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WO2002053773A2 - Verfahren zur bestimmung des hautstress oder der hautalterung in vitro - Google Patents

Verfahren zur bestimmung des hautstress oder der hautalterung in vitro Download PDF

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WO2002053773A2
WO2002053773A2 PCT/EP2001/015178 EP0115178W WO02053773A2 WO 2002053773 A2 WO2002053773 A2 WO 2002053773A2 EP 0115178 W EP0115178 W EP 0115178W WO 02053773 A2 WO02053773 A2 WO 02053773A2
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WO
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skin
proteins
mrna molecules
column
fragments
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PCT/EP2001/015178
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WO2002053773A3 (de
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Dirk Petersohn
Marcus Conradt
Kay Hofmann
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Henkel AG and Co KGaA
Original Assignee
Henkel AG and Co KGaA
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Publication date
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    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
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    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/20—Dermatological disorders

Definitions

  • the present invention relates to a method for determining skin stress and / or skin aging in humans or animals in vitro, test kits and biochips for determining skin stress and / or skin suppuration, and the use of proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules as stress and / or aging markers of the skin; furthermore a test method for proving the effectiveness of cosmetic or pharmaceutical active substances against skin stress and / or skin aging as well as a screening method for the identification of cosmetic or pharmaceutical active substances against skin stress and / or skin aging and a method for the production of a cosmetic or pharmaceutical preparation against skin stress and / or or skin aging.
  • Every living cell is able to react to signals from its environment.
  • the reactions of the cells are realized by an orderly regulation of the gene expression, so that the metabolism of cells is not static but very dynamic.
  • the human genome comprises around 140,000 genes.
  • each cell uses only a small, specific part for the synthesis of proteins, which is reflected in the gene expression pattern.
  • Exogenous signals are received by cells and lead to changes in the gene expression pattern, partly via complex signal transduction cascades. In this way, each cell responds to signals from its environment by adapting its metabolism.
  • the cells of the skin notice the high-energy radiation from the sun and react to it by changing their RNA and protein synthesis performance.
  • Some molecules are increasingly synthesized after a stress stimulus (e.g. sunlight) (e.g. MMP-1), others are produced to a lesser extent (e.g. collagen ⁇ (I)).
  • a stress stimulus e.g. sunlight
  • MMP-1 e.g. MMP-1
  • others are produced to a lesser extent (e.g. collagen ⁇ (I)).
  • no significant change will take place in a large number of the synthesis processes (for example TIMP-1).
  • Human skin is the largest organ in the human body. It is a very complex organ, which consists of a variety of different cell types and forms the body's interface with the environment. This fact makes it clear that the cells of the skin are particularly exposed to exogenous signals of the environment, physical and chemical nature and therefore regulate their gene expression continuously. To understand skin reactions to exogenous stimuli, the analysis of gene expression in the skin is therefore of crucial importance.
  • the macroscopic phenomena of aging skin are based on the one hand on intrinsic or chronological aging (skin aging), and on the other hand on extrinsic aging due to environmental stress (skin stress).
  • skin aging intrinsic or chronological aging
  • extrinsic aging due to environmental stress (skin stress).
  • the ability of living skin cells to react to your environment changes over time - there are aging processes that lead to senescence and ultimately cell death.
  • the visible signs of aged skin are to be understood as an integral of intrinsic and extrinsic aging (e.g. due to sunlight), the events of extrinsic aging accumulating in the skin over a longer period of time.
  • the skin consists of several different cell types (fibroblasts, keratinocytes in different differentiation states, melanocytes, Merkel cells, Langerhans cells, hair follicle cells, sweat gland cells etc.), so that the complexity of genes expressed in the skin is very great. It has never been possible to describe this immense complexity. So far, it has not been possible to identify genes from this complexity that are related to skin aging and can serve as molecular markers of skin aging.
  • mRNA molecules are present in the cell in concentrations between a few and several hundred copies.
  • the weakly expressed genes have so far not been available or have been very difficult to access, but they can certainly play a decisive role in aging processes and for the skin's home ostasis.
  • transcriptome The entirety of all mRNA molecules that are synthesized by a cell or a tissue at a specific point in time is referred to as a "transcriptome”. To date, it has not been possible to describe the complete transcriptome, i.e. the entirety of all transcribed genes, in human skin.
  • the cosmetic antiage products on the market exert their effects on one of the few known markers of extrinsic skin aging, such as collagen synthesis, collagenase activity or collagenase inhibitors.
  • methods for determining skin stress and / or skin aging are to be provided by means of the identified genes.
  • This first object is achieved according to the invention by a method (1) for identifying the genes which are important for skin aging and / or skin stress in humans or animals in vitro, characterized in that a) a first mixture of expressed in human or animal skin, ie transcribed and possibly also translated genetically coded factors, ie proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules from young human or animal skin, b) a second mixture of expressed, ie transcribed and optionally in human or animal skin also translates translated genetically coded factors, ie of proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules from old human or animal skin and c) subjecting the mixtures obtained in a) and b) to a serial analysis of gene expression (SAGE), and thereby identifying the genes which are expressed differently (differentially) in old and young skin.
  • SAGE serial analysis of gene expression
  • the method according to the invention can preferably be applied to human skin, but can also be applied to animal skin and to skin models based on human or animal skin.
  • SAGE TM serial analysis of gene expression
  • collagen (I) ⁇ 1 is overexpressed by a factor of 4-5 in young skin
  • collagen (I) ⁇ 2 by a factor of 4
  • collagen (III) ⁇ 1 by a factor of 8.
  • Other gene classes are those of young skin overexpressed correspond to marker proteins, for example of the cytoskeleton.
  • transgelin, desmin, actin, myosin, calponin and tropomyosin are overrepresented between 6 and 37 times.
  • some keratins and other keratinocyte-specific genes are overrepresented in the library from old skin.
  • epidermal keratins 5, 10 and 14 which are strongly expressed in both libraries are e.g. B. represented about 2 times more strongly in the old skin, while keratin 1, which is also strongly expressed, does not show this tendency.
  • Stratifin, Desmocollin, MMP2 (gelatinase) and CLSP (keratinocyte-specific calmodulin) are 5 to 8 times overrepresented.
  • Tables 1 to 4 contain a detailed list of the genes determined with the aid of the method according to the invention, which are differentially expressed in old and young skin, stating a serial number in column 1, the tag sequence used in column 2, and the determined relative expression frequency in young skin in column 3, the determined expression frequency in old skin in column 4, the quotient of the frequencies (from column 3 and column 4) in column 5, the significance in column 6, the UniGene accession number in column 7 and a brief description of the Gene or gene product in column 8.
  • the quotient in column 5 indicates the strength of the differential expression, i. i.e. by which factor the respective gene is expressed more strongly in young skin than in old skin, or vice versa.
  • the database is accessible on the Internet at the following address: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.
  • genes or gene products are also available at the Internet addresses httD.7 / www.ncbi.nlm.nih.gov / UniGene / Hs.Home.html or http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/ quide directly accessible. Table 1 lists all genes that are at least 2-fold and less than 5-fold differentially expressed.
  • Table 2 lists all genes that are at least 5-fold and less than 7-fold differentially expressed.
  • Table 3 lists all genes that are at least 7-fold and less than 10-fold differentially expressed.
  • Table 4 lists all genes that are at least 10-fold differentially expressed.
  • Table 5 lists genes that are at least 2-fold differentially expressed; to which, however, no database entry could be assigned and which can therefore only be identified by the tag sequence in column 2.
  • Table 6 lists genes that are at least 2-fold differentially expressed and that in column 2 by their UniGene Accession Number, in column 3 by their Swissprot or TREMBL number, or in column 4 by their EMBUGenbank number To be defined.
  • Table 7 lists genes that are differentially expressed between 2.89 and 11.10-fold. The assignment of the tags to the genes, which are defined by your UniGene Accession Number in column 6, was done by manual annotation.
  • the databases were downloaded from the NCBI, formatted for a local version of the BLAST program (also NCBI) and compared for identical hits with the tags detected in the SAGE analysis.
  • the genes / clones found were checked for redundancy and reworked as follows:
  • ESTs are from dbEST through 19-Oct-2001
  • the second object underlying the present invention is achieved according to the invention by a method (2) for determining skin stress and / or skin aging in humans or animals, in particular in women, in vitro, which is characterized in that a) a mixture of proteins , mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules from human or animal skin, b) the mixture obtained is examined for the presence and, if appropriate, the amount of at least one of the proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules, which are identified as differentially expressed in old and young skin by means of serial analysis of gene expression (SAGE), c) compares the test results from b) with the expression patterns identified by means of serial analysis of gene expression (SAGE) and d) the mixture examined in b) is assigned to old or stressed skin if it predominantly contains proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules which are expressed more strongly in old or stressed skin than in young or undressed skin , or assigns the mixture examined in b) to young or undressed skin
  • step b) of the method for determining skin stress and / or skin aging it may be sufficient to examine the mixture obtained for the presence of at least one of the proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules by means of serial analysis gene expression (SAGE) can be identified as differentially expressed in old and young skin if these are only expressed in old or only in young skin. In all other cases, the amount of differentially expressed molecules must also be examined in step b). that is, expression must be quantified.
  • SAGE serial analysis gene expression
  • step d) of the method for determining skin stress and / or skin aging the mixture of old or stressed skin examined in b) is assigned if it predominantly contains proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules which are expressed more in old or stressed skin than in young or stressed skin, d. that is, the mixture either contains more different compounds typically expressed in old skin than those typically expressed in young skin (qualitative differentiation), or contains more copies of compounds typically expressed in old skin than is typically present in young skin are (quantitative differentiation).
  • the assignment to young or undressed skin is carried out in a complementary manner.
  • a preferred embodiment of the method according to the invention for determining skin stress and / or skin aging is characterized in that in step b) the mixture obtained is checked for the presence and optionally the amount of at least one of the proteins, mRNA molecules or fragments of protein NEN or mRNA molecules that are defined in Tables 1 to 4 in column 7 by their UniGene Accession Number, in step c) the test results from b) with those in Tables 1 to 4 in columns 3 and 4 compares the specified expression frequencies and the expression quotients specified in column 5 and in step d) assigns the mixture of old or stressed skin examined in b) if it predominantly contains proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules which are in old age or stressed skin are expressed at least twice as strongly as in young or undressed skin, or assigns the mixture of young or undressed skin examined in b) if it predominantly contains proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules, which are expressed at least twice as strongly in young or undressed skin
  • a further preferred embodiment of the method according to the invention for determining skin stress and / or skin aging is characterized in that in step b) the mixture obtained is checked for the presence and optionally the amount of at least one of the proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or Examined mRNA molecules, which are defined in Tables 2 to 4 in column 7 by their UniGene Accession Number, in step c) the test results from b) with the relative given in Tables 2 to 4 in columns 3 and 4 Expression frequencies and the expression quotients indicated in column 5 are compared and in step d) the mixture of old or stressed skin examined in b) is assigned if it predominantly contains proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules which are in old or stressed skin are expressed at least 5 times as strongly as in young or undressed skin, or in b) the examined mixture of young or undressed skin is assigned if it predominantly contains proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules which are expressed in young or undressed skin at least
  • step b) the mixture obtained is examined for the presence and, if appropriate, the amount of at least one of the proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules, which are listed in tables 3 and 4 in column 7 by their UniGene accession number in step c) the test results from b) are compared with the relative expression frequencies given in tables 3 and 4 in columns 3 and 4 as well as with the expression quotients given in column 5 and in step d) the mixture of old resp assigned stressed skin if it contains predominantly proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules which are expressed at least 7-fold as strongly in old or stressed skin as in young or undressed skin, or that in b ) examined mixture of young or undressed skin assigned if it predominantly contains proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules which are expressed at least 7-fold as strongly in young or undressed skin as in old
  • a further preferred embodiment of the method according to the invention for determining skin stress and / or skin aging is characterized in that in step b) the mixture obtained is checked for the presence and optionally the amount of at least one of the proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or investigated mRNA molecules, which are defined in Table 4 in column 7 by their UniGene Accession Number, in step c) the test results from b) with the relative expression frequencies given in table 4 in columns 3 and 4 and the column 5 compares the given expression quotient and in step d) assigns the mixture of old or stressed skin examined in b) if it predominantly contains proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules that are at least 10 times in old or stressed skin are expressed as strongly as in young or undressed skin, or the gemi examined in b) assigned to young or undressed skin if it predominantly contains proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules which are expressed at least 10 times as strongly in young or undressed skin as in old or stressed skin
  • a further preferred embodiment of the method according to the invention for determining skin stress and / or skin aging is characterized in that in step b) the mixture obtained is checked for the presence and optionally the amount of at least one of the proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules investigated, which are defined in Table 5 or in Table 7 in column 2 by their 11-base tag sequence, in step c) the test results from b) with those in Table 5 or in Table 7 in columns 3 and 4 specified relative expression frequencies and the expression quotient indicated in column 5 and in step d) assigns the mixture of old or stressed skin examined in b) if it predominantly contains proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules which are contained in old or stressed skin at least twice, especially 5 times, preferably 7 times, especially b e are preferably expressed 10 times as strongly as in young or undressed skin, or assigns the mixture of young or undressed skin examined in b) if it predominantly contains proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA
  • the condition of the skin can also be described by quantifying several markers (expression products of the genes which are important for skin aging and / or skin stress), which must then be active in a characteristic relationship with one another in order to represent young skin, or in a characteristic ratio different from this must be active in order to represent old skin.
  • the present invention therefore furthermore relates to a method (3) for determining skin stress and / or skin aging in humans or animals, in particular in women, in vitro, which is characterized in that a) a mixture of proteins, mRNA Molecules or fragments of proteins or mRNA molecules from human or animal skin wins, b) in the mixture obtained at least two of the proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules quantified by means of method (1) as for skin aging and / or the skin stress are significantly identified, c) the expression ratios of the at least two proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules relative to one another are determined, d) the expression ratios from c) are compared with the expression ratios, which are typically young or old for the molecules quantified in b) Skin is present, in particular with the expression ratios that result from Tables 1 to 5, columns 3 and 4, and e) assigns the mixture of old or stressed skin obtained in a) if the expression ratios of the examined skin match the expression
  • the mixture is preferably obtained from a skin sample, in particular from a whole skin sample or from an epidermis sample.
  • a skin sample opens up more extensive comparison options with the SAGE libraries, which are also obtained from whole skin.
  • the epidermis sample on the other hand, is easier to obtain, for example by applying an adhesive tape to the skin and tearing it off, as described in WO 00/10579, to which reference is hereby made in full.
  • the mixture is obtained in step a) by means of microdialysis.
  • microdialysis A method for measurement of local tissue metabolism", Nielsen PS, Winge K, Petersen LM; Ugeskr Laeger 1999 Mar 22 161: 12 1735-8; and in "Cutaneous microdialysis for human in vivo dermal absorption studies ", Anderson, C. et al. ; Drugs Pharm. Sci., 1998, 91, 231-244; and also described on the Internet at http://www.microdialysis.se/techniqu.htm, to which reference is hereby made in full.
  • microdialysis When using microdialysis, a probe is typically inserted into the skin and the probe is slowly rinsed with a suitable carrier solution. After the acute reactions after the puncture have subsided, the microdialysis delivers proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules which occur in the extracellular space and which can then be isolated and analyzed in vitro, for example by fractionation of the carrier liquid. Microdialysis is less invasive than taking a whole skin sample; however, it is disadvantageously limited to the extraction of compounds occurring in the extracellular space.
  • a further preferred embodiment of the method according to the invention for determining skin stress and / or skin aging is characterized in that in step b) in method (2) the examination for the presence and optionally the amount of at least one of the proteins or protein fragments; or in method (3) the quantification of at least two proteins or protein fragments is carried out by means of a method which is selected from
  • 2D gel electrophoresis is described, for example, in LD Adams, Two-dimensional Gel Electrophoresis using the Isodalt System or in LD Adams & SR Gallagher, Two-dimensional Gel Electrophoresis using the O'Farrell System; both in Current Protocols in Molecular Biology (1997, Eds. FM Ausubel et al.), Unit 10.3.1-10.4.13; or in 2-D E-lectrophoresis manual; T. Berkelman, T. Senstedt; Amersham Pharmacia Biotech, 1998 (Order No. 80-6429-60).
  • the mass spectrometric characterization of the proteins or protein fragments is carried out in a manner known in the art, for example as described in the following references:
  • a further preferred embodiment of the method according to the invention for determining skin stress and / or skin aging is characterized in that in step b) in method (2) the examination for the presence and, if appropriate, the amount of at least one of the mRNA molecules or mRNA molecules molecular fragments; or in method (3) performs the quantification of at least two mRNA molecules or mRNA molecule fragments by means of a method which is selected from Northern blots,
  • RT-PCR Reverse transcriptase polymerase chain reaction
  • RNase protection experiments iv. Dot blots
  • v. cDNA sequencing vi. Clone hybridization
  • vii. Differential display viii. Subtractive hybridization
  • TOGA Total Gene Expression Analysis
  • SAGE Serial analysis of gene expression (SAGE) and especially xii. Use of nucleic acid chips, or by means of suitable combinations of these methods.
  • a further preferred embodiment of the method according to the invention for determining skin stress and / or skin aging is characterized in that in step b) the presence and optionally the amount of 1 to about 5000, preferably 1 to about 1000, in particular about 10 to about 500, preferably about 10 to about 250, particularly preferably about 10 to about 100 and very particularly preferably about 10 to about 50 of the proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules which i. in tables 1 to 4 in column 7 by their UniGene Accession Number, or ii.
  • Another object of the present invention is a test kit for determining skin stress and / or skin aging in humans or animals in vitro, comprising means for carrying out the method according to the invention for determining skin stress and / or skin aging.
  • Another object of the present invention is a biochip for determining skin stress and / or skin aging in humans or animals in vitro, comprising i. a solid, ie rigid or flexible support and ii. on this immobilized probes which are capable of specific binding to at least one of the proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules which are defined in Tables 1 to 4 in column 7 by their UniGene accession number, or which are defined in Table 5 or in Table 7 in column 2 by their 11-base tag sequence.
  • a BioChip is a miniaturized functional element with molecules immobilized on a surface, in particular biomolecules, which can serve as specific interaction partners.
  • DNA DNA
  • RNA in the case of nucleic acids and their chemical derivatives there may be single strands, triplex structures or combinations thereof
  • saccharides e.g. Antibodies, antigens, receptors
  • peptides proteins
  • proteins e.g. Antibodies, antigens, receptors
  • derivatives of combinatorial chemistry e.g. organic molecules
  • BioChips have a 2D base area for coating with biologically or biochemically functional materials.
  • the base surfaces can, for example, also be formed by walls of one or more capillaries or by channels.
  • the prior art can e.g. For example, reference is made to the following publications: Nature Genetics, Vol. 21, Supplement (total), Jan. 1999 (BioChips); Nature Biotechnology, Vol. 16, pp. 981-983, Oct. 1998 (BioChips); Trends in Biotechnology, Vol. 16, pp. 301-306, Jul.
  • the DNA chip technology which is particularly preferred in the context of the present invention is based on the ability of nucleic acids to enter into complementary base pairings. This technical principle, known as hybridization, has been used for years in Southern blot and Northern blot analysis. Compared to these conventional methods, in which only a few genes are analyzed, DNA chip technology allows a few hundred to several tens of thousands of genes to be examined in parallel.
  • a DNA chip essentially consists of a carrier material (e.g. glass or plastic) on which single-stranded, gene-specific probes are immobilized in a high density at a defined location (spot).
  • a carrier material e.g. glass or plastic
  • probe immobilization is considered problematic. According to the current state of the art, several ways of immobilizing probes are realized:
  • E. M. Southern (EM Southern et al. (1992), Nucleic Acid Research 20, 1679-1684 and EM Southern et al. (1997), Nucleic Acid Research 25, 1155-1161) describes the production of oligonucleotide arrangements by direct synthesis on a glass surface, which was derivatized with 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane and then with a glycol.
  • a similar method realizes the in situ synthesis of oligonucleotides using a photosensitive, combinatorial chemistry that can be compared with photolithographic techniques (Pease, AC et al. (1994), Proc. Natl Acad Sei USA 91, 5022- 5026).
  • photolithographic techniques Pease, AC et al. (1994), Proc. Natl Acad Sei USA 91, 5022- 5026.
  • existing DNA molecules can also be bound to surfaces of support material.
  • P.O. Brown (DeRisi et al. (1997), Science 278, 680-686) describes the immobilization of DNA on glass surfaces coated with polylysine.
  • the DNA probes can be applied to a carrier using a so-called “pin spotter”.
  • a pin spotter thin metal needles, for example with a diameter of 250 ⁇ m, are immersed in probe solutions and then transfer the attached sample material with defined volumes to the carrier material of the DNA Crisps.
  • the probe is preferably applied by means of a piezo-controlled nanodispenser, which, similar to an inkjet printer, applies probe solutions with a volume of 100 picoliters to the surface of the carrier material in a contact-free manner.
  • the probes are immobilized, for example, as described in EP-A-0 965 647:
  • the generation of DNA probes is carried out by means of PCR using a sequence-specific primer pair, a primer at the 5 'end being modified and a linker with a free one Amino group carries. This ensures that a defined strand of the PCR products can be bound to a glass surface which has been treated with 3-aminopropyltrimethoxysilane and then with 1, 4-phenyldiisothiocyanate.
  • the gene-specific PCR products should ideally have a defined nucleic acid sequence with a length of 200-400 bp and contain non-redundant sequences.
  • mRNA is isolated from two cell populations to be compared.
  • the isolated mRNAs are converted into cDNA by means of reverse transcription using, for example, fluorescence-labeled nucleotides.
  • the samples to be compared are marked with, for example, red or green fluorescent nucleotides.
  • the cDNAs are then hybridized with the gene probes immobilized on the DNA chip and the bound fluorescence is then quantified.
  • the biochip according to the invention preferably comprises 1 to approximately 5000, preferably 1 to approximately 1000, in particular approximately 10 to approximately 500, preferably approximately 10 to approximately 250, particularly preferably approximately 10 to approximately 100 and very particularly preferably approximately 10 to approximately 50 different probes.
  • the different probes can each be present in duplicate on the chip.
  • the biochip according to the invention preferably comprises nucleic acid probes, in particular RNA or PNA probes, particularly preferably DNA probes.
  • the nucleic acid probes preferably have a length of approximately 10 to approximately 1000, in particular approximately 10 to approximately 800, preferably approximately 100 to approximately 600, particularly preferably approximately 200 to approximately 400 nucleotides.
  • the biochip according to the invention comprises peptide or protein probes, in particular antibodies.
  • the biochip according to the invention comprises probes which are capable of specific binding to at least one of the proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules which are listed in Table 6 or 8 in column 2 by their UniGene accession. Number, or in column 3 by their Swissprot or TREMBL number, or in column 4 by their EMBL / Genbank number, or in Table 9 by the name of the gene.
  • Another object of the present invention is the use of the proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules which i. in tables 1 to 4 in column 7 by their UniGene Accession Number, or the ii. in Table 6 or 8 in column 2 by their UniGene Accession Number, or in column 3 by their Swissprot or TREMBL number, or in column 4 by their EMBL / Genbank number, or in Table 9 by the name of the gene , or the iii. in Table 5 or in Table 7 in column 2 are defined by their 11-base tag sequence as stress and / or aging markers of the skin in humans or animals.
  • Another object of the present invention is a test method for demonstrating the effectiveness of cosmetic or pharmaceutical active substances against skin stress and / or skin aging in vitro, characterized in that a) the skin status is determined by a method according to the invention for determining skin stress and / or skin aging, or using a test kit according to the invention for determining skin stress and / or skin aging, or using a biochip according to the invention, b) applying an active ingredient against skin stress and / or skin aging to the skin one or more times, c) renewing the skin status by means of an inventive method Method for determining skin stress and / or skin aging, or using a test kit according to the invention for determining skin stress and / or skin aging, or using a biochip according to the invention, and d) the effectiveness of the active ingredient by comparing the results from a) and c) determined.
  • Another object of the present invention is a test kit for demonstrating the effectiveness of cosmetic or pharmaceutical active substances against skin stress and / or skin aging in vitro, comprising means for carrying out the test method according to the invention.
  • Another object of the present invention is the use of the proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules which i. in tables 1 to 4 in column 7 by their UniGene Accession Number, or ii. in Table 6 or 8 in column 2 by their UniGene Accession Number, or in column 3 by their Swissprot or TREMBL number, or in column 4 by their EMBL / Genbank number, or in Table 9 by the name of the gene , or the iii. in Table 5 or in Table 7 in column 2 are defined by their 11-base tag sequence to demonstrate the effectiveness of cosmetic or pharmaceutical active ingredients against skin stress and / or skin aging.
  • Another object of the present invention is a screening method for the identification of cosmetic or pharmaceutical active ingredients against skin stress and / or skin aging in vitro, characterized in that a) the skin status by an inventive method for determining the skin stress and / or Skin aging, or by means of a test kit according to the invention for determining skin stress and / or skin aging, or by means of a biochip according to the invention, b) applying a potential active substance against skin stress and / or skin aging to the skin one or more times, c) the skin status again determined by a method according to the invention for determining skin stress and / or skin aging, or by means of a test kit according to the invention for determining skin stress and / or skin aging, or by means of a biochip according to the invention, and d) active ingredients by comparing the results from a ) and c) determined.
  • Another object of the present invention is the use of the proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules which i. in tables 1 to 4 in column 7 by their UniGene Accession Number, or the ii. in Table 6 or 8 in column 2 by their UniGene Accession Number, or in column 3 by their Swissprot or TREMBL number, or in column 4 by their EMBL / Genbank number, or in Table 9 by the name of the gene , or the iii. in Table 5 or in Table 7 in column 2 are defined by their 11-base tag sequence for the identification of cosmetic or pharmaceutical active substances against skin stress and / or skin aging.
  • Another object of the present invention is a method for producing a cosmetic or pharmaceutical preparation for skin stress and / or skin aging, characterized in that a) active ingredients with the aid of the screening method according to the invention, or the use for the identification of cosmetic or pharmaceutical active ingredients against skin stress and / or skin aging and b) active ingredients found to be effective mixed with cosmetically and pharmacologically suitable and compatible carriers.
  • the present invention further provides a cosmetic or pharmaceutical preparation for skin stress and / or skin aging, comprising at least one nucleic acid construct which is suitable for suppressing or reducing the activity of at least one of the proteins which are more strongly expressed in old or stressed skin than in young or undressed skin, or to induce or to increase the activity of at least one of the proteins which are expressed more strongly in young or undressed skin than in old or stressed skin.
  • the proteins are preferably selected from those in Tables 1 to 4 in column 7 by their UniGene accession number, or in Table 6 or 8 in column 2 by their UniGene accession number, or in column 3 their Swissprot or TREMBL number, or in column 4 by their EMBL / Genbank number, or in Table 9 by the name of the gene, or the tag sequence in Table 5 or in Table 7 in column 2 by their 11 bases
  • the nucleic acid construct is preferably selected from DNA, RNA or PNA. However, linear combinations of these nucleic acids or hybrid molecules, for example RNA / DNA hybrids, are also possible.
  • the nucleic acid construct is also preferably selected from protein-coding sequences, ribozymes, antisense nucleic acids, triple helix formers and rRNA.
  • the preparation according to the invention can contain approximately 1000, in particular approximately 10 to approximately 500, preferably approximately 10 to approximately 250, particularly preferably approximately 10 to approximately 100 and very particularly preferably approximately 10 to approximately 50 nucleic acid constructs which differ from one another.
  • the nucleic acid construct is present in the preparation according to the invention in particular enclosed in lipid vesicles, for example in liposomes, niosomes or transfersomes, preferably in liposomes.
  • Suitable nucleic acid constructs for the purposes of the invention are DNA and RNA sequences which code for one of the age markers and constructs of these polynucleotides.
  • the invention also includes partial sequences of age genes and genes whose sequence has been changed in comparison to the age genes mentioned by directed or other types of mutagenesis.
  • polynucleotides for insertion into the skin are DNA and RNA sequences which comprise part of the sequence of one or more of the genes mentioned and themselves have a desired biological activity (for example anti-sense RNA, rRNA or short double-stranded DNA molecules) ,
  • Any gene which can be used according to the invention, but preferably those which were found to be weakly expressed in the aging skin, can be introduced into the cells of the skin with the aim of its increased expression.
  • Any construct from one of the genes which can be used according to the invention, functionally linked to a eukaryotic promoter, can be used.
  • the constructs with one of the age genes can be any eukaryotic expression constructs.
  • bacterial plasmids, viral constructs, or other DNA constructs can be genetically modified to produce a recombinant DNA (or RNA) molecule that contains a sequence that encodes one of the age genes and expresses the desired gene product in skin cells ,
  • the preparation according to the invention is preferably applied to the skin.
  • the DNA contained in it can be either linear or circular, preferably circular DNA molecules.
  • the polynucleotide or the polynucleotide-containing construct can be reproduced and purified by known methods and is used as a pure molecule or in one of the u.g. Wording used.
  • Constructs which carry a promoter which enables expression of the DNA of interest are preferred. Depending on the nature of the gene and the purpose of its use, different promoters can be used. Strong, constitutive promoters can be used, such as the immediate early promoter gene "of cytomegalovirus (CMV) or the promoter of the" long terminal repeat "of Rous Sarcoma virus (RSV).
  • CMV cytomegalovirus
  • RSV Rous Sarcoma virus
  • tissue-specific promoters or cell type-specific promoters can be used.
  • the promoter can be selected so that it effects the specific expression in skin cells or certain skin cell types.
  • tissue-specific or cell-type-specific promoters include the keratin promoters (e.g. human keratin 14 promoter (Wang et al. 1997 Proc. Natl. Acad. Be US 94: 219-226)) or tyrosinase promoters (specific for melanocytes).
  • inducible promoters can be used.
  • the constructs can also contain other elements which enhance the transcriptional or translational expression of the gene product.
  • the construct may include an "internal ribosomal entry site" (IRES) to enhance translation of the downstream sequence (see Murakami et al. 1997, Gene 202: 23-29).
  • IRS internal ribosomal entry site
  • Other components that are present on the construct may include markers (e.g., antibiotic resistance genes such as the ampicillin resistance gene) for selecting cells containing the construct, an origin of replication that causes the construct to replicate stably in prokaryotic cells, a nuclear localization signal, or other elements that inhibit the production of the construct Support DNA construct and / or the encoded protein.
  • the constructs can also contain a polyadenylation signal.
  • the sequence of such a signal can be selected from various known polyadenylation signals.
  • a preferred example is the SV40 early polyadenylation signal.
  • the constructs can also include one or more introns that can enhance expression of the DNA.
  • the invention also includes constructs that code for fusion proteins of one of the age markers with a second protein or for a fusion protein of two age markers.
  • Preferred nucleic acid constructs are those with a plurality of expression cassettes, on which two or more age markers are coded, or which code one of the age genes and a gene for a further protein.
  • Co-transfection with one or more further vectors which can support the expression of the gene of interest is also possible.
  • Vectors which carry one or more of the features mentioned and, in addition, can also contain further functional units have been described many times in the literature and are commercially available. Such vectors are e.g. pCI and pSI (Promega GmbH) or pDEST (Gibco BRL).
  • sequences of the age genes and partial sequences of the genes which can be determined according to the invention and in particular those listed in Tables 1 to 9 can be used for the selective inhibition of the expression of individual genes.
  • Oligonucleotides and polynucleotides suitable for this purpose include antisense nucleotides, ribozyme nucleotides and double-stranded RNAs.
  • Antisense nucleotides are well known in their ability to hybridize with sense strands of the mRNA and thereby interfere with the expression of the mRNA (see, for example, Wingers et al., Laboratory Investigation 79, 1415-1424 (1999). An overview of the use of antisense nucleotides in the skin gives Wraight et al., Pharmacol & Ther 90, 89-104 (2001).
  • Ribozyme nucleic acids are also known as single-stranded RNA molecules that have the ability to selectively cleave ssRNA and ssDNA, and thereby selectively inhibit the expression of the target molecules.
  • Post-transcriptional gene repression can also be caused by double-stranded RNAs. These dsRNAs will soon interfere with the target RNA after cleavage. right segments by ribonuclease III. Duplexes from short RNA sequences can also be used for gene repression (SM Elbashir et al., Nature 411, 494-498 (2001). These double-stranded RNA molecules can also be used in the sense of the invention for the repression of the found age genes.
  • Unmodified DNA or RNA molecules are rapidly degraded in tissues or cells.
  • modifications have been developed which affect either the backbone or the pyridine or pyrimidine bases of an oligonucleotide.
  • modified DNA or RNA sequences can also be used for the purposes of the invention. Suitable modifications are e.g. Phosphorothioates, methylphosphonates or peptide linkages (PNAs) for the sugar backbone as well as C5-propynyl-dU, dC for the nucleoside bases.
  • PNAs Phosphorothioates, methylphosphonates or peptide linkages
  • the DNA or RNA molecules of the invention can e.g. can be applied topically.
  • the molecules can either be used without further substances influencing the penetration, or in a mixture or associated with molecules which influence the penetration through the stratum corneum and the transfection of the cells of the skin.
  • a preferred embodiment of the topical application of the age genes is that in a formulation with lipids, optionally in a mixture with surfactants, preferably in the form of liposomes.
  • the formulation contains about 0.1 ⁇ g - 5 mg DNA or RNA per mg liposome.
  • the components of the liposomes can be neutral or charged and in the form of e.g. multilamellar vesicles or unilamelar vesicles are present.
  • Suitable lipids for the production of liposomes are, for example, natural phosphatidylcholine, which can be obtained, for example, from egg, soybean, olives, coconut, whale fat, saffron, linseed, evening primrose or primrose.
  • Other suitable lipids are, for example, natural or synthetic phosphatidylethanolamine, synthetic phosphatidylcholine, phosphatidic acids or their esters, phosphatidylserine and phosphatid dyl (poly) alcohols, such as phosphatidylinisitol or phosphatidylglycerol.
  • lipids mentioned are DPPC (dipalmitoylphosphatidylcholine), DOPE (dioleylphosphatidylethanolamine), DOTMA (N [1- (2,3, dioleoyloxy) propyl] -N, N, N trimethylammonium chloride), DOTAB (N-1- (2,3-Dioleoyloxy) propyl N, N, N-trimethylammonium chloride), DPPA (dipalmitoylphosphatidic acid), DPPG (dipalmitoylphosphatidylglycerol).
  • DPPC dipalmitoylphosphatidylcholine
  • DOPE dioleylphosphatidylethanolamine
  • DOTMA N [1- (2,3, dioleoyloxy) propyl] -N, N, N trimethylammonium chloride
  • DOTAB N-1- (2,3-Dioleoyloxy) propyl N, N, N-trimethylammoni
  • liposomes Individual surface-active compounds, which are used, for example, as detergents or emulsifiers, can also be used to form liposomes. Examples include DODAC (dioctadecylammonium chloride) and CTAC (cetyltrimethylammonium chloride). Suitable constituents of liposomes and production processes are described in the literature (see, for example, “Liposome Drug Delivery Systems”, G. Betageri (ed.), Lancaster Techonomic Publishing Company (1993) or “Liposome Technology”, Gregoriadis (ed.), CRC Press ). In addition to liposomes, other lipid vesicles such as niosomes and transfersomes (see e.g. WO9817255) can also be used.
  • DODAC dioctadecylammonium chloride
  • CTAC cetyltrimethylammonium chloride
  • Suitable constituents of liposomes and production processes are described in the literature (see, for example, “L
  • Suitable penetration enhancers include organic solvents (eg ethanol), pyrrolidones, sulfoxides (eg DMSO), fatty acids (saturated or unsaturated, branched or unbranched with a preferred chain length of 8-18), terpenes (eg L-menthol or 1,8-cineol) surfactants (e.g. polysorbates (Tween), polyethylene alkylphenols (Brij), alkyl ether sulfates as well as betaines and amphoteric glycinates).
  • organic solvents eg ethanol
  • pyrrolidones eg pyrrolidones
  • sulfoxides eg DMSO
  • fatty acids saturated or unsaturated, branched or unbranched with a preferred chain length of 8-18
  • terpenes eg L-menthol or 1,8-cineol
  • surfactants e.g. polysorbates (Tween), polyethylene alkylphenols
  • invasive or minimally invasive methods are also possible for improving the penetration of oligo- or polynucleotides in the sense of the invention.
  • Common minimally invasive methods include electroporation and iontophoresis. In both methods, a voltage is applied to the surface of the skin with the help of electrodes. Electroporation uses a short pulse of high voltage to permeate the skin. For this purpose, a small voltage with constant current is used in iontophoresis. Low frequency ultrasound can also be used to increase skin permeability to DNA or RNA.
  • 6.1 ⁇ l of the resulting liposome dispersion are diluted with 1.5 ml PBS and mixed with 20 ⁇ g plasmid dissolved in 1.5 ml HBS (150 mM NaCl, 20 mM Hepes, pH 7.4).
  • 1.5 ml HBS 150 mM NaCl, 20 mM Hepes, pH 7.4
  • 6.7 ⁇ l of the resulting liposome dispersion are diluted with 1.5 ml PBS and mixed with 20 ⁇ g plasmid dissolved in 1.5 ml HBS (150 mM NaCl, 20 mM Hepes, pH 7.4).
  • Figure 1 TEM image of the liposome-DNA complexes from Example 2 in cryomode. Magnification: 10000 times
  • TRANSPORTER 1. (4F2 LC) 4F2 LIGHT CHAIN. (SLC7A5).
  • MSP58 NUCLEOLAR PROTEIN CELL CYCLE-REGULATED FACTOR P78.
  • NFATX4 (NFATC3 OR NFAT4) NUCLEAR FACTOR OF ACTIVATED T-CELLS, CYTOPLASMIC 3 (T CELL TRANSCRIPTION FACTOR NFAT4) (NF-ATC3) (NF-AT4) (NFATX).
  • NMT1 (NMT1 OR NMT) GLYCYLPEPTIDE N- TETRADECANOYLTRANSFERASE 1 (EC 2.3.1.97) (PEPTIDE N-MYRISTOYLTRANSFERASE 1) (MYRISTOYL-COA.PROTEIN N- MYFERISTASE) (NM
  • NR4A1 Hs.1119 P22736 NR4A1: (NR4A1 OR HMR OR NAK1 OR GFRP1) ORPHAN NUCLEAR RECEPTOR HMR (EARLY RESPONSE PROTEIN NAK1) (TR3 ORPHAN RECEPTOR)
  • NRF1 (NFE2L1 OR NRF1 OR TCF11 OR HBZ17) NUCLEAR FACTOR ERYTHROID 2 RELATED FACTOR 1 (NF-E2 RELATED FACTOR 1) (NFE2-RELATED FACTOR 1) (NUCLEAR FACTOR, ERYTHROID DERIVED 2, LIKE TRANSCRIPTION FACTOR 11) (TRANSCRIPTION FACTOR HBZ17)
  • ODC1 ORNITHINE DECARBOXYLASE (EC 4.1.1.17) (ODC).
  • PGS2 BONE PROTEOGLYCAN II PRECURSOR (PG-S2) (DECORIN) (PG40).
  • PPP2R1A SERINE / THREONINE PROTEIN PHOSPHATASE 2A, 65 KDA REGULATORY SUBUNIT A, ALPHA ISOFORM (PP2A, SUBUNIT A, PR65-ALPHA ISOFORM) (PP2A, SUBUNIT A, R1-ALPHA TEMPERAMENT) ANTIGEN-ASSOCIATED 61 KDA PROTEIN)
  • PSMA6 PROTEASOME IOTA CHAIN (EC 3.4.99.46)
  • MACROPAIN IOTA CHAIN MULTICATALYTIC ENDOPEPTIDASE COMPLEX IOTA CHAIN
  • 27 KDA PROSOMAL PROTEIN PROS-27

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung bei Menschen oder Tieren in vitro, Test-Kits und Biochips zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung sowie die Verwendung von Proteinen, mRNA-Molekülen oder Fragmenten von Proteinen oder mRNA-Molekülen als Streß- und/oder Alterungsmarker der Haut; ferner ein Testverfahren zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Hautstreß und/oder Hautalterung sowie ein Screening-Verfahren zur Identifikation von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Hautstreß und/oder Hautalterung und ein Verfahren zur Herstellung einer kosmetischen oder pharmazeutischen Zubereitung gegen Hautstreß und/oder Hautalterung. Des weiteren eine kosmetische oder pharmazeutische Zubereitung gegen Hautstreß und/oder Hautalterung.

Description

Verfahren zur Bestimmung des Hautstreß oder der Hautalterung in vitro
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung bei Menschen oder Tieren in vitro, Test-Kits und Biochips zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautaiterung sowie die Verwendung von Proteinen, mRNA-Molekülen oder Fragmenten von Proteinen oder mRNA-Molekülen als Streß- und/oder Alterungsmarker der Haut; ferner ein Testverfahren zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Hautstreß und/oder Hautalterung sowie ein Screening-Verfahren zur Identifikation von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Hautstreß und/oder Hautalterung und ein Verfahren zur Herstellung einer kosmetischen oder pharmazeutischen Zubereitung gegen Hautstreß und/oder Hautalterung.
Jede lebende Zelle ist in der Lage auf Signale ihrer Umwelt zu reagieren. Die Reaktionen der Zellen werden durch eine geordnete Regulation der Genexpression realisiert, sodaß der Metabolismus von Zellen nicht statisch sondern sehr dynamisch ist. Das menschliche Genom umfasst nach jüngsten Schätzungen ca. 140.000 Gene. Von diesem immensen Informationsangebot verwendet jede Zelle jedoch lediglich einen kleinen, für sie spezifischen Teil für die Synthese von Proteinen, der sich im Genexpressionsmuster wiederspiegelt. Exogene Signale werden von Zellen empfangen und führen, zum Teil über komplexe Signaltransduktionskaskaden, zu Veränderungen im Genexpressionsmuster. Auf diese Weise reagiert jede Zelle auf Signale aus ihrer Umgebung mit der Anpassung ihres Metabolismus.
Z.B. bemerken die Zellen der Haut die energiereiche Strahlung der Sonne und reagieren darauf mit der Umstellung ihrer RNA- und Proteinsyntheseleistungen. Einige Moleküle werden nach einem Stresstimulus (z.B. Sonnenlicht) vermehrt synthetisiert (z.B. MMP-1), andere wiederum werden in einem geringerem Umfang produziert (z.B. Kollagen αι (I)). Weiterhin wird bei einer Vielzahl der Syntheseprozesse keine signifikante Veränderung erfolgen (z.B. TIMP-1).
Die menschliche Haut ist das größte Organ des menschlichen Körpers. Sie ist ein sehr komplex aufgebautes Organ, welches aus einer Vielzahl verschiedener Zelltypen besteht und die Grenzfläche des Körpers zur Umwelt bildet. Diese Tatsache verdeutlicht, dass die Zellen der Haut in besonderem Maße exogenen Signalen der Umwelt, physikalischer und chemischer Natur ausgesetzt sind und daher kontinuierlich ihre Genexpression regulieren. Für das Verständnis von Hautreaktionen auf exogene Stimuli ist daher die Analyse der Genexpression in der Haut von entscheidender Bedeutung.
Die makroskopischen Phänomene alternder Haut beruhen zum einen auf der intrinsischen oder chronologischen Alterung (Hautalterung), zum anderen auf der extrinsischen Alterung durch Umweltstress (Hautstreß). Die Fähigkeit lebender Hautzellen, auf Ihre Umwelt zu reagieren, verändert sich mit der Zeit - es finden Alterungsprozesse statt, die zur Se- neszenz und letztendlich zum Zelltod führen. Die sichtbaren Zeichen gealterter Haut sind als Integral der intrinsischen und der extrinsischen Alterung (z.B. durch Sonnenlicht) zu verstehen, wobei die Ereignisse der extrinsischen Alterung über einen längeren Zeitraum in der Haut akkumulieren.
Ein entscheidendes Merkmal der Haut ist, dass mit zunehmendem Alter die Zellen ihre Fähigkeit verlieren die Homöostase des Organs aufrecht zu erhalten. Welche molekularen Mechanismen dieser Entwicklung zugrunde liegen ist bislang weitgehend unklar.
Effektive Antiage-Produkte zeigen ihre Wirkung auf ein möglichst breites Spektrum molekularer Phänomene der Hautalterung. Bisher sind jedoch nur wenige molekulare Ereignisse der Hautalterung beschrieben worden, die somit als Target kosmetischer Antiage- Produkte dienen können. Die Identifikation neuer Alterungsmarker ermöglicht es, den komplexen Prozesse der intrinsischen und extrinsischen Hautalterung und ihre kausalen Zusammenhänge zu begreifen. Nur mit diesem Wissen können neue Konzepte für kosmetische Antiage-Produkte entwickelt werden, die ihre Wirkung auf das breite Spektrum extrinsischer und intrinsischer Alterungsprozesse in der Haut ausüben. Jeder Zelltyp der Haut exprimiert ca. 15.000 verschiedene Gene und synthetisiert daraus entsprechend viele Proteine. Welche Gene davon bei der Hautalterung eine Rolle spielen ist bisher jedoch weitgehend unklar.
Die Haut besteht aus mehreren verschiedenen Zelltypen (Fibroblasten, Keratinozyten in verschiedenen Differenzierungszuständen, Melanozyten, Merkelzellen, Langerhanszellen Haarfollikelzellen, Schweisdrüsenzellen etc.), sodass die Komplexität in der Haut expri- mierter Gene sehr groß ist. Es ist bisher nicht möglich gewesen, diese immense Komplexität zu beschreiben. Ebenso wenig war es bisher möglich aus dieser Komplexität die Gene zu identifizieren, die mit der Hautalterung in Zusammenhang stehen und als molekulare Marker der Hautalterung dienen können.
Erschwerend kommt hinzu, dass in der Zelle mRNA-Moleküle in Konzentrationen zwischen einigen wenigen und mehreren hundert Kopien vorkommen. Die schwach expri- mierten Gene sind bisherigen Analysen nicht oder nur sehr schwer zugänglich gewesen, können aber durchaus eine entscheidende Rolle für Alterungsprozesse und für die Home- ostase der Haut spielen.
Die Gesamtheit aller mRNA-Moleküle, die von einer Zelle oder einem Gewebe zu einem bestimmten Zeitpunkt synthetisiert werden, bezeichnet man als "Transkriptom". Bis heute ist es nicht möglich gewesen das komplette Transkriptom, also die Gesamtheit aller transkribierten Gene, der humanen Haut zu beschrieben.
Die Analyse der Genexpression ist zwar mit der Quantifizierung spezifischer mRNA- Moleküle möglich (z.B. Northern-Blot, RNase-Schutzexperimente). Mit diesen Techniken können jedoch nur eine relativ begrenzte Anzahl an Genen gemessen werden.
Die am Markt befindlichen kosmetischen Antiage-Produkte üben ihre Wirkungen auf einen der wenigen bekannten Marker der extrinsischen Hautalterung, wie z.B. die Kollagensynthese, die Kollagenaseaktivität oder Kollagenaseinhibitoren aus.
Ein Verständnis der komplexen Alterungsprozesse in der Haut und die Identifikation geeigneter Markerproteine gestattet die gezielte Suche nach Substanzen oder Kombinationen von Substanzen mit einem breiten Antiage-Wirkspektrum. Produktkonzepte dieser Art konnten jedoch bis zu dem jetzigen Zeitpunkt nicht entwickelt werden, da eine Vielzahl der Hautalterungsmarker noch nicht bekannt waren.
Bisherige Untersuchungen zur Identifikation von Alterungsmarkern wurden unter Verwendung artifizieller Systeme durchgeführt. Die WO 99/52929 (Lifespan Bioscience Inc.) und die Arbeit von Danit, L. et al., (2000), Science 287, S. 2486-2492, beschreiben die Identifikation von Alterungsmarkern aus isolierten und anschließend in vitro kultivierten Fibroblasten der Haut. Die Zellen sind dabei nicht mehr in ihrer natürlichen Umgebung in der sich nur extrem langsam teilen, sondern teilen sich relativ schnell und stellen dabei ihre Genexpression um. Ein weiterer entscheidender Punkt ist die Tatsache, dass Fibroblasten in der Haut dem Einfluss benachbarter Hautzellen ausgesetzt sind, welches bei isolierten und in vitro kultivierten Zellen nicht mehr der Fall ist.
Es besteht daher ein Bedarf an der Identifikation möglichst vieler, vorzugsweise aller, für die Alterung der Haut wichtigen Gene.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, einen möglichst großen Teil der für die Hautalterung und/oder den Hautstreß bedeutsamen Gene zu identifizieren. Außerdem sollen mittels der identifizierten Gene Verfahren zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung bereitgestellt werden.
Diese erste Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren (1) zur Identifizierung der für die Hautalterung und/oder den Hautstreß bedeutsamen Gene bei Menschen oder Tieren in vitro, dadurch gekennzeichnet, daß man a) ein erstes Gemisch von in menschlicher oder tierischer Haut exprimierten, d. h. transkribierten und gegebenenfalls auch translatierten genetisch codierten Faktoren, also von Proteinen, mRNA-Molekülen oder Fragmenten von Proteinen oder mRNA- Molekülen aus junger menschlicher oder tierischer Haut gewinnt, b) ein zweites Gemisch von in menschlicher oder tierischer Haut exprimierten, d. h. transkribierten und gegebenenfalls auch translatierten genetisch codierten Faktoren, also von Proteinen, mRNA-Molekülen oder Fragmenten von Proteinen oder mRNA- Molekülen aus alter menschlicher oder tierischer Haut gewinnt und c) die in a) und b) gewonnenen Gemische einer Seriellen Analyse der Genexpression (SAGE) unterwirft, und dadurch die Gene identifiziert, die in alter und junger Haut unterschiedlich stark (differentiell) exprimiert werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich ebenso wie die weiteren Gegenstände der Erfindung bevorzugt auf menschliche Haut anwenden, aber auch auf tierische Haut sowie auf Hautmodelle auf der Basis menschlicher oder tierischer Haut übertragen.
Zur Erfassung des Transkriptoms der Haut wurde die Technik der „Seriellen Analyse der Genexpression" (SAGE™) eingesetzt. Diese Technik erlaubt gleichzeitig die Identifikation und Quantifizierung aller in der Haut exprimierten Gene. Der Vergleich des Transkriptoms junger Haut, mit dem Transkriptom alter Haut lässt die Unterscheidung zwischen relevanten und nicht relevanten Genen der Hautalterung zu.
Für die SAGE™-Analyse wurde humane Haut von gesunden weiblichen Spendern verwendet. Die Durchführung der SAGE™-Analyse erfolgte wie in der EP-A-0 761 822 und bei Velculescu, V.E. et al., 1995 Science 270, 484-487, beschrieben. Analysiert wurden zwei SAGE™-Libraries aus humaner Haut verschiedener Altersgruppen. Die erste Library stammt von einer 29-jährigen Probandin (30048 Tags), die andere Library von einer 69- jährigen Probandin (32840 Tags). Zur weiteren Analyse wurden beide SAGE™-Libraries auf die durchschnittliche tag-Anzahl normiert (31594 Tags). Die beiden Libraries wurden miteinander verglichen, um Gene mit einer altersabhängigen Regulation zu identifizieren. Wie für zwei Libraries desselben Gewebetyps erwartet, ist das Tag-Repertoire der beiden Haut-Libraries weitgehend ähnlich.
Zunächst fällt auf, dass die Library aus junger Haut eine deutliche Überexpression von Kollagenen aufweist. Einige Kollagene weisen mehrere alternative poly-Adenylierungen auf, die resultierenden tags zeigen jeweils konsistente Ergebnisse. So ist z.B. Kollagen (I) α1 in der jungen Haut um einen Faktor 4-5 überexprimiert, Kollagen (I) α2 um einen Faktor von 4, und Kollagen (III) α 1 um einen Faktor 8. Weitere Genklassen, die der jungen Haut überexprimiert sind entsprechen Marker- Proteinen z.B. des Cytoskeletts. So sind u. a. Transgelin, Desmin, Actin, Myosin, Calponin und Tropomyosin zwischen 6-fach und 37-fach überrepräsentiert. Im Gegensatz dazu sind in der Library aus alter Haut einige Keratine und andere Kerati- nocyten-spezische Gene überrepräsentiert. Die in beiden Libraries stark exprimierten epidermalen Keratine 5, 10 und 14 sind z. B. etwa 2-fach stärker in der alten Haut vertreten, während das ebenfalls stark-exprimierte Keratin 1 diese Tendenz nicht zeigt. Stratifin, Desmocollin, MMP2 (Gelatinase) und CLSP (Keratinocyten-spezifisches Calmo- dulin) sind 5- bis 8-fach überrepräsentiert.
Die Tabellen 1 bis 4 enthalten eine detaillierte Auflistung der mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens ermittelten, in alter und junger Haut differentiell exprimierten Gene unter Angabe einer laufenden Ordnungsnummer in Spalte 1 , der verwendeten Tag-Sequenz in Spalte 2, der ermittelten relativen Expressionsfrequenz in junger Haut in Spalte 3, der ermittelten relativen Expressionsfrequenz in alter Haut in Spalte 4, des Quotienten der Frequenzen (aus Spalte 3 und Spalte 4) in Spalte 5, der Signifikanz in Spalte 6, der UniGene-Accession-Number in Spalte 7 und einer Kurzbeschreibung des Gens bzw. Genproduktes in Spalte 8.
Der Quotient in Spalte 5 gibt die Stärke der differentiellen Expression an, d. h., um welchen Faktor das jeweilige Gen in junger Haut stärker exprimiert wird, als in alter Haut, oder umgekehrt.
Unter ihrer UniGene-Accession-Number sind die jeweiligen Gene bzw. Genprodukte in der Datenbank des National Center for Biotechnology Information (NCBI) offenbart. Diese
Datenbank ist im Internet unter folgender Adresse zugänglich: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.
Die Gene bzw. Genprodukte sind außerdem unter den Internet-Adressen httD.7/www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/Hs.Home.html oder http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/quide direkt zugänglich. In Tabelle 1 sind alle Gene aufgelistet, die mindestens 2-fach und weniger als 5-fach differentiell exprimiert sind.
In Tabelle 2 sind alle Gene aufgelistet, die mindestens 5-fach und weniger als 7-fach differentiell exprimiert sind.
In Tabelle 3 sind alle Gene aufgelistet, die mindestens 7-fach und weniger als 10-fach differentiell exprimiert sind.
In Tabelle 4 sind alle Gene aufgelistet, die mindestens 10-fach differentiell exprimiert sind.
In Tabelle 5 sind Gene aufgelistet, die mindestens 2-fach differentiell exprimiert sind; denen jedoch kein Datenbankeintrag zugeordnet werden konnte und die somit nur durch die Tag-Sequenz in Spalte 2 identifizierbar sind.
In Tabelle 6 sind Gene aufgelistet, die mindestens 2-fach differentiell exprimiert sind und die in Spalte 2 durch ihre UniGene-Accession-Number, oder in Spalte 3 durch ihre Swissprot- oder TREMBL-Nummer, oder in Spalte 4 durch ihre EMBUGenbank-Nummer definiert werden.
In Tabelle 7 sind Gene aufgelistet, die zwischen 2,89- und 11 , 10-fach differentiell exprimiert sind. Die Zuordnung der Tags zu den Genen, die durch Ihre UniGene-Accession- Number in Spalte 6 definiert werden, erfolgte durch manuelle Annotation.
Zur Annotation wurden folgende Datenbanken verwendet:
1. Unigene - Version vom 30.10.01 mit folgenden Datenbankeinträgen: a. der bekannten Gene aus Genbank (Stand: 12.10.01) b. der EST's aus dbEST (Stand: 19.10.01)
2. mRNA - Version released am 17.10.01
Die Datenbanken wurden vom NCBI heruntergeladen, für eine lokale Version des BLAST- Programmes (ebenfalls NCBI) formatiert und mit den in der SAGE-Analyse detektierten Tags auf identische Hits verglichen. Die gefundenen Gene/Klone wurden auf Redundanz geprüft und wie nachfolgend aufgeführt nachbearbeitet:
1. Tag-Sequenzen mit mehreren unterschiedlichen Treffern: Bewertung als nicht annotierbar.
2. Tag-Sequenzen mit doppelten oder mehreren identischen Treffern: Eliminierung der Treffer, die am weitesten vom Poly-A-Tail entfernt lagen.
Zunächst wurden die Ergebnisse aus der Unigene-Datenbank ausgewertet und dann mit den Ergebnissen aus der mRNA-Datenbank abgeglichen. Letztere tauchen in der Tabelle 7 nicht auf, da sie auch über die Unigene-Einträge abrufbar sind.
Alle in der Ergebnistabelle aufgeführten Links wurden auf der im folgenden dokumentierten Datenbasis des 30.10.2001 (Unigene-Datenbankrelease: UniGene Build #143) überprüft:
Sequences Included in UniGene
Known genes are from GenBank (Oct 12, 2001) ESTs are from dbEST through 19-Oct-2001
69367 mRNAs + gene CDSs
1147828 EST, 3'reads
1196006 EST, 5'reads
+ 598081 EST, other/unknown
3011282 total sequences in clusters
Final Number of Clusters (sets) 96332 sets total
20516 sets contain at least one known gene 95171 sets contain at least one EST 19355 sets contain both genes and ESTs
Release Notes
Die durch ihre Swissprot- bzw. TREMBL-Nummern definierten Gene oder Genprodukte sind im Internet unter folgenden Adressen offenbart: http://www.ebi.ac.uk/swissprot/ oder http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.
Die durch ihre EMBUGenbank-Nummern definierten Gene oder Genprodukte sind im
Internet unter folgender Adresse offenbart: http://ncbi.nlm.nih.gov/.
Die zweite der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren (2) zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung bei Menschen oder Tieren, insbesondere bei Frauen, in vitro, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man a) ein Gemisch von Proteinen, mRNA-Molekülen oder Fragmenten von Proteinen oder mRNA-Molekülen aus menschlicher oder tierischer Haut gewinnt, b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die mittels Serieller Analyse der Genexpression (SAGE) als in alter und junger Haut differentiell exprimiert identifiziert werden, c) die Untersuchungsergebnisse aus b) mit den mittels Serieller Analyse der Genexpression (SAGE) identifizierten Expressionsmustern vergleicht und d) das in b) untersuchte Gemisch alter bzw. gestreßter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in alter bzw. gestreßter Haut stärker exprimiert werden als in junger bzw. ungestreßter Haut, oder das in b) untersuchte Gemisch junger bzw. ungestreßter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in junger bzw. ungestreßter Haut stärker exprimiert werden als in alter bzw. gestreßter Haut.
Es kann in Schritt b) des Verfahrens zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung ausreichend sein, das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA- Molekülen zu untersuchen, die mittels Serieller Analyse der Genexpression (SAGE) als in alter und junger Haut differentiell exprimiert identifiziert werden, wenn diese ausschließlich in alter oder ausschließlich in junger Haut exprimiert werden. In allen anderen Fällen muß in Schritt b) auch die Menge der differentiell exprimierten Moleküle untersucht werden, d. h., die Expression muß quantifiziert werden.
In Schritt d) des Verfahrens zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung wird das in b) untersuchte Gemisch alter bzw. gestreßter Haut zugeordnet, wenn es ü- berwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA- Molekülen enthält, die in alter bzw. gestreßter Haut stärker exprimiert werden als in junger bzw. ungestreßter Haut, d. h., daß das Gemisch entweder mehr unterschiedliche typischerweise in alter Haut exprimierte Verbindungen enthält, als solche, die typischerweise in junger Haut exprimiert werden (qualitative Differenzierung), oder mehr Kopien von typischerweise in alter Haut exprimierten Verbindungen enthält, als typischerweise in junger Haut vorhanden sind (quantitative Differenzierung). Für die Zuordnung zu junger bzw. ungestreßter Haut wird in komplementärer weise verfahren.
Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung ist dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Protei- nen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in den Tabellen 1 bis 4 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number definiert werden, in Schritt c) die Untersuchungsergebnisse aus b) mit den in den Tabellen 1 bis 4 in den Spalten 3 und 4 angegebenen relativen Expressionsfrequenzen sowie den in Spalte 5 angegebenen Expressionsquotienten vergleicht und in Schritt d) das in b) untersuchte Gemisch alter bzw. gestreßter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA- Molekülen enthält, die in alter bzw. gestreßter Haut mindestens doppelt so stark exprimiert werden wie in junger bzw. ungestreßter Haut, oder das in b) untersuchte Gemisch junger bzw. ungestreßter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in junger bzw. ungestreßter Haut mindestens doppelt so stark exprimiert werden wie in alter bzw. gestreßter Haut.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung ist dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in den Tabellen 2 bis 4 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number definiert werden, in Schritt c) die Untersuchungsergebnisse aus b) mit den in den Tabellen 2 bis 4 in den Spalten 3 und 4 angegebenen relativen Expressionsfrequenzen sowie den in Spalte 5 angegebenen Expressionsquotienten vergleicht und in Schritt d) das in b) untersuchte Gemisch alter bzw. gestreßter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA- Molekülen enthält, die in alter bzw. gestreßter Haut mindestens 5-fach so stark exprimiert werden wie in junger bzw. ungestreßter Haut, oder das in b) untersuchte Gemisch junger bzw. ungestreßter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in junger bzw. ungestreßter Haut mindestens 5-fach so stark exprimiert werden wie in alter bzw. gestreßter Haut.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung ist dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in den Tabellen 3 und 4 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number definiert werden, in Schritt c) die Untersuchungsergebnisse aus b) mit den in den Tabellen 3 und 4 in den Spalten 3 und 4 angegebenen relativen Expressionsfrequenzen sowie den in Spalte 5 angegebenen Expressionsquotienten vergleicht und in Schritt d) das in b) untersuchte Gemisch alter bzw. gestreßter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA- Molekülen enthält, die in alter bzw. gestreßter Haut mindestens 7-fach so stark exprimiert werden wie in junger bzw. ungestreßter Haut, oder das in b) untersuchte Gemisch junger bzw. ungestreßter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in junger bzw. ungestreßter Haut mindestens 7-fach so stark exprimiert werden wie in alter bzw. gestreßter Haut.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung ist dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in Tabelle 4 in Spalte 7 durch ihre UniGene- Accession-Number definiert werden, in Schritt c) die Untersuchungsergebnisse aus b) mit den in Tabelle 4 in den Spalten 3 und 4 angegebenen relativen Expressionsfrequenzen sowie den in Spalte 5 angegebenen Expressionsquotienten vergleicht und in Schritt d) das in b) untersuchte Gemisch alter bzw. gestreßter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA- Molekülen enthält, die in alter bzw. gestreßter Haut mindestens 10-fach so stark exprimiert werden wie in junger bzw. ungestreßter Haut, oder das in b) untersuchte Gemisch junger bzw. ungestreßter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in junger bzw. ungestreßter Haut mindestens 10-fach so stark exprimiert werden wie in alter bzw. gestreßter Haut. Eine weitere bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung ist dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in Tabelle 5 oder in Tabelle 7 in Spalte 2 durch ihre 11 Basen umfassende Tag-Sequenz definiert werden, in Schritt c) die Untersuchungsergebnisse aus b) mit den in Tabelle 5 oder in Tabelle 7 in den Spalten 3 und 4 angegebenen relativen Expressionsfrequenzen sowie den in Spalte 5 angegebenen Expressionsquotienten vergleicht und in Schritt d) das in b) untersuchte Gemisch alter bzw. gestreßter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA- Molekülen enthält, die in alter bzw. gestreßter Haut mindestens doppelt, insbesondere 5- fach, vorzugsweise 7-fach, besonders bevorzugt 10-fach so stark exprimiert werden wie in junger bzw. ungestreßter Haut, oder das in b) untersuchte Gemisch junger bzw. ungestreßter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in junger bzw. ungestreßter Haut mindestens doppelt, insbesondere 5-fach, vorzugsweise 7-fach, besonders bevorzugt 10- fach so stark exprimiert werden wie in alter bzw. gestreßter Haut.
Man kann den Zustand der Haut auch dadurch beschreiben, daß mehrere Marker (Expressionprodukte der für die Hautalterung und/oder den Hautstreß bedeutsamen Gene) quantifiziert werden, die dann untereinander in einem charakteristischen Verhältnis aktiv sein müssen, um junge Haut zu repräsentieren, bzw. in einem hiervon verschiedenen charakteristischen Verhältnis aktiv sein müssen, um alte Haut zu repräsentieren.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren (3) zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung bei Menschen oder Tieren, insbesondere bei Frauen, in vitro, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man a) ein Gemisch von Proteinen, mRNA-Molekülen oder Fragmenten von Proteinen oder mRNA-Molekülen aus menschlicher oder tierischer Haut gewinnt, b) in dem gewonnenen Gemisch mindestens zwei der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen quantifiziert, die mittels Verfahren (1) als für die Hautalterung und/oder den Hautstreß bedeutsam identifiziert werden, c) die Expressionsverhältnisse der mindestens zwei Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen zueinander bestimmt, d) die Expressionsverhältnisse aus c) mit den Expressionsverhältnissen vergleicht, die für die in b) quantifizierten Moleküle typischerweise in junger bzw. in alter Haut vorliegen, insbesondere mit den Expressionsverhältnissen, die sich aus den Tabellen 1 bis 5, Spalten 3 bzw. 4 ergeben, und e) das in a) gewonnene Gemisch alter bzw. gestreßter Haut zuordnet, wenn die Expressionsverhältnisse der untersuchten Haut den Expressionsverhältnissen in alter Haut entsprechen, oder das in a) gewonnene Gemisch junger bzw. ungestreßter Haut zuordnet, wenn die Expressionsverhältnisse der untersuchten Haut den Expressionsverhältnissen in junger Haut entsprechen.
Vorzugsweise gewinnt man in Schritt a) der erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung das Gemisch aus einer Hautprobe, insbesondere aus einer Vollhautprobe oder aus einer Epidermisprobe. Hierbei eröffnet die Vollhautprobe umfassendere Vergleichsmöglichkeiten mit den gleichfalls aus Vollhaut gewonnenen SAGE-Libraries. Die Epidermisprobe ist hingegen leichter zu gewinnen, beispielsweise durch Aufbringen eines Klebebandes auf die Haut und Abreißen desselben, wie in der WO 00/10579 beschrieben, auf die hiermit in vollem Umfang Bezug genommen wird.
In einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung gewinnt man in Schritt a) das Gemisch mittels Mikrodialyse. Die Technik der Mikrodialyse wird beispielsweise in „Microdialysis: A method for measurement of local tissue metabolism", Nielsen PS, Winge K, Petersen LM; Ugeskr Laeger 1999 Mar 22 161 :12 1735-8; sowie in „Cutaneous microdialysis for human in vivo dermal absorption studies", Anderson, C. et al. ; Drugs Pharm. Sei., 1998, 91 , 231-244; und auch im Internet unter http://www.microdialysis.se/techniqu.htm beschrieben, worauf hiermit in vollem Umfang Bezug genommen wird.
Bei der Anwendung der Mikrodialyse führt man typischerweise eine Sonde in die Haut ein und beginnt mit einer geeigneten Trägerlösung die Sonde langsam zu spülen. Nach dem Abklingen der akuten Reaktionen nach dem Einstich liefert die Mikrodialyse Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen, die im extrazellulären Raum vorkommen und die, beispielsweise durch Fraktionierung der Trägerflüssigkeit, dann in vitro isoliert und analysiert werden können. Die Mikrodialyse ist weniger inva- siv, als die Entnahme einer Vollhautprobe; sie ist aber nachteiligerweise auf die Gewinnung im extrazelulären Raum vorkommender Verbindungen beschränkt.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung ist dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt b) in Verfahren (2) die Untersuchung auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine oder Proteinfragmente; bzw. in Verfahren (3) die Quantifizierung mindestens zweier Proteine oder Proteinfragmente, mittels einer Methode durchführt, die ausgewählt ist unter
Ein- oder zweidimensionaler Gelelektrophorese Affinitätschromatographie Protein-Protein-Komplexierung in Lösung iv. Massenspektrometrie, insbesondere Matrix Assistierter Laser Desorptions Ionisation (MALDI) und insbesondere v. Einsatz von Proteinchips, oder mittels geeigneter Kombinationen dieser Methoden.
Diese erfindungsgemäß einsetzbaren Methoden sind in dem Übersichtsartikel von Akhi- lesh Pandey und Matthias Mann: „Proteomics to study genes and genomes", Nature, Volume 405, Number 6788, 837 - 846 (2000), und den dort angegebenen Referenzen beschrieben, worauf hiermit in vollem Umfang Bezug genommen wird.
Die 2D-Gelelektrophorese, wird beispielsweise in L.D. Adams, Two-dimensional Gel E- lectrophoresis using the Isodalt System oder in L.D. Adams & S.R. Gallagher, Two- dimensional Gel Electrophoresis using the O'Farrell System; beide in Current Protocols in Molecular Biology (1997, Eds. F.M. Ausubel et al.), Unit 10.3.1 - 10.4.13; oder in 2-D E- lectrophoresis-Manual; T. Berkelman, T. Senstedt; Amersham Pharmacia Biotech, 1998 (Bestell-Nr. 80-6429-60), beschrieben. Die massenspektrometrische Charakterisierung der Proteine oder Proteinfragmente erfolgt in der Fachwelt bekannter Weise, beispielsweise wie in den folgenden Literaturstellen beschrieben:
Methods in Molecular Biology, 1999; Vol 112; 2-D Proteome Analysis Protocols; Editor: A. J. Link; Humana Press; Totowa; New Jersey. Darin insbesondere: Courchesne, P. L. und Patterson, S. D.; S. 487-512.
Carr, S. A. und Annan, R. S.; 1997; in: Current Protocols in Molecular Biology; Editor: Ausubel, F. M. et al.; John Wiley and Sons, Inc. 10.2.1-10.21.27.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung ist dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt b) in Verfahren (2) die Untersuchung auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der mRNA-Moleküle oder mRNA-Molekülfragmente; bzw. in Verfahren (3) die Quantifizierung mindestens zweier mRNA-Moleküle oder mRNA- Molekülfragmente mittels einer Methode durchführt, die ausgewählt ist unter Northern Blots,
Reverse Transkriptase Polymerasekettenreaktion (RT-PCR), RNase-Schutzexperimente, iv. Dot-Blots, v. cDNA-Sequenzierung, vi. Klon-Hybridisierung, vii. Differential Display, viii. Subtraktive Hybridisierung, ix. cDNA-Fragment-Fingerprinting, x. Total Gene Expression Analysis (TOGA) xi. Serielle Analyse der Genexpression (SAGE) und insbesondere xii. Einsatz von Nukleinsäurechips, oder mittels geeigneter Kombinationen dieser Methoden.
Diese erfindungsgemäß einsetzbaren Methoden sind in den Übersichtsartikeln von Akhi- lesh Pandey und Matthias Mann: „Proteomics to study genes and genomes", Nature, Volume 405, Number 6788, 837 - 846 (2000), und „Genomics, gene expression and DNA arrays", Nature, Volume 405, Number 6788, 827 - 836 (2000), und den dort angegebenen Referenzen beschrieben, worauf hiermit in vollem Umfang Bezug genommen wird. Das TOGA-Verfahren ist in "J. Gregor Sutcliffe et al, TOGA: An automated parsing tech- nology for analyzing expression of nearly all genes, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (PNAS), Vol. 97, No. 5, pp. 1976-1981 (2000)" beschrieben, worauf hiermit vollumfänglich Bezug genommen wird.
Es können jedoch erfindungsgemäß auch andere dem Fachmann bekannte Methoden zur Untersuchung auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA- Molekülen eingesetzt werden.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung ist dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt b) auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von 1 bis etwa 5000, bevorzugt 1 bis etwa 1000, insbesondere etwa 10 bis etwa 500, vorzugsweise etwa 10 bis etwa 250, besonders bevorzugt etwa 10 bis etwa 100 und ganz besonders bevorzugt etwa 10 bis etwa 50 der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die i. in den Tabellen 1 bis 4 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number, oder die ii. in Tabelle 6 oder 8 in Spalte 2 durch ihre UniGene-Accession-Number, oder in Spalte 3 durch ihre Swissprot- oder TREMBL-Nummer, oder in Spalte 4 durch ihre EMBL/Genbank-Nummer, oder in Tabelle 9 durch den Namen des Gens, oder die iii. in Tabelle 5 oder in Tabelle 7 in Spalte 2 durch ihre 11 Basen umfassende Tag- Sequenz definiert werden.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Test-Kit zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung bei Menschen oder Tieren in vitro, umfassend Mittel zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Biochip zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung bei Menschen oder Tieren in vitro, umfassend i. einen festen, d. h. starren oder flexiblen Träger und ii. auf diesem immobilisierte Sonden, die zur spezifischen Bindung an mindestens eines der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA- Molekülen befähigt sind, die in den Tabellen 1 bis 4 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number definiert werden, oder die in Tabelle 5 oder in Tabelle 7 in Spalte 2 durch ihre 11 Basen umfassende Tag-Sequenz definiert werden.
Bei einem BioChip handelt es sich um ein miniaturisiertes Funktionselement mit auf einer Oberfläche immobilisierten Molekülen, insbesondere Biomolekülen, die als spezifische Interaktionspartner dienen können.
Häufig weist die Struktur dieser Funktionselemente Reihen und Spalten auf; man spricht dann von Chip-"Arrays". Da tausende von biologischen bzw. biochemischen Funktionselementen auf einem Chip angeordnet sein können, müssen diese in der Regel mit mikrotechnischen Methoden angefertigt werden.
Als biologische und biochemische Funktionselemente kommen insbesondere in Frage: DNA, RNA, PNA, (bei Nukleinsäuren und ihren chemischen Derivaten können z. B. Einzelstränge, Triplex-Strukturen oder Kombinationen hiervon vorliegen), Saccharide, Pepti- de, Proteine (z. B. Antikörper, Antigene, Rezeptoren) und Derivate der kombinatorischen Chemie (z. B. organische Moleküle).
Im allgemeinen haben BioChips eine 2D-Basisfläche für das Beschichten mit biologisch oder biochemisch funktioneilen Materialien. Die Basisflächen können beispielweise auch von Wänden einer oder mehrerer Kapillaren oder von Kanälen gebildet sein. Zum Stand der Technik kann z. B. auf folgende Publikationen hingewiesen werden: Na- ture Genetics, Vol. 21 , Supplement (Gesamt), Jan. 1999 (BioChips); Nature Biotechnology, Vol. 16, S. 981-983, Okt. 1998 (BioChips); Trends in Biotechnology, Vol. 16, S. 301- 306, Jul. 1998 (BioChips) sowie die bereits genannten Übersichtsartikel von Akhilesh Pandey und Matthias Mann: „Proteomics to study genes and genomes", Nature, Volume 405, Number 6788, 837 - 846 (2000), und „Genomics, gene expression and DNA arrays", Nature, Volume 405, Number 6788, 827 - 836 (2000), und die dort angegebenen Referenzen, worauf hiermit in vollem Umfang Bezug genommen wird. Eine übersichtliche Darstellung der praktischen Anwendungsverfahren der DNA- Chiptechnologie liefern die Bücher „DNA Microarrays: A Practical Approach" (Editor: Mark Schena, 1999, Oxford University Press) und „Microarray Biochip Technology" (Editor: Mark Schena, 2000, Eaton Publishing), auf die hiermit in vollem Umfang Bezug genommen wird.
Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung besonders bevorzugte DNA-Chiptechnologie beruht auf der Fähigkeit von Nukleinsäuren komplementäre Basenpaarungen einzugehen. Dieses als Hybridisierung bezeichnete technische Prinzip wird bereits seit Jahren bei der Southern-Blot- und Northern-Blot-Analyse eingesetzt. Im Vergleich zu diesen herkömmlichen Methoden, bei denen lediglich einige wenige Gene analysiert werden, gestattet es die DNA-Chiptechnologie einige hundert bis zu mehreren zehntausend Genen parallel zu untersuchen.
Ein DNA-Chip besteht im wesentlichen aus einem Trägermaterial (z.B. Glas oder Kunststoff), auf dem einzelsträngige, genspezifische Sonden in hoher Dichte an einer definierten Stelle (Spot) immobilisiert werden. Als problematisch wird dabei die Technik der Sonden-Applikation und die Chemie der Sonden-Immobilisierung eingeschätzt. Nach dem derzeitigen Stand der Technik sind mehrere Wege der Sonden-Immobilisierung realisiert:
E.M. Southern (E.M. Southern et al. (1992), Nucleic Acid Research 20, 1679-1684 und E.M. Southern et al. ( 1997), Nucleic Acid Research 25, 1155-1161) beschreibt die Herstellung von Oligonukleotidanordnungen durch direkte Synthese an einer Glasoberfläche, die mit 3-Glycidoxypropyltrimethoxysilan und anschließend mit einem Glycol derivatisiert wurde.
Ein ähnliches Verfahren realisiert die in situ Synthese von Oligonukleotiden mittels einer photosensitiven, kombinatorischen Chemie, die mit photolithographischen Techniken verglichen werden kann (Pease, A.C. et al. (1994), Proc. Natl Acad Sei USA 91 , 5022- 5026). Neben diesen auf der in s/ft/-Synthese von Oligonukleotiden beruhenden Techniken können ebenso bereits vorhandene DNA-Moleküle an Oberflächen von Trägermaterial gebunden werden.
P.O. Brown (DeRisi et al. (1997), Science 278, 680-686) beschreibt die Immobilisierung von DNA an mit Polylysin beschichteten Glasoberflächen.
Die Veröffentlichung von L.M. Smith (Guo, Z. et al. (1994), Nucleic Acid Research 22, 5456-5465) legt ein ähnliches Verfahren offen: Oligonukleotide, die eine 5'terminale Aminogruppe tragen, können an eine Glasoberfläche gebunden werden, die mit 3- Aminopropyltrimethoxysilan und anschließend mit 1 ,4-Phenyldiisothiocyanat behandelt wurde.
Die Applikation der DNA-Sonden auf einem Träger kann mit einem sogenannten „Pin- Spotter" erfolgen. Dazu tauchen dünne Metallnadeln mit z.B. einem Durchmesser von 250 μm, in Sondenlösungen ein und überführen anschließend das anhängende Probenmaterial mit definierten Volumina auf das Trägermaterial des DNA-Chips.
Bevorzugterweise erfolgt die Sondenapplikation jedoch mittels eines piezogesteuerten Nanodispensers, der ähnlich einem Tintenstrahldrucker, Sondenlösungen mit einem Volumen von 100 Picolitern kontaktfrei auf die Oberfläche des Trägermaterials aufbringt.
Die Immobilisierung der Sonden erfolgt z.B. wie in der EP-A-0 965 647 beschrieben: Die Generierung von DNA-Sonden erfolgt hierbei mittels PCR unter Verwendung eines sequenzspezifischen Primerpaares, wobei ein Primer am 5'-Ende modifiziert ist und einen Linker mit einer freien Aminogruppe trägt. Damit ist sichergestellt, dass ein definierter Strang der PCR-Produkte an einer Glasoberfläche gebunden werden kann, welche mit 3- Aminopropyltrimethoxysilan und anschließend mit 1 ,4-Phenyldiisothiocyanat behandelt wurde. Die genspezifischen PCR-Produkte sollen idealerweise eine definierte Nukleinsäu- resequenz in einer Länge von 200-400 bp haben und nicht redundante Sequenzen beinhalten. Nach der Immobilisierung der PCR-Produkte über den derivatisierten Primer wird der Gegenstrang des PCR-Produkts durch eine Inkubation bei 96°C für 10 Min entfernt. In einer für DNA-Chips typischen Anwendung wird mRNA aus zwei zu vergleichenden Zellpopulationen isoliert. Die isolierten mRNAs werden mittels reverser Transkription unter Verwendung von z.B. fluoreszenzmarkierten Nukleotiden in cDNA umgewandelt. Dabei werden die zu vergleichenden Proben mit z.B. rot bzw. grün fluoreszierenden Nukleotiden markiert. Die cDNAs werden dann mit den auf dem DNA-Chip immobilisierten Gensonden hybridisiert und anschließend die gebundenen Fluoreszenzen quantifiziert.
Der erfindungsgemäße Biochip umfasst bevorzugt 1 bis etwa 5000, bevorzugtermaßen 1 bis etwa 1000, insbesondere etwa 10 bis etwa 500, vorzugsweise etwa 10 bis etwa 250, besonders bevorzugt etwa 10 bis etwa 100 und ganz besonders bevorzugt etwa 10 bis etwa 50 voneinander verschiedene Sonden. Die voneinander verschiedenen Sonden können jeweils in mehrfacher Kopie auf dem Chip vorhanden sein.
Der erfindungsgemäße Biochip umfasst bevorzugt Nukleinsäuresonden, insbesondere RNA- oder PNA-Sonden, besonders bevorzugt DNA-Sonden. Die Nukleinsäuresonden weisen bevorzugt eine Länge von etwa 10 bis etwa 1000, insbesondere etwa 10 bis etwa 800, vorzugsweise etwa 100 bis etwa 600, besonders bevorzugt etwa 200 bis etwa 400 Nukleotiden auf.
In einer weiteren bevorzugten Form umfasst der erfindungsgemäße Biochip Peptid- oder Proteinsonden, insbesondere Antikörper.
In einer weiteren bevorzugten Form umfasst der erfindungsgemäße Biochip Sonden, die zur spezifischen Bindung an mindestens eines der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen befähigt sind, die in Tabelle 6 oder 8 in Spalte 2 durch ihre UniGene-Accession-Number, oder in Spalte 3 durch ihre Swissprot- oder TREMBL-Nummer, oder in Spalte 4 durch ihre EMBL/Genbank-Nummer, oder in Tabelle 9 durch den Namen des Gens definiert werden.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen, die i. in den Tabellen 1 bis 4 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number, oder die ii. in Tabelle 6 oder 8 in Spalte 2 durch ihre UniGene-Accession-Number, oder in Spalte 3 durch ihre Swissprot- oder TREMBL-Nummer, oder in Spalte 4 durch ihre EMBL/Genbank-Nummer, oder in Tabelle 9 durch den Namen des Gens, oder die iii. in Tabelle 5 oder in Tabelle 7 in Spalte 2 durch ihre 11 Basen umfassende Tag- Sequenz definiert werden als Streß- und/oder Alterungsmarker der Haut bei Menschen oder Tieren.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Testverfahren zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Hautstreß und/oder Hautalterung in vitro, dadurch gekennzeichnet, daß man a) den Hautstatus durch ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung, oder mittels eines erfindungsgemäßen Test-Kits zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung, oder mittels eines erfindungsgemäßen Biochips bestimmt, b) einen Wirkstoff gegen Hautstreß und/oder Hautalterung einmal oder mehrmals auf die Haut aufbringt, c) erneut den Hautstatus durch ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung, oder mittels eines erfindungsgemäßen Test-Kits zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung, oder mittels eines erfindungsgemäßen Biochips bestimmt, und d) die Wirksamkeit des Wirkstoffs durch den Vergleich der Ergebnisse aus a) und c) bestimmt.
Zur Beschleunigung des Testverfahrens ist es auch möglich, verschiedene Wirkstoffe oder Placebos parallel auf verschiedene Hautareale aufzubringen; beispielsweise einen Wirkstoff auf den linken Unterarm und ein Placebo auf den rechten Unterarm, oder umgekehrt.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Test-Kit zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Hautstreß und/oder Hautalterung in vitro, umfassend Mittel zur Durchführung des erfindungsgemäßen Testverfahrens. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen, die i. in den Tabellen 1 bis 4 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number, oder die ii. in Tabelle 6 oder 8 in Spalte 2 durch ihre UniGene-Accession-Number, oder in Spalte 3 durch ihre Swissprot- oder TREMBL-Nummer, oder in Spalte 4 durch ihre EMBL/Genbank-Nummer, oder in Tabelle 9 durch den Namen des Gens, oder die iii. in Tabelle 5 oder in Tabelle 7 in Spalte 2 durch ihre 11 Basen umfassende Tag- Sequenz definiert werden zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Hautstreß und/oder Hautalterung.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Screening-Verfahren zur I- dentifikation von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Hautstreß und/oder Hautalterung in vitro, dadurch gekennzeichnet, daß man a) den Hautstatus durch ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung, oder mittels eines erfindungsgemäßen Test- Kits zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung, oder mittels eines erfindungsgemäßen Biochips bestimmt, b) einen potentiellen Wirkstoff gegen Hautstreß und/oder Hautalterung einmal oder mehrmals auf die Haut aufbringt, c) erneut den Hautstatus durch ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung, oder mittels eines erfindungsgemäßen Test-Kits zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung, oder mittels eines erfindungsgemäßen Biochips bestimmt, und d) wirksame Wirkstoffe durch den Vergleich der Ergebnisse aus a) und c) bestimmt.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen, die i. in den Tabellen 1 bis 4 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number, oder die ii. in Tabelle 6 oder 8 in Spalte 2 durch ihre UniGene-Accession-Number, oder in Spalte 3 durch ihre Swissprot- oder TREMBL-Nummer, oder in Spalte 4 durch ihre EMBL/Genbank-Nummer, oder in Tabelle 9 durch den Namen des Gens, oder die iii. in Tabelle 5 oder in Tabelle 7 in Spalte 2 durch ihre 11 Basen umfassende Tag-Sequenz definiert werden, zur Identifikation von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Hautstreß und/oder Hautalterung.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer kosmetischen oder pharmazeutischen Zubereitung gegen Hautstreß und/oder Hautalterung, dadurch gekennzeichnet, daß man a) wirksame Wirkstoffe mit Hilfe des erfindungsgemäßen Screening-Verfahrens, oder der Verwendung zur Identifikation von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Hautstreß und/oder Hautalterung bestimmt und b) als wirksam befundene Wirkstoffe mit kosmetisch und pharmakologisch geeigneten und verträglichen Trägern vermischt.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine kosmetische oder pharmazeutische Zubereitung gegen Hautstreß und/oder Hautalterung, enthaltend mindestens ein Nukleinsäurekonstrukt, das geeignet ist, die Aktivität mindestens eines der Proteine zu unterdrücken oder zu verringern, die in alter bzw. gestreßter Haut stärker exprimiert werden als in junger bzw. ungestreßter Haut, oder die Aktivität mindestens eines der Proteine zu induzieren oder zu verstärken, die in junger bzw. ungestreßter Haut stärker exprimiert werden als in alter bzw. gestreßter Haut.
Vorzugsweise sind die Proteine ausgewählt sind unter denen, die in den Tabellen 1 bis 4 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number, oder die in Tabelle 6 oder 8 in Spalte 2 durch ihre UniGene-Accession-Number, oder in Spalte 3 durch ihre Swissprot- oder TREMBL-Nummer, oder in Spalte 4 durch ihre EMBL/Genbank-Nummer, oder in Tabelle 9 durch den Namen des Gens, oder die in Tabelle 5 oder in Tabelle 7 in Spalte 2 durch ihre 11 Basen umfassende Tag-Sequenz definiert werden. Das Nukleinsäurekonstrukt ist bevorzugtermaßen ausgewählt unter DNA, RNA oder PNA. Möglich sind aber auch lineare Kombinationen dieser Nukleinsäuren oder Hybridmoleküle, beispielsweise RNA/DNA-Hybride. Das Nukleinsäurekonstrukt ist außerdem vorzugsweise ausgewählt unter proteinkodierenden Sequenzen, Ribozymen, Antisense-Nukleinsäuren, Triple-Helix-Bildnern und rRNA.
Die erfindungsgemäße Zubereitung kann etwa 1000, insbesondere etwa 10 bis etwa 500, vorzugsweise etwa 10 bis etwa 250, besonders bevorzugt etwa 10 bis etwa 100 und ganz besonders bevorzugt etwa 10 bis etwa 50 voneinander verschiedene Nukleinsäurekonstrukte enthalten.
Das Nukleinsäurekonstrukt liegt in der erfindungsgemäßen Zubereitung insbesondere in Lipidvesikeln eingeschlossen vor, beispielsweise in Liposomen, Niosomen oder Transfersomen, vorzugsweise in Liposomen.
Als Nukleinsäurekonstrukte im Sinne der Erfindung kommen in Betracht DNA und RNA Sequenzen, die für einen der Altersmarker kodieren und Konstrukte dieser Polynukleotide.
Diese werden nach ihrem Transport in die Zellen der Haut transkribiert und/oder transla- tiert und führen zur verstärkten Expression des von ihnen codierten Proteins.
Die Erfindung umfasst auch Teilsequenzen von Altersgenen sowie Gene deren Sequenz im Vergleich zu den genannten Altersgenen durch gerichtete oder andere Arten der Muta- genese verändert wurde.
Eine Reihe von Techniken zur Veränderung von Monierten Genen sind bekannt und beschrieben z.B. in „Current Protokols in Molecular Biology", Volume 1, Chapter δ, Ausubel et al. (Hrsg.), John Wiley & Sons, Ine (2001). Diese Veränderungen können so ausgeführt werden, daß das nach Transkription und/oder Translation resultierende Protein die identische Aminosäuresequenz besitzt, wie das Protein, das ohne diese Mutation resultieren würde (Redundanz des genetischen Codes). Das veränderte Gen kann aber auch zur Expression eines Proteins mit veränderter Aminosäuresequenz führen, so daß dessen biologische Aktivität verändert, z.B. verstärkt oder verringert ist. Darüberhinaus kommen als Polynukleotide zur Einschleussung in die Haut DNA und RNA Sequenzen in Betracht, die einen Teil der Sequenz eines oder mehrerer der genannten Gene umfassen und selbst eine gewünschte biologische Aktivität besitzen (z.B. anti-sense RNA, rRNA oder kurze doppelsträngige DNA-Moleküle).
Jedes erfindungsgemäß verwendbare Gen, bevorzugt aber solche, die in der Altershaut als schwach exprimiert gefunden wurden, kann mit dem Ziel seiner verstärkten Expression in die Zellen der Haut eingeschleusst werden.
Jedes Konstrukt aus einem der erfindungsgemäß verwendbaren Gen, funktioneil verknüpft mit einem eukaryotischen Promotor, kann verwendet werden.
Die Konstrukte mit einem der Altersgene können beliebige eukaryotische Expression- konstrukte sein. Beispielsweise können bakterielle Plasmide, virale Konstrukte oder andere DNA-Konstrukte genetisch modifiziert werden, so daß ein rekombinantes DNA- (oder RNA-) Molekül entsteht, welches eine Sequenz enthält, die für eines der Altersgene codiert und das gewünschte Genprodukt in Zellen der Haut exprimiert.
Bevorzugt sind Konstrukte, die die Fähigkeit zur Replikation sowohl in eukaryotischen als auch in prokaryotischen Wirtszellen besitzen. Solche Konstrukte sind Stand der Technik und kommerziell erhältlich.
Die erfindungsgemäße Zubereitung wird vorzugsweise auf die Haut appliziert. Die in ihr enthaltene DNA kann entweder linear oder zirkulär sein, vorzugsweise handelt es sich um zirkuläre DNA-Moleküle. Das Polynukleotid oder das Polynukleotid-enthaltende Konstrukt kann nach bekannten Methoden vervielfältigt und gereinigt werden und wird als pures Molekül oder in einer der u.g. Formulierungen verwendet.
Bevorzugt sind Konstrukte, die einen Promotor tragen, welcher eine Expression der interessierenden DNA ermöglicht. In Abhängigkeit von der Art des Gens und dem Zweck seiner Anwendung können verschiedene Promotoren verwendet werden. Starke, konstitu- tive Promotoren können verwendet werden, wie z.B. der Promotor des „immediate early gene" von Cytomegalovirus (CMV) oder der Promotor des „long terminal repeat" des Rous Sarcoma Virus (RSV).
Alternativ können gewebespezifische Promotoren oder zelltypspezifische Promotoren eingesetzt werden. Beispielsweise kann der Promotor so gewählt sein, daß er die spezifische Expression in Hautzellen oder bestimmten Hautzell-Typen bewirkt. Beispiele für gewebespezifische oder zelltypspezifische Promotoren sind u.a. die Keratin-Promotoren (z.B. humanes Keratin 14 Promotor (Wang et al. 1997 Proc. Natl. Acad. Sei US 94:219-226)) oder Tyrosinase Promotoren (spezifisch für Melanocyten). Alternativ können induzierbare Promotoren verwendet werden.
Die Konstrukte können neben den Promotoren noch andere Elemente enthalten, die die transkriptionale oder translationale Expression des Genprodukts verstärken. Beispielsweise kann das Konstrukt eine „intemal ribosomal entry site" (IRES) beinhalten, um die Translation der stromabwärts liegenden Sequenz zu verstärken (siehe Murakami et al. 1997, Gene 202:23-29). Weitere Komponenten, die auf dem Konstrukt vorhanden sein können umfassen Marker (z.B. Antibiotikaresistenz-Gene wie das Ampicillin-Resistenz Gen) zur Selektion von Zellen die das Konstrukt enthalten, einen Replikationsursprung der die stabile Replikation des Konstrukts in prokaryotischen Zellen bewirkt, ein Kern- Lokalisierungs Signal oder andere Elemente, die die Produktion des DNA-Konstrukts und/oder des codierten Proteins unterstützen.
Die Konstrukte können auch ein Polyadenylierungs-Signal enthalten. Die Sequenz eines solchen Signals kann ausgewählt werden aus verschiedenen bekannten Polyadenylie- rungs-Signalen. Ein bevorzugtes Beispiel ist das SV40 early Polyadenylierungs-Signal.
Die Konstrukte können auch ein oder mehrere Introns beinhalten, welche die Expression der DNA verstärken kann.
Die Erfindung umfasst auch Konstrukte, die für Fusionsproteine eines der Altersmarker mit einem zweiten Protein oder für ein Fusionsprotein aus zwei Altersmarkern codieren. Bevorzugte Nukleinsäurekonstrukte sind solche mit mehreren Expressionskasetten, auf denen zwei oder mehr Altersmarker codiert sind, oder die eines der Altersgene und ein Gen für ein weiteres Protein kodieren.
Auch die Co-Transfektion mit einem oder mehreren weiteren Vektoren, die die Expression des interessierenden Gens unterstützen können ist möglich.
Vektoren, die eines oder mehrere der genannten Merkmale tragen und darüber hinaus auch noch weitere funktionelle Einheiten beinhalten können sind vielfach in der Literatur beschrieben und kommerziell erhältlich. Solche Vektoren sind z.B. pCI und pSI (Promega GmbH) oder pDEST (Gibco BRL).
Die Sequenzen der erfindungsgemäß bestimmbaren und insbesondere die, der in den Tabellen 1 bis 9 aufgeführten Altersgene und Teilsequenzen der Gene können zur selektiven Inhibierung der Expression einzelner Gene genutzt werden.
Bevorzugte Targets für die Inhibierung der Expression sind solche, die in der Altershaut als verstärkt exprimiert gefunden wurden. Oligo- und Polynukleotide, die für diesen Zweck geeignet sind umfassen Antisense-Nukleotide, Ribozym-Nukleotide und doppelsträngige RNAs.
Antisense-Nukleotide sind wohlbekannt in ihrer Eigenschaft mit sense-Strängen der mRNA zu hybridisieren und dadurch mit der Expression der mRNA zu interferieren (siehe z,B. Wingers et al., Laboratory Investigation 79, 1415-1424 (1999). Einen Überblick über die Anwendung von Antisense-Nukleotiden in der Haut gibt Wraight et al., Pharmacol & Ther 90, 89-104 (2001).
Ribozym-Nukleinsäuren sind ebenfalls bekannt als einzelsträngige RNA-Moleküle, die die Fähigkeit besitzen, ssRNA und ssDNA selektiv zu spalten, und dadurch die Expression der Targetmoleküle selektiv zu inhibieren.
Post-transkriptionale Gen-Repression kann ebenfalls durch doppelsträngige RNAs hervorgerufen werden. Diese dsRNAs interferieren mit der Ziel-RNA nach Spaltung in kürze- re Segmente durch Ribonuklease III. Ebenso können zur Gen-Repression Duplexe aus kurzen RNA-Sequenzen verwendet werden (S.M. Elbashir et al., Nature 411 ,494-498 (2001). Auch diese doppelsträngigen RNA-Moleküle können im Sinne der Erfindung zur Repression der gefundenen Altersgene verwendet werden.
Unmodifizierte DNA oder RNA-Moleküle unterliegen in Gewebe oder Zellen einem schnellen Abbau. Um die Resistenz von Oligo-oder Polynukleotiden gegenüber Abbau durch Nukleasen zu erhöhen, wurden Modifizierungen entwickelt, die entweder das Rückgrat oder die Pyridin- bzw Pyrimidinbasen eines Oligonukleotids betreffen. Solche modofi- zierten DNA- oder RNA-Sequenzen können ebenfalls im Sinne der Erfindung verwendet werden. Geeignete Modifizierungen sind z.B. Phosphorthioate, Methylphosphonate oder Peptid-Verknüpfungen (PNAs) für das Zucker-Rückgrat sowie C5-propynyl-dU, dC für die Nukleosid-Basen.
Die DNA oder RNA-Moleküle der Erfindung können z.B. topisch appliziert werden. Die Moleküle können dabei entweder ohne weitere die Penetration beeinflussende Substanzen angewendet werden, oder im Gemisch bzw. assoziiert mit Molekülen, welche die Penetration durch das stratum corneum und die Transfektion der Zellen der Haut beeinflussen.
Eine bevorzugte Ausführung der topischen Applikation der Altersgene ist die in einer Formulierung mit Lipiden, wahlweise in Gemisch mit Surfactants, bevorzugt in Form von Liposomen.
Dabei enthält die Formulierung etwa 0,1 μg - 5 mg DNA oder RNA pro mg Liposom. Die Bestandteile der Liposomen können neutral oder geladen sein und in Form von z.B. mul- tilamellaren Vesikeln oder unilamelaren Vesikeln vorliegen.
Geeignete Lipide für die Herstellung von Liposomen sind z.B. natürliches Phosphatidyl- cholin, welches beispielsweise aus Ei, Sojabohne, Oliven, Kokosnuß, Walfett, Safran, Leinsamen, Nachtkerze oder Primel gewonnen werden kann. Weitere geeignete Lipide sind z.B. natürliches oder synthetisches Phosphatidylethanolamin, synthetisches Phosphatidylcholin, Phosphatidsäuren oder ihre Ester, Phosphatidylserin und Phosphati- dyl(poly)alkohole, wie z.B. Phosphatidylinisitol oder Phosphatidylglycerol. Beispiele für die genannten Lipide sind DPPC (Dipalmitoylphosphatidylcholin), DOPE (Dioleylphospha- tidylethanolamin), DOTMA (N[1-(2,3,dioleoyloxy)propyl]-N,N,N trimethyl- ammoniumchlorid), DOTAB (N-1-(2,3-Dioleoyloxy)propyl N,N,N-trimethylammo- niumchlorid) , DPPA (Dipalmitoylphosphatidsäure), DPPG (Dipalmitoylphos- phatidylglycerol).
Auch einzelne oberflächeaktive Verbindungen, welche z,B, als Detergenzien oder Emul- gatoren verwendet werden, können zur Bildung von Liposomen eingesetzt werden. Beispiele hierfür sind DODAC (Dioctadecylammoniumchlorid) und CTAC (Cetyltrimethylam- moniumchlorid). Geeignete Bestandteile von Liposomen und Herstellungsverfahren sind in der Literatur beschrieben (siehe z.B. „Liposome Drug Delivery Systems", G. Betageri (Hrsg.), Lancaster Techonomic Publishing Company (1993) oder „Liposome Technology", Gregoriadis (Hrsg.), CRC Press). Neben Liposomen können auch andere Lipidvesikel wie beispielsweise Niosomen und Transfersomen (siehe Z.B.WO9817255) eingesetzt werden.
Die Penetrationsfähigkeit der DNA- und RNA-Moleküle kann durch die vorherige oder gleichzeitige Applikation von Penetrationsenhancem verbessert werden. Chemische pe- netrationsenhancer sind in der Literatur zahlreich beschrieben (siehe z.B. M. Foldvari, PSTT 3, 417-425 (2000) oder N. Kanikkannan, Curr Med. Chem. 7, 593-608 (2000)). Geeignete Penetrationsenhancer sind u.a. organische Lösungsmittel (z.B. Ethanol), Pyr- rolidone, Sulfoxide (z.B. DMSO), Fettsäuren (gesättigte oder ungesättigte, verzweigte oder unverzweigte mit einer bevorzugten Kettenlänge von 8-18), Terpene (z.B. L-Menthol oder 1,8-Cineol) Surfactants (z.B. Polysorbate (Tween), Polyethylenalkylphenole (Brij), Alkylethersulfate sowie Betaine und amphotere Glycinate).
Weiterhin kommen zur Verbesserung der Penetration von Oligo- oder Polynukleotiden im Sinne der Erfindung auch invasive oder minimal-invasive Methoden in Betracht. Zu den gängigen minimal-invasiven Methoden gehören die Elektroporation und die lontophorese. Bei beiden Methoden wird mit Hilfe von Elektroden eine Spannung an der Oberfläche der Haut angelegt. Die Elektroporation nutzt einen kurzen Puls hoher Spannung zur Permea- bilisierung der Haut. Bei der lontophorese kommt zu diesem Zweck eine kleine Spannung mit konstantem Strom zum Einsatz. Ultraschall von geringer Frequenz kann ebenfalls verwendet werden, um die Permeabilität der Haut für DNA oder RNA zu erhöhen.
Die folgenden Ausführungsbeispiele verdeutlichen die Erfindung, ohne sie jedoch darauf einzuschränken:
Beispiel 1
Herstellung von Liposomen-DNA-Komplexen
18,6 μl (25 μmol) DOPE und 0,0175 g DOTAP (25 μmol) werden zusammen in 1 ml Etha- nol gelöst. Die Lösung wird über Nacht in Eksikkator eingetrocknet und die Lipidmischung anschließend in 3 ml PBS (58 mM NaHPO4, 17 mM NaH2PO4, 69 mM NaCI, pH 7,4) unter Lichtausschluss für 3-4 h unter gelegentlichem Mischen rehydratisiert. Die so entstandene Lipiddispersion wird 2 mal für je 5 min im Ultraschallbad beschallt mit einer zwischenzeitlichen 2-stündigen Pause. 6,1 μl der entstandenen Liposomen-Dispersion werden mit 1 ,5 ml PBS verdünnt und mit 20 μg Plasmid gelöst in 1 ,5 ml HBS (150 mM NaCI, 20 mM Hepes, pH 7,4) gemischt. Die bei Zugabe der Plasmid-Lösung zu der Liposomen- Dispersion entstehende stärkere Trübung gibt einen Hinweis auf das Entstehen der DNA- Liposomen-Komplexe.
Beispiel 2
Herstellung von Liposomen-DNA-Komplexen
18,6 μl (25 μmol) DOPE und 0,0175 g DOTAP (25 μmol) werden zusammen in 1 ml Etha- nol gelöst. Die Lösung wird über Nacht in Eksikkator eingetrocknet und die Lipidmischung anschließend in 3 ml PBS (58 mM NaHPO4, 17 mM NaH2PO4, 69 mM NaCI, pH 7,4) unter Lichtausschluss für 3-4 h unter gelegentlichem Mischen rehydratisiert. Die so entstandene Lipiddispersion wird 2 mal für je 5 min im Ultraschallbad beschallt mit einer zwischenzeitlichen 2-stündigen Pause. 50 μl der entstandenen Liposomen-Dispersion werden mit 50 μg Plasmid gelöst in 50 μl HBS (150 mM NaCI, 20 mM Hepes, pH 7,4) gemischt. Der Nachweis der Liposomen erfolgt durch TEM-Aufnahmen der Liposomen-DNA-Komplexe (Figur 1)- Beispiel 3
Herstellung von Liposomen mit kationischen Detergenz und Komplexbildung mit DNA
29,8 μl (40 μmol) DOPE und 4 mg CTAC (Cetyltrimethylammoniumchlorid) (10 μmol) werden zusammen in 1 ml Ethanol gelöst. Das Lösungsmittel Ethanol wird im Rotationsverdampfer abgezogen und die Mischung anschließend in 3 ml PBS (58 mM NaHPO4, 17 mM NaH2PO4, 69 mM NaCI, pH 7,4) unter Lichtausschluss für 3-4 h unter gelegentlichem Mischen rehydratisiert. Die so entstandene Lipiddispersion wird 2 mal für je 5 min im Ultraschallbad beschallt mit einer zwischenzeitlichen 2-stündigen Pause. 6,7 μl der entstandenen Liposomen-Dispersion werden mit 1 ,5 ml PBS verdünnt und mit 20 μg Plasmid gelöst in 1 ,5 ml HBS (150 mM NaCI, 20 mM Hepes, pH 7,4) gemischt.
Verzeichnis der Figuren:
Figur 1 : TEM-Aufnahme der Liposomen-DNA-Komplexe aus Beispiel 2 im Cryomode. Vergrößerung: 10000-fach
Figur 1:
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Tabellen:
Tabelle 4:
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Tabelle 3:
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Tabelle 2:
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Tabelle 1:
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Tabelle 5:
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Tabelle 7:
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Tabelle 6:
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Tabelle 8:
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TRANSPORTER 1. (4F2 LC) 4F2 LIGHT CHAIN. (SLC7A5).
144 Hs.73965 Q01130 MRF1: (SFRS2) SPLICING FACTOR, ARGININE/SERINE- RICH 2 (SPLICING FACTOR SC35) (SC-35) (SPLICING COMPONENT, 35 KDA) (PR264 PROTEIN).
145 Hs.25313 014742 MSP58: (MSP58) NUCLEOLAR PROTEIN CELL CYCLE- REGULATED FACTOR P78.
146 Hs.76941 P54709 NA-K-ATPASE-B3: (ATP1 B3) SODIUM/POTASSIUM- TRANSPORTING ATPASE BETA-3 CHAIN (SODIUM/POTASSIUM-DEPENDENT ATPASE BETA-3 SUBUNIT) (ATPB-3).
147 Hs.15977 Q9Y6M9 NDUFB9: (NDUFB9 OR UQOR22) NADH-UBIQUINONE OXIDOREDUCTASE B22 SUBUNIT (EC 1.6.5.3) (EC 1.6.99.3) (COMPLEX 1-B22) (CI-B22).
148 Hs.172674 Q99842 NFATX4: (NFATC3 OR NFAT4) NUCLEAR FACTOR OF ACTIVATED T-CELLS, CYTOPLASMIC 3 (T CELL TRANSCRIPTION FACTOR NFAT4) (NF-ATC3) (NF-AT4) (NFATX).
149 Hs.62041 P14543 NIDOGEN: (NID) NIDOGEN PRECURSOR (ENTACTIN).
150 Hs.111039 P30419 NMT1: (NMT1 OR NMT) GLYCYLPEPTIDE N- TETRADECANOYLTRANSFERASE 1 (EC 2.3.1.97) (PEPTIDE N-MYRISTOYLTRANSFERASE 1) (MYRISTOYL-COA.PROTEIN N- MYRISTOYLTRANSFERASE 1) (NMT 1).
151 Hs.724 P20393 NR1D1: (NR1D1 OR THRAL OR EAR1 OR HREV) ORPHAN NUCLEAR RECEPTOR NR1D1 (V-ERBA RELATED PROTEIN EAR-1) (REV-ERBA-ALPHA).
152 Hs.1119 P22736 NR4A1 : (NR4A1 OR HMR OR NAK1 OR GFRP1) ORPHAN NUCLEAR RECEPTOR HMR (EARLY RESPONSE PROTEIN NAK1) (TR3 ORPHAN RECEPTOR)
153 Hs.82120 P43354 NR4A2: (NR4A2 OR NURR1 OR TINUR OR NOT) ORPHAN NUCLEAR RECEPTOR NURR1
154 Hs.83469 Q14494 NRF1: (NFE2L1 OR NRF1 OR TCF11 OR HBZ17) NUCLEAR FACTOR ERYTHROID 2 RELATED FACTOR 1 (NF-E2 RELATED FACTOR 1) (NFE2-RELATED FACTOR 1) (NUCLEAR FACTOR, ERYTHROID DERIVED 2, LIKE 1) (TRANSCRIPTION FACTOR 11) (TRANSCRIPTION FACTOR HBZ17)
155 Hs.75212 P11926 ODC1: (ODC1) ORNITHINE DECARBOXYLASE (EC 4.1.1.17) (ODC).
156 Hs.88474 P23219 PGH1: (PTGS1 OR COX1) PROSTAGLANDIN G/H SYNTHASE 1 PRECURSOR (EC 1.14.99.1) (CYCLOOXYGENASE-1) (COX-1) (PROSTAGLANDIN- ENDOPEROXIDE SYNTHASE 1) (PROSTAGLANDIN H2SYNTHASE 1) (PGH SYNTHASE 1) (PGHS-1) (PHS 1).
157 Hs.76152 P07585 PGS2: (DCN) BONE PROTEOGLYCAN II PRECURSOR (PG-S2) (DECORIN) (PG40).
158 Hs.9589 Q9UMX0 PLIC-1: (UBQLN1) PLIC-1 UBIQUILIN. (DA41)
159 Hs.173902 P30153 PPP2R1A: (PPP2R1A) SERINE/THREONINE PROTEIN PHOSPHATASE 2A, 65 KDA REGULATORY SUBUNIT A, ALPHA ISOFORM (PP2A, SUBUNIT A, PR65-ALPHA ISOFORM) (PP2A, SUBUNIT A, R1-ALPHA ISOFORM) (MEDIUM TUMOR ANTIGEN-ASSOCIATED 61 KDA PROTEIN)
160 P34062 PSMA6: (PSMA6 OR PROS27) PROTEASOME IOTA CHAIN (EC 3.4.99.46) (MACROPAIN IOTA CHAIN) (MULTICATALYTIC ENDOPEPTIDASE COMPLEX IOTA CHAIN) (27 KDA PROSOMAL PROTEIN) (PROS-27) (P27K).
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Tabelle 9:
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Claims

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Identifizierung der für die Hautalterung und/oder den Hautstreß bedeutsamen Gene bei Menschen oder Tieren in vitro, dadurch gekennzeichnet, daß man a) ein erstes Gemisch von in menschlicher oder tierischer Haut exprimierten, d. h. transkribierten und gegebenenfalls auch translatierten genetisch codierten Faktoren, also von Proteinen, mRNA-Molekülen oder Fragmenten von Proteinen oder mRNA-Molekülen aus junger menschlicher oder tierischer Haut gewinnt, b) ein zweites Gemisch von in menschlicher oder tierischer Haut exprimierten, d. h. transkribierten und gegebenenfalls auch translatierten genetisch codierten Faktoren, also von Proteinen, mRNA-Molekülen oder Fragmenten von Proteinen oder mRNA-Molekülen aus alter menschlicher oder tierischer Haut gewinnt und c) die in a) und b) gewonnenen Gemische einer Seriellen Analyse der Genexpression (SAGE) unterwirft, und dadurch die Gene identifiziert, die in alter und junger Haut unterschiedlich stark (differentiell) exprimiert werden.
2. Verfahren zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung bei Menschen oder Tieren in vitro, dadurch gekennzeichnet, daß man a) ein Gemisch von Proteinen, mRNA-Molekülen oder Fragmenten von Proteinen oder mRNA-Molekülen aus menschlicher oder tierischer Haut gewinnt, b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die mittels Serieller Analyse der Genexpression (SAGE) als in alter und junger Haut differentiell exprimiert identifiziert werden, c) die Untersuchungsergebnisse aus b) mit den mittels Serieller Analyse der Genexpression (SAGE) identifizierten Expressionsmustern vergleicht und d) das in b) untersuchte Gemisch alter bzw. gestreßter Haut zuordnet, wenn es ü- berwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in alter bzw. gestreßter Haut stärker exprimiert werden als in junger bzw. ungestreßter Haut, oder das in b) untersuchte Gemisch junger bzw. ungestreßter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA- Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in junger bzw. ungestreßter Haut stärker exprimiert werden als in alter bzw. gestreßter Haut.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in den Tabellen 1 bis 4 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number definiert werden, in Schritt c) die Untersuchungsergebnisse aus b) mit den in den Tabellen 1 bis 4 in den Spalten 3 und 4 angegebenen relativen Expressionsfrequenzen sowie den in Spalte 5 angegebenen Expressionsquotienten vergleicht und in Schritt d) das in b) untersuchte Gemisch alter bzw. gestreßter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen o- der mRNA-Molekülen enthält, die in alter bzw. gestreßter Haut mindestens doppelt so stark exprimiert werden wie in junger bzw. ungestreßter Haut, oder das in b) untersuchte Gemisch junger bzw. ungestreßter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA- Molekülen enthält, die in junger bzw. ungestreßter Haut mindestens doppelt so stark exprimiert werden wie in alter bzw. gestreßter Haut.
4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in den Tabellen 2 bis 4 in
Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number definiert werden, in Schritt c) die Untersuchungsergebnisse aus b) mit den in den Tabellen 2 bis 4 in den Spalten 3 und 4 angegebenen relativen Expressionsfrequenzen sowie den in
Spalte 5 angegebenen Expressionsquotienten vergleicht und in Schritt d) das in b) untersuchte Gemisch alter bzw. gestreßter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen o- der mRNA-Molekülen enthält, die in alter bzw. gestreßter Haut mindestens 5-fach so stark exprimiert werden wie in junger bzw. ungestreßter Haut, oder das in b) untersuchte Gemisch junger bzw. ungestreßter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA- Molekülen enthält, die in junger bzw. ungestreßter Haut mindestens 5-fach so stark exprimiert werden wie in alter bzw. gestreßter Haut.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in den Tabellen 3 und 4 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number definiert werden, in Schritt c) die Untersuchungsergebnisse aus b) mit den in den Tabellen 3 und 4 in den Spalten 3 und 4 angegebenen relativen Expressionsfrequenzen sowie den in Spalte 5 angegebenen Expressionsquotienten vergleicht und in Schritt d) das in b) untersuchte Gemisch alter bzw. gestreßter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen o- der mRNA-Molekülen enthält, die in alter bzw. gestreßter Haut mindestens 7-fach so stark exprimiert werden wie in junger bzw. ungestreßter Haut, oder das in b) untersuchte Gemisch junger bzw. ungestreßter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA- Molekülen enthält, die in junger bzw. ungestreßter Haut mindestens 7-fach so stark exprimiert werden wie in alter bzw. gestreßter Haut.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in Tabelle 4 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number definiert werden, in Schritt c) die Untersuchungsergebnisse aus b) mit den in Tabelle 4 in den Spalten 3 und 4 angegebenen relativen Expressionsfrequenzen sowie den in Spalte 5 angegebenen Expressionsquotienten vergleicht und in Schritt d) das in b) untersuchte Gemisch alter bzw. gestreßter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen o- der mRNA-Molekülen enthält, die in alter bzw. gestreßter Haut mindestens 10-fach so stark exprimiert werden wie in junger bzw. ungestreßter Haut, oder das in b) untersuchte Gemisch junger bzw. ungestreßter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA- Molekülen enthält, die in junger bzw. ungestreßter Haut mindestens 10-fach so stark exprimiert werden wie in alter bzw. gestreßter Haut.
7. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in Tabelle 5 oder 7 in Spalte 2 durch ihre 11 Basen umfassende Tag-Sequenz definiert werden, in Schritt c) die Untersuchungsergebnisse aus b) mit den in Tabelle 5 oder 7 in den Spalten 3 und 4 angegebenen relativen Expressionsfrequenzen sowie den in Spalte 5 angegebenen Expressionsquotienten vergleicht und in Schritt d) das in b) untersuchte Gemisch alter bzw. gestreßter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen o- der mRNA-Molekülen enthält, die in alter bzw. gestreßter Haut mindestens doppelt, insbesondere 5-fach, vorzugsweise 7-fach, besonders bevorzugt 10-fach, ganz besonders bevorzugt 11 -fach so stark exprimiert werden wie in junger bzw. ungestreßter Haut, oder das in b) untersuchte Gemisch junger bzw. ungestreßter Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in junger bzw. ungestreßter Haut mindestens doppelt, insbesondere 5-fach, vorzugsweise 7-fach, besonders bevorzugt 10-fach so stark exprimiert werden wie in alter bzw. gestreßter Haut.
8. Verfahren zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung bei Menschen oder Tieren in vitro, dadurch gekennzeichnet , daß man a) ein Gemisch von Proteinen, mRNA-Molekülen oder Fragmenten von Proteinen oder mRNA-Molekülen aus menschlicher oder tierischer Haut gewinnt, b) in dem gewonnenen Gemisch mindestens zwei der Proteine, mRNA-Moleküle o- der Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen quantifiziert, die mittels eines Verfahrens gemäß Anspruch 1 als für die Hautalterung und/oder den Hautstreß bedeutsam identifiziert werden, c) die Expressionsverhältnisse der mindestens zwei Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen zueinander bestimmt, d) die Expressionsverhältnisse aus c) mit den Expressionsverhältnissen vergleicht, die für die in b) quantifizierten Moleküle typischerweise in junger bzw. in alter Haut vorliegen, insbesondere mit den Expressionsverhältnissen, die sich aus den Tabellen 1 bis 5 und 7, Spalten 3 bzw. 4 ergeben, und e) das in a) gewonnene Gemisch alter bzw. gestreßter Haut zuordnet, wenn die Expressionsverhältnisse der untersuchten Haut den Expressionsverhältnissen in alter Haut entsprechen, oder das in a) gewonnene Gemisch junger bzw. ungestreßter Haut zuordnet, wenn die Expressionsverhältnisse der untersuchten Haut den Expressionsverhältnissen in junger Haut entsprechen.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt a) das Gemisch aus einer Hautprobe, insbesondere aus einer Vollhautprobe o- der aus einer Epidermisprobe gewinnt.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt a) das Gemisch mittels Mikrodialyse gewinnt.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 7, 9 und 10, dadurch gekennzeichnet, daß man die Untersuchung in Schritt b) auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine oder Proteinfragmente mittels einer Methode durchführt, die ausgewählt ist unter i. Ein- oder zweidimensionaler Gelelektrophorese ii. Affinitätschromatographie iii. Protein-Protein-Komplexierung in Lösung iv. Massenspektrometrie, insbesondere Matrix Assistierter Laser Desorptions Ionisation (MALDI) und insbesondere v. Einsatz von Proteinchips, oder mittels geeigneter Kombinationen dieser Methoden.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß man die Untersuchung in Schritt b) die Quantifizierung mindestens zweier Proteine oder Proteinfragmente mittels einer Methode durchführt, die ausgewählt ist unter
Ein- oder zweidimensionaler Gelelektrophorese Affinitätschromatographie Protein-Protein-Komplexierung in Lösung iv. Massenspektrometrie, insbesondere Matrix Assistierter Laser Desorptions Ionisation (MALDI) und insbesondere v. Einsatz von Proteinchips, oder mittels geeigneter Kombinationen dieser Methoden.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 7, 9 und 10, dadurch gekennzeichnet, daß man die Untersuchung in Schritt b) auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der mRNA-Moleküle oder mRNA-Molekülfragmente mittels einer Methode durchführt, die ausgewählt ist unter i. Northern Blots, ii. Reverse Transkriptase Polymerasekettenreaktion (RT-PCR), iii. RNase-Schutzexperimente, iv. Dot-Blots, v. CDNA-Sequenzierung, vi. Klon-Hybridisierung, vii. Differential Display, viii. Subtraktive Hybridisierung, ix. cDNA-Fragment-Fingerprinting, x. Total Gene Expression Analysis (TOGA) xi. Serielle Analyse der Genexpression (SAGE) und insbesondere xii. Einsatz von Nukleinsäurechips, oder mittels geeigneter Kombinationen dieser Methoden.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß man die Untersuchung in Schritt b) die Quantifizierung mindestens zweier mRNA-Moleküle oder mRNA-Molekülfragmente mittels einer Methode durchführt, die ausgewählt ist unter Northern Blots,
Reverse Transkriptase Polymerasekettenreaktion (RT-PCR),
RNase-Schutzexperimente, iv. Dot-Blots, v. CDNA-Sequenzierung, vi. Klon-Hybridisierung, vii. Differential Display, viii. Subtraktive Hybridisierung, ix. cDNA-Fragment-Fingerprinting, x. Total Gene Expression Analysis (TOGA) xi. Serielle Analyse der Genexpression (SAGE) und insbesondere xii. Einsatz von Nukleinsäurechips, oder mittels geeigneter Kombinationen dieser Methoden.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 7, 9, 10, 11 und 13, dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt b) auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von 1 bis etwa 5000, bevorzugt 1 bis etwa 1000, insbesondere etwa 10 bis etwa 500, vorzugsweise etwa 10 bis etwa 250, besonders bevorzugt etwa 10 bis etwa 100 und ganz besonders bevorzugt etwa 10 bis etwa 50 der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die i. in den Tabellen 1 bis 4 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number, oder die ii. in Tabelle 6 oder 8 in Spalte 2 durch ihre UniGene-Accession-Number, oder in Spalte 3 durch ihre Swissprot- oder TREMBL-Nummer, oder in Spalte 4 durch ihre EMBL/Genbank-Nummer, oder in Tabelle 9 durch den Namen des Gens, oder die iii. in Tabelle 5 oder in Tabelle 7 in Spalte 2 durch ihre 11 Basen umfassende Tag- Sequenz definiert werden.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, 12 und 14, dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt b) 1 bis etwa 5000, bevorzugt 1 bis etwa 1000, insbesondere etwa 10 bis etwa 500, vorzugsweise etwa 10 bis etwa 250, besonders bevorzugt etwa 10 bis etwa 100 und ganz besonders bevorzugt etwa 10 bis etwa 50 der Proteine, mRNA- Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen quantifiziert, die i. in den Tabellen 1 bis 4 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number, oder die ii. in Tabelle 6 oder 8 in Spalte 2 durch ihre UniGene-Accession-Number, oder in Spalte 3 durch ihre Swissprot- oder TREMBL-Nummer, oder in Spalte 4 durch ihre EMBL/Genbank-Nummer, oder in Tabelle 9 durch den Namen des Gens, oder die iii. in Tabelle 5 oder in Tabelle 7 in Spalte 2 durch ihre 11 Basen umfassende Tag- Sequenz definiert werden.
17. Test-Kit zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung bei Menschen oder Tieren in vitro, umfassend Mittel zur Durchführung der Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 16.
18. Biochip zur Bestimmung des Hautstreß und/oder der Hautalterung bei Menschen oder Tieren in vitro, umfassend i. einen Träger und ii. auf diesem immobilisierte Sonden, die zur spezifischen Bindung an mindestens eines der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA- Molekülen befähigt sind, die in den Tabellen 1 bis 4 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number definiert werden, oder die in Tabelle 5 oder in Tabelle 7 in Spalte 2 durch ihre 11 Basen umfassende Tag-Sequenz definiert werden.
19. Biochip nach Anspruch 18, umfassend 1 bis etwa 5000, bevorzugt 1 bis etwa 1000, insbesondere etwa 10 bis etwa 500, vorzugsweise etwa 10 bis etwa 250, besonders bevorzugt etwa 10 bis etwa 100 und ganz besonders bevorzugt etwa 10 bis etwa 50 voneinander verschiedene Sonden.
20. Biochip nach Anspruch 18 oder 19, umfassend Nukleinsäuresonden, insbesondere RNA- oder PNA-Sonden, besonders bevorzugt DNA-Sonden.
21. Biochip nach Anspruch 20, umfassend Sonden mit einer Länge von etwa 10 bis etwa 1000, insbesondere etwa 10 bis etwa 800, vorzugsweise etwa 100 bis etwa 600, besonders bevorzugt etwa 200 bis etwa 400 Nukleotiden.
22. Biochip nach Anspruch 18 oder 19, umfassend Peptid- oder Proteinsonden, insbesondere Antikörper.
23. Biochip nach einem der Ansprüche 18 bis 22, umfassend Sonden, die zur spezifischen Bindung an mindestens eines der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen befähigt sind, die in Tabelle 6 oder 8 in Spalte 2 durch ihre UniGene-Accession-Number, oder in Spalte 3 durch ihre Swissprot- oder TREMBL-Nummer, oder in Spalte 4 durch ihre EMBL/Genbank-Nummer, oder in Tabelle 9 durch den Namen des Gens definiert werden,
24. Verwendung der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen, die i. in den Tabellen 1 bis 4 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number, oder die ii. in Tabelle 6 oder 8 in Spalte 2 durch ihre UniGene-Accession-Number, oder in Spalte 3 durch ihre Swissprot- oder TREMBL-Nummer, oder in Spalte 4 durch ihre EMBL/Genbank-Nummer, oder in Tabelle 9 durch den Namen des Gens, oder die iii. in Tabelle 5 oder in Tabelle 7 in Spalte 2 durch ihre 11 Basen umfassende Tag- Sequenz definiert werden als Streß- und/oder Alterungsmarker der Haut bei Menschen oder Tieren.
25. Testverfahren zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Hautstreß und/oder Hautalterung in vitro, dadurch gekennzeichnet, daß man a) den Hautstatus durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 16, oder mittels eines Test-Kits nach Anspruch 17, oder mittels eines Biochips nach einem der Ansprüche 18 bis 23 bestimmt, b) einen Wirkstoff gegen Hautstreß und/oder Hautalterung einmal oder mehrmals auf die Haut aufbringt, c) erneut den Hautstatus durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 16, oder mittels eines Test-Kits nach Anspruch 17, oder mittels eines Biochips nach einem der Ansprüche 18 bis 23 bestimmt, und d) die Wirksamkeit des Wirkstoffs durch den Vergleich der Ergebnisse aus a) und c) bestimmt.
26. Test-Kit zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Hautstreß und/oder Hautalterung in vitro, umfassend Mittel zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 25.
27. Verwendung der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen, die i. in den Tabellen 1 bis 4 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number, oder die ii. in Tabelle 6 oder 8 in Spalte 2 durch ihre UniGene-Accession-Number, oder in Spalte 3 durch ihre Swissprot- oder TREMBL-Nummer, oder in Spalte 4 durch ihre EMBL/Genbank-Nummer, oder in Tabelle 9 durch den Namen des Gens, oder die iii. in Tabelle 5 oder in Tabelle 7 in Spalte 2 durch ihre 11 Basen umfassende Tag- Sequenz definiert werden zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Hautstreß und/oder Hautalterung.
28. Screening-Verfahren zur Identifikation von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Hautstreß und/oder Hautalterung in vitro, dadurch gekennzeichnet, daß man a) den Hautstatus durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 16, oder mittels eines Test-Kits nach Anspruch 17, oder mittels eines Biochips nach einem der Ansprüche 18 bis 23 bestimmt, b) einen potentiellen Wirkstoff gegen Hautstreß und/oder Hautalterung einmal oder mehrmals auf die Haut aufbringt, c) erneut den Hautstatus durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 16, oder mittels eines Test-Kits nach Anspruch 17, oder mittels eines Biochips nach einem der Ansprüche 18 bis 23 bestimmt, und d) wirksame Wirkstoffe durch den Vergleich der Ergebnisse aus a) und c) bestimmt.
29. Verwendung der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen, die i. in den Tabellen 1 bis 4 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number, oder die ii. in Tabelle 6 oder 8 in Spalte 2 durch ihre UniGene-Accession-Number, oder in Spalte 3 durch ihre Swissprot- oder TREMBL-Nummer, oder in Spalte 4 durch ihre EMBL/Genbank-Nummer, oder in Tabelle 9 durch den Namen des Gens, oder die iii. in Tabelle 5 oder in Tabelle 7 in Spalte 2 durch ihre 11 Basen umfassende Tag- Sequenz definiert werden zur Identifikation von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen gegen Hautstreß und/oder Hautalterung.
30. Verfahren zur Herstellung einer kosmetischen oder pharmazeutischen Zubereitung gegen Hautstreß und/oder Hautalterung, dadurch gekennzeichnet, daß man a) wirksame Wirkstoffe mit Hilfe des Verfahrens nach Anspruch 28, oder der Verwendung nach Anspruch 29 bestimmt und b) als wirksam befundene Wirkstoffe mit kosmetisch und pharmakologisch geeigneten und verträglichen Trägern vermischt.
31. Kosmetische oder pharmazeutische Zubereitung gegen Hautstreß und/oder Hautalterung, enthaltend mindestens ein Nukleinsäurekonstrukt, das geeignet ist, die Aktivität mindestens eines der Proteine zu unterdrücken oder zu verringern, die in alter bzw. gestreßter Haut stärker exprimiert werden als in junger bzw. ungestreßter Haut, oder die Aktivität mindestens eines der Proteine zu induzieren oder zu verstärken, die in junger bzw. ungestreßter Haut stärker exprimiert werden als in alter bzw. gestreßter Haut.
32. Zubereitung nach Anspruch 31 , dadurch gekennzeichnet, daß das Protein ausgewählt ist, bzw. die Proteine ausgewählt sind unter denen, die a) in den Tabellen 1 bis 4 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number, oder die b) in Tabelle 6 oder 8 in Spalte 2 durch ihre UniGene-Accession-Number, oder in Spalte 3 durch ihre Swissprot- oder TREMBL-Nummer, oder in Spalte 4 durch ihre EMBL/Genbank-Nummer, oder in Tabelle 9 durch den Namen des Gens, oder die c) in Tabelle 5 oder in Tabelle 7 in Spalte 2 durch ihre 11 Basen umfassende Tag- Sequenz definiert werden.
33. Zubereitung nach Anspruch 31 oder 32, dadurch gekennzeichnet, daß das Nukleinsäurekonstrukt ausgewählt ist unter DNA, RNA oder PNA.
34. Zubereitung nach einem der Ansprüche 31 bis 33, dadurch gekennzeichnet, daß sie etwa 1000, insbesondere etwa 10 bis etwa 500, vorzugsweise etwa 10 bis etwa 250, besonders bevorzugt etwa 10 bis etwa 100 und ganz besonders bevorzugt etwa 10 bis etwa 50 voneinander verschiedene Nukleinsäurekonstrukte enthält.
35. Zubereitung nach einem der Ansprüche 31 bis 34, dadurch gekennzeichnet, daß das Nukleinsäurekonstrukt ausgewählt ist unter proteinkodierenden Sequenzen, Ribozy- men, Antisense-Nukleinsäuren, Triple-Helix-Bildnern und rRNA.
36. Zubereitung nach einem der Ansprüche 31 bis 35, dadurch gekennzeichnet, daß das Nukleinsäurekonstrukt in Lipidvesikeln eingeschlossen ist, beispielsweise in Liposomen, Niosomen oder Transfersomen, vorzugsweise in Liposomen.
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