EP1611255A2

EP1611255A2 - Verfahren zur erkennung akuter generalisierter entzündlicher zustände (sirs), sepsis, sepsis ähnlichen zuständen und systemischen infektionen

Info

Publication number: EP1611255A2
Application number: EP04724591A
Authority: EP
Inventors: Stefan Russwurm; Konrad Reinhart; Hans-Peter Saluz; Eberhard Straube; Peter F. Zipfel; Hans-Peter Deigner
Original assignee: SIRS Lab GmbH
Current assignee: SIRS Lab GmbH
Priority date: 2003-04-02
Filing date: 2004-03-31
Publication date: 2006-01-04
Also published as: US20080070235A1; EP2366799A3; WO2004087949A3; WO2004087949A2; EP2366799A2

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur in vitro Erkennung von SIRS, Sepsis und/oder sepsisähnlichen Zuständen, das es ermöglicht, den Schweregrad und/oder den therapiebegleitenden Verlauf von Sepsis und schweren Infektionen, insbesondere sepsisähnlichen systemischen Infektionen zu beurteilen. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von rekombinant oder synthetisch hergestellten Nukleinsäuresequenzen oder davon abgeleiteten Peptidsequenzen als Kalibrator in Sepsis-Assays und/oder zur Bewertung der Wirkung und Toxizität beim Wirkstoffscreening und/oder zur Herstellung von Therapeutika zur Vorbeugung und Behandlung von SIRS, Sepsis, sepsisähnlichen systemischen entzündlichen Zuständen und sepsisähnlichen systemischen Infektionen.

Description

Beschreibung

Verfahren zur Erkennung akuter generalisierter entzündlicher Zustände (SIRS). Sepsis, sepsisähnlichen Zuständen und systemischen Infektionen

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur in vitro Erkennung akuter generalisierter entzündlicher Zustände (SIRS) gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 30, sowie die Verwendung von rekombinant oder synthetisch hergestellten Nukleinsäuresequenzen oder davon abgeleiteten Peptidsequenzen gemäß Anspruch 57.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur in vitro Erkennung von Sepsis und/oder sepsisähnlichen Zuständen gemäß Anspruch 2 oder Anspruch 31 , sowie die Verwendung von rekombinant oder synthetisch hergestellten Nukleinsäuresequenzen oder davon abgeleiteten Peptidsequenzen gemäß Anspruch 58.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur in vitro Erkennung von schwerer Sepsis gemäß Anspruch 3 oder Anspruch 32, sowie die Verwendung von rekombinant oder synthetisch hergestellten Nukleinsäuresequenzen oder davon abgeleiteten Peptidsequenzen gemäß Anspruch 59.

Zur Beschreibung der vorliegenden Erfindung gehört ein 1430-seitiges Sequenzprotokoll, welches drei Teile umfasst, nämlich die Teile I bis III. Teil I des Sequenzprotokolls umfasst die SEQUENZ-lDs: 1.1 bis 1.6242, Teil II umfasst die SEOUENZ-IDs: 11.1 bis 11.130 und Teil III umfasst die SEQUENZ-lDs III.1 bis 111.4168.

Das vollständige Sequenzprotokoll mit den Teilen I bis III ist Bestandteil der Beschreibung und somit Bestandteil der Offenbarung der vorliegenden Erfindung.

Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Genaktivitätsmarker für die Diagnose und Therapieoptimierung von akuten generalisierten entzündlichen Zuständen (SIRS). Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Erkennung akuter generalisierter entzündlicher Zustände und/oder, Sepsis, sepsisähnlichen Zuständen, schwerer Sepsis und systemischen Infektionen ebenso wie zur entsprechenden Therapieoptimierung bei akuten generalisierten entzündlichen Zuständen (SIRS).

Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung neue Diagnosemöglichkeiten, die sich aus experimentell abgesicherten Erkenntnissen im Zusammenhang mit dem Auftreten von Änderungen der Genaktivitäten (Transkription und nachfolgende Proteinexpression) bei Patienten mit akuten generalisierten entzündlichen Zuständen (SIRS) ableiten lassen.

Trotz Fortschritten im pathophysiologischen Verständnis und der supportiven Behandlung von Intensivpatienten ist SIRS eine bei Patienten auf Intensivstationen sehr häufig auftretende und erheblich zur Sterblichkeit beitragende Erkrankung [2-5].

Im internationalen Schrifttum haben sich zwischenzeitlich die Kriterien der Konsensuskonferenz des „American College of Chest Physicians/Society of Critical Gare Medicine Consensus Conference (ACCP/SCCM)" aus dem Jahr 1992 am breitesten zur Definition des SIRS-Begriffs durchgesetzt [4]. Entsprechend dieser Definition wird SIRS (in diesem Patent als „akute generalisierte entzündliche Zustände" übersetzt) als die systemische Antwort des inflammatorischen Systems auf einen nichtinfektiösen Reiz definiert. Dazu müssen mindestens zwei der folgenden klinischen Kriterien erfüllt sein: Fieber >38°C oder Hypothermie <36°C, eine Leukozytose >12G/I oder eine Leukopenie <4G/I bzw. eine Linksverschiebung im Differentialblutbild, eine Herzfrequenz von über 90/min, eine Tachypnoe >20 Atemzüge/min oder ein PaCO2 <4,3 kPa.

Die Sterblichkeit des SIRS beträgt ca. 20 % und steigt bei Entwicklung stärkerer Organfunktionsstörungen weiter an [6]. Der orbiditäts- und Letalitätsbeitrag von SIRS ist dabei von fachübergreifender Bedeutung. Dadurch werden in zunehmenden Maße die Behandlungserfolge der fortgeschrittensten oder experimentellen Therapieverfahren zahlreicher medizinischer Fachgebiete (z.B. Herzchirurgie, Traumatologie, Transplantationsmedizin, Hämatologie/ Onkologie) gefährdet, da diesen ohne Ausnahme eine Erhöhung des Risikos zur Ausbildung akuter generalisierter entzündlicher Zustände immanent ist. Die Senkung der Morbidität und Letalität einer Vielzahl von schwer erkrankten Patienten ist daher an einen gleichzeitigen Fortschritt in der Vorbeugung, Behandlung und insbesondere der Erkennung und Verlaufsbeobachtung von akuten generalisierten entzündlichen Zuständen gebunden.

SIRS ist ein Ergebnis von komplexen und stark heterogenen molekularen Vorgängen, die gekennzeichnet sind durch eine Einbeziehung von vielen Komponenten und deren Wechselwirkungen auf jeder organisatorischen Ebene des menschlichen Körpers: Gene, Zellen, Gewebe, Organe. Die Komplexität der zugrundeliegenden biologischen und immunologischen Prozesse haben viele Arten von Forschungsstudien hervorgerufen, die einen weiten Bereich klinischer Aspekte umfassen. Eines der hieraus zu erkennenden Ergebnisse war, dass die Bewertung neuerer Therapien durch die heute verwendete relativ unspezifische, klinischbasierte Definition, welche die molekularen Mechanismen in nicht ausreichender Weise wiederspiegeln, erschwert wird [7].

Leider zählen Sepsis und konsekutive Organfunktionsstörungen auch heute noch zu den Haupttodesursache auf nichtkardiologischen Intensivstationen [1-3]. Man nimmt an, daß in den U.S.A. jährlich ca. 400.000 Patienten an einer Sepsis erkranken [4]. Die Letalität beträgt ca. 40 % und steigt bei Entwicklung eines Schocks auf 70-80 % an [5,6]. Die von der Grunderkrankung der Patienten und der zugrundeliegenden Infektion unabhängige Exzessletalität beträgt bis zu 35 % [8].

Im internationalen Schrifttum haben sich zwischenzeitlich ebenfalls die Kriterien der Konsensuskonferenz des „American College of Chest Physicians/Society of Critical Gare Medicine Consensus Conference (ACCP/SCCM)" aus dem Jahr 1992 am breitesten zur Definition des Sepsisbegriffs durchgesetzt [4]. Entsprechend dieser Kriterien [4] werden die klinisch definierten Schweregrade „systemic inflammatory response syndrom" (SIRS), „sepsis", „severe sepsis" und „septic shock" unterschieden. Als SIRS (in diesem Patent als „sepsisähnlicher akuter entzündlicher Zustand übersetzt) wird dabei die systemische Antwort des inflammatorischen Systems auf einen infektiösen oder nichtinfektiösen Reiz definiert. Dazu müssen mindestens zwei der folgenden klinischen Kriterien erfüllt sein: Fieber >38°C oder Hypothermie <36°C, eine Leukozytose >12G/I oder eine Leukopenie <4G/I bzw. eine Linksverschiebung im Differentialblutbild, eine Herzfrequenz von über 90/min, eine Tachypnoe >20 Atemzüge/min oder ein PaCO2 <4,3 kPa. Als Sepsis werden solche klinischen Zustände definiert, bei denen die SIRS-Kriterien erfüllt sind und ursächlich eine Infektion nachgewiesen wird oder zumindest sehr wahrscheinlich ist. Eine schwere Sepsis ist vom zusätzlichen Auftreten von Organfehlfunktionen gekennzeichnet. Häufige Organfehlfunktionen sind Änderungen der Bewusstseinslage, eine Oligurie, eine Laktazidose oder eine sepsisinduzierte Hypotension mit einem systolischen Blutdruck von weniger als 90 mmHg bzw. ein Druckabfall um mehr als 40 mmHg vom Ausgangswert. Wenn eine solche Hypotension nicht durch die Verabreichung von Kristalloiden und/oder Kolloiden zu beheben ist und es zusätzlich zu einer Katecholaminpflichtigkeit des Patienten kommt, so spricht man von einem septischen Schock. Dieser wird bei etwa 20 % aller Sepsispatienten nachgewiesen.

Die klinische Anwendung von Katecholaminen bei der Behandlung von Patienten mit einer schweren Sepsis ist stark subjektiv geprägt. Während viele Ärzte auf den Abfall des Blutdruckes mit der Verabreichung großer Mengen von Infusionslösungen reagieren und so den Einsatz von Katecholaminen vermeiden, gibt es auch viele Ärzte, welche ein solches Vorgehen ablehnen und bei gleicher klinischer Schwere der Erkrankung viel frühzeitiger Katecholamine verabreichen und diese auch noch höher dosieren. Konsequenz dessen ist, dass in der täglichen Praxis Patienten mit gleicher klinischer Schwere nur auf Grund rein subjektiver Gründe in die Gruppe „severe sepsis" oder „septic shock" [4] eingeordnet werden können. Vor diesem Hintergrund hat es sich im internationalen Schrifttum durchgesetzt, Patienten mit den Schweregraden „severe sepsis" und „septic shock" [4] in einer Gruppe zusammenzufassen. Der in dieser Patentschrift benutzte Begriff „schwere Sepsis" wird deshalb entsprechend der o.g. Konsensuskonferenzdefinition auf Patienten mit Sepsis plus zusätzlichem Nachweis von Organfunktionsstörungen angewendet und umfasst damit alle Patienten der Gruppen „severe sepsis" und „septic shock" entsprechend [4] Die Sterblichkeit der Sepsis beträgt ca. 40 % und steigt bei Entwicklung einer schweren Sepsis auf 70-80 % an [5,6]. Der Morbiditäts- und Letalitätsbeitrag von Sepsis und schwerer Sepsis ist von fachübergreifender Bedeutung. Im Vergleich dazu stieg die Häufigkeit der Erkrankungen kontinuierlich an (z.B. zwischen 1979 und 1987 um 139% von 73,6 auf 176 Krankheitsfälle je 100.000 Krankenhauspatienten) [7]. Dadurch werden in zunehmenden Maße die Behandlungeerfolge der fortgeschrittensten oder experimentellen Therapieverfahren zahlreicher medizinischer Fachgebiete (z.B. Viszeralchirurgie,

Transplantationsmedizin, Hämatologie/Onkologie) gefährdet, da diesen ohne Ausnahme eine Erhöhung des Sepsisrisikos immanent ist. Die Senkung der Morbidität und Letalität einer Vielzahl von schwer erkrankten Patienten ist daher an einen gleichzeitigen Fortschritt in der Vorbeugung, Behandlung und insbesondere der Erkennung und Verlaufsbeobachtung der Sepsis und schweren Sepsis gebunden. Von namhaften Autoren wird deshalb schon lange kritisiert, dass zu Lasten einer verbesserten Sepsisdiagnose in der vergangenen Dekade zuviel Energie und finanzielle Ressourcen für die Suche nach Sepsistherapeutika aufgewendet wurden.

Sepsis ist ein Ergebnis von komplexen und stark heterogenen molekularen Vorgängen, die gekennzeichnet sind durch eine Einbeziehung von vielen Komponenten und deren Wechselwirkungen auf jeder organisatorischen Ebene des menschlichen Körpers: Gene, Zellen, Gewebe, Organe. Die Komplexität der zugrundeliegenden biologischen und immunologischen Prozesse haben viele Arten von Forschungsstudien hervorgerufen, die einen weiten Bereich klinischer Aspekte umfassen. Eines der hieraus zu erkennenden Ergebnisse war, daß die Bewertung neuer Sepsis-Therapien durch relativ unspezifische, klinisch-basierte Einschlusskriterien, welche die molekularen Mechanismen in nicht ausreichender Weise wiedergeben, erschwert wird [9].

Daher ist ein dringender Bedarf für innovative diagnostische Mittel entstanden, welche die Fähigkeit des Fachmanns verbessern sollen, Patienten mit SIRS, Sepsis, sepsisähnlichen Zuständen, schwerer Sepsis und systemischen Infektionen frühzeitig zu diagnostizieren, die Schwere einer SIRS auf molekularer Ebene messbar zu machen und im klinischem Verlauf vergleichbar zu gestalten, und bezüglich der individuellen Prognose und dem Ansprechen auf spezifische Behandlungen Aussagen abzuleiten.

Der Morbiditäts- und Letalitätsbeitrag der Sepsis ist von fachübergreifender Bedeutung. In den letzten Jahrzehnten veränderte sich die Letalität der Sepsis nur unwesentlich. Im Vergleich dazu stieg die Inzidenz kontinuierlich an (z.B. zwischen 1979 und 1987 um 139 % von 73,6 auf 176 pro 100.000 Krankenhauspatienten) [7]. Dadurch werden in zunehmenden Maße die Behandlungserfolge der fortgeschrittensten oder experimentellen Therapieverfahren zahlreicher Fachgebiete (Viszeralchirurgie, Transplantationsmedizin, Hämatologie/Onkologie) gefährdet, da diesen ohne Ausnahme eine Erhöhung des Sepsisrisikos immanent ist. Die Senkung der Morbidität und Letalität einer Vielzahl von schwer erkrankten Patienten ist daher an einen gleichzeitigen Fortschritt in der Prophylaxe, Behandlung und insbesondere der Diagnose der Sepsis gebunden.

Sepsis ist ein Ergebnis von stark heterogenen molekularen Vorgängen, die gekennzeichnet sind durch eine Einbeziehung von vielen Komponenten und deren Wechselwirkungen auf jeder organisatorischen Ebene des menschlichen Körpers: Gene, Zellen, Gewebe, Organe. Die Komplexität der zugrundeliegenden biologischen und immunologischen Prozesse haben viele Arten von Forschungsstudien hervorgerufen, die einen weiten Bereich klinischer Aspekte umfassen. Eines der hieraus zu erkennenden Ergebnisse war, daß die Bewertung neuer Sepsis-Therapien durch relativ unspezifische, klinisch-basierte Einschlusskriterien, welche die molekularen Mechanismen in nicht ausreichender Weise wiedergeben, erschwert wird [9].

Technologische Fortschritte, insbesondere die Entwicklung der Microarray- Technologie, versetzen den Fachmann nun in die Lage, 10 000 oder mehr Gene und deren Genprodukte gleichzeitig zu vergleichen. Die Anwendung solcher Microarray- Technologien kann nun Hinweise auf den Status von Gesundheit, Regulationsmechanismen, biochemischer Wechselwirkungen und

Signalisierungsnetzwerken geben. Das Verbessern des Verständnisses darüber, wie ein Organismus auf Infektionen reagiert, sollte die Entwicklung von verstärkten Erkennungs-, Diagnose- und Behandlungsmodalitäten für systemische Erkrankungen erleichtern.

Microarrays stammen vom „Southern blotting" [10] ab, was die erste Herangehensweise darstellt, DNA-Moleküle in einer räumlich ansprechbaren Art und Weise auf einer festen Matrix zu immobilisieren. Die ersten Microarrays bestanden aus DNA-Fragmenten, oft mit unbekannter Sequenz, und wurden auf eine poröse Membran (normalerweise Nylon) punktweise aufgebracht. Routinegemäß wurden cDNA, genomische DNA oder Plasmid-Bilbliotheken verwendet, und das hybridisierte Material wurde mit einer radioaktiven Gruppe markiert [11-13].

Kürzlich hat es die Verwendung von Glas als Substrat und Fluoreszenz zur Detektion zusammen mit der Entwicklung neuer Technologien für die Synthese und für das Aufbringen der Nukleinsäuren in sehr hohen Dichten erlaubt, die Nukleinsäurearrays zu miniaturisieren bei gleichzeitiger Erhöhung des experimentellen Durchsatzes und des Informationsgehaltes [14-16].

Weiterhin ist aus WO 03/002763 bekannt, dass Microarrays grundsätzlich für die Diagnose von Sepsis und sepsisähnlichen Zuständen verwendet werden können.

Eine Begründung für die Anwendbarkeit der Microarray-Technologie wurde zunächst durch klinische Untersuchungen auf dem Gebiet der Krebsforschung geliefert. Hier haben Expressionsprofile ihre Nützlichkeit bei der Identifizierung von Aktivitäten einzelner Gene oder Gengruppen gezeigt, die mit bestimmten klinischen Phänotypen korrelieren [17]. Durch die Analyse vieler Proben, die von Individuen mit oder ohne akute Leukämie oder diffuse Lymphome großer B-Zellen stammten, wurden Genexpressionsmarker (RNA) gefunden und auf die Klassifizierung dieser Krebsarten angewandt [17,18]. Golub et al. haben herausgefunden, daß verläßliche Vorhersagen nicht aufgrund von irgendeinem einzelnen Gen gemacht werden können, aber daß Vorhersagen, die auf den Expressionsspiegeln von 53 Genen (ausgewählt aus über 6000 Genen, die auf den Arrays vertreten waren) basieren, sehr genau sind [17]. Alisadeh et al. [18] untersuchten große B-Zell Lymphome (DLBCL). Die Autoren erarbeiteten Expressionsprofile mit einem „Lymphochip", einem Microarray, der 18 000 Klone komplementärer DNA trug und entwickelt worden war, um Gene zu überwachen, die in normale und abnormale Lymphozytenentwicklung involviert sind. Unter Verwendung von Cluster-Analyse waren sie in der Lage, DILBCL in zwei Kategorien einzuteilen, welche starke Unterschiede bezüglich der Überlebenschancen der Patienten aufzeigten. Die Genexpressionsprofile dieser Untergruppen entsprachen zwei bedeutsamer Stadien der B-Zelldifferenzierung.

Besonders wertvoll hat sich die Bestimmung von Genexpressionsprofilen zur differentialdiagnostischen Unterscheidung von Krankheitserscheinungen, die auf systemische Microbielle Infektionen zurückzuführen sind, von anderen Krankheitserscheinungen nichtinfektiöser Ätiologie erwiesen, die aufgrund ihres klinischen Erscheinungsbildes auf eine Sepsis hindeuten könnten, jedoch in Wirklichkeit nicht auf eine systemische Microbielle Infektion zurückzuführen sind, z.B. von Krankheitserscheinungen, die auf nicht-infektiöse Entzündungen einzelner Organe zurückzuführen sind [19-22]. Die Messung von Genexpressionprofilen zur Diagnose von SIRS aus Körperflüssigkeiten wurde noch nicht beschrieben.

Ausgangspunkt für die in der vorliegenden Patentanmeldung offenbarten Erfindung ist die Erkenntnis, daß vor der Diagnose von SIRS, Sepsis, sepsisähnlichen Zuständen, schwerer Sepsis und systemischen Infektionen in biologischen Proben eines Individuums sich von normalen Werten unterscheidende RNA-Spiegel, bzw. sich davon ableitbare Peptid- und Teilpeptid-Spiegei in einem Serum oder Plasma eines Patienten, bei dem ein SIRS-Risiko besteht bzw. bei dem SIRS-typische Krankheitserscheinungen festgestellt werden, feststellbar sind.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, das die Erkennung, die Beurteilung des Schweregrads und/oder die therapiebegleitende Verlaufsbeurteilung von SIRS und/oder Sepsis und/oder schwerer Sepsis und/oder systemischen Infektionen, ermöglicht. Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren mit den kennzeichnenden Merkmalen der Ansprüche 1 bis 3 und 30 bis 32 gelöst.

Weiterhin liegt der voriiegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, eine Verwendungsmöglichkeit von Markern in dem Verfahren gemäß Anspruch 1-56 zur Verfügung zu stellen.

Diese Aufgabe wird durch die Verwendungen gemäß den Ansprüchen 57 bis 59 gelöst.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man in einer Probe einer biologischen Flüssigkeit eines Individuums die Aktivität eines oder mehrerer Markergene bestimmt und aus der festgestellten Anwesenheit und/oder Menge des bestimmten Genprodukts SIRS und/oder den Erfolg einer therapeutischen Behandlung ableiten kann.

Eine Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren zur in vitro Erkennung von SIRS folgende Schritte umfaßt: a) Isolieren von Proben-RNA aus einer aus einem Säuger stammenden Probe; b) Markieren der Proben-RNA und/oder wenigstens einer DNA, die ein für SIRS spezifisches Gen oder Genfragment ist, mit einem detektierbaren Marker; c) In-Kontakt-Bringen der Proben-RNA mit der DNA unter Hybridisierungsbedingungen; d) In-Kontakt-Bringen von Kontroll-RNA, welche eine Kontrolle für nichtpathologische Zustände darstellt, mit wenigstens einer DNA, unter Hybridisierungsbedingungen, wobei die DNA ein für SIRS spezifisches Gen oder Genfragment ist; e) quantitatives Erfassen der Markierungssignale der hybridisierten Proben-RNA und der Kontroll-RNA; f) Vergleichen der quantitativen Daten der Markierungssignale, um eine Aussage zu treffen, ob für SIRS spezifische Gene oder Genfragmente in der Probe stärker oder schwächer exprimiert sind als in der Kontrolle. Eine alternative Ausführungsform ist dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren zur in vitro Erkennung von Sepsis und/oder sepsisähnlichen Zuständen folgende Schritte umfasst:

g) Isolieren von Proben-RNA aus einer aus einem Säuger stammenden Probe;

h) Markieren der Proben-RNA und/oder wenigstens einer DNA, die ein für Sepsis und/oder sepsisähnliche Zustände spezifisches Gen oder Genfragment ist, mit einem detektierbaren Marker;

i) In-Kontakt-Bringen der Proben-RNA mit der DNA unter Hybridisierungsbedingungen;

j) In-Kontakt-Bringen von Kontroll-RNA, welche eine Kontrolle für nichtpathologische Zustände darstellt, mit wenigstens einer DNA, unter Hybridisierungsbedingungen, wobei die DNA ein für Sepsis und/oder sepsisähnliche Zustände spezifisches Gen oder Genfragment ist;

k) quantitatives Erfassen der Markierungssignale der hybridisierten Proben-RNA und der Kontroll-RNA;

I) Vergleichen der quantitativen Daten der Markierungssignale, um eine Aussage zu treffen, ob für Sepsis und/oder sepsisähnliche Zustände spezifische Gene oder Genfragmente in der Probe stärker oder schwächer exprimiert sind als in der Kontrolle.

Eine weitere alternative Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren zur in vitro Erkennung von schwerer Sepsis, folgende Schritte umfasst:

m) Isolieren von Proben-RNA aus einer aus einem Säuger stammenden Probe;

n) Markieren der Proben-RNA und/oder wenigstens einer DNA, die ein für schwere Sepsis spezifisches Gen oder Genfragment ist, mit einem detektierbaren Marker;

o) In-Kontakt-Bringen der Proben-RNA mit der DNA unter Hybridisierungsbedingungen; p) In-Kontakt-Bringen von Kontroll-RNA, welche eine Kontrolle für nichtpathologische Zustände darstellt, mit wenigstens einer DNA, unter Hybridisierungsbedingungen, wobei die DNA ein für schwere Sepsis spezifisches Gen oder Genfragment ist;

q) quantitatives Erfassen der Markierungssignale der hybridisierten Proben-RNA und der Kontroll-RNA;

r) Vergleichen der quantitativen Daten der Markierungssignale, um eine Aussage zu treffen, ob für schwere Sepsis spezifische Gene oder Genfragmente in der Probe stärker oder schwächer exprimiert sind als in der Kontrolle.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß man die Kontroll-RNA vor dem Messen der Proben-RNA mit der DNA hybridisiert und die Markierungssignale des Kontroll-RNA/DNA-Komplexes erfaßt und gegebenenfalls in Form einer Kalibrierkurve oder -tabelle ablegt.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß als Proben-RNA mRNA verwendet wird.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die DNA an vorbestimmten Bereichen auf einem Träger in Form eines Microarrays angeordnet, insbesondere immobilisiert, wird.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren zur differentialdiagnostischen Früherkennung, zur Kontrolle des therapeutischen Verlaufs, zur Risikoabschätzung für Patienten sowie zur post mortem Diagnose von SIRS und/oder Sepsis und/oder schwerer Sepsis und/oder systemischen Infektionen und/oder septischen Zuständen und/oder Infektionen, eingesetzt wird.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die Probe ausgewählt wird aus: Körperflüssigkeiten, insbesondere Blut, Liquor, Urin, Ascitesflüssigkeit, Seminalflüssigkeit, Speichel, Punktat; Zellinhalt oder eine Mischung davon. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß Zellproben gegebenenfalls einer lytischen Behandlung unterzogen werden, um deren Zellinhalte freizusetzen.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Säuger um einen Menschen handelt.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß das für SIRS spezifische Gen oder Genfragment ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus SEQUENZ-ID No. III.1 bis SEQUENZ-ID No. 111.4168, sowie Genfragmenten davon mit wenigstens 5-2000, bevorzugt 20-200, mehr bevorzugt 20-80 Nukleotiden.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß das für Sepsis und/oder sepsisähnliche Zustände spezifische Gen oder Genfragment ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus SEQENZ-ID No. 1.1 bis SEQUENZ- ID No. I.6242, sowie Genfragmenten davon mit wenigstens 5-2000, bevorzugt 20- 200, mehr bevorzugt 20-80 Nukleotiden.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß das für schwere Sepsis spezifische Gen oder Genfragment ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus SEQUENZ-ID No." 11.1 bis SEQUENZ-ID No. 11.130, sowie Genfragmenten davon mit wenigstens 5-2000, bevorzugt 20-200, mehr bevorzugt 20-80 Nukleotiden.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass die immobilisierten Sonden markiert werden. Für diese Ausführungsform finden selbstkomplementäre Oligonukleotide, so genannte Molecular beacons, als Sonden Verwendung. Sie tragen an ihren Enden ein Fluorophor/Quencher-Paar, so daß sie in Abwesenheit einer komplementären Sequenz in einer gefalteten Haarnadelstruktur vorliegen und erst mit einer entsprechenden Probensequenz ein Fluoreszenzsignal liefern. Die Haamadelstruktur der Molecular Beacons ist so lange stabil, bis die Probe an der spezifischen Fängersequenzsequenz hybridisiert, was zu einer Konformationsänderung und damit auch Freisetzung der Reporterfluoreszenz führt.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 2 bis 100 unterschiedliche cDNAs verwendet werden. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 200 unterschiedliche cDNAs verwendet werden.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 200 bis 500 unterschiedliche cDNAs verwendet werden.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 500 bis 1000 unterschiedliche cDNAs verwendet werden.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 1000 bis 2000 unterschiedliche cDNAs verwendet werden.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die als cDNA von den in Anspruch 10 aufgelisteten Genen ersetzt wird durch synthetische Analoga, sowie Peptidonukleinsäuren.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die synthetische Analoga der Gene 5-100, insbesondere ca. 70 Basenpaare umfassen.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß als detektierbarer Marker ein radioaktiver Marker, insbesondere ³²P, ¹⁴C, ¹²⁵l, ¹⁵⁵Ep, ³³P oder ³H verwendet wird.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß als detektierbarer Marker ein nicht radioaktiver Marker, insbesondere ein Färb- oder Fluoreszenzmarker, ein Enzymmarker oder Immunmarker, und/oder quantum dots oder ein elektrisch messbares Signal, insbesondere Potential- und/oder Leitfähigkeits- und/oder Kapazitätsänderung bei Hybridisierungen, verwendet wird.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die Proben-RNA und Kontroll-RNA dieselbe Markierung tragen.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die Proben-RNA und Kontroll-RNA unterschiedliche Markierungen tragen.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die cDNA-Sonden auf Glas oder Kunststoff, immobilisiert werden. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die einzelnen cDNA Moleküle über eine kovalente Bindung an das Trägermaterial immobilisiert werden.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die einzelnen cDNA Moleküle mittels Adsorption, insbesondere mittels elektrostatischer- und/oder Dipol-Dipol- und/oder hydrophober Wechselwirkungen und/oder Wasserstoffbrücken an das Trägermaterial immobilisiert werden.

Eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur in vitro Erkennung von SIRS ist dadurch gekennzeichnet, daß es folgende Schritte umfaßt: a) Isolieren von Proben-Peptiden aus einer aus einem Säuger stammenden Probe; b) Markieren der Proben-Peptide mit einem detektierbaren Marker;

c) In-Kontakt-Bringen der markierten Proben-Peptide mit wenigstens einem Antikörper oder dessen bindendem Fragment, wobei der Antikörper ein für SIRS spezifisches Peptid- oder Peptidfragment bindet; d) In-Kontakt-Bringen von markierten Kontroll-Peptiden, welche aus gesunden Probanden stammen, mit wenigstens einem, in Form eines Microarray auf einem Träger immobilisierten Antikörper oder dessen bindendes Fragment, wobei der Antikörper ein für SIRS spezifisches Peptid- oder Peptidfragment bindet; e) quantitatives Erfassen der Markierungssignale der Proben-Peptide und der Kontroll-Peptide; f) Vergleichen der quantitativen Daten der Markierungssignale, um eine Aussage zu treffen, ob für SIRS spezifisches Gene oder Genfragmente in der Probe stärker oder schwächer exprimiert sind als in der Kontrolle.

Eine weitere alternative Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur in vitro Erkennung von Sepsis und/oder sepsisähnlichen Zuständen ist dadurch gekennzeichnet, daß es folgende Schritte umfaßt:

g) Isolieren von Proben-Peptiden aus einer aus einem Säuger stammenden Probe;

h) Markieren der Proben-Peptide mit einem detektierbaren Marker;

i) In-Kontakt-Bringen der markierten Proben-Peptide mit wenigstens einem Antikörper oder dessen bindendem Fragment, wobei der Antikörper ein für Sepsis und/oder sepsisähnliche Zustände spezifisches Peptid- oder Peptidfragment bindet;

j) In-Kontakt-Bringen von markierten Kontroll-Peptiden, welche aus gesunden Probanden stammen, mit wenigstens einem, in Form eines Microarray auf einem Träger immobilisierten Antikörper oder dessen bindendes Fragment, wobei der Antikörper ein für Sepsis und/oder sepsisähnliche Zustände spezifisches Peptid- oder Peptidfragment bindet;

k) quantitatives Erfassen der Markierungssignale der Proben-Peptide und der Kontroll-Peptide;

I) Vergleichen der quantitativen Daten der Markierungssignale, um eine Aussage zu treffen, ob für Sepsis und/oder sepsisähnliche Zustände spezifisches Gene oder Genfragmente in der Probe stärker oder schwächer exprimiert sind als in der Kontrolle.

Eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur in vitro Erkennung von schwerer Sepsis ist dadurch gekennzeichnet, dass es folgende Schritte umfasst:

m) Isolieren von Proben-Peptiden aus einer aus einem Säuger stammenden Probe;

n) Markieren der Proben-Peptide mit einem detektierbaren Marker;

o) In-Kontakt-Bringen der markierten Proben-Peptide mit wenigstens einem Antikörper oder dessen bindendem Fragment, wobei der Antikörper ein für schwere Sepsis spezifisches Peptid- oder Peptidfragment bindet;

p) In-Kontakt-Bringen von markierten Kontroll-Peptiden, welche aus gesunden Probanden stammen, mit wenigstens einem, in Form eines Microarray auf einem Träger immobilisierten Antikörper oder dessen bindendes Fragment, wobei der Antikörper ein für schwere Sepsis spezifisches Peptid- oder Peptidfragment bindet;

q) quantitatives Erfassen der Markierungssignale der Proben-Peptide und der Kontroll-Peptide; r) Vergleichen der quantitativen Daten der Markierungssignale, um eine Aussage zu treffen, ob für schwere Sepsis spezifisches Gene oder Genfragmente in der Probe stärker oder schwächer exprimiert sind als in der Kontrolle.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper auf einem Träger in Form eines Microarrays immobilisiert ist.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß es als Immunoassay ausgebildet ist.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren zur differentialdiagnostischen Früherkennung, zur Kontrolle des therapeutischen Verlaufs, zur Risikoabschätzung für Patienten sowie zur post mortem Diagnose von SIRS und/oder Sepsis und/oder schwerer Sepsis und/oder systemischen Infektionen eingesetzt wird.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die Probe ausgewählt wird aus: Körperflüssigkeiten, insbesondere Blut, Liquor, Urin, Ascitesflüssigkeit, Seminalflüssigkeit, Speichel, Punktat; Zellinhalt oder eine Mischung davon.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß

Gewebe- oder Zellproben gegebenenfalls einer lytischen Behandlung unterzogen werden, um deren Zellinhalte freizusetzen.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß das für SIRS spezifische Peptid ein Expressionsprodukt eines Gens oder Genfragmentes ist, welches ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus SEQUENZ-ID No. III.1 bis SEQUENZ-ID No. 111.4168 sowie Genfragmenten davon mit wenigstens 5-2000, bevorzugt 20-200, mehr bevorzugt 20-80 Nukleotiden.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß das für Sepsis und/oder sepsisähnliche Zustände spezifische Peptid ein Expressionsprodukt eines Gen oder Genfragmentes ist, welches ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus SEQUENZ - ID No. 1.1 bis SEQUENZ - ID No. I.6242, sowie Genfragmenten davon mit wenigstens 5-2000, bevorzugt 20-200, besonders bevorzugt 20-80 Nukleotiden.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß das für schwere Sepsis spezifische Peptid ein Expressionsprodukt eines Gens oder Genfragmentes ist, welches ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus SEQUENZ-ID No. 11.1 bis SEQUENZ-ID No. 11.130, sowie Genfragmenten davon mit wenigstens 5-2000, bevorzugt 20-200, mehr bevorzugt 20-80 Nukleotiden.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 2 bis 100 unterschiedliche Peptide verwendet werden.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 200 unterschiedliche Peptide verwendet werden.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 200 bis 500 unterschiedliche Peptide verwendet werden.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 500 bis 1000 unterschiedliche Peptide verwendet werden.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 1000 bis 2000 unterschiedliche Peptide verwendet werden.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß als ddeetteekkttiieerrbbaarreerr MMaarrkkeerr eeiin radioaktiver Marker, insbesondere ³²P, ¹⁴C, ¹²⁵l, ¹⁵⁵Ep, ³³P oder ³H verwendet wird.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß als detektierbarer Marker ein nicht radioaktiver Marker, insbesondere ein Färb- oder Fluoreszenzmarker, ein Enzymmarker oder Immunmarker und/oder quantum dots oder ein elektrische messbares Signal, insbesondere Potential- und/oder Leitfähigkeits- und/oder Kapazitätsänderung bei Hybridisierungen, verwendet wird.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die Proben-Peptide und Kontroll-Peptide dieselbe Markierung tragen. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die Proben-Peptide und Kontroll-Peptide unterschiedliche Markierungen tragen.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die Peptid-Sonden auf Glas oder Kunststoff, immobilisiert werden.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die einzelnen Peptidmoleküle über eine kovalente Bindung an das Trägermaterial immobilisiert werden.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die einzelnen Peptidmoleküle mittels Adsorption, insbesondere mittels elektrostatischer- und/oder Dipol-Dipol- und/oder hydrophober Wechselwirkungen und/oder Wasserstoffbrücken an das Trägermaterial immobilisiert werden an das Trägermaterial immobilisiert werden.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die einzelnen Peptidmoleküle mittels monoklonaler Antikörper oder deren bindenden Fragmenten erkannt werden.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß das Bestimmen einzelner Peptide mittels Immunoassay, oder Präzipitationsassay unter Verwendung monoklonaler Antikörper durchgeführt wird.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung besteht in der Verwendung von rekombinant oder synthetisch hergestellten, für SIRS spezifischen Nukleinsäuresequenzen, Partialsequenzen oder davon abgeleiteten Protein-/ Peptidsequenzen einzeln oder in Teilmengen als Kalibrator in SIRS-Assays und/oder zur Bewertung der Wirkung und Toxizität beim Wirkstoffscreening und/oder zur Herstellung von Therapeutika und von Stoffen und Stoffgemischen, die als Therapeutikum vorgesehen sind, zur Vorbeugung und Behandlung von SIRS.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung besteht in der Verwendung von rekombinant oder synthetisch hergestellten, für Sepsis und/oder sepsisähnlichen Zustände spezifischen Nukleinsäuresequenzen, Partialsequenzen oder davon abgeleiteten Protein-/ Peptidsequenzen einzeln oder in Teilmengen als Kalibrator in Sepsis-Assays und/oder zur Bewertung der Wirkung und Toxizität beim Wirkstoffscreening und/oder zur Herstellung von Therapeutika und von Stoffen und Stoffgemischen, die als Therapeutikum vorgesehen sind, zur Vorbeugung und Behandlung von Sepsis, sepsisähnlichen systemischen entzündlichen Zuständen und sepsisähnlichen systemischen Infektionen.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung besteht in der Verwendung von rekombinant oder synthetisch hergestellten, für schwere Sepsis spezifischen Nukleinsäuresequenzen, Partialsequenzen oder davon abgeleiteten Protein-/ Peptidsequenzen einzeln oder in Teilmengen als Kalibrator in Sepsis-Assays und/oder zur Bewertung der Wirkung und Toxizität beim Wirkstoffscreening und/oder zur Herstellung von Therapeutika und von Stoffen und Stoffgemischen, die als Therapeutikum vorgesehen sind, zur Vorbeugung und Behandlung von schwerer Sepsis.

Es ist dem Fachmann klar, daß die in den Ansprüchen dargelegten einzelnen Merkmale der Erfindung ohne Einschränkung beliebig miteinander kombinierbar sind.

Als Markergene im Sinne der Erfindung werden alle abgeleiteten DNA-Sequenzen, Partialsequenzen und synthetischen Analoga (beispielsweise Peptido-Nukleinsäuren, PNA) verstanden. Weiterhin werden im Sinne der Erfindung alle von den Markergenen kodierten Proteine, Peptide bzw. Partialsequenzen oder synthetische -Pepu tomimetica verstanden. Die auf Bestimmung der Genexpression auf RNA- Ebene bezogene Beschreibung der Erfindung stellt keine Einschränkung sondern nur eine beispielhafte Anwendung dar.

Die auf Blut bezogene Beschreibung der Erfindung stellt nur eine beispielhafte Anwendung der Erfindung dar. Als biologische Flüssigkeiten im Sinne der Erfindung werden alle Körperflüssigkeiten des Menschen verstanden.

Eine Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt in der Messung der differentiellen Genexpression bei SIRS, Sepsis, sepsisähnlichen Zuständen, schwerer Sepsis und systemischen Infektionen. Hierzu wird die RNA aus dem Vollblut von entsprechenden Patienten und eine Kontrollprobe eines gesunden Probanden oder eines nicht an einer der erwähnten Krankheiten erkrankten Patienten isoliert. Die RNA wird anschließend markiert, beispielsweise radioaktiv mit ³²P oder mit Farbstoffmolekülen (Fluoreszenz). Als Markierungsmoleküle können alle im Stand der Technik zu diesem Zwecke bekannten Moleküle und/oder Detektionssignale eingesetzt werden. Entsprechende Moleküle und/oder Verfahren sind dem Fachmann ebenfalls bekannt.

Die so markierte RNA wird anschließend mit auf einem Microarray immobilisierten cDNA-Moiekülen hybridisiert. Die auf dem Microarray immobilisierten cDNA-Moleküle stellen eine spezifische Auswahl der Gene gemäß Anspruch 12 dieser Erfindung für die Messung von SIRS, gemäß Anspruch13 für Sepsis und sepsisähnlichen Zuständen, gemäß Anspruch 14 für schwere Sepsis und systemische Infektionen, dar.

Die Intensitätssignale der hybridisierten Moleküle werden im Anschiuss durch geeignete Messgeräte (Phosporimager, Microarray-Scanner) gemessen und durch weitere softwaregestützte Auswertungen analysiert. Aus den gemessenen Signalintensitäten werden die Expressionsverhältnisse zwischen der Patientenprobe und der Kontrolle bestimmt. Aus den Expressionsverhältnissen der unter- und/oder überregulierten Gene lassen sich.wie in den nachstehend dargestellten Experimenten, Rückschlüsse auf das Vorhandensein von SIRS, Sepsis, sepsisähnlichen Zuständen, schwerer Sepsis und systemischen Infektionen ziehen.

Eine weitere Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht in der Messung der differentiellen Genexpression für die therapiebegleitende Bestimmung der Wahrscheinlichkeit, daß Patienten auf die geplante Therapie ansprechen werden, und/oder für die Bestimmung des Ansprechens auf eine spezialisierte Therapie und/oder auf die Festlegung des Therapieendes im Sinne eines „drug monitoring" bei Patienten mit SIRS, Sepsis, sepsisähnlichen Zuständen, schwerer Sepsis und systemischen Infektionen. Hierzu wird aus den in zeitlichen Abständen gesammelten Blutproben des Patienten die RNA (Proben-RNA) isoliert. Die verschiedenen RNA-Proben werden zusammen mit der Kontrollprobe markiert und mit ausgewählten Genen, welche auf einem Microarray immobilisiert sind, hybridisiert. Aus den jeweiligen Expressionsverhältnissen läßt sich somit beurteilen, welche Wahrscheinlichkeit besteht, daß Patienten auf die geplante Therapie ansprechen werden und/oder ob die begonnene Therapie wirksam ist und/oder wie lange die Patienten noch entsprechend therapiert werden müssen und/oder ob der maximale Therapieeffekt mit der verwendeten Dosis und Dauer schon erreicht worden ist.

Eine weitere Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht in der Messung des Bindungsgrades von Proteinen, beispielsweise monoklonaler Antikörper, mittels der Verwendung von Immunoassays, Protein- oder Peptidarrays oder Präpitationsassays. Durch die Bestimmung der Konzentration der von den Sequenzen der in Anwendungsbeispiel 1 aufgeführten Nukleinsäuren entsprechenden Proteine oder Peptide kann auf ein erhöhtes Risiko zur Entwicklung einer SIRS geschlossen werden. Weiterhin ermöglicht diese Verfahrenweise die differentialdiagnostische Erkennung bei Patienten mit SIRS, Sepsis, sepsisähnlichen Zuständen, schwerer Sepsis und systemischen Infektionen .

Ebenso kann auf ein erhöhtes Risiko zur Entwicklung einer Sepsis, sepsisähnlichen Zuständen, schwerer Sepsis und systemischen Infektionen geschlossen werden.

Weitere Vorteile und Merkmale der vorliegenden Erfindung ergeben sich aufgrund der Beschreibung von Ausführungsbeispielen sowie an Hand der Zeichnung.

Es zeigt:

Figur 1 ein 2-dimensionales Gel, das darauf aufgetragenes präzipitiertes Serum- Protein eines Patienten mit Sepsis enthält, und

Figur 2 ein 2-dimensionales Gel, das darauf aufgetragenes präzipitiertes Serum- Protein eines Kontroll-Patienten enthält. Ausführungsbeispiel 1 - SIRS:

Untersuchungen zur differentiellen Genexpression bei SIRS-erkrankten Patienten.

Für die Messung der differentiellen Genexpression bei SIRS wurden Untersuchungen von Vollblutproben von Patienten, welche auf einer operativen Intensivstation behandelt wurden, durchgeführt.

Als Kontrollproben dienten Vollblutproben der Patienten, welche unmittelbar vor der Operation entnommen wurden. Keiner dieser Patienten wies zu diesem Zeitpunkt oder vor der stationären Behandlung eine Infektion und/oder wies klinische Zeichen einer SIRS (definiert entsprechend SIRS-Kriterien [4]) auf.

Zusätzlich wurden Vollblutproben der gleichen operativ behandelten Patienten vier Stunden nach der Operation (Patientenproben) entnommen. Jeder dieser Patienten entwickelte nach der Operation eine SIRS. Ausgewählte Charakteristika der Patienten mit SIRS sind in Tabelle 1 dargestellt. Dabei werden Angaben zum Alter, Geschlecht, Diagnose sowie die Dauer der extrakorporalen Behandlung angegeben.

Nach Abnahme des Vollblutes wurde die totale RNA unter Anwendungen des PAXGene Blood RNA Kit gemäß den Vorgaben des Herstellers (Qiagen) isoliert. Im Anschiuss wurde aus der totalen RNA die cDNA mittels reverser Transkrition mittels Superscript II RT (Invitrogen) nach dem Protokoll des Herstellers synthetisiert, mit Aminoallyl-dUTP und Succinimidylester von der Fluoreszenzfarbstoffe Cy3 und Cy5 (Amersham) markiert und hydrolisiert.

Für die Hybridisierung wurden die Microarrays (Lab-Arraytor human 500-1 cDNA) der Firma SIRS-Lab GmbH verwendet. Diese Microarrays sind mit 340 humanen cDNA- Molekülen bestückt. Die 340 humanen cDNA-Moleküle sind auf jedem Microarray 3- fach in drei Subarrays immobilisiert.

Die vorbereiteten und markierten Proben wurden mit den Microarrays entsprechend den Anweisungen des Herstellers hybridisiert und im Anschiuss gewaschen. Die Fluoreszenzsignale der hybridisierten Moleküle wurden mittels eines Auslesegerätes (AXON 4000B) gemessen.

Auswertung

Die Auswertung eines Experiments erfolgte aufgrund von eingescannten Bildern der Microarrays nach der Hybridisierung. Der mittlere Intensitätswert der detektierten Spots wurde als der gemessene Expressionswert des zugehörigen Gens definiert. In einer Bildanalyse wurden Spots automatisch erkannt und ihre Homogenität überprüft. Die Analyse wurde manuell kontrolliert. Die ermittelten Signale beinhalteten neben der gewünschten Information, nämlich der Menge gebundener Nukleinsäuren aber auch Hintergrundsignale, welche durch unspezifische Bindungen an der Membranoberfläche verursacht wurden. Die Definition des Hintergrundbereichs ermöglichte eine optimale Unterscheidung zwischen Spots und der Chipoberfläche, welche ebenfalls Farbeffekte aufwies. In der Auswertung der Microarrays wurden leere Spots als Hintergrund gewählt. Der mittlere Expressionswert ausgewählter leeren Spots innerhalb eines Blocks (von 14 mal 14 Spots) wurde von Expressionswerten der Gene-Spots (im entsprechenden Block) subtrahiert.

Punktuelle Signale, die nicht durch Bindung von Nukleinsäuren sondern durch Staubpartikel oder sonstige Störungen auf dem Filter verursacht wurden, konnten von realen Spots durch ihre Unregelmäßigkeit der Form unterschieden werden und wurden von der weiteren Analyse ausgeschlossen.

Um die Werte zwischen den 3 Subarrays und zwischen verschiedenen Microarrays miteinander vergleichbar zu machen, wurde anschließend eine Normalisierung der Daten notwendig. Wegen der hohen Anzahl der Spots auf dem Microarray wurde als Normalisierungsreferenz der Mittelwert aller Expressionswerte festgelegt. Für die Berechnung der mittleren Expression pro Gen wurden die zwei (aus drei) Wiederholungen gewählt, welche am nächsten zueinander lagen.

Aus den Signalintensitäten wurden mittels der Software AI DA Array Evaluation die Expressionsverhältnisse zwischen Kontroll- und Patientenproben Probe berechnet. Die Höhe des Expressionsverhältnisses jedes Gens stellte das Kriterium für eine Sortierung der untersuchten Gene dar. Von Interesse waren die Gene, die in den Patientenproben gegenüber Kontrollproben am meisten überexprimiert bzw. unterexprimiert wurden.

Aus Tabelle 2 ist ersichtlich, dass 57 Gene der Patientenprobe gefunden wurden, die gegenüber der Kontroilprobe signifikant überexprimiert waren. Weiterhin wird aus Tabelle 3 deutlich, dass 16 Gene der Patientenprobe signifikant unterexprimiert gegenüber der Kontrollprobe waren. Aus den Ergebnissen wird deutlich, dass die in Tabelle 2 und Tabelle 3 aufgeführten Gene mit dem Auftreten von SIRS korrelieren. Somit stellen die aufgeführten Genaktivitäten der Gene Marker für eine Diagnose von SIRS dar.

Tabelle 2: Signifikant gesteigerte Transkriptionsaktivitäten und deren relatives Verhältnis zur Kontrollprobe bei SIRS

GeneBank SEQUENZ-

Hugo-Name Patient 1 Patient 2 Patient 3 Patient 4 Accession-Nr. ID

XM_051958 ALOX5 2,43 1,49 1,81 1,40 ^* HI.36

X _015396 ALOX5AP 3,71 7,39 3,89 2,68 III 37

XM_008738 BCL2 1,16 6,76 1,55 1,04 III 38

BC016281 BCL2A1 13,71 10,29 1,41 4,36 lil 96

NM_021073 BMP5 2,02 1,83 1,78 1,51 III 39

X _002101 BMP8 2,32 10,85 1,31 0,87 III 40

X _045933 CAMKK2 2,20 1,26 1,95 1,13 III 41

XM_055386 CASP1 1,40 1,76 1,89 ^• 1,45 III 42^"

NM_004347 CASP5 1,92 2,77 0,67 1,89 III 43

NM_004166 CCL14 1,24 1,58 2,46 0,77 III 91

XM_012649 SCYA7 1,24 9,78 0,85 1,82 III 93

NM_001760 CCND3 1,23 2,68 1,56 1,12 III 44

NM_000591 CD14 3,45 4,43 1,76 2,05 III 45

XM_038773 CD164 0,84 1,91 3,26 3,15 III 46

X _048792 CD1A 3,24 3,10 1,00 1,11 III 47

N _001779 CD58 2,14 2,11 1,54 2,91 III 48

XM_002948 CD80 1,69 1,16 2,25 0,69 III 51

X _027978 CFLAR 2,33 4,97 1,44 1,39 III 52

NM_000760 CSF3R 1,55 1,47 1,81 1,02 III 53

XM_012717 CSNK1D 1,95 3,15 1,24 1,32 III 54

XM_048068 SCYD1 3,70 12,12 0,86 3,88 III 94

XM_051229 CXCR4 2,33 2,10 2,15 1,60 III 55

XM_039625 DUSP10 2,49 3,77 0,90 1,10 III 57

XM_010177 DUSP9 2,17 5,27 1,12 1,63 III 58

XM_055699 ENTPD1 1,91 3,18 0,71 0,86 III 59

XM_007189 FOX01A 1,61 3,10 1,09 1,67 III 60

XM_012039 FUT4 1,55 5,07 1,88 0,93 III 61

XM_040683 HPRT1 5,15 66,19 1,44 2,28 III 62

NM_017526 OBRGRP 1,93 1,10 1,53 1,40 III 63

XM_049516 ICAM1 1,27 1,88 2,05 1,30 III 64

XM_049531 ICAM3 2,31 2,32 1,61 1,45 III 65

XM_041744 IER3 4,17 7,25 1,98 2,08 III 66

XM_048562 IFNAR1 2,16 ^■ 4,87 1,09 2,36 III 67

XM_006447 IL10RA 1,02 1,51 1,96 0,67 III 68

M90391 IL-16 1,77 1,50 1,16 1,09 III 69

XM_002765 IL1R2 2,84 12,75 1,03 2,75 III 70

NM_000418 IL4R 3,34 6,44 2,05 2,79 III 71

XM_057491 IL6 1,72 1,48 1,53 1,37 III 72

N _002184 IL6ST 2,50 9,25 1,07 1,87 III 73

NM_000634 1L8RA 2,27 3,73 1,45 1,68 III 74

NM_006084 1SGF3G 1,72 1,08 2,54 1,12 III 75

XM_045985 ITGA2B 3,69 2,00 0,83 3,79 III 76 XM_008432 ITGA3 2,11 7,62 1 ,08 1 ,06 III.77

XM 028642 ITGA5 2,49 4,48 1 ,39 3,54 III.78

XM 036107 ITGB2 1 ,72 1 ,13 2,08 1,13 III.79

XM 009064 JUNB 2,21 1 ,84 3,59 2,05 III.80

XM 036154 LAMP2 1 ,79 1,68 1,62 1 ,41 111.81

GeneBank SEQUENZ-

Hugo-Name Patient 1 Patient 2 Patient 3 Patient 4 Accession-Nr. ID

XM 042066 MAP3K1 2,06 7,67 2,91 8,93 III.82

NM 001315 MAPK14 2,50 12,01 0,90 4,20 III.83

NM_003684 MKNK1 2,58 17,17 1,74 1 ,83 III.84

U68162 MPL 2,58 1 ,10 1 ,39 6,99 III.85

NM_004555 NFATC3 1 ,40 1,70 2,80 0,75 III.86

XM 306931 OLR1 1,53 5,01 1,10 3,16 1II.87

XM_039764 PDCD5 1,11 3,09 1 ,21 1 ,95 III.88

XM 329791 PIK3C2G 0,93 1 ,62 0,96 1,52 IH.89

NM 006219 PIK3CB 1,52 0,99 0,94 1 ,66 III.95

XM M3864 PIK3R1 1,81 4,07 1,48 1 ,26 III.90

Tabelle 3: Signifikant reduzierte Transkriptionsaktivitäten und deren relatives Verhältnis zur Kontrollprobe bei SIRS

GeneBank SEQUENZ-

Hugo-Name Patient 1 Patient 2 Patient 3 Patient 4 Accession-Nr. ID

BC001374 CD151 0,00 0,00 0,39 0,71 lli.3

XM_006454 CD3G 0,63 0,40 0,75 1 ,01 III.6

XM D43767 CD3Z 0,43 0,00 0,82 0,77 III.7

XM_056798 CD81 0,50 1 ,12 0,32 0,00 III.8 26315 CD8A 1,45 0,00 0,30 1 ,31 III.9

NM_004931 CD8B1 0,40 0,90 0,50 1,19 111.10

NM_001511 CXCL1 0,09 0,00 0,50 1,34 111.13

XM_057158 ADCY6 1 ,17 0,00 0,42 1 ,34 111.11

X _044428 ICAM2 0,00 1,16 0,50 1 ,10 111.14

NM_000880 IL7 0,00 1 ,06 0,74 0,10 111.16

L34657 PECAM-1 0,68 0,39 1 ,13 0,64 III.24

XM_044882 PTGS1 0,00 1 ,34 0,52 0,76 III.25

XMJ335842 SCYA5 0,60 0,50 0,80 0,99 III.29

NM_021805 SIGIRR 0,00 0,40 0,45 0,66 III.30

XMJD57372 TNFRSF5 0,00 0,49 0,59 1 ,03 III.34

NM 003809 TNFSF12 1 ,34 0,99 0,53 0,60 ÜI.35

Diese charakteristischen Veränderungen sind beispielsweise für das erfindungsgemäße Verfahren gemäß Anspruch 1 und 30 ausnutzbar. Die in den Tabellen 2 und 3 aufgeführten GenBank Accession Nummern (Internet- Zugang über http://www.ncbi.nim.aih.gov/) der einzelnen Sequenzen sind in dem dieser Anmeldung angefügten 1430-seitigen Sequenzprotokoll, das somit Teil der Erfindung ist, im Einzelnen jeweils einer Sequenz ID (Sequenz ID: III.1 bis zur Sequenz ID: 111.4168) zugeordnet.

Ausführungsbeispiel 2 - SIRS:

Untersuchung zur Genexpression zwischen drei Patienten mit SIRS und einer Kontrollprobe.

Es wurde die Genexpression bei Patienten mit SIRS und einer Kontrollprobe gemessen. Alle Patienten entwickelten eine SIRS entsprechend den Kriterien nach [4]. Die Kontrollprobe wurde aus einem Patienten gewonnen, der operativ behandelt wurde, jedoch während der gesamten stationären Behandlung keine SIRS aufwiesen. Die Daten der Patienten mit SIRS und der Kontrolle sind in Tabelle 4 zusammengefasst.

Tabelle 4: Charakteristika der Patienten- und Kontrollproben

Nach Abnahme des Vollblutes wurde die totale RNA unter Anwendungen des RNAeasy-Kits gemäß den Vorgaben des Herstellers (Qiagen) isoliert. Im Anschiuss wurde aus der totalen RNA die cDNA mittels reverser Transkrition mittels Superscript II RT (Invitrogen) nach dem Protokoll des Herstellers synthetisiert, mit ³³P radioaktiv markiert und hydrolisiert.

Für die Hybridisierung wurden Filtermembranen der Deutschen Ressourcenzentrum für Genomforschung gGmbH (RZPD) verwendet. Diese Filtermembran war mit ca. 70.000 humanen cDNA-Molekülen bestückt.

Die vorbereiteten und markierten Proben wurden mit der Fiftermembran entsprechend den Anweisungen des RZPD hybridisiert und im Anschiuss gewaschen. Nach einer 24-stündigen Exposition im Phosphorimager wurden die radioaktiven Signale ausgewertet.

Auswertung

Die Auswertung der Genexpressionsdaten aus den radioaktiv markierten Filtern beruht auf der Messung der Färbungsintensitäten im digitalisierten Bild. Dazu werden über allen 57600 Spotpositionen kreisförmige Flächen definiert, innerhalb derer die Pixelintensitäten integriert werden. Die möglichst exakte Positionierung der Flächen über die Spots erfolgt automatisch durch die Analysesoftware (AIDA Array Evaluation, raytest Isotopenmessgeräte GmbH).

Die ermittelten Signale beinhalten neben der gewünschten Information, nämlich der Menge gebundener Nukleinsäuren aber auch Hintergrundsignale, welche durch unspezifische Bindungen an der Membranoberfläche verursacht werden. Um diese Einflüsse zu eliminieren, werden die Hintergrundsignale in 4608 leeren Flächen des Filters bestimmt und als Grundrauschen von den Hybridisierungssignalen subtrahiert.

Um die Werte verschiedener Filter miteinander vergleichbar zu machen, ist anschließend eine Normalisierung der Daten notwendig. Wegen der hohen Anzahl der Spots auf dem Filter wird als Normalisierungsreferenz der Mittelwert aller Expressionswerte festgelegt. Weiterhin ist der Ausschluss niedriger Spotsignale (unterhalb 10% des durchschnittlichen Expressionssignals) notwendig, da diese einem prozentual großen Fehler unterliegen und bei den späteren Berechnungen zu starken Schwankungen der Ergebnisse führen würden. Die Selektion der SIRS-relevanten Gene basiert auf dem Vergleich der Genexpressionswerte bei einer Kontrollperson ohne SIRS gegenüber den Patienten mit SIRS. Die Höhe des Expressionsverhältnisses jedes Gens stellt das Kriterium für eine Sortierung der untersuchten Gene dar. Von Interesse sind die Gene, die in den Patienten gegenüber der Kontrolle signifikant überexprimiert bzw. unterexprimiert wurden.

Aus Tabelle 5 ist ersichtlich, dass 24 Gene der Patientenprobe gefunden wurden, die gegenüber der Kontrollprobe signifikant überexprimiert waren. Weiterhin wird aus Tabelle 6 deutlich, dass 24 Gene der Patientenprobe signifikant unterexprimiert gegenüber der Kontrollprobe waren. Aus den Ergebnissen wird deutlich, dass die in Tabelle 5 und Tabelle 6 aufgeführten Gene mit dem Auftreten von SIRS korrelieren. Somit stellen die aufgeführten Gene Markergene für die Diagnose von SIRS dar.

Tabelle 5: Signifikant gesteigerte Transkriptionsaktivitäten und deren relatives Verhältnis zur Kontrollprobe bei SIRS

GenBank

Hugo-Name Patient 1 Patient 2 Patient 3 SEQUENZ-ID Accession-Nr.

R33626 TFAP2A .57,57 30,43 96,57 111.135

N54839 CRSP3 47, 17 29,00 63,17 111.180

AA010908 LCAT 32,90 15,00 18,60 111.189

R59573 TU12B1 85,50 60,50 49,00 111.198

R65820 GEF 38,00 45,80 78,00 III.222

N30458 NCL 26,57 20,00 17,86 III.252

H86783 RINZF 43,33 17,00 31 ,33 III.274

R11676 CDC20 30,75 52,00 55,25 III.300

H79834 SLC20A2 16,56 14,33 27,44 III.309

H05746 SLC12A5 70,78 20,00 17,22 111.313

N211 12 ARHGEF12 62,00 14,50 27,00 111.321

R71085 PCANAP7 23,00 17,63 21 ,96 III.325

R40287 NIN283 35,00 28,00 28,00 111.331

H52708 PDE2A 32,78 14,11 59,22 111.351

AF086381 GNPAT ^"18,94 19,75 ' 25,63 IH.353

W57892 FN1 23,61 14,67 17,06 111.381

H75516 KIN 19,23 17,15 20,00 IH.389

R59212 MN1 19,65 16,65 18,61 III.404

H62284 CMAH 23,40 36,20 32,40 111.421

W16423 GCMB 23,83 45,67 21 ,00 III.446

N40557 U5 55,78 20,67 22,1 1 III.454

H52695 DDC 14,80 13,70 22,30 III.472

R68244 HMG14 15,81 23,19 27,56 III.493

R34679 ITGB8 19,20 32,00 79,20 III.502 Tabelle 6: Signifikant reduzierte Transkriptionsaktivitäten und deren relatives Verhältnis zur Kontrollprobe bei SIRS

GenBank

Hugo-Name Patient 1 Patient 2 Patient 3 SEQUENZ-ID Accession-Nr.

H18595 RPL10A 0,03 0,07 0, 15 111.181

N90220 DGUOK 0,04 0,07 0,12 III.202

R19651 H19 0,09 0,07 0, 19 III.329

R52108 UBE2D2 0,13 0,07 0,02 III.369

R83836 LYN 0,07 0,03 0, 18 III.387

H04648 CSF2RB 0,06 0,07 0,13 III.395

H27730 PPP2R1 B 0,09 0,07 0, 16 111.416

N70020 PR02822 0,10 0,04 0,11 llt.422

N52437 CHI3L2 0,07 0,08 0, 16 III.440

W96179 GCLM 0,04 0,01 0,19 Hl.450

H42506 GABARAP 0,08 0,03 0, 17 III.470

H66258 SCP2 0,10 0,05 0,21 III.474

N38985 RAP140 0,10 0,06 0,21 III.524

N73912 TMP21 0,09 0,07 0,08 III.533

N51024 TEGT 0,08 0,06 0,07 III.537

R99466 EEF1A1 0,07 0,02 0,14 III.636

R14080 CAM LG 0,11 0,02 0, 18 III.662

W93782 XPC 0,12 0,05 0,21 III.664

N91584 RPS6 0,06 0,05 0,12 111.981

W52982 PIG7 0,05 0,07 0,10 111.1040

AA033725 KLF8 0,06 0,08 0,19 111.1163

N20406 SRP14 0,10 0,04 0,16 111.1 193

T83104 TAF2F 0,02 0,05 0, 12 111.1258

H79277 CASP8 0,12 0,06 0,13 111.1305

Diese charakteristischen Veränderungen sind beispielsweise für das erfindungsgemäße Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 30 ausnutzbar. Die in den Tabellen 5 und 6 aufgeführten GeneBank Accession Nummern (Internet- Zugang über http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) der einzelnen Sequenzen sind in dem dieser Anmeldung angefügten 1430-seitigen Sequenzprotokoll, das somit Teil der Erfindung ist, im Einzelnen jeweils einer Sequenz ID (Sequenz ID: 111.1 bis zur Sequenz ID: 111.4168) zugeordnet.

Ausführunqsbeispiel 3 - Sepsis:

Untersuchung zur Genexpression zwischen einem Patienten mit einer frühen Sepsis und einer Kontrollprobe

Es wurde die Genexpression bei Auftreten einer frühen Sepsis und einer Kontrollprobe gemessen. Die Patientendaten sind in Tabelle 7 zusammengefasst.

Tabelle 7: Daten der Patienten- und Kontrollprobe

34

Nach Abnahme des Vollblutes wurde die totale RNA unter Anwendungen von RNAeasy gemäß den Vorgaben des Herstellers (Quiagen) isoliert. Im Anschiuss wurde aus der totalen RNA die cDNA mittels reverser Transkrition mittels Superscript II RT (Invitrogen) nach dem Protokoll des Herstellers synthetisiert, mit ³³P radioaktiv markiert und hydrolisiert.

Die vorbereiteten und markierten Proben wurden mit der Filtermembran entsprechend den Anweisungen des RZPD hybridisiert und im Anschiuss gewaschen. Nach einer 24-stündigen Exposition im Phosphorimager wurde die radioaktiven Signale ausgewertet.

Aus den Signalintensitäten wurden mittels der Software AIDA Array Evaluation die Expressionsverhältnisse zwischen Patienten- und Kontrollprobe berechnet.

Aus Tabelle 8 ist ersichtlich, dass 230 Gene der Patientenprobe gefunden wurden, die gegenüber der Kontrollprobe signifikant überexprimiert waren (Expressionsverhältnisse zwischen 13,67 und 98,33). Weiterhin wird aus Tabelle 3 deutlich, dass 206 Gene der Patientenprobe signifikant unterexprimiert gegenüber der Kontrollprobe waren (Expressionsverhältnisse zwischen 0,01 und 0,09). Aus den Ergebnissen wird deutlich, dass die in Tabelle 2 und Tabelle 3 aufgeführten Gene mit dem Auftreten einer frühen Sepsis korrelieren. Somit stellen die aufgeführten Gene Markergene für die Diagnose einer frühen Sepsis dar. Tabelle 8: Expressionverhältnis überexprimierter Gene zwischen Patienten- und Kontrollprobe

Tabelle 9: Expressionverhältnis unterrexprimierter Gene zwischen Patienten- und Kontrollprobe

Diese charakteristischen Veränderungen sind insbesondere für das erfindungsgemäße Verfahren gemäß Anspruch 2 und/oder 31 ausnutzbar.

Die in den Tabellen 8 und 9 aufgeführten GeneBank Accession Nummern (Internet- Zugang über http://www.ncbi.nim.nih.gov/) der einzelnen Sequenzen sind in dem dieser Anmeldung angefügten 1430-seitigen Sequenzprotokoll, das somit Teil der Erfindung ist, im Einzelnen jeweils einer SEQUENZ-ID (SEQUENZ-ID: 1.1 bis zur SEQUENZ- ID: I.6242) zugeordnet.

Durchführung:

RNÄ-Vorfoereitung. Die konditionierten Medien wurden aus den Kuiturflaschen entfernt und die adherenten Zellen wurden gemäß den Herstelleranweisungen direkt in den Kulturflaschen unter Verwendung von TRIzol-Reagens (GIBCO/BRL) lysiert. Nach einem Deproteinierungszyklus wurde die RNA durch Zusatz von Isopropanol präzipitiert, danach mit Äthanol gespült und erneut in 200 μl RNA-sicherer Resuspensions-Lösung (Ambion, Austin, TX) gelöst.. Die RNA-Präparate wurden mit 0,1 Mengeneinheiten/μl DNase I abgebaut, in DNase 1 Puffer von CLONTECH. Die RNA-Einheiten wurden zusätzlich in einer Alkoholmischung aus Phenol, Chloroform und Isoamylalkohol von Proteinen befreit, durch Zusatz von Äthanol präzipitiert und in 50-1 OOμl RNA-sicherer Resupensions-Lösung gelöst. Die RNA-Konzentration wurde spektrophotometrisch unter der Prämisse, daß 1A₂₆o einer Konzentration von 40 μg/ml entspricht, bestimmt. Die Proben wurden auf eine Endkonzentration von 1 mg/ml angepasst und bei 80°C gelagert, ohne daß irgendwelche Anzeichen der Qualitätsverschlechterung festzustellen waren. Alle RNA-Präparate wurden durch eine Agarosegelelektrophorese auf ihre Ganzheit (im Sinne von Nichtzerfall in seine Bestandteile) hin beurteilt, wobei RNA-Standards (GIBCO/BRL) zu Hilfe genommen wurden. Alle hier beschriebenen Präparate enthielten intakte RNA mit eindeutig erkennbaren 28S-, 18S- and 5S-Banden (Daten sind nicht angegeben). Es wurden keine erkennbaren Unterschiede hinsichtlich der elektrophoretisch bestimmten RNA- Muster zwischen gesunden und infektiösen Zellen festgestellt.

Vorbereitung von radioaktiv-markierten cDNA-Proben und Hybridisierung mittels DNA-Arrays. Gemäß dem Herstellerprotokoll wurde die cDNA-Synthese unter Verwendung von genspezifischen Primern (CLONTECH) und [³²P]-dATP mit der Moloney Murine Leukemea Virus Reverse Transkriptase (SuperScript II, GIBCO/BRL) durchgeführt. Für die cDNA-Synthese wurden gleiche Mengen (5 μg) an RNA von jeder Probe verwendet.

Alternative Möglichkeit

RNA wurde aus den Gewebeproben mit Hilfe von Guanidinium Thiocyanate extrahiert und danach wie beschrieben [19] in CsCI zentrifugiert. Gemäß den

Herstellerempfehlungen wurde die RNA aus den Zeil-Linien mit RNAzol (Biotex

Laboratories, Houston) extrahiert. Die Poly(A)-RNA wurde von 500 μg RNA mittels

DynaBeads (Dynal, Oslo) isoliert, ganz entsprechend den Empfehlungen des

Herstellers.

Die Unterschiede in der Genexpression wurden unter Verwendung von Atlas Array

Membranen (CLONTECH) untersucht. In einem ersten kurzen Arbeitsschritt wurden jeweils 1 μg RNA von jeder Zeil-Linie in [-³²P]dATP-markierte cDNA umgeschrieben.

Auswertung

Die ermittelten Signale beinhalten neben der gewünschten Information, nämlich der Menge gebundener Nukleinsäuren aber auch Hintergrundsignale, welche durch unspezifische Bindungen an der Membranoberfläche verursacht werden. Um diese Einflüsse zu eliminieren, werden die Hintergrundsignale in 4608 leeren Flächen des Filters bestimmt und als Grundrauschen von den Hybridisierungssignalen subtrahiert. Punktuelle Signale, die nicht durch Bindung von Nukleinsäuren sondern durch Staubpartikel oder sonstige Störungen auf dem Filter verursacht werden, können von realen Spots durch ihre Unregelmäßigkeit der Form unterschieden werden und werden von der weiteren Analyse ausgeschlossen.

Um die Werte verschiedener Filter miteinander vergleichbar zu machen, ist anschließend eine Normalisierung der Daten notwendig. Wegen der hohen Anzahl der Spots auf dem Filter wird als Normalisierungsreferenz der Mittelwert aller Expressionswerte festgelegt. Weiterhin ist der Ausschluss niedriger Spotsignale (unterhalb 10% des durchschnittlichen Expressionssignals) notwendig, da diese einem prozentual großen Fehler unterliegen und bei den späteren Berechnungen zu starken Schwankungen der Ergebisse führen würden.

Die Selektion der SIRS/Sepsis-relevanten Gene basiert auf dem Vergleich der Genexpressionswerte bei einer Kontrollperson ohne SIRS/Sepsis gegenüber jeweils einem Patienten mit der Diagnose Sepsis/SIRS. Die Höhe des Expressionsverhältnisses jedes Gens stellt das Kriterium für eine Sortierung der untersuchten Gene dar. Von Interesse sind die Gene, die in den Patienten gegenüber der Kontrolle am meisten überexprimiert bzw. unterexprimiert wurden.

Ausführunqsbeispiel 4-Sepsis:

Untersuchung zur Proteinexpression zwischen einem Patienten mit einer Sepsis und einer Kontrollprobe Es wurde die Proteinexpression bei Auftreten einer Sepsis und einer Kontrollprobe gemessen. Die Patientendaten sind in Tabelle 10 zusammengefasst.

abelle 10: Daten der Kontroll- und Patientenprobe

44

Nach Abnahme des Vollblutes in ein Serum-Röhrchen erfolgte eine Zentrifugation (5500 rcf; 10 min; 4° C). Der Serum-Überstand wurde unmittelbar nach der Zentrifugation in Kryoröhrchen überführt und dann bei -35 ° C gelagert.

Das Serum wurde zur Abreicherung des Albumins mit Affi-Gel Blue Affinity Chromatographie Gel for Enzyme and Blood Protein Purifications (Bio-Rad) gemäß den Angaben des Herstellers behandelt. Zur Vermeidung unerwünschter Protein-Matrix-Wechselwirkungen wurden Equilibrierungs- und Bindungspuffer zusätzlich mit 400 mM NaCI versetzt.

Nicht bindende Proteine wurden gesammelt und mit Methanol und Chloroform entsprechend dem Protokoll von Wessel und Flügge (Anal Biochem. 1984 Apr; 138(1): 141 -3.) präzipitiert.

250 Microgramm des präzipitierten Serum-Proteins wurden in einer Lösung bestehend aus 8M Harnstoff; 2,0 M Thioharnstoff; 4% CHAPS; 65 mM DTT und 0,4% (w/v) Bio-Lytes 3/10 (Bio-Rad) aufgenommen und einer isoelektrischen Fokussierung, sowie einer nachfolgenden SDS-PAGE unterzogen.

SDS-PAGE

In Figur 1 und in Figur 2 ist mit K4 das Akutphase Protein Transthyretin (TTR; P02766, SEQUENZ-ID 1.6241 , SEQUENZ-ID I.6242) und mit K5 und K6 das Vitamin D-bindende Protein (DBP; P02774, SEQUENZ-ID 1.1554, SEQUENZ-ID 1.1555) bezeichnet.

Die Gele (Cibacron FT, W1-W3, 400mM NaCI, IEF pH 3-10, Coomassie) können wie folgt erstellt werden:

250 Microgramm präzipitiertes Serum-Protein werden in einer Lösung bestehend aus 8M Harnstoff; 2,0 M Thioharnstoff; 4% CHAPS; 65 mM DTT und 0,4% (w/v) Bio-Lytes 3/10 (Bio-Rad) aufgenommen und einer isoelektrischen Fokussierung, sowie einer nachfolgenden SDS-PAGE unterzogen. Die fertigen 2-dimensionalen Gele wurden mit Coomassie Brilliant Blau G-250 angefärbt und differentiell exprimierte Proteine wurden massenspektrometrisch identifiziert.

Die vergleichende Analyse (Figur 1 , Figur 2) zeigt, dass das Akutphase Protein Transthyretin (TTR; P02766, SEQUENZ-ID: 1.6241 , SEQUENZ-ID 1.6242 ), sowie das Vitamin D-bindende Protein (DBP; P02774, SEQUENZ-ID 1.1554, SEQUENZ-ID 1.1555) beim Sepsis-Patienten gegenüber dem Kontroll-Patienten schwächer exprimiert wird.

Aus diesen Ergebnissen lässt sich eindeutig ableiten, dass die Proteinexpression bzw. die Proteinzusammensetzung von Serum und Plasma krankheitsbegleitend verändert werden.

Ausführunqsbeispiel 5 - schwere Sepsis:

Untersuchungen zur differentiellen Genexpression bei Patienten mit schwerer θpS'S.

Für die Messung der differentiellen Genexpression bei schwerer Sepsis wurden Untersuchungen von Vollblutproben von Patienten, welche auf einer operativen Intensivstation behandelt worden, durchgeführt.

Als Kontrollproben dienten Vollblutproben von Patienten nach einer unkomplizierten neurochirurgischen Operation, welche auf der gleichen Intensivstation behandelt wurden. Keiner dieser Patienten entwicklete während seiner gesamten stationären Behandlung eine Infektion und/oder wies klinische Zeichen einer generalisierten Entzündungsreaktion (definiert entsprechend SIRS-Kriterien [4]) auf.

Zusätzlich wurden Vollblutproben von sechs männlichen und zwei weiblichen Patienten abgenommen (Patientenproben). Jeder dieser Patienten entwickelte im Zeitraum von 24 Stunden vor Vollblutentnahme neu eine schwere Sepsis mit Organfunktionsstörung. Ausgewählte Charakteristika der Patienten mit schwerer Sepsis sind in Tabelle 1 dargestellt. Dabei werden Angaben zum Alter, Geschlecht, der Ursache der schweren Sepsis (siehe Diagnose) sowie klinischer Schwere, gemessen anhand der im klinischen Schrifttum gut belegten APACHE-ll- und SOFA-Scores (jeweils in Punkte), gemacht. Gleichfalls sind die Plasmaproteinspiegel von Procalcitonin (PCT), einem neuartigen Sepsismarker, und der individuelle Überlebensstatus angegeben.

Tabelle11 : Daten der Patientengruppe

Für die Hybridisierung wurden die Microarrays (Lab-Arraytor human 500-1 cDNA) der Firma SIRS-Lab GmbH verwendet. Diese Microarrays sind mit 340 humanen cDNA-Molekülen bestückt. Die 340 humanen cDNA-Moleküle sind auf jedem Microarray 3-fach in drei Subarrays immobilisiert.

Auswertung

Die Auswertung eines Experiments erfolgte aufgrund von eingescannten Bildern der Microarrays nach der Hybridisierung. Der mittlere Intensitätswert der detektierten Spots wurde als der gemessene Expressionswert des zugehörigen Gens definiert. In einer Bildanalyse wurden Spots automatisch erkannt und ihre Homogenität überprüft. Die Analyse wurde manuell kontrolliert. Die ermittelten Signale beinhalteten neben der gewünschten Information, nämlich der Menge gebundener Nukleinsäuren aber auch Hintergrundsignale, welche durch unspezifische Bindungen an der Membranoberfläche verursacht wurden. Die Definition des Hintergrundbereichs ermöglichte eine optimale Unterscheidung zwischen Spots und der Chipoberfläche, welche ebenfalls Farbeffekte aufwies. In der Auswertung der Microarrays wurden leere Spots als Hintergrund gewählt. Der mittlere Expressionswert ausgewählter leeren Spots innerhalb eines Blocks (von 14 mal 14 Spots) wurde von Expressionswerten der Gen-Spots (im entsprechenden Block) subtrahiert.

Aus den Signalintensitäten wurden mittels der Software AIDA Array Evaluation die Expressionsverhältnisse zwischen Kontroll- und Patientenproben Probe berechnet. Die Höhe des Expressionsverhältnisses jedes Gens stellte das Kriterium für eine Sortierung der untersuchten Gene dar. Von Interesse waren die Gene, die in den Patientenproben gegenüber Kontrollproben am meisten überexprimiert bzw. unterexprimiert wurden.

Aus Tabelle 12 ist ersichtlich, dass 41 Gene der Patientenprobe gefunden wurden, die gegenüber der Kontrollprobe signifikant überexprimiert waren. Weiterhin wird aus Tabelle 13 deutlich, dass 89 Gene der Patientenprobe signifikant unterexprimiert gegenüber der Kontrollprobe waren. Aus den Ergebnissen wird deutlich, dass die in Tabelle 12 und Tabelle 13 aufgeführten Gene mit dem Auftreten einer schweren Sepsis korrelieren. Auch korrelieren diese Ergebnisse mit der klinischen Eingruppierung entsprechend [4] sowie PCT-Konzentrationen der Patienten, welche typisch sind für das Auftreten einer schweren Sepsis [23]. Somit stellen die aufgeführten Genaktivitäten der Gene Marker für eine Diagnose einer schweren Sepsis dar.

Tabelle 12: Expressionverhältnis überexprimierter Gene zwischen Patienten- und Kontrollprobe

Tabelle 13: Expressionverhältnis unterrexprimierter Gene zwischen Patienten- und Kontrollprobe

Diese charakteristischen Veränderungen sind beispielsweise für das erfindungsgemäße Verfahren gemäß Anspruch 3 und 32 ausnutzbar. Die in den Tabellen 12 und 13 aufgeführten GenBank Accession Nummern (Internet-Zugang über http://www.ncbi.nim.nih.gov/) der einzelnen Sequenzen sind in dem dieser Anmeldung angefügten 1430-seitigen Sequenzprotokoll, das somit Teil der Erfindung ist, im Einzelnen jeweils einer SEQUENZ-ID (SEQUENZ-ID: 11.1 bis zur SEQUENZ-ID: 11.130) zugeordnet. Dieses Sequenzprotokoll ist Teil der vorliegenden Erfindung.

Literatur

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Claims

Ansprüche

1. Verfahren zur in vitro Erkennung von akuten generalisierten entzündlichen Zuständen (SIRS),

dadurch gekennzeichnet, daß

es folgende Schritte umfasst:

a) Isolieren von Proben-RNA aus einer aus einem Säuger stammenden Probe;

b) Markieren der Proben-RNA und/oder wenigstens einer DNA, die ein für SIRS spezifisches Gen oder Genfragment ist, mit einem detektierbaren Marker;

c) In-Kontakt-Bringen der Proben-RNA mit der DNA unter Hybridisierungsbedingungen;

d) In-Kontakt-Bringen von Kontroll-RNA, welche eine Kontrolle für nichtpathologische Zustände darstellt, mit wenigstens einer DNA, unter Hybridisierungsbedingungen, wobei die DNA ein für SIRS spezifisches Gen oder Genfragment ist;

e) quantitatives Erfassen der Markierungssignale der hybridisierten Proben- RNA und der Kontroll-RNA;

f) Vergleichen der quantitativen Daten der Markierungssignale, um eine Aussage zu treffen, ob für SIRS spezifische Gene oder Genfragmente in der Probe stärker oder schwächer exprimiert sind als in der Kontrolle.

2. Verfahren zur in vitro Erkennung von Sepsis und/oder sepsisähnlichen Zuständen,

dadurch gekennzeichnet, dass

es folgende Schritte umfasst:

g) Isolieren von Proben-RNA aus einer aus einem Säuger stammenden Probe;

k) quantitatives Erfassen der Markierungssignale der hybridisierten Proben- RNA und der Kontroll-RNA;

3. Verfahren zur in vitro Erkennung von schwerer Sepsis,

dadurch gekennzeichnet, dass

es folgende Schritte umfasst:

m) Isolieren von Proben-RNA aus einer aus einem Säuger stammenden Probe;

n) Markieren der Proben-RNA und/oder wenigstens einer DNA, die ein für schwere Sepsis ^' spezifisches Gen oder Genfragment ist, mit einem detektierbaren Marker;

o) In-Kontakt-Bringen der Proben-RNA mit der DNA unter Hybridisierungsbedingungen;

p) In-Kontakt-Bringen von Kontroll-RNA, welche eine Kontrolle für nichtpathologische Zustände darstellt, mit wenigstens einer DNA, unter Hybridisierungsbedingungen, wobei die DNA ein für schwere Sepsis spezifisches Gen oder Genfragment ist;

q) quantitatives Erfassen der Markierungssignale der hybridisierten Proben- RNA und der Kontroll-RNA;

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man die Kontroll-RNA vor dem Messen der Proben-RNA mit der DNA hybridisiert und die Markierungssignale des Kontroll-RNA/DNA-Komplexes erfaßt und gegebenenfalls in Form einer Kalibrierkurve oder -tabelle ablegt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß nicht veränderte Gene aus der Proben- und/oder Kontroll-RNA als Bezugsgene für die Quantifizierung genutzt werden.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß als Proben-RNA mRNA verwendet wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA an vorbestimmten Bereichen auf einem Träger in Form eines Microarrays angeordnet, insbesondere immobilisiert, wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren zur differentialdiagnostischen Früherkennung, zur Kontrolle des klinischen Verlaufs, zur individuellen Risikoabschätzung für Patienten, zur Abschätzung des wahrscheinlichen Ansprechens auf eine spezifische Behandlung sowie zur post mortem Diagnose von SIRS und/oder Sepsis und/oder schwerer Sepsis und/oder systemischen Infektionen und/oder septischen Zuständen und/oder Infektionen, eingesetzt wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe ausgewählt wird aus: Körperflüssigkeiten, insbesondere Blut, Liquor, Urin, Ascitesflüssigkeit, Seminalflüssigkeit, Speichel, Punktat; Zellinhalt oder eine Mischung davon.

10.Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß Zellproben gegebenenfalls einer lytischen Behandlung unterzogen werden, um deren Zellinhalte freizusetzen.

11.Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Säuger um einen Menschen handelt.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 4 bis 11 dadurch gekennzeichnet, daß das für SIRS spezifische Gen oder Genfragment ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus SEQUENZ-ID No. III.1 bis SEQUENZ-ID No. 111.4168, sowie Genfragmenten davon mit wenigstens 5-2000, bevorzugt 20-200, mehr bevorzugt 20-80 Nukleotiden.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 oder 4 bis 11 , dadurch gekennzeichnet, dass das für Sepsis und/oder sepsisähnliche Zustände spezifische Gen oder Genfragment ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus SEQENZ-ID No. 1.1 bis SEQUENZ-ID No. I.6242, sowie Genfragmenteπ davon mit wenigstens 5-2000, bevorzugt 20-200, mehr bevorzugt 20-80 Nukleotiden.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 oder 4 bis 11 , dadurch gekennzeichnet, daß das für schwere Sepsis spezifische Gen oder Genfragment ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus SEQUENZ-ID No. II.1 bis SEQUENZ-ID No. 11.130, sowie Genfragmenten davon mit wenigstens 5-2000, bevorzugt 20-200, mehr bevorzugt 20-80 Nukleotiden.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14 dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 2 bis 100 unterschiedliche cDNAs verwendet werden.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15 dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 200 unterschiedliche cDNAs verwendet werden.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16 dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 200 bis 500 unterschiedliche cDNAs verwendet werden.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17 dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 500 bis 1000 unterschiedliche cDNAs verwendet werden.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18 dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 1000 bis 2000 unterschiedliche cDNAs verwendet werden.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19 dadurch gekennzeichnet, daß die cDNA von den in den Ansprüchen 12, 13 und 14 aufgelisteten Genen durch synthetische Analoga sowie Peptidonukleinsäuren ersetzt wird.

21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet daß die synthetischen Analoga der aufgelisteten Gene 5-100, insbesondere ca. 70 Basenpaare, umfassen.

22. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21 , dadurch gekennzeichnet, daß als detektierbarer Marker ein radioaktiver Marker, insbesondere ³²P, ¹ C, ¹²⁵l, ¹⁵⁵Ep,³³P oder ³H verwendet wird.

23. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß als detektierbarer Marker ein nicht radioaktiver Marker, insbesondere ein Färb- oder Fluoreszenzmarker, ein Enzymmarker oder Immunmarker, und/oder quantum dots oder ein elektrisch messbares Signal, insbesondere Potential- und/oder Leitfähigkeits- und/oder Kapazitätsänderung bei Hybridisierungen, verwendet wird.

24. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß die Proben-RNA und Kontroll-RNA dieselbe Markierung tragen.

25. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Proben-RNA und Kontroll-RNA unterschiedliche Markierungen tragen.

26. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass die immobilisierten Sonden eine Markierung tragen.

27. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 26 dadurch gekennzeichnet, daß die cDNA-Sonden auf Glas oder Kunststoff immobilisiert werden.

28. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß die einzelnen cDNA Moleküle über eine kovalente Bindung an das Trägermaterial immobilisiert werden.

29. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 28, dadurch gekennzeichnet, daß die einzelnen cDNA Moleküle mittels Adsorption, insbesondere mittels elektrostatischer- und/oder Dipol-Dipol- und/oder hydrophobe Wechselwirkungen und/oder Wasserstoffbrücken an das Trägermaterial immobilisiert werden.

30. Verfahren zur in vitro Erkennung von SIRS,

dadurch gekennzeichnet, daß

es folgende Schritte umfaßt:

a) Isolieren von Proben-Peptiden aus einer aus einem Säuger stammenden Probe;

b) Markieren der Proben-Peptide mit einem detektierbaren Marker;

c) In-Kontakt-Bringen der markierten Proben-Peptide mit wenigstens einem Antikörper oder dessen bindendem Fragment, wobei der Antikörper ein für SIRS spezifisches Peptid- oder Peptidfragment bindet;

d) In-Kontakt-Bringen von markierten Kontroll-Peptiden, welche aus gesunden Probanden stammen, mit wenigstens einem, in Form eines Microarray auf einem Träger immobilisierten Antikörper oder dessen bindendes Fragment, wobei der Antikörper ein für SIRS spezifisches Peptid- oder Peptidfragment bindet; e) quantitatives Erfassen der Markierungssignale der Proben-Peptide und der Kontroll-Peptide;

f) Vergleichen der quantitativen Daten der Markierungssignale, um eine Aussage zu treffen, ob für SIRS spezifisches Gene oder Genfragmente in der Probe stärker oder schwächer exprimiert sind als in der Kontrolle.

31. Verfahren zur in vitro Erkennung von Sepsis und/oder sepsisähnlichen Zuständen,

dadurch gekennzeichnet, dass

es folgende Schritte umfasst:

g) Isolieren von Proben-Peptiden aus einer aus einem Säuger stammenden Probe;

h) Markieren der Proben-Peptide mit einem detektierbaren Marker;

32. Verfahren zur in vitro Erkennung von schwerer Sepsis,

dadurch gekennzeichnet, dass

es folgende Schritte umfasst:

m) Isolieren von Proben-Peptiden aus einer aus einem Säuger stammenden Probe;

n) Markieren der Proben-Peptide mit einem detektierbaren Marker;

q) quantitatives Erfassen der Markierungssignale der Proben-Peptide und der Kontroll-Peptide;

r) Vergleichen der quantitativen Daten der Markierungssignale, um eine Aussage zu treffen, ob für schwere Sepsis spezifisches Gene oder Genfragmente in der Probe stärker oder schwächer exprimiert sind als in der Kontrolle.

33. Verfahren nach einem der Ansprüche 30 bis 32, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper auf einem Träger in Form eines Microarrays immobilisiert ist.

34. Verfahren nach einem der Ansprüche 30 bis 33, dadurch gekennzeichnet, daß es als Immunoassay ausgebildet ist.

35. Verfahren nach einem der Ansprüche 30 bis 34, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren zur differentialdiagnostischen Früherkennung, zur Kontrolle des klinischen und therapeutischen Verlaufs, zur Risikoabschätzung für Patienten sowie zur post mortem Diagnose von SIRS und/oder Sepsis und/oder schwerer Sepsis und/oder systemischen Infektionen und/oder septischen Zuständen und/oder Infektionen eingesetzt wird.

36. Verfahren nach einem der Ansprüche 30 bis 35, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe ausgewählt wird aus: Körperflüssigkeiten, insbesondere Blut, Liquor, Urin, Ascitesflüssigkeit, Seminalflüssigkeit, Speichel, Punktat; Zellinhalt oder eine Mischung davon.

37. Verfahren nach einem der Ansprüche 30 bis 36, dadurch gekennzeichnet, daß Zellproben gegebenfalls einer lyrischen Behandlung unterzogen werden, um deren Zellinhalte freizusetzen.

38. Verfahren nach einem der Ansprüche 30 bis 37, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Säuger um einen Menschen handelt.

39. Verfahren nach einem der Ansprüche 30 oder 33 bis 38, dadurch gekennzeichnet, daß das für SIRS spezifische Peptid ein Expressionsprodukt eines Gen oder Genfragmentes ist, welches ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus SEQUENZ-ID No. III.1 bis SEQUENZ-ID No. 111.4168, sowie Genfragmenten davon mit wenigstens 5-2000, bevorzugt 20-200, besonders bevorzugt 20-80 Nukleotiden.

40. Verfahren nach einem der Ansprüche 31 oder 33 bis 38, dadurch gekennzeichnet, daß das für Sepsis und/oder sepsisähnliche Zustände spezifische Peptid ein Expressionsprodukt eines Gen oder Genfragmentes ist, welches ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus SEQUENZ - ID No. 1.1 bis SEQUENZ - ID No. I.6242, sowie Genfragmenten davon mit wenigstens 5-2000, bevorzugt 20- 200, besonders bevorzugt 20-80 Nukleotiden.

41. Verfahren nach einem der Ansprüche 32 oder 33 bis 38, dadurch gekennzeichnet, daß das für schwere Sepsis spezifische Peptid ein Expressionsprodukt eines Gen oder Genfragmentes ist, welches ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus SEQUENZ-ID No. 11.1 bis SEQUENZ-ID No. 11.130, sowie Genfragmenten davon mit wenigstens 5-2000, bevorzugt 20-200, mehr bevorzugt 20-80 Nukleotiden.

42. Verfahren nach einem der Ansprüche 30 bis 41 , dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 2 bis 100 unterschiedliche Peptide verwendet werden.

43. Verfahren nach einem der Ansprüche 30 bis 42, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 200 unterschiedliche Peptide verwendet werden.

44. Verfahren nach einem der Ansprüche 30 bis 43, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 200 bis 500 unterschiedliche Peptide verwendet werden.

45. Verfahren nach einem der Ansprüche 30 bis 44, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 500 bis 1000 unterschiedliche Peptide verwendet werden.

46. Verfahren nach einem der Ansprüche 30 bis 45, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 1000 bis 2000 unterschiedliche Peptide verwendet werden.

47. Verfahren nach einem der Ansprüche 30 bis 46, dadurch gekennzeichnet, daß als detektierbarer Marker ein radioaktiver Marker, insbesondere ³²P, ¹ C, ¹²⁵l, ¹⁵⁵Ep, ³³P oder ³H verwendet wird.

48. Verfahren nach einem der Ansprüche 30 bis 47, dadurch gekennzeichnet, daß als detektierbarer Marker ein nicht radioaktiver Marker, insbesondere ein Färb- oder Fluoreszenzmarker, ein Enzymmarker oder Immunmarker, und/oder quantum dots oder ein elektrisch messbares Signal, insbesondere Potential- und/oder Leitfähigkeits- und/oder Kapazitätsänderung bei Hybridisierungen, verwendet wird.

49. Verfahren nach einem der Ansprüche 30 bis 48, dadurch gekennzeichnet, daß die Proben-Peptide und Kontroll-Peptide dieselbe Markierung tragen.

50. Verfahren nach einem der Ansprüche 30 bis 49, dadurch gekennzeichnet, daß die Proben-Peptide und Kontroll-Peptide unterschiedliche Markierungen tragen.

51. Verfahren nach einem der Ansprüche 30 bis 50, dadurch gekennzeichnet, dass als Sonden solche Peptide verwendet werden, an welche markierte Antikörper gebunden sind, die durch eine Konformationsänderung bei Bindung an die Proben-Peptide eine Signaländerung der markierten Antikörper bewirken.

52. Verfahren nach einem der Ansprüche 30 bis 51 dadurch gekennzeichnet, daß die Peptid-Sonden auf Glas oder Kunststoff immobilisiert werden.

53. Verfahren nach einem der Ansprüche 30 bis 52, dadurch gekennzeichnet, daß die einzelnen Peptidmoleküle über, eine kovalente Bindung an das Trägermaterial immobilisiert werden.

54. Verfahren nach einem der Ansprüche 30 bis 53, dadurch gekennzeichnet, daß die einzelnen Peptidmoleküle mittels Adsorption, insbesondere mittels elektrostatischer- und/oder Dipol-Dipol- und/oder hydrophober Wechselwirkungen und/oder Wasserstoffbrücken an das Trägermaterial immobilisiert werden.

55. Verfahren nach einem der Ansprüche 30 bis 54, dadurch gekennzeichnet, daß die einzelnen Peptidmoleküle mittels monoklonaler Antikörper oder deren bindenden Fragmenten erkannt werden.

56. Verfahren nach einem der Ansprüche 30 bis 55, dadurch gekennzeichnet, daß das Bestimmen einzelner Peptide mittels Immunoassay, oder Präzipitationsassay unter Verwendung monoklonaler Antikörper durchgeführt wird.

57. Verwendung von rekombinant oder synthetisch hergestellten, für SIRS spezifischen Nukleinsäuresequenzen, Partialsequenzen oder davon abgeleiteten Protein-/ Peptidsequenzen einzeln oder in Teilmengen als Kalibrator in SIRS-Assays und/oder zur Bewertung der Wirkung und Toxizität beim Wirkstoffscreening und/oder zur Herstellung von Therapeutika und von Stoffen und Stoffgemischen, die als Therapeutikum vorgesehen sind, zur Vorbeugung und Behandlung von SIRS. ^{• <}

58. Verwendung von rekombinant oder synthetisch hergestellten, für Sepsis und/oder sepsisähnlichen Zustände spezifischen Nukleinsäuresequenzen, Partialsequenzen oder davon abgeleiteten Protein-/ Peptidsequenzen einzeln oder in Teilmengen als Kalibrator in Sepsis-Assays und/oder zur Bewertung der Wirkung und Toxizität beim Wirkstoffscreening und/oder zur Herstellung von Therapeutika und von Stoffen und Stoffgemischen, die als Therapeutikum vorgesehen sind, zur Vorbeugung und Behandlung von Sepsis, sepsisähnlichen systemischen entzündlichen Zuständen und sepsisähnlichen systemischen Infektionen.

59. Verwendung von rekombinant oder synthetisch hergestellten, für schwere Sepsis spezifischen Nukleinsäuresequenzen,

Partialsequenzen oder davon abgeleiteten Protein-/ Peptidsequenzen einzeln oder in Teilmengen als Kalibrator in Sepsis-Assays und/oder zur Bewertung der Wirkung und Toxizität beim Wirkstoffscreening und/oder zur Herstellung von Therapeutika und von Stoffen und Stoffgemischen, die als Therapeutikum vorgesehen sind, zur Vorbeugung und Behandlung von schwerer Sepsis.