetzung des komplexen Expressionsprofils auf Basis der ermittelten Differenzen weiterhin die Identifizierung eines bisher unbekannten Expressionsprofils umfaßt. Der Vergleich zwischen zwei komplexen Proben liefert zunächst eine differentielle Genexpression, die sowohl durch Unterschiede der zellulären Zusammensetzung als auch durch Genregulation hervorgerufen sein kann. Im ersten Schritt ist deshalb die zelluläre Zusammensetzung aufzuschlüsseln. Dies erfolgt unter Verwendung von Signaturen, die verschiedene Zelltypen charakterisieren. Durch die Verwendung von Normalsignaturen für Gewebe und einzelne Zelltypen wird ein zu erwartendes Profil errechnet, das nur die normale Genexpression berücksichtigt. Der Unterschied aus diesem virtuellen Profil und dem tatsächlich gemessenen Profil ergibt die Gene, die entweder durch weitere, noch nicht berücksichtigte Zelltypen oder durch Regulation verändert sind. Funktionelle Veränderungen in der Genexpression sind deshalb in dieser Differenz zu erwarten. Eine Zuordnung zu einem bestimmten Zelltyp ist zunächst nicht möglich. Diese Gene gehen aber aus der funktioneilen Veränderung der beteiligten Zellen hervor. Werden Markergene für die vom Zelltyp bereinigte funktionelle Signatur definiert, kann der Anteil dieser Signatur im Unterschied zwischen virtuellem Profil und tatsächlich gemessenem Profil quantitativ abgeschätzt werden. Diese funktionellen Profile lassen sich nun schrittweise aus dem Unterschied zwischen virtuellem Profil und tatsächlich gemessenem Profil erschließen.

Insgesamt werden so Parameter für die zelluäre Zusammensetzung und molekulare Funktionen geschaffen, die untereinander sowie mit klinischen Merkmalen korreliert werden können. Dadurch ergeben sich neue Bewertungsmaßstäbe für die Interpretation von Array Daten, die sowohl für die Diagnostik, als auch für die Identifizierung von therapeutisch bedeutsamen Zielstrukturen (insbesondere Proteine (z. B. Enzyme, Rezeptoren) und/oder deren Komplexe) bzw. Regulationsmechanismen entscheidende Verbesserung liefern.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft somit ein Verfaliren zur quantitativen Bestimmung und qualitativen Charakterisierung eines komplexen Expressionsprofils in einer biologischen Probe, wobei das Bestimmen der quantitativen Zusammensetzung des komplexen Expressionsprofils auf Basis der ermittelten Differenzen weiterhin die Identifizierung von molekularen Kandidaten für die diagnostische, prognostische und/oder therapeutische Anwendung umfaßt.

Ein noch weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft dann einen molekularen Kandidaten oder auch Zielstruktur für die diagnostische, prognostische und/oder therapeutische Anwendung, identifiziert mittels des erfindungsgemäßen Verfahren. Bevorzugt ist ein moleil kularer K andidat für die diagnostische, prognostische und/oder therapeutische Anwendung, der eine in einer der Tabellen 5 bis 8 aufgeführte Sequenz aufweist.

Erfindungsgemäß können die molekularen Kandidaten der Erfindung zum Beispiel a) zur Charakterisierung der entzündlichen Zellinfiltration in ein entzündetes Gewebe mit Genen der Tabelle 5 abgrenzend von der Genaktivierung durch Entzündung, b) zur Charakterisierung der Genaktivierung in einem entzündeten Gewebe mit Genen der Tabelle 6 abgrenzend von der Zellinfiltration, c) zur Charakterisierung der Genaktivierung bzw. der entzündlichen Zellinfiltration in ein entzündetes Gewebe über den berechneten Anteil an Aktivierung bzw. Infiltration der Gene in Tabelle 7 und/oder d) zur Charakterisierung von Untergruppen entzündlicher Genaktivierung mit Genen der Tabellen 6, 7 und/oder 8.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft dann diese Kandidaten und/oder Zielstrukturen als „Werkzeuge" zur Diagnostik, molekularen Definition und Therapieentwicklung von Erkrankungen, insbesondere chronischer entzündlicher Gelenkerkrankungen, und anderer entzündlicher, infektiöser oder tumoröser Erkrankungen beim Menschen. Dabei können die Sequenzen einzelner Gene, eine Auswahl von Genen oder alle Gene, die in Tabellen 5 bis 8 genannt sind sowie deren kodierte Proteine verwendet werden. Diese erfindungsgemäßen Werkzeuge können weiterhin Gensequenzen einbeziehen, die in ihrer Sequenz identisch zu den in Tabellen 5 bis 8 genannten Genen bzw. zu deren kodierten Proteine sind oder mindestens 80% Sequenzidentität in den Protein-kodierenden Abschnitten besitzen. Weiterhin sind entsprechende (DNA oder RNA oder Aminosäure-) Sequenzabschnitte oder Teilsequenzen einbezogen, die in ihrer Sequenz eine Sequenzidentität von mindestens 80% zu den entsprechenden Abschnitten der genannten Gene besitzen.

Die erfindungsgemäßen Werkzeuge können in vielen Aspekten der Prognose, Therapie und/oder Diagnose von Erkrankungen Verwendung finden. Bevorzugte Verwendungen sind high-throughput Verfaliren in der Protein-Expressionsanalytik (hochauflösende, zweidimen- sionale Protein-Gelelektrophorese, MALDI-Techniken), high-throughput Verfahren in der Protein-Spotting Technik (Protein Arrays) zum Screening von Autoantikörpern als diagnostisches Werkzeug für entzündliche Gelenkerkrankungen und andere entzündliche, infektiöse oder tumoröse Erkrankungen beim Menschen, high-throughput Verfahren in der Protein- Spotting Technik (Protein Arrays) zum Screening von autoreaktiven T-Zellen als diagnostisches Werkzeug für entzündliche Gelenkerkrankungen und andere entzündliche, infektiöse oder tumoröse Erkrankungen beim Menschen, nicht-high-throughput Verfaliren in der Protein-Spotting Technik zum Screening von autoreaktiven T-Zellen als diagnostisches Werkzeug für entzündliche Gelenkerkrankungen und andere entzündliche, infektiöse oder tumoröse Erkrankungen beim Menschen oder zur Erzeugung von Antikörpern (auch humanisierten oder humanen), die spezifisch für die genannten Proteine oder Teilsequenzen der Werkzeuge sind, die in Tabellen 5 bis 8 aufgeführt sind oder für die Analytik in Tierexperimenten oder zur Diagnostik bei Tieren mit entzündlichen Gelenkerkrankungen und anderen entzündlichen, infektiösen oder tumorösen Erkrankungen mittels entsprechenden homologen Sequenzen einer entsprechenden anderen Spezies.

Weiter Verwendungen betreffen die Werkzeuge als diagnostische Werkzeuge zum Nachweis genetischer Veränderungen (Mutationen), in den genannten Genen oder deren Regulationssequenzen (Promotor, Enhancer, Silencer, spezifische Sequenzen für die Bindung weiterer regulatorischer Faktoren).

Weiterhin können die erfindungsgemäßen Werkzeuge zum Therapie-Entscheid und/ oder zur Verlaufskontrolle/ Therapiekontrolle entzündlicher Gelenkerkrankungen und/oder anderen entzündlichen, infektiösen oder tumorösen Erkrankungen beim Menschen unter Verwendung der genannten Gene, DNA-Sequenzen oder davon abgeleitete Proteine oder Peptide und / oder zur Entwicklung von Therapiekonzepten, die direkte oder indirekte Beeinflussung der Expression der genannten Gene oder Gensequenzen, die Expression der genannten Proteine oder Protein-Teilsequenzen oder die direkte oder indirekte Beeinflussung autoreaktiver T- Zellen, gerichtet gegen die genannten P roteine oder P rotein-Teilsequenzen, b einhalten v erwendet werden, oder um unter Design und Verwendung von hiterpretationsalgorithmen die genannten Gene und Sequenzen und deren Regulationsmechanismen verwenden, um Therapiekonzepte, -Wirkungen, -Optimierungen oder Krankheitsprognosen erkennen zu lassen oder vorauszusagen.

Weiterhin können die erfindungsgemäßen Werkzeuge zur Beeinflussung der biologischen Wirkung der aus den genannten Gensequenzen abgeleiteten P oteine, der unmittelbaren molekularen Regelkreise, in die die genannten Gene und davon abgeleiteten Proteine eingebunden sind, und zur Entwicklung von biologisch wirksamen Medikamenten (Biologicals) unter Verwendung von Genen, Gensequenzen, Regulation von Genen oder Gensequenzen, oder unter Verwendung von Proteinen, Proteinsequenzen, Fusionsproteinen oder unter Verwendung von Antikörpern oder autoreaktiven T-Zellen wie oben genannt, verwendet werden.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen Array als molekulares Werkzeug, bestehend aus verschiedenen Antikörpern oder Molekülen mit vergleichbarem proteinspezifischem Bindungsverhalten, die zum Nachweis aller oder einer Auswahl der von den Genen der Tabellen 5 bis 8 abgeleiteten Proteine oder aller bzw. einer Auswahl dieser Proteine dienen. Dieser Array kann auch als Kit vorliegen, z.B. zusammen mit herkömmlichen Inhaltsstoffen und Gebrauchsanweisungen.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft schließlich die Verwendung eines erfindungsgemäßen molekularen Kandidaten zum Screenen auf pharmakologisch aktive Substanzen, insbesondere Bindepartner. Entsprechende Verfahren sind im Stand der Technik gut bekannt einschließlich unter anderem der folgenden Publikationen: Abagyan R, Totrov M. High-throughput docking for lead generation. Curr Opin Chem Biol. 2001 Aug;5(4):375-82. Review. Bertrand M, Jackson P, Walther B. Rapid assessment of drug metabohsm in the drug discovery process. Eur J Pharm Sei. 2000 Oct;ll Suppl 2:S61-72. Review. Panchagnula R, Thomas NS. Biopharmaceutics and pharmaeokinetics in drug research. Int J Pharm. 2000 May 25;201(2):131-50. Review. White RE. High-throughput screening in drug metabohsm and pharmaeokinetie support of drug discovery. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2000;40:133- 57. Review. Zuhlsdorf MT. Relevance of pheno- and genotyping in clinical drug develop- ment. Int J Clin Pharmacol Ther. 1998 Nov;36(ll):607-12. Review. Chu YH, Cheng CC. Affinity capillary electrophoresis in biomolecular recognition. Cell Mol Life Sei. 1998 Jul;54(7):663-83. Review. Kuhlmann J. Drug research: from the idea to the produet. Int J Clin Pharmacol Ther. 1997 D ec;35(12):541-52. Review. J Hepatol. 1997;26 S uppl 2:26-36. Review. Shaw I. Receptor-based assays in screemng for biologically active substances. Curr Opin Biotechnol. 1992 Feb;3(l):55-8. Review. Manila Tl. Validity of in vitro testing. Drug Metab Rev. 1990;22(6-8):777-87. Review. Bush K. Screening and characterization of enzyme inhibitors as drug candidates. Drug Metab Rev. 1983;14(4):689-708. Review.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Diagnose, Prognose und/oder Verfolgung einer Erkrankung, umfassend ein wie oben genanntes Verfahren. Die entsprechende Verknüpfung der Expressionsprofildaten mit der Diagnose, Prognose und/oder Verfolgung einer Erkrankung ist dem Fachmann aus dem Stand der Technik bekannt und kann entsprechend an die jeweiligen Verhältnisse angepaßt werden (siehe z. B. Simon R. Using DNA microarrays for diagnostic and prognostic prediction. Expert Rev Mol Diagn. 2003 Sep;3(5):587-95. Review.; Franklin WA, Carbone DP. Molecular staging and pharma- cogenomics. Clinical implications: from lab to patients and back. Lung Cancer. 2003 Aug;41 Suppl 1:S 147-54. Review. Kalow W. Pharmacogenetics and personalised medicine. Fundam Clin Pharmacol. 2002 Oct;16(5):337-42. Review; Jain KK. Personalized medicine. Curr Opin Mol Ther. 2002 Dec;4(6):548-58. Review.).

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft dann ein Computersystem, das mit Mitteln zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens versehen ist. Ein Computersystem im Sinne der vorliegenden Erfindung kann aus einem oder mehreren einzelnen Rechnern bestehen, die zentral oder dezentral miteinander vernetzt sein können. Ein noch weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Computerprogramm, umfassend einen Programmiercode, um die Schritte des erfindungsgemäßen Verfalirens durchzuführen, wemi auf einem Computer ausgeführt. Ein noch weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft schließlich ein computerlesbares Datenträgermedium, umfassend ein erfindungsgemäßes Compute rogramm in Form eines computerlesbaren Programmcodes.

Ein noch weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen Laborroboter oder Auswertegerät für molekulare Nachweismethoden (z. B. ein computerisiertes CCD-Kamera- Auswertesystem), umfassend ein erfindungsgemäßes Computersystem und/oder ein erfindungsgemäßes Computerprogramm. Entsprechende Geräte sind dem Fachmann gut bekannt und können an die vorliegende Erfindung ohne weiteres angepaßt werden.

Die Erfindung soll nun im folgenden anhand der beigefügte Beispiele weiter verdeutlicht werden, ohne darauf beschränkt zu sein. In den beigefügten Figuren zeigt:

Figur 1 : ein Verdünnungsexperiment zur Abschätzimg der Konzentration nicht- regulierter Markergene

Figur 2: den K urvenverlauf i n G renzbereichen b ei n iedriger u nd h oher K onzentration des Markers Figur 3: die verschiedenen Beziehungsgrößen, die für Berechnungen angenommen werden

Figur 4: Beziehung zwischen Signal und Konzentration bei den Extremzuständen Mj und ₂

Figur 5: die hierarchische Clusteranalyse unter Verwendung der Gene aus Tabelle 5

Figur 6: die hierarchische Clusteranalyse unter Verwendung der Informationen aus der

Berechnung von Infiltrationsanteilen der verschiedenen Zelltypen (Tabelle 4)

Figur 7: A) Hierarchische Clusteranalyse unter Verwendung der Gene aus Tabelle 6.

Die Vertreter RA3, RA6, RA7 und RA9 stellen in der hierarchischen Clusteranalyse mit euklidischer Distanzrechnung eine separate Gruppe d ar, die zwischen der OA Gruppe und der übrigen RA Gruppe steht. B) Veranschaulichung mittels Principle Component Analysis (PCA); Gene der Tabelle 6

Figur 8: die hierarchische Clusteranalyse mit den Genen der Tabelle 7

Figur 9: A) die hierarchische Clusteranalyse mit den Genen der Tabelle 8. B) die Veranschaulichung der Unterschiede mittels PCA der Experimente, die sich durch Verwendung der Gene aus Tabelle 8 ergeben

Beispiele

Ausgangssituation

Es können die beiden folgenden unterschiedlichen Ausgangssituationen vorliegen:

1.) Ein Zelltyp (zu messender Einfluß) kann in der Kontroll-Probe vollständig fehlen. Erst im veränderten (erkrankten) Zustand werden in der Probe unterschiedliche und für die Erkrankung bedeutsame Zellen (oder Einflüsse) gefunden. Beispiel: Synovialgewebe weist im Normalzustand k eine Infiltrate aus T-Zellen, Monozyten, etc. auf. Erst durch Entzündungsvorgänge gelangen diese Zellen in das Gewebe und erfahren dort weitere Aktivierung. 2.) Andererseits kann bereits in der Normalsituation eine Mischung aus verschiedenen Zelltypen (oder Einflüssen) vorliegen. So setzt sich z.B. das Blut aus verschiedenen Zellen zusammen, d ie a uch i m N ormalzustand V ariationen u nterliegen. Bei E rkrankungen k önnen d iese Variationen sehr stark ausgeprägt sein. Sie sind nicht krankheitsspezifisch, können aber möglicherweise die für eine Krankheit typischen Genregulationen verschleiern.

Einstellungen der verwendeten Software

Idenfϊzierung von Markergenen

Unterschiedliche Zelltypen lassen sich durch Zelloberflächenmarker unterscheiden. Vergleichbar sind auch aus Genexpressionsanalysen unterschiedliche Merkmale zu erwarten, die für einzelne Zelltypen charakteristisch sind und eine quantitative Abschätzung erlauben.

Genexpressionsprofile von Geweben und aufgereinigten Zellen wurden miteinander verglichen. Es werden Gene ausgewählt, die nur in einer Zellpopulation oder einem Gewebe vorhanden sind, nicht aber in den anderen. Diese sind Kandidaten für die Abschätzung, mit welchem Anteil diese Population in einer Probe mit gemischten Zelltypen vorhanden ist.

Die in Tabelle 1 angegebenen Zellpopulationen und Gewebe wurden miteinander verglichen. Die Auswahlkriterien für die erste Stufe der Genselektion waren, daß

• alle Messungen in der Markerpopulation eine signifikant höhere Expression ergeben als alle Messungen in anderen Populationen und Geweben und • der mittlere Unterschied zwischen den Signalen ein Ausmaß übersteigt, das auch in einem geringen Anteil am Gesamtprofil noch meßbare Unterschiede erwarten läßt.

Mit dieser Auswahl wurden die in Tabelle 2 angegeben Gene identifiziert. Diese Gene sind nicht für alle Proben geeignet. Zum Beispiel können einige dieser Gene bei niedrigen Zellkonzentrationen nicht mehr nachweisbar sein und dann zu einer quantitativen Unterschätzung des Einflusses führen. Deshalb sind weitere Einschränkungskriterien erforderlich, die auf die zu untersuchenden komplexen Proben angepaßt werden müssen. • Die Markergene müssen ausreichende Signale und Unterschiede in der zu untersuchenden komplexen Probe liefern, wenn eine Infiltration / Anteil am Gesamtprofil erwiesen ist (z.B. über Bestimmung des Differentialblutbildes). • Im Vergleich zur Kontrolle darf keine Regulation dieser Gene in der zu untersuchenden Probe stattfinden. • Die Gene dürfen im Signaturprofil im Vergleich zur untersuchten Probe nicht artifizi- ell induziert oder unterdrückt sein.

Für die Untersuchung von Synovialgeweben bzw. Vollblut-Proben wurden die in Tabelle 2 gesondert bezeichneten Gene verwendet. Zur Berechnung der Anteile wurden die im nachfolgenden Abschnitt etablierten Bedingungen und aufgestellten Gleichungen verwendet. Zur Auswahl dienten die in Tabelle 3 genannten Einschränkungskriterien.

Beziehung zwischen Signal und RNA- bzw. Zeil-Konzentration

Es wird von der Grundbeziehung ausgegangen, daß sich die logarithmierten Werte von gemessenem Signal und Konzentration der RNA zueinander linear verhalten (Gleichung 1).

log* 0 ) = k ^■ \og_b (x ) + a (Gleichung 1 )

mit y:= Signal; x:= Konzentration der RNA und b _ R.

Die praktische Anwendbarkeit wurde in einem Verdünnungsexperiment mit unterschiedlichen Konzentrationen von CD4-positiven T-Zellen in CD4-depletierten peripheren mononuklearen Blutzellen überprüft. Für nicht regulierte Gene, die ausschließlich in einer Population vorkommen, stellt die Konzentration dieser Population eine „Konzentrationseinheit" für das Gen dar. D amit v erhält s ich a uch d er Logarithmus d er K onzentration d er C D4-positiven Z eilen zum Logarithmus des Signals linear. Diese Annäherung wird in Figur 1 an dem Verdünnungsexperiment veranschaulicht.

Aus dieser Modellannahme ergibt sich folgende theoretischen Beziehungen:

• Mit Annäherung an eine Konzentration von 0 geht der Logarithmus gegen -∞ . • Mit einer Annäherung der Signale an 0 geht auch der Logarithmus der Signale gegen —00 . In der Realität ergeben sich jedoch andere Grenzbedingungen. Bei niedrigen Konzentrationen eines Gens wird die Nachweisgrenze erreicht. Geringe Signale der spezifisch bindenden Probe werden durch Signale aus fehlerhaften Hybridisierungen und Hintergrundsintensitäten überlagert. Dadurch kommt es zu einer Abflachung, wie sie in Figur 2 dargestellt ist. Dieser Übergang erweist sich in der Praxis sehr vielfältig. Wird für diesen Grenzbereich eine lineare Beziehung angenommen, ergeben sich fälschlicherweise zu hohe Werte für die Konzentration des Gens in einer Probe.

Darüber hinaus wird die Hybridisierungsstärke und damit der Anstieg des Signals mit der Zunahme der Konzentration für jede Sequenz einer individuellen Dynamik folgen. Diese ist bestimmt v on d er S equenz d er P robe, aber auch v on d en H ybridisierungsbedingungen, d er Hybridisierungsdauer und den Stringenzbedingungen der anschließenden Waschschritte.

Auch in hohen Signalbereichen werden sich die Hybridisierungs- und Detektionsbedingungen nicht mehr linear verhalten sondern an ein Maximum des Meßsystems annähern. In diesem Bereich wird die echte Konzentration eines Gens unterschätzt (Figur 2).

Die tatsächlichen Konzentrationen für ein Gen in einer gegebenen Probe sind unbekannt. Sie ließen sich theoretisch aus der Array-Hybridisierung nur abschätzen, wenn eine entsprechende Eichkurve für jedes Gen vorliegen würde. Diese Eichkurven sind aber nicht vorhanden und auch zu aufwendig, um sie für alle Gene zu erstellen. Für den Vergleich zweier Arrays ist zunächst die Kenntnis der Konzentrationen auch unerheblich. Bedeutend ist lediglich die Abstimmung der Arrays aufeinander durch Normalisierung der Signale.

Figur 3 veranschaulicht die verschiedenen Beziehungsgrößen, die für Berechnungen angenommen werden.

Es ergibt sich aus Gleichung 1 für die Bestimmung von Unterschieden zwischen zwei Arrays A und B folgende Beziehung:

log₄ (S_A ) - log₆ (S_B ) = [k- log_A (K_Λ ) + a] - [k • log₆ (K_B ) + a] oder zusammengefaßt

l g, -) = *^• log, (§*-) (Gleichung 2) Damit ist die Bestimmung des Unterschieds zwischen den logarithmierten Werten der Signale S_A und S_s , die auch Signal Log Ratio genannt wird, ein Maß für die Unterschiede zwischen den Konzentrationen K_A und K_B in den beiden Proben A und B.

Für die Berechnung der Gesamtkonzentration aus den Anteilen A_{ der verschiedenen Zelltypen bzw. Einflüssen i mit ihren unterschiedlichen Konzentrationen _ST. ergibt sich die folgende Beziehung: « K_Probe = K₁ - A₁ +K₂ - A₂ +... =∑(K A_t) mit / e N (Gleichung 3) !=1

Damit wird ersichtlich, daß für die Aufschlüsselung der Gesamtprofile in Einzelkomponenten die Festlegung von absoluten Bezugsgrößen für die RNA- bzw. Zeil-Konzentration erforderlich ist.

Abschätzung der Detektionsgrenzen und des Dynamikbereichs des Arrays

Aus Gleichungen 1 bis 3 und den Überlegungen zu Figur 2 ergeben sich folgende unbekannte Größen, die für die Berechnung erforderlich sind:

• der Anstieg k als Ausdruck der Dynamik des Meßbereichs für ein Gen und • die Zuordnung eines definierten Signalwerts zu einer definierten Konzentration für die Festlegung der Geraden im Koordinatensystem

Als Fixpunkt für die Festlegung der Geraden im Koordinatensystem wird die untere Nachweisgrenze S_min gewählt. Die Nachweisgrenze kann theoretisch durch Verdünnungsexperimente für jedes Gen ermittelt werden. Alternativ kann zur Abschätzung eine fehlerhafte Hybridisierung mit nicht vollständig übereinstimmenden Sequenzen (mismatch- Oligonukleotiden) gemessen werden. Die Affymetrix Technologie verwendet diese perfect match / mismatch Technologie und errechnet daraus eine Wahrscheinlichkeit, ob das gemessene Signal eines Gens vorhanden oder abwesend ist („present" oder „absent").

Um S_min für jedes Gen individuell zu bestimmen, wurden 123 Messungen mit Affymetrix HG-U133A Arrays von verschiedenen Zelltypen, Zellmischungen und Gewebeproben analysiert. E s w urden d ie m aximalen u nd m inimalen W erte für j edes g emessene G en b estimmt. Gleichzeitig wurde die Präsenz dieser Gene geprüft. Es ergaben sich von insgesamt 22283 Affymetrix "Probe-Sets" dieses Arrays drei Gruppen:

1.) 4231 Probe-Sets, die in allen 123 Messungen als "absent" eingestuft wurden, 2.) 2197 Probe-Sets, die ausschließlich den Status "present" lieferten und 3.) 15855 Probe-Sets, die zum Teil mit "present" und zum Teil mit "absent" eingestuft wurden.

Die Gene, die nur absent gefunden wurden, spielen in den gemessenen Proben offensichtlich keine Rolle und müssen in der Berechnung nicht näher berücksichtigt werden. Sollten diese Gene in anderen Probenarten nachweisbar werden, kann analog zur 3. Gruppe die Berechnung erfolgen. Für Gene, die ausschließlich als "present" eingestuft werden, kann eine Nachweisgrenze nur geschätzt werden. Als Maß kann der Mediän oder Mittelwert aller Nachweisgrenzen dienen, die für die 3. Gruppe definiert wurden.

Die Signalhöhe S_min als Grenze des Übergangs von „absent" zu „present" wurde ebenfalls aus den 123 Messungen für jedes Gen individuell bestimmt. Zunächst wurden die niedrigsten „present" Signale und höchsten „absent" Signale festgestellt. Von allen zwischen diesen Grenzen liegenden Werten wurde der Mediän als die Grenze S_min definiert. Bei fehlender Überlappung wurde der höchste „absent" Wert als S_min festgelegt. Für alle Gene, die keine „absent" Bestimmungen aufwiesen, wurde der Mediän aller S_m/π Grenzwerte als einheitlicher S_min festgelegt (68,6). Alternativ könnte auch eine andere Form der Abschätzung wie der Mittelwert oder ein gewichteter Mittelwert dienen.

Die Abschätzung des Dynamikbereichs kann aus den gemessenen Signalwerten einer Vielzahl verschiedener Experimente mit unterschiedlichen Proben wie folgt abgeschätzt werden:

S_j kann als der größte gemessene Wert in einer Reihe von Experimenten unabhängig vom Gen als oberer Grenze des Meßspektrums definiert werden.

S₀ kann als der niedrigste verläßlich gemessene Wert dieser Reihe von Experimenten unabhängig vom Gene definiert werden.

Die Signal Log Ratio ergibt sich dann als og, -— - (Gleichung 4)

In dem hier verwendeten Beispiel wurden aus den 123 Messungen das größte Signal mit S_j = 31581,5 arbitrary units; AU) und das kleinste Signal mit S₀ = 1,2 AU unabhängig von einem individuellen Gen über alle Gene bestimmt.

Die Signal Log Ratio errechnet sich damit unter Verwendung von b = 2 für die Basis des Logarithmus wie folgt:

Zum Vergleich ergab der Unterschied zwischen größtem Signal und kleinstem Signal unter Betrachtung jedes Gens für sich eine Signal Log Ratio von 15,4. Wurden nur „present" Signale einbezogen und jedes Gen für sich betrachtet, lag die größte Signal Log Ratio bei 10,5. Alle absoluten Zahlenwerte für Signalgrößen sind abhängig von der Einstellung der Normierungsgrößen im jeweiligen Software Paket für das Auslesen und Vergleichen von DNA Arrays. Es ist nicht die Einstellung auf bestimmte Normierungsgrößen und damit die hier genannten Zahlenwerte entscheidend sondern die einheitliche Verwendung der gleichen Einstellung für alle Array-Analysen, die für die Berechnung benötigt werden. Mit der Einstellung auf andere Normierungsgrößen ergeben sich somit andere Zahlenwerte, die entsprechend den genannten Auswahlbedingungen festzulegen. Entscheidend ist dann die einheitliche Anwendung.

Der Wert aus Gleichung 4 wurde in dem hier dargestellten Beispiel als theoretisches Maß für den maximalen Dynamikbereich der Signale festgelegt. Für die angestrebten relativen Berechnungen sind die exakten Größen für beide Skalen nicht entscheidend. Die Signaleinheiten werden bei jeder Array Plattform arbiträr festgelegt. Ebenso können die Konzentrationseinheiten arbiträr festgelegt werden. Entscheidend sind die relativen Beziehungen zwischen den Signalen und Konzentrationen sowie die Festlegung der Nachweisgrenze. Ferner muß bei einem Gen für alle v erschiedenen Zelltypen und Proben die gleiche Beziehung gelten, um Berechnungen zwischen den verschiedenen Proben und Signaturen durchzuführen. Die Anwendung ähnlicher Größenverhältnisse für die Beziehung zwischen Konzentration und Signal bei allen verschiedenen Genen ermöglicht den Anteil einer Signatur von einem Gen auf andere Gene angenähert zu übertragen. Es wird hier die Konvention getroffen, daß für den Konzentrationsbereich eine Größenordnung vergleichbar zum Signalbereich zugeordnet wird.

Für die Beziehung zwischen Signal und Konzentration ergeben sich die in Figur 4 dargestellten Extremzustände M, und M₂. Sie zeigen die beiden Grenzbereiche auf, wie die Beziehung zwischen Konzentration und Signal in Abhängigkeit von der Nachweisgrenze in das Modell einfließen kann.

Mo zeigt dabei den Verlauf unter optimalen Bedingungen. Im diesem idealen Fall wird bereits bei sehr niedrigen Signalen S_minI eine lineare Beziehung zur minimalen Konzentration K_minI bestehen. Für viele Gene liefert die Analyse der Hybridisierung jedoch ein relativ hohes Einstiegssignal S_minG, über welchem erst verläßlich die Präsenz eines Gens angezeigt wird und von dem aus eine lineare Beziehung angenommen werden darf.

Im Modell M₁ wird davon ausgegangen, daß eine Hintergrundaktivität die Nachweisgrenze K_minI eines Gens nicht wesentlich beeinträchtigt. Es wird lediglich der Detektionsbereich des Signals verkleinert und damit die Dynamik des Signalanstiegs vermindert. Im Modell M₂ wird davon ausgegangen, daß niedrige Konzentrationen durch den hohen Hintergrund verborgen bleiben und erst ab einer höheren Konzentration K_minM2 ein Gen detektiert werden kann. Die Figur 4 veranschaulicht die Auswirkungen auf die Konzentrationsbestimmungen K_ProbeM1 bzw. K_ProbeM2 in Abhängigkeit von der Wahl des Modells M_t oder M₂.

Im Modell _; wird für jedes Gen individuell der Signalwert S_min berechnet und diesem eine minimale Konzentration K_min zugeordnet. Dabei muß gelten K_min <K Aus praktischen Gründen wurde hier K_min = 1 zugeordnet. Dem höchsten gemessenen Signalwert S_; wird K₁ zugeordnet. Aus praktischen Gründen wurde eine vergleichbar zum Signalmessbereich liegende Konzentration von K₁ - 2¹⁴'⁷ zugeordnet. Die Steigung der Geraden ergibt sich über Gleichung 1 für jedes Gen individuell wie folgt:

Im Modell M₂ ist K_mjnI = 1 und damit K_minM2 deutlich größer als K_mM. Die Steigung der Geraden ergibt sich aus den besten gemessenen und hier als ideal anzusehenden Detektionsgren- zen K_minI = \ und S_m._n/ = 1,2 sowie den zugehörigen maximalen Werten S, = 31581,5 und K, =2 ^A'^η wie folgt: _l (Gleichung 6)

Signalwerten unter der Detektionsgrenze können in beiden Modellen keine eindeutigen Konzentrationswerte zugeordnet werden. Im grau unterlegten Bereich der Figur 4 liegt die mögliche Schwankungsbreite der Beziehung zwischen Signal und Konzentration. Theoretisch körinte über aufwendige Verdünnungsreihen für jedes Gen individuell eine spezifische Beziehungsgleichung aufgestellt werden. Diese müßte dann auch für jede Probenart überprüft werden und bei Weiterentwicklungen des Arrays wieder neu erhoben werden. Derzeit stehen solche Daten nicht zur Verfügung. Es werden deshalb anhand beider Modelle M_t und M₂ berechnet und die Ergebnisse miteinander verglichen.

Zusammengefaßt ergibt sich nun unter Anwendung der Gleichung 1 für das Modell M, die Beziehung

log_b(S_Probe)= ϊ^0gJr ^~?^{l gb}fΛ ^{■ lo}g>(^)+ l°g*£ (Gleichung 7)

und für das Modell M₂ entsteht unter Verwendung der in Gleichung 6 angenommenen Bezugsgrößen zwischen Signal und Konzentration die Beziehung ^g_b(S_Probe)= log_b(K_Probe)x- \og_b(S_minI) (Gleichung 8)

Quantitative Abschätzung der Anteile einer Zellpopulation in einer Probe mit verschiedenen Zelltypen

Die dargestellten Berechnungsgrundlagen lassen sich zunächst auf die Markergene für einzelne Zelltypen anwenden. Für die in Tabelle 2 A bis C genannten Gene ergibt dies die in Tabelle 2 A bis C genannten S_nιft Werte. Aus Gleichung 7 und 8 kann die RNA Konzentration für ein Markergen in einer gemessenen Probe wie folgt abgeleitet werden:

Modell Mf. ~Probe (Gleichung 9)

Modell ₂ unter Verwendung der in Gleichung 6 angenommenen Bezugsgrößen zwischen Signal und Konzentration:

K_Probe =b^[Xo^^Sp^ ^xoZb{Smkd bzw. j^ ^ C -^ ] (Gleichung 10)

Ein Markergen für einen bestimmten Zelltyp wurde so definiert, daß es in anderen Zeil- oder Gewebetypen nicht oder vernachlässigbar gering zu finden ist. Damit ergibt sich folgende Berechnung:

-A-Zelltyp ^' ^Zellfyp ^"*^" -^Kontrolle ' -^Kontrolle ^ Probe

Da Anteil der Zellpopulation und Konzentration des Markergens in der Kontrolle gegen null geht (A_Kmtrolle < 0,01, S_Kontrolle < S_min und damit K_Kmtrolle < 1), ergibt sich für den Anteil des Zelltyps in einer gemischten Probe:

^ =η *- (Gleichung 11) ^ Zelltyp

Für die Berechnung der Konzentrationen stehen verschiedene Ausgangsdaten zur Verfügung. So liefern zahlreiche Plattformen und Software Pakete normalisierte Signalwerte, mit denen weitere Berechnungen durchgeführt werden können. Hierfür sind die genannten Gleichungen unmittelbar anwendbar.

Eine besondere Stellung nimmt die Affymetrix Technologie ein. Bei dieser Plattform werden mehrere verschiedene Oligonukleotide pro Gen und zugehörige „mis-match" Oligonukleotide verwendet. Auch hier können Signale zur unmittelbaren weiteren Berechnung generiert wer- den (z.B. über die robust multiarray analysis; RMA). Sowohl Signalbestimmung als auch Vergleiche können aber auch über spezielle Algorithmen vorgenommen werden, die sowohl perfect match als auch mis-match Informationen einbeziehen. D ie Ergebnisse aus der Vergleichsberechnung werden ebenfalls als Signal Log Ratio (SJR) angegeben und können in die hier durchgeführten Berechnungen integriert werden. Ferner kann auf diese Weise eine Bezugspopulation als Norm verwendet werden. Dies ist in Figur 3 veranschaulicht. Diese Bezugsgröße wird Kontrolle genannt. Für das Beispiel der Synovialgewebsanalyse ist dies das Normalgewebe (siehe auch Tabelle 1). Es ergeben sich hierbei für die Berechnung der Infiltration folgende Beziehungen:

SJR ^uZelltyp '-'Probe Z. elltyp I Kontrotte = lθg; und SJR 'Probe/ Kontrolle = lθg; ° Kontrolle X ^u Kontrolle

Zusammen mit Gleichung 1 folgt daraus:

!°gi ( zelltyp )= ^SLRZelltyp I Kontrolle ^' + ^lθg* ( Kontrolle) ^DZW- -SLR

^Zelltyp ^ Kontrolle ^Δ (Gleichung 12)

und analog •SLRp_mι_>eι_Ko„_lroιι_c ^Probe ^Kontrolle ^ (Gleichung 13)

Unter Verwendung der Gleichungen 11, 12 und 13 folgt für den Anteil eines Zelltyps gemessen an den SLR Werten von Markergenen:

(Gleichung (14)

Für die beiden Modelle M, und M₂ ergibt sich der Wert für die Steigung k aus den Gleichungen 5 und 6.

Die Gleichung 14 kann auf mehrere Gene angewendet werden, die für die Abschätzung der Anteile eines Zelltyps in einer Zellmischung geeignet sind (siehe Tabelle 2 und 3). Der Mit- telwert aus den je Gen berechneten Anteilen liefert ein Maß für den Anteil des Zelltyps in der zu untersuchenden Probe.

Identifizierung der regulierten Gene durch Berechnung der virtuellen Profile aus der zellulären Zusammensetzung

Sind die verschiedenen zellulären Komponenten einer Probe und ihre anteilige Verteilung bekannt, kann aus den Profilen für j eden Zelltyp ein zu erwartendes Mischprofil errechnet werden.

1. Ausgangssituation: Der Zelltyp fehlt in der Normalsituation

Für das Synovialgewebe ergibt sich die Ausgangssituation, daß das Normalgewebe keine Immunzellen enthält. Dies entspricht dem oben genannten Kontrollgewebe. Die Infiltration bei Erkrankung kann über die Markergene verschiedener Zellpopulationen wie oben dargestellt berechnet werden (Gleichung 11 bzw. 14). Die Anteile der jeweiligen Zelltypen und des Normalgewebes summieren sich zu 100%.

Weiterhin kann über Gleichung 12 für jedes in einem Zelltyp exprimierte Gen die Konzentration K_Zelljyp bestimmt werden. Die Konzentration K_Kontrolle im Kontrollgewebe, dem normalen

Synovialgewebe, wird über das Signal S_Kontrolle des betreffenden Gens gemäß Gleichung 8 ermittelt.

Die zu erwartende Konzentration K_P'_robe eines Gens, die aufgrund der zellulären Zusammensetzung zu erwarten ist, errechnet sich dann gemäß Gleichung 3 wie folgt: n r_obe = ^Kontrolle ' ^Kontrolle + Σ( ' ^Ki) (Gleichung 15) ι=l

Der zugehörige logarithmierte Wert des Signals ergibt sich über Gleichung 1 mit (Gleichung 16)

mit k gemäß Modell M, bzw. M₂ aus den Gleichungen 5 und 6 Der gemessene Unterschied zwischen erkranktem Synovialgewebe und normalem Synovialgewebe ergibt sich als l -Prohel Kontrolle

Der Anteil der Regulation SLR_reguliert ergibt sich durch Abzug der Infiltration:

S R_regllliert =l g_b ^ " 'Probe- = _ S eLrR p_{Probe/Kontrolle} — -.lonσ ^Pr -,, ~ ^LjJ Probel 'Kontrolle ^lυ&_g4_i - <-,Ä- (Gleichung 17) ^Probe '-'Kontrolle

Alternativ kann in gleicher Weise der Konzentrationsunterschied (Concentration Log Ratio; CLR) berechnet werden unter Verwendung von Gleichung 13 und 15:

^

CLR_reguliert = log, -f*- (Gleichung 18) Probe ι=l

mit k gemäß Modell M, bzw. M₂ aus den Gleichungen 5 und 6.

2. Ausgangssituation: Der Zelltyp ist in der Normalsituation vorhanden

Im Vollblut sind bereits in der Normalsituation die verschiedenen Immunzellen vorhanden. Daher wird zunächst die „Normalsituation" analysiert.

Bestimmung der Normalsituation

Die Berechnungen erfolgen direkt mit den ermittelten und aufeinander abgestimmten Signalen. Alternativ kann mit Hilfe des von Affymetrix entwickelten Vergleichs-Algorithmus unter Berücksichtigung der perfect match und mis-match Informationen der Bezug zu einem Kontrollgewebe dienen, das die verschiedenen Zelltypen nicht enthält wie z.B. das normale Synovialgewebe. Die Konzentration K_KontroUe errechnet sich somit aus Gleichung 10 bzw. 13. Die Anteile der einzelnen Zelltypen werden gemäß Gleichung 1 1 aus den Konzentrationen d er Markergene bzw. den SLRs gemäß Gleichung 14 abgeschätzt. Zur Berechnung der Gesamtkonzentration fehlt der Anteil der Restpopulationen, die nicht als Einzelprofile vorliegen. Dieser kann zu einer eigenen virtuellen „Restpopulation" zusammengefaßt werden. Dir Anteil ergibt sich wie folgt: n

^Aκ_,Rest = ^{l ~} Σ^Aκ,ι (Gleichung 19) =1

Der Anteil der Restpopulation kann verschwindend gering sein und die errechnete erwartete Konzentration aus den Signaturen und ihren Anteilen den tatsächlich gemessenen Wert übersteigen, also n

^KKont,-otte - Σ(4r,/ ^• K,) < 0 ι=l

Für diesen Fall ist eine einheitliche Anpassung der Konzentrationen K_t für jeden Zelltyp i erforderlich. Unter der Annahme, daß kein Beitrag durch das Restprofil erfolgt, d.h. die Expression des Gens im Restprofil unterhalb der Nachweisgrenze liegt, ergibt sich der Korrekturfaktor wie folgt:

KF = (Gleichung 20) (=1

mit K_Rest < K_min . Hier kann z.B. ein Wert von K_Rest = 0,5 eingesetzt werden.

Die Konzentration für jedes Gen im Profil der virtuellen Restpopulation ergibt sich unter Anwendung der Gleichung 3 als

K Rest (Gleichung 21)

Damit wird die Summe aus den errechneten Einzelkomponenten der Konzentrationen identisch mit der aus der tatsächlichen Messung errechneten Konzentration, also Kon_trol_le = ^A _K,_{Re t} ' K_Rest + ^ ^■ K (GleichlUlg 22) ι=l

Für j edes Gen werden die b erechneten Konzentrationen K_Rest d er R estpopulation aus allen Normalspendern gemittelt. So entsteht eine virtuelle Signatur für die Restpopulation des Normalspenders vergleichbar zu den gemessenen Signaturen der verschiedenen Zelltypen. Hiermit sind alle Voraussetzungen für die Berechnung der Normalsituation auf der Basis der vorhandenen Zellsignaturen und eines virtuellen normalen Restprofils gegeben.

Bestimmung in der Krankheitssituation

Die Berechnungen erfolgen analog zur Normalsituation direkt mit den ermittelten und aufeinander abgestimmten Signalen. Alternativ kann mit Hilfe des von Affymetrix entwickelten Vergleichs-Algorithmus der Bezug zum gleichen Kontrollgewebe wie für Normalspender verwendet werden. Die Konzentration K_Probe errechnet sich somit aus Gleichung 10 bzw. 13. Die Anteile der einzelnen Zelltypen werden gemäß Gleichung 11 aus den Konzentrationen der Markergene bzw. den SLRs gemäß Gleichung 14 abgeschätzt. Der Anteil der Restpopulation ergibt sich aus Gleichung 19.

Die erwartete Konzentration gemäß der zelluläre Zusammensetzung errechnet sich aus den Einzelkomponenten gemäß Gleichung 22:

K Probe — ^AP,Rest ^' ι=l

Die erwarteten Signale errechnen sich aus Gleichung 16. Die regulierten Gene, die sich nicht auf die bekannten Signaturen zurückführen lassen, ergeben sich entweder über die SLRs gemäß Gleichung 17 oder die CLRs gemäß Gleichung 18.

Anwendung des Berechnungsverfahrens zur Charakterisierung von Genexpressionsprofilen

Die Zerlegung in einzelne Komponenten erfolgt schrittweise.

1. Aufteilung in Teilkomponenten von Zelltyp-Signaturen. 2. Erkennen funktioneller Signaturen

3. Prüfung von gegenseitigen Abhängigkeiten zwischen 1. und 2.

4. Korrelation mit klinischen Merkmalen

Der Vergleich zwischen zwei komplexen Proben liefert zunächst eine differentielle Genexpression, die sowohl durch Unterschiede der zellulären Zusammensetzung als auch durch Genregulation hervorgerufen sein kann. Im Ersten Schritt ist deshalb die zelluläre Zusammensetzung aufzuschlüsseln. Dies erfolgt unter Verwendung von Signaturen, die verschiedene Zelltypen charakterisieren. Durch die Verwendung von Normalsignaturen für Gewebe und einzelne Zelltypen wird ein zu erwartendes Profil errechnet, das nur die normale Genexpression berücksichtigt. Der Unterschied aus diesem virtuellen Profil und dem tatsächlich gemessenen Profil ergibt die Gene, die entweder durch weitere, noch nicht berücksichtigte Zelltypen oder durch Regulation verändert sind. Funktionelle Veränderungen in der Genexpression sind deshalb in dieser Differenz zu erwarten. Eine Zuordnung zu einem bestimmten Zelltyp ist zunächst nicht möglich. Diese Gene gehen aber aus der funktionellen Veränderung der beteiligten Zellen hervor.

H n

K Probe - 2-ι ^Ai ^' ^i ⁺ 2-i^Ai ^'^i,reg 1=1 ι=l

mit der Konzentration K_t im Normalzustand und der Konzentrationsänderung K_ireg, die sich zusätzlich durch die funktionelle Regulation ergibt mit i als der Anzahl d er v erschiedenen beteiligten Zelltypen.

Die Untersuchung von einzelnen Zelltypen unter funktioneilen Einflüssen kann eine funktionelle Signatur für einen Zelltyp liefern. Diese funktionelle Veränderung läßt sich wie folgt darstellen:

^Ki,f = ^Ki ^{+ K}i,reg-

Daraus ergibt sich eine von der Signatur des Zelltyps bereinigte funktionelle Konzentrationsänderung

K ι,reg -Kι_,f -K Werden Markergene für die vom Zelltyp bereinigte funktionelle Signatur definiert, kann der Anteil dieser Signatur im Unterschied zwischen virtuellem Profil und tatsächlich gemessenem Profil quantitativ abgeschätzt werden. Diese funktioneilen Profile lassen sich nun schrittweise aus dem Unterschied zwischen virtuellem Profil und tatsächlich gemessenem Profil erschließen.

Insgesamt werden so Parameter für die zelluäre Zusammensetzung und molekulare Funktionen geschaffen, die untereinander sowie mit klinischen Merkmalen korreliert werden können. Dadurch ergeben sich neue Bewertungsmaßstäbe für die Interpretation von Array Daten, die sowohl für die Diagnostik, als auch für die Identifizierung von therapeutisch bedeutsamen Zielstrukturen bzw. Regulationsmechanismen entscheidende Verbesserung liefern.

Anwendung am Beispiel des Synovialgewebes.

Das genannte Verfahren wurde auf die Analyse von insgesamt 10 verschiedenen Proben von Patienten mit rheumatoider Arthritis (RA), 10 Patienten mit Osteoarthritis (OA) und 10 normale Synovialgewebe angewendet. Die in Tabelle 2 unter Auswahl mit 1 markierten Gene wurden für die Abschätzung der Anteile der CD4+ T-Zellen, der Monozyten und der Granulozyten im Synovialgewebe von den RA und OA Patienten verwendet. Es ergab sich die in Tabelle 4 genannte anteilige Verteilung für RA bzw. OA.

Anhand der dargestellten Berechnungsgrundlagen und der Anwendung von Modell Mi wurden die Anteile bestimmt, die je Gen durch Infiltration von T-Zellen, Monozyten bzw. Granulozyten zu erwarten sind. Aus dem Unterschied zwischen zu erwartendem Expressionsniveau über die Berechnungsgrundlage nach Modell Mi und dem tatsächlich gemessenem Expressionsniveau ergab sich der Anteil der durch Aktivierung bedingten Expressionsunterschiede. Es wurden zunächst die Gene bestimmt, die mittels der von Affymetrix entwickelten Software MAS 5.0 einen Unterschied in mehr als 50% aller paarweisen Vergleiche zwischen RA und Normalgewebe ergaben mit einer mittleren SLR größer 1,5. Die so erhaltenen Geneinträge wurden weiter unterteilt in Gruppen,die folgende Bedingungen erfüllen: 1. infiltrierte Gene, wenn das Verhältnis von SLRp_robe/p_robe zu SLRp_robe/Kontroiie unter 0,25 lag 2. regulierte Gene bzw. Gene von weiteren eingewanderten Zelltypen, die noch nicht berücksichtigt wurden, wenn das Verhältnis von SLRp_robe/Pwbe zu SLRp_robe/_Kontroiie über 0,75 lag 3. Gene, die sowohl infiltriert als auch reguliert bzw. von weiteren nicht berücksichtigten Zelltypen stammen können, wenn das Verhältnis von SLRp_robe/probe zu SLRp_robe/κontroiie zwischen 0,25 und 0,75 lag.

Die unter der 1. Bedingung gefundenen Geneinträge sind unten in Tabelle 5 angegeben. Sie stellen einen Genpool dar, der bei einer chronisch entzündlichen Gelenkerkrankung wie der rheumatoiden Arthritis als Diagnostikum für das Ausmaß der Infiltration, insbesondere von von T -Zellen, M onozyten b zw. Granulozyten, v erwendet w erden k ann. Diese G ene alleine können bereits Kriterium für die Diagnostik entzündlicher Gelenkerkrankungen darstellen. Für die Osteoarthritis ergab sich eine vergleichsweise deutlich geringere Infiltration (Figur 5, Hierarchische Clusteranalyse mit den Genen der Tabelle 5 zwischen RA, OA und Normalgewebe) A uch für e ine E inteilung i n U ntergruppen v on v erschiedenen R A P atienten e rgeben sich Infiltrationsunterschiede, die sowohl an dieser Auswahl von Genen als auch über den Vergleich der Infiltrationsanteile anhand der Markergene identifiziert werden können (Figur 6). Die Signale dieser Gene können ohne vorherige Berechnung für die diagnostischen Untersuchungen eingesetzt werden, da sie vorwiegend durch Infiltration entstanden sind.

Die unter der 2. Bedingung gefundenen Geneinträge sind unten in Tabelle 6 angegeben. Sie stellen einen Genpool dar, der als Diagnostikum für die charakteristische Art der Genregulation verwendet werden kami. Hier können Unterschiede zwischen einzelnen RA Patienten identifiziert werden und Untereinteilungen möglich werden. Hierzu gehören Einteilungen nach Art der Arthritis, Stadium der Erkrankung, Kranklieitsprognose, Zuweisung zu einer optimalen Therapieform, Abschätzung bzw. Verlaufskontrolle der Ansprechrate auf eine spezifische Therapie. Es ergeben sich somit neue Marker bzw. Markergruppen, die als molekulare Merkmale mit verschiedenen klinischen Merkmalen bzw. zu erwartenden Merkmalsentwicklungen korreliert sein können und deshalb diagnostische Bedeutung erlangen. Auch diese Signale könnten unmittelbar ohne vorherige Berechnung der Infiltration bzw. Aktivierung diagnostisch verwendet werden, da sie vorwiegend durch Aktivierung entstanden sind. Dennoch kann auch hier die Berechnung des Genaktivierung entstandenen Signalteils eine Verbesserung in der Interpretation bewirken. Eine Unterteilung in Untergruppen ist in Figur 7 dargestellt. Die unter der 3. Bedingung identifizierten Geneinträge sind in Tabelle 7 angegeben. Sie stellen ebenfalls eine diagnostisch bedeutenden Genpool dar, der aber zur Differenzierung von Infiltration und Aktivierung erst in Signale umgerechnet werden muß, die den Regulationsbzw. Infiltrationsanteil widerspiegeln (Auflösung der Gleichung 16 nach S 'p_wbe)-

Es wurde der durch Regulation bedingte Signalanteil für die Gene bestimmt, die sich zusammengefaßt durch die 2. bzw. 3. Bedingung ergeben. Auch der durch Infiltration bedingte Anteil könnte in analoger Weise weiter untersucht werden. Nach Umrechung in den regulierten Signalanteil wurde eine hierarchische Clusteranalyse durchgeführt. Das Ergebnis ist in Figur 8 dargestellt. Es ergeben sich offensichtlich Unterscheidungsmerkmale für die beiden Untergruppen RA 1, 2, 4, 5, 8, 10 und RA 3, 6, 7, 9. Zur Identifizierung der für die Unterscheidung relevanten Gene wurde eine t-Test Analyse auf die berechneten Signale von allen Genen aus den Bedingungen 2 und 3 angewandt. Diese führte zu den in Tabelle 8 angegebene Geneinträgen, die eine Unterscheidung ermöglichen. Figur 9 stellt die Clusteranalyse und zugehörige Principle Component Analyse dar.

Anhand des dargestellten Beispiels wurde gezeigt, wie die Methode beiträgt, neue Bedeutungen für Gene und Gengruppen zu definieren, die sowohl für die Diagnostik als auch für die Entwicklung neuer Therapiestrategien bedeutsam sind. Es wurden damit Gene bzw. ihre Bedeutung in der Beurteilung entzündlicher Gelenkerkrankungen neu definiert hinsichtlich Infiltration und insbesondere hinsichtlich Aktivierung als Maß der aktiven Beteiligung und somit pathophysiologischen Bedeutung am Krankheitsprozeß.

Tabelle 1: Verwendete Proben und Signaturen für die Etablierung der Berechnung

Tabelle 2: Verwendete Markergene

Tabelle 2A: Auswahlliste für Monozyten-Markergene:

Die Gene wurden in allen untersuchten Monozyten-Populationen im Vergleich zu anderen Zelltypen oder nicht infiltrierten Geweben mindestens 4-fach erhöht exprimiert.

Affymetrix Gen AusUnigen Name S min _ID Symbol wahl

201850_at CAPG Hs.82422 capping protein (actin filament), gelsolin-like 0 126,8 202295_s_ CTSH Hs.114931 cathepsin H 0 76,3 at

202944 _at NAGA Hs.75372 N-acetylgalactosamimdase, alpha- 0 77,8

203300^ adaptor-related protein complex 1, sigma 2„ -^X-AP1S2 Hs.40368 68,6 at subunit

203922_ cytochrome b -245, b eta polypeptide (chronic„ -^S- CYBB Hs.88974 54,55 at granulomatous disease)

203923. cytochrome b -245, beta polypeptide (chronic -^S- CYBB Hs.88974 58,6 at granulomatous disease) HLA- major histocompatibility complex, class II,„

203932_. Hs.1162 74,4 - DMB DM beta interferon consensus sequence binding protein«

204057_. _at ICSBP1 Hs.14453 78,95 1

204081 _at NRGN Hs.232004 neurogranin (protein kinase C Substrate, RC3) 0 110,4

204588_. solute carrier family 7 (cationic amino acid„ -^S- SLC7A7 Hs.194693 193,1 at transporter, y+ System), member 7

204619_. -^S- CSPG2 Hs.434488 chondroitin sulfate proteoglycan 2 (versican) 0 34,7 at

205076_. -^S- CRA Hs.425144 cisplatin resistance associated 0 122,8 at

205552_. -^S- OASl Hs.442936 2',5'-oligoadenylate synthetase 1, 40/46kDa 0 86,4 at CD86 antigen ( CD28 antigen 1 igand 2 , B 7-2

205685 at CD86 Hs.27954 46,9 antigen)

205686 CD86 antigen ( CD28 antigen 1 igand 2 , B 7-2_Q - CD86 Hs.27954 112,6 at antigen)

205789 at CD1D Hs.1799 CD1D antigen, d polypeptide 0 28,1

205859 at LY86 Hs.184018 lymphocyte antigen 86 1 219,5

206120 at CD33 Hs.83731 CD33 antigen (gp67) 1 124,8

206130 ASGR2 Hs.1259 asialoglycoprotein receptor 2 0 186,1 at phospholipase A2, group VII (platelet-

206214 at PLA2G7 Hs.93304 1 16,8 activating factor acetylhydrolase, plasma)

206715 at TFEC Hs.125962 transcription factor EC 0 45,6

206743_. ^S- ASGR1 Hs.12056 asialoglycoprotein receptor 1 0 at

206978 at CCR2 Hs.511794 chemokine (C-C motif) receptor 2 1 69

208146_ ^S- CPVL Hs.95594 carboxypeptidase, vitellogenic-like 0 68,2 at lectin, galactoside-binding, soluble,

208450 at LGALS2 Hs.l 13987 ^'1 54,05 (galectin 2)

208771_ - - LTA4H Hs.81118 leukotriene A4 hydrolase 0 68,6 at

208890_. ^S- PLXNB2 Hs.3989 plexin B2 0 188,5 at

209555_. CD36 antigen (collagen type I receptor, ₁ ^S- CD36 Hs.443120 116,85 at thrombospondin receptor)

210222_. -^S- RTN1 Hs.99947 reticulon 1 37,2 at

210314_. tumor necrosis factor (ligand) superfamily, ^X-TNFSF13 Hs.54673 54,9 at member 13

210895 s CD86 Hs.27954 CD86 antigen ( CD28 antigen ligand 2 , B 7-20 170,35 at antigen)

213385_at CHN2 Hs.407520 chimerin (chimaerin) 2 0 52,85 v-myc myelocytomatosis viral oncogene

214058 at MYCL1 Hs.437922 1 61,25 homolog 1, hing carcinoma derived (avian)

217478_. s_ HLA- major histocompatibility complex, class ü,_π Hs.351279 109,1 at DMA DM alpha

219574 at FLJ20668 Hs.136900 hypothetical protein FLJ20668 0 32,55

219714_. s_ CACNA2 calcium Channel, voltage-dependent, alpha Hs.435112 at 95,6 D3 2/delta 3 subunit

219806_. s FN5 Hs.416456 FN5 protein 0 121,8 at solute carrier family 2 (facilitated glucose„

220091_. _at SLC2A6 Hs.244378 103,95 transporter), member 6

220307 at CD244 Hs.157872 natural killer cell receptor 2B4 0 252,45

Tabelle 2B:

Auswahlliste für T-Zell-Markergene:

Die Gene wurden in allen untersuchten T-Zell-Populationen im Vergleich zu anderen Zelltypen oder nicht infiltrierten Geweben mindestens 8-fach erhöht exprimiert.

203413 at NELL2 Hs.79389 NEL-like 2 (chicken) 0 75

203685 ^at BCL2 Hs.79241 B-cell CLL/lymphoma 2 0 49,5

203828_. s -NK4 Hs.943 natural killer cell transcript 4 0 255,35 at

204777_. ^S- MAL Hs.80395 mal, T-cell differentiation protein 0 53,2 at

204890 - LCK Hs.1765 lymphocyte-specific protein tyrosine kinase 0 43,2 at

204891_. - LCK Hs.1765 lymphocyte-specific protein tyrosine kinase 0 61,85 at PTPRCA protein tyrosine phosphatase, receptor type_5f.

204960 at Hs.155975 224,7 C-associated protein

205255 x transcription factor 7 (T-cell specific, HMG - -TCF7 Hs.169294 229,8 at box) CD3E antigen, epsilon polypeptide (TiT3

205456 at CD3E Hs.3003 85,4 complex) granzyme A (granzyme 1, cytotoxic T-„

205488_at GZMA Hs.90708 53,3 lymphocyte-associated serine esterase 3) RAS guanyl releasing protein 1 (calcium and_;

205590_at ^S⁰¹^ Hs.189527 2,6 DAG-regulated) 205790 at SCAPl Hs.411942 src family associated phosphoprotein 1 0 91,65 205798_at IL7R Hs.362807 interleukin 7 receptor 0 82,5 CD2 antigen (p50), sheep red blood cell re-„ 205831 at CD2 Hs.89476 66,5 ceptor rumor necrosis factor receptor superfamily,«

206150 at TNFRSF7Hs.355307 65,6 member 7

206337 at CCR7 Hs. 1652 chemokine (C-C motif) receptor 7 0 66,65 206545 _at CD28 Hs.1987 CD28 antigen (Tp44) 0 25 206761^" at CD96 Hs.142023 CD96 antigen 0 54,4 CD3G antigen, gamma polypeptide (TiT3„

206804 at CD3G Hs.2259 34,5 complex)

206828 at TXK Hs.29877 TXK tyrosine kinase 0 32,4

206980 -^S-FLT3LG Hs.428 fms-related tyrosine kinase 3 ligand 0 109 at

206983 at CCR6 Hs.46468 chemokine (C-C motif) receptor 6 0 14

207651 ^"at H963 Hs.159545 platelet activating receptor homolog 0 38,8

209504 s PLEKHB pleckstrin homology domain containing, fami-„ Hs.445489 16,8 at 1 ly B (evectins) member 1

209602 GATA3 Hs.l 69946 GATA binding protein 3 0 23,9 at

209604 - GATA3 Hs.l 69946 GATA binding protein 3 0 72,1 at

209670 at TRA(i Hs.74647 T cell receptor alpha locus 1 93,7

209671_, x -TRAG Hs.74647 T cell receptor alpha locus 1 77,1 at

209871. amyloid beta (A4) precursor protein-binding,« APBA2 Hs.26468 26 at family A, member 2 (XI 1-like)

209881. LAT Hs.498997 linker for activation of T cells 0 237,8 at CD3Z antigen, zeta polypeptide (TiT3 com-„

210031_at CD3Z Hs.97087 137,75 plex) 210038_at PRKCQ Hs.408049 protein kinase C, theta 0 159,95 SH2 domain protein 1A, Duncan's disease „ 210116 at SH2D1A Hs.151544 45,9 (lymphoproliferative syndrome)

210370 -^a- LY9 Hs.403857 lymphocyte antigen 9 0 322,7 at

210439 at ICOS Hs .56247 inducible T-cell co-stimulator 0 46,3

210607 at FLT3LG Hs .428 fms-related tyrosine kinase 3 ligand 0 19,75

210847 x_TNFRSF2 tumor necrosis factor receptor superfamily,„ Hs. 299558 19,15 at 5 member 25

210915 x Homo sapiens T cell receptor beta chain Hs.419777 1 79,2 at BV20S1 BJ1-5 BC1 mRNA, complete cds

210948 - - LEF1 Hs, 44865 lymphoid enhancer-binding factor 1 0 57,55 at

210972 -^X-TRA@ Hs, ,74647 T cell receptor alpha locus 1 124,8 at

211005 at LAT Hs, ,498997 linker for activation of T cells 0 74,7

211272 -^S- DGKA Hs. 172690 diacylglycerol kinase, alpha 80kDa 0 54,15 at

211282 x_TNFRSF2 tumor necrosis factor receptor superfamily,« Hs. 299558 223,8 at 5 member 25

211339 s ITK Hs.211576 IL2-inducible T-cell kinase 0 22,3 at

211796_s_ Homo sapiens T cell receptor beta chain.. Hs.419777 33,3 at BV20S1 BJ1-5 BC1 mRNA, complete cds

211841_s_ T FRSF2_{Hs 299558} tumor necrosis factor receptor superfamily, 61,6 at 5 member 25

211902_x_ 89,65 at Homo sapiens mRNA; cDNA

212400_at — Hs.460208 DKFZp586A0618 (from cloneO 13,45 DKFZp586A0618)

21ι24<n14«_ ss_ _SEpτ6 Hs.90998 septin 6 56,4 at

213193_x__ _ Homo sapiens T cell receptor beta chain Hs.419777 at 62,9 BV20S1 BJ1-5 BC1 mRNA, complete cds

213534_s_ _pASK PAS domain containing serine/threonine kinaHs.397891 46,15 at se CD3D antigen, delta polypeptide (TiT3 com¬

213539_at CD3D Hs.95327 74,25 plex) 13587_s_ _C7orß2 Hs.351612 chromosome 7 open reading frame 32 88,7 at

213906_at MYBL1 Hs.300592 v-myb myeloblastosis viral oncogene homo-„ 23,85 log (avian)-like 1

213958_at CD6 Hs.436949 CD6 antigen 0 149,4 zeta-chain (TCR) associated protein kinase_n

214032_at ZAP70 Hs.234569 84,8 70kDa

214049_x__CD7 Hs.36972 CD7 antigen (p41) 0 26,65 at killer cell lectin-like receptor subfamily B,

214470_at KLRB1 Hs.169824 0 240,6 member 1

214551_s_ _CD? Hs.36972 CD7 antigen (p41) 0 59,2 at

214617_at PRF1 Hs.2200 perforin 1 (pore forming protein) 0 77,7

215967_s_ _Lγ9 Hs.403857 lymphocyte antigen 9 0 117,8 at

216920 _s_ Hs.385086 T cell receptor gamma locus 0 156,75 at

21694 _^x__pASK PAS domain containing serine/threonine kinaHs.397891 0 57,7 at se

² _t ¹⁷¹⁴⁷-^S- TRIM Hs.138701 T-cell receptor interacting molecule 0 32,65 at

217838 s _{Ü rr} EVL Hs.241471 Enah Vasp-like 0 76,4 at

217950_at NOSIP Hs.7236 nitric oxide synthase interacting protein 0 125,8

218237_s_ _{SLC38A1 Hs- 13}2246 solute carrier family 38, member 1 0 69 at

219423_x_TNFRSF2_{Hs 299558} tumor necrosis factor receptor superfamily,« 74 at 5 member 25

219528_s_ _BCLUB B-cell CLL/lymphoma 11B (zinc finger prote- Hs.57987 0 25 at in)

219541 at FLJ20406 Hs.149227 hypothetical protein FLJ20406 0 141,55

219812 at STAG3 Hs.323634 stromal antigen 3 0 6,5 _rκ~_{^ Λ Λ n} __. UBASH3 _{ττ 1 0 rι l} ubiquitin associated and SH3 domain ccoonnttaaXi-_Λ 220418 at _A Hs.l 83924 . . 0 92,4 - A mng, A

22108 l_s_ _FLj22457 Hs.447624 hypothetical protein FLJ22457 0 12,6lt LEF1 Hs.44865 lymphoid enhancer-binding factor 1 0 13,55

8.1

221756_at ^^GC1733Hs.26670 HGFL gene 0 141,6

221790_s_ _ARH Hs.184482 LDL receptor adaptor protein 0 96,2

39248_at AQP3 Hs.234642 aquaporin 3 0 18

Tabelle 2C:

Auswahlliste für Granulozyten-Markergene:

Die Gene wurden in allen untersuchten neutrophilen Granulozytenpopulationen-Populationen im Vergleich zu anderen Zelltypen oder nicht infiltrierten Geweben mindestens 8-fach erhöht exprimiert.

Affyme- Gen Sym- Aus- Unigene Name S min trix ID bol wähl

202018 s LTF Hs.437457 lactotransferrin 0 231,75 at

202083_s SEC14L1 Hs.75232 SEC14-like 1 (S. cerevisiae) 1 25,6 at

202193 at LIMK2 Hs.278027 LIM domain kinase 2 1 33,45 membrane metallo-endopeptidase (neutral

203434_s_ MME Hs.307734 endopeptidase, enkephalinase, CALLA,0 54,7 at CD10) membrane metallo-endopeptidase (neutral

203435_s_ MME Hs.307734 endopeptidase, enkephalinase, CALLA, 1 190,6 at CD10)

203691_at PI3 Hs.l 12341 protease inhibitor 3, skin-derived (SKALP) 1 46,7

203936_s_. matrix metalloproteinase 9 (gelatinase B, MMP9 Hs.151738 0 68,6 at 92kDa gelatinase, 92kDa type IV collagenase)

204006_s_. Fc fragment of IgG, low affinity lila, receptor FCGR3A Hs.372679 0 77,9 at for (CD 16)

204007 at FCGR3A Hs.372679 Fc fragment of IgG, low affinity lila, receptorO 57 for (CD16) KIAA032

204307 at Hs.l 1711 KIAA0329 gene product 0 54,7 ^~ 9

204308 s KIAA032 Hs.11711 KIAA0329 gene product 1 88,8 at 9

204351_at S100P Hs.2962 S 100 calcium binding protein P 0 94,1

204409 s eukaryotic translation initiation factor 1A, Y- ^" EIF1AY Hs.461178 0 24 at linked

204542_at STHM Hs.288215 sialyltransferase 0 131

204669 s RNF24 Hs.30524 ring finger protein 24 0 87 at

205033_s_ DEFA1 Hs.511887 defensin, alpha 1, myeloid-related sequence 0 71,7 at

205220_at HM74 Hs.458425 putative chemokine receptor 0 77,95

205227_at ILIRAP Hs.143527 interleukin 1 receptor accessory protein 0 46,8

205403_at IL1R2 Hs.25333 interleukin 1 receptor, type II 1 62,85

205645_at REPS2 Hs.334168 RALBPl associated Eps domain containing 2 1 46,35 solute carrier family 6 (neurotransmitter 205920_at SLC6A6 Hs.l 194 0 114 transporter, taurine), member 6

206177 s ARG1 Hs.440934 arginase, liver 0 27,2 at

206208_at CA4 Hs.89485 carbonic anhydrase IV 0 47,9 tumor necrosis factor receptor superfamily, TNFRSF1 206222 at Hs.l 19684 member 10c. decoy without an intracellularO 39,7 ^~ 0C domain cytochrome P450, family 4, subfamily F, 206515_at CYP4F3 Hs.l 06242 0 28,6 polypeptide 3

206522_at MGAM Hs.122785 maltase-glucoamylase (alpha-glucosidase) 0 54,8 CEACAM carcinoembryonic antigen-related cell

206676_at Hs.41 0 98,9 8 adhesion molecule 8 potassium inwardly-rectifying Channel, 206765_at KCNJ2 Hs.l 547 1 108,5 subfamily J, member 2

206877_at MAD Hs.379930 MAX dimerization protein 1 0 92,05

206925_at SIAT8D Hs.308628 sialyltransferase 8D (alpha-2, 8-0 39,2 polysialyltransferase)

207008_at IL8RB Hs.846 interleukin 8 receptor, beta 1 43,6

207094_at IL8RA Hs.l 94778 interleukin 8 receptor, alpha 1 124,6

207275_s_ FACL2 Hs.511920 fatty-acid-Coenzyme A ligase, long-chaiinn 22 00 72,65 at

207384_at PGLYRP Hs.137583 peptidoglycan recognition protein 0 238,15

207387_s_ GK Hs.1466 glycerol kinase 0 47,7 at

207890_s_ MMP25 Hs.290222 matrix metalloproteinase 25 1 72,3 at tumor necrosis factor (ligand) superfamily, 207907_at TNFSF14 Hs.129708 0 92,8 member 14

208304_at CCR3 Hs.506190 chemokine (C-C motif) receptor 3 0 32

208748 s ^{~ ~} FLOTl Hs.179986 flotillin 1 0 113,7 at

209369_at ANXA3 Hs.442733 annexin A3 0 24

209776 s solute carrier family 19 (folate transporter), ^{~ ~} SLC19A1 Hs.84190 0 74,95 at member 1 potassium inwardly-rectifying Channel, 210119_at KCNJ15 Hs.17287 1 49,9 subfamily J, member 15

210244_at CAMP Hs.51120 cathelicidin antimicrobial peptide 0 228,9

210484 s MGC3195 Hs.253829 hypothetical protein MGC31957 0 52,5 at 7 egf-like module-containing mucin-like 210724_at EMR3 Hs.438468 1 50,8 receptor 3

210773_s_ FPRL1 Hs.99855 formyl peptide receptor-like 1 0 104,45 at tumor necrosis factor receptor superfamily, 211163_s_ TNFRSFl Hs.l 19684 member 10c, decoy without an intracellularl 85,1 at 0C domain

211372_s_ IL1R2 Hs.25333 interleukin 1 receptor, type II 0 110,8 at

211574 s membrane cofactor protein (CD46, ^~ MCP Hs.83532 0 192,3 at trophoblast-lymphocyte cross-reactive antigen) coagulation factor II (thrombin) receptor-like 213506_at F2RL1 Hs.154299 0 56,2

HIST1H2 214455 at Hs.356901 histone 1, H2bc 0 25,85 ^_ BC

215071 s - - ... ._. ... 0 75 at

215719 x tumor necrosis factor receptor superfamily, ^{~ ~}TNFRSF6Hs.82359 0 37,6 at member 6

215783_s_ ALPL Hs.250769 alkaline phosphatase, liver/bone/kidney 1 30,5 at

216316_x_ 72,65 at Homo sapiens cDNA: FLJ23026 fis, clone 216782 at — Hs.306863 0 50,45 LNG01738

216985 s ^~ STX3A Hs.82240 syntaxin 3A 0 59,2 at LOC2836 217104_at Hs.512015 hypothetical protein LOC283687 1 27,45 87

217475 s_ LIMO Hs.278027 LIM domain kinase 2 0 27,05 at interferon-induced protein with

217502_at IFIT2 Hs.169274 0 109,9 tetratricopeptide repeats 2

217966_s_ Clorf24 Hs.48778 chromosome 1 open reading frame 24 0 53,9 at

217967_s_ Clorf24 Hs.48778 chromosome 1 open reading frame 24 0 68,6 at

218963_s_ KRT23 Hs.9029 keratin 23 (histone deacetylase inducible) 0 64 at DKFZp43 219313 at Hs.24583 hypothetical protein DKFZp434C0328 0 42,3 ^" 4C0328

220302_at MAK Hs.148496 male germ cell-associated kinase 0 63,6

220404_at GPR97 Hs.383403 G protein-coupled receptor 97 1 79,95

220528_at VNN3 Hs.183656 vanin 3 1 59,2 220603 s FLJ11175 Hs.33368 hypothetical protein FLJ11175 55,4 at 221345_at GPR43 Hs.248056 G protein-coupled receptor 43 42,5 221920_s_. MSCP Hs.283716 mitochondrial solute carrier protein 47,8 at 41469_at PI3 Hs.l 12341 protease inhibitor 3, skin-derived (SKALP) 0 39,4

Tabelle 3: Auswahlbedingungen für Zelltyp-assoziierte Markergene:

Tabelle 4 A) Anteile von verschiedenen Zelltypen im Synovialgewebe von RA-Patienten.

B) Anteile von verschiedenen Zelltypen im Synovialgewebe von OA-Patienten.

Tabelle 5

Gene ausgewählt nach Infiltrationsmerkmalen unter -Bedingung 1.

Affymetrix_ID Gen Symbol Unigen Name integrin, beta 2 (antigen CD 18 (p95), lym- 202803_s_at ITGB2 Hs.375957 phocyte function-associated antigen 1 ; ma- crophage antigen 1 (mac-1) beta subunit) serine (or cysteine) proteinase inhibitor,

202833_s_at SERPINA1 Hs.297681 clade A (alpha- 1 antiproteinase, anti- trypsin), member 1 solute carrier family 16 (monocarboxylic 202855 s at SLC16A3 Hs.386678 acid transporters), member 3 S100 calcium binding protein A8 (calgra-

202917_s_at S100A8 Hs.416073 nulin A)

203047_at STK10 Hs.16134 serine/threonine kinase 10

20328 l_s_at UBE1L Hs.l 6695 ubiquitin-activating enzyme El-like

203388 at ARRB2 Hs.435811 arrestin, beta 2

203485_at RTN1 Hs.99947 reticulon 1 sema domain, immunoglobulin domain (Ig), transmembrane domain (TM) and

203528_at SEMA4D Hs.511748 short cytoplasmic domain, (semaphorin) 4D S100 calcium binding protein A9 (calgra-

203535_at S100A9 Hs.l 12405 nulin B)

203828_s_at NK4 Hs.943 natural killer cell transcript 4 interleukin 2 receptor, gamma (severe

204116_at IL2RG Hs.84 combined immunodeficiency)

204118 at CD48 Hs.901 CD48 antigen (B-cell membrane protein)

204192 at CD37 Hs.l 53053 CD37 antigen

204198_s_at RUNX3 Hs.170019 runt-related transcription factor 3

204220_at GMFG Hs.5210 glia maturation factor, gamma selectin L (lymphocyte adhesion molecule

204563_at SELL Hs.82848 1)

204661_at CDW52 Hs.276770 CDW52 antigen (CAMPATH-1 antigen)

204698_at ISG20 Hs.l 05434 interferon stimulated gene 20kDa Homo sapiens transcribed sequence with strong similarity to protein sp:Q13075

204860_s_at — Hs.508565 (H.sapiens) BIR1_HUMAN Baculoviral IAP repeat-containing protein 1 (Neuronal apoptosis inhibitory protein) lymphocyte-specific protein tyrosine kina¬

20489 l_s_at LCK Hs.l 765 se

204949_at ICAM3 Hs.353214 intercellular adhesion molecule 3

204959_at MNDA Hs.153837 myeloid cell nuclear differentiation antigen protein tyrosine phosphatase, receptor type,

204960_at PTPRCAP Hs.155975 C-associated protein neutrophil cytosolic factor 1 (47kDa, chro-

204961 s at NCF1 Hs.458275 nic granulomatous disease, autosomal 1) glutaminyl-peptide cyclotransferase (glu-

205174_s_at QPCT Hs.79033 taminyl cyclase) ficolin (collagen/fibrinogen domain contai¬

205237_at FCN1 Hs.440898 ning) 1

205285_s_at FYB Hs.276506 FYN binding protein (FYB-120/130) spieen focus forming virus (SFFV) proviral

205312_at SPI1 Hs.157441 integration oncogene spil RAS guanyl releasing protein 1 (calcium

205590_at RASGRP1 Hs.l 89527 and DAG-regulated)

205639_at AOAH Hs.82542 acyloxyacyl hydrolase (neutrophil)

20568 l_at BCL2A1 Hs.227817 BCL2-related protein AI

205798_at IL7R Hs.362807 interleukin 7 receptor CD2 antigen (p50), sheep red blood cell

20583 l_at CD2 Hs.89476 receptor integrin, alpha 4 (antigen CD49D, alpha 4

205885_s_at ITGA4 Hs.145140 subunit of VLA-4 receptor)

205936_s_at HK3 Hs.411695 hexokinase 3 (white cell) caspase 1, apoptosis-related cysteine pro¬

20601 l_at CASP1 Hs.2490 tease (interleukin 1, beta, convertase)

206082_at HCP5 Hs.511759 HLA complex P5 mitogen-activated protein kinase kinase

206296_x_at MAP4K1 Hs.95424 kinase kinase 1

206337 at CCR7 Hs.l 652 chemokine (C-C motif) receptor 7

206470_at PLXNC1 Hs.286229 plexin Cl sialyltransferase 8D (alpha-2, 8-

206925_at SIAT8D Hs.308628 polysialyltransferase)

206978 at CCR2 Hs.511794 chemokine (C-C motif) receptor 2 leukocyte immunoglobulin-like receptor,

207104 x at LILRB1 Hs.149924 subfamily B (with TM and ITBVI domains), member 1 protein tyrosine phosphatase, receptor type,

207238_s_at PTPRC Hs.444324 C lymphotoxin beta (TNF superfamily,

207339_s_at LTB Hs.376208 member 3) ras-related C3 botulinum toxin Substrate 2

207419_s_at RAC2 Hs.301175 (rho family, small GTP binding protein Rac2)

207522_s_at ATP2A3 Hs.5541 ATPase, Ca++ transporting, ubiquitous

207540_s_at SYK Hs.192182 spieen tyrosine kinase egf-like module containing, mucin-like,

207610_s_at EMR2 Hs.137354 hormone receptor-like sequence 2

207677 s at NCF4 Hs.196352 neutrophil cytosolic factor 4, 40kDa leukocyte immunoglobulin-like receptor,

207697_x_at LILRB2 Hs.306230 subfamily B (with TM and ITEVI domains), member 2

208018_s_at HCK Hs.89555 hemopoietic cell kinase lectin, galactoside-binding, soluble, 2 (ga-

208450 at LGALS2 Hs.l 13987 lectin 2)

208885_at LCP1 Hs.381099 lymphocyte cytosolic protein 1 (L-plastin)

209083_at CORO1A Hs.415067 coronin, actin binding protein, 1 A

209201 x_at CXCR4 Hs.421986 chemokine (C-X-C motif) receptor 4

209670_at TRA@ Hs.74647 T cell receptor alpha locus

20967 l_x_at TRA@ Hs.74647 T cell receptor alpha locus 209813_x_at TRG@ Hs.407442 T cell receptor gamma locus 209879_at SELPLG Hs.423077 selectin P ligand 209901 x at AIF1 Hs.76364 allografit inflammatory factor 1 neutrophil cytosolic factor 2 (65kDa, chro-

209949_at NCF2 Hs.949 nic granulomatous disease, autosomal 2) CD3Z antigen, zeta polypeptide (TiT3

210031_at CD3Z Hs.97087 complex) SH2 domain protein 1 A, Duncan's disease

210116_at SH2D1A Hs.151544 (lymphoproliferative syndrome) 210140 at CST7 Hs.143212 cystatin F (leukocystatin) leukocyte immunoglobulin-like receptor,

210146 x at LILRB2 Hs.306230 subfamily B (with TM and ITIM domains), member 2

210222_s_at RTN1 Hs.99947 reticulon 1

210629_x_at LST1 Hs.436066 leukocyte specific transcript 1 CD86 antigen (CD28 antigen ligand 2, B7-

210895_s_at . CD86 Hs.27954 2 antigen) Homo sapiens T cell receptor beta chain

210915_x_at — Hs.419777 BV20S1 BJ1-5 BC1 mRNA, complete cds

210972__x_at TRA@ Hs.74647 T cell receptor alpha locus Fc fragment of IgG, low affinity Ha, recep¬

210992 x at FCGR2A Hs.352642 tor for (CD32) caspase 1, apoptosis-related cysteine pro¬

211367 s at CASP1 Hs.2490 tease (interleukin 1, beta, convertase) caspase 1, apoptosis-related cysteine pro¬

211368 s at CASP1 Hs.2490 tease (interleukin 1, beta, convertase) Fc fragment of IgG, low affinity Ilb, recep¬

211395 x at FCGR2B Hs.126384 tor for (CD32) Homo sapiens PRO2275 mRNA, complete

211429_s_at — Hs.513816 cds

211581_x_at LST1 Hs.436066 leukocyte specific transcript 1

211582 x at LST1 Hs.436066 leukocyte specific transcript 1

211742_s_at EVI2B Hs.5509 ecotropic viral integration site 2B

211795_s_at FYB Hs.276506 FYN binding protein (FYB-120/130) Homo sapiens T cell receptor beta chain

211796_s_at — Hs.419777 BV20S1 BJ1-5 BC1 mRNA, complete cds Homo sapiens T-cell receptor alpha chain

211902_x_at — Hs.74647 (TCRA) mRNA sortilin-related receptor, L(DLR class) A

212560_at SORL1 Hs.438159 repeats-containing protein tyrosine phosphatase, receptor type,

212587_s_at PTPRC Hs.444324 C

212613_at BTN3A2 Hs.376046 butyrophilin, subfamily 3, member A2

212873_at HA-1 Hs.l 96914 minor histocompatibihty antigen HA-1

213095_x_at AIF1 Hs.76364 allograft inflammatory factor 1 Homo sapiens T cell receptor beta chain

213193_x_at — Hs.419777 BV20S1 BJ1-5 BC1 mRNA, complete cds

213309_at PLCL2 Hs.54886 phospholipase C-like 2 integrin, alpha 4 (antigen CD49D, alpha 4

213416_at ITGA4 Hs.145140 subunit of VLA-4 receptor)

213475 s at ITGAL Hs.174103 integrin, alpha L (antigen CD11A (pl80), lymphocyte function-associated antigen 1; alpha polypeptide) CD3D antigen, delta polypeptide (TiT3

213539 at CD3D Hs.95327 complex) ras-related C3 botulinum toxin Substrate 2

213603 s at RAC2 Hs.301175 (rho family, small GTP binding protein Rac2)

213888_s_at DJ434O14.3 Hs.147434 hypothetical protein dJ434O14.3 213915 at NKG7 Hs.10306 natural killer cell group 7 sequence Homo sapiens similar to neutrophil cytosolic factor 1 (47kD, chronic granulomatous

214084_x_at — Hs.448231 disease, autosomal 1) (LOC220830), mRNA

214181_x_at NCR3 Hs.509513 natural cytotoxicity triggering receptor 3

214366 s at ALOX5 Hs.89499 arachidonate 5-lipoxygenase

214467_at GPR65 Hs.131924 G protein-coupled receptor 65

214574 x at LST1 Hs.436066 leukocyte specific transcript 1

214617_at PRF1 Hs.2200 perforin 1 (pore forming protein)

215051_x_at AIF1 Hs.76364 allograf inflammatory factor 1

215633_x_at LST1 Hs.436066 leukocyte specific transcript 1

215806_x_at TRG@ Hs.385086 T cell receptor gamma locus

216920 s at TRG@ Hs.385086 T cell receptor gamma locus

217147_s_at TREVI Hs.138701 T-cell receptor interacting molecule hematological and neurological expressed

217755_at HN1 Hs.l 09706 1

218231_at NAGK Hs.7036 N-acetylglucosamine kinase

218870 at ARHGAP15 Hs.433597 Rho GTPase activating protein 15

219014 at PLAC8 Hs.371003 placenta-specific 8

219191 s at BIN2 Hs.14770 bridging integrator 2

219279_at DOCK10 Hs.21126 dedicator of cytokinesis protein 10

219403 s at HPSE Hs.44227 heparanase

219452_at DPEP2 Hs.499331 dipeptidase 2 cat eye syndrome chromosome region,

219505_at CECR1 Hs.170310 candidate 1 paired immunoglobin-like type 2 receptor

219788_at PILRA Hs.122591 alpha

219812_at STAG3 Hs.323634 stromal antigen 3 C-type (calcium dependent, carbohydrate-

219947_at CLECSF6 Hs.115515 recognition domain) lectin, superfamily member 6 caspase recruitment domain family, mem¬

220066_at CARD15 Hs.135201 ber 15 carbohydrate (N-acetylglucosamine 6-O)

221059_s_at CHST6 Hs.l 57439 sulfotransferase 6

221081_s_at FLJ22457 Hs.447624 hypothetical protein FLJ22457

221558_s_at LEF1 Hs.44865 lymphoid enhancer-binding factor 1 Williams-Beuren syndrome chromosome

221581_s_at WBSCR5 Hs.56607 region 5

221601_s_at TOSO Hs.58831 regulator of Fas-induced apoptosis

222062_at WSX1 Hs.132781 class I cytokine receptor

222218 s at PILRA Hs.122591 paired immunoglobin-like type 2 receptor alpha

34210 at CDW52 Hs.276770 CDW52 antigen (CAMPATH-1 antigen) 35974 at LRMP Hs.124922 lymphoid-restricted membrane protein

Tabelle 6

Gene ausgewählt nach Merkmalen unter Bedingung 2. Die in der letzten Spalte mit 1 markierten Gene stellen neben ausgewählten Vertretern weitere Mehrfachbestimmungen von Immun- globulinsequenzen dar und wurden deshalb für die statistischen Berechnungen und Clusteranalyse in den zugehörigen Figuren nicht verwendet.

Affymetrix_ID Gen Symbol Unigene Name signal transducer and activator of transcrip- 200887 s at STAT1 Hs.21486 tion 1, 91kDa major histocompatibility complex, class II,

201137_s_at HLA-DPB1 Hs.368409 DP beta 1 201286_at SDC1 Hs.82109 syndecan 1 201287_s_at SDC1 Hs.82109 syndecan 1 201291_s_at TOP2A Hs.l 56346 topoisomerase (DNA) II alpha 170kDa 201310 s at C5orfl3 Hs.508741 chromosome 5 open reading frame 13 myristoylated alanine-rich protein kinase C

201668 x at MARCKS Hs.318603 Substrate myristoylated alanine-rich protein kinase C

201669_s_at MARCKS Hs.318603 Substrate myristoylated alanine-rich protein kinase C

201670_s_at MARCKS Hs.318603 Substrate

201688_s_at TPD52 Hs.162089 tumor protein D52

201689_s_at TPD52 Hs.162089 tumor protein D52

201690_s_at TPD52 Hs.l 62089 tumor protein D52 collagen, type III, alpha 1 (Ehlers-Danlos

201852 x at COL3A1 Hs.443625 syndrome type IV, autosomal dominant)

201890_at RRM2 Hs.226390 ribonucleotide reductase M2 polypeptide guanylate binding protein 1, interferon-

202269_x_at GBP1 Hs.62661 inducible, 67kDa guanylate binding protein 1, interferon-

202270_at GBP1 Hs.62661 inducible, 67kDa

202310_s_at COL1A1 Hs.l 72928 collagen, type I, alpha 1

202311_s_at COL1A1 Hs.l 72928 collagen, type I, alpha 1

202404 s at COL1A2 Hs.232115 collagen, type I, alpha 2

20241 l_at IFI27 Hs.278613 interferon, alpha-inducible protein 27

202898_at SDC3 Hs.l 58287 syndecan 3 (N-syndecan)

202998_s_at LOXL2 Hs.83354 lysyl oxidase-like 2

203213_at CDC2 Hs.334562 cell division cycle 2, Gl to S and G2 to M spinocerebellar ataxia 1 (olivopontocerebel-

203232_s_at SCA1 Hs.434961 lar ataxia 1, autosomal dominant, ataxin 1)

203325_s_at COL5A1 Hs.433695 collagen, type V, alpha 1

203417_at MFAP2 Hs.389137 microfibrillar-associated protein 2

203570_at LOXL1 Hs.65436 lysyl oxidase-like 1

203666 at CXCL12 Hs.436042 chemokine (C-X-C motif) ligand 12 (stro- mal cell-derived factor 1)

203868 s_at VCAM1 Hs.l 09225 vascular cell adhesion molecule 1

203915_at CXCL9 Hs.77367 chemokine (C-X-C motif) ligand 9

203917_at CXADR Hs.79187 coxsackie virus and adenovirus receptor major histocompatibility complex, class II,

203932_at HLA-DMB Hs.l 162 DM beta

20405 l_s_at SFRP4 Hs.l 05700 secreted frizzled-related protein 4

204114 at NID2 Hs.147697 nidogen 2 (osteonidogen) fibronectin leucine rieh transmembrane

204358_s_at FLRT2 Hs.48998 protein 2 fibronectin leucine rieh transmembrane

204359_at FLRT2 Hs.48998 protein 2 chemokine (C-X-C motif) ligand 1 (mela-

204470_at CXCL1 Hs.789 noma growth stimulating activity, alpha)

204471_at GAP43 Hs.79000 growth associated protein 43 matrix metalloproteinase 1 (interstitial col-

204475_at MMP1 Hs.83169 lagenase)

204533 at CXCLIO Hs.413924 chemokine (C-X-C motif) ligand 10 major histocompatibility complex, class π,

204670_x_at HLA-DRB3 Hs.308026 DR beta 3 CD79A antigen (immunoglobulin-

205049_s_at CD79A Hs.79630 associated alpha) 205081 at CRIP1 Hs.423190 cysteine-rich protein 1 (intestinal) solute carrier family 16 (monocarboxylic

205234_at SLC16A4 Hs.351306 acid transporters), member 4 CXC chemokine (C-X-C motif) ligand 13 (B-cell

205242_at L13 Hs.l 00431 chemoattraetant)

205267_at POU2AF1 Hs.2407 POU domain, class 2, associating factor 1

205569_at LAMP3 Hs.10887 lysosomal-associated membrane protein 3 major histocompatibility complex, class II,

205671_s_at HLA-DOB Hs.l 802 DO beta

205692 s at CD38 Hs.l 74944 CD38 antigen (p45)

205721_at GFRA2 Hs.441202 GDNF family receptor alpha 2 RAS guanyl releasing protein 3 (calcium

205801 s at RASGRP3 Hs.24024 and DAG-regulated) macrophage receptor with collagenous

205819 at MARCO Hs.67726 strueture matrix metalloproteinase 3 (stromelysin 1,

205828_at MMP3 Hs.375129 progelatinase)

205890_s_at UBD Hs.44532 ubiquitin D a disintegrin and metalloproteinase domain

205997_at ADAM28 Hs.l 74030 28

206022_at NDP Hs.2839 Norrie disease (pseudoglioma) tumor necrosis factor, alpha-induced prote¬

206025_s_at TNFAIP6 Hs.407546 in 6 tumor necrosis factor, alpha-induced prote¬

206026_s_at TNFAIP6 Hs.407546 in 6 ADAMDEC

206134 at 1 Hs.145296 ADAM-like, decysin 1 lymphocyte antigen 64 homolog, radiopro-

206206 at LY64 Hs.87205 tective 105kDa (mouse) major histocompatibility complex, class π,

206313 at HLA-DOA Hs.351874 DO alpha chemokine (C-X-C motif) ligand 6 (granu-

206336_at CXCL6 Hs.164021 locyte chemotactic protein 2)

206366_x_at XCL1 Hs.174228 chemokine (C motif) ligand 1

206407_s_at CCL13 Hs.414629 chemokine (C-C motif) ligand 13

206513 at AIM2 Hs.105115 absent in melanoma 2 tumor necrosis factor receptor superfamily,

206641 at TNFRSF17 Hs.2556 member 17 C-type (calcium dependent, carbohydrate- recognition domain) lectin, superfamily

206682_at CLECSF13 Hs.54403 member 13 (macrophage-derived) cadherin 11, type 2, OB-cadherin (osteo-

207173_x_at CDH11 Hs.443435 blast) 207655 s at BLNK Hs.l 67746 B-cell linker serine (or cysteine) proteinase inhibitor, clade H (heat shock protein 47), member 1,

207714_s_at SERPINHl Hs.241579 (collagen binding protein 1) 207977_s_at DPT Hs.80552 dermatopontin DKFZP564

20809 l_s_at K0822 Hs.4750 hypothetical protein DKFZp564K0822 ATP-binding cassette, sub-family C

208161_s_at ABCC3 Hs.90786 (CFTR/MRP), member 3 208850_s_at THY1 Hs.l 34643 Thy-1 cell surface antigen 208851 s at THY1 Hs.134643 Thy-1 cell surface antigen major histocompatibility complex, class II,

208894 at HLA-DRA Hs.409805 DR alpha Bernardinelli-Seip congenital lipodystrophy

208906_at BSCL2 Hs.438912 2 (seipin)

209138_x_at IGL@ Hs.458262 immunoglobulin lambda locus BCG-induced gene in monocytes, clone

209267_s_at BIGM103 Hs.284205 103 major histocompatibility complex, class II,

209312_x_at HLA-DRB3 Hs.308026 DR beta 3

209374_s_at IGHM Hs.439852 immunoglobulin heavy constant mu retinoic acid receptor responder (tazarotene

209496_at RARRES2 Hs.37682 induced) 2

209546_s_at APOL1 Hs.l 14309 apolipoprotein L, 1 antigen identified by monoclonal antibody

209583_s_at MOX2 Hs.79015 MRC OX-2 DKFZp564I

209596 at 1922 Hs.72157 adlican CD74 antigen (invariant polypeptide of major histocompatibility complex, class II

209619 at CD74 Hs.446471 antigen-associated)

209627_s_at OSBPL3 Hs.197955 oxysterol binding protein-like 3

209696_at FBPl Hs.360509 fructose-l,6-bisphosphatase 1 secreted phosphoprotein 1 (osteopontin, bone sialoprotein I, early T-lymphocyte

209875_s_at SPP1 Hs.313 activation 1) 209906 at C3AR1 Hs.155935 complement component 3 a receptor 1 chemokine (C-C motif) ligand 18 (pulmo-

209924 at CCL18 Hs.16530 nary and activation-regulated)

209946 at VEGFC Hs.79141 vascular endothelial growth factor C

209955 s_at FAP Hs.436852 fibroblast activation protein, alpha

210072 at CCL19 Hs.50002 chemokine (C-C motif) ligand 19 leukocyte immunoglobulin-like receptor, subfamily B (with TM and HTM domains),

210152_at LILRB4 Hs.67846 member 4

210163_at CXCLl 1 Hs.103982 chemokine (C-X-C motif) ligand 11 membrane-spanning 4-domains, subfamily

210356_x_at MS4A1 Hs.438040 A, member 1 tumor necrosis factor (ligand) superfamily,

210643_at TNFSF11 Hs.333791 member 11 Fc fragment of IgG, low affinity Ilb, recep¬

210889_s_at FCGR2B Hs.126384 tor for (CD32)

211122 s at CXCLl 1 Hs.103982 chemokine (C-X-C motif) ligand 11 collagen, type III, alpha 1 (Ehlers-Danlos

211161 s at Hs.119571 syndrome type IV, autosomal dominant) immunoglobulin heavy constant gamma 3

211430 s at IGHG3 Hs.413826 (G3m marker) Homo sapiens clone P2-114 anti-oxidized LDL immunoglobulin heavy chain Fab

211633 x at Hs.406615 mRNA, partial cds Homo sapiens partial mRNA for immunoglobulin heavy chain variable region

211634 x at Hs.449011 (IGHV gene), isolate B-CLL G026 Homo sapiens partial mRNA for immunoglobulin heavy chain variable region

211635 x at Hs.449011 (IGHV gene), isolate B-CLL G026 Homo sapiens partial mRNA for immunoglobulin heavy chain variable region

211637 x at Hs.383169 (IGHV32-D-JH-Cmu gene), clone ET39 Homo sapiens clone HAI anti-HAN capsid immunoglobulin G heavy chain variable

211639 x at Hs.383438 region mR A, partial cds Homo sapiens partial mRΝA for immunoglobulin heavy chain variable region

211640 x at Hs.449011 (IGHV gene), isolate B-CLL G026 Homo sapiens clone P2-116 anti-oxidized LDL immunoglobulin heavy chain Fab

211641 x at Hs.64568 mRΝA, partial cds Homo sapiens clone P2-32 anti-oxidized LDL immunoglobulin light chain Fab

211643 x at Hs.512126 mRΝA, partial cds Homo sapiens clone H2-38 anti-oxidized LDL immunoglobulin light chain Fab

211644 x at Hs.512125 mRΝA, partial cds Homo sapiens isolate donor Z clone Z55K immunoglobulin kappa light chain variable

211645_x_at Hs.512133 region mRΝA, partial cds 211647 x at Hs.449057 Homo sapiens partial mRΝA for immuno- globulin heavy chain variable region (IGHV gene), case 1, variant tumor clone 5 Homo sapiens partial mRNA for immunoglobulin heavy chain variable region

211649 x at Hs.449057 (IGHV gene), case 1, variant tumor clone 5 Homo sapiens partial mRNA for IgM immunoglobulin heavy chain variable region

211650 x at Hs.448957 (IGHV gene), clone LIBPM376 major histocompatibility complex, class II,

211654_x_at HLA-DQB1 Hs.409934 DQ beta 1 Homo sapiens cDNA clone MGC:62026

211655_at — Hs.405944 IMAGE:6450688, complete cds major histocompatibility complex, class π,

211656_x_at HLA-DQB1 Hs.409934 DQ beta 1

211798 x at IGLJ3 Hs.l 02950 immunoglobulin lambda joining 3 Homo sapiens mRNA for single-chain anti-

211835_at Hs.159386 body, complete cds (scFv2) Homo sapiens mRNA for single-chain anti-

211868_x_at --- Hs.249245 body, complete cds. 211881 x at IGLJ3 Hs.l02950 immunoglobulin lambda joining 3 Homo sapiens partial mRNA for IgM immunoglobulin heavy chain variable region

211908_x_at Hs.448957 (IGHV gene), clone LIBPM376 major histocompatibility complex, class π,

211990_at HLA-DPA1 Hs.914 DP alpha 1 major histocompatibility complex, class II,

211991_s_at HLA-DPA1 Hs.914 DP alpha 1 212311_at KIAA0746 Hs.49500 KIAA0746 protein 212314_at KIAA0746 Hs.49500 KIAA0746 protein 212488_at COL5A1 Hs.433695 collagen, type V, alpha 1 212489 at COL5A1 Hs.433695 collagen, type V, alpha 1 immunoglobulin J polypeptide, linker protein for immunoglobulin alpha and mu po-

212592_at IGJ Hs.381568 lypeptides 212624_s_at CHN1 Hs.380138 chimerin (chimaerin) 1 21265 l_at RHOBTB1 Hs.l 5099 Rho-related BTB domain containing 1 major histocompatibility complex, class II,

212671_s_at HLA-DQA1 Hs.387679 DQ alpha 1

212827_at IGHM Hs.439852 immunoglobulin heavy constant mu

212942_s_at KIAAl 199 Hs.212584 KIAAl 199 protein

213056_at GRSP1 Hs.158867 GRP1 -binding protein GRSP1

213068_at DPT Hs.80552 dermatopontin DKFZP586L

213125_at 151 Hs.43658 DKFZP586L151 protein Homo sapiens, clone IMAGE:5728597,

213502_x_at Hs.272302 mRNA major histocompatibility complex, class π,

213537_at HLA-DPA1 Hs.914 DP alpha 1 213592_at AGTRL1 Hs.438311 angiotensin II receptor-like 1 213869_x_at THY1 Hs.l 34643 Thy-1 cell surface antigen 213909 at LRRC15 Hs.288467 leucine rieh repeat containing 15 213975 s_at LYZ Hs.234734 lysozyme (renal amyloidosis)

214560 at FPRL2 Hs.511953 formyl peptide receptor-like 2

214567_s_at XCL2 Hs.458346 chemokine (C motif) ligand 2 Homo sapiens clone H2-38 anti-oxidized LDL immunoglobulin light chain Fab

214669 x at Hs.512125 mRNA, partial cds 1

214677 x at IGLJ3 Hs.449601 immunoglobulin lambda joining 3 1

214702_at FN1 Hs.418138 fibronectin 1 Homo sapiens clone RI-34 thyroid peroxi- dase autoantibody light chain variable regi¬

214768 x at Hs.449610 on mRNA, partial cds 1

214770_at MSR1 Hs.436887 macrophage scavenger receptor 1 Homo sapiens immunoglobulin kappa light

214777_at — Hs.512124 chain VKJ region mRNA, partial cds 1 Homo sapiens clone RI-34 thyroid peroxi- dase autoantibody light chain variable regi¬

214836_x_at — Hs.449610 on mRNA, partial cds 1 Homo sapiens partial mRNA for IgM immunoglobulin heavy chain variable region

214916_x_at — Hs.448957 (IGHV gene), clone LIBPM376 1 Homo sapiens isolate sy-3M/ll-B4 immunoglobulin heavy chain variable region

214973 x at Hs.448982 mRNA, partial cds. 1

214974 x at CXCL5 Hs.89714 chemokine (C-X-C motif) ligand 5 collagen, type III, alpha 1 (Ehlers-Danlos

215076 s at COL3A1 Hs.443625 syndrome type IV, autosomal dominant) Homo sapiens cDNA FLJ26905 fis, clone RCT01427, highly similar to Ig lambda

215121 x at Hs.356861 chain C regions 1 Homo sapiens immunoglobulin kappa light chain variable and constant region mRNA,

215176 x at Hs.503443 partial cds 1 major histocompatibility complex, class π,

215193 x at HLA-DRB3 Hs.308026 DR beta 3 Homo sapiens clone ASPBLL54 immunoglobulin lambda light chain VJ region

215214 at Hs.449579 mRNA, partial cds 1 major histocompatibility complex, class II,

215536_at HLA-DQB2 Hs.375115 DQ beta 2 Homo sapiens cDNA FLJ12215 fis, clone

215565 at — Hs.467914 MAMMA1001021. Homo sapiens clone mcg53-54 immunoglobulin lambda light chain variable region

215777 at Hs.449575 4a mRNA, partial cds 1 Homo sapiens, clone IMAGE:5728597,

215946 x at Hs.272302 mRNA colony stimulating factor 2 (granulocyte-

215949_x_at — Hs.1349 macrophage) 1

216207 x at IGKV1D-13 Hs.390427 immunoglobulin kappa variable 1 D- 13 1 Homo sapiens clone bsmneg3-t7 immuno¬

216365 x at Hs.283876 globulin lambda light chain VJ region, 1 (IGL) mRNA, partial cds. Homo sapiens partial IGKV gene for immunoglobulin kappa chain variable region,

216401_x_at — Hs.307136 clone 38 Homo sapiens immunoglobulin lambda light chain variable and constant region

216412_x_at — Hs.449599 mRNA, partial cds

216430_x_at IGLJ3 Hs.449601 immunoglobulin lambda j oining 3 Human immunoglobulin heavy chain varia-

216491_x_at — Hs.288711 ble region (V4-4) gene, partial cds Homo sapiens IgH VH gene for immuno-

216510_x_at — Hs.301365 globulin heavy chain, partial cds Human germline gene for the leader peptide and variable region of a kappa immunoglo-

216517_at Hs.283770 bulin (subgroup V kappa I) Homo sapiens partial IGVH1 gene for immunoglobulin heavy chain V region, case 1,

216541_x_at — Hs.272359 cell Mo V 94 Homo sapiens partial IGVH3 V3-20 gene for immunoglobulin heavy chain V region,

216542_x_at — Hs.272355 case 1, clone 2 Human rearranged immunoglobulin heavy

216557_x_at — Hs.249245 chain (A1VH3) gene, partial cds Homo sapiens immunoglobulin lambda

216560_x_at — Hs.249208 gene locus DNA, clone: 84E4 H. sapiens mRNA for Ig light chain, varia- 216573_at Hs.449596 ble region (ID:CLL001VL) Homo sapiens clone H10 anti-HLA- A2/A28 immunoglobulin light chain varia-

216576 x at — Hs.512131 ble region mRNA, partial cds Homo sapiens clone H10 anti-HLA- A2/A28 immunoglobulin light chain varia-

216829_at Hs.512131 ble region mRNA, partial cds

216853_x_at IGLJ3 Hs.102950 immunoglobulin lambdajoining 3 216984 x at IGLJ3 Hs.449592 immunoglobulin lambda joining 3 Homo sapiens partial mRNA for IgM immunoglobulin heavy chain variable region

217084_at Hs.448876 (IGHV gene), clone LIBPM327

217148 x at IGLJ3 Hs.449592 immunoglobulin lambdajoining 3 Homo sapiens isolate donor N clone N8K immunoglobulin kappa light chain variable

217157_x_at Hs.449620 region mRNA, partial cds H.sapiens (Tl.l) mRNA for IG lambda 217179_x_at Hs.440830 light chain Human immunoglobulin heavy chain varia- 217198_x_at Hs.247989 ble region (V4-30.2) gene, partial cds Homo sapiens clone P2-114 anti-oxidized LDL immunoglobulin light chain Fab

217227_x_at Hs.449598 mRNA, partial cds Immunoglobulin light chain lambda varia- 217235 x at Hs.449593 ble region [Homo sapiens], mRNA sequen- ce Homo sapiens immunoglobulin lambda light chain variable and constant region

217258_x_at Hs.449599 mRNA, partial cds Homo sapiens mRNA for immunoglobulin 217281_x_at Hs.448987 heavy chain variable region, ID 31 Homo sapiens sequence ra34b-4G14 immunoglobulin heavy chain variable region

217320_at Hs.512023 mRNA, partial cds. Homo sapiens partial IGVH3 gene for immunoglobulin heavy chain V region, case 1,

217360 x at Hs.272363 cell Mo VI 162 major histocompatibility complex, class II,

217362_x_at HLA-DRB3 Hs.308026 DR beta 3 Homo sapiens partial IGVH3 gene for immunoglobulin heavy chain V region, case 1,

217369_at — Hs.272358 cell Mo TV 72 Human VI 08 gene encoding an immuno¬

217378 x at — Hs.247804 globulin kappa orphon Homo sapiens partial IGVH3 gene for immunoglobulin heavy chain V region, case 1,

217384_x_at — Hs.272357 clone 19

217388_s_at KYNU Hs.444471 kynureninase (L-kynurenine hydrolase) membrane-spanning 4-domains, subfamily

217418 x at MS4A1 Hs.438040 A, member 1 Homo sapiens mRNA for chimaeric transcript of collagen type 1 alpha 1 and platelet

217430 x at — Hs.172928 derived growth factor beta, 189 bp. major histocompatibility complex, class π,

217478 s at HLA-DMA Hs.351279 DM alpha Human kappa-immunoglobulin geπnline pseudogene (cos 118) variable region (sub-

217480 x at — Hs.278448 group V kappa I)

217771 at GOLPH2 Hs.352662 golgi phosphoprotein 2

217853_at TENS1 Hs.12210 tensin-like SH2 domain-containing 1 osteoglycin (osteoinductive factor, mime-

218730_s_at OGN Hs.109439 can)

218815_s_at FLJ10199 Hs.30925 hypothetical protein FLJ10199

218876 at CGI-38 Hs.412685 brain specific protein

219087 at ASPN Hs.435655 asporin (LRR class 1)

219117 s at FKBP11 Hs.438695 FK506 binding protein 11, 19 kDa

219118 at FKBP 11 Hs.438695 FK506 binding protein 11, 19 kDa

219159_s_at CRACC Hs.132906 19 A24 protein B lymphocyte activator macrophage ex¬

219385_at BLAME Hs.438683 pressed B lymphocyte activator macrophage ex¬

219386_s_at BLAME Hs.438683 pressed

219519_s_at SN Hs.31869 sialoadhesin

219667_s_at BANK Hs.193736 B-cell scaffold protein with ahkyrin repeats

219696_at FLJ20054 Hs.101590 hypothetical protein FLJ20054

219725 at TREM2 Hs.435295 triggering receptor expressed on myeloid cells 2 NADP-dependent retinol dehydrogena-

219799_s_at RDHL Hs.l 79608 se/reductase BCG-induced gene in monocytes, clone

219869_s_at BIGM103 Hs.284205 103 solute carrier family 12 (potassium/chloride

219874 at SLC12A8 Hs.36793 transporters), member 8

219888_at SPAG4 Hs.123159 sperm associated antigen 4

220076 at ANKH Hs.l 56727 ankylosis, progressive homolog (mouse)

220146 at TLR7 Hs.179152 toll-like receptor 7

220423_at PLA2G2D Hs.l 89507 phospholipase A2, group IID

220532_s_at LR8 Hs.190161 LR8 protein runt-related transcription factor 1 (acute

220918 at RUNX1 Hs.410774 myeloid leukemia 1; amll oncogene)

221045_s_at PER3 Hs.418036 period homolog 3 (Drosophila) tumor necrosis factor (ligand) superfamily,

221085_at TNFSF15 Hs.241382 member 15

221286_s_at PACAP Hs.409563 proapoptotic caspase adaptor protein DKFZp564

221538_s_at A176 Hs.432329 hypothetical protein DKFZp564A176

221651 x at IGKC Hs.377975 immunoglobulin kappa constant

221730 at COL5A2 Hs.283393 collagen, type V, alpha 2

221933 at NLGN4 Hs.21107 neuroligin 4 Homo sapiens transcribed sequence with weak similarity to protein ref:NP_060312.1 (H.sapiens) hypothetical

222288_at — Hs.130526 protein FLJ20489 [Homo sapiens] chemokine (C-C motif) ligand 18 (pulmo-

32128 at CCL18 Hs.16530 nary and activation-regulated)

37170 at BMP2K Hs.20137 BMP2 inducible kinase

59644 at BMP2K Hs.20137 BMP2 inducible kinase

Tabelle 7

Gene ausgewählt nach Merkmalen wie beschrieben unter Beispiel Bedingung 3.

Affymetrix_ID Gen Symbol Unigene Name

1405_i_at CCL5 Hs.489044 chemokine (C-C motif) ligand 5 pleckstrin homology domain containing,

20141 l_s_at PLEKHB2 Hs.307033 family B (evectins) member 2

201422_at IFI30 Hs.14623 interferon, gamma-inducible protein 30 Lysosomal-associated multispanning mem¬

201720_s_at LAPTM5 Hs.436200 brane protein-5

201743_at CD14 Hs.75627 CD 14 antigen capping protein (actin filament), gelsolin-

201850_at CAPG Hs.82422 like sialyltransferase 1 (beta-galactoside alpha-

201998_at SIAT1 Hs.2554 2,6-sialyltransferase)

202329 at CSK Hs.77793 c-src tyrosine kinase vesicle-associated membrane protein 8 (en-

202546_at VAMP8 Hs.172684 dobrevin) solute carrier family 16 (monocarboxylic

202856_s_at SLC16A3 Hs.386678 acid transporters), member 3

202869_at OAS1 Hs.442936 2',5'-oligoadenylate synthetase 1, 40/46kDa

20290 l_x_at CTSS Hs.181301 cathepsin S

202902_s_at CTSS Hs.181301 cathepsin S

202906 s_at NBS1 Hs.25812 Nijmegen breakage syndrome 1 (nibrin)

203028_s_at CYBA Hs.68877 cytochrome b-245, alpha polypeptide colony stimulating factor 1 receptor, for-

203104_at CSF1R Hs.174142 merly McDonough feline sarcoma viral (v- frns) oncogene homolog

203148_s_at TRTM14 Hs.370530 tripartite motif-containing 14 interferon-induced protein with tetratrico-

203153_at IFIT1 Hs.20315 peptide repeats 1 spinocerebellar ataxia 1 (olivopontocerebel-

20323 l_s_at SCA1 Hs.434961 lar ataxia 1, autosomal dominant, ataxin 1)

20347 l_s_at PLEK Hs.77436 pleckstrin Fc fragment of IgG, low affinity Ha, recep¬

203561_at FCGR2A Hs.352642 tor for (CD32)

203625_x_at SKP2 Hs.23348 S-phase kinase-associated protein 2 (p45)

203741_s_at ADCY7 Hs.172199 adenylate cyclase 7

203771_s_at BLVRA Hs.435726 biliverdin reductase A cytochrome b-245, beta polypeptide (cliro-

203922_s_at CYBB Hs.88974 nic granulomatous disease) cytochrome b-245, beta polypeptide (cliro-

203923_s_at CYBB Hs.88974 nic granulomatous disease) matrix metalloproteinase 9 (gelatinase B,

203936 s at MMP9 Hs.151738 92kDa gelatinase, 92kDa type IV collage- nase)

203964_at NMI Hs.54483 N-myc (and STAT) interactor Fc fragment of IgG, low affinity lila, recep¬

204006 s at FCGR3A Hs.372679 tor for (CD 16) Fc fragment of IgG, low affinity lila, recep¬

204007 at FCGR3A Hs.372679 tor for (CD 16) retinoic acid receptor responder (tazarotene

204070 at RARRES3 Hs.l 7466 induced) 3 highly expressed in cancer, rieh in leucine

204162 at HEC Hs.414407 heptad repeats apolipoprotein B mRNA editing enzyme,

204205_at APOBEC3GHs.286849 catalytic polypeptide-like 3G 204269 at P 2 Hs.80205 pim-2 oncogene proteasome (prosome, macropain) subunit,

204279_at PSMB9 Hs.381081 beta type, 9 (large multifunctional protease 2) solute carrier family 2 (facilitated gluco-

204430_s_at SLC2A5 Hs.33084 se/fruetose transporter), member 5

204446_s_at ALOX5 Hs.89499 arachidonate 5-lipoxygenase

204655_at CCL5 Hs.489044 chemokine (C-C motif) ligand 5

204774_at EVI2A Hs.70499 ecotropic viral Integration site 2A

204820 s at BTN3A3 Hs.167741 butyrophilin, subfamily 3, member A3 204821_at BTN3A3 Hs.167741 butyrophilin, subfamily 3, member A3

20486 l_s_at BIRC1 Hs.79019 baculoviral IAP repeat-containing 1

205098_at CCR1 Hs.301921 chemokine (C-C motif) receptor 1

205099_s_at CCR1 Hs.301921 chemokine (C-C motif) receptor 1 colony stimulating factor 2 receptor, beta,

205159 at CSF2RB Hs.285401 low-affinity (granulocyte-macrophage) lymphocyte cytosolic protein 2 (SH2 do¬

205269 at LCP2 Hs.2488 main containing leukocyte protein of 76kDa) granzyme A (granzyme 1, cytotoxic T-

205488_at GZMA Hs.90708 lymphocyte-associated serine esterase 3)

205552_s_at OAS1 Hs.442936 2',5'-oligoadenylate synthetase 1, 40/46kDa integrin, alpha M (complement component receptor 3, alpha; also known as CD 11b

205786 s at ITGAM Hs.172631 (pl70), macrophage antigen alpha polypeptide)

205841_at JAK2 Hs.434374 Janus kinase 2 (a protein tyrosine kinase) tumor necrosis factor receptor superfamily,

206150_at TNFRSF7 Hs.355307 member 7 phosphoinositide-3-kinase, catalytic, gam¬

206370_at PIK3CG Hs.32942 ma polypeptide

206545_at CD28 Hs.1987 CD28 antigen (Tp44)

206584_at LY96 Hs.69328 lymphocyte antigen 96 granzyme K (serine protease, granzyme 3;

206666_at GZMK Hs.277937 tryptase II) class-I MHC-restricted T cell associated

206914_at CRTAM Hs.159523 molecule

20699 l_s_at CCR5 Hs.511796 chemokine (C-C motif) receptor 5

208146_s_at CPVL Hs.95594 carboxypeptidase, vitellogenic-like ataxia telangiectasia mutated (includes

208442_s_at ATM Hs.504644 complementation groups A, C and D)

20877 l_s_at LTA4H Hs.81118 leukotriene A4 hydrolase uncoupling protein 2 (mitochondrial, proton

208997_s_at UCP2 Hs.80658 carrier) uncoupling protein 2 (mitochondrial, proton

208998_at UCP2 Hs.80658 carrier) proteasome (prosome, macropain) subunit,

209040 s at PSMB8 Hs.l 80062 beta type, 8 (large multifunctional protease 7) ectonucleoside triphosphate diphosphohy-

209474_s_at ENTPD1 Hs.444105 drolase 1 major histocompatibility complex, class π,

209480_at HLA-DQBl Hs.409934 DQ beta 1 pleckstrin homology, Sec7 and coiled-coil

209606_at PSCDBP Hs.270 domains, binding protein major histocompatibility complex, class π,

209728_at HLA-DRB3 Hs.308026 DR beta 3

209734_at HEM1 Hs.443845 hematopoietic protein 1 spastic paraplegia 4 (autosomal dominant;

209748_at SPG4 Hs.512701 spastin)

209823_x_at HLA-DQBl Hs.409934 major histocompatibility complex, class π, DQ beta 1

209846_s_at BTN3A2 Hs.376046 butyrophilin, subfamily 3, member A2 signal transducer and activator of transcrip- 209969 s at STAT1 Hs.21486 tion 1, 91kDa isocitrate dehydrogenase 2 (NADP+), mito¬

210046 s at IDH2 Hs.5337 chondrial malic enzyme 2, NAD(+)-dependent, mito¬

210154_at ME2 Hs.75342 chondrial granzyme B (granzyme 2, cytotoxic T-

210164_at GZMB Hs.1051 lymphocyte-associated serine esterase 1)

210220 at FZD2 Hs.142912 frizzled homolog 2 (Drosophila)

210538_s_ at BIRC3 Hs.127799 baculoviral IAP repeat-containing 3 major histocompatibility complex, class II,

210982_s_ at HLA-DRA Hs.409805 DR alpha leukocyte immunoglobulin-like receptor,

211336 x at LILRB1 Hs.149924 subfamily B (with TM and ITIM domains), member 1

212415 at Sep 06Hs.90998 septin 6 212543_at AMI Hs.422550 absent in melanoma 1 protein tyrosine phosphatase, receptor type,

212588_at PTPRC Hs.444324 C major histocompatibility complex, class π,

212998_x_at HLA-DQB2 HS.375115 DQ beta 2 major histocompatibility complex, class II,

212999_x_at HLA-DQBl Hs.409934 DQ beta 1

213160 at DOCK2 Hs.l 7211 dedicator of cyto-kinesis 2 213174 at KIAA0227 Hs.79170 KIAA0227 protein 213241 at PLXNCl Hs.286229 plexin CI 213452_at ZNF184 Hs.158174 zinc finger protein 184 (Kruppel-like) 213618_at CENTDl Hs.427719 centaurin, delta 1 major histocompatibility complex, class II,

21383 l_at HLA-DQA1 Hs.387679 DQ alpha 1

214054_at DOK2 Hs.71215 docking protein 2, 56kDa Homo sapiens cDNA: FLJ21545 fis, clone

214218_s_at Hs.83623 COL06195 S100 calcium binding protein A8 (calgranu-

214370 at S100A8 Hs.416073 lin A) Fc fragment of IgG, high affinity Ia, recep¬

214511 x at FCGR1A Hs.77424 tor for (CD64) Fc fragment of IgG, high affinity Ia, recep¬

216950 s at FCGR1A Hs.77424 tor for (CD64)

217028_at CXCR4 Hs.421986 chemokine (C-X-C motif) receptor 4

217983_s at RNASE6PL Hs.388130 ribonuclease 6 precursor

218035 s at FLJ20273 Hs.95549 RNA-binding protein

218404_at SNX10 Hs.418132 sorting nexin 10

218747_s_at TAPBP-R Hs.267993 TAP binding protein related

218979_at FLJ12888 Hs.284137 hypothetical protein FLJ12888

219546 at BMP2K Hs.20137 BMP2 inducible kinase

21955 l_at EAF2 Hs.383018 ELL associated factor 2 membrane-spanning 4-domains, subfamily

219666 at MS4A6A Hs.371612 A, member 6A 219694_at FLJ11127 Hs.155085 hypothetical protein FLJ11127 219759_at LRAP Hs.374490 leukocyte-derived arginine aminopeptidase 219777_at hIAN2 Hs.l 05468 human immune associated nucleotide 2 DKFZp434L

219872 at hypothetical protein DKFZp434L142 142 UDP-N-acetyl-alpha-D- galactosamineφolypeptide N-

219956 at GALNT6 Hs.20726 acetylgalactosaminyltransferase 6 (Gal- NAc-T6) SAM domain, SH3 domain and nuclear

220330 s at SAMSN1 Hs.221851 localisation signals, 1 N-acetylneuraminate pyruvate lyase (dihy-

221210_s_at NPL Hs.64896 drodipicolinate synthase) 221658 s at IL21R Hs.210546 interleukin 21 receptor C-type (calcium dependent, carbohydrate-

221698 s at CLECSF12 Hs.161786 recognition domain) lectin, superfamily member 12 Homo sapiens cDNA: FLJ21545 fis, clone

221728_x_at — Hs.83623 COL06195 ceroid-lipofuscinosis, neuronal 6, late in¬

221879_at CLN6 Hs.43654 fantile, variant 38241 at BTN3A3 Hs.167741 butyrophilin, subfamily 3, member A3

Tabelle 8

Ausgewählte Gene der Tabellen 6 und 7, die zur Unterscheidung von zwei Untergruppen der rheumatoiden Arthritis geeignet sind. Die Gene sind bei der t-Test Analyse mit einer Signifikanz von p<0,05 unterschiedlich aktiv zwischen den beiden RA Untergruppen und dienen als Grundlage für die Figur 9

Affymetrix_ID Gen Symbol Unigene Name signal transducer and activator of transcrip- 200887 s at STAT1 Hs.21486 tion 1, 91kDa

201310 s at C5orfl3 Hs.508741 chromosome 5 open reading frame 13

201422_at IFI30 Hs.14623 interferon, gamma-inducible protein 30 capping protein (actin filament), gelsolin-

201850_at CAPG Hs.82422 like

203915 at CXCL9 Hs.77367 chemokine (C-X-C motif) ligand 9

203964_at NMI Hs.54483 N-myc (and STAT) interactor

204051 s at SFRP4 Hs.l 05700 secreted frizzled-related protein 4

204114_at NID2 Hs.147697 nidogen 2 (osteonidogen) proteasome (prosome, macropain) subunit,

204279 at PSMB9 Hs.381081 beta type, 9 (large multifunctional protease 2) fibronectin leucine rieh transmembrane

204358_s_at FLRT2 Hs.48998 protein 2

204359 at FLRT2 Hs.48998 fibronectin leucine rieh transmembrane protein 2 matrix metalloproteinase 1 (interstitial col-

204475 at MMP1 Hs.83169 lagenase) CD79A antigen (immunoglobulin-

205049 s at CD79A Hs.79630 associated alpha) solute carrier family 16 (monocarboxylic

205234_at SLC16A4 Hs.351306 acid transporters), member 4 CXC chemokine (C-X-C motif) ligand 13 (B-cell

205242_at Hs.l 00431 _L13 chemoattractant) 205267_at POU2AF1 Hs.2407 POU domain, class 2, associating factor 1 granzyme A (granzyme 1, cytotoxic T- 205488 at GZMA Hs.90708 lymphocyte-associated serine esterase 3) major histocompatibility complex, class II,

20567 l_s_at HLA-DOB Hs.l 802 DO beta

205692_s_at CD38 Hs.l 74944 CD38 antigen (p45) matrix metalloproteinase 3 (stromelysin 1,

205828_at MMP3 Hs.375129 progelatinase)

205890_s_at UBD Hs.44532 ubiquitin D tumor necrosis factor, alpha-induced prote¬

206025_s_at TNFAIP6 Hs.407546 in 6 tumor necrosis factor, alpha-induced prote¬

206026_s_at TNFAIP6 Hs.407546 in 6 chemokine (C-X-C motif) ligand 6 (granu- ,

206336_at CXCL6 Hs.164021 locyte chemotactic protein 2)

206545_at CD28 Hs.1987 CD28 antigen (Tp44) tumor necrosis factor receptor superfamily,

206641_at TNFRSF17 Hs.2556 member 17 cadherin 11, type 2, OB-cadherin (osteo-

207173_x_at CDH11 Hs.443435 blast)

208146_s_at CPVL Hs.95594 carboxypeptidase, vitellogenic-like proteasome (prosome, macropain) subunit,

209040_s_at PSMB8 Hs.l 80062 beta type, 8 (large multifunctional protease 7)

209546_s_at APOL1 Hs.l 14309 apolipoprotein L, 1 spastic paraplegia 4 (autosomal dominant;

209748_at SPG4 Hs.512701 spastin) secreted phosphoprotein 1 (osteopontin,

209875 s at SPP1 Hs.313 bone sialoprotein I, early T-lymphocyte activation 1) tumor necrosis factor (ligand) superfamily,

210643_at TNFSF11 Hs.333791 member 11 212651_at RHOBTB1 Hs.l 5099 Rho-related BTB domain containing 1 major histocompatibility complex, class II, 212671 s at HLA-DQA1 Hs.387679 DQ alpha 1 major histocompatibility complex, class EL,

215536_at HLA-DQB2 Hs.375115 DQ beta 2 major histocompatibility complex, class II,

217362_x_at HLA-DRB3 Hs.308026 DR beta 3 217388_s_at KYNU Hs.444471 kynureninase (L-kynurenine hydrolase) Homo sapiens mRNA for chimaeric trans217430 x at Hs.l 72928 cript of collagen type 1 alpha 1 and platelet derived growth factor beta, 189 bp. major histocompatibility complex, class π,

217478 s at HLA-DMA Hs.351279 DM alpha B lymphocyte activator macrophage ex¬

219386 s at BLAME Hs.438683 pressed Homo sapiens transcribed sequence with weak similarity to protein

222288 at Hs.130526 ref:NP_060312.1 (H.sapiens) hypothetical protein FLJ20489 [Homo sapiens]

Glossar

Genom die komplette DNA Sequenz eines Chromosomensatzes Transkriptom der komplette Satz von RNA Transkripten, die zu einem gegebenen Zeitpunkt vom Genom abgelesen -wurden

Proteom Der komplette Satz an Proteinen, der nach der Transkription hergestellt und modifiziert wurde

Genexpressioiisprofil Muster des Transkriptionsniveaus von Genen in einer gegebenen Probe

Genexpressionssignatur Profile, die von einer definierten Bedingung induziert wurden oder mit einem Zustand assoziiert sind (z.B. das Profil eines bestimmten Zelltyps im Normalzustand; oder das durch ein Zytokin induzierte Profil in einem Gewebe- oder Zelltyp)

Normalzustand gesunder, nicht durch Krankheit beeinflußter Zustand Markergen Gen, das für eine Signatur charakteristisch ist und anhand dessen Expressionsstärke der Anteil der Signatur in einer komplexen Probe ermittelt werden kann. molekulares Profil ein Muster von Signalstärken aus verschiedenen Vertretern einer molekularen Substanzklasse in einer gegebenen Probe.

Erklärung zu den in den Gleichungen verwendeten Variablen: y Signal

X Konzentration

SI maximal gemessenes Signal über alle Gene in allen einbezogenen Arrays (hier 123 Arrays) Kl zum Signal SI angenommene RNA Konzentration so minimales gemessenes und noch als „present" eingestuftes Signal über alle Gene in allen einbezogenen Arrays (hier 123 Arrays)

KO zum Signal SO angenommene RNA Konzentration

SZelltyp Signal eines Gens, das von einem vom Normalzustand aufgereinigten Zelltyp gemessen wird

KZelltyp zum Signal SZelltyp gehörige RNA Konzentration eines Gens AZelltyp Anteil einer definierten Zellpopulation in einer komplexen Probe aus verschiedenen Zelltypen

Ki zum Zelltyp i gehörige RNA Konzentration eines Gens im Normalzustand Ai bzw. AP,i Anteil der Zellpopulation i in einer komplexen Probe aus verschiedenen Zelltypen

A ,i Anteil der Zellpopulation i in einer komplexen Kontrolle aus verschiedenen Zelltypen

SProbe Signal eines Gens, das von einer komplexen zu untersuchenden Probe gemessen wird

KProbe zum Signal SProbe gehörige RNA Konzentration eines Gens SKontrolle Signal eines Gens, das von einer definierten Kontrollprobe (Normalzustand) gemessen wird KKontrolle zum Signal SKontrolle gehörige RNA Konzentration eines Gens Smin Signal, das als Detektionsgrenze für ein Gen gemessen wird

K in zum Signal Smin gehörige RNA Konzentration eines Gens

SminI Signal, das bei einer für das Messsystem idealen Detektionsgrenze gemessen wird KminI zum Signal SminI gehörige RNA Konzentration eines Gens

SminG Signal, das unter ungünstigen Bedingungen als Detektionsgrenze für ein Gen gemessen wird KminG zum Signal SminG gehörige RNA Konzentration eines Gens KminMl zum Signal SminG gehörige RNA Konzentration eines Gens, die sich unter der Annahme von Modell Ml ergibt

KminM2 zum Signal SminG gehörige RNA Konzentration eines Gens, die sich unter der Annahme von Modell M2 ergibt

KProbeMl Konzentration einer Probe unter Annahme des Modells Ml KProbeM2 Konzentration einer Probe unter Annahme des Modells M2 S 'Probe Signal eines Gens in einer komplexen Probe, das sich virtuell aus den Signaturen errechnet

K'Probe Konzentration eines Gens in einer komplexen Probe, das sich virtuell aus den Signaturen errechnet

ARest Rest-Anteil in einer komplexen Probe, der nach Abzug aller zu den bekannten Signaturen gehörenden Anteile verbleibt

KRest Konzentration eines Genes in der Restpopulation im Normalzustand KF Korrekturfaktor zur Anpassung der Signaturkonzentrationen an eine komplexe Kontrolle

Ki,reg Konzentrationsänderung e ines Gens, die durch Regulation im Vergleich zum Normalzustand entsteht

Ki,f Konzentration eines Genes im Zelltyp i unter funktionellem Einfluss SLR Signal Log Ratio

Claims

U30085Patentansprüche

1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung und qualitativen Charakterisierung eines komplexen Expressionsprofils in einer biologischen Probe, umfassend die Schritte von a) zur Verfügung stellen einer zu untersuchenden biologischen Probe, b) zur Verfügung stellen mindestens eines für einen Einfluss charakteristischen und damit definierte Expressionsprofils, das in der zu untersuchenden Probe enthalten ist oder gesucht wird, wobei das mindestens eine definierte Expressionsprofil einen oder mehrere Marker umfaßt, die ausschließlich für das Expressionsprofil typisch sind, c) Bestimmen des komplexen Expressionsprofils der biologischen Probe, und d) quantitative Bestimmung des Anteils eines jeden im Schritt b) zur Verfügung gestellten definierten Expressionsprofils über den Anteil an typischen Markern in dem in Schritt c) bestimmten Expressionsprofil der biologischen Probe.

2. Verfahren zur quantitativen Bestimmung und qualitativen Charakterisierung eines komplexen Expressionsprofils in einer biologischen Probe, umfassend die weiteren Schritte von e) Berechnung eines virtuellen Profils von Signalen, das aufgrund der Anteile von den bekannten charakteristischen Expressionsprofilen erwartet wird, f) Berechnung des Unterschieds zwischen dem tatsächlichen gemessenen komplexen Expressionsprofil und dem virtuellen Profil, so daß ein Restprofil entsteht, und g) Bestimmen weiterer typischer Merkmale für die Probe aus dem Restprofil durch den Vergleich mit Restprofilen anderer komplexer Proben.

3. Verfahren zur quantitativen Bestimmung und qualitativen Charakterisierung eines komplexen Expressionsprofils in einer biologischen Probe nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Bestimmen des geeigneten Expressionsprofils das Bestimmen eines RNA-Expressionsprofils, Protein-Expressionsprofils, -Sekretionsprofils, DNA-Methylierungsprofils und/oder Metaboli- tenprofil umfaßt.

4. Verfaliren zur quantitativen Bestimmung und qualitativen Charakterisierung eines komplexen Expressionsprofils in einer biologischen Probe nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Bestimmen eines Expressionsprofils eine molekulare Nachweismethode, wie z. B. ein Genarray, Proteinarray, Peptidarray und/oder PCR-Array, eine Massenspektrometrie oder die Erstellung eines Differentialblutbilds oder eine FACS-Analyse umfaßt.

5. Verfahren zur quantitativen Bestimmung und qualitativen Charakterisierung eines komplexen Expressionsprofils in einer biologischen Probe nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die in Schritt b) bestimmten Expressionsprofile ausgewählt sind aus der Gruppe von Expressionsprofilen, die funktionelle Einflüsse o der Zustände charakterisieren, wie z ,B. Expressionsprofile, die die Aktivität von b estimmten B otenstoffen, d er S ignaltransduktion o der der Genregulation charakterisieren oder die Ausprägung bestimmter molekularer Vorgänge charakterisieren, wie z.B. der Apoptose, Zellteilung, Zelldifferenzierung, Gewebeentwicklung, Entzündung, Infektion, Tumorgenese, Metastasierung, Gefäßneubildung, Invasion, Zerstörung, Regeneration, Autoimmunreaktion, Immunkompatibilität, Wundheilung, Allergie, Vergiftung, Sepsis oder die die Ausprägung bestimmter klinischer Zustände charakterisieren, wie z.B. des Erkrankungsstatus oder der Wirkung von Medikamenten.

6. Verfahren zur quantitativen Bestimmung und qualitativen Charakterisierung eines komplexen Expressionsprofils in einer biologischen Probe nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Berechnung der Gesamtkonzentration aus den Anteilen A_i der verschiedenen Zelltypen bzw. Einflüssen i mit ihren unterschiedlichen Konzentrationen K mittels der Beziehung n

K_Probe =K₁ - A₁ +K₂ - A₂ + ... = ∑(K A_i) rmt i e N (Gleichung 3) (=1 erfolgt.

7. Verfahren zur quantitativen Bestimmung und qualitativen Charakterisierung eines komplexen Expressionsprofils in einer biologischen Probe nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der Anteil eines Markergens mittels der Formel

Az_eii_tp ⁼ — ^Ec2^~ ^^zw- ^ ^eme doppelt-logarithmische Beziehung von Konzentration und Si- ^Zelltyp

gnal A_Zelltyp = ₂r^^«»-^«— ) (Gleichung 11 bzw. 14)

bestimmt wird, wobei „Zelltyp" stellvertretend für ein charakteristisches definiertes Expressionsprofil steht.

8. Verfahren zur quantitativen Bestimmung und qualitativen Charakterisierung eines komplexen Expressionsprofils in einer biologischen Probe nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei für die Bestimmung der Anteile von Monozyten, T-Zellen oder Granulozyten der Marker ausgewählt ist aus den in Tabelle 2 angegebenen Marke n.

9. Verfahren zur quantitativen Bestimmung und qualitativen Charakterisierung eines komplexen Expressionsprofils in einer biologischen Probe nach einem der Ansprüche 1 bis 8, umfassend die qualitative und oder quantitative Erkennung von Expressionsprofilen eines bei Entzündungsvorgängen vorhandenen Zelltyps, insbesondere der T-Zellen, B-Zellen, Monozyten, Makrophagen, Granulozyten, natürliche Killer-Zellen (NK-Zellen), dendritische Zellen.

10. Verfahren zur quantitativen Bestimmung und qualitativen Charakterisierung eines komplexen Expressionsprofils in einer biologischen Probe nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Bestimmen der quantitativen Zusammensetzung des komplexen Expressionsprofils auf Basis der ermittelten Unterschiede zwischen virtuellem und tatsächlichem Expressionsprofil weiterhin die Identifizierung eines bisher unbekannten Expressionsprofils umfaßt.

11. Verfahren zur quantitativen Bestimmung und qualitativen Charakterisierung eines komplexen Expressionsprofils in einer biologischen Probe nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das Bestimmen der quantitativen Zusammensetzung des komplexen Expressionsprofils auf Basis der ermittelten Unterschiede zwischen virtuellem und tatsächlichem Expressionsprofil weiterhin die Identifizierung von molekularen Kandidaten für die diagnostische, prognostische und/oder therapeutische Anwendung umfaßt.

12. Verfaliren zur Diagnose, Prognose und/oder Verfolgung einer Erkrankung, umfassend ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11.

13. Computersystem, das mit Mitteln zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 11 versehen ist.

14. Computerprogramm, umfassend einen Programmiercode, um die Schritte des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 11 durchzuführen, wenn auf einem Computer ausgeführt.

15. Computerlesbares Datenträgermedium, umfassend ein Computerprogramm nach Anspruch 14 in Form eines computerlesbaren Programmcodes.

16. Laborroboter oder Auswertegerät für molekulare Nachweismethoden, umfassend ein Computersystem und/oder ein Computerprogramm nach Anspruch 13 oder 14.

17. Molekularer Kandidat für die diagnostische, prognostische und/oder therapeutische Anwendung, identifiziert nach einem der Ansprüche 1 bis 11.

18. Molekularer Kandidat für die diagnostische, prognostische und/oder therapeutische Anwendung nach Anspruch 17, der eine in einer der Tabellen 5 bis 8 aufgeführte Sequenz aufweist.

19. Verwendung eines molekularen Kandidaten nach einem der Ansprüche 17 oder 18 a) zur Charakterisierung der entzündlichen Zellinfiltration in ein entzündetes Gewebe mit Genen der Tabelle 5 abgrenzend von der Genaktivierung durch Entzündung, b) z ur C harakterisierung d er G enaktivierung i n einem e ntzündeten G ewebe m it G enen der Tabelle 6 abgrenzend von der Zellinfiltration, c) zur Charakterisierung der Genaktivierung bzw. der entzündlichen Zellinfiltration in ein entzündetes Gewebe über den berechneten Anteil an Aktivierung bzw. Infiltration der Gene in Tabelle 7, d) zur Charakterisierung von Untergruppen entzündlicher Genaktivierung mit Genen der Tabellen 6, 7 und/oder 8.

20. Verwendung eines molekularen Kandidaten nach einem der Ansprüche 17 oder 18 zum Screenen auf pharmakologisch aktive Substanzen, insbesondere Bindepartner.