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EP3105346A1 - Prädiktive mrna biomarker zur vorhersage der behandlung mit methotrexat (mtx) - Google Patents

Prädiktive mrna biomarker zur vorhersage der behandlung mit methotrexat (mtx)

Info

Publication number
EP3105346A1
EP3105346A1 EP15705277.0A EP15705277A EP3105346A1 EP 3105346 A1 EP3105346 A1 EP 3105346A1 EP 15705277 A EP15705277 A EP 15705277A EP 3105346 A1 EP3105346 A1 EP 3105346A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
hla
drb4
mtx
responders
treatment
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP15705277.0A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Bruno STUHLMÜLLER
Karsten MANS
Thomas Häupl
Gerd-R. Burmester
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Charite Universitaetsmedizin Berlin
Original Assignee
Charite Universitaetsmedizin Berlin
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Charite Universitaetsmedizin Berlin filed Critical Charite Universitaetsmedizin Berlin
Publication of EP3105346A1 publication Critical patent/EP3105346A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Definitions

  • the present invention relates to predictive mRNA biomarkers used in combination with HLA-DRB4 to predict treatment with MTX (methotrexate).
  • the present invention further relates to a method of predicting treatment with MTX (methotrexate), comprising the detection of the predictive mRNA biomarkers in combination with HLA-DRB4 in patient samples, wherein the patients are classified into responders or non-responders.
  • RA Rheumatoid arthritis
  • the RA occurs in the total population, depending on the ethnic group, between 0.5 to 3%. Worldwide, the annual incidence is reported to be between 0.1 to 0.5%. In Germany, about 2% of the total population (1.5 million) is affected by this disease; and every year about 100,000 new cases of illness are added. The average cost averaged by this disorder per patient is> € 23,000.
  • the 'rheumatoid factor' is a laboratory parameter in the diagnosis of many rheumatic diseases, but only occurs in about 60% of RA patients (Meyer et al., 1999).
  • the most common laboratory test used today for the diagnosis of RA is the anti-citrullm (anti-CCP) test, which has a significantly higher specificity than the RF test alone. Both test systems have a very good correlation (van Gaalen et al., 2004, Umeda et al., 2013).
  • Second, correlations with human leukocyte antigens have been shown to indicate an increased risk of RA.
  • Methotrexate is the drug of first choice in rheumatoid arthritis and is used in approximately 98% of patients immediately after initial diagnosis. In addition, MTX is also used in other autoimmune diseases and is also a common drug for chemotherapy in various cancers (see Abolmaali et al, 2013 and http://www.cancerresearchuk.org/cancer-help/about-cancer/treatment/cancer - drugs / methotrexate).
  • the object of the present invention was therefore to identify and define suitable biomarkers and to develop suitable test systems in order to enable an improved prediction of the treatment of rheumatic and other diseases.
  • MTX metalhotrexate
  • the gene (s) is (are) used in the form of its mRNA (s).
  • the following 16 genes are assigned to the "HLA-DRB4 positive patient group": ARG1, CKAP4, CRISP3, CST3, GCLM, KIAA0564, KIAA1324, LCN2, LOC654433 / PAX8-AS1, LTP, OLFM4, OSBPL1A, MMP8, SIAH1, SLC8A1 / BF223010 and SULF2.
  • HLA-DRB4-positive patient group and the “HLA-DRB4-negative patient group” herein refer to patients in whose samples the HLA-DRB4 mRNA is expressed as a selectable marker or is not expressed.
  • HLA-DRB4 mRNA is expressed as a selectable marker when a cutoff / cut-off value is reached or exceeded.
  • HLA-DRB4 mRNA is not expressed if a cut-off value is not reached.
  • signal values for the HLA-DRB4 negative patient subgroup of ⁇ 100 and> 1000 for the HLA-DRB4 positive subgroup can be defined as the cut-off value for the FILA gene expression. See, e.g. Table 4.
  • a “predictive marker” refers to a marker that allows the prediction of future expected response (in this case: response and non-response) to a drug.
  • the predictive marker allows the prediction of the course of treatment with a drug, such as MTX, already before the start of treatment The predictive marker allows this prediction for the individual patient.
  • a “predictive marker” differs in particular from a prognostic marker in that in a prognosis at least 2 measurement times are needed to classify a patient as a responder or a non-responder.
  • the patients are preferably classified into responders or non-responders.
  • Methotrexate is the drug of first choice in rheumatoid arthritis and is used in approximately 98% of patients immediately after initial diagnosis.
  • MIX is also used in other autoimmune diseases and is also a common drug for chemotherapy in various cancers (see Abolmaali et al., 2013 and http://www.cancerresearchuk.org/cancer-help/about-cancer/treatment/ cancer-drugs / methotrexate or http: //wvm.drugs.corn/monograph/methotrexate.html#r262).
  • treatment with methotrexate includes combination with biologics and MTX.
  • adalimumab Humira®
  • certolizumab certolizumab
  • golimumab Simponi®
  • infliximab Remicade®
  • rituximab such as rituximab (Rituxan®), abatacept (Orencia®), tocilizumab (Actemra® or
  • the prediction of the treatment and / or the classification of the patients before the start of treatment with MTX metalhotrexate.
  • the samples are preselected in HLA-DRB4-positive or HLA-DRB4-negative samples.
  • inflammatory, chronic inflammatory diseases, autoimmune diseases and / or tumor diseases are preferably treated.
  • the inflammatory, chronic inflammatory diseases and autoimmune diseases are preferably selected from:
  • Rheumatoid arthritis or primarily chronic polyarthritis, juvenile idiopathic arthritis, systemic lupus erythematosus (SLE), systemic sclerosis (scleroderma), polymyositis, dermatomyositis, inclusion-body myositis, psoriasis, multiple sclerosis, uveitis, Crohn's disease, Churg-Strauss disease Syndrome (CSS), Boeck's disease, ankylosing spondylitis, recurrent polychondritis, ulcerative colitis, polymyalgia rheumatica, giant cell arteritis, vasculitis.
  • the tumor diseases are preferably selected from:
  • ALL Acute lymphoblastic leukemia (ALL) (children and adults), bladder urothelial carcinoma, breast cancer, medulloblastoma, ependymoma (children and adults), non-Hodgkin's lymphoma (NHL) (children and adults), osteosarcoma (children and adults).
  • ALL Acute lymphoblastic leukemia
  • bladder urothelial carcinoma breast cancer
  • medulloblastoma medulloblastoma
  • ependymoma children and adults
  • NHL non-Hodgkin's lymphoma
  • osteosarcoma children and adults.
  • At least 50% of the mRNA biomarker genes are determined in combination with HLA-DRB4.
  • biomarker genes 50% of the biomarker genes are 16 of the 32 biomarker genes. In further embodiments, at least 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 or 32 of the 32 biomarker genes are determined, each in combination with HLA-DRB4 ,
  • biomarker genes of the HLA-DRB4 positive patient dummy are determined, in some embodiments only the biomarker genes of the HLA-DRB4 negative patient group are determined, in some embodiments the biomarker genes of both groups, the HLA DRB4-positive and HLA-DRB4-negative patient group determined (in each case in combination with HLA-DRB4).
  • the use according to the invention preferably comprises the determination of the presence of the mRNA marker / biomarker genes and their expression strength in a sample.
  • the presence of the mRNA marker / biomarker genes and their expression strength is preferably determined by means of
  • Sequence-based methods such as serial analysis of gene expression (SAGE) (such as SuperSAGE), real-time quantitative PCR (qPCR) (such as RT-qPCR), bead technology, blot, RNA or next-generation sequencing (such as IonTorrent)
  • SAGE serial analysis of gene expression
  • qPCR real-time quantitative PCR
  • blot blot
  • RNA or next-generation sequencing such as IonTorrent
  • Hybridization-based methods such as in situ hybridization, Northern blot, DNA micro and macroarrays,
  • the technologies for the investigation / determination of gene expression can be divided into hybridization-based methods and sequence-based methods.
  • hybridization-based methods are:
  • RNA is first isolated and electrophoretically separated according to size in a gel. After transfer to a membrane (blotting), the desired RNA sequence is detected by labeled probes (labeled, for example, with radioisotopes, fluorescence dyes) from complementary RNA or DNA via complementary binding. As a rule, only small numbers of sequences are examined simultaneously.
  • the amount of mRNA of a plurality of genes from cells of a culture / tissue can be determined simultaneously.
  • the mRNA is isolated and transcribed into cDNA / cRNA.
  • detection is carried out by complementary hybridization of the labeled cDNA / cRNA (labeled, for example, with radioisotopes, fluorescent dyes) with the probes of the DNA array.
  • RNA microarray techniques use Affymetrix arrays / chips such as biotin / streptavidin amplification and the dye phycoerythrin.
  • sequence-based methods are:
  • SAGE serial analysis of gene expression
  • SuperSAGE the expression of all genes of a cell can be determined very accurately by generating a short sequence piece of each transcript (the so-called "tag") and if possible many of these tags are sequenced.
  • tag a short sequence piece of each transcript
  • the advantage over microarrays is the much more accurate quantification of the transcripts, as well as the ability to identify new transcripts (e.g., non-coding ribonucleic acids such as microRNAs or antisense RNAs) and to study organisms with previously unknown genomes (preferably with SuperSAGE).
  • qPCR real-time quantitative PCR
  • PCR polymerase chain reaction
  • Dyes or special probes added to the reaction mixture are used to monitor the concentration of the product during the PCR.
  • the temporal change of the concentration makes it possible to draw conclusions about the initial concentration of the relevant nucleic acid.
  • RT-qPCR reverse transcriptase real-time qPCR
  • extended form of the multiplex qPCR is a special variant of qPCR.
  • RNA sequencing refers to the determination of the nucleotide sequence of RNA by translating the RNA into cDNA so that the DNA sequencing method can be used Gene expression, for example, how different alleles Genes are expressed to post-transcriptional modifications or for the identification of fusion genes.
  • the DNA microarray technique measures the relative activity of previously identified target genes. Sequence-based methods, such as serial analysis of gene expression (SAGE, SuperSAGE), are also used for gene expression analysis. SuperSAGE is particularly accurate because this method is not limited to previously defined genes but can measure any active gene. Since the introduction of next-generation sequencing methods (RNA-Seq), sequence-based expression analysis has become increasingly popular as it represents a digital alternative to microarrays.
  • SAGE serial analysis of gene expression
  • SuperSAGE is particularly accurate because this method is not limited to previously defined genes but can measure any active gene. Since the introduction of next-generation sequencing methods (RNA-Seq), sequence-based expression analysis has become increasingly popular as it represents a digital alternative to microarrays.
  • the sample according to the invention is preferably a patient sample, which is more preferably selected from whole blood, peripheral blood leukocytes or from purified blood cells.
  • At least one biomarker / gene is selected from the following:
  • HLA-DRB4 as a predictive biomarker for predicting treatment with MTX (methotrexate) / for predicting therapy response to MTX.
  • qPCR real-time quantitative PCR
  • At least one biomarker / gene is selected from CKAP4, CRISP3, KIAA0564, LCN2, OLFM4, MMP8, or SLC8A1 / BF223010 selected from:
  • Method of predicting MTX treatment The object is further achieved according to the invention by methods for predicting the treatment with MTX (methotrexate) / for predicting the therapy response to MTX.
  • the method according to the invention comprises the steps:
  • the patients are classified into responders or non-responders.
  • detecting in step (ii) comprises determining the presence of mRNA markers and their level of expression.
  • determining the relative level of expression of the at least one mRNA biomarker and HLA-DRB4 in step (iii) comprises comparing the level of expression with a cut-off value.
  • determining the relative level of expression of the at least one mRNA biomarker and HLA-DRB4 in step (iii) further comprises determining a Fold Change (FC).
  • the limit values or cut-off values are determined by the manufacturer of the array or chip and / or the evaluation software used (such as BioRetis, online database of BioRetis GmbH Berlin).
  • the cut-off value may be> 50
  • the amount of the regulation factor (FC) may be at least 1.5 (
  • step (iii) the expression level of the at least one mRNA biomarker and of HLA-DRB4 is compared with reference standard (s) and / or control sample (s).
  • the reference standard (s) according to the invention in step (iii) is preferably sample (s) containing one or more household gene (s), such as actin-beta (ACTB), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), 60S ribosomal protein PO (RPLPO).
  • ACTB actin-beta
  • GPDH glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
  • RPLPO 60S ribosomal protein PO
  • control sample (s) according to the invention in step (iii) are preferably samples of responders and / or non-responders.
  • control sample (s) according to the invention are preferably reference collectives, ie several or a plurality of samples of responders and / or non-responders.
  • control samples the 52 patient samples as described herein in the examples are used.
  • the relative expression strength of the at least one mRNA biomarker and the presence or absence of expression of HLA-DRB4 preferably results from the comparison with control sample (s) of responders and / or non-responders.
  • FC Frexacity
  • a regulation factor (FC, "Fold Orange) or an amount of the regulation factor of at least 1.5 (or>
  • the at least 70% of the individual samples / patients are preferably 60 to 100%, more preferably 70 to 100% or 70 to 90%.
  • each sample or control sample is compared with the other individual samples / control samples.
  • pairwise individual comparisons are made with all control samples (i.e., samples from known responders and / or non-responders) to classify into responders and non-responders.
  • the patients are classified as responders if in step (iii) in 60-100% (preferably at least 70%) of the pairwise comparisons the relative expression level has a value of>
  • FC is achieved at 100% of the detected mRNA biomarker.
  • the patients are classified as non-responders if in step (iii) in 60-100% (preferably at least 70%) of the pairwise comparisons the relative expression level with a reciprocal FC value of>
  • the treatment with methotrexate comprises the combination with biologics such.
  • Anti-TNF antibodies as described above
  • MTX methotrexate
  • the prediction of the treatment and / or the classification of the patients before the start of treatment with MTX metalhotrexate.
  • the sample (s) are preselected in HLA-DRB4-positive or HLA-DRB4-negative sample (s).
  • the sample is subjected to a pretreatment.
  • Such pretreatment may include:
  • Label with label e.g. Biotin.
  • detecting in step (ii) comprises determining the presence of mRNA markers and their level of expression.
  • the determination is preferably carried out by means of
  • Sequence-based methods such as serial analysis of gene expression (SAGE) (such as SuperSAGE), real-time quantitative PCR (qPCR) (such as RT-qPCR), bead technology, blot, RNA or next-generation sequencing (such as IonTorrent)
  • SAGE serial analysis of gene expression
  • qPCR real-time quantitative PCR
  • blot blot
  • RNA or next-generation sequencing such as IonTorrent
  • Hybridization-based methods such as in situ hybridization, Northern blot, DNA micro and macroarrays,
  • At least one mRNA biomarker is selected in step (ii)
  • At least one mRNA biomarker is selected from CKAP4, CRISP3, KIAA0564, LCN2, OLFM4, MMP8, or SLC8A1 / BF223010 from:
  • inflammatory, chronic inflammatory diseases, autoimmune diseases and / or tumor diseases are preferably treated.
  • the inflammatory, chronic inflammatory diseases and autoimmune diseases are preferably selected from:
  • Rheumatoid arthritis or primarily chronic polyarthritis, juvenile idiopathic arthritis, systemic lupus erythematosus (SLE), systemic sclerosis (scleroderma), polymyositis, dermatomyositis, inclusion-body myositis, psoriasis, multiple sclerosis, uveitis, Crohn's disease, Churg-Strauss disease Syndrome (CSS), Boeck's disease, ankylosing spondylitis, recurrent polychondritis, ulcerative colitis, polymyalgia rheumatica, giant cell arteritis, vasculitis.
  • the tumor diseases are preferably selected from:
  • Acute lymphoblastic leukemia (ICinder and adults), bladder urothelial carcinoma, breast cancer, medulloblastoma, ependymoma (children and adults), non-Hodgkin's lymphoma (NHL) (children and adults), osteosarcoma (children and adults).
  • ALL Acute lymphoblastic leukemia
  • bladder urothelial carcinoma breast cancer
  • medulloblastoma ependymoma
  • NHL non-Hodgkin's lymphoma
  • osteosarcoma children and adults.
  • at least 50% of the biomarker genes are determined in combination with HLA-DRB4.
  • 50% of the biomarker genes are 16 of the 32 biomarker genes.
  • only the biomarker genes of the HLA-DRB4 positive patient group are determined, in some embodiments only the biomarker genes of the HLA-DRB4 negative patient group are determined, in some embodiments, the biomarker genes of both groups, the HLA DRB4-positive and HLA-DRB4-negative patient group determined (in each case in combination with HLA-DRB4).
  • the sample according to the invention is preferably a patient sample, which is more preferably selected from whole blood, peripheral blood leukocytes or from purified blood cells.
  • kits for predicting the treatment with MTX metalhotrexate
  • MTX metalhotrexate
  • a kit according to the invention comprises:
  • Control sample (s) comprising sample (s) of respondera and / or non-responders.
  • Suitable reference standard (s) and control sample (s) are as described above.
  • the means (a) for carrying out for detecting at least one mRNA biomarker (s) are selected from
  • At least one mRNA biomarker is selected from CKAP4, CRISP3, KIAA0564, LCN2, OLFM4, MMP8, or SLC8A1 / BF223010 from:
  • the means (a) for carrying out for detecting at least one mRNA biomarker (s) in patient samples preferably comprise:
  • the object is further achieved according to the invention by the use of at least one miRNA which is selected from the following 6 miRNAs:
  • the patients are preferably classified into responders or non-responders.
  • methotrexate is the drug of choice in rheumatoid arthritis and is used in approximately 98% of patients immediately after initial diagnosis.
  • MTX is also used in other autoimmune diseases and is also a common drug for chemotherapy in various cancers (see Abolmaali et al, 2013 and http://www.cancerresearchuk.org/cancer- help / about-cancer / treatment / cancer -drugs / methotrexate or
  • treatment with methotrexate includes combination with biologics and MTX.
  • adalimumab Humira®
  • certolizumab certolizumab
  • golimumab Simponi®
  • infliximab Remicade®
  • Rituximab (Rituxan®), Abatacept (Orencia®), Tocilizumab (Actemra® or RoActemra®)
  • the prediction of the treatment and / or the classification of the patients before the start of treatment with MTX metalhotrexate.
  • the samples are preselected in HLA-DRB4-positive or HLA-DRB4-negative samples.
  • inflammatory, chronic inflammatory diseases, autoimmune diseases and / or tumor diseases are preferably treated.
  • the inflammatory, chronic inflammatory diseases and autoimmune diseases are preferably selected from:
  • Rheumatoid arthritis or primarily chronic polyarthritis, juvenile idiopathic arthritis, systemic lupus erythematosus (SLE), systemic sclerosis (scleroderma), polymyositis, dermatomyositis, inclusion-body myositis, psoriasis, multiple sclerosis, uveitis, Crohn's disease, Churg-Strauss disease Syndrome (CSS), Boeck's disease, ankylosing spondylitis, recurrent polychondritis, ulcerative colitis, polymyalgia rheumatica, giant cell arteritis, vasculitis.
  • the tumor diseases are preferably selected from:
  • ALL Acute lymphoblastic leukemia (ALL) (children and adults), bladder urothelial carcinoma, breast cancer, medulloblastoma, ependymoma (children and adults), non-Hodgkin's lymphoma (NHL) (children and adults), osteosarcoma (children and adults).
  • ALL Acute lymphoblastic leukemia
  • bladder urothelial carcinoma breast cancer
  • medulloblastoma medulloblastoma
  • ependymoma children and adults
  • NHL non-Hodgkin's lymphoma
  • osteosarcoma children and adults.
  • the use according to the invention preferably comprises the determination of the presence of the miRNA marker (s) in a sample.
  • the presence of the miRNA marker / biomarker is preferably determined by means of:
  • Sequence-based methods such as serial analysis of gene expression (SAGE) (such as SuperSAGE), real-time quantitative PCR (qPCR) (such as RT-qPCR), bead technology, blot, RNA or next-generation sequencing (eg IonTorrent)
  • SAGE serial analysis of gene expression
  • qPCR real-time quantitative PCR
  • blot blot
  • RNA or next-generation sequencing eg IonTorrent
  • Hybridization-based methods such as in situ hybridization, Northern blot, DNA micro and macroarrays,
  • Microarray analysis, quantitative PCR and / or bead-based methods are preferably used for the determination of miRNAs.
  • the sample according to the invention is preferably a patient sample, which is more preferably selected from whole blood, peripheral blood leukocytes or from purified blood cells.
  • the object is further according to the invention by methods for the prediction of
  • the method according to the invention comprises the steps:
  • detecting in step (ii) comprises determining the presence of the miRNA markers.
  • the patients are classified into responders or non-responders.
  • the patients are classified as responders if the expression among themselves to the non-responder with a FC value of at least
  • and within the comparison with the non-responder a significance of p ⁇ 0.05 occurs.
  • the patients are classified as non-responders if the expression among themselves to the non-responder with a FC value of at least
  • and within the comparison with the responder a significance of p ⁇ 0.05 occurs.
  • the treatment with methotrexate (MTX) comprises the combination with biologics such. Anti-TNF antibodies (as described above), and MTX.
  • the prediction of the treatment and / or the classification of the patients before the start of treatment with MTX metalhotrexate.
  • the sample is subjected to a pretreatment.
  • Such pretreatment may include:
  • Labeling with indirect labels e.g. Biotin, streptavidin, and / or
  • detecting in step (ii) comprises determining the presence of the miRNA markers.
  • the determination is preferably carried out by means of
  • Sequence-based methods such as serial analysis of gene expression (SAGE) (such as SuperSAGE), real-time quantitative PCR (qPCR) (such as RT-qPCR), bead technology, blot, RNA or next-generation sequencing (eg Ion Torrent),
  • SAGE serial analysis of gene expression
  • qPCR real-time quantitative PCR
  • blot blot
  • RNA or next-generation sequencing eg Ion Torrent
  • Hybridization-based methods such as in situ hybridization, Northern blot, DNA micro and macroarrays,
  • Microarray analysis and / or quantitative PCR are preferably used for the determination of miRNAs.
  • inflammatory, chronic inflammatory diseases, autoimmune diseases and / or tumor diseases are preferably treated.
  • the inflammatory, chronic inflammatory diseases and autoimmune diseases are preferably selected from:
  • RA Rheumatoid arthritis
  • SLE systemic lupus erythematosus
  • Scleroderma systemic sclerosis
  • polymyositis dermatomyositis
  • inclusion-body myositis psoriasis
  • psoriasis multiple sclerosis
  • uveitis Crohn's disease
  • Boeck's disease ankylosing spondylitis, recurrent polychondritis, ulcerative colitis, polymyalgia rheumatica, giant cell arteritis, vasculitis.
  • the tumor diseases are preferably selected from:
  • ALL Acute lymphoblastic leukemia (ALL) (children and adults), bladder urothelial carcinoma, breast cancer, medulloblastoma, ependymoma (children and adults), non-Hodgkin's lymphoma (NHL) (children and adults), osteosarcoma (children and adults).
  • ALL Acute lymphoblastic leukemia
  • bladder urothelial carcinoma breast cancer
  • medulloblastoma medulloblastoma
  • ependymoma children and adults
  • NHL non-Hodgkin's lymphoma
  • osteosarcoma children and adults.
  • the sample according to the invention is preferably a patient sample, which is more preferably selected from whole blood, peripheral blood leukocytes or from purified blood cells.
  • the reference standard / the control sample in step (iv) is preferably a reference standard consisting of household gene (s),
  • Embodiment Rheumatoid Arthritis (RA)
  • RA is usually treated immediately after diagnosis by a rheumatologist with disease-modifying anti-rheumatic drugs (DMARDs).
  • DMARDs disease-modifying anti-rheumatic drugs
  • This category also includes the conventionally used MTX, which is> 95% DMARD of choice.
  • the therapeutic success is not yet predictable and so far exists with the detectable joint destruction.
  • MTX is also used to treat other rheumatic diseases, other autoimmune diseases and the treatment of cancer.
  • the RA patient shows individual success after 3-6 weeks from the start of treatment, but only proves this after assessing the clinical parameters for determining the DAS28 change. An assessment of the response rate is certainly guaranteed only after 12-14 weeks (Quinn et al., 2005) and only reaches the maximum after about 6 months.
  • this is expressed by the preselection of HLA-DRB4 subgroups in combination with the 16 specific candidate genes for the evaluation of responders and non-responders.
  • Total genomic transcriptional analyzes are new technologies that, on the one hand, allow rapid, adapted adaptation to other molecular technologies, and have a very high priority for individualized medicine.
  • microfluidic based techniques can / will help relieve the health care system of annually increasing costs
  • these methods using whole blood as a starting material routinely accepted in the clinical trials, are well suited to providing rapid and differentiated results and to provide the physician with an effective choice of treatment for the individual patient as early as possible, with the aim of avoiding side effects (>5%;).
  • the inventors have now succeeded in developing a predictive test to estimate the future response to MTX therapy using the following predictive biomarker genes in combination with HLA-DRB4:
  • DEF4A Defensin alpha 4 (DEFA4, alias: cortico statin), which is expressed more strongly in MTX responders in the I ILADR B4 negative subgroup, has a multitude of biological functions.
  • DEF4A is described as acting for peptides with microbial and cytotoxic antiviral function for pathogen defense (Spitznagel, 1990, Wu et al., 2005).
  • DEF4A inhibits corticotropin-stimulated corticosterone production (Genz et al., 1990).
  • DEF3A has been reported by, among others, Cheok et al. (2003) as a marker contributing to the discrimination of drug responses. These findings were obtained from human leukemia cell lines in vitro.
  • the prediction marker Complement Factor-D (CFD, alias: adipsin), which is up-regulated in respondents of the HLA-DRB4 negative subgroup, functionally belongs to the trypsin family of peptidases. CFD is a component of the alternative complement pathway and is also involved in the humoral response to ward off infectious agents (Jouvin et al, 1983).
  • Transcobalamin-1 (TCN1) encodes a vitamin B12 binding protein and transfers cobalamin into the cell. Diseases that have been reported in the literature in connection with this gene are Pernicious anemia, pemicious anemia, and oral tumors. Interestingly, at the genetic level, polymorphisms within the TCN family have been described that influence MTX metabolism (Linnebank et al., 2005). Parallels between genetic and genomic findings are not yet known.
  • RNASE2 Ribonuclease-2 belongs to the ribonuclease type A family, has ribonuclease activity and binds nucleic acids. Further specified, RNASE2 is a pyrimidine-specific nuclease with also low binding affinity for uridine, cytotoxin and helminthotoxin. Another biological role of RNASE2 is in immune overreaction and in anti-parasitic defense (Yang et al., 2003; Yang et al., 2004). RNASE2 is also chemotactic for dendritic cells and is an endogenous ligand for Toll-like receptor-2 (Rosenberg 2008).
  • Transketolase-like I (TKTLI) is functionally involved in the pentose phosphate pathway and has been described to regulate the effects of MTX (Lee et al., 2008). In our own investigations, the predictive marker TKT, but not TKTL1, could be identified, which is described in the rat tumor model as an MTX predictor (Yamashita et al., 1999).
  • Peptidylglycine alpha-amidating monooxygenase (PAM), a coded enzyme capable of binding divalent copper and calcium ions, is involved in a variety of different biological functions (Prigge et al., 2000). An indirect or direct link to MTX interaction with efficacy effects is not known to date.
  • the potassium channel CNE3 belongs to the Isk family. The biological function of potassium channels is manifold. It is known that in gene model member 4 (KCNE4) in the rat model, Lee et al. (2008) show that MTX has an influence on its expression strength. 9.
  • KCNE4 gene model member 4
  • MTX has an influence on its expression strength.
  • SAG9 Sperm associated antigen-9
  • the encoded protein of SPAG9 mRNA has scaffold protein properties and structurally assembles with mitogen-activated protein kinases, thus contributing to c-Jun terminal kinase mediated sinaltransduction. SPAG9 binds to kinesin-1 and plays a role in tumor growth and development. To date, there are no connections to MTX.
  • Mitochondrial precursor Peroxiredoxin-5 (PRDX5) interacts with the peroxisome receptor 1 and has antioxidant protective functions in the normal and inflammatory tissues (Yamashita et al., 1999). Again, so far no connection with MTX is known.
  • the aquaporin-3 (AQP3) mRNA is down-regulated and encodes a protein-associated protein (Ishibashi et al., 1995), such as the
  • Wntless Wnt ligand secretion mediator has so far been largely functionally unknown. Involvement of the protein is discussed in NFkB and MAP kinase pathway (Matsuda et al., 2003). A direct and indirect connection to MTX is not known for either AQP3 or WLS.
  • the encoded GATA-binding protein-3 (GA A3) carries two GATA-type-specific zinc fingers, and is involved in the regulation of T cells in the so-called 'innate lymphoid group 3' cell development (Yagi et al. 2011, Serafini et al, 2014) and endothelial cell maturation (Umetani et al., 2001). GATA3 has been ascribed an immunosuppressive and anti-inflammatory effect (Li et al., 2013).
  • GATA3 has been described in vitro as a predictor of cytorabine hydrochloride (Ara-C), dexamethasone, methylprednisolone, mitoxantrone and rituximab treatment in tumor cell lines (US 2009/0023149 AI). It has also been described that GATA3 is a predictor of taxane insensitivity (Tominaga et al., 2012). The mRNA of GATA3 is upregulated in rat liver tumor tissue and in human breast cancer cell tissue by treatment with MTX (Belisnky et al, 2007, Gulbahce et al, 2013). However, a prediction of the efficacy of MTX does not follow from these findings. 14.
  • Eukaryotic translation initiation factor 5A encodes an mRNA-binding protein involved in translation elongation. It is also known that EIF5A plays a role in methionine metabolism and in hyposine biosynthesis (Scuoppo et al., 2012). Overexpression of EBF5A mR A in colorectal tumor tissue samples correlates with tumor severity in patients with colorectal cancer disease. EIF5A has therefore been proposed as a prognostic marker for the success of MTX-treated patients with colorectal cancer (Tunca et al., 2013, and Council Genome Database, Bioinformatics Research Center, Medical College of Wisconsin, National Heart Lung and Blood Institute (NHLBI)). ,
  • the mRNA for 'Solute carrier family' member E2_i (SLC35E2) is a new member of the 'Solute Carrier Family' and contributes to the sugar transport nucleotide.
  • the model system has shown that this transporter is involved in tumor metastasis, cellular immunity, organogenesis, and morphogenesis and in the development of connective tissue and muscle (Ishida & Kawakita 2004).
  • SLC35, as well as the other members of this gene family have transporter functionalities, including drugs, via nucleotide sugar, and are localized in the Golgi apparatus and in the endoplasmic reticulum (Nishimura et al., 2009).
  • Pathologically in animal studies of the deficiency of this gene increased tumor metastasis, as well as a disturbance of immunity, organogenesis and morphogenesis (Ishida & Kawakita 2004).
  • the upregulated mRNA of the small nucleolar RNA host gene 5 gene (SNHG5, alias: U50HG) is involved in ribosome biogenesis (Tanaka et al., 2000).
  • SNHG5 has been described as a biomarker in B-cell lymphoma, breast and prostate tumors (Dong et al., 2009, Nakamura et al, 2008, Dong et al., 2008) and is being amplified there expressed.
  • the irradiation of tumor cells leads to a counterregulation with a reduction of the mRNA expression of SNHG5 (Chaudry 2013).
  • KIAA1324 is still a functionally unknown gene. ⁇ 1 ⁇ 1324 is overexpressed in intestinal tumor cells and has been described as a diagnostic marker in epithelial intestinal tumors (US 2008/0064049 AI).
  • SIAH1 E3-ubiquitin protein ligase-1
  • the gene for E3-ubiquitin protein ligase-1 encodes a protein from the, seven in absentia homologous family (Hu et al., 1997, Nakayama et al., 2004).
  • SIAH1 plays a major role in the development of various Parkinson's diseases (Franck et al., 2006).
  • SIAH5 is regulated in conjunction with high-density lipoproteins after hypoxia and apoptosis induction via the Jun kinase pathway (Nakayama et al., 2004).
  • Cystatin-3 (CST3, alias: cystatin-C) encodes a protein that contains multiple cystatin-like sequence regions (Türk et al., 2008). CST3 is more extensively expressed in atherosclerosis (Arpegard et al, 2008), but also in diseases of the rheumatic type (Hansen et al., 2000). Hayashi et al. (2010) was able to show that an elevated serum level of Cys-C is an indicator of MTX-induced myelotoxicity in patients with RA. As with the findings of the inventors on mRNA level, especially the MTX responders, CST3 is also upregulated at the protein level of RA patients before treatment with MTX. From this it can be concluded that with MTX treatment increased myelotoxicity is to be expected also in the responders.
  • Sulfatase-2 is a heparan sulfate 6-O-endosulfatase.
  • SULF2 modulates hepatan sulfate binding by altering binding sites on cell-signaling receptors (Dai et al., 2005). Elevated expression levels of SULF1 and SULF2 are described for both tumor tissue (Wigersma et al., 1991, Nawroth et al, 2007) and inflammatory diseases such as osteoarthritis (Otsuki et al., 2008) or RA in synovial tissue (Kar et al., 1976). 5.
  • KIAA0564 (alias: Von Willebrand Factor A d omain containing 8) is functionally unknown. However, the term and other evidence suggests that von Willebrand Factor A domain containing 8 / KIAA0564 is a protein with cell adhesion properties (Reininger et al., 2006). GO annotations show that this protein has ATPase activity and ATP binding. KIAA0564 has been described in the context of diagnosis and prevention with a perspective for the prediction of therapies (WO 2002/008423 A2).
  • GCLM Glutamate-Cysteine Liquefacial Modifie
  • GCLM is important in erythrocyte survival (Foller et al., 2013) and is up-regulated in hemolytic anemia.
  • GCLM is downregulated in the MTX responders compared to the nonresponders of the HLA-DRB4 positive subgroup.
  • C AP4 The cytoskeleton-associated protein 4 (C AP4) is a transmembrane protein and is expressed in the endoplasmic reticulum. Increased expression of C AP4 has been observed in metastatic lymphoid tissue (Li et al., 2013). Functionally, CKAP4 regulates the plasminogen activating system of blood vessels (Razzaq et al., 2003). In addition, susceptibility to MTX has been reported for CKAP4 (Prigge et al., 2000) and CKAP4 has been described as a predictor of MTX in tumor disease (US 8,445,198 B2, US 2008/0292546 AI).
  • the oxysterol binding protein-like LA (OSBPL1A) is co-localized with the GTPases Rab7, Rab9 and the lysosome-associated membrane protein- ⁇ and binds phosphoinositides to endosomes and lysosomes (Johansson et al., 2005). A connection to MTX was not described.
  • the expressed gene 'Solute carrier family 8A member V acts as a sodium / calcium exchanger (Khananshvili, 2013) and GO annotations indicate that it is a cytoskeletal protein with calmodulin-binding function.
  • the transcriptional regulator (miRNA) of SLC8A1 but not SLC8A1 itself has been described as a predictor of MTX treatment in inflammatory bowel disease (WO 2009/120877 A2; WO 2011/014721 A2).
  • MTX a transcriptional regulator
  • SLC35E2 see also the Rat Genome Database, Bioinformatics Research Center, Medical College of Wisconsin, National Heart Lung and Blood Institute (NHLBI).
  • SLC8A1 has been described as a diagnostic marker for autoimmune diseases such as Systemic Lupus Erythematosus (SLE) and ANCA positive Wegener Granulomatosus (WO 2006/020899 A2).
  • the biomarker LOC654433 is a long non-coding RNA with previously unknown function.
  • Arginase 1 is a type I specific arginase that catalyzes the hydrolysis of arginine to ornithine with the elimination of urea (Ivanenkov et al., 2014).
  • Monocytes / macrophages are the major cell population expressing arginases (Murphy et al., 1998).
  • Huang et al. (2001) reported that arginase activity was significantly associated with Arginase protein expression in patients with RA.
  • Gene expression of ARG1 is enhanced in the HLA-DRB4 positive subgroup in the MTX responders. Shen et al. (2013) showed a correlation of the expression of ARG1 and the folate receptor-ß on positive Ml-type macrophages, which also express the mannose receptor. There is no direct correlation between gene expression of ARG1 and MTX.
  • Lipocalin 2 (LCN2) is expressed on neutrophils and is associated with the proteolytic enzyme gelatinase (Kjeldsen et al., 2000).
  • LCN2 is an iron trafficking protein involved in multiple processes, such as innate immunity (Zughaier et al., 2013, Landro et al., 2008), renal development, and cell migration (Paulsson et al., 2007). Bläser et al. (1995) reported that Lipocalin 2 is detectable in high amounts in the synovial fluid of patients with RA. In responders of the HLA-DRB4 positive subgroup, the mRNA encoding this enzyme is reduced.
  • CRISP3 The biomarker 'Cysteine Rich Secretory Protein' (CRISP3) has so far no biological function described.
  • a paralogue of CRISP3 is the C-type lectin domain family 18, member B (CLEC18B), which - according to GO annotation - has the ability to bind carbohydrates as a 'mannose receptor-like protein'.
  • CRISP3 interacts with 17beta-estradiol (Pfisterer et al., 1996).
  • Gene expression of CRISP3 is expressed more extensively in DHEA-stimulated human submandibular gland cells (Laine et al., 2007).
  • Gene expression of CRISP3 has been described in the context of the disease Sjögren 's syndrome (Tapinos et al., 2002).
  • CRISP3 has been described as a predictor of the treatment of prostate cancer cells (WO 2013/070088 AI).
  • Lactotransfenin (LTF, alias: lactoferrin) is a member of the transferrin gene family and is essentially expressed by neutrophils.
  • the LTF protein has heparin binding activity and has a broad functional spectrum. This includes u.a. an anti-inflammatory activity (Paulsen et al., 2002), regulation of cell growth and differentiation (Liao et al., 2012) and protection in the development of tumors (Kanwar et al., 2013).
  • LTF acts as a so-called survival factor for neutrophils in the synovial fluid (Wong et al., 2009).
  • MTX reduces expression of LTF mRNA (Oshida et al., 2011).
  • LTF has been described as a predictive gene for the treatment of ethanecept, an anti-TNF biologic, among other 43 genes.
  • the studies do not refer to the baseline gene expression before therapy alone, but were dependent on a second examination a few days after the start of therapy and therefore have no predictive, but rather a prognostic value.
  • the protein-coding Olfactomedin 4 (OLFM4) mRNA assigned to the Noelin gene family is increasingly expressed during myeloid cell development and has been described for the first time in myeloblasts (Zhang et al., 2002).
  • the protein OLFM4 is expressed in the endoplasmic reticulum, has an anti-apoptotic function and among other things promotes tumor growth (Park et al., 2012).
  • OLFM4 prevents cell growth of prostate tumor cells and has a suppressive effect on bone metastatase via the negative interaction with cathepsin D and the chemokine (CXC Motif) ligand 12 (alias: SDF-1, Berger 1988).
  • OLFM4 In systemic lupus erythematosus and inflammatory bowel disease, OLFM4 has been described as a diagnostic and prognostic marker in conjunction with other other markers (US 8,148,067 B2, US 8,148,067 B2). To date, there is no knowledge about the role and expression of OLFM4 in RA. However, in inflammatory bowel disease, OLFM4 has been described as a diagnostic biomarker and regulates autophagic processes via cathepsin-D involvement in the immune response to bacterial infections (Montero-Melendez et al., 2013). 16.
  • MMP8 matrix metalloproteinase-8
  • HLA-DRB4 positive RA subgroup The matrix metalloproteinase-8 (MMP8), the penultimate biomarker for the MTX prediction of the HLA-DRB4 positive RA subgroup, is capable of degrading type II collagen (Billinghurst et al., 1997). A connection to MTX does not exist so far
  • Figure 2 Hierarchical cluster analysis of HLA-DRB4 positive and HLA-DRB4 negative patient subgroups between responders and non-responders.
  • FIG. 1 Hierarchical cluster analysis of HLA-DRB4 positive and HLA-DRB4 negative patients Subgroups between responders and non-responders, including the moderate responder group.
  • HLA-DRB4 positive and HLA-DRB4 negative RA patient subpopulations Considering the classification into HLA-DRB4 positive and HLA-DRB4 negative RA patient subpopulations, according to the described conditions (HLA-DRB4 cut-off values, the given fold change value and the increased / decreased reference values) within the pairwise comparisons between responders and non-responders, hierarchical cluster analyzes were performed involving the moderate responders. Genesis cluster analysis was performed by log transformation followed by Pearson analysis. Again, the HLA-DRB4 negative RA patient subgroup showed a clear separation between the responders and the non-responders with a specificity and sensitivity of 100%. In the HLA-DRB4 positive RA patient subgroup, a sensitivity of 100% and a specificity of 92.9% (without consideration of the moderate responders) and 95.7% (with the moderate responders who were rated as responders) were achieved.
  • FIG. 4 Validation of Affymetrix gene selection via quantitative real-time PCR. Exemplary results of the validations, for the prediction of therapy response to MTX, are presented on quantitative real-time qPCR with triplicate evaluations (A) HLADRB4; (B) RNASE2; (C) MMP8.
  • the representation of the y-axis represents the gene expression of the individual candidate genes in relation to the applied household gene 'Ribosomal Protein Large PO' (RPLPO).
  • RPLPO Ribosomal Protein Large PO'
  • the presentation was made using a box plot method using the software SPSS.
  • the bars represent the mean, and the bars show the standard deviation within the comparisons between the MTX Responders (R), the Moderate Responders (MR) and the Non-Responders (NR).
  • the points indicate absolute deviations that are not within the defined range.
  • Figure 5 Validation of affymetrix gene selection via quantitative real-time PCR. Presented are results of the validations, for the prediction of therapy response on MTX, on quantitative real-time qPCR with triplicate evaluations.
  • the representation of the y-axis represents the gene expression of the individual candidate genes in relation to the applied household gene 'Ribosomal Protein Large PO' (RPLPO).
  • RPLPO Ribosomal Protein Large PO'
  • the presentation was made using a box plot method using the software SPSS.
  • the bars represent the median value and the bars show the standard deviation within the comparisons between the MTX Responders (R), the Moderate Respondem (MR), and the Non-Responders (NR).
  • the points indicate absolute deviations that are not within the defined range.
  • Figure 6 Validation of affymetrix gene selection via quantitative real-time PCR. Presented are results of the validations, for the prediction of therapy response on MTX, on quantitative real-time qPCR with triplicate evaluations.
  • the representation of the y-axis represents the gene expression of the individual candidate genes in relation to the applied household gene 'Ribosomal Protein Large PO' (RPLPO).
  • RPLPO Ribosomal Protein Large PO'
  • the presentation was made using a box plot method using the software SPSS.
  • the bars represent the median value and the bars show the standard deviation within the comparisons between the MTX responders (R), the moderate responders (MR) and the non-responders (NR).
  • the points indicate absolute deviations that are not within the defined range.
  • the stored and frozen PAXgene blood tubes were thawed according to the manufacturer's instructions for two hours at room temperature and the RNA using the PAXgene Blood miRNA ® Kit (PreAnalytiX) were prepared. This kit allows for both mRNA and miRNA transcriptional analysis. The amount of the purified total RNA was performed in the NanoDrop 1000 ® UV Vis Spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific Inc., NanoDrop, Wilmington, DE, USA) and the quality check on the Bioanalyzer 2100 ® (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA ).
  • globin mRNA was reduced using the GLOBINclear TM kit (Life Technologies, Ambion, USA) according to the manufacturer's instructions. This was followed by synthesis of the complementary DNA (cDNA) and transcription in vitro transcription into cRNA via the Affymetrix GeneChip® 3'IVT Express kit (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA). The amplified and biotin-labeled cRNA was then used according to the manufacturer's instructions on the GeneChip® Human Genome U133 Plus 2.0 arrays hybridized for 16 hours at 45 ° C. The washes and labeling were done in a GeneChip® Fluidics Station 450 GeneChip® using Affymetrix hybridization, washing and labeling kit. Hybridization signal readout was performed in an Affymetrix GeneChip® 3000 7G scanner, followed by normalization using the Affymetrix MAS5.0 algorithm of the Expression Console software.
  • the differential mRNA gene expression was evaluated via the BioRetis Online database (BioRetis GmbH, Berlin). This was done by pre-filtering the data according to the criteria> 70% in all group comparisons (eg R versus NR) and a fold change of> 1.5 or ⁇ -1.5.
  • the limit of signal strength, within the pairwise group comparisons (responder versus non-responder); without and with the moderate responders) was set to at least> 50 in one of the two comparison groups.
  • the data was visualized using the hierarchical clustering software Genesis 1.7.6 (Gene Expression Similarity Investigation Suite, University of Graz, Austria; Sturn et al., 2002) on log transformation and Pearson analysis. Signals, clinical data, and mutually both were determined via 1- and 2-tailed Wilcoxon Rank test using the IBM Software SPSS Statistics v.22 (Stacon, Witzenhausen, Germany).
  • qPCR quantitative real-time PCR
  • VAS Visual Analog Squares
  • HAQ Health Assessment Questionnaire
  • the following criteria were set via the database query in BioRetis (online database of BioRetis GmbH, Berlin): minimal change call with a match of> 30% increase / decrease within the group comparisons (R vs. NR) and a fold change (FC) from>
  • Amount).
  • the Analysis yielded a candidate gene of 14 genes.
  • the selection criteria of the query to identify the two HLA-DRB4 subgroup-specific genes between the group of responders and the nonresponders were at least 70% matches (increase / decrease, see Tables 2 and 3) within the pairwise single comparisons (R vs. NR) and an average fold factor (FC) of>
  • the sensitivity was 100% and the specificity 93%.
  • the moderate responders (n 4) within the non-responder group and all MTX responders clustered separately in a distinctly remote group.
  • the sensitivity was as well as the specificity at 100% each ( Figure 3A and 3B).
  • HLA-DRB4 negative subgroup and HLA-DRB4 gene sets were validated via the quantitative RT-qPCR and provided a relatively clear agreement of regulation within the respective groups (responders and non-responders). See Figure 4 with exemplary results of the validation.
  • the amount of the purified total RNA was performed in the NanoDrop 1000 ® UV Vis Spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific Inc., NanoDrop, Wilmington, DE, USA) and the quality check on the Bioanalyzer 2100 ® (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA ).
  • Affymetrix-based differential expression analysis of 30 of the 32 defined biomarkers was assessed by an independent method using quantitative real-time PCR (qPCR).
  • qPCR quantitative real-time PCR
  • 2 primer assay Qiagen; Hilden, Germany
  • Power SYBR ® Green PCR Master Mix for two of the defined biomarkers, no commercial RT 2 primer assays were available at the time of the experiment.
  • the evaluation was carried out by normalizing the gene expression of the individual candidate genes in relation to the applied household gene 'Ribosomal Protein Large PO' (RPLPO).
  • QPCR runs were in a StepOne Plus ® real-time cycler (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) down.
  • Amplification efficiencies and efficiency-corrected delta-delta-Ct (A ⁇ Ct) values were calculated according to Fleige et al., 2006.
  • the gene sets of the FILA-DRB4 negative subgroup and the HLA-DRB4 positive subgroup were validated by quantitative RT-qPCR and provided a relatively clear agreement of regulation within the respective groups (responders and non-responders).
  • CRISP3, LCN2, MMP8, OLFM4 resulted in an average regulation factor
  • of> 3 signal; p value qPCR ⁇ 0.1; Correlation to the microarray data at least> 0.5.
  • miRNA expression profiles of n 39 patients, the two previously mentioned clinical studies, were determined.
  • the purified total RNA was processed with the Affymetrix Flash-Taq TM Biotin HSR RNA Labeling Kit (Genisphere, Hatfield, PA, USA).
  • the hybridization of the labeled samples was carried out for 16 hours at 45 ° C with miRNA 2.0 microarrays according to the manufacturer's instructions in the GeneChip® Fluidics Station 450.
  • the hybridization signals were read in the Affymetrix GeneChip® 3000 7G scanner and the normalization of the data with the post
  • the samples were washed with the miRNA QCTool software version 1.1.1.0 (Affymetrix).
  • n 7 miRNA biomarkers could be identified.
  • NCX sodium-calcium exchangers
  • CRISP-3 a protein with homology to plant defense proteins, is expressed in mouse B cells under the control of Oct2. Molecular and cellular biology 16, 6160-6168.
  • Lactoferrin is a survival factor for neutrophils in rheumatoid synovial fluid. Rheumatology 48, 39-44.
  • Table 1 Clinical and laboratory diagnostic data of RA patients before and during treatment with MTX.
  • ACPA anti-citrullinated protein antibody
  • ANA Antinuclear antibodies
  • CRP C-reactive protein
  • transcript variant 1 transcript variant 1
  • NM_001130527.2 Variant 2
  • HLA-DRB4 positive RA subgroup HLA-DRB4 negative RA subgroup
  • OSBPL1A 1.4 0.24 - 8.78 0.08-29.34 0.542 0.38 0.005 0.30 0.035 1.7
  • HLA-DRB4 1.5 0.11-3.04 0.50-5.72 0.118 0.75 0.000 0.87 0.000 0.8
  • RNASE2 -1.3 0.36 - 1.35 0.22 - 2.17 0.141 0.59 0.000 0.63 0.000 -1.8
  • affymetrix-based differential expression results of 30 of the 32 defined biomarkers was performed by an independent method using quantitative real-time PCR.
  • RPLPO served as reference gene.
  • the table contains the gene expression differences of the RT-qPCR expressed as FC, the standard error expressed as hr error, the confidence intervals expressed as C.I. and the

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Abstract

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf prädiktive mRNA Biomarker, die in Kombination mit HLA-DRB4 zur Vorhersage der Behandlung mit MTX (Methotrexat) verwendet werden. Die vorliegende Erfindung bezieht sich weiterhin auf ein Verfahren zur Vorhersage der Behandlung mit MTX (Methotrexat), umfassend die Detektion der prädiktiven mRNA Biomarker in Kombination mit HLA-DRB4 in Patientenproben, wobei die Patienten in Responder oder Non-Responder klassifiziert werden.

Description

Prädiktive mRN A Biomarker zur Vorhersage der
Behandlung mit Methotrexat (MTX)
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf prädiktive mRNA Biomarker, die in Kombination mit HLA-DRB4 zur Vorhersage der Behandlung mit MTX (Methotrexat) verwendet werden. Die vorliegende Erfindung bezieht sich weiterhin auf ein Verfahren zur Vorhersage der Behandlung mit MTX (Methotrexat), umfassend die Detektion der prädiktiven mRNA Biomarker in Kombination mit HLA-DRB4 in Patientenproben, wobei die Patienten in Responder oder Non-Responder klassifiziert werden.
Hintergrund der Erfindung
Die Rheumatoide Arthritis (RA) ist eine chronisch entzündliche Erkrankung des Bewegungsapparates. Mit fortschreitender Krankheitsdauer kommt es zu einer Zerstörung von Knorpel und Knochenstrukturen. Die RA tritt in der Gesamtbevölkerung, abhängig von der ethnischen Gruppe, zwischen 0,5 bis 3 % auf. Weltweit wird die jährliche Inzidenz zwischen 0.1 bis 0.5% angegeben. In Deutschland sind etwa 2% der Gesamtbevölkerung (1,5 Millionen) von dieser Erkrankung betroffen; und jährlich kommen ca. 100.000 neue Krankheitsfälle hinzu. Die durchschnittlichen Kosten, die durch diese Erkrankung pro Patient durchschnittlich kalkuliert werden, betragen >23.000€.
Über die Ätiologie und Pathophysiologie der RA ist jedoch bis dato nur wenig bekannt.
Der , Rheumafaktor' ist ein Laborparameter in der Diagnose zahlreicher rheumatischer Erkranlcungen, tritt aber nur bei ca. 60 % der RA Patienten auf (Meyer et al., 1999). Der heutzutage am meisten verwendete Labortest, zur Diagnose der RA, ist der anti-Citrullm (anti-CCP) Test, der eine deutlich höhere Spezifität als der RF-Test alleine aufweist. Beide Testsysteme haben eine sehr gute Korrelation (van Gaalen et al., 2004; Umeda et al., 2013). Zum anderen wurden Korrelationen mit humanen Leukozyten-Antigenen (Heidt et al., 2003) gezeigt, die ein erhöhtes Risiko indizieren, an RA zu erkranken. Diese Krankheitsassoziationen konnten auf genetischer Ebene insbesondere für das HLA- DRB 1 in Zusammenhang mit dem sogenannten ,shared Epitop' (O'Dell et al, 1998), oder auch der Expression des HLA-DRB1 Moleküls in Verbindung mit bestimmten Nukleotidaustauschen innerhalb der Lymphotoxin-alpha/TNF-alpha Region bei Patienten mit früher RA gefestigt werden (Criswell et al., 2004). Das Vorhandensein des HLA-DRB1 Oberflächenantigens mit dem erhöhten Risiko an einer RA zu erkranken, tritt allerdings nur zu ca. 40 % auf und ist nach bisherigem Kenntnisstand alleine betrachtet weder für die Erkrankung selbst, noch für eine Vorhersage von Therapie indikativ. Anderson et al. (2000) beschrieben den Zusammenhang einer verminderten Therapieantwort bei Patienten mit längerer Krankheitsdauer und Haberauer und Peichl (1989) konnten auf genetischer Ebene eine Korrelation zwischen dem Vorhandensein von HLA-DRB4 mit dem Rheumafaktor zeigen. Heidt et al. (2003) berichteten bei Patienten mit früher RA über eine Korrelation zwischen gleichzeitiger Expression der HLA-DRB I *04 und HLA-DRB4 Allele mit einer erhöhten radiologischen Progression.
Methotrexat (MTX) ist bei der rheumathoiden Arthritis das Medikament der ersten Wahl und wird bei ca. 98% der Patienten sofort nach erfolgter Erstdiagnose eingesetzt. Des Weiteren kommt MTX auch bei anderen Autoimmunerkrankungen zum Einsatz und ist außerdem zur Chemotherapie bei diversen Tumorerkrankungen ein gängiges Medikament (siehe Abolmaali et al, 2013 und http://www.cancerresearchuk.org/cancer-help/about-cancer/treatment/cancer- drugs/methotrexate) .
Gerade zu Beginn der Krankheit ist es wichtig effektiv zu behandeln, um das Fortschreiten der Erkrankung aufzuhalten oder zur vollständigen Remission zu bringen. Leider ist die Behandlung mit MTX nur zu 40 bis 60 % erfolgreich und nicht selten mit Nebenwirkungen verbunden (5 bis 20 %). Nach dem ersten Jahr des geringen Therapieansprechens erfolgen heutzutage deshalb oft Kombinationstherapien mit MTX und Biologika, welche die Therapieansprechrate auf ca. 60 % bis max. 70 %, abhängig vom verwendeten Biologikum und vom individuellen Patientenstatus selbst, erhöhen. Falls massive Unverträglichkeiten beim Patienten auftreten, ist es dem behandelten Arzt erlaubt, auch schon etwas früher die Therapieanwendung zu wechseln. Die Krankheitsaktivität der rheumatoiden Arthritis wird mit den seitens der Europäischen Gesellschaft für Rheumatologie vorgegeben Krankheitsparametern (Blutsenkungsgeschwindigkeit, C-reaktives Protein, Einschätzung nach dem Visual Analogue Square (VAS), Anzahl der geschwollenen und Anzahl der schmerzhaften Gelenke) über den sogenannten ,Disease Activity Score' bestimmt und ist auf n=28 definierte Gelenke bezogen (DAS28).
In Deutschland gibt es nach epidemiologischen Abschätzungen ca. 80.000 Patienten mit RA, die in Folge der chronischen Entzündung alle behandelt werden. Behandlungskosten für die RA belaufen sich in Deutschland auf jährlich >7 Milliarden€ und weltweit auf etwa 180 Milliarden€. Um Kosten für das Gesundheitssystem und weitere Ausgaben auf sozio- ökonomischer Ebene durch ein ausbleibendes Ansprechen und durch Nebenwirkungen der Medikation so gering wie möglich zu halten, sind individualisierte Therapien notwendig. Hierzu ist es nötig über Biomarker das Therapieansprechen schon im Vorfeld zu beurteilen, um nicht nur bei der RA, sondern auch bei anderen Automnnunerl ankungen und bei der Tumortherapie notwendigerweise sanfter und ohne Nebenwirkungen gezielt zu therapieren.
Es besteht somit ein Bedarf im Stand der Technik nach prädikativen Testverfahren für die Standardmedikamente, die bei der Behandlung von rheumatischen Erkrankungen, wie RA, eingesetzt werden, wie insbesondere MTX, die zudem kostengünstig und schnell eingesetzt werden können.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, geeignete Biomarker zu identifizieren und zu definieren und geeignete Testsysteme zu entwickeln, um eine verbesserte Vorhersage der Behandlung rheumatischer und weiterer Erkrankungen zu ermöglichen.
Prädiktive mRNA Biomarker-Gene
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die Verwendung von mindestens einem Gen, das ausgewählt ist aus den folgenden 32 Genen:
ARG1, CKAP4, CRISP3, CST3, GCLM, KIAA0564, KIAA1324, LCN2, LOC654433/PAX8-AS1, LTF, OLFM4, OSBPL1A, MMP8, SIAH1, SLC8A1/BF223010, SULF2, AQP3, CFD, DEFA4, EIF5A, GATA3, Hs.674648, KCNE3, PAM, PRDX5, RNASE2, TCN1, TKT, SLC35E2, SNHG5, SPAG9, und/oder WLS
in Kombination mit HLA-DRB4
als prädiktive(r) Biomarker zur Vorhersage der Behandlung mit MTX (Methotrexat) / zur Prädiktion des Therapieansprechens auf MTX gelöst.
Bevorzugt, wird/werden das Gen/die Gene in Form seiner/ihrer mRNA verwendet. Die folgenden 16 Gene werden der„HLA-DRB4 positiven Patientengruppe" zugeordnet: ARG1 , CKAP4, CRISP3, CST3, GCLM, KIAA0564, KIAA1324, LCN2, LOC654433/PAX8-AS1, LTP, OLFM4, OSBPL1A, MMP8, SIAH1, SLC8A1/ BF223010 und SULF2.
Die Gen-Bezeichnung„LOC654433" und LOC654433/PAX8-AS1" beziehen sich auf dasselbe Gen.
Die folgenden weiteren 16 Gene werden der „HLA-DRB4 negativen Patientengruppe" zugeordnet:
AQP3, CFD, DEFA4, EIF5A, GATA3, Hs.674648, KCNE3, PAM, PRDX5, RNASE2, TCN1, TKT, SLC35E2, SNHG5, SPAG9 und WLS.
Die„HLA-DRB4-positive Patientengruppe" und die„HLA-DRB4-negative Patientengruppe" bezieht sich hierin auf Patienten, in deren Proben die HLA-DRB4 mRNA als Selektionsmarker exprimiert oder nicht exprimiert vorliegt.
Beispielsweise, liegt die HLA-DRB4 mRNA als Selektionsmarker exprimiert vor, wenn ein Grenz wert/Cut-Off- Wert erreicht bzw. überschritten wird.
Beispielsweise, liegt HLA-DRB4 mRNA nicht exprimiert vor, wenn ein Grenzwert/Cut-Off- Wert nicht erreicht wird.
Als Cut-off Wert für die FILA-Genexpression können beispielsweise Signalwerte für die HLA-DRB4 negative Patienten-Subgruppe von < 100 und von > 1000 für die HLA-DRB4 positive Subgruppe definiert werden. Siehe z.B. Tabelle 4.
Ein„prädiktiver Marker" bezieht sich auf einen Marker, der die Vorrausage des zukünftig zu erwartenden Verlaufs des Ansprechens (hier: Response und Non-Response) auf ein Medikament erlaubt. Der prädiktive Marker erlaubt die Vorhersage des Behandlungsverlaufs mit einem Medikament, wie MTX, bereits vor Behandlungsbeginn. Der prädiktive Marker erlaubt diese Vorhersage für den individuellen Patienten. Ein„prädiktiver Marker" unterscheidet sich insbesondere von einem prognostischen Marker dahingehend, dass bei einer Prognose mindestens 2 Messzeitpunkte benötigt werden, um einen Patienten als Responder oder Non-Responder einzuordnen.
Erfindungsgemäß werden die Patienten bevorzugt in Responder oder Non-Responder klassifiziert.
In der HLA-DRB4 positiven Patientengruppe werden Medium-Responder oder moderate
Responder zu den Respondern gezählt.
Dies gilt beispielsweise für das Ausführungsbeispiel der RA.
In der HLA-DRB4 negativen Patientengruppe werden Medium-Responder oder moderate
Responder zu den Non-Respondern gezählt.
Dies gilt beispielsweise für das Ausführungsbeispiel der RA.
Methotrexat (MTX) ist bei der Rheumathoiden Arthritis das Medikament der ersten Wahl und wird bei ca. 98% der Patienten sofort nach erfolgter Erstdiagnose eingesetzt. Des Weiteren kommt M I X auch bei anderen Autoimmunerkrankungen zum Einsatz und ist außerdem zur Chemotherapie bei diversen Tumorerkrankungen ein gängiges Medikament (siehe Abolmaali et al., 2013 und http://www.cancerresearchuk.org/cancer-help/about-cancer/treatment/cancer- drugs/methotrexate oder http://wvm.drugs.corn/monograph/methotrexate.html#r262).
In einer Ausfuhrungsform umfasst die Behandlung mit Methotrexat (MTX) die Kombination mit Biologika und MTX.
Bei„Biologika" handelt es sich um
- anti-TNF-Antikörper,
wie beispielsweise monklonale anti-TNF-Antikörper, wie Adalimumab (Humira®), Certolizumab (Cimzia), Golimumab (Simponi®), Infliximab (Remicade®),
(siehe den Broeder et al, 2002; Barra et al., 2014);
- anti-TNF Inhibitoren,
wie Ethanercept (Enbrel®)
(siehe Cohen et al., 2008; Rubbert-Roth and Finckh, 2009)
oder - andere Antikörper,
wie Rituximab (Rituxan®), Abatacept (Orencia®), Tocilizumab (Actemra® oder
RoActemra®)
(siehe z.B. Taylor 2003).
Bevorzugt erfolgt die Vorhersage der Behandlung und/oder die Klassifizierung der Patienten vor Beginn der Behandlung mit MTX (Methotrexat).
In einer Ausfiihrungsform werden die Proben vorselektiert in HLA-DRB4-positive oder HLA-DRB4-negative Proben.
Erfrndungsgemäß werden bevorzugt inflammatorisch, chronisch entzündliche Erkrankungen, Autoimmunerkrankungen und/oder Tumorerkrankungen behandelt.
Dabei sind die inflammatorisch, chronisch entzündlichen Erkrankungen und Autoimmunerkrankungen bevorzugt ausgewählt aus:
Rheumatoider Arthritis (RA) oder primär chronischer Polyarthritis, juveniler idiopathischer Arthritis, Systemischem Lupus Erythematodes (SLE), Systemischer Sklerose (Sklerodermie), Polymyositis, Dermatomyositis, Inclusion-body Myositis, Psoriasis, Multipler Sklerose, Uveitis, Morbus Crohn, Churg-Strauss-Syndrom (CSS), Morbus Boeck, Morbus Bechterew, Rezidivierender Polychondritis, Colitis ulcerosa, Polymyalgia rheumatica, Riesenzellarteriitis, Vaskulitis.
Dabei sind die Tumorerkrankungen bevorzugt ausgewählt aus:
Akuter lymphatischer Leukämie (ALL) (Kinder und Erwachsene), Urothelkarzinom der Harnblase, Mammakarzinom, Medulloblastom, Ependymom (Kinder und Erwachsene), Non- Hodgkin-Lymphom (NHL) (Kinder und Erwachsene), Osteosarkom (Kinder und Erwachsene).
In einer bevorzugten Ausfiihrungsform werden mindestens 50% der mRNA Biomarker-Gene in Kombination mit HLA-DRB4 bestimmt.
Bei 50% der Biomarker-Gene handelt es sich um 16 der 32 Biomarker-Gene. In weiteren Ausfdhrungsformen werden mindestens 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 oder 32 der 32 Biomarker-Gene, jeweils in Kombination mit HLA-DRB4 bestimmt.
In manchen Ausführungsförmen werden ausschließlich die Biomarker-Gene der HLA-DRB4- positiven Patientengrappe bestimmt, in manchen Ausführungsformen werden ausschließlich die Biomarker-Gene der HLA-DRB4-negativen Patientengruppe bestimmt, in manchen Ausfuhrungsformen werden die Biomarker-Gene von beiden Gruppen, der HLA-DRB4- positiven und der HLA-DRB4-negativen Patientengruppe bestimmt (jeweils in Kombination mit HLA-DRB4).
In der Ausfuhrungsform der Behandlung von rheumatoider Arthritis (RA) werden alle 32 Biomarker-Gene (also 100%) in Kombination mit HLA-DRB4 bestimmt.
Die erfindungsgemäße Verwendung umfasst bevorzugt die Bestimmung der Anwesenheit der mRNA Marker/Biomarker-Gene und deren Expressionsstärke in einer Probe.
Die Anwesenheit der mRNA Marker/Biomarker-Gene und deren Expressionsstärke wird bevorzugt bestimmt mittels
- Sequenz-basierter Methoden, wie serielle Analyse der Genexpression (SAGE) (wie SuperSAGE), Real-Time-quantitative PCR (qPCR) (wie RT-qPCR), Bead-Technologie, Blot, RNA- oder Next-Generation Sequenzierung (wie IonTorrent),
- Hybridisierungs-basierter Methoden, wie in situ Hybridisierung, Northern blot, DNA- Mikro- und Makroarrays,
und/oder
- Kombinationen davon.
Grundsätzlich kann man die Technologien zur Erforschung/Bestimmung der Genexpression in hybridisierungsbasierende Methoden und sequenzbasierte Methoden einteilen.
Beispiele für Hybridisierungsbasierende Methoden sind:
- Mit der in-situ-Hybridisierung wird sequenzspezifisch RNA eines definierten Gens/Gen-Sets im Gewebe detektiert und das lokale Genexpressionsmuster bestimmt. - Bei der Northern-Blot-Methode wird RNA zunächst isoliert und elektrophoretisch nach ihrer Größe in einem Gel aufgetrennt. Nach Übertragung auf eine Membran (Blotting) wird die gesuchte RNA-Sequenz durch markierte Sonden (markiert z.B. mit Radioisotopen, Fluoreszenz-Farbstoffen) aus komplementärer RNA oder DNA über komplementäre Bindung nachgewiesen. In der Regel werden nur geringe Anzahlen von Sequenzen simultan untersucht.
- In DNA-Mikroarrays oder -Makroarrays kann die Menge an mRNA einer Vielzahl von Genen aus Zellen einer Kultur/eines Gewebes simultan bestimmt werden. Dazu wird die mRNA isoliert und in cDNA/cRNA umgeschrieben. Die Detektion erfolgt bei dieser Methode über komplementäre Hybridisierung der markierten cDNA/cRNA (markiert z.B. mit Radioisotopen, Fluoreszenz-Farbstoffen) mit den Sonden des DNA-Arrays.
Bekannte DNA Mikroarray Techniken verwenden Affymetrix Arrays/Chips, wie beispielsweise mit Biotin/Streptavidin Verstärkung und dem Farbstoff Phycoerythrin.
Beispiele für Sequenzbasierte Methoden sind:
- Mit der Seriellen Analyse der Genexpression (SAGE) und insbesondere SuperSAGE kann die Expression theoretisch aller Gene einer Zelle sehr genau bestimmt werden, indem von jedem Transkript ein kurzes Sequenzstück (dem sog. "Tag" - engl. Etikett) erzeugt wird, und möglichst viele dieser Tags sequenziert werden. Vorteil gegenüber Mikroarrays ist die sehr viel genauere Quantifizierung der Transkripte, sowie die Möglichkeit (v.a. mit SuperSAGE) neue Transkripte (z.B. nichtcodierende Ribonukleinsäuren, wie microRNAs oder antisense- RNAs) zu identifizieren und Organismen mit bisher nicht bekannten Genomen zu untersuchen.
- Die Real-Time-quantitative-PCR (qPCR) ist eine Variante der Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Durch dem Reaktionsgemisch zugesetzte Farbstoffe oder spezielle Sonden wird die Konzentration des Produktes während der PCR verfolgt. Die zeitliche Änderung der Konzentration ermöglicht Rückschlüsse auf die Ausgangskonzentration der betreffenden Nukleinsäure. Eine spezielle Variante der qPCR ist die Reverse-Transkriptase Real-Time qPCR (RT-qPCR) und die erweiterte Form der Multiplex-qPCR.
- Als RNA-Sequenzierung, oder auch„Next-Generation-Sequencing", wird die Bestimmung der Nukleotidabfolge der RNA bezeichnet. Hierfür wird die RNA in cDNA übersetzt, damit die Methode der DNA-Sequenzierung angewendet werden kann. RNA-Sequenzierung enthüllt Informationen zur Genexpression, zum Beispiel wie unterschiedliche Allele eines Gens exprimiert sind, zu posttranskriptionalen Modifikationen oder zur Identifizierung von Fusions-Genen.
Die DNA Mikroarray Technik misst die relative Aktivität zuvor identifizierter Zielgene. Sequenz-basierte Methoden, wie die serielle Analyse der Genexpression (SAGE, SuperSAGE), werden ebenfalls zur Genexpressionsanalyse verwendet. SuperSAGE ist besonders genau, da diese Methode nicht auf zuvor definierte Gene beschränkt ist, sondern jedes aktive Gen messen kann. Seit der Einführung von„Sequenzierungsmethoden der nächsten Generation" (RNA-Seq) erfreut sich die Sequenz-basierte Expressionsanalyse zunehmender Beliebtheit, da sie eine digitale Alternative zu Mikroarrays darstellt.
Die Probe ist erfindungsgemäß bevorzugt eine Patientenprobe, die weiter bevorzugt ausgewählt ist aus Vollblut, peripheren Blutleukozyten oder aus gereinigten Blutzellen.
In einer bevorzugten Ausfuhrungsform wird mindestens ein Biomarker / Gen ausgewählt aus den folgenden:
CKAP4, CRISP3, KIAA0564, LCN2, OLFM4, MMP8, oder SLC8A1/BF223010
und/oder
AQP3, DEFA4, oder SNHG5,
und in Kombination mit HLA-DRB4 als prädiktive(r) Biomarker zur Vorhersage der Behandlung mit MTX (Methotrexat) / zur Prädiktion des Therapieansprechens auf MTX verwendet.
Beispielsweise erfolgt die Bestimmung der Anwesenheit des/der (mRNA) Marker und deren Expressionsstärke in einer Probe mittels sequenz-basierter Methoden, wie oben erläutert, bevorzugt Real-Time-quantitative PCR (qPCR) (wie RT-qPCR).
In einer bevorzugten Ausführungsforrn wird aus CKAP4, CRISP3, KIAA0564, LCN2, OLFM4, MMP8, oder SLC8A1/BF223010 bevorzugt mindestens ein Biomarker / Gen ausgewählt aus:
CRJSP3, LCN2, OLFM4 oder MMP8.
Verfahren zur Vorhersage der MTX-Behandlung Die Aufgabe wird weiterhin erfindungsgemäß durch Verfahren zur Vorhersage der Behandlung mit MTX (Methotrexat) / zur Prädiktion des Therapieansprechens auf MTX gelöst.
Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst die Schritte:
(i) zur Verfügung stellen einer Patientenprobe,
(ii) Detektieren mindestens eines mRNA Biomarker(s) ausgewählt aus den folgenden 32 Genen:
ARG1, CKAP4, CRTSP3, CST3, GCLM, Κ1ΛΛ0564, KIAA1324, LCN2, LOC654433/PAX8-AS 1 , LTP, OLFM4, OSBPL1A, MMP8, SIAHl , SLC8A1/BF223010, SULF2, AQP3, CFD, DEFA4, EIF5A, GATA3, Hs.674648, KCNE3, PAM, PRDX5, RNASE2, TCN1, TKT, SLC35E2, SNHG5, SPAG9, und/oder WLS
in Kombination mit HLA-DRB4
in der Patientenprobe,
und
(iii) Bestimmen der relativen Expressionsstärke des mindestens einen mRNA Biomarkers und von HLA-DRB4 durch Vergleich mit Referenzstandard(s) und/oder Kontrollprobe(n).
Mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Patienten in Responder oder Non- Responder klassifiziert.
Bevorzugt umfasst das Detektieren in Schritt (ii) die Bestimmung der Anwesenheit der mRNA Marker und deren Expressionsstärke.
Bevorzugt umfasst das Bestimmen der relativen Expressionsstärke des mindestens einen mRNA Biomarkers und von HLA-DRB4 in Schritt (iii) den Vergleich der Expressionsstärke mit einem Grenzwert bzw. Cut-off Wert.
Der Grenzwert bzw. Cut-off- Wert ergibt sich aus der jeweils verwendeten Bestimmungsmethode, wie Array, Bioplex, SAGE, Sequenzierung, qPCR, Multiplex-qPCR etc. Bevorzugt umfasst das Bestimmen der relativen Expressionsstärke des mindestens einen mRNA Biomarkers und von HLA-DRB4 in Schritt (iii) weiterhin die Bestimmung eines Regulierungsfaktors (FC,„Fold Change").
Beispielsweise, bei der Verwendung von Affymetrix Arrays/Chips werden die Grenzwerte bzw. Cut-off Werte vom Hersteller des Arrays oder Chips und/oder der verwendeten Auswertesoftware (wie BioRetis, Online Datenbank der BioRetis GmbH Berlin) festgelegt. Zum Beispiel, kann der Cut-off- Wert bei einem Affymetrix Array/Chip der Signalwert > 50 und bei einer BioRetis Online Datenbank Auswertung der Betrag des Regulierungsfaktors (FC) von mindestens 1.5 (| 1,51) in > 70 % der paarweisen Einzelvergleiche (bzw. innerhalb der paarweisen Gruppenvergleiche Responder versus Non-Responder) sein.
Siehe auch Beispiel 1 und Beispiel 2.
In Schritt (iii) wird Expressionsstärke des mindestens einen mRNA Biomarkers und von HLA-DRB4 mit Referenzstandard(s) und/oder Kontrollprobe(n) verglichen.
Bei den erfindungsgemäßen Referenzstandard(s) in Schritt (iii) handelt es sich bevorzugt um Probe(n) enthaltend ein oder mehrere Haushaltgen(e), wie beispielsweise Aktin-beta (ACTB), Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH), 60S Ribosomales Protein PO (RPLPO).
Bei den erfindungsgemäßen Kontrollprobe(n) in Schritt (iii) handelt es sich bevorzugt um Proben von Respondern und/oder Non-Respondern.
Die erfindungsgemäßen Kontrollprobe(n) sind bevorzugt Referenzkollektive, also mehrere oder eine Vielzahl von Proben von Respondern und/oder Non-Respondern.
Beispielsweise werden als Kontrollproben die 52 Patientenproben, wie hierin in den Beispielen beschrieben, verwendet.
Die relative Expressionsstärke des mindestens einen mRNA Biomarkers und der vorhandenen oder nicht vorhandenen Expression von HLA-DRB4 ergibt sich bevorzugt aus dem Vergleich mit Kontrollprobe(n) von Respondern und/oder Non-Respondern. Die Erfinder haben gefunden, dass
- bei Respondern im Vergleich mit Non-Respondern:
ein Regulierungsfaktor (FC,„Fold Orange") bzw. ein Betrag des Regulierungsfaktors von mindestens 1.5 (bzw. > |1,5|)
in mindestens 70 % der paarweisen Einzelvergleiche (bzw. innerhalb der paarweisen Gruppenvergleiche Responder versus Non-Responder)
bei 100 % der jeweils detektierten mRNA Biomarker
vorliegt
- bei Non-Respondern im Vergleich mit Respondern hierzu
äquivalent dazu ein reziproker Regulierungsfaktor bzw. ein Betrag des Regulierungsfaktors von < -1,5
in mindestens 70 % der paarweisen Einzel vergleiche (bzw. innerhalb der paarweisen Gruppenvergleiche Responder versus Non-Responder)
bei 100 % der jeweils detektierten mRNA Biomarker
vorliegt.
Siehe auch Beispiel 1 (Abschnitt 1.4) und Beispiel 2.
Bei den mindestens 70 % der Einzelproben/Patienten handelt es sich bevorzugt um 60 bis 100 %, weiter bevorzugt 70 bis 100 % oder 70 bis 90 %.
Bei den paarweisen Einzelvergleichen wird jede Probe bzw. Kontrollprobe mit jeweils den einzelnen anderen Proben/Kontrollproben verglichen.
Bevorzugt werden paarweise Einzelvergleiche mit allen Kontrollproben (d.h. Proben von Bekannten Respondern und/oder Non-Respondern) durchgeführt, um die Klassifizierung in Responder und Non-Responder vorzunehmen.
Bevorzugt werden die Patienten als Responder klassifiziert, wenn in Schritt (iii) in 60-100% (bevorzugt mindestens 70%) der paarweisen Vergleiche die relative Expressionsstärke eines Wertes von > |1,5| FC bei 100 % der detektierten mRNA Biomarker erreicht wird.
Das bedeutet beispielsweise, wenn in einer Probe z.B. 16 mRNA Biomarker detektiert werden (in Kombination mit HLA-DRB4) und die Expressionsstärke von allen 16 mRNA Biomarkem über dem Cut-Off-Wert liegt, und die relative Expressionsstärke von beispielsweise > |1,5| in mindestens 70 % (bzw. 60-100%) der paarweisen Vergleiche für alle 16 Marker als erreicht gilt, dann wird dieser Patient als Responder klassifiziert.
Bevorzugt werden die Patienten als Non-Responder klassifiziert, wenn in Schritt (iii) in 60- 100% (bevorzugt mindestens 70%) der paarweisen Vergleiche die relative Expressionsstärke mit einem reziproken FC- Wert von > |1,5| bei 100 % der detektierten mRNA Biomarker erreicht ist.
Das bedeutet beispielsweise, wenn in einer Probe z.B. 16 mRNA Biomarker detektiert werden (in Kombination mit HLA-DRB4) und die Expressionsstärke von allen 16 mRNA Biomarkern über dem Cut-Off- Wert liegt und die relative Expressionsstärke von beispielsweise > |1,5| in mindestens 70 % (bzw. 60-100%) der paarweisen Vergleiche für alle 16 Marker als erreicht gilt, dann wird dieser Patient als Non-Responder klassifiziert.
Dabei werden die folgenden 16 Gene:
ARG1, CKAP4, CRISP3, CST3, GCLM, KIAA0564, KIAA1324, LCN2, LOC654433/PAX8-AS1, LTF, OLFM4, OSBPLIA, MMP8, SIAH1, SLC8A1/BF223010 und SULF2
der„HLA-DRB4 positiven Patientengruppe" zugeordnet, wie oben beschrieben. Dabei werden die folgenden 16 Gene:
AQP3, CFD, DEFA4, EIF5A, GATA3, Hs.674648, KCNE3, PAM, PRDX5, RNASE2, TCN1, TKT, SLC35E2, SNHG5, SPAG9 und WLS
der„HLA-DRB4 negativen Patientengruppe" zugeordnet, wie oben beschrieben.
In der HLA-DRB4 positiven Patientengruppe werden Medium-Responder oder moderate Responder zu den Respondem gezählt.
Dies gilt beispielsweise für das Ausführungsbeispiel der RA, sowie bei anderen Autoimmun- und Tumorerkrankungen.
In der HLA-DRB4 negativen Patientengruppe werden Medium-Responder oder moderate Responder zu den Non-Respondern gezählt.
Dies gilt beispielsweise für das Ausfuhrungsbeispiel der RA, sowie bei anderen Autoimmun- und Tumorerkrankungen. In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst die Behandlung mit Methotrexat (MTX) die Kombination mit Biologika, wie z. B. anti-TNF-Antikörper (wie oben beschrieben), und MTX.
Bevorzugt erfolgt die Vorhersage der Behandlung und/oder die Klassifizierung der Patienten vor Beginn der Behandlung mit MTX (Methotrexat).
In einer bevorzugten Ausführangsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Probe(n) vorselektiert wird/werden in HLA-DRB4-positive oder HLA-DRB4-negative Probe(n).
In einer bevorzugten Ausführangsform des erfmdungsgemäßen Verfahrens wird die Probe einer Vorbehandlung unterzogen.
Eine solche Vorbehandlung kann umfassen:
- die Entfernung von Globin-mRNA,
- reverse Transkription der Total mRNA
und/oder
- Markierung mit Label, wie z.B. Biotin.
Bevorzugt umfasst das Detektieren in Schritt (ii) die Bestimmung der Anwesenheit der mRNA Marker und deren Expressionsstärke umfasst.
Die Bestimmung erfolgt bevorzugt mittels
- Sequenz-basierter Methoden, wie serielle Analyse der Genexpression (SAGE) (wie SuperSAGE), Real-Time-quantitative PCR (qPCR) (wie RT-qPCR), Bead-Technologie, Blot, RNA- oder Next-Generation Sequenzierung (wie IonTorrent),
- Hybridisierungs-basierter Methoden, wie in situ Hybridisierung, Northern blot, DNA- Mikro- und Makroarrays,
und/oder
- Kombinationen davon
wie oben beschrieben. In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird in Schritt (ii) mindestens ein mRNA Biomarker ausgewählt aus
CKAP4, CRISP3, KIAA0564, LCN2, OLFM4, MMP8, oder SLC8A1/BF223010 und/oder
AQP3, DEFA4, oder SNHG5
in Kombination mit HLA-DRB4 in der Patientenprobe detektiert.
In einer bevorzugten Ausfuhrungsform wird aus CKAP4, CRISP3, KIAA0564, LCN2, OLFM4, MMP8, oder SLC8A1/BF223010 bevorzugt mindestens ein mRNA Biomarker ausgewählt aus:
CRISP3, LCN2, OLFM4 oder MMP8.
Erfindungsgemäß werden bevorzugt inflammatorisch, chronisch entzündliche Erkrankungen, Autoimmunerkrankungen und/oder Tumorerkrankungen behandelt.
Dabei sind die inflammatorisch, chronisch entzündlichen Erkrankungen und Autoirnmunerkrankungen bevorzugt ausgewählt aus:
Rheumatoider Arthritis (RA) oder primär chronischer Polyarthritis, juveniler idiopathischer Arthritis, Systemischem Lupus Erythematodes (SLE), Systemischer Sklerose (Sklerodermie), Polymyositis, Dermatomyositis, Inclusion-body Myositis, Psoriasis, Multipler Sklerose, Uveitis, Morbus Crohn, Churg-Strauss-Syndrom (CSS), Morbus Boeck, Morbus Bechterew, Rezidivierender Polychondritis, Colitis ulcerosa, Polymyalgia rheumatica, Riesenzellarteriitis, Vaskulitis.
Dabei sind die Tumorerkrankungen bevorzugt ausgewählt aus:
Akuter lymphatischer Leukämie (ALL) (ICinder und Erwachsene), Urothelkarzinom der Harnblase, Mammakarzinom, Medulloblastom, Ependymom (Kinder und Erwachsene), Non- Hodgkin-Lymphom (NHL) (Kinder und Erwachsene), Osteosarkom (Kinder und Erwachsene). In einer bevorzugten Ausführungsfomi des erfindungsgemäßen Verfahrens werden mindestens 50% der Biomarker-Gene in Kombination mit HLA-DRB4 bestimmt.
Bei 50% der Biomarker-Gene handelt es sich um 16 der 32 Biomarker-Gene.
In weiteren Ausfuhrungsformen werden mindestens 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27,
28, 29, 30, 31 oder 32 der 32 Biomarker-Gene, jeweils in Kombination mit HLA-DRB4 bestimmt.
In manchen Ausführungsformen werden ausschließlich die Biomarker-Gene der HLA-DRB4- positiven Patientengruppe bestimmt, in manchen Ausführungsformen werden ausschließlich die Biomarker-Gene der HLA-DRB4-negativen Patientengruppe bestimmt, in manchen Ausführungsformen werden die Biomarker-Gene von beiden Gruppen, der HLA-DRB4- positiven und der HLA-DRB4-negativen Patientengruppe bestimmt (jeweils in Kombination mit HLA-DRB4).
In der AusfiU ingsform des erfindungsgemäßen Verfahrens der Behandlung von rheumatoider Arthritis (RA) werden alle 32 Biomarker-Gene (also 100%) in Kombination mit HLA-DRB4 bestimmt.
Die Probe ist erfindungsgemäß bevorzugt eine Patientenprobe, die weiter bevorzugt ausgewählt ist aus Vollblut, peripheren Blutleukozyten oder aus gereinigten Blutzellen.
Kits zur Vorhersage der Behandlung mit MTX
Die Aufgabe wird weiterhin erfindungsgemäß durch Kits zur Vorhersage der Behandlung mit MTX (Methotrexat) / zur Prädiktion des Therapieansprechens auf MTX gelöst.
Ein erfindungsgemäßer Kit umfasst:
(a) Mittel zur Durchführung zum Detektieren mindestens eines iriRNA Biomarker(s) ausgewählt aus
ARG1, CKAP4, CR1SP3. CST3, GCLM, KIAA0564, KIAA1324, LCN2, LOC654433/PAX8-AS1, LTF, OLFM4, OSBPL1A, MMP8, SIAH1, SLC8A1/BF223010, oder SULF2
und/oder
AQP3, CFD, DEFA4, EIF5A, GATA3, Hs.674648, KCNE3, PAM, PRDX5, RNASE2, TCN1, TKT, SLC35E2, SNHG5, SPAG9, oder WLS in Kombination mit HLA-DRB4
in Patientenproben,
(b) Referenzstandard(s) umfassend Probe(n) enthaltend ein oder mehrere Haushai tgen(e),
(c) Kontrollprobe(n) umfassend Probe(n) von Respondera und/oder Non-Respondern.
Geeignete Referenzstandard(s) und Kontrollprobe(n) sind wie oben beschrieben.
In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Kits werden die Mittel (a) zur Durchführung zum Detektieren mindestens eines mRNA Biomarker(s) ausgewählt aus
CKAP4, CRISP3, KIAA0564, LCN2, OLFM4, MMP8, oder SLC8A1/BF223010 und/oder
AQP3, DEFA4, oder SNHG5.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird aus CKAP4, CRISP3, KIAA0564, LCN2, OLFM4, MMP8, oder SLC8A1/BF223010 bevorzugt mindestens ein mRNA Biomarker ausgewählt aus:
CRISP3, LCN2, OLFM4 oder MMP8.
Die Mittel (a) zur Durchführung zum Detektieren mindestens eines mRNA Biomarker(s) in Patientenproben umfassen bevorzugt:
Arrays, Chips (wie hierin oben beschrieben),
Primer,
Marker und Label (wie hierin oben beschrieben),
und/oder Kombinationen davon.
Prädiktive miRNA Biomarker
Die Aufgabe wird weiterhin erfindungsgemäß durch die Verwendung von mindestens einer miRNA, die ausgewählt ist aus den folgenden 6 miRNAs:
Hsa-mir-193b _st, Hsa-mir-223_st, Hsa-mir-572__st, Hsa-mir-1184, Hsa-mir-1915_st, Hsa- mir-3177_st, und/oder Hsa-mir-4298_st
als prädiktive(r) miRNA Biomarker zur Vorhersage der Behandlung mit MTX (Methotrexat) / zur Prädiktion des Therapieansprechens auf MTX gelöst. Erfindungsgemäß werden die Patienten bevorzugt in Responder oder Non-Responder klassifiziert.
Wie oben diskutiert, ist Methotrexat (MTX) bei der rheumathoiden Arthritis das Medikament der ersten Wahl und wird bei ca. 98% der Patienten sofort nach erfolgter Erstdiagnose eingesetzt. Des Weiteren kommt MTX auch bei anderen Autoimmunerkrankungen zum Einsatz und ist außerdem zur Chemotherapie bei diversen Tumorerkrankungen ein gängiges Medikament (siehe Abolmaali et al, 2013 und http://www.cancerresearchuk.org/cancer- help/about-cancer/treatment/ cancer-drugs/ methotrexate oder
http://www.drugs.eom/monograph/methotrexate.html#r262).
In einer Ausfuhrungsform umfasst die Behandlung mit Methotrexat (MTX) die Kombination mit Biologika und MTX.
Bei„Biologika" handelt es sich um
- anti-TNF- Antikörper,
wie beispielsweise monklonale anti-T F-Antikörper, wie Adalimumab (Humira®), Certolizumab (Cimzia), Golimumab (Simponi®), Infliximab (Remicade®),
(siehe den Broeder et al., 2002; Barra et al., 2014);
- anti-TNF Inhibitoren,
wie Ethanercept (Enbrel®)
(siehe Cohen et al., 2008; Rubbert-Roth and Finckh, 2009)
oder
- andere Antikörper,
wie Rituximab (Rituxan®), Abatacept (Orencia®), Tocilizumab (Actemra® oder RoActemra®)
(siehe z.B. Taylor 2003),
wie bereits oben diskutiert.
Bevorzugt erfolgt die Vorhersage der Behandlung und/oder die Klassifizierung der Patienten vor Beginn der Behandlung mit MTX (Methotrexat). In einer Ausiuhrungsfomi werden die Proben vorselektiert in HLA-DRB4-positive oder HLA-DRB4-negative Proben.
Erfindungsgemäß werden bevorzugt inflammatorisch, chronisch entzündliche Erkrankungen, Autoimmunerkrankungen und/oder Tumorerkrankungen behandelt.
Dabei sind die inflammatorisch, chronisch entzündlichen Erkrankungen und Autoimmunerkrankungen bevorzugt ausgewählt aus:
Rheumatoider Arthritis (RA) oder primär chronischer Polyarthritis, juveniler idiopathischer Arthritis, Systemischem Lupus Erythematodes (SLE), Systemischer Sklerose (Sklerodermie), Polymyositis, Dermatomyositis, Inclusion-body Myositis, Psoriasis, Multipler Sklerose, Uveitis, Morbus Crohn, Churg-Strauss-Syndrom (CSS), Morbus Boeck, Morbus Bechterew, Rezidivierender Polychondritis, Colitis ulcerosa, Polymyalgia rheumatica, Riesenzellarteriitis, Vaskulitis.
Dabei sind die Tumorerkrankungen bevorzugt ausgewählt aus:
Akuter lymphatischer Leukämie (ALL) (Kinder und Erwachsene), Urothelkarzinom der Harnblase, Mammakarzinom, Medulloblastom, Ependymom (Kinder und Erwachsene), Non- Hodgkin-Lymphom (NHL) (Kinder und Erwachsene), Osteosarkom (Kinder und Erwachsene).
Die erfindungsgemäße Verwendung umfasst bevorzugt die Bestimmung der Anwesenheit des/der miRNA Marker in einer Probe.
Die Anwesenheit der miRNA Marker/Biomarker wird bevorzugt bestimmt mittels:
- Sequenz-basierter Methoden, wie serielle Analyse der Genexpression (SAGE) (wie SuperSAGE), Real-Time-quantitative PCR (qPCR) (wie RT-qPCR), Bead-Technologie, Blot, RNA- oder Next-Generation Sequenzierung (z.B. IonTorrent),
- Hybridisierungs-basierter Methoden, wie in situ Hybridisierung, Northern blot, DNA- Mikro- und Makroarrays,
und/oder
- Kombinationen davon
wie oben beschrieben. Bevorzugt werden für die Bestimmung von miRNAs Mikroarrayanalytik, quantitative PCR und/oder Beads-basierte Verfahren verwendet.
Die Probe ist erfindungsgemäß bevorzugt eine Patientenprobe, die weiter bevorzugt ausgewählt ist aus Vollblut, peripheren Blutleukozyten oder aus gereinigten Blutzellen.
Verfahren zur Vorhersage der MTX-Behandlung mittels miRNA Biomarker(n)
Die Aufgabe wird weiterhin erfindungsgemäß durch Verfahren zur Vorhersage der
Behandlung mit MTX (Methotrexat) / zur Prädiktion des Therapieansprechens auf MTX gelöst.
Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst die Schritte:
(i) zur Verfügung stellen einer Patientenprobe,
(ii) Detektieren mindestens einer miRNA ausgewählt aus
Hsa-mir-193b st, Hsa-mir-223_st, Hsa-mir-572 _st, Hsa-mir-1184, Hsa-mir- 1915 st, Hsa-mir-3177_st, und/oder Hsa-mir-4298 st,
und
(iii) optional, Vergleich der Detektion des mindestens einen miRNA Biomarkers mit einem Referenzstandard und/oder einer Kontrollprobe,
Bevorzugt umfasst das Detektieren in Schritt (ii) die Bestimmung der Anwesenheit der miRNA Marker.
Mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Patienten in Responder oder Non- Responder klassifiziert.
Bevorzugt werden die Patienten als Responder klassifiziert, wenn der Expression unter sich zum Non-Responder mit einem FC-Wert von mindestens |1,3| unterscheidet und innerhalb des Vergleichs mit dem Non-Responder eine Signifikanz von p = < 0.05 auftritt.
Bevorzugt werden die Patienten als Non-Responder klassifiziert, wenn der Expression unter sich zum Non-Responder mit einem FC-Wert von mindestens |1,3| unterscheidet und innerhalb des Vergleich mit dem Responder eine Signifikanz von p = < 0.05 auftritt. In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst die Behandlung mit Methotrexat (MTX) die Kombination mit Biologika, wie z. B. anti-TNF- Antikörper (wie oben beschrieben), und MTX.
Bevorzugt erfolgt die Vorhersage der Behandlung und/oder die Klassifizierung der Patienten vor Beginn der Behandlung mit MTX (Methotrexat).
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Probe einer Vorbehandlung unterzogen.
Eine solche Vorbehandlung kann umfassen:
- die Entfernung von Globin-mRNA,
- reverse Transkription der Total mRNA
und/oder
- Markierung mit indirekten Labels, wie z.B. Biotin, Streptavidin, und/oder
- direkte Markierung mit Fluoreszenzfarbstoffen.
Bevorzugt umfasst das Detektieren in Schritt (ii) die Bestimmung der Anwesenheit der miRNA Marker.
Die Bestimmung erfolgt bevorzugt mittels
- Sequenz-basierter Methoden, wie serielle Analyse der Genexpression (SAGE) (wie SuperSAGE), Real-Time-quantitative PCR (qPCR) (wie RT-qPCR), Bead-Technologie, Blot, RNA- oder Next-Generation Sequenzierung(z.B. Ion Torrent),
- Hybridisierungs-basierter Methoden, wie in situ Hybridisierung, Northern blot, DNA- Mikro- und Makroarrays,
und/oder
- Kombinationen davon
wie oben beschrieben.
Bevorzugt werden für die Bestimmung von miRNAs Mikroarrayanalytik und/oder quantitative PCR verwendet. Erfindungsgemäß werden bevorzugt inflammatorisch, chronisch entzündliche Erkrankungen, Autoimmunerkrankungen und/oder Tumorerkrankungen behandelt.
Dabei sind die inflammatorisch, chronisch entzündlichen Erkrankungen und Autoimmunerkrankungen bevorzugt ausgewählt aus:
Rheumatoider Arthritis (RA) oder primär chronischer Polyarthritis, juveniler idiopathischer Arthritis, Systemischem Lupus Erythematodes (SLE), Systemischer Sklerose (Sklerodermie), Polymyositis, Dermatomyositis, Inclusion-body Myositis, Psoriasis, Multipler Sklerose, Uveitis, Morbus Crohn, Churg- S trau ss- S y ndrom (CSS), Morbus Boeck, Morbus Bechterew, Rezidivierender Polychondritis, Colitis ulcerosa, Polymyalgia rheumatica, Riesenzellarteriitis, Vaskulitis.
Dabei sind die Tumorerkrankungen bevorzugt ausgewählt aus:
Akuter lymphatischer Leukämie (ALL) (Kinder und Erwachsene), Urothelkarzinom der Harnblase, Mammakarzinom, Medulloblastom, Ependymom (Kinder und Erwachsene), Non- Hodgkin-Lymphom (NHL) (Kinder und Erwachsene), Osteosarkom (Kinder und Erwachsene).
Die Probe ist erfindungsgemäß bevorzugt eine Patientenprobe, die weiter bevorzugt ausgewählt ist aus Vollblut, peripheren Blutleukozyten oder aus gereinigten Blutzellen.
Erfindungsgemäß ist der Referenzstandard / die Kontrollprobe in Schritt (iv) bevorzugt ein Referenzstandard bestehend aus Haushaltgen(en),
und/oder eine Mischung aus Kontrollproben von Respondern und Non-Respondern.
Ausführungsform Rheumatoide Arthritis (RA)
Die RA wird gewöhnlich unmittelbar nach Diagnosestellung durch einen Rheumatologen mit Disease-modifying Antirheumatic Drugs (DMARDs) behandelt. Unter diese Medikamentenkategorie fällt auch das konventionell verwendete MTX, welches in >95 % ein DMARD der ersten Wahl darstellt. Der Therapieerfolg ist bisher nicht vorhersagbar und bisher besteht mit der erfassbaren Gelenksdestruktion. MTX wird außerdem auch zur Behandlung weiterer rheumatischer Erkrankungen, bei anderen Autoimmunerkrankungen und zur Behandlung von Tumorerkrankungen eingesetzt. Der RA Patient zeigt vom Behandlungsbeginn individuell betrachtet nach 3-6 Wochen erste Erfolge, belegt diese aber erst nach Beurteilung der klinischen Parameter zur Bestimmung der DAS28 Veränderung. Sicher gewährleistet ist eine Beurteilung der Ansprechrate aber erst nach 12-14 Wochen (Quinn et al., 2005) und erreicht erst nach ca. 6 Monaten das Maximum. Oftmals verliert sich die Wirksamkeit bereits nach einem Jahr, wobei anhaltende Erfolgsraten von 40-50% zu verzeichnen sind (Fürst 1996) und veranlasst dazu, die MTX Therapie mit anderen DMARDs, wie Sulfasalazin oder Leflunomid, zu kombinieren (Smolen et al. 2010). Sollte auch dabei keine Besserung eintreten, erfolgt die Kombinationstherapie mit MTX und Biologika. Auswertungen zum Therapieansprechen auf MTX wurden anhand von 14 unterschiedlichen klinischen Studien von Anderson et al. (2000) untersucht. In diesen Vergleichen zeigte sich, dass RA Patienten mit langjähriger Erkrankung ein schlechteres Ansprechverhalten haben, als Patienten bei denen die Erkrankungsdauer unter einem Jahr liegt. Ein Zusammenhang zwischen Frauen, die doppelt so häufig betroffen sind, und einer möglichen Vorhersage zum Therapieansprechen, konnte dabei nicht gezeigt werden. Auch sind bisher keine Zusammenhänge zwischen den routinemäßig gemessenen klinischen Parametern, Laborparametern, oder Umweltereignissen zur Vorhersage des Therapieansprechens auf MTX belegt. Erfahrungsgemäß sprechen nur 40-45 % der RA Patienten auf eine Kombinationstherapie mit MTX und monoklonalen anti-TNF Antikörpern an (siehe z.B. den Broeder et al. 2002), wobei die übrigen 55-60 % der Patienten aus klinischer Sicht nicht den erwünschten Therapieerfolg zeigen. Die Erfassung der Besserungsrate zur Beurteilung erfolgt nach definierten Regeln, die von der Amerikanischen Gesellschaft für Rheumatologie (ACR response) etabliert wurden, oder nach den Regeln der Europäischen Gesellschaft für Rheumatologie (EULAR response). Auch nach dem Verlust des Ansprechens (Intoleranz) oder dem Auftreten von Nebenwirkungen (adverse effects) auf die Behandlung mit MTX erfolgt die weitere Behandlung mit anderen anti-TNF Inhibitoren (Cohen et al., 2008; Rubbert-Roth and Finckh, 2009) oder mit anderen Biologika, z.B. mit Riruximab, Abatacept, Tocilizumab, Certolizumab (siehe z.B. Taylor 2003) oder zukünftig sicherlich auch mit anderen Therapeutika nach dem Prinzip des 'trial and error' (Blom et al., 2009). Klar wird, dass eine Therapieschiene die Erfolg aufweist, schnellstens auch angewandt werden sollte, um so früh wie nur möglich einer Chronifizierung mit fortlaufender Gelenkszerstörung entgegenzuwirken (Smolen et al., 2010). Das individuelle Therapieansprechen kann bis dato noch nicht vorhergesagt werden. Daher ist es wünschenswert für jedes einzelne Standardmedikament das bei der RA eingesetzt wird, Biomarker zu definieren und um Testsysteme zu entwickeln.
In den letzten 10 Jahren wurde sowohl über genetische (SNP-Analytik), als auch genomische (mRNA) Testverfahren versucht, eine Therapieprädiktion zu gewährleisten. Letztere Ansätze finden sich in der vorliegenden Patenanmeldung wieder. Über genetische Untersuchungen gelang es bisher nicht, singulären Nukleotidaustauschen in Einzelgenen statistische Signifikanzen zuzuordnen. Dies drückt sich in sehr niedrigen Odds Ratios' aus. Zum Beispiel erbrachten genetische Assoziationsansätze bei RA Patienten und Trägern des HLA- DRB1 *04:01 nur ,odds ratio' Werte von 4.44 (Scally et al. 2013), einem Wert dem statistisch gesehen keine eindeutige Relevanz zugeordnet werden kann. Aus diesem Grund sind die bisher verwendeten Sequenzierverfahren mit niederen Korrelationen für ein Risikomanagement der Erkrankung und zur Bewertung von Vorhersagen, weder für die Erlirankung selbst, noch für das Therapieansprechen geeignet.
Zukünftig werden vermehrt Hoffnungen den komplexeren Untersuchungen der genomweiten DNA- Sequenzierung entgegengebracht, die es erlauben sollen, über sehr aufwendige bioinformatische Algorithmen eine große Anzahl von Genen in größeren Patientenkollektiven zu untersuchen. Eine Verknüpfung der genomweiten Transkriptionsanalyse mit neuartigen Massen-Sequenzierungsansätzen ist erfolgsversprechend. Zusammenfassend wird immer klarer, dass es sich bei inflammatorischen chronischen Erkrankungen, Tumorerkrankungen eingeschlossen, um Erkrankungen handelt, die ein multifaktoriell verursachtes Geschehen haben und subgruppenabhängig sind, und es daher meist notwendig wird, auch mehrere Betrachtungsweisen zu vereinen.
In der vorliegenden Anmeldung drückt sich dies durch die Vorselektion der HLA-DRB4 Subgruppen in Kombination mit den jeweils 16 spezifischen Kandidatengenen zur Bewertung von Respondern und Non-Respondern aus.
Gesamt-genomische Transkriptionsanalysen sind neue Technologien, die es einerseits erlauben, zügig und adaptiert in andere molekulare Technologien überführt zu werden, und haben für die individualisierte Medizin einen sehr hohen Stellenwert. Die Umsetzung in kostengünstigere Testsysteme, wie z.B. quantitative Polymerasen-Ketten Reaktion, insbesondere auf „Mikrofluidic" basierten Techniken können/werden dazu beitragen das Gesundheitssystem von jährlich steigenden Kosten zu entlasten. Technisch sind diese Methoden unter Verwendung von Gesamtblut als Ausgangsmaterial, welches routinegemäß bei den klinischen Untersuchungen abgenommen wird, hervorragend dazu geeignet, schnelle und differenzierte Ergebnisse zu liefern und dem Arzt im Sinne der Vermeidung von Nebenwirkungen (>5 %;) so früh wie nur möglich eine effektive Therapiewahl für den individuellen Patienten zu ermöglichen.
Bislang gab noch keine Testverfahren, weder für MTX, noch für Biologika, die kostengünstig, ohne aufwendige Logistik und außerdem auch schnell eingesetzt werden können.
Den Erfindern ist es nun gelungen, einen prädiktiven Test zur Abschätzung des zukünftigen Therapieansprechens auf MTX zu entwickeln, in dem die folgenden prädiktiven Biomarker- Gene in Kombination mit HLA-DRB4 verwendet werden:
- Prädiktive Gene der HLA-DRB4 negativen Subgruppe
Hier werden die erfindungsgemäßen für MTX prädiktiven Biomarker-Gene der HLA-DRB4 negativen RA Subgruppe aufgeführt und erläutert:
1. Defensin alpha 4 (DEFA4; alias: Cortico statin) das in MTX Respondern in der I ILA- DR B4 negativen Subgruppe verstärkt exprimiert wird, hat eine Vielzahl von biologischen Funktionen. Für DEF4A ist beschrieben, dass es für Peptide mit mikrobiellen und zytotoxischen, antiviralen Funktion zur Erregerabwehr fungiert (Spitznagel, 1990; Wu et al., 2005). Zum anderen inhibiert DEF4A die Corticotropin stimulierte Kortikosteron Produktion (Genz et al., 1990). DEF3A wurde unter anderem von Cheok et al. (2003) als Marker beschrieben der zur Diskriminierung von Medikamentenantworten beiträgt. Diese Befunde wurden anhand von humanen Leukämiezelllinien in vitro erhoben.
2. Der Prädiktionsmarker Complement Factor-D (CFD; alias: Adipsin) der in Respondem der HLA-DRB4 negativen Subgruppe hochreguliert ist, gehört funktionell zur der Trypsin Family der Peptidasen. CFD ist eine Komponente des alternativen Komplement Pathways und auch bei der humoralen Antwort zur Abwehr infektiöser Erreger beteiligt ist (Jouvin et al, 1983). 3. Transcobalamin-1 (TCN1) kodiert für ein Vitamin B12 bindendes Protein und transferiert Cobalmin in die Zelle. Erkrankungen die in Zusammenhang mit diesem Gen in der Literatur genannt wurden, sind die Pernicious anemia ,pemiköse Anämie' und orale Tumoren. Interessanterweise wurde auf genetischer Ebene, Polymorphisms innerhalb der TCN Familie beschrieben, die einen Einfluß auf den MTX Metabolismus haben (Linnebank et al. 2005). Parallelen zwischen genetischen und genomischen Befunden sind bisher nicht bekannt.
4. Die Ribonuclease-2 (RNASE2) gehört zur Ribonuklease Typ-A Familie, besitzt namensgebend Ribonuklease Aktivität und bindet Nukleinsäuren. Weiter spezifiziert ist die RNASE2 eine Pyrimidin spezifische Nuklease mit auch geringer Bindungsaffinität für Uridin, Cytotoxin and Helminthotoxin. Eine weitere biologische Rolle hat die RNASE2 bei Immun Überreaktion und bei anti-parasitischer Abwehr (Yang et al., 2003; Yang et al., 2004). RNASE2 ist außerdem chemotaktisch für dendritische Zellen und ist ein endogener Ligand für den Toll-like Rezeptor-2 (Rosenberg 2008).
5. Die Transketolase-like I (TKTLl) wirkt funktionell im Pentosephosphat Pathway mit und wurde beschrieben, die Wirkung von MTX zu regulieren (Lee et al., 2008). In den eigenen Untersuchungen konnte der Prädiktionsmarker TKT, nicht aber TKTLl, identifiziert werden, der im Rattentumormodell als MTX Prädiktor beschrieben ist (Yamashita et al., 1999).
6. Hs.674648 ist bisher funktionell noch unbekannt, wie auch die -
7. Peptidylglycin alpha-amidating Monooxygenase (PAM), ein kodiertes Enzym das zweiwertige Kupfer- und Calcium Ionen binden kann ist an einer Vielzahl verschiedener biologischer Funktionen beteiligt (Prigge et al., 2000). Eine indirekte oder direkte Verbindung zu MTX Interaktion mit Einfluss auf die Wirksamkeit ist bis dato nicht bekannt.
8. Der Kalium Kanal CNE3 gehört zur Isk-Familie. Die biologische Funktion von Kalium Kanälen ist vielfältig. Bekannt ist, dass beim Genfamilienmitglied 4 (KCNE4) im Rattenmodell konnte von Lee et al. (2008) gezeigt werden, dass MTX einen Einfluss auf dessen Expressionstärke hat. 9. Die Sperm associated antigen-9 (SPAG9) mRNA kodiert für ein Protein aus derTumor Testis Antigen Familie (Garg et al, 2007). Das kodierte Protein der SPAG9 mRNA hat Scaffold Protein Eigenschaften und organisiert sich strukturell mit Mitogen-aktivierten Protein Kinasen und trägt somit zur c-Jun terminalen Kinase vermittelten Sinaltransduktion bei. SPAG9 bindet an Kinesin-1 und spielt eine Rolle beim Tumorwachstum und der Entwicklung. Bis dato bestehen keine Zusammenhänge zu MTX.
10. Mitochondrial Precursor Peroxiredoxin-5 (PRDX5) interagiert mit dem Peroxisome Rezeptor 1 und hat antioxidantische schützende Funktionen im normalen und inflammatorischen Gewebe (Yamashita et al., 1999). Auch hier ist bisher keine Verbindung mit MTX bisher bekannt.
11. Die Aquaporin-3 (AQP3) mRNA ist herunterreguliert und kodiert für ein Wasserkanal zugehöriges Protein (Ishibashi et al., 1995), der wie der
12. Wntless Wnt ligand Sekretion Mediator (WLS) bisher weitgehend funktionell unbekannt ist. Eine Beteiligung des Proteins wird bei NFkB und MAP -Kinase Pathway diskutiert (Matsuda et al., 2003). Eine direkte und indirekte Verbindung zu MTX ist weder für AQP3, noch für WLS bisher bekannt.
13. Das kodierte GATA-bindende Protein-3 (GA A3) trägt zwei GATA-Typ-spezifische Zink Finger, und ist bei der Regulation von T-Zellen, bei der sogenannten ,innate lymphoid group 3' Zellentwicklung (Yagi et al., 2011; Serafini et al, 2014) und der endothelialen Zellreifung beteiligt (Umetani et al., 2001). GATA3 wurde eine immunosupprimierende und anti-inflammatorische Wirkung zugeschrieben (Li et al., 2013). GATA3 wurde in vitro als Prädiktor der Cytorabine Hydrochloride (Ara-C), Dexamethason, Methylprednisolon, Mitoxantron und Rituximab- Behandlung bei Tumorzellinien beschrieben (US 2009/0023149 AI). Außerdem wurde beschrieben, dass GATA3 Prädiktor einer Taxan Unempfindlichkeit ist (Tominaga et al., 2012). Die mRNA von GATA3 wird im Lebertumorgewebe von Ratten und im humanen Brustkrebszellgewebe durch die Behandlung mit MTX hochreguliert (Belisnky et al, 2007; Gulbahce et al, 2013). Eine Prädiktion für die Wirksamkeit von MTX ergibt sich aus diesen Befunden jedoch nicht. 14. Der Eukaryotic translation initiation factor 5A (EIF5A) kodiert für ein mRNA- bindendes Protein, das bei der Translations-Elongation beteiligt ist. Bekannt ist außerdem, dass EIF5A eine Rolle im Methionin-Metabolismus und bei der Hypusin-Biosynthese spielt (Scuoppo et al., 2012). Die Überexpression der EBF5A mR A in kolorektalen Tumorgewebsproben korreliert mit der Stärke der Tumorausprägung bei Patienten mit kolorektalen Krebserlcrankungen. EIF5A wurde deshalb als prognostischer Marker für die Beurteilung des Erfolgs von MTX behandelten Patienten mit kolorektalen Krebserkrankungen vorgeschlagen (Tunca et al., 2013 und Rat Genome Database, Bioinformatics Research Centre, Medical College of Wisconsin des National Heart Lung and Blood Institutes (NHLBI)).
15. Die mRNA für 'Solute carrier family 35 member E2_i (SLC35E2) ist ein neues Mitglied aus der , Solute Carrier Familie' und steuert beim Nukleotid Zucker Transport bei. Im Modellsystem konnte gezeigt werden, dass dieser Transporter bei der Tumor Metastase, der zellulären Immunität, Organogenese, und Morphogenese und der Entwicklung des Bindegewebes und Muskel beteiligt ist (Ishida & Kawakita 2004). SLC35, wie auch die anderen Mitglieder aus dieser Genfamilie, haben über Nukleotid-Zucker WechselwirlcungenTransporterfunktionen, unter anderem von Medikamenten und sind im Golgi Apperat und im Endoplasmatischen Retikulum lokalisiert (Nishimura et al., 2009). Pathologisch zeigte sich in tierexperimentellen Studien nach Defizienz dieses Gens eine verstärkte Tumormetastase, wie auch eine Störung der Immunität, Organogenese und Morphogenese (Ishida & Kawakita 2004).
Genen aus der SLC Familie wurde eine Rolle innerhalb der Pharmakokinetik von Medikamenten zugeordnet (WO 2011/014721 A2). Bei Tumorpatienten, die mit Tamoxifen behandelt wurde, ergaben sich Hinweise, dass sich die Expression von SLC35E2 verändert (Han et al., 2006). Die Genexpression zahlreicher Mitglieder aus der SLC-Familie, wird durch Methotrexat verändert (siehe auch die Rat Genome Database, Bioinformatics Research Centre, Medical College of Wisconsin des National Heart Lung and Blood Institutes (NHLBI)).
16. Die hochregulierte mRNA des Gens 'Small nucleolar RNA host gene 5 (SNHG5; alias: U50HG) ist bei der Ribosomen Biogenese beteiligt (Tanaka et al., 2000). SNHG5 wurde beim B-Zell Lymphom, Brust- und Prostata-Tumoren als Biomarker beschrieben (Dong et al., 2009; Nakamura et al, 2008; Dong et al., 2008) und wird dort verstärkt exprimiert. Die Bestrahlung von Tumorzellen führt zu einer Gegenregulation mit Verminderung der mRNA Expression von SNHG5 (Chaudry 2013).
Prädiktive Gene der HLA-DRB4 positiven S bgruppe
Hier werden die erfindungsgemäßen für MTX prädiktiven Biomarker-Gene der HLA-DRB4 positiven RA Subgruppe aufgeführt und erläutert:
1. KIAA1324 ist ein noch bisher funktionell unbekanntes Gen. Κ1ΛΛ1324 wird in Darmtumorzellen überexprimiert und wurde als diagnostischer Marker bei epithelialen Darmtumoren beschrieben (US 2008/0064049 AI).
2. Das Gen für E3-Ubiquitin protein ligase-1 (SIAH1) kodiert für ein Protein aus der ,seven in absentia homolog Familie (Hu et al., 1997; Nakayama et al., 2004). SIAH1 spielt bei der Entwicklung verschiedener Parkinson Erkrankungen eine übergeordnete Rolle (Franck et al., 2006). SIAH5 wird im Zusammenspiel mit High-density Lipoproteinen nach Hypoxie und Apoptose Induktion über den Jun-Kinase Weg reguliert (Nakayama et al., 2004).
3. Cystatin-3 (CST3; alias: Cystatin-C) kodiert für ein Protein welches vielfache Cystatin-ähnliche Sequenzbereiche enthält (Türk et al., 2008). Verstärkt exprimiert wird CST3 bei Artheriosklerose (Arpegard et al, 2008), aber auch bei Erkrankungen aus dem rheumatischen Formenkreis (Hansen et al., 2000). Hayashi et al. (2010) konnte zeigen, dass ein erhöhter Serumspiegel von Cys-C ein Indikator für die MTX-induzierte Myelotoxizität in Patients mit RA ist. Wie bei den Befunden der Erfinder auf mRNA Ebene, insbesondere den MTX Respondern, ist CST3 auch auf Proteinebene von RA Patienten bereits vor der Behandlung mit MTX hochreguliert. Daraus lässt sich ableiten, dass bei MTX-Behandlung eine verstärkte Myelotoxizität auch bei den Respondern zu erwarten ist.
4. Sulfatase-2 (SULF2) ist eine Heparan Sulfat 6-O-Endosulfatase. SULF2 moduliert über die Bindung von Heparan-Sulfat die Veränderung von Bindungsstellen an Zell-Signal Rezeptoren (Dai et al. 2005). Erhöhte Expressionsraten von SULF1 und SULF2 sind sowohl für Tumorgewebe (Wigersma et al., 1991; Nawroth et al, 2007), als auch bei entzündlichen Erkrankungen, wie z.B. der Osteoarthritis (Otsuki et al., 2008) oder der RA im synovialen Gewebe beschrieben (Kar et al., 1976). 5. KIAA0564 (alias: Von Willebrand Factor A d omain containing 8) ist funktionell noch unbekannt. Allerdings deutet die Bezeichnung und andere Hinweise darauf hin, dass der Von Willebrand Factor A domain containing 8 / KIAA0564 ein Protein mit Zell- Adhäsionseigenschaften ist (Reininger et al. 2006). GO Annotierungen zeigen dass dieses Protein eine ATPase Aktivität und ATP-Bindung aufweist. KIAA0564 wurde im Rahmen der Diagnose und Prävention mit Perspektive zur Prädiktion von Therapien beschrieben (WO 2002/008423 A2).
6. Der 'Glutamat-Cy stein Li gase Modifie (GCLM; alias: gamma-Glutamylcystein Synthetase) ist bei der Glutathion Synthese beteiligt. GCLM ist wichtig bei der Erythrozyten Überlebensfähigkeit (Foller et al., 2013) und ist bei hämolytischer Anämia hochreguliert. GCLM ist bei den MTX Respondern im Vergleich zu den Non-Respondern der HLA-DRB4 positiven Patienten Subgruppe herunter reguliert .
7. Das 'Cytoskeleton-assoziierte Protein 4 (C AP4) ist ein Transmembran Protein und wird im Endoplasmatischen Retikulum exprimiert. Eine erhöhte Expression von C AP4 wurde im metastasierendem lymphatischen Gewebe beobachtet (Li et al., 2013). Funktionell reguliert CKAP4 das Plasminogen aktivierende System der Blutgefäße (Razzaq et al., 2003). Außerdem wurde für CKAP4 eine Suszeptibilität für MTX berichtet (Prigge et al., 2000) und CKAP4 wurde als Prädiktor von MTX bei Tumorerkrankungen beschrieben (US 8,445,198 B2; US 2008/0292546 AI).
8. Das Oxysterol Binding Protein-Like LA (OSBPL1A) ist zusammen mit den GTPasen Rab7, Rab9 und dem 'Lysosome-associated membrane protein-Γ kolokalisiert und bindet Phosphoinositide in Endosomem und Lysosomen (Johansson et al., 2005). Eine Verbindung zu MTX wurde nicht beschrieben.
9. Das exprimierte Gen 'Solute carrier family 8A member V (SLC8A1; alias BF223010) agiert als Natrim/Calcium Austauscher (Khananshvili, 2013) und GO Annotierungen indizieren, dass es sich um ein zytoskeletales Protein mit Calmodulin bindender Funktion handelt. Der transkriptionelle Regulator (miRNA) des SLC8A1, aber nicht SLC8A1 selbst, wurde als Prädiktor der MTX Behandlung bei entzündlichen Darmerlcrankungen beschrieben (WO 2009/120877 A2; WO 2011/014721 A2). Verschiedene Mitglieder der SLC Familie interagieren mit MTX und werden durch MTX reguliert (siehe auch SLC35E2) (siehe auch die Rat Genome Database, Bioinformatics Research Centre, Medical College of Wisconsin des National Heart Lung and Blood Institutes (NHLBI).
SLC8A1 wurde als diagnostischer Marker für Autoimmunerkrankungen, wie dem Systemischen Lupus Erythematosus (SLE) und beim ANCA positiven Wegener Granulomatosus beschrieben (WO 2006/020899 A2).
10. Der Biomarker LOC654433 ist eine lange nicht-kodierende RNA mit bisher unbekannter Funktion.
11. Arginase 1 (ARG1) ist eine Typ-I spezifische Arginase, die die Hydrolyse von Arginin zu Ornithin unter der Abspaltung von Harnstoff katalysiert (Ivanenkov et al., 2014). Monozyten/Makrophagen sind die übergeordnete Zellpopulation, welche Arginasen exprimiert (Murphy et al., 1998). Huang et al. (2001) berichteten, dass die Arginase Aktivität signifikant mit der Arginase Proteinexpression bei Patienten mit RA einhergeht. Die Genexpression von ARG1 ist in der HLA-DRB4 positiven Subgruppe bei den MTX Respondern verstärkt. Shen et al. (2013) zeigten einen Zusammenhang der Expressionen von ARG1 und des Folat Rezeptors-ß auf positiven Ml -Typ Macrophagen, welche auch den Mannose Rezeptor exprimieren. Ein direkter Zusammenhang zwischen der Genexpression von ARG1 und MTX besteht bisher nicht.
12. Lipocalin 2 (LCN2) wird auf Neutrophilen exprimiert und ist mit dem proteolytischen Enzym Gelatinase assoziiert (Kjeldsen et al., 2000).
LCN2 is an Eisen-trafficking Protein, welches in multiple Prozesse involviert ist, wie innate Immunität (Zughaier et al., 2013; Landro et al., 2008), renale Entwicklung, und Zellmigration (Paulsson et al., 2007). Bläser et al. (1995) berichtetem, dass Lipocalin 2 in hohen Mengen in der Synovialflüssigkeit von Patienten mit RA detektierbar ist. In Respondern der HLA-DRB4 positiven Subgruppe ist die dieses Enzym kodierende mRNA verringert.
13. Der Biomarker 'Cysteine-Rich Secretory Protein Γ (CRISP3) hat bisher keine beschriebene biologische Funktion. Ein Paralog des CRISP3 stellt das C-Typ Lektin Domain Family 18, Member B (CLEC18B) dar, das - gemäß GO Annotatierung - als 'Mannose receptor like protein' die Fähigkeit hat, Kohlenhydrate zu binden. CRISP3 interagiert mit 17beta-estradiol (Pfisterer et al., 1996). Die Genexpression von CRISP3 wird in DHEA stimulierten humanen submandibulären Drüsenzellen verstärkt exprimiert (Laine et al., 2007). Die Genexpression von CRISP3 wurde in Zusammenhang der Erkrankung Sjögren' s Syndrom beschrieben (Tapinos et al., 2002). CRISP3 wurde als Prädiktor für die Therapie von Prostata Krebszellen beschrieben (WO 2013/070088 AI).
14. Lactotransfenin (LTF; alias: Lactoferrin) ist ein Mitglied aus der Transferrin Genfamilie und wird im Wesentlichen von Neutrophilen exprimiert. Das LTF Protein hat Heparin Bindungsaktivität und weist ein breites funktionelles Spektrum auf. Hierzu gehört u.a. eine anti-inflammatorische Aktivität (Paulsen et al., 2002), die Regulation des Zellwachstums und der Zelldifferenzierung (Liao et al., 2012) und der Schutz bei der Entwicklung von Tumoren (Kanwar et al., 2013). Bei der RA fungiert LTF als sogenannter Überlebensfaktor für Neutrophile in der synovialen Flüssigkeit (Wong et al., 2009). MTX vermindert die Expression der LTF mRNA (Oshida et al., 2011). In der von Koczan et al. (2008) publizierten Arbeit wurde LTF neben weiteren 43 Genen als prädiktives Gen für die Therapie mit Ethanercept, einem anti-TNF Biologikum beschrieben. Die Untersuchungen beziehen sich dabei allerdings nicht auf die Baseline Genexpression vor Therapie alleine, sondern waren abhängig von einer Zweituntersuchung wenige Tage nach Therapiebeginn und haben deshalb keinen prädiktiven, sondern eher einen prognostischen Wert.
15. Die für das Protein kodierende Olfactomedin 4 (OLFM4) mRNA die der Noelin Genfamilie zugeordnet wird, wird während der myeloiden Zellentwicklung verstärkt exprimiert und wurde erstmalig in Myeloblasten beschrieben (Zhang et al., 2002). Das Protein OLFM4 wird im endoplasmatischen Retikulum exprimiert, hat eine anti-apoptotische Funktion und fördert u.a. auch das Tumorwachstum (Park et al., 2012). OLFM4 verhindert das Zellwachstum von Prostata Tumorzellen und wirkt supprimierend auf die Knochen Metastatase über die negative Interaktion mit Cathepsin D und dem Chemokin (C-X-C Motif) Liganden 12 (alias: SDF-1 ; Berger 1988). Beim systemischen Lupus Erythematosus und bei entzündlichen Darmerkrankungen, wurde OLFM4 als diagnostischer und prognostischer Marker in Zusammenhang mit weiteren anderen Markern beschrieben (US 8,148,067 B2, US 8,148,067 B2). Bis dato liegt keine Erkenntnis über die Rolle und die Expression von OLFM4 bei der RA vor. Jedoch wurde bei entzündlichen Darmerkrankungen beschrieben, dass OLFM4 als diagnostischer Biomarker in Frage kommt und bei der Immunantwort nach bakteriellen Infektionen autophagische Prozesse über Cathepsin-D Beteiligung reguliert (Montero-Melendez et al., 2013). 16. Die Matrix Metalloproteinase-8 (MMP8), als vorletzt beschriebener Biomarker für die MTX Prädiktion derHLA-DRB4 positive RA Subgruppc ist in der Lage Typ-Ii Collagen zu degradieren (Billinghurst et al., 1997). Eine Verbindung zu MTX besteht bisher nicht
Sowohl bei der Osteoarthritis als auch bei der RA kommt Matrix Metalloproteinasen bei der Destruktion der Knorpelstrukturen eine entscheidende Rolle zu (Shlopov et al., 1997). Zum anderen sind die Proteine im Serum und in der Synovialflüssigkeit bei RA Patienten nachweisbar (Tchetverikov et al., 2004). Eine direkte oder gar indirekte Interaktion zwischen MMP8 und MTX ist bislang nicht bekannt.
Die vorliegende Erfindung wird in den folgenden Figuren und Beispielen weiter verdeutlicht, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein. Die zitierten Referenzen sind hiermit durch Bezugnahme vollständig aufgenommen.
Figuren
Figur 1. Vorauswahl für prädiktive mRNA Biomarker für die MTX Monotherapie.
Die Genauswahl, unter den oben beschriebenen Kriterien der paarweisen Affymetrixvergleiche zwischen Respondern und Non-Respondern (n=52 RA Patienten) ergaben in der Voranalyse eine Anzahl von 14 Bi omarkern. Der in den folgenden Analysen als Selektionsmarker und in den Ansprüchen beschriebene Selektionsmarker HLA-DRB4 (ID: 209728_at), hatte wegen seines 'plus/minus' Regulationsverhaltens einen entscheidenden Effekt zur Unterteilung der RA Patienten in die HLA-DRB4 positive und HLA-DRB4 negative Subpopulation und ist in der hierarchischen Clusteranalysen Darstellung durch ein Rechteck ( L I ) gekennzeichnet. Die Clusteranalyse über Genesis erfolgte durch Log- Transformation mit anschließender Pearson Analyse.
Figur 2. Hierarchische Clusteranalyse der HLA-DRB4 positiven und der HLA-DRB4 negativen Patienten Subgruppen zwischen Respondern und Non-Respondern.
Unter Berücksichtigung der Einteilung in HLA-DRB4 positive und HLA-DRB4 negative RA Patienten Subpopulationen, gemäß den beschriebenen Bedingungen (HLA-DRB4 Cut-off Werte, dem vorgegebenen Fold-Change-Wert und den 'increased/decreased Referenzwerten) innerhalb der paarweisen Vergleiche zwischen Respondern und Non-Respondern, wurden jeweils n=16 Biomarker als Biomarker-Gensets definiert. Die Clusteranalyse über Genesis erfolgte durch Log-Transformation mit anschließender Pearson Analyse. Innerhalb der HLA- DRB4 negativen Patienten-Subgruppe ergab sich bei einer eindeutigen Trennung eine Sensitivität und Spezifität von jeweils 100 %, während die HLA-DRB4 positive RA-Patienten Subgruppe eine Sensitivität von 83.3 % und eine Spezifität von 92.9 % zeigte.
Figur 3. Hierarchische Clusteranalyse der HLA-DRB4 positiven und der HLA-DRB4 negativen Patienten Subgruppen zwischen Respondern und Non-Respondern unter Einbeziehung der moderaten Respondergruppe.
Unter Berücksichtigung der Einteilung in HLA-DRB4 positive und HLA-DRB4 negative RA Patienten Subpopulationen, gemäß den beschriebenen Bedingungen (HLA-DRB4 Cut-off Werte, dem vorgegebenen Fold-Change-Wert und den 'increased/decreased Referenzwerten) innerhalb der paarweisen Vergleiche zwischen Respondern und Non-Respondern, wurden unter Einbeziehung der moderaten Responder hierarchische Clusteranalysen durchgeführt. Die Clusteranalyse über Genesis erfolgte durch Log-Transformation mit anschließender Pearson Analyse. Dabei ergab sich wiederum für die HLA-DRB4 negative RA-Patienten Subgruppe eine eindeutige Trennung zwischen den Respondern und den Non-Respondern mit einer Spezifität und Sensitivität von 100 % . Bei der HLA-DRB4 positiven RA Patienten Subgruppe wurde ein Sensitivität von 100 % und eine Spezifität von 92.9 % (ohne Berücksichtigung der moderaten Responder) und 95.7 % (mit den moderaten Respondern die als Responder gewertet wurden) erreicht.
Figur 4. Validierung der Affymetrix Genauswahl über quantitative Real-Time PCR. Dargestellt sind exemplarische Ergebnisse der Validierungen, zur Prädiktion des Therapieansprechens auf MTX, über quantitative Real-Time qPCR mit Triplikatauswertungen (A) HLADRB4; (B) RNASE2; (C) MMP8.
Die Darstellung der y- Achse repräsentiert die Genexpression der einzelnen Kandidatengene in Bezug zum verwendeten Haushaltsgen 'Ribosomal Protein Large PO' (RPLPO). Hierzu wurden die spezifischen Biomarker, der HLA-DRB4 negativen Gruppe, wie auch der Biomarkerauswahl der HLA-DRB4 positiven Subgruppe verglichen. Die Darstellung erfolgte über ein Box-Plotverfahren mittels der Software SPSS. Die Striche repräsentieren den Mittelwert und die Balken zeigen die Standardabweichung innerhalb der Vergleiche zwischen den MTX Respondern (R) , den moderaten Respondern (MR) und den Non-Respondern (NR). Die Punkte deuten auf absolute Abweichungen die sich nicht im definierten Bereich befinden hin. Figur 5. Validierung der Affymetrix Genauswahl über quantitative Real-Time PCR. Dargestellt sind Ergebnisse der Validierungen, zur Prädiktion des Therapieansprechens auf MTX, über quantitative Real-Time qPCR mit Triplikatauswertungen.
(A) ARG1, CKAP4, CRISP3, CST3, GCLM, KIAA0564;
(B) KIAA1324, LCN2, LTF, MMP8, OLFM4, OSBPL1 A;
(C) SIAH1, SLC8A1, SULF2, HLA-DRB4.
Die Darstellung der y- Achse repräsentiert die Genexpression der einzelnen Kandidatengene in Bezug zum verwendeten Haushaltsgen 'Ribosomal Protein Large PO' (RPLPO). Hierzu wurden die spezifischen Biomarker der HLA-DRB4 positiven Subgruppe verglichen. Die Darstellung erfolgte über ein Box-Plotverfahren mittels der Software SPSS. Die Striche repräsentieren den Median wert und die Balken zeigen die Standardabweichung innerhalb der Vergleiche zwischen den MTX Respondern (R) , den moderaten Respondem (MR) und den Non- Respondern (NR). Die Punkte deuten auf absolute Abweichungen die sich nicht im definierten Bereich befinden hin.
Figur 6. Validierung der Affymetrix Genauswahl über quantitative Real-Time PCR. Dargestellt sind Ergebnisse der Validierungen, zur Prädiktion des Therapieansprechens auf MTX, über quantitative Real-Time qPCR mit Triplikatauswertungen.
(A) AQP3, CFD, DEFA4, EIF5A, GATA3, KCNE3;
(B) PAM, PRDX5, RNASE2, SLC35E2, SNHG5, SPAG9;
(C) TCN1, TKT, WLS.
Die Darstellung der y- Achse repräsentiert die Genexpression der einzelnen Kandidatengene in Bezug zum verwendeten Haushaltsgen 'Ribosomal Protein Large PO' (RPLPO). Hierzu wurden die spezifischen Biomarker der HLA-DRB4 negativen Gruppe verglichen. Die Darstellung erfolgte über ein Box-Plotverfahren mittels der Software SPSS. Die Striche repräsentieren den Medianwert und die Balken zeigen die Standardabweichung innerhalb der Vergleiche zwischen den MTX Respondern (R) , den moderaten Respondern (MR) und den Non- Respondern (NR). Die Punkte deuten auf absolute Abweichungen die sich nicht im definierten Bereich befinden hin.
Beispiele
Beispiel 1 mRNA Biomarker
1. Methoden 1.1 Patientenproben
Innerhalb der Versuchsreihe zur Identifikation und Definition von Biomarkern zur Therapieprädiktion mit MTX wurden 52 Patienten mit einer klinisch gesicherten RA untersucht. Hierzu wurden den Patienten jeweils 5 ml Gesamtblut in 2 PAXgene Röhrchen (PreAnalytiX, Hombrechtikon, Schweiz) abgenommen und für 24 Stunden auf einem Überkopfroller bei 20°C gedreht (20 Upm) und danach, bis zur Aufarbeitung, bei -20°C eingefroren. Die Patientenproben wurden im Rahmen von zwei klinischen Studien unter Standardbedingungen (HitHard Studie; n=29; eigene klinische Studie; n=22) und nach Genehmigung durch die Ethikkommission der Charite, wie auch Zustimmung der Patienten, aquiriert. Die klinischen Daten, vor MTX Therapie und im Verlauf über >1 Jahr wurden im Rahmen der Studienbedingungen in einer klinischen Datenbank nach ISO9001 Standardrichtlinien hinterlegt. Die Berechnung zur Abschätzung der MTX Antwort vor und während den Therapiezeiträumen erfolgte nach den Richtlinien der europäischen Gesellschaft für Rheumatologie (ELUAR) nach dem ,Disease Activity Score' unter Einbeziehung von 28 Gelenken (DAS28; (van Gestel et al, 1999)). Die MTX Therapieantwort erfolgte gemäß den Richtlinien in die folgenden drei Gruppen: Responder (R), moderate Responder (MR) und Non-Responder (NR).
1.2 Präparation der Gesamt RNA (total RNA)
Die gelagerten und gefrorenen PAXgene Blutröhrchen wurden nach den Vorgaben des Herstellers zwei Stunden bei Raumtemperatur aufgetaut und die RNA mit dem PAXgene® Blood miRNA Kit (PreAnalytiX) präpariert. Dieser Kit ermöglicht es, sowohl mRNA, als auch miRNA Transkriptionsanalysen durchzuführen. Die Menge der gereinigten total RNA erfolgte im NanoDrop 1000® UV- Vis Spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific Inc., NanoDrop, Wilmington, DE, USA) und die Qualitätsprüfung über den Bioanalyzer 2100® (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA).
1.3 Microarray Analysen
Vor der Verwendung der Proben zur Mikroarrayanalyse wurde Globin mRNA unter Verwendung des GLOBINclear™ Kits (Life Technologies, Ambion, USA) nach den Vorgaben des Herstellers reduziert. Im Anschluß erfolgte die Synthese der komplementären DNA (cDNA) und die Umschreibung in vitro Transkription in cRNA über den Affymetrix GeneChip® 3'IVT Express Kit (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA). Die amplifizierte und Biotin markierte cRNA wurde dann nach Vorgaben des Herstellers auf den GeneChip® Human Genome U133 Plus 2.0 Arrays für 16 Stunden bei 45°C hybridisiert. Die Waschschritte und die Markierung erfolgte in einer GeneChip® Fluidics Station 450GeneChip® unter Verwendung des Hybridisierungs, Wasch und Markierungskits von Affymetrix. Die Hybridisierungssignalauslesung erfolgte in einem Affymetrix GeneChip® 3000 7G Scanner, mit anschließender Normalisierung über den Affymetrix MAS5.0 Algorithmus der Expression Console Software.
1.4 Statistische Analyse und hierarchisches Clusterverfah ren der Microarray
Ergebnisse
Die dif leren ti eile mRNA Genexpression wurde über die BioRetis Online Datenbank (BioRetis GmbH, Berlin) ausgewertet. Hierbei erfolgte eine Vorfilterung der Daten nach den Kriterien > 70% in allen Gruppenvergleichen (Bsp. R versus NR) und einem Fold-Change von > 1.5 oder < -1,5. Der Grenzwert der Signalstärke, innerhalb der paarweisen Gruppenvergleiche (Responder versus Non-Responder); ohne und mit den moderaten Respondern ) wurde auf mindestens > 50 in einem der beiden Vergleichsgruppen gesetzt. Die Visualisierung der Daten erfolgte über die hierarchische Clustersoftware Genesis 1.7.6 (Gene Expression Similarity Investigation Suite; Universität Graz, Österreich; (Sturn et al., 2002) über die Log-Transformation und Pearson Analyse. Korrelationsanalysen der mRNA Probeset (Gen-)Signale, der klinischen Daten, und gegenseitig beide wurde über 1- und 2-tailed Wilcoxon Rank-Test mit Hilfe der IBM Software SPSS Statistics v.22 (Stacon, Witzenhausen, Deutschland) bestimmt.
1.5 Validierung der Mikroarrayanalysen über quantitative qPCR
Die Prüfung der Affymetrix basierten Ergebnislage zur differentiellen Genexpression definierter Biomarker erfolgte mit einer unabhängigen Methode über quantitative Real Time PCR (qPCR). Hierzu wurden standardisierte RT2 Primer Assays (Qiagen; Hilden, Germany) und zur Detektion Power SYBR® Green PCR Master Mix (Lifetechnologies, Applied Biosystems, USA) verwendet. Die Auswertung erfolgte über die Normalisierung der Genexpression der einzelnen Kandidatengene in Bezug zum verwendeten Haushaltsgen 'Ribosomal Protein Large PO' (RPLP0). Die qPCR Läufe wurden in einem StepOne Plus® Real Time Cycler (Lifeteclmologies, Carlsbad, CA, USA) gefahren. Die Amplifikation der Amplifikationseffiziensen und die Berechnung der Effizienz-korrigierten delta-delta-Ct (AACt) Werte erfolgte mit Hilfe des Softwareprogramms MS Excel 2010 (Microsoft, Redmont, WA, USA) bestimmt und die Visualisierung der Graphen erfolgte über das Softwareprogramm SPSS.
2. Ergebnisse
Die Identifizierung und Definition von Biomarkern im Vollblut zur Prädiktion des Behandlungserfolgs mit MTX bereits schon vor Therapie, erfolgte mit 52 Patientenproben der zwei unabhängigen Studien (klinikinterne Studie (n=23 RA; HitHard Studie (n=29; Detert et al., 2013). Beide Studien wurden hinsichtlich der Einschlusskriterien weitgehend aufeinander abgestimmt. Die durchschnittliche Erkrankungsdauer der RA Patienten aus der klinikinternen Studien betrug dabei 15,6 Monate (SD=48,9; SEM-22,3) und bei Patienten aus der HitHard Studie im Durchschnitt 1,7 Monate (SD=1.9; SEM=1.4). Bis auf den Unterschied der Erlcrankungsdauer ergaben sich statistisch keine Auffälligkeiten innerhalb der anderen erhobenen Parameter. Die Berechnung der Krankheitsaktivität und der zukünftigen Ansprecbrate auf die Medikation mit MTX erfolgte nach der Definition der europäischen Gesellschaft für Rheumatologie (EULAR) nach DAS28 Klassifikation (van Gestel et al., 1996).
Siehe auch Tabelle 1 für klinische und labordiagnostische Daten der 52 RA Patienten vor und während der Behandlung mit MTX.
Keine oder nur sehr geringe Korrelationen ergaben sich innerhalb des Geschlechts, dem sog. Visual Analog Squares (VAS), dem Fragebogen (Health Assessment Questionnaire, (HAQ)) zur Beurteilung subjektiv durch den Patienten selbst und objektiv begutachtet durch den behandelnden Arzt, dem Titer des C-Reaktiven Proteins (CRP), der Blutsenkungsgeschwindigkeit (BSG), der Anzahl der geschollenen Gelenke (28er Basis) und der Anzahl der schmerzhaften Gelenke (28er Basis).
Der erste Ansatz zur Einordnung in Responder und Non-Responder, mit und ohne Einbeziehung der MR, erbrachte bei den 52 Patientenproben noch keinen wünschenswerten Erfolg mit eindeutiger Trennung. Hierzu wurden über die Datenbankabfrage in BioRetis (Online Datenbank der BioRetis GmbH, Berlin) folgende Kriterien gesetzt: minimaler Change Call mit einer Übereinstimmung von > 30% increase/decrease innerhalb der Gruppenvergleiche (R vs. NR) und einem Fold-Change (FC) von > |1,5| (| | = Betrag). Die Analyse erbrachte einen Kandidatengensatz von 14 Genen. Die HLA-DRB4 mRNA war ein Biomarkergen aus dieser Vorauswahl.
Auch unter Einbeziehung der moderaten Responder, konnte noch keine eindeutige Trennung zwischen der Responder- und Non-Responder Gruppe gewährleistet werden (Figur 1).
Zur Untersuchung mittels Transkriptionsanalyse über Affymetrix Mikroarrays kamen die Patientenproben aus der eigenen ldinischen Studie (Gesamt n=29; Responder n=T4; Non- Responder n=6) und aus der HitHard Studie (Gesamt n=23; Responder n=T2; Non-Responder n=7). Unter Einbeziehung des Prä-Selektionsmarkers HLA-DRB4 (Affymetrix ID: 209728_at), konnten mit den über BioRetis (BioRetis Datenbank, BioRetis GmbH, Berlin) definierten Gensätzen (16 Gene für jede der HLA-Subgruppen) exakte Trennungen mit einer Sensitivität von 100% und Spezifität 96 % in der HLA-DRB4 positiven Patientengruppe zwischen Respondern und den Non-Respondern erreicht werden. Die Selektionskriterien der Abfrage zur Identifizierung der beiden HLA-DRB4 subgruppenspezifischen Gene zwischen der Gruppe der Responder und der Non-Responder waren Übereinstimmungen von mindestens 70% (increase/decrease; siehe Tabellen 2 und 3) innerhalb der paarweisen Einzelvergleiche (R vs. NR) und einem durchschnittlichen Regulierungsfaktor (fold change; FC) von >|1.5|.
Die Trennung innerhalb der HLA-DRB4 negativen Subpopulation erreichte jeweils eine Sensitivität und Spezifität von 100 %. Die Darstellung erfolgte über hierarchische Clusteranalyse mittels des Softwaretool Genesis (Figur 2A und 2B).
Unter Hinzunahme von moderaten Respondern (MR; n=9) clusterten diese innerhalb der Responder Gruppe in der HLA-DRB4 positiven Subgruppe, bei einer Falschzuordnung eines einzigen MTX Non-Responders. Die Sensitivität lag bei 100 % und die eine Spezifität bei 93 %. Bei der HLA-negativen Subpopulation der RA Patienten clusterten die moderaten Responder (n=4) innerhalb der Non-Responder Gruppe und alle MTX Responder getrennt dazu in einer eindeutig abgesetzten Gruppe. Hierbei lag die Sensitivität, wie auch die Spezifität bei jeweils 100 % (Figur 3A und 3B).
HLA-DRB4 (Affymetrix ID: 209728 at), welches als zusätzlicher Selektionsmarker innerhalb des Systems für die eindeutige Trennung beiträgt, wurde früher schon als Krankheitsmarker mit Diagnoserelevanz bei der RA beschrieben (Heidt et al. 2003). Innerhalb der HLA-DRB4 positiven (n=29) und -negativen Subgruppe (η=23) ergibt sich ein eindeutiger und auch signifikanter Genexpressionsunterschied durch sichtbare Signalintensitätsunterschiede der jeweiligen Patienten.
Dennoch wird aber klar, dass die Güte zur Unterscheidung von Respondern und Non- Respondern nicht genügt, um dem Qualitätslaiterium eines prädiktiv-diagnostischen Tests mit abverlangter Güte annähernd zu entsprechen. Dies drückt sich auch darin aus, dass die Minimalanzahl der beiden subgruppenspezifischen Biomarker notwendig wird und ein Weglassen jedes Einzelnen zu einer verminderten Qualität der Einteilung der MTX Therapieprädiktion führt.
Die Gensets der HLA-DRB4 negativen Subgruppe und der HLA-DRB4 wurden über die quantitative RT-qPCR validiert und erbrachten eine relativ eindeutige Übereinstimmung der Regulation innerhalb der jeweiligen Gruppen (Responder und Non-Responder). Siehe Figur 4 mit exemplarischen Ergebnissen der Validierung.
Beispiel 2 Weitere Validierung der m NA Biomarker
2.1 Präparation der Gesamt RNA (total RNA)
Vollblutproben wurden vor der MTX-Behandlung in PAXgene® Blutröhrchen (PreAnalytiX, Hombrechtikon, Schweiz) gesammelt, 24h bei Raumtemperatur rotierend inkubiert und anschließend bei -20° gelagert. Die gelagerten und gefrorenen PAXgene® Blutröhrchen wurden nach den Vorgaben des Herstellers zwei Stunden bei Raumtemperatur aufgetaut und die RNA mit dem PAXgene® Blood miRNA Kit (PreAnalytiX) präpariert. Dieser Kit ermöglicht es, sowohl mRNA, als auch miRNA Transkriptionsanalysen durchzuführen. Die Menge der gereinigten total RNA erfolgte im NanoDrop 1000® UV- Vis Spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific Inc., NanoDrop, Wilmington, DE, USA) und die Qualitätsprüfung über den Bioanalyzer 2100® (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA).
2.2 Validierung über quantitative RT-qPCR
Die Prüfung der Affymetrix basierten Ergebnisse zur differentiellen Genexpression von 30 der 32 definierten Biomarker erfolgte mit einer unabhängigen Methode über quantitative Real Time PCR (qPCR). Hierzu wurden standardisierte RT2 Primer Assays (Qiagen; Hilden, Germany) und zur Detektion Power SYBR® Green PCR Master Mix (Lifetechnologies, Applied Biosystems, USA) verwendet. Für zwei der definierten Biomarker waren zum Zeitpunkt des Experiments keine kommerziellen RT2 Primer Assays erhältlich. Die Auswertung erfolgte über die Normalisierung der Genexpression der einzelnen Kandidatengene in Bezug zum verwendeten Haushaltsgen 'Ribosomal Protein Large PO' (RPLPO). Die qPCR Läufe wurden in einem StepOne Plus® Real Time Cycler (Lifetechnologies, Carlsbad, CA, USA) gefahren. Amplifikationseffizienzen und effizienzkorrigierten delta-delta-Ct (AÄCt) Werte wurden nach Fleige et al., 2006, berechnet.
Die statistische Auswertung der differentiellen Genexpression zwischen Respondern, moderaten Respondern und Nicht-Respondern wurde mit der REST 2009 Software (Qiagen, Pfaffl et al., 2002) durchgeführt. Die individuellen delta-Ct- Werte wurden mit SPSS (Systat) dargestellt. Die Mittelwerte von Mikroarray-FC und delta-delta-CT- Werten der RT-qPCR wurden mittels t-Test-Statistik verglichen. Die nicht-parametrischen Wilcoxon-Rank- und Kruskal- Wallis-Tests wurden auf die zukünftige Antwort auf die MTX-Behandlung und die korrespondierenden klinischen Werte vor und nach der Therapie. Korrelationen zwischen Bonferroni-korrigierten Ergebnissen aus Mikroarray- und RT-qPCR- Versuchen wurden mittels des Pearson- und Spearman-Rank-Tests mit SPSS (Systat) untersucht.
Ergebnisse:
Die Gensets der FILA-DRB4 negativen Subgruppe und der HLA-DRB4 positiven Subgruppe wurden über quantitative RT-qPCR validiert und erbrachten eine relativ eindeutige Übereinstimmung der Regulation innerhalb der jeweiligen Gruppen (Responder und Non- Responder).
Siehe Figuren 5 und 6 mit weiteren Ergebnissen der Validierung. Siehe auch Tabelle 5 für die RT-qPCR-Ergebnisse und deren Korrelation mit den Microarray-Daten.
Die folgenden Marker der Gruppe HLA-DRB4+:
CKAP4, CR1SP3, KIAA0564, LCN2, MMP8, OLFM4, SLC8A1
und die folgenden Marker der Gruppe HLA-DRB4-:
AQP3, DEFA4, SNHG5
ergaben einen durchschnittlichen Regulierungsfaktor |FC| von > 1,5 = Signal; p-Wert qPCR <
0,1 ; Korrelation zu den Microarray-Daten mindestens >0,5.
Die folgenden Marker der Gruppe HLA-DRB4+:
CRISP3, LCN2, MMP8, OLFM4 ergaben einen durchschnittlichen Regulierungsfaktor |FC| von > 3 = Signal; p-Wert qPCR < 0,1; Korrelation zu den Microarray-Daten mindestens >0,5.
Für Details, siehe Tabelle 5.
Beispiel 3 miRNA Biomarker Methoden:
Neben den in der Ausführung genannten Biomarkern für die Prädiktion der Therapie mit MTX, wurden miRNA Expressionsprofile von n=39 Patienten, der zwei vorab schon genannten klinischen Studien, bestimmt.
Die gereinigte Total-RNA wurde mit dem Affymetrix Flash-Taq™ Biotin HSR RNA Labeling Kit (Genisphere, Hatfield, PA, USA) prozessiert. Die Hybridisierung der markierten Proben erfolgte für 16 Stunden bei 45°C mit miRNA 2.0 Microarrays nach den Vorgaben des Herstellers in der GeneChip® Fluidics Station 450. Die Auslesung der Hybridisierungssignale erfolgte im Affymetrix GeneChip® 3000 7G Scanner und die Normalisierung der Daten mit der Nach dem Waschen der Proben erfolgte mit der miRNA QCTool Software Version 1.1.1.0 (Affymetrix).
Ergebnisse:
Insgesamt konnten n=7 miRNA Biomarker identifiziert werden. Unter Hinzunahme der moderaten Responder (n=13) lag die Sensitivität, mit zwei Ausreißern, zwischen der Responder Gruppe (n=T8) und der Non-Responder Gruppe (n=8) bei 100 % und die Spezifität bei 94.9 %.
Tabelle 5 Prädiktive miRNA Biomarker miRNA (reife) Nukleotidsequenz Accession No. SEQ ID NO.
miRBase**
Hsa-mir-572_st GUCCGCUCGGCGGUGGCCCA MIOOOS 579 34 MIMAT0003237
Hsa-m ir- 1915_$t ACCUUGCCÜUGCUGCCCGGGCC M10008336 35
MIMAT0007891
IIsa-mir-223_st CGUGUÄUÜUGACAAGCUGAGUU MI0000300 36
MIMAT0004570
Hsa-mir-193b_st CGGGGUÜUUGAGGGCGAGAUGA MI0003137 37
MIMAT0004767
Hsa-mir-3177_st UGUGUACACACGUGCCAGGCGCU MI0014211 38
MIMAT0019215
Hsa-niir-4298_st CUGGGACAGGAGGÄGGAGGCAG MI0015830 39
ΜΪΜΑΤ0016852
Hsa-mir-U84_st CCUGCAGCGACUUGAUGGCUUCC MI0005829 40
MIMAT0005829
** Accession No. der Stem-loop Sequenz (kursiv) und Accession No. der reifen miRNA- Nukleotidsequenz (Quelle: miRBase Datenbank, www.mirbase.org)
Statistik:
Korrelationsanalysen zwischen mRNA und miRNA Signalen, klinischen Parametern und der Kandidaten Gene untereinander erfolgte über den 1- und 2-tailed Wilcoxon Rang-Test
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Tabelle 1. Klinische und labordiagnostische Daten der RA Patienten vor-und wälirend der Behandlung mit MTX.
MTX
ErkrankungsGeschwollene Schmerzhafte ANA- ACCPA-
Patient BehandlungsAlter RF CRP BSG DAS28 EULAR dauer Geschlecht Gelenke Gelenke Titer Titer HAQ DAS28
ID dauer (Jahre) (IU) (mg/dl) lh Reduktion Response (Monate) (28er Basis) (28er Basis) (IU) (IU)
(Monate)
R_22 + 8.8 0 27 f 617 10 13 1.64 35 640 622 1.6 6.410
3.8 0 0 0.15 10 0.6 2.279 4.131 R
RJ23+ 1.1 0 66 m 275 8 7 1.53 72 0 94 1.5 5.933
3.7 0 1 0.07 10 0.8 2.351 3.581 R
R 25+ 0.6 0 44 m 305 6 8 3.70 33 320 604 1.4 5.821
3.7 0 1 0.39 2 1.3 1.424 4.397 R
R_39+ 0.0 0 37 m 3 12 4 3.19 35 0 331 nd 5.009
3.0 0 0 0.17 10 nd 1.612 3.397 R
R_41+ 0.1 0 77 m 8 9 15 3.17 54 320 26 nd 6.220
5.9 0 0 0.56 8 nd 1.740 4.480 R
R_44+ 11.8 0 43 f 389 3 4 0.21 26 320 34 nd 4.735
3.5 0 2 0.5 6 nd 2.323 2.411 R
R_205+ 1.1 0 35 m 72 6 10 1.96 20 320 1,000 0.9 5.556
3.7 3 0 0.27 6 0.3 2.073 3.483 R
R_206+ 5.3 0 59 m 39 13 15 2.92 4 160 1,000 1.8 5.209
3.7 2 0 0.34 4 0.0 1.429 3.780 R
R_211+ 1.4 0 47 m 41 7 7 1.83 28 160 54 1.0 5.745
3.7 2 3 0.1 1 6 0.1 2.844 2.901 R
R_221+ 0.7 0 68 f 129 6 9 0.80 41 160 28 1.4 6.039
3.8 2 2 0.40 10 0.1 2.841 3.198 R
R_223+ 0.0 0 70 f 45 6 8 0.10 32 320 7 1.4 5.714
3.5 0 2 0.20 10 1.0 2.723 2.991 R
RJ014+ 12.3 0 52 m 318 4 9 0.98 36 80 nd nd 5.167
3.7 0 0 0.18 12 nd 2.165 3.002 R
RJ019+ 1.1 0 37 f 35 1 1 0.76 34 80 61 nd 3.307
3.0 0 1 0.50 5 nd 1.966 1.342 R
RJ020+ 2.8 0 63 f 234 2 12 0.13 22 320 243 nd 5.624
3.0 0 0 0.13 10 nd 1.754 3.870 R
MTX
Erkrankungs- Geschwollene Schmerzhafte ANA- ACCPA-
Patient BehandlungsAlter RF CRP BSG DAS28 EULAR dauer Geschlecht Gelenke Gelenke Titer Titer HAQ DAS28
ID dauer (Jahre) (IU) (mg/dl) lh Reduktion Response (Monate) (28er Basis) (28er Basis) (IU) (IU)
(Monate)
R_28- 1.4 0 59 m 12 6 8 1.70 36 80 8 0.9 5.285
3.7 0 0 0.50 11 0.1 1.750 3.536 R
R_31- 2.2 0 61 m 1 9 9 1.20 20 0 1 1.3 5.296
3.7 3 1 3.00 2 0.5 1.688 3.607 R
R 42- 0.3 0 22 f 14 11 22 1.78 35 0 31 nd 6.886
4.9 0 1 1.15 18 nd 3.146 3.740 R
R_43- 0.0 0 45 f 81 0 3 0.27 20 160 8 nd 3.626
3.0 0 0 0.11 6 nd 1.396 2.230 R
R_45- 0.0 0 65 m 58 2 9 0.58 30 nd >1000 nd 4.873
3.0 0 1 nd 2 nd 1.182 3.691 R
R_47- 6.0 0 32 f 85 4 6 6 23 nd >1000. 0.75 4.648
3.03 7 0 2 8 0.75 2.491 2.157 R
R_202- 2.2 0 57 f 28 8 8 0.39 48 80 9 1.9 5.935
3.8 0 0 0.16 18 0.0 2.165 3.770 R
R_204- 4.1 0 54 f 3,040 8 9 0.75 34 2,560 957 0.9 5.604
3.9 2 1 0.84 16 1.3 3.167 2.437 R
RJ215- 0.8 0 73 m 48 15 25 3.55 49 320 6 2.5 7.948
3.7 0 0 0.31 13 1.1 2.363 5.585 R
R_217- 0.0 0 75 m 53 16 18 3.11 73 160 11 2.1 7.431
3.7 0 0 0.52 25 1.1 2.637 4.795 R
R_218- 2.6 0 20 f 14 6 13 1.54 81 80 3 0.4 6.241
3.6 1 1 0.30 19 0.3 2.957 3.285 R
RJ012- 0.7 0 47 m 20 6 10 1.03 12 80 6 nd 5.042
3.5 1 1 0.10 2 nd 1.608 3.434 R
MTX
Erkrankungs- Geschwollene Schmerzhafte ANA- ACCPA-
Patient BehandlungsAlter RF CRP BSG DAS28 EULAR dauer Geschlecht Gelenke Gelenke Titer Titer HAQ DAS28
ID dauer (Jahre) (IU) (mg/dl) lh Reduktion Response (Monate) (28er Basis) (28er Basis) (IU) (IU)
(Monate)
MR+_32 0.2 0 40 m 239 19 21 6.70 62 320 1,000 1.0 7.806
3.6 12 14 3.70 20 1.0 5.796 2.010 MR
MR+_33 2.2 0 60 f 11 13 14 0.87 26 0 18 0.1 6.361
3.7 7 3 0.72 32 0.4 4.976 1.385 MR
MR+_34 0.6 0 70 f 3 24 27 0.99 28 160 6 2.0 7.687
3.7 2 6 0.33 18 1.1 4.210 3.477 MR
MR+_203 0.7 0 43 f 243 21 28 1.67 68 80 581 2.5 8.328
3.7 8 5 0.36 38 1.3 5.457 2.871 MR
MR+_209 0.1 0 58 f 247 9 12 3.91 50 320 1,000 1.4 6.422
3.7 1 5 1.53 48 0.6 4.533 1.889 MR
MR+_212 1.9 0 23 f 121 11 13 2.67 42 80 490 0.0 6.610
3.7 8 14 0.28 12 0.1 5.159 1.451 MR
MR+_214 5.2 0 53 f 269 8 11 3.33 36 80 9 0.9 6.047
3.8 2 5 0.95 18 0.3 3.907 2.140 MR
MR+JOll 42.1 0 74 f 366 8 14 2.88 45 640 1,000 nd 6.823
4.2 4 10 1.04 35 nd 5.380 1.443 MR
MR+J015 240.9 0 56 f 131 17 24 2.67 55 320 375 nd 7.831
3.2 4 18 0.47 15 nd 5.812 2.019 MR
MR-_29 1.2 0 44 f 859 16 21 0.47 91 640 434 1.9 7.788
3.8 0 3 0.31 29 1.4 3.546 4.243 MR
MR-_30 0.2 0 66 m 6 16 27 3.85 81 0 9 2.4 8.260
3.7 0 10 0.31 26 0.5 4.348 3.912 MR
MR-_35 0.9 0 66 f 5 8 8 2.50 33 1,280 4 0.9 5.076
3.7 0 4 0.37 23 0.9 3.660 1.416 MR
MR-J017 20.6 0 72 f 278 0 15 0.42 40 5,120 27 nd 5.726
3.0 0 2 0.37 35 nd 4.126 1.600 MR
MTX
Erkrankungs- Geschwollene Schmerzhafte ANA- ACCPA-
Patient BehandlungsAlter RF CRP BSG DAS28 EULAR dauer Geschlecht Gelenke Gelenke Titer Titer HAQ DAS28
ID dauer (Jahre) (IU) (mg/dl) 1h Reduktion Response (Monate) (28er Basis) (28er Basis) (IU) (IU)
(Monate)
NR_24+ 2.4 0 67 f 26 7 7 1.24 69 0 10 2.0 5.979
3.7 1 9 1.47 72 1.5 5.823 0.156 NR
NR_27+ 1.2 0 53 f 104 8 12 5.40 41 320 3 0.0 5.908
3.7 8 12 1.60 28 0.0 5.612 0.295 NR
NRJ6+ 1.1 0 68 f 34 0 4 0.27 32 160 651 nd 4.246
8.9 6 5 0.22 42 nd 5.831 -1.585 NR
NR_37+ 2.8 0 77 f 639 2 0 0.32 55 1280 1000 nd 3.917
4.0 11 19 1.13 45 nd 7.304 -3.387 NR
NR_38+ 3.8 0 64 m 1 4 7 0.13 18 80 10 nd 4.486
6.0 4 7 0.32 12 nd 4.202 0.284 NR
NR_46+ 0.0 0 70 f 45 1 5 3.81 36 nd 12 nd 4.743
2.6 1 6 nd 24 nd 4.578 0.165 NR
NR_26- 0.1 0 57 f 22 8 12 1.70 19 -1 3 1.9 5.696
3.7 8 12 0.80 17 1.9 5.334 0.362 NR R_40- 0.5 0 58 f 83 5 14 0.11 24 160 26 nd 5.788
3.5 5 25 0.11 35 nd 7.035 -1.246 NR
NR_21 - 0.7 0 48 f 1,010 8 10 1.57 49 320 58 1.5 6.475
3.7 0 12 0.71 69 2.3 5.596 0.879 NR
NRJ013- 0.9 0 52 f 2 8 13 0.92 55 160 7 nd 6.745
3.5 7 16 1.13 24 nd 5.906 0.839 NR
NRJ016- 0.5 0 42 m 66 3 4 1.00 26 320 9 nd 4.877
2.8 1 6 0.16 29 nd 4.285 0.592 NR
NRJ018- 4.2 0 52 f 49 5 2 0.15 26 0 16 nd 4.127
3.2 6 5 0.15 30 nd 4.744 -0.617 NR
NRJ021 - 5.7 0 35 m 69 4 9 0.50 24 80 48 nd 5.026
2.7 0 13 0.12 30 nd 5.092 -0.066 NR
ACPA = Anti-Citrullinated Protein Antikörper; ANA = Antinucleäre Antikörper; CRP = C-Reactives Protein; DAS28 = Disease Activity Score (28 Gelenke); BSG = Blutsenkungsgeschwindigkeit; f = weiblich, m = männlich; HAQ = Gesundheitsabfragebogen (Health Assessment Questionnaire); + = HLA-DRB3 positiv; - = HLA-DRB3 negative; ID = Patient Identification no.; I.U. = International Unit; n.d. = not determined; MTX = Methotrexats; R = Responder, MR = Medium-Responder, NR = Non- Responder
Tabelle 2. Prädiktive Gene der HLA-DRB4 negativen Patienten Subgruppe
Sequenz im Sequenzprotokoll: contig Sequenz aus 5 EST mRNA Sequenzen
Sequenz im Sequenzprotokoll: transcript variant 1, 2, 3 and 4 mRNA (NM_001130527.2 (Variant 2)
Tabelle 3. Prädiktive Gene der HLA-DRB4 negativen Patienten Subgruppe
33 209728_at HLA-DRB4 NM_021983.4
Tabelle 4. HLA-DRB4 Signale erhalten bei den Affymetrix U133 Plus 2 MicroaiTay Analysen
HLA-DRB4 positive RA Subgruppe HLA-DRB4 negative RA Subgruppe
Patient ID Signal Patient ID Si nal
Tabelle 4 zeigt die Signale zum Probeset (209728_at) der Affymetrix Auswertungen innerhalb der HLA-DRB4 positiven (+) und der HLA-DRB4 negativen RA Patienten Subgruppen bestehend aus n=29 und n=23 Patienten der Responder (R), moderaten Responder (MR) und der Non-Responder (NR). Tabelle 5. qPCR Validierung der prädiktiven Gene in (A) HLA-DRB4-positiven und (B) HLA-DRB4-negativen Patienten-Subgruppen.
(A)
Korrelation von Mikroarray- und qPCR-Daten
Pearson Korrelation Spearman Korrelation
FC p-Wert Korrelations ... , Korrelations„ ... FC
Gen Std. E. 95% C.l. ·. p-Wert . „. . . p-Wei
qPCR qPCR -koeffizient -koeffizient v Array
ARG1 1.7 0.32- 10.74 0.07-29.02 0.292 0.68 0.000 0.79 0.000 2.1
CKAP4 1.7 0.64 - 4.44 0.36- 10.43 0.087 0.78 0.000 0.79 0.000 1.6
CRISP3 3.9 0.46-45.76 0.06- 183.20 0.070 0.42 0.001 0.51 0.000 3.4
CST3 1.1 0.29-3.99 0.13-8.88 0.903 0.19 0.188 0.21 0.133 -1.5
GCLM 1.4 0.70-2.82 0.48 - 5.05 0.188 0.30 0.031 0.34 0.015 1.5
KIAA0564 2.1 0.71 -6.48 0.41-28.51 0.036 0.41 0.003 0.22 0.129 1.5
KIAA1324 1.1 0.05-39.70 0.01 - 197.08 0.896 0.49 0.000 0.52 0.000 -2.8
LCN2 4.0 1.08-14.58 0.28-26.27 0.007 0.84 0.000 0.89 0.000 3.1
LTF 3.4 0.23 - 56.21 0.11 -359.63 0.244 0.39 0.005 0.41 0.003 4.4
MMP8 1.1 1.53-45.23 0.13-170.97 0.008 0.76 0.000 0.83 0.000 6.0
1.26-
OLFM4 13.4 0.29 - 304.01 0.005 0.78 0.000 0.91 0.000 4.7
108.43
OSBPL1A 1.4 0.24 - 8.78 0.08-29.34 0.542 0.38 0.005 0.30 0.035 1.7
SIAH1 1.2 0.57-2.49 0.26-4.45 0.499 0.19 0.191 0.16 0.257 -1.7
SLC8A1 2.2 0.85 - 6.40 0.53-15.64 0.010 0.47 0.001 0.31 0.025 1.9
0.353-
SULF2 -1.2 0.25-4.32 0.455 0.68 0.000 0.68 0.000 -1.5
1.697
HLA-DRB4 1.5 0.11-3.04 0.50-5.72 0.118 0.75 0.000 0.87 0.000 0.8
RPLPO 1.0 1.0
Korrelation von Mikroarray- und qPCR-Daten
Pearson Korrelation Spearman Korrelation
FC p-Wert Korrelations FC
Gene Std. Error 95% C.l. Wert Korrelations p-Wert
qPCR qPCR -koeffizient e -koeffizient Array
AQP3 1.6 0.68 - 3.42 0.46 - 6.20 0.067 0.60 0.000 0.60 0.000 1.5
CFD 1.1 0.25 - 3.79 0.08 - 7.41 0.829 0.26 0.065 0.12 0.387 -2.2
DEFA4 -1.8 0.20 - 1.63 0.09 - 3.69 0.060 0.82 0.000 0.89 0.000 -2.5
EIF5A 1.2 0.69 - 2.14 0.41 - 4.14 0.292 -0.01 0.965 -0.01 0.921 1.7
GATA3 1.4 0.65 - 3.03 0.42 - 5.72 0.143 0.37 0.007 0.29 0.041 1.6
KCNE3 1.4 0.51 - 5.12 0.11 - 10.01 0.326 0.10 0.478 -0.06 0.680 -1.6
PAM -1.2 0.09 - 7.41 0.02 - 40.43 0.809 0.39 0.004 0.44 0.001 -1.7
PRDX5 -1.0 0.53 - 1.74 0.35 - 5.26 0.873 0.57 0.000 0.49 0.000 -1.5
RNASE2 -1.3 0.36 - 1.35 0.22 - 2.17 0.141 0.59 0.000 0.63 0.000 -1.8
SLC35E2 1.7 0.54 - 5.37 0.23 - 10.21 0.132 0.49 0.000 0.50 0.000 1.7
SNHG5 1.9 0.78 - 4.69 0.40 - 9.48 0.023 0.66 0.000 0.68 0.000 1.7
SPAG9 1.3 0.40 - 4.61 0.13 - 1 1.28 0.449 0.07 0.618 -0.05 0.710 -1.6
TCN 1 -1.9 0.01 - 30.77 0.01 - 167.35 0.522 0.20 0.157 0.25 0.078 -2.0
TKT 2.1 0.16 - 25.57 0.04 - 79.12 0.274 0.12 0.390 0.10 0.506 -1.8
WLS 1.2 0.39 - 3.67 0.12 - 8.38 0.660 0.61 0.000 0.67 0.000 1.7
RPLPO 1.0 1.0
Die Prüfung der Affymetrix-basierten Ergebnisse zur differentiellen Genexpression von 30 der 32 definierten Biomarker erfolgte mit einer unabhängigen Methode über quantitative Real Time PCR. RPLPO diente als Referenzgen. Die Tabelle beinhaltet die Genexpressionsunterschiede der RT-qPCR ausgedrückt als FC, den Standardfehler ausgedrückt als Std. Error, die Konfidenzintervalle ausgedrückt als C.l. und die
korrespondierenden Probabilitätswerte ausgedrückt als p-Wert qPCR zur Unterscheidung von MTX-Respondern und nicht-Respondern mittels der Analysesoftware REST (Pfaffl et al, 2002). Zum Vergleich sind die Genexpressionsunterschiede der vorangegangenen Mikroarray Analyse angegeben. Die Korrelation der Ergebnisse zu Einzelgenen aus dem Mikroarray und RT-qPCR Vergleich erfolgte über die Software SPSS gemäß den Pearson bzw. Spearman Kriterien.

Claims

Ansprüche
1. Verwendung von mindestens einem Gen ausgewählt aus
ARG1, CKAP4, CRISP3, CST3, GCLM, ΚΙΑΛ0564, KIAA1324, LCN2, LOC654433/PAX8-AS1, LTF, OLFM4, OSBPLIA, MMP8, SIAHl, SLC8A1/BF223010, oder SULF2
und/oder
AQP3, CFD, DEFA4, EIF5A, GATA3, Hs.674648, KCNE3, PAM, PRDX5, RNASE2, TCN1, TKT, SLC35E2, SNHG5, SPAG9, oder WLS in Kombination mit HLA-DRB4 als prädiktive(r) Biomarker zur Vorhersage der Behandlung mit MTX (Methotrexat), wobei das/die Gene bevorzugt in Form ihrer mRNA verwendet werden.
2. Die Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die Patienten in Responder oder Non- Responder klassifiziert werden.
3. Die Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Behandlung mit MTX die Kombination mit Biologika und MTX umfasst.
4. Die Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Vorhersage der Behandlung und/oder die Klassifizierung der Patienten vor Beginn der Behandlung mit MTX (Methotrexat) erfolgt.
5. Die Verwendung gemäß einem Ansprüche 1 bis 4, wobei die Proben vorselektiert werden in HLA-DRB4-positive oder HLA-DRB4-negative Proben.
6. Die Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei inflammatorisch, chronisch entzündliche Erkrankungen, Autoimmunerkrankungen und/oder Tumorerkrankungen behandelt werden.
7. Die Verwendung gemäß Ansprach 6, wobei
- die inflammatorisch, chronisch entzündlichen Erkrankungen und Autoimmunerkranlaingen ausgewählt sind aus
Rheumatoider Arthritis (RA) oder primär chronischer Polyarthritis, juveniler idiopathischer Arthritis, Systemischem Lupus Erythematodes (SLE), Systemischer Sklerose (Sklerodermie), Polymyositis, Dermatomyositis, Inclusion-body Myositis, Psoriasis, Multipler Sklerose, Uveitis, Morbus Crohn, Churg-Strauss-Syndrom (CSS), Morbus Boeck, Morbus Bechterew, Rezidivierender Polychondritis, Colitis ulcerosa, Polymyalgia rheumatica, Riesenzellarteriitis, Vaskulitis, Myositiden,
- Tumorerkrankungen ausgewählt sind aus:
Akuter lymphatischer Leukämie (ALL) (Kinder und Erwachsene), Urothelkarzinom der Harnblase, Mammakarzinom, Medulloblastom, Ependymom (Kinder und Erwachsene), Non- Hodgkin-Lymphom (NHL) (Kinder und Erwachsene), Osteosarkom (Kinder und Erwachsene).
8. Die Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei mindestens 50% der Biomarker-Gene in Kombination mit HLA-DRB4 bestimmt werden.
9. Die Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei im Falle der Behandlung von rheumatoider Arthritis (RA) alle 32 Biomarker-Gene (100%) in Kombination mit HLA- DRB4 bestimmt werden
10. Die Verwendung gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, umfassend die Bestimmung der Anwesenheit des/der mRNA Marker und deren Expressionsstärke in einer Probe.
11. Die Verwendung gemäß Anspruch 10, wobei die Bestimmung mittels
- Sequenz-basierter Methoden, wie serielle Analyse der Genexpression (SAGE), Real-Timequantitative PCR (qPCR), Bead-Technologie, Blot, RNA- oder Next-Generation Sequenzierung, und/oder
- Hybridisierungs-basierter Methoden, wie in situ Hybridisierung, Northern blot, DNA-
Mikro- und Makroarrays,
erfolgt.
12. Die Verwendung gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Probe eine Patientenprobe ist, bevorzugt ausgewählt aus Vollblut, peripheren Blutleukozyten oder aus gereinigten Blutzellen.
13. Die Verwendung von mindestens einem Gen ausgewählt aus
CKAP4, CRISP3, IAA0564, LCN2, OLFM4, MMP8, oder SLC8A1/BF223010
(bevorzugt CRISP3, LCN2, OLFM4 oder MMP8)
und/oder
AQP3, DEFA4, oder SNHG5, gemäß einem der vorangehenden Ansprüche.
14. Verfahren zur Vorhersage der Behandlung mit MTX (Methotrexat), umfassend die Schritte
(i) zur Verfügung stellen einer Patientenprobe,
(ii) Detektieren mindestens eines mRNA Biomarker(s) ausgewählt aus
ARG1, CKAP4, CRISP3, CST3, GCLM, KIAA0564, KIAA1324, LCN2, LOC654433/PAX8-AS1, LTF, OLFM4, OSBPL1A, MMP8, SIAH1, SLC8A1/BF223010, oder SULF2
und/oder
AQP3, CFD, DEFA4, EIF5A, GATA3, Hs.674648, KCNE3, PAM, PRDX5, RNASE2, TCN1, TKT, SLC35E2, SNHG5, SPAG9, oder WLS
in Kombination mit HLA-DRB4
in der Patientenprobe,
und
(iii) Bestimmen der relativen Expressionsstärke des mindestens einen mRNA Biomarkers und von HLA-DRB4 durch Vergleich mit Referenzstandard(s) und/oder Kontrollprobe(n), wobei die Patienten in Responder oder Non-Responder klassifiziert werden.
15. Das Verfahren gemäß Anspruch 14, wobei die Behandlung mit MTX die Kombination mit Biologika und MTX umfasst
16. Das Verfahren gemäß Anspruch 14 oder 15, wobei die Vorhersage der Behandlung und/oder die Klassifizierung der Patienten vor Beginn der Behandlung mit MTX (Methotrexat) erfolgt.
17. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 14 bis 16, wobei die Probe(n) vorselektiert wird/werden in HLA-DRB4-positive oder HLA-DRB4-negative Probe(n).
18. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 14 bis 17, wobei die Probe einer Vorbehandlung unterzogen wird, umfassend die Entfernung von Globin-mRNA, reverse Transkription der Total mRNA und/oder Markierung mit Label.
19. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 14 bis 18, wobei das Detektieren in Schritt (ii) die Bestimmung der Anwesenheit der mRNA Marker und deren Expressionsstärke umfasst,
oder die Bestimmung der Anwesenheit der miRNA Marker umfasst.
20. Das Verfahren gemäß Anspruch 19, wobei die Bestimmung mittels
- Sequenz-basierter Methoden, wie serielle Analyse der Genexpression (SAGE), Real-Timequantitative PCR (qPCR), Bead-Technologie, Blot, RNA- oder Next-Generation Sequenzierung,
und/oder
- Hybridisierungs-basierter Methoden, wie in situ Hybridisierung, Northern blot, DNA- Mikro- und Makroarrays,
erfolgt.
21. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 14 bis 20, wobei inflammatorisch, chronisch entzündliche Erkrankungen, Autoimmunerkrankungen und/oder Tumorerkrankungen behandelt werden.
22. Das Verfahren gemäß Anspruch 21, wobei
- die inflammatorisch, chronisch entzündlichen Erkrankungen und Autoimmunerkrankungen ausgewählt sind aus
Rheumatoider Arthritis (RA) oder primär chronischer Polyarthritis, juveniler idiopathischer Arthritis, Systemischem Lupus Erythematodes (SLE), Systemischer Sklerose (Sklerodermie), Polymyositis, Dermatomyositis, Inclusion-body Myositis, Psoriasis, Multipler Sklerose, Uveitis, Morbus Crohn, Churg-Strauss-Syndrom (CSS), Morbus Boeck, Morbus Bechterew, Rezidivierender Polychondritis, Colitis ulcerosa, Polymyalgia rheumatica, Riesenzellarteriitis, Vaskulitis, Myositiden,
- Tumorerkrankungen ausgewählt sind aus:
Akuter lymphatischer Leukämie (ALL) (Kinder und Erwachsene), Urothelkarzinom der Harnblase, Mammakarzinom, Medulloblastom, Ependymom (Kinder und Erwachsene), Non- Hodgkin-Lymphom (NHL) (Kinder und Erwachsene), Osteosarkom (Kinder und Erwachsene).
23. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 14 bis 22, wobei mindestens 50% der mRNA Biomarker-Gene in Kombination mit HLA-DRB4 detektiert werden.
24. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 14 bis 23, wobei im Falle der Behandlung von rheumatoider Arthritis (RA) alle 32 Biomarker-Gene (100%) in Kombination mit HLA- DRB4 bestimmt werden
25. Das Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche 14 bis 24, wobei die Probe eine Patientenprobe ist, bevorzugt ausgewählt aus Vollblut, peripheren Blutleukozyten oder aus gereinigten Blutzellen.
26. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 14 bis 25, wobei in Schritt (ii) mindestens ein mRNA Biomarker(s) ausgewählt aus
CKAP4, CRISP3, KIAA0564, LCN2, OLFM4, MMP8, oder SLC8A1/BF223010
(bevorzugt CRISP3, LCN2, OLFM4 oder MMP8)
und/oder
AQP3, DEFA4, oder SNHG5 in Kombination mit IILA-DRB4 in der Patientenprobe detektiert wird.
27. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 14 bis 26, wobei in Schritt (iii)
Referenzstandard(s) Probe(n) enthaltend ein oder mehrere Haushaltgen(e) und Kontrollprobe(n) Probe(n) von Respondern und/oder Non-Respondern sind.
28. Kit zur Vorhersage der Behandlung mit MTX (Methotrexat), umfassend
(a) Mittel zur Durchführung zum Detektieren mindestens eines rnRNA Biomarker(s) ausgewählt aus
ARG1, C AP4. CRISP3, CST3, GCLM, KJAA0564, KIAA1324, LCN2, LOC654433/PAX8-AS1, LTF, OLFM4, OSBPL1A, MMP8, SIAH1, SLC8A1/BF223010, oder SULF2
und/oder
AQP3, CFD, DEFA4, EIF5A, GATA3, Hs.674648, KCNE3, PAM, PRDX5, RNASE2, TCN1, TKT, SLC35E2, SNHG5, SPAG9, oder WLS
in Kombination mit HLA-DRB4
in Patientenproben,
(b) Referenzstandard(s) umfassend Probe(n) enthaltend ein oder mehrere Haushaltgen(e),
(c) Kontrollprobe(n) umfassend Probe(n) von Respondern und/oder Non- Respondern.
29. Kit gemäß Anspruch 28, wobei die Mittel (a) zur Durchführung zum Detektieren mindestens eines mRNA Biomarker(s) ausgewählt aus
CKAP4, CRISP3, KIAA0564, LCN2, OLFM4, MMP8, oder SLC8A1/BF223010
(bevorzugt CRISP3, LCN2, OLFM4 oder MMP8)
und/oder
AQP3, DEFA4, oder SNHG5, sind.
30. Kit gemäß Anspruch 28 oder 29, wobei die Mittel (a) zur Durchführung zum Detektieren mindestens eines mRNA Biomarker(s) in Patientenproben umfassen:
Arrays, Chips,
Primer,
Marker und Label,
und/oder Kombinationen davon.
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