DE69933391T2

DE69933391T2 - Diacylglyzerin-acyltransferase gen aus pflanzen

Info

Publication number: DE69933391T2
Application number: DE69933391T
Authority: DE
Inventors: Jitao Saskatoon ZOU; C. David Saskatoon TAYLOR; Yangdou Saskatoon WEI; C. Colette Saskatoon JAKO
Original assignee: National Research Council of Canada
Current assignee: National Research Council of Canada
Priority date: 1998-12-17
Filing date: 1999-12-16
Publication date: 2007-11-15
Anticipated expiration: 2019-12-17
Also published as: EP1141324B1; CA2355845C; AU1763800A; CN1352690A; CA2355845A1; WO2000036114A1; AU779969B2; EP1141324A1; DE69933391D1; ATE340861T1

Description

TECHNISCHES GEBIET
Diese Erfindung betrifft Pflanzengene, welche für die genetische Manipulierung von Pflanzenmerkmalen brauchbar sind. Genauer gesagt, betrifft die Erfindung die Identifizierung, Isolierung und Einführung von Diacylglycerinacyltransferase (DGAT)-Genen, welche zum Beispiel zur Änderung des Samenöl-Gehalts, des Verhältnisses von Diacylglycerin/Triacylglycerin-Proportionen im Samenöl, der Fettsäuresynthese, der Samenöl-Acylzusammensetzung, der/dem Samengröße/Gewicht und des Kohlenstoff-Flusses zu anderen Samenkomponenten in kommerziellen oder Kulturpflanzen nützlich sind.
TECHNISCHER HINTERGRUND
Pflanzensamenöle sind Hauptquellen von essenziellen mehrfach ungesättigten Fettsäuren für menschliche Nahrungsmittel und erneuerbare Einsatzmaterialien für die chemische Industrie. Die Enzyme des Fettsäuresynthase-Komplexes in den Plastiden von sich entwickelnden Samen sind verantwortlich für die Biosynthese von Fettsäuren, welche in den cytosolischen Acyl-CoA-Pool kanalisiert werden, um die Triacylglycerin-Akkumulierung aufrecht zu erhalten bzw. zu unterstützen. Die Triacylglycerin(TAG)-Biosynthese ist im endoplasmatischen Retikulum lokalisiert, mit Glycerin-3-Phospat und Fettacyl-CoA's als den primären Substraten. Es gibt drei Acyltransferasen, die an der Pflanzen-Speicherlipid-Bioassemblierung beteiligt sind, nämlich die Glycerin-3-phoshat-Acyltransferase (GPAT, EC 2.3.1.15), die lyso-Phosphatidsäure-Acyltransferase (LPAT, EC 2.3.1.51) und die Diacylalycerinacyltransferase (DGAT, EC 2.3.1.20). Diese drei Acyltransferasen katalysieren die schrittweise Acylierung des Glycerin-Grundgerüsts, wobei der letztendliche Schritt die Acylierung von sn-1,2-Diacylglycerin (DAG) durch DGAT zur Bildung von TAGs ist, ein biochemischer Prozess, welcher allgemein als der Kennedy-Weg bekannt ist (Stymne und Stobart, 1987).
Unter den drei ER-basierenden Fettacyl-CoA-Acyltransferasen sind nur LPAT-Gen(e) aus Pflanzen kloniert worden (Knutzon et al., 1995, Lassner et al., 1995). Wie mehrere andere Enzyme, die an der Speicherlipid-Biosynthese beteiligt sind, sind Acyltransferasen intrinsische ER-Proteine und sind äußerst schwierig zu reinigen. Die Forschung bezüglich Pflanzen-DGAT ist in großem Maße auf Untersuchungen von Aktivitätsprofilen durch Verwenden der partikulären bzw. einzelnen Fraktionen beschränkt gewesen, die durch Differenzialzentrifugation von aus Samen oder Mikrosporen abgeleiteten Embryo-Homogenaten erzeugt wurden (Weselake et al., 1993). Obwohl die partielle Reinigung von DGAT aus Cotyledonen von keimenden Sojabohnensamen berichtet wurde (Kwanyuan und Wilson, 1986), fehlt eine ausführliche molekulare Charakterisierung dieses Enzyms.
Es wird Bezug genommen auf den R61u012-Datenbank-Eintrag Ac005917; Zugangsnummer AC005917; 4. November 1998; LIN X. ET AL: "Arabidopsis thaliana chromosome II section 113 of 255 of the complete sequence". Dieser betrifft eine Nukleotidsequenz-Hinterlegung, welche erstmalig bei der NCBI GenBank am 3. November 1998 ohne jedwede Identifizierung von vermeintlichen codierenden Sequenzen, die darin enthalten sind, eingereicht wurde. In den hinterlegten Materialien fand sich kein Bezug auf ein Diacylglycerin-O-Acyltransferase-Gen".
Es wird ebenfalls Bezug genommen auf VESNA KATAVIC ET AL.: "Alteration of Seed Fatty Acid Composition by an Ethyl Methanesulfonat-induced Mutation in Arabidopisis thaliana Affecting Diacylglycerol Acyltransferase Activity": PLANT PHYSIOLOGY, Band 108, 1995, S. 399-409. Diese Bezugsstelle offonbart eine als AS11 bezeichnete Arabidopsis-Mutante, welche eine reduzierte Diacylglycerinacyltransferase-Aktivität aufweist. Die Bezugsstelle offenbart keinerlei DNA-Sequenzen und lehrt nur, dass Änderungen in der DGAT-Aktivität zu Änderungen im Fettsäuregehalt führen können.
Folglich, obwohl der Kennedy-Weg bekannt ist und die Schritte in der Biosynthese von TAGs in Pflanzen zeigt, gab es keinerlei Identifikation und Verwendung eines genetischen Elementes, welches zuverlässig in Pflanzen verwendet werden kann, um TAG-Synthese und -Zusammensetzung in einer Weise zu modifizieren, die kommerziell genutzt werden kann.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Ein Ziel der Erfindung besteht darin, ein genetisches Element zu identifizieren, zu isolieren und zu klonieren, welches verwendet werden kann, um die natürliche Bildung von Triacylglycerinen in Pflanzen zu modifizieren, um die Ausbeute an kommerziellen Pflanzenölen zu erhöhen oder um ihre Zusammensetzung zu modifizieren, um spezifische kommerzielle Verbesserungen von Pflanzen und Pflanzenprodukten zu erreichen.
Ein anderes Ziel der Erfindung besteht darin, Diacylglycerinacyltransferase (DGAT)-Gen- und cDNA-Sequenzen aus Arabidopsis zu identifizieren, zu isolieren und zu charakterisieren und diese Sequenzen bei der genetischen Manipulation von Pflanzen zu verwenden.
Ein anderes Ziel der Erfindung besteht darin, einen Vektor, welcher die Volllängen-DGAT-cDNA-Sequenz aus Arabidopsis in einer Sinn- bzw. Sense-Orientierung unter der Regulation eines samenspezifischen Promotors (z. B. Napin; siehe Josefsson et al., 1987; Radke et al., 1988; Voelker et al., 1992) enthält, zum erneuten Einbringen in Arabidopsis oder zum Einbringen in andere Pflanzen bereitzustellen.
Ein anderes Ziel der Erfindung besteht darin, einen Vektor, der ein genomisches Fragment aus Arabidopsis enthält, welches aus dem Volllängen-DGAT-Gen unter der Regulation seiner eigenen 5' stromaufwärts regulatorischen Sequenzen besteht, zum erneuten Einbringen in Arabidopsis oder zum Einbringen in andere Pflanzen bereitzustellen.
Ein anderes Ziel der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zum Konstruieren eines Vektors, welcher die Volllängen-DGAT-Sequenz oder einen signifikanten Anteil der DGAT-Sequenz aus Arabidopsis, in einer Antisense-Orientierung unter der Regulation entweder eines konstitutiven oder eines samenspezifischen Promotors enthält, zum erneuten Einbringen in Arabidopsis oder zum Einbringen in andere Pflanzen bereitzustellen.
Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zum Modifizieren von Arabidopsis und anderen Pflanzen bereitzustellen, um ihren Samenöl-Gehalt zu verändern.
Ein anderes Ziel der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zum Modifizieren von Arabidopsis und anderen Pflanzen bereitzustellen, um die Acylzusammensetzung ihres Samenöls zu verändern.
Ein anderes Ziel der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zum Modifizieren von Arabidopsis und anderen Pflanzen bereitzustellen, um ihr(e) durchschnittliche(s) Samengewicht oder -größe zu verändern.
Gemäß eines Aspekts der vorliegenden Erfindung wird ein Vektor bereitgestellt, der isolierte und gereinigte Desoxyribonukleinsäure (cDNA) von SEQ ID NO: 1 (pDGATcDNA; ATCC Nr. PTA-989) enthält, zur Einbringung der cDNA in einer Sense-Orientierung in eine Pflanzenzelle.
Gemäß noch eines anderen Ziels der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines Vektors, enthaltend SEQ ID NO: 1 oder einen Teil davon, zum Einbringen des Gens oder partiellen Gens in einer Antisense-Orientierung in eine Pflanzenzelle bereit gestellt.
Gemäß noch eines anderen Ziels der Erfindung werden Samen von Arabidopsis thaliana Ökotyp Columbia, Mutante AS11 (ATCC Nr. PTA-1013) und die Charakterisierung von dessen Lipid-Phänotyp (Katavic et al., 1995; Zou et al. 1999) vorgesehen. Die AS11-Mutanten-Samenlinie besitzt eine Insertionsmutation am TAG1-Locus auf Chromosom 11 und erzeugt Pflanzen, welche eine verringerte DGAT-Aktivität (4) und ein verringertes TAG/DAG-Verhältnis während der Samenentwicklung (Tabelle 1) aufzeigen, was zu einer veränderten Samen-Fettacyl-Zusammensetzung (2), reduziertem Ölgehalt (Tabelle 1) und erhöhtem Samenöl-Diacylglycerin-Gehalt während der Entwicklung (3) und bei der Reife (niedrigeres TAG/DAG-Verhältnis von Tabelle 1) führt. Die cDNA-Sequenz der AS11-DGAT ist in SEQ ID NO: 23 gezeigt, die genomische DNA-Sequenz ist in SEQ ID NO: 24 gezeigt, und die translatierte Proteinsequenz der AS11-DGAT ist in SEQ ID NO: 25 gezeigt.
Die Erfindung betrifft des Weiteren transgene Pflanzen und Pflanzensamen, aufweisend ein Genom, enthaltend eine eingebrachte DNA-Sequenz von SEQ ID NO: 1, und ein Verfahren zur Herstellung derartiger Pflanzen und Pflanzensamen.
Die Erfindung betrifft des Weiteren SEQ ID NO: 1 oder einen Teil von SEQ ID NO: 1, oder SEQ ID NO: 1, enthaltend eine 81 bp große Insertion [SEQ ID NO: 23], oder SEQ ID NO: 3, enthaltend eine 147 bp große Insertion [SEQ ID NO: 24], so dass die abgeleitete Aminosäuresequenz des codierten Proteins die wiederholte Sequenz SHAGLFNLCVVVLIAVNSRLIIENLMK [SEQ ID NO: 25] enthält, worin der Abstand und die Identität der unterstrichenen Aminosäuren identisch sind oder durch konservierte Substitutionen ersetzt sind, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz in Sense- oder Antisense-Orientierung eingebracht worden ist, sowie ein Verfahren zur Herstellung solcher Pflanzen und Pflanzensamen.
Allgemeiner ausgedrückt, betrifft die vorliegende Erfindung die Isolierung, Reinigung und Charakterisierung eines Diacylglycerinacyltransferase (DGAT)-Gens aus den Brassicaceae (spezifisch Arabidopsis thaliana) und zeigt seine Nützlichkeit bei der Regulierung der Fettsäuresynthese, des Samenöl-Gehaltes, der Diacylglycerin/Triacylglycerin-Verhältnisse und der Samengröße/-gewicht. Bis heute sind keine konkreten Daten über die Genstruktur von Pflanzen-DGATs oder ihre Nützlichkeit bei der Änderung von Ölgehalt oder -zusammensetzung durch genetische Manipulation verfügbar.
Bei der Betrachtung von veränderten Öl-Gehalten oder -Zusammensetzungen werden am besten Ergebnisse aus Durchschnittswerten von statistisch signifikanten Anzahlen an Pflanzen oder Samen gemäß der Erfindung verglichen mit Ergebnissen aus Durchschnittswerten von statistisch signifikanten Anzahlen von nicht-transformierten (Kontroll-)Pflanzen oder -Samen des gleichen Genotyps, die unter identischen Bedingungen zur gleichen Zeit gezogen wurden. Dies berücksichtigt die Variabilität von individuellen Pflanzen des gleichen Genotyps, insbesondere, wenn derartige Pflanzen unter verschiedenen Bedingungen gezogen werden. Die tatsächliche Anzahl von Pflanzen oder Samen, welche verwendet wird zur Bildung des erforderlichen Durchschnittwerts, kann schwanken, sollte aber ausreichend sein, um einen im Allgemeinen konstanten Durchschnittwert bereitzustellen, wann immer eine derartige Anzahl gewählt wird. Im Allgemeinen sollte die Anzahl mindestens 10 betragen, und ist stärker bevorzugt wenigstens 20, 30, 50 oder 100.
Das DGAT-Gen wurde kloniert, charakterisiert und hinsichtlich der Echtheit bestätigt aus Arabidopsis, durch: (1) Selektion und Charakterisierung von Pflanzen-ESTs, welche eine gewisse Homologie mit Säuger-Acyl-CoA: Cholesterinacyltransferasen gemeinsam haben; (2) die funktionelle Expression einer Volllängen-cDNA in Hefe; (3) die Charakterisierung und Isolierung des DGAT (TAG1)-Gens aus der Arabidopsis-Mutante AS11, enthaltend eine Insertionsmutation im DGAT-Gen, und eines Samenöl-Phänotyps, welcher aus einem veränderten DAG/TAG-Verhältnis und einem veränderten Öl-Gehalt und einer veränderten Acylzusammensetzung besteht; (4) Komplementation der AS11-Mutante durch Insertion der DGAT-cDNA-Sequenz zur Wiederherstellung einer Wildtyp-Fettsäurezusammensetzung; (5) die Überexpression der DGAT-cDNA in transgenen Wildtyp-A. thaliana-Pflanzen, welche Samen mit einem erhöhten Ölgehalt, erhöhtem durchschnittlichen Samengewicht und veränderter Samenöl-Acylzusammensetzung produzieren.
Die A. thaliana-DGAT-Struktur ist signifikant homolog (über 40 % identisch über einen Bereich von mehr als 400 Aminosäuren) zu ihren Säuger-Gegenstücken, und ist in hohem Maße homolog zu nachfolgend berichteten vermeintlichen B. napes-DGATs sowohl auf der Nukleotidebene (92 %) als auch der Ebene der abgeleiteten Aminosäure (90 %) (Nykiforuk et al., 1999; GenBank/EMBL Zugangs-Nr. AF155224; AF164434).
Die DGAT der vorliegenden Erfindung ist nützlich bei der Manipulierung von DGAT-Aktivität und der Tri acylglycerin-Bioassemblierung in Pflanzen. Durch Transformieren von Pflanzen mit einem Konstrukt, welches das DGAT-Gen in einer Sense-Orientierung unter der Regulation eines gewebespezifischen Promotors (z. B. des samenspezifischen Promotors Napin) enthält, kann zum Beispiel die Expression von DGAT und die Akkumulierung von Samenöl gesteigert oder die Acylzusammensetzung des Samenöls verändert werden. Noch ein anderes Beispiel würde darin bestehen, die DGAT-cDNA unter der Regulation eines konstitutiven Promotors (z. B. 35S (Datia et al., 1993)) zu exprimieren, um den TAG-Gehalt von vegetativen Geweben (Blättern, Wurzeln, Stängeln) zu erhöhen. Dies kann besondere Vorteile zur Veränderung des Stärke/Öl-Verhältnisses in Hackfrüchten bzw. Wurzelgemüse besitzen.
Alternativ dazu kann die DGAT-Expression in einem gewissen Ausmaß durch Antisense- oder Co-Suppression (Transwitch)-Phänomene zum Ruhen gebracht werden (De Lange et al., 1995; Mol et al., 1990; Jorgensen und Napoli, 1994; Kinney, 1995; Vaucheret et al., 1998; Taylor, 1998). Zum Beispiel kann das Silencing bzw. Ruhigstellen von DGAT in einer samenspezifischen Weise zu einer Verringerung der TAG-Akkumulierung führen. Dies könnte Anwendungen bei der Verringerung des Ölgehalts in Saatgut-Gerste haben, um die Stabilität während der Lagerung zu erhöhen. Als ein zweites Beispiel kann ein samenspezifisches Silencing zu einer relativ hohen Akkumulierung von DAG oder zu einer Erhöhung im DAG/TAG-Verhältnis im sich entwickelnden oder reifen Samen führen. Als noch ein anderes Beispiel kann die Expression des mutierten DGAT-Gens, welche zu einer 27-Aminosäure-Wiederholungseinheit (bzw. Repeat)-Insertion im Mutanten-DGAT-Protein führt (siehe 5a), verwendet werden, um das DAG/TAG-Verhältnis in sich entwickelnden und reifen Samen zu ändern. Solche Manipulationen können zu essbaren Samenölen führen, welche auf natürliche Weise in der Pflanze produziert werden, enthaltend gesteigerte rela tive Gehalte von DAG/reduzierte Gehalte von TAG (siehe 3; Tabelle 1), um als vollständig natürliche Emulgatoren in der Nahrungsmittel- und Süßwaren-Industrie zu wirken oder um das Nährstoff/Gesundheits-Profil von Pflanzenölen als funktionelle Lebensmittel (z. B. als Öle zum Kochen, Öle zum Pfannenrühren, in Salat-Soßen, Margarinen etc.) durch Inhibieren von Neutralfettablagerung in Menschen zu verbessern. Verarbeitete Öle, hergestellt aus Canola und Sojabohne, welche erhöhte Anteile an Diacylglycerin enthalten, sind von der Kao Corporation of Japan (z. B. Econa Cooking Oil; Kao Corporation KI, 1-14-10 Nihonbashi-Kayabacho, Chuoku, Tokyo 103, Japan; e-Mail: 210064@kastanetkao.co.jp) als ein Produkt zitiert worden, welches den Anstieg von Blut-Neutralfett nach einer Mahlzeit und das Ansetzen von Fett am Körper erschwert, wodurch Personen geholfen wird, die übergewichtig sind oder die unter hohen Neutralfettspiegeln leiden. Als ein drittes Beispiel wird das Silencing oder Reduzieren der Aktivität von DGAT in einer samenspezifischen Weise (wie beobachtet in der Mutante AS11; z. B. durch Überexprimieren von SEQ ID NO: 23 oder Silencing der Expression von SEQ ID NO: 1, und Kombinieren dieses Merkmals mit der Fähigkeit, Polyhydroxyalkanoate (PHAs; z. B. Polyhydroxybutyrat) in Samen zu produzieren (Poirier et al., 1992; 1995)) einen erhöhten Fluss von nicht-veresterten Fettsäuren in Richtung zur β-Oxidation gestatten (Poirier et al., 1999). Durch Recycling oder Umleitung der nicht-veresterten Fettsäuren zur β-Oxidation werden die resultierenden Acetyl-CoA-Reste zu einer signifikanten Erhöhung hinsichtlich Polyhydroxyalkanoaten (PHAs) oder einer Änderung in der PHA-Zusammensetzung (Poirier et al., 1999) führen. Transgene Pflanzen, welche PHAs in Samen produzieren, besitzen das Potenzial zur Nützlichkeit als bioabbaubare Thermoplaste. Allerdings sind bis heute die hergestellten Gehalte an PHAs relativ niedrig gewesen (Poirier et al., 1992; 1995). Die Nutzbarkeit des transgenen Verringerns der DGAT-Aktivität zur signifikanten Steigerung (z. B. 10-fache Erhöhung) der PHA-Produktion in PHA-produzierenden Samen ist nun, aufgrund der vorliegenden DGAT-Erfindung, möglich.
Einige der Manipulationen und lieferbaren Formen, welche unter Verwendung des DGAT-Gens oder eines Teils davon möglich sind, schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, die folgenden ein: Samen mit erhöhtem oder verringertem Ölgehalt; Samen, welche Öle mit einem erhöhten Diacylglycerin-Gehalt enthalten, Samenöle mit einer veränderten Acylzusammensetzung; Pflanzen, welche größere oder schwerere Samen herstellen; Pflanzen, welche eine gesteigerte oder veränderte Kapazität zum Akkumulieren von Speicherverbindungen in anderen Speicherorganen (z. B. Knollen, Wurzeln) aufweisen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die 1 ist ein Diagramm, welches den Kennedy-Weg für die Bioassemblierung von Triacylglycerinen in Pflanzen veranschaulicht, und zeigt die kritische Rolle, welche DGAT als letzter Schritt des Kennedy-Wegs spielt.
Die 2 ist eine Grafik, welche den Vergleich der Fettsäurezusammensetzung von Samenöl aus Wildtyp (WT)- und DGAT-Mutanten-AS11-Linien von Arabidopsis thaliana zeigt. Die Anteile von Fettsäuren sind als Mol-% der Gesamt-Fettsäurezusammensetzung des Samenöls aus jeder Linie aufgeführt. Fehlerbalken sind ± Standardabweichung (n = 10 Pflanzen von jeder als Probe herangezogenen Linie, mit 50 Samen pro Probe pro Analyse).
Die 3 ist eine Grafik, weiche einen Vergleich des DAG-Gehaltes in sich entwickelnden Samen von Wildtyp (WT)- und DGAT-Mutanten-AS11-Linien von Arabidopsis thaliana zeigt. Genauer gesagt, ist sie ein Vergleich des Fettsäuregehalts des DAG-Pools in grünen, sich entwickelnden Wildtyp-Samen, verglichen mit demjenigen der AS11-Mutante.
Die 4 ist eine Grafik, welche einen Vergleich der DGAT-Aktivität (pMol/min/mg Protein) in sich entwickelnden Samen bei den milchigen, frühen grünen, mittel-grünen und braun-grünen Stadien der Embryo-Entwicklung in Wildtyp (WT)- und DGAT-Mutanten-AS11-Linien von Arabidopsis thaliana zeigt. Sich entwickelnde Samen bei jedem Stadium wurden selektiert, und DGAT-Enzym-Analysen wurden durchgeführt, wie früher von Katavic et al. (1995) beschrieben.
Die 5(a) zeigt die Aminosäuresequenz-Alignierung der Arabidopsis-DGAT (AtTAG1) [SEQ ID NO: 2] mit Säuger-DGATs (Maus und, mutmaßlich, Mensch): MDGAT, Maus-DGAT [SEQ ID NO: 4]; GenBank/EMBL-Zugangs-Nr. AF078752 (Cases et al., 1998)]; HARGP1, humanes ARGP1-Protein [SEQ ID NO: 5]; GenBank/EMBL-Zugangs-Nr. AF059202; Oelkers et al., 1998]. Punkte stehen für Lücken. Identische Aminosäurereste sind in Schwarz hervorgehoben. Konservierte Reste sind schattiert. Die 27-Aminosäure-Wiederholungseinheit, welche in der Arabidopsis thaliana-Mutante AS11 gefunden und durch die Insertionsmutation (81 bp) erzeugt wurde, zu finden in der SEQ ID NO: 23 (SHAGLFNLCVVVLIAVNSRLIIENLMK), ist folgendermaßen überstrichen: -------------. Die mutmaßliche Diacylglycerin-Bindungsstelle ist folgendermaßen überstrichen

. Die SnRK1-Targeting-Stelle ist folgendermaßen überstrichen:
mit einem Asterisken (*) über dem Serin(S)-Rest als der angezielten Phosphorylierungsstelle.
Die 5(b) zeigt den Kyte-Doolittle-Hydropathie-Plot des DGAT-Proteins.
Die 6(a) zeigt die Ergebnisse einer Northern-Analyse von TAG1-Genexpression in Arabidopsis thaliana.
Gesamt-RNA wurde aus Wurzeln (RT), Blättern (LF), Blüten (FL), jungen Keimlingen (YS), sich entwickelnden Schoten (SL) und keimenden Samen (GS) extrahiert.
Die 6(b) zeigt die Ergebnisse von Southern-Blot-Analysen des TAG1-Gens in Arabidopsis thaliana. Genomische DNA wurde mit den Restriktionsenzymen BglII (Spur 1), EcoRI (Spur 2) und HindIII (Spur 3) verdaut. Die TAG1-DNA-Sonde wurde durch statistisches Primen mit ³²P markiert.
Die 7(a) ist eine diagrammartige Wiedergabe der TAG1-Genstruktur. Die Rahmen bzw. Kästchen zeigen die 16 Exons (ausgefüllte Rahmen für codierende Regionen, offene Rahmen für untranslatierte Regionen), und die Linien repräsentieren die 15 Introns. A, B und C bezeichnen die Positionen der Primer, weiche für PCR-Amplifikationen der Segmente aus Wildtyp (WT) und AS11 verwendet wurden. Die spezifischen Primer A, B und C werden in 'Experimentelle Vorgehensweisen: Primerstrategie' (was später in dieser Beschreibung zu finden ist) beschrieben.
7(b) zeigt die Gel-Trennung der PCR-Produkte, welche aus Wildtyp(WT) und AS11 amplifiziert wurden. Spur 1, PCR-Produkt mit Primern A und B unter Verwendung von genomischer WT-DNA als Matrize. Spur 2, PCR-Produkt mit den Primern A und B unter Verwendung von genomischer AS11-DNA als Matrize. Spur 3, PCR-Produkt mit den Primern C und B unter Verwendung genomischer WT-DNA als Matrize. Spur 4, PCR-Produkt mit den Primern C und 8 unter Verwendung von genomischer AS11-DNA als Matrize. Spur 5, RT-PCR mit den Primern A und B unter Verwendung von RNA, welche aus WT-Keimling-RNA hergestellt wurde. Spur 6, RT-PCR mit den Primern A und B unter Verwendung von RNA, welche aus AS11-Keimling-RNA hergestellt wurde.
Die 8 ist eine Grafik, welche mikrosomale DGAT- Aktivität im Hefe-Stamm YMN5 zeigt, welcher mit leerem Plasmid (pYES Con) und mit der A.thaliana-DGAT-cDNA (pYES:DGAT) transformiert wurde. Dies veranschaulicht die Expression der TAG1-cDNA in Hefe. Wirtskulturen des Stamms YMN5 wurden mit pYES2-Plasmid allein (pYES2; ohne TAG1-Insert) oder mit pYES2, enthaltend das TAG1-cDNA-Insert (pYES2:TAG1) transformiert. Im Anschluss an die Induktion in Gegenwart von Galactose wurden Transformanten lysiert und hinsichtlich DGAT-Aktivität geassayt, wie beschrieben in den 'Experimentellen Vorgehensweisen'. Die Ergebnisse von zwei getrennten DGAT-Aktivitätsexperimenten sind gezeigt.
Die 9 ist eine Karte des Plasmids pSE129A, welches als ein Vektor verwendet werden kann. Der Vektor enthält die folgenden hauptsächlichen Merkmalen zur Pflanzentransformation in der vorliegenden Erfindung: den samenspezifischen Napin-Promotor und NOS-Terminator, zwischen welchen eine Mehrfachklonierungsstelle liegt.
Die 10 ist eine Grafik, welche die Komplementation der AS11-DGAT-Mutation mit der Wildtyp-cDNA zeigt. Die Transformation der Arabidopsis thaliana-Mutantenlinie AS11 mit der DGAT-cDNA [SEQ ID NO: 1] unter der Regulation eines Napin-Promotors führt zu einer Wiederherstellung der Wildtyp (WT)-Fettsäurezusammensetzung im Samenöl der Transformantenlinien 3-4, 9-1, 14-2 und 9-4. Die Fettsäurezusammensetzung (Gew.-%) wurde an dem Samenöl bestimmt, welches aus 100-Samen-Proben aus nicht-transformierten A. thaliana-Kontrollen (WT), Mutanten-Linie AS11 und T₂-Samen von transgenen Napin:DGAT-Linien extrahiert worden war.
Die 11 ist eine Grafik, welche den Samenöl-Gehalt von nicht-transformierter WT-Kontrolle und pRD400-Kontrolle (leeres Plasmid) und transgenen Napin:DGAT-T₂-Arabidopsis thaliana-Samenlinien zeigt. Genauer gesagt, zeigt die Grafik die Transformation von Wildtyp (WT)- Arabidopsis thaliana mit der DGAT-cDNA [SEQ ID NO: 1] unter der Regulation eines Napin-Promotors, was zu einem höheren Samenöl-Gehalt in den DGAT-transgenen Linien führt. Der Ölgehalt wird als μg Gesamt-Fettsäuren (FAs) pro 100 Samen aus nicht-transformierten A. thaliana-Kontrollen (WT Con) und T₂-Samen von transgenischen pRD400-Kontroll-(leeres Plasmid) sowie Napin:DGAT-transgenischen Linien 1', 2', 9, 10 und 11 ausgedrückt. Standardabweichungs-Balken für die Kontroll-Linien sind angegeben; n = 10.
Die 12 ist eine Grafik, welche das durchschnittliche 100-Samen-Gewicht von nicht-transformierten WT-Kontroll- und pRD400-Kontroll (leeres Plasmid)- und Napin:DGAT-T₂-transgenen Arabidopsis thaliana-Samenlinien zeigt. Genauer gesagt, zeigt die Grafik, dass die Überexpression der DGAT-cDNA unter der Regulation eines Napin-Promotors, in Wildtyp(WT)-Arabidopsis thaliana, zu einem höheren durchschnittlichen Samengewicht führt. Das durchschnittliche Gewicht von 100-Samen-Proben aus nicht-transformierten A. thaliana-Kontroll-(WT Con) und T₂-Samen von transgenen pRD400-Kontroll-(leeres Plasmid) und transgenen Napin:DGAT-Linien 1', 2', 9, 10 und 11 wird als mg Trockengewicht (DW) aufgeführt.
Die 13 ist eine Grafik, welche die positive Korrelation zwischen dem Ölgehalt (ausgedrückt als μg Gesamtfettsäuren (FAs) je 100 Samen) und dem durchschnittlichen Samengewicht (ausgedrückt als Durchschnitt mg DW pro 100-Samen-Proben) aus nicht-transformierten A, thaliana-Kontrollen (WT Con ♦) und T2-Samen von transgenen pRD400-Kontroll- (leeres Plasmid) (( ) und transgenen Napin:DGAT-Linien 1', 2', 9, 10 und 11 (∎) zeigt, was als mg Trockergewicht (DW) aufgeführt wird.
BESTE WEGE ZUR AUSFÜHRUNG DER ERFINDUNG
Die 1 ist ein Diagramm, welches den Kenne dy-Weg für die Biosynthese von TAGs in Pflanzen veranschaulicht. Von den verschiedenen veranschaulichten Enzymen ist DGAT das einzige Enzym im Kennedy-Weg, welches ausschließlich auf TAG-Biosynthese festgelegt ist, und seine Schlüsselrolle ist aus dem Schema von 1 offensichtlich. sn-1,2-DAG, welches als Ergebnis entweder der katalytischen Wirkung von PA-Phosphatase (EC 3.1.3.4) oder CPTase (EC 2.7.8.2) erzeugt wird, kann in der Biosynthese von TAG verwendet werden.
Aus diesem Grund entschieden sich die Anmelder der vorliegenden Erfindung dazu, DGAT zu untersuchen, um heraus zu finden, ob das entsprechende Gen in Pflanzen sequenziert und kloniert und verwendet werden könnte, um den Samenöl-Gehalt und die Fettsäurezusammensetzung von Pflanzen in einer Weise zu modifizieren, welche kommerziell nützlich sein könnte.
Die Acyl-CoA-abhängige Acylierung von sn-1,2-DAG wird durch DGAT katalysiert (Stymne und Stobart, 1987). In sich entwickelnden und keimenden Samen von Ölsamenpflanzen wurde gezeigt, dass TAG-Akkumulierung und DGAT-Aktivität mit dem endoplasmatischen Retikulum (ER; Hochgeschwindigkeit-Mikrosomal-Fraktion) assoziiert sind (Stobart et al., 1986; Cao und Huang, 1986; Stymne und Stobart, 1987; Frentzen, 1993, Settlage et al., 1995; Lacey und Hills, 1996). Die biochemischen Eigenschaften von mikrosomaler DGAT sind in einer Anzahl von Pflanzensystemen (Frentzen, 1993), einschließlich sich entwickelnden Samen (Bernerth und Frentzen, 1990; Vogel und Browse, 1996; Cao und Huang, 1987) und Embryokulturen (Taylor et al., 1991; Weselake et al., 1991; Taylor et al., 1992; Little et al., 1994) von B. napes L. untersucht worden. Im Allgemeinen zeigen Untersuchungen mit sich entwickelnden Samen, dass DGAT-Aktivität während der aktiven Phase der Öl-Akkumulierung rasch ansteigt und dann merklich absinkt, wenn der Samen-Lipid-Gehalt ein Plateau erreicht (Tzen et al., 1993; Weselake et al., 1993).
Eine Anzahl von Untersuchungen mit sowohl Säuger-(Mayorek et al., 1989; Tijburg et al., 1989) als auch Pflanzen-(Ichihara et al., 1988; Perry und Harwood, 1993 a und 1993 b; Settlage et al., 1995) Systemen hat nahe gelegt, dass DGAT eine Geschwindigkeitslimitierende Reaktion in der TAG-Bioassemblierung katalysieren kann. Allerdings ist diese Hypothese nicht streng getestet worden, und ist bis heute nicht auf die Praxis reduziert worden durch transgene Expression von irgendeinem DGAT-Gen in Pflanzen- oder Tier-Systemen. Sich entwickelnde Samen von B. napus L., cv bzw. Kultivar Shiralee, produzieren gezeigtermaßen signifikante Gehalte an DAG während der aktiven Phase der Ölakkumulierung, was nahe legt, dass eine DGAT-katalysierte Reaktion den Fluss von Kohlenstoff zu TAG regulieren kann (Perry und Harwood, 1993 a und 1993 b). Darüber hinaus ist von einer Ethylmethansulfonat-induzierten (EMS-induzierten) Mutante von A. thaliana, bezeichnet als AS11, gezeigt worden, eine reduzierte DGAT-Aktivität zu besitzen, was sowohl mit einem erhöhten DAG-Pool als auch verringerter Akkumulierung von TAG korrelierte (Katavic et al., 1995). Angesichts ihrer möglichen Geschwindigkeits-limitierenden Rolle in der TAG-Bioassemblierung haben die Anmelder der vorliegenden Erfindung DGAT als ein potenzielles Ziel in der genetischen Modifikation der Pflanzen-Lipidbiosynthese identifiziert.
Früher wurde von der partiellen Charakterisierung einer EMS-induzierten Arabidopsis thaliana-Mutante, AS11, mit veränderter Fettsäurezusammensetzung berichtet (Katavic et al., 1995). Im Vergleich zu Wildtyp-Pflanzensamen, besitzen AS11-Samen verringerte Anteile der sehr langkettigen Fettsäure Eicosensäure (20:1) und reduzierte Gehalte an Ölsäure (18:1) und akkumulieren α-Linolensäure (18:3) als die hauptsächliche Fettsäure in Triacylglycerinen (2). Die AS11-Mutante besitzt ein konsistent niedrigeres Verhältnis von TAG/DAG in sich entwickelnden Samen, und sie akkumuliert eine erhöhte Menge an Samen-DAG (3), das Substrat der Diacylglycerinacyltransferase. Durch eine Reihe von biochemischen Analysen wurde es gezeigt, dass AS11 verringerte Diacylglycerinacyltransferase-Aktivitäten während der gesamten Samenentwicklung aufwies (4). AS11 hatte des Weiteren einen (um 25-30 %) reduzierten Ölgehalt-Phänotyp, was einen gewissen Beweis lieferte, dass DGAT den Fluss zur TAG-Biosynthese steuern kann, wie in der nachstehenden Tabelle 1 gezeigt ist. Der AS11 hatte keinen faltigen Samen-Phänotyp, wie beschrieben in anderen Mutanten mit wenig Samenöl (Focks und Benning, 1998). Tabelle 1 Vergleich von AS11-[Katavic et al. (1995)] und Wildtyp-A.thaliana-Samen bezüglich Lipidprofilen bei der mittleren Entwicklung und der relativen TAG-, DAG- und Sterinester-Gehalte in AS11- und WT-Samen bei der Reife.

^a Die Embryonen wurden eingestuft und die Lipide gemessen, wie beschrieben in Katavic et al. (1995);
^b Relativer TAG-Gehalt von 200-Samen-Proben von AS 11 und WT, wurden gemessen mittels MASSEN-1 H-NMR gemäß des Verfahrens von Rutar (1989). Die Integrations antwort für Resonanzen, welche flüssigkeitsähnlichem Öl zuzuschreiben waren, wurden summiert, und der Wert für AS11-Samen wird relativ zu der Antwort für die WT-Kontrolle-Samenprobe berichtet (wobei der letztere auf einen Wert von 1,00 gesetzt wird);
^c TAG-Gehalt (nMol/mg DW), gemessen durch Transmethylierung einer TLC-gereinigten TAG-Fraktion, gefolgt von GC-Analyse von Fettsäuremethylestern;
^d Ein Gesamtlipidextrakt wurde hergestellt, wie beschrieben von Taylor et al., (1991; 1992), und Sterinester wurden isoliert und charakterisiert, wie beschrieben in den Experimentellen Vorgehensweisen.

Eine genetische Analyse zeigte, dass der Fettsäure-Phänotyp durch eine semidominante Mutation in einem nukleären Gen, das als TAG1 bezeichnet wird, verursacht wird. Die Mutation wurde auf das Chromosom II kartiert, und von ihr wurde geschätzt, in der Region zu liegen, welche ungefähr 17,5 ± 3 cM von dem sti-Locus und 8 ± 2 cM von dem cp2-Locus entfernt ist.
Weil ein DGAT-Gen bislang nicht aus irgendeiner Pflanze kloniert worden ist, war es bis heute nicht möglich gewesen, die Möglichkeit von genetischen Modifikationen zur Veränderung des Kohlenstoff-Flusses, zur Erhöhung der Fettsäuresynthese, des Ölgehalts, der Öl-Acylzusammensetzung oder der Samengröße durch Modulieren von Pflanzen-DGAT-Aktivität zu prüfen.
Allerdings gibt es viele Beispiele von erfolgreichen Modifikationen am Pflanzenmetabolismus, welche durch gentechnischen Eingriff zum Übertragen neuer Gene oder zum Verändern der Expression bestehender Gene, in Pflanzen, erzielt worden sind. Es ist nun routinemäßig möglich, Gene in viele Pflanzenarten von landwirtschaftlicher Bedeutung einzubringen, μm die Ernteleistung zu verbessern (z. B. Samenöl- oder Knollenstärke-Gehalt/Zusammensetzung; Speisenverbesserung; Herbizid-, Krankheits- oder Insektenresistenz; Schwermetall-Toleranz etc.) (MacKenzie und Jain, 1997; Budziszewski et al., 1996; Somerville, 1993; Kishore und Somerville, 1993).
Zum Beispiel sind Erhöhungen in den Anteilen von einigen strategischen Fettsäuren und in den Mengen von Samenöl erzielt worden durch die Einbringung verschiedener Fettsäure-Biosynthese- und Acyltransferase-Gene in Ölsamen-Kulturpflanzen. Diese schließen die folgenden Demonstrationen ein: Expression eines Antisense-Konstruktes zur Stearoyl-ACP Δ9-Desaturase in Brassicaceae führte zu einer Erhöhung im Stearinsäuregehalt (Knutzon et al., 1992). Die Expression einer Mittelkettigen-Fettacyl-ACP-Thioesterase aus California Bay, in Brassicaceae, erhöhte gezeigtermaßen den Laurinsäure(12:0)-Gehalt (Voelker et al., 1992; 1996). Die Expression einer Jojoba-β-Keto-Acyl-CoA-Synthase in Brassicaceae mit niedrigem Erucasäure-Gehalt führte zu einer Erhöhung des Gehalts an Erucasäure (22:1); der Effekt im Anschluss an die Expression in Kultivaren mit hohem Erucasäuregehalt war vernachlässigbar (Lassner et al., 1996). Erhöhte Anteile an Ölsäure in Brassica napus und in Sojabohne sind erreicht worden durch Silencing der mikrosomalen FAD2 (Δ12)-Desaturase (Hitz et al., 1995; Kinney, 1995; 1997). Transformation von Arabidopsis thaliana und Rübsamen (B. napus) mit einer Hefe-sn-2-Acyltransferase führte zu Samenölen mit erhöhten Anteilen an 22:1- und anderen sehr langkettigen Fettsäuren und zu signifikanten Erhöhungen im Samenöl-Gehalt (Zou et al., 1997).
Die Stärkeablagerung ist auch durch gentechnischen Eingriff verändert worden. Durch Expression eines mutanten E. coli-glgC16-Gens, welches eine ADP-Glucose-Pyrophosphorylase codiert, in Kartoffelknollen wurde eine Erhöhung der Stärkeakkumulierung erreicht (Stark et al., 1992).
Die Erfinder zogen deshalb in Betracht, dass das DGAT-Gen vielversprechend für die gewünschte Modifikation von TAGs in Pflanzen ist.
Die besten Wege zur Ausführung der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung der Ergebnisse von Tests und Experimenten, welche von den Erfindern durchgeführt worden sind, offensichtlich werden.
Die Erfinder entschlossen sich, das allgemein anerkannte Modellpflanzensystem Arabidopsis thaliana für die Klonierung von DGAT, als ein Wirtssystem für die gentechnische Veränderung der DGAT-Expression und zur Untersuchung der Effekte der Veränderung von DGAT-Expression auf Samen-Triacylglycerin-Bioassemblierung zu verwenden. Dies beruht darauf, dass über die letzten mehreren Jahre hinweg, Arabidopsis thaliana eine typische Blütenpflanze, wachsende Popularität als ein Modellsystem für die Untersuchung der Pflanzenbiologie erlangt hat. Als ein Ergebnis der Leichtigkeit, mit welcher sich die Pflanze für Arbeiten sowohl hinsichtlich klassischer als auch molekularer Genetik eignet, ist es dazu gekommen, dass Arabidopsis weithin als ein Modellorganismus in der Pflanzen-Molekulargenetik, Entwicklung, Physiologie und Biochemie verwendet wird (Meyerowitz und Chang, 1985; Meyerowitz, 1987; Goodman et al., 1995). Diese zweikeimblättrige Modellpflanze ist ebenfalls nah verwandt mit Brassica-Kulturpflanzenarten, und es ist zunehmend offensichtlich, dass Informationen bezüglich der genetischen Regulation von grundlegenden biologischen Prozessen in Arabidopsis auf andere Spezies übertragbar ist (Lagercrantz et al., 1996).
Tatsächlich gibt es zahlreiche Beispiele, in welchen Untersuchungen der Molekularbiologie und Biochemie eines bestimmten Stoffwechselweges oder Entwicklungsprozesses, und die Möglichkeit der gentechnischen Manipulation einer Pflanze zur Bewirkung von Änderungen an dem Stoffwechselweg oder Prozess, zuerst in der Modellpflanze Arabidopsis getestet wurden, und man von ihnen danach gezeigt hat, ähnliche Phänotypen in anderen Pflanzen, insbesondere Kulturpflanzen, zu ergeben.
Zum Beispiel wurde das Gen für extra-plastidiale membranassoziierte Oleat(18:1)Δ12 (ω-6)-Desaturase, FAD2, ursprünglich untersucht und letztendlich kloniert aus Arabidopsis thaliana durch Identifizieren der Läsion, die gefunden wurde in einer A. thaliana-Mutante, welche hinsichtlich der Desaturierung von Oleat zur Produktion von Linoleat(18:2) auf dem Phosphatidylcholin-Grundgerüst defizient war. Dies führte zu einem Phänotyp mit hohem Ölsäuregehalt im A. thaliana-Samenöl (Okuley et al., 1994). Gentechnische Behandlung von sowohl Sojabohne (Glycine max.) als auch Canola, B. napus, zum Ruhigstellen der indigenen FAD2-Gen(e) in einer samenspezifischen Weise durch Antisense- oder Co-Suppressions-Vorgehensweisen führten zu ähnlichen Samenöl-Phänotypen mit hohem Ölsäuregehalt (Kinney, 1995; 1997).
Die transgene Expression eines Hefe-sn-2-Acyltransferase (SLC1-1)-Gens zum Erzielen eines erhöhten Samenöl- und sehr langkettigen Fettsäure-Gehaltes wurde zuerst in Arabidopsis durchgeführt, und später wurde davon gezeigt, ähnliche Phänotypen in transgenem Rübsamen(B. napus)-Experimenten zu ergeben (Zou et al., 1997). Arabidopsis thaliana hat sich wiederholt als ein nützliches Modellsystem für die metabolische Manipulation von Stoffwechselwegen (z. B. Lipidbiosynthese, Photosynthese) oder Prozessen (Organogenese, reproduktive Entwicklung etc.) erwiesen, welche allen höheren Pflanzen gemeinsam sind.
Auf dem Gebiet von Sekundärmetabolismus/Signaltransduktion wurde ein für den Anthocyanin-Weg spezifischer Transkriptionsaktivator aus dem einkeimblättrigen Mais, bezeichnet als R (der myc-Transkriptionsfaktor, der an der Aktivierung von biosynthetischen Genen für Anthocyanin-Produktion in den Aleuronzellen von Maiskernen beteiligt ist) im zweikeimblättrigen Arabidopsis exprimiert, was eine erhöhte Anthocyanin-Pigmentierung in den Infloreszenzen verursachte. Die anschließende Expression in einem anderen Zweikeimblättrigen, Tabak (Nicotiana tabacum), führte zu ähnlichen Blütenpigmentierungs-Veränderungen (Lloyd et al., 1992). Diese Experimente zeigen, dass ganze Stoffwechselwege, welche allen Blütenpflanzen gemeinsam sind, koordiniert durch die Einführung von transkriptionellen Regulatoren gesteuert werden können, und dass die Mechanismen verschiedenartigen Pflanzenspezies gemeinsam sind.
Im Kontext der vorliegenden Erfindung akkumulieren alle Pflanzensamen etwas Triacylglycerin (Öl), und dieser ubiquitäre Prozess wird wenigstens teilweise durch die Aktivität einer mikrosomalen DGAT beeinflusst, wie zuvor erklärt wurde. Daher kann von vielen der Effekte, welche im Anschluss an einen gentechnischen Eingriff zum Modulieren von DGAT-Expression in Arabidopsis beobachtet werden, erwartet und vorhergesagt werden, zu ähnlichen Phänotypen bei Ausführung in allen anderen Pflanzen zu führen. Zum Beispiel ist, nachdem die vorliegende Erfindung bewerkstelligt wurde, Information verfügbar geworden, welche die Befunde der Anmelder der vorliegenden Erfindung unterstützt, indem gezeigt wird, dass B. napes ein hoch homologes DGRT-Gen aufweist (Nikiforuk et al., 1999) und somit B. napes ein klares Ziel für ähnliche genetische Modifikationen ist, wie diejenigen, welche für A. thaliana gezeigt wurden.
Es gibt eine Anzahl von Wegen, auf welchen Gene und Genkonstrukte in Pflanzen eingeführt werden können, und eine Kombination von Pflanzentransformation und Gewebekulturtechniken wurde erfolgreich in effektive Strategien zur Erzeugung transgener Kulturpflanzen in tegriert. Diese Verfahren, welche in der vorliegenden Erfindung angewandt werden können, sind andernorts umfassend besprochen worden (Potrykus, 1991; Vasil, 1994; Walden und Wingender, 1995; Songstad et al., 1995) und sind dem Fachmann auf dem Gebiet allgemein bekannt. Zum Beispiel wird dem Fachmann auf dem Gebiet sicher bewusst sein, dass zusätzlich zu Agrobacteriumvermittelter Transformation von Arabidopsis durch Vakuum-Infiltration (Bechtold et al., 1993) oder Wunden-Inokulierung (Katavic et al., 1994), es gleichermaßen möglich ist, andere Pflanzen- und Kulturpflanzenspezies unter Verwendung von Agrobacterium-Ti-Plasmidvermittelter Transformation (z. B. Wundeninfektion von Hypokotyl (DeBlock et al., 1989) oder Cotyledonen-Blattstiel (Moloney et al., 1989)), Teilchenbeschuss/Biolistik-Methoden (Sanford et al., 1987; Nehra et al., 1994; Becker et al., 1994) oder Polyethylenglycol-unterstützte Protoplasten-Transformationsmethoden (Rhodes et al., 1988; Shimamoto et al., 1989) zu transformieren.
Wie dem Fachmann auf dem Gebiet ebenfalls offensichtlich sein wird, und wie andernorts umfassend besprochen wurde (Meyer, 1995; Datla et al., 1997), ist es möglich, Pflanzenpromotoren zu verwenden, um jedwede beabsichtige Auf- oder Abwärts-Regulierung von Transgen-Expression unter Verwendung konstitutiver Promotoren (z. B. denjenigen auf Basis von CaMV35S) oder durch Verwendung von Promotoren, welche Genexpression auf besondere Zellen, Gewebe (z. B. Napin-Promotor für die Expression von Transgenen in sich entwickelnden Samen-Cotyledonen), Organe (z. B. Wurzeln), auf ein besonderes Entwicklungsstadium oder in Antwort auf einen besonderen externen Stimulus (z. B. Hitzeschock) zielrichten können, zu lenken.
Besonders bevorzugte Pflanzen zur Modifikation gemäß der vorliegenden Erfindung schließen Arabidopsis thaliana, Boretsch (Borago spp.), Canola, Rizinus (Ri cinus communis), Kakaobohne (Theobroma cacao), Mais (Zea mays), Baumwollpflanze (Gossypium spp.), Crambe spp., Cuphea spp., Flachs (Linum spp.), Lesquerella und Limnanthes spp., Linola, Kapuzinerkresse (Tropaeolum spp.), Oenothera spp., Olive (Olea spp.), Palme (Elaeis spp.), Erdnuss (Arachis spp.), Rübsamen, Saflor (Carthamus spp.), Sojabohne (Glycine und Soja spp.), Sonnenblume (Heleanthus spp.), Tabak (Nicotiana spp.), Vernonia spp., Weizen (Triticum spp.), Gerste (Hordeum spp.), Reis (Oryza spp.), Hafer (Avena spp.), Sorghum (Sorghum spp.), Roggen (Secale spp.) oder andere Mitglieder der Gramineae ein.
Die vorliegende Erfindung ist besonders nützlich, wenn sie zum Modifizieren des Ertrags oder der Zusammensetzung von Ölsamen, produziert aus Ölsamen-Kulturpflanzen, verwendet wird. Ölsamen-Kulturpflanzen sind Pflanzenarten, welche fähig zum Erzeugen essbarer oder industriell nützlicher Öle in kommerziell bedeutenden Erträgen sind, und schließen viele der oben aufgezählten Pflanzenspezies ein. Derartige Ölsamen-Kulturpflanzen sind dem Fachmann auf dem Gebiet allgemein bekannt.
ERGEBNISSE
Isolation der TAG1 (DGAT)-cDNA aus Arabidopsis thaliana
Da einer der wahrscheinlichsten Defekte in der AS11-Mutante bei der DGAT selbst vorliegt (Tabelle 1; 4), erprobten die Erfinder Klonierungsstrategien, basierend auf Sequenzinformation von Enzymen, welche gemeinsame Substrate mit DGAT gemein haben. Eines der Kandidatenenzyme, welches diesem Zweck dienen wird, ist die Acyl-CoA:Cholesterin-Acyltransferase (ACAT, EC 2.3.1.26) (Chang et. al., 1997). Wie DGAT ist ACAT ein ER-Protein, welches als eine O-Acyltransferase durch Verwenden von Acyl-CoA als dem Fettacyldonor für die Veresterung von freiem Cholesterin zur Erzeugung von Sterinestern fungiert. Durch eine BLAST-Datenbank-Suche identifizierten die Erfinder einen von Arabidopsis thaliana exprimierten Sequenz-Tag (EST) [Zugangs-Nr. AA042298; SEQ ID NO: 6] mit einer abgeleiteten Aminosäuresequenz, welche 41 % Identität zu derjenigen der Hefe-Acyl-CoA:Cholesterin-Acyltransferase (Yang et al., 1996, Yu et al., 1996) zeigt, innerhalb der kurzen Sequenz (104 Aminosäuren), welche für den EST verfügbar war.
Der entsprechende cDNA (E6B2T7)-Klon wurde von dem "Arabidopsis Biological Resource Center", Columbus, Ohio, erhalten. Nach vollständigem Sequenzieren wurde von dem 878 bp großen E6B2T7-Klon festgestellt, eine partielle cDNA zu sein. Allerdings bestätigte die ORF-Vorhersage aus dieser partiellen cDNA die anfänglichen EST-Suchergebnisse dahingehend, dass das codierte Produkt strukturell ähnlich zu ACAT ist, speziell in den Regionen am C-Terminus. Die Erfinder waren überzeugt, dass die cDNA die 3'-untranslatierte Region enthielt, durch eine ORF-Suche, obwohl der PolyA-Schwanz fehlte.
Die Erfinder verwendeten ferner die partielle cDNA-Sequenz, um eine Suche gegen genomische Sequenzinformation von Arabidopsis thaliana auszuführen. Von einem Arabidopsis'IGF'-BAC-Klon 'F27F23' [Zugangs-Nr. AC003058] wurde identifiziert, dass er eine Region einschloss, welche der cDNA entsprach, und daher wurde gefolgert, dass dies die Region war, welche das entsprechende Gen überspannte. Darüber hinaus ist dieser BAC-Klon 'F27F23' im YAC-Klon, CIC06E08, enthalten, welcher, gemäß der veröffentlichten Karten-Position (http://weeds.mgh.harvard.edu/goodman/c2_b.html), eine Region zwischen Centimorgan 35,9 und Centimorgan 38,7 auf dem Chromosom II repräsentiert; diese Position ist ähnlich zu der geschätzten Lokation für TAG1, und der Läsion, welche durch die Mutation in AS11 identifiziert wurde (Katavic et al., 1995). In Hinsicht auf unsere früheren Ergebnisse bezüglich der Charakterisierung der AS11-Mutante, legte die Karten-Position dieses Gens in starkem Maße nahe, dass es eine DGAT codieren kann.
Um eine Volllängen-cDNA zu klonieren, wurde eine Reihe von Oligonukleotidprimern entworfen, basierend auf den genomischen Sequenzen, die an verschiedenen Positionen 5' stromaufwärts zu der Region, welche die partielle cDNA überspannt lokalisiert sind. Wir verwendeten diese Primer in Kombination mit einem Primer, der am 3'UTR der partiellen cDNA (E6B2T7) lokalisiert ist, um PCR-Reaktionen mit cDNA-Phagemid durchzuführen, hergestellt aus einer für Arabidopsis thaliana (Ökotyp Columbia)-Schoten spezifischen cDNA-Bibliothek (Giraudat et al., 1992), als einer Matrize. Die längste amplifizierte cDNA war 1904 bp groß, welche wir anschließend als TAG1 bezeichneten, und sie wurde in der Genbank unter der Zugangsnummer AJ238008 [SEQ ID NO: 1] hinterlegt. Wir nehmen an, dass diese cDNA einen Volllängen-Klon repräsentiert, weil ihre Größe in Übereinstimmung mit derjenigen des im Northern-Blot nachgewiesenen Transkripts steht (siehe 6a). Das längste offene Leseraster wird von einer 134 Nukleotide großen 5' untranslatierten Region und einer 203 Nukleotide großen 3' untranslatierten Region flankiert. Es gibt ein im Raster befindliches Stop-Codon (TGA an Position nt-43), welchem ein im Raster befindliches ATG an der Position nt-139 folgt. Hieraus wird somit gefolgert, dass das ATG an der Position nt-139 das Initiationscodon ist.
Die Primärstruktur von TAG1 sagt ein DGAT-verwandtes Enzym voraus.
Das vorhergesagte offene Leseraster der TAG1-cDNA codiert ein Polypeptid von 520 Aminosäuren mit einem berechneten Molekulargewicht von 58993 Dalton. Mit dem BLAST-Suchprogramm (Altschul et al., 1990), wurde es gefunden, dass die kürzlich berichtete Maus-Diacylglycerinacyltransferase [Zugangs-Nr. AF078752] (Cases et al., 1998) ein Protein ist, welches die höchste Sequenzähnlichkeit zu der abgeleiteten Aminosäuresequenz von TAG1 (5a) zeigte. TAG1 war auch ähnlich zu einem humanen Acyl-CoA:Cholesterin-Acyltransferase-verwandten Enzym [Zugangs-Nr. AF059202]. Das humane Acyl-CoA:Cholesterin-Acyltransferase-verwandte Enzym, ebenfalls bekannt als ARGP1, ist am wahrscheinlichsten eine DGAT ohne signifikante ACAT-Aktivität, obwohl die wahre Natur des Enzyms noch einer weiteren Bestätigung bedarf (Oelkers et al., 1998). Die Ähnlichkeit zwischen TAG1 und der Säuger-DGAT erstreckt sich über eine Region von mehr als 400 Aminosäuren mit einer Sequenzidentität von etwa 41 %. Ein vermutliches Diacylglycerin/Phorbolester-Bindungsmotiv HKW-X-X-RH-X-Y-X-P, eine Signatursequenz, welche beobachtetermaßen einzigartig für DGAT ist, während sie in den ACATs abwesend ist (Oelkers et al., 1998), ist an den Aminosäuren 414-424 lokalisiert ([SEQ ID NO: 7]; 5a). Dieses Diacylglycerin-Bindungsmotiv wird auch in den anschließend veröffentlichten B. napus-DGAT-Sequenzen (Nikyiforuk et al., 1999; GenBank/EMBL-Zugangs-Nr. AF155224, SEQ ID NO: 8; AF164434, SEQ ID NO: 9) gefunden. Unter anderen klonierten Acyltransferasen (z. B. GPATs, LPATs, Dihydroxyacetonphosphat-Acyltransferasen) ist es berichtet worden, dass ein invariantes Prolin in einem hoch hydrophoben Block IV vorkommt, welches an der Acyl-CoA-Bindung teilnehmen kann (Lewin et al., 1999). In der TAG1-Sequenz könnte der hydrophobe Block von den Resten 221-229, der ein invariantes Prolin am Rest 224 enthält, ein derartiges Motiv darstellen.
TAG1 zeigte eine gewisse Sequenzähnlichkeit zu anderen Acyl-CoA:Cholesterin-Acyltransferasen aus einer Anzahl von Spezies (Chang et al., 1997). Allerdings ist die Ähnlichkeit in großem Maße auf den C-Terminus beschränkt und ist niedriger (ungefähr 30 %) als die Ähnlichkeit von TAG1 zu der Säuger-DGAT.
Das TAG1-Protein besitzt mehrere hydrophobe Domänen (5b), und eine Analyse durch das "PC Gene"- Programm, sagte voraus, dass das Protein 5 mögliche Transmembran-Segmente aufweist (Aminosäuren 178-195, 233-253, 363-388, 433-476, 486-507). In der Säuger-DGAT wurde ein mutmaßliches Tyrosinphosphorylierungs-Motiv beobachtet (Cases et al., 1998), aber es konnte keine offensichtliche Tyrosinphosphorylierungsstelle in TAG1 gefunden werden. Allerdings enthüllte eine visuelle Untersuchung eine Konsensus-Sequenz (X-L²⁰⁰-X-K²⁰²-X-X-S²⁰⁵-X-X-X-V²⁰⁹; SEQ ID NO: 10), welche als ein für Mitglieder der SnRK1-Proteinkinasefamilie typisches Targeting-Motiv identifiziert wird, wobei der Serinrest 205 der Rest für die Phosphorylierung ist. Die SnRK1 ("SNF1-verwandte Proteinkinase-1")-Proteine sind eine Klasse von Ser/Thr-Proteinkinasen, welche zunehmend mit der globalen Regulierung des Kohlenstoff-Metabolismus in Pflanzen in Verbindung gebracht worden sind (Halford und Hardie, 1998). Dieses Konsensus-SnRK1-Targeting-Motiv wird auch in den nachfolgend veröffentlichten B. napus-DGAT-Sequenzen (Nikyiforuk et al., 1999; Gen-Bank/EMBL-Zugangs-Nr. RF155224; AF164434) gefunden. Interessanterweise konnten ähnliche SnRK1-Targeting-Motive auch in den lyso-Phosphatidsäure-Acyltransferasen (LPATs) aus Kokosnuss (Knutzon et al., 1995) bzw. Wiesenschaumkraut (Lassner et al., 1995) identifiziert werden.
Das TAG1-Gen wird ubiquitär in Arabidopsis exprimiert
Northern-Blot-Analysen wurden durchgeführt, um das Expressionsprofil des TAG1-Gens zu untersuchen. Gesamt-RNA wurde aus unterschiedlichen Geweben, einschließlich Wurzeln, Blättern, Blüten, sich entwickelnden Schoten, jungen Keimlingen und keimenden Samen, extrahiert. Die höchste Gehaltsakkumulierung im stationären Zustand von TAG1-Transkript lag in RNA vor, welche aus keimenden Samen und jungen Keimlingen isoliert worden war (6a). TAG1-Transkripte wurden auch in Wurzel-, Blatt- und Blütengeweben, wenngleich bei geringerer Gehalten, nachgewiesen. Überraschender weise wird das TAG1-Gen in sich entwickelnden Schoten bei einem Gehalt exprimiert, welcher zu demjenigen von anderen vegetativen Geweben vergleichbar ist, aber niedriger als derjenige von keimenden Samen und jungen Keimlingen ist. Dieses Expressionsprofil ist im Allgemeinen nicht inkonsistent mit der Vorstellung, dass DGAT in allen Pflanzengeweben vorhanden ist, die zur TAG-Biosynthese in der Lage sind (Kwanyuan und Wilson, 1986). Es ist in einer Anzahl von Pflanzenspezies, einschließlich Sojabohne und Saflor, gezeigt worden, dass keimende Samen aktiv TAGs synthetisieren (Ichihara und Noda, 1981; Kwanyuan und Wilson, 1986; Wilson und Kwanyuan, 1986). Der relativ hohe Expressionsgrad in Wurzeln ist ebenfalls mit der Tatsache konsistent, dass Wurzelplastiden in der Lage zum Synthetisieren großer Mengen an Triacylglycerin in der Lage sind (Sparace et al., 1992).
Southern-Blot-Hybridisierung (Southern, 1975) wurde mit genomischer DNA durchgeführt, welche mit mehreren Restriktionsenzymen verdaut wurde, einschließlich BglIII, EcoRI und HindIII. Das TAG1-Gen besitzt keine interne BglII- und HindIII-Stelle, wohingegen eine interne EcoRI-Stelle existiert. Unsere Southern-Analyse legte nahe, dass TAG1 am wahrscheinlichsten ein Einzelkopie-Gen in dem Arabidopsis-Genom repräsentiert (6b).
Eine Insertionsmutation wird im TAG1-Gen in der Mutante AS11 gefunden
Die Alignierung der genomischen Sequenz (Zugangs-Nr. AC003058; SEQ ID NO: 3) mit derjenigen der TAG1-cDNA [SEQ ID NO: 1] enthüllte, dass das TAG1-Gen 16 Exons und 15 Introns enthält, welche eine Region von etwa 3,4 kb überspannen (7a). DNA, welche das TAG1-Allel aus AS11 enthält, wurde PCR-amplifiziert und vollständig sequenziert. Das AS11-TAG1-Allel besitzt eine 147-bp-Insertion, lokalisiert an der zentralen Re gion von Intron 2. Die Insertion ist eine Duplikation eines Segmentes, welches aus 12 bp vom 3'-Ende von Intron 1, der gesamten Sequenz von Exon 2 (81 bp) und 54 bp aus dem 5'-Ende von Intron 2 aufgebaut ist (7a).
Um die Möglichkeit von PCR-Artefakten auszuschließen, wurden zwei Sätze von Primern verwendet, um weitere PCR-Amplifikationen durchzuführen. Die Primer A und B (siehe Experimentelle Vorgehensweisen, Primer Strategy), lokalisiert in den Exons 1 bzw. 3, amplifizierten aus AS11 ein DNA-Fragment, welches etwa 150 bp länger ist (7b, Spur 2) als jenes aus dem Wildtyp (7b, Spur 1). Das zweite Paar von Primern, C und B (Experimentelle Vorgehensweisen), wobei einer sowohl in Exon 2 als auch in dem Insertionssegment zu finden ist, und der andere in Exon 3 lokalisiert ist, erzeugte zwei amplifizierte Fragmente aus AS11 (7b, Spur 4), hingegen nur eines aus dem Wildtyp (7b, Spur 3). Somit bestätigten diese Ergebnisse, dass die Insertionsmutation, welche die Erfinder durch Sequenzierurg identifizierten, die wahre Natur der Mutation im TAG1-Gen im AS11-Genom reflektierte.
Das AS11-TAG1-Transkript weist eine 81 bp große Insertion in seinem offenen Leseraster auf
Northern-Blot-Analysen zeigten, dass kein Unterschied in den Expressionsprofilen des TAG1-Gens zwischen der AS11-Mutante und Wildtyp-A. thaliana bestand. Um den Effekt der Mutation auf dem Transkript-Niveau zu untersuchen, wurde eine Reverse-Transkriptions-PCR (RT-PCR) durchgeführt, um das TAG1-Transkript aus RNA, welche aus keimenden Keimlingen von mutantem AS11 extrahiert wurde, zu amplifizieren. Eine Sequenzierungsanalyse enthüllte, dass es eine 81 bp große Insertion, welche vollständig aus Exon 2 aufgebaut ist, in dem Transkript von AS11 gibt. Das Exon 2 in der Wiederho lungseinheit wird korrekt gespleisst. Die Änderung des Transkripts stört somit nicht das Leseraster. Allerdings wird diese zusätzliche Exon-2-Sequenz in dem AS11-Transkript zu einem veränderten DGRT-Protein mit der 27-Aminosäuren-Insertion ¹³¹SHAGLFNLCVVVLIAVNSRLIIENLMK¹⁵⁷ [SEQ ID NO: 11] führen. Die Daten der Erfinder zeigen, dass diese Insertion zu einer 40- bis 70%igen Reduktion der DGAT-Aktivität während der gesamten Samenentwicklung führt (Katavic et al., 1995). Das 81 bp große Insert, verantwortlich für reduzierte DGAT-Aktivität in AS11, ist im Vergleich von RT-PCR-Produkten sichtbar (7b: vergleiche Spur 5 (WT) und Spur 6 (AS11)). Die in der AS11-Mutante beobachtete DNA-Abweichung war unerwartet, weil Ethylmethansulfonat (EMS) im Allgemeinen Punktmutationen verursacht. Obwohl wir die Möglichkeit nicht ausschließen können, dass diese AS11-Mutante das Ergebnis eines spontanen Mutationsereignisses war, sind EMS-induzierte Deletionen und Insertionen in anderen Systemen berichtet worden (Mogami et al., 1986, Okagaki et al., 1991).
Die TAG1-Geninsertion in der Arabidopsis-Mutante AS11 beeinflusst die Samen-Triacylglycerin-Akkumulation, aber nicht die Sterinester-Akkumulation in Samen.
Weil TAG1 auch eine gewisse Sequenzhomologie zu Acyl-CoA:Cholesterin-Acyltransferasen (ACATs) aus einer Anzahl von Spezies aufzeigt (Chang et al., 1997), verglichen die Erfinder sowohl Triacylglycerin- als auch Sterinester-Akkumulation in Samen des Wiltyp-A. thaliana und der AS11-Mutante. Während der Triacylglycerin-Gehalt und TAG/DAG-Verhältnisse in AS11 reduziert waren (d. h. erhöhter Anteil an Samenöl-DAGs), waren, im Gegensatz dazu, die Proportionen von Sterinestern in WT- und AS11-Samen ähnlich, bei 0,8 bzw. 1 des Gesamtlipidextraktes (Tabelle 1). Wenn die TAG1-Läsion ACAT-ähnliche Aktivität beeinflusst, könnte man eine Reduktion hinsichtlich Samen-Sterinestern erwar ten, aber diese wurde nicht beobachtet. Diese Ergebnisse wiesen darauf hin, dass TAG1 nicht in der Sterinester-Homeogenese beteiligt ist, und somit nicht eine AcylCoA:Sterin-Acyltransferase ist.
TAG1-Expression in Hefe.
Die in Hefe überexprimierte TAG1-cDNA führte zu einer 3,5- bis 4-fachen Erhöhung in der mikrosomalen DGAT-Aktivität, im Vergleich zu Kontrolltransformanten (8) nur mit Plasmid (pYES2), was bestätigt, dass das TAG1-Genprodukt als eine DGAT funktioniert. Wenn ¹⁴C-18:1-CoA den Hefelysaten zugesetzt wurde, wurden auch Sterinester in vitro markiert (Daten nicht gezeigt), aber es gab keinen signifikanten Unterschied in den ¹⁹C-markierten Sterinestern, welche von Lysaten aus der pYES2GAL-induzierten Kontrolle und der pY-ES2:TAG1Gal-induzierten Transformante hergestellt wurden. Dies bestätigt, dass das TAG1-Produkt nicht eine Acyl-CoA:Sterin-Acyltransferase (wie ACAT) codiert.
Komplementation der A. thaliana-AS11-Mutanten-Linie durch Transformation mit der DGAT-cDNA.
Die klonierte Volllängen-DGAT-cDNA wurde als eine Matrize zur PCR-Amplifikation mit den Primern DGATXbaI (CTAGTCTAGAATGGCGATTTTGGA; SEQ ID NO: 12) und DGATXhoI (GCGCTCGAGTTTCATGACATCGA; SEQ ID NO: 13) verwendet, um neue Restriktionsstellen auf jedem Ende der Sequenz bereitzustellen, wie beschrieben in den 'Experimentellen Vorgehensweisen'. Ein 1,6 kb großes Fragment wurde durch einen XbaI/KpnI-Verdau herausgeschnitten und in die entsprechenden Stellen des pSE129-Vektors (bereitgestellt von Dr. P. Covello, PBI/NRC) ligiert. pSE129A ist ein Vektor, der aus dem Pflanzentransformationsvektor pRD400 (Datla et al., 1992) abgeleitet ist. Der Vektor pSE129R enthält den samenspezifischen Napin-Promotor und den nos-Terminator, kloniert in die EcoRI- und HindIII-Stellen des Plasmids pRD400 (9). In dem DGAT-pSE129A-Konstrukt steht die Arabidopsis-DGAT-cDNA somit unter der Regulation des Napin-Promotors. Die Integrität des Konstrukts wurde durch Sequenzierung bestätigt.
Der pSE129A, der die Napin:DGATcDNA enthält, wurde in A.tumefaciens eingeführt, das zum. Transformieren der A. thaliana-Mutante AS11 verwendet wurde, und die Nachkommenschaft wurde analysiert, wie es in 'Experimentelle Vorgehensweisen' beschrieben wird. Eine Anzahl von transgenen T₂-Linien wurde isoliert, welche den Fettsäure-Mutanten-Phänotyp komplementierten, der in AS11 gefunden wird (reduzierte 20:1 und erhöhte mehrfach ungesättigte C₁₈S), wodurch das Wildtyp-Samen-Fettsäureprofil wiederhergestellt wurde (10). Dieser Befund bestätigt die Natur der Läsion in AS11 und verbindet den AS11-Lipidphänotyp direkt mit dieser Mutation.
Überexpression der DGAT-cDNA in Wildtyp-A. thaliana
Die klonierte Volllängen-DGAT-cDNA wurde als eine Matrize zur PCR-Amplifikation mit den Primern DGATXbaI (CTAGTCTAGAATGGCGATTTTGGA; SEQ ID NO: 12) und DGATXhoI (GCGCTCGAGTTTCATGACATCGA; SEQ ID NO: 13) verwendet, um neue Restriktionsstellen auf jedem Ende der Sequenz bereitzustellen, wie beschrieben in Experimentelle Vorgehensweisen. Ein 1,6 kb großes Fragment wurde durch einen XbaI/KpnI-Verdau herausgeschnitten und in die entsprechenden Stellen des pSE129-Vektors (bereitgestellt von Dr. P. Covello, PBI/NRC) ligiert. pSE129A ist ein Vektor, der aus dem Pflanzentransformationsvektor pRD400 (Datla et al., 1992) ableitet wurde. Der Vektor pSE129A enthält den samenspezifischen Napin-Promotor und den nos-Terminator, kloniert in die EcoRI- und HindIII-Stellen des Plasmids pRD400 (9). In dem DGAT-pSE129A-Konstrukt steht die Arabidopsis-DGAT-cDNA somit unter der Regulation des Napin-Promotors. Die Integrität des Konstrukts wurde durch Sequenzierung bestätigt.
Der pSE129A, der die Napin:DGATcDNA enthält, wurde in A. tumefaciens eingeführt, das zum Transformieren von Wildtyp-A.thaliana verwendet wurde, und die Nachkommenschaft wurde analysiert, wie beschrieben in Experimentelle Vorgehensweisen. Eine Anzahl von transgenen T₂-Linien wurde isoliert, welche einen erhöhten Ölgehalt (11), ein erhöhtes durchschnittliches 100-Samen-Gewicht (12) und eine starke lineare Korrelation zwischen den zwei Merkmalen (13) aufzeigten.
In Bezug auf die Fettacylzusammensetzung zeigten Wildtyplinien, welche überexprimierte DGAT-cDNA enthielten, eine Verringerung bei den Total-Gesättigten und Erhöhungen in den Einfach-Ungesättigten und im 18:1/[18:2 + 18:3]-Index, wie gezeigt in der nachstehenden Tabelle 2. Derartige Änderungen liegen alle in der Richtung auf ein "gesünderes" Ölprofil hin und können direkt auf Canola, andere Ölsamen in den Brassicaceae und andere essbare Öl-Kulturpflanzen angewandt werden, um ähnliche Verbesserungen hinsichtlich der Ölzusammensetzung hervorzurufen. Tabelle 2 Fettsäurezusammensetzung von Samenöl aus nicht-transformierten A. thaliana-Wildtyp-Kontrollen (WT Con) und drei T2-transgenen Linien (2', 9 und 11) vom Wildtyp, transformiert mit der DGAT-cDNA unter der Regulation eines Napin-Promotors (Napin: DGAT).
EXPERIMENTELLE VORGEHENSWEISEN
Pflanzenmaterial
Arabidopsis thaliana-Ökotyp Columbia und Mutante AS11 wurden unter Bedingungen gezogen, welche früher beschrieben wurden (Katavic et al., 1995). Die A. thaliana-Mutantenlinie AS11 wurde erzeugt und charakterisiert relativ zum Wildtyp (WT)-A.thaliana-Ökotyp Columbia, wie beschrieben von Katavic et al. (1995); (ATCC Nr.: PTA-1013).
DNA-Manipulation
Standardmethoden und -Vorgehensweisen wurden für DNA-Herstellung, Plasmid-Vermehrung und -Isolierung angewandt (Sambrook et al., 1989). Die Sequenzierung wurde auf einem Applied Biosystems Modell 373A-DNA-Sequenzierungs-System durchgeführt, wobei das Taq Dye-Deoxy^TM-Terminator-Zyklus-Sequenzierungs-Kit (Applied Biosystems, Inc.) verwendet wurde. Die Nukleotid- und die abgeleiteten Aminosäuresequenzen wurden mit in Datenbanken verfügbaren Sequenzen verglichen, wobei das BLAST-Programm (Altschul et al., 1990) eingesetzt wurde.
Southern- und Northern-Analyse
Gesamt-RNA wurde aus unterschiedlichen Geweben bei verschiedenen Entwicklungsstadien unter Anwendung des Verfahrens von Lindstrom und Vodkin (1991) extrahiert. RNA-Proben wurden mit Formaldehyd denaturiert und auf 1,2%igen Formaldehyd-Agarose-Gelen denaturiert. Etwa 5 μg Gesamt-RNA wurden aufgetragen, und die Menge an RNA pro Spur wurde kalibriert durch die Ethidiumbromid-Färbungs-Intensität der rRNA-Banden. Genomische DNA wurde isoliert, mit Restriktionsenzymen verdaut, und eine Southern-Blot-Analyse wurde gemäß Sambrook et al. (1989) durchgeführt. Die TAG1-DNA-Sonde wurde ³²Pmarkiert durch statistisches Priming gemäß Protokollen des Herstellers (BRL).
PCR-Strategie
Primer, welche für die Amplifikation des TAG1-Gens verwendet wurden, waren wie folgend: DGAT1 (AGACACGAATCCCATTCCCACCGA; SEQ ID NO: 14), DGAT2 (AGTGGTGACAACGCAGGGATGATG; SEQ ID NO: 15), DGAT3 (ATGGTCGCTCCCACATTGTGT; SEQ ID NO: 16), DGAT4 (CATACAATCCCCATGACATTTATCA; SEQ ID NO: 17). DGAT1 und DGAT2 amplifizieren die 5'-Hälfte des TAG1-Gens, und DGAT3 und DGAT4 amplifizieren das 3'-Ende des TAG1-Gens. Genomische DNA aus AS11 wurde als Matrize für die PCR-Amplifizierung des Mutanten-TAG1-Allels verwendet, wobei folgendes thermisches Profil eingesetzt wurde: 94°C 3 min.; 40 Zyklen von 94°C 30 Sekunden, 62°C 45 Sekunden, 72°C 1 min.; und 72°C 15 min. Um die Mutation weiter zu bestätigen, wurden Primer A (CGACCGTCGGTTCCAGCTCATCGG: [SEQ ID NO: 18] und B (GCGGCCAATCTCGCAGCGATCTTG; [SEQ ID NO: 19]) sowie Primer C (TAAACAGTAGACTCATCATCG; [SEQ ID NO: 20]) und B jeweilig in Paaren verwendet, um das interne Fragment, welches die Mutation enthielt, zu amplifizieren. Die Primer DGAT1 und DGAT4 wurden zur PCR-Amplifikation der cDNA mit einer A. thaliana-Schoten-cDNA-Bibliothek als Matrize verwendet. Die Primer A und B wurden auch in RT-PCR-5-Amplifikation des cDNA-Fragmentes verwendet, welches das Insertionssegment umfasst.
Konstruktion von TAG1-Mehrfachkopien-Vektor und Transformation und Charakterisierung von DGAT-Expression in Hefe
Die TAG1-cDNA wurde in pBluescript SK kloniert, wie beschrieben (Hadjeb und Berkowitz, 1996). Die cDNA wurde aus dem Vektor mit KpnI/XbaI herausgeschnitten und anschließend in die jeweiligen Stellen des Hefeexpressionsvektors pYes2 (Invitrogen) kloniert. Das Konstrukt wurde durch Sequenzierung bestätigt. Konstrukte mit TAG1-Transkription unter der Regulation des GAL1-Promotors setzten ein Fragment von ungefähr 1,9 kb frei. Weil das TAG1-Fragment sein eigenes initiierendes ATG-Codon besitzt, ist das exprimierte Produkt kein Fusionsprotein. Als ein Wirt für die Hefeexpression wurde ein SLC-Deletionsstamm (YMN5 [sic1Δ2::LEU2 ura3]) (freundlicherweise bereitgestellt von M.M. Nagiec und R.C. Dickson, University of Kentucky, Lexington, KY; Nagiec et al., 1993) verwendet; wir gingen davon aus, dass in dieser Mutante der endogene DAG-Pool niedriger sein kann als in WT-Hefe, und dies würde uns gestatten, die Aktivität aus überexprimiertem TAG1 in Gegenwart von exogen zugeführten ¹⁴C-DAG während In-vitro-DGRT-Assays von Transformanten-Lysaten zu maximieren. Hefe-Transformation wurde durchgeführt gemäß Elble (1992). YMN5-Transformanten, welche nur Vektor (pYES2) enthielten, wurden als Kontrollen verwendet. Einzelkolonien wurden über Nacht in 20 ml SD-Medium (Synthetisches Dextrose-Medium mit Glukose und ohne Uracil, wie beschrieben von Ausubel et al., 1995, Band 2, S. 13.1.3) auf einem Rotationsschüttler (270 U/min.) bei 28°C kultiviert. Die Zellen wurden aus der Übernachtkultur pelletiert und in 50 ml Medium zur Induktion von Expression (SD-Medium mit Galactose und ohne Uracil) resuspendiert. Die Zellen wurden erneut bei 28°C unter Schütteln bei 270 U/min. inkubiert und nach 4-6 h geerntet. GAL-induzierte Hefetransformanten wurden durch Zentrifugation bei 5000 U/min. während 5 Minuten geerntet und in 100 mM Hepes-NaOH, pH 7,4, enthaltend 1 mM EDTA und 1 mM DTT, resuspendiert. Zell-Lysate wurden unter Verwendung von mit Säure gewaschenen Glasperlen hergestellt, wie beschrieben von Ausubel et al. (1995). Das Protein in Hefelysaten wurde gemessen unter Anwendung des Assays von Bradford (1976), die Proteingehalte in jedem Lysat wurden normiert, und Aliquote (250 μg Protein) wurden hinsichtlich der DGAT-Aktivität, wie nachstehend beschrieben, analysiert.
Lipid-Substrate und DGAT-Analysen
¹⁴C-markiertes Diolein [1-¹⁴C-Olein] (sp. Aktivität 55 mCi/mMol) wurde von American Radiolabeled Chemicals (St. Louis, MO) erworben. Das ¹⁴C-markierte sn-1,2-Diolein-Isomer wurde durch TLC auf Borat-imprägnierten Platten gereinigt und in Hepes-Puffer in Gegenwart von 0,2 % Tween-20 emulgiert, wie beschrieben von Taylor et al. (1991). 20:1-CoA, CoASH, ATP und alle anderen Biochemikalien wurden von Sigma bezogen.
DGAT-Assays wurden bei pH 7,4 unter Schütteln bei 100 U/min. in einem Wasserbad bei 30°C während 30-60 Minuten durchgeführt. Assaymischungen (0,5 ml Endvolumen) enthielten Lysatprotein (250 μg), 90 mM Hepes-NaOH, 0,5 mM ATP, 0,5 mM CoASH, 1 mM MgCl₂, 200 μM sn-1,2-Diolein (sp. Aktivität 2 nC/nMol) in 0,02 % Tween 20, und 18 μM 20:1-CoA als den Acyldonor. Die ¹⁴C-markierten TAGs wurden durch TLC isoliert und quantifiziert, wie beschrieben von Taylor et al. (1991).
Weitere Lipid- und Sterinester-Analysen in AS11 und WT:
Gesamtlipidextrakte (TLEs) und Lipidklassen-Analysen in WT und der AS11-Mutante wurden durchgeführt, wie beschrieben von Taylor et al. (1991; 1992) und von Katavic et al. (1995). Der relative Samenöl-Gehalt wurde auch durch "magische Winkel"-Proben"Spinning"-¹H-NMR gemäß des Verfahrens von Rutar (1989) gemessen. Analysen wurden mit 200-Samen-Proben von intakten Wildtyp- und AS11-Samen unter Verwendung eines Bruker AM Weit-Bohrungs-Spektrometers (Bruker Analytische Messtechnik GmbH, Silberstreifen D-76287, Rheinstetten 4/Karlsruhe, Deutschland), welches bei 360 MHz betrieben wurde, durchgeführt. Um anisotrope Linienverbreiterung zu reduzieren, wurde die Samenprobe bei 1 kHz in einem Zirconiumrotor rotiert, welcher bei 54,7° zu dem Magnetfeld orientiert war. Die Integrationsantwort für Resonanzen, welche dem flüssigkeitsähnlichen Öl zuzuschreiben waren, wurden summiert, und der Wert für AS11-Samen wurde relativ zu der Antwort für die WT-Kontrollsamen-Probe aufgezeichnet, wobei letztere auf einen Wert von 1,00 gesetzt wurde.
Sterinester wurden aus den TLEs durch Dünnschichtchromatographie (TLC) auf Silica H-Platten gereinigt, welche in Hexan:Diethylether:Ameisensäure (80:20:2, v/v/v) entwickelt wurden. Nach Elution aus dem Silica H mit Chloroform:Methanol (2:1, v/v), wurden die Sterinester quantifiziert durch Verseifung, gefolgt von Methylierung der resultierenden Fettsäuren mit 3N methanolischer HCl. Die Fettsäuremethylester (FAMEs) wurden durch GC analysiert, wie früher beschrieben (Taylor et al., 1991). Die durch Verseifung freigesetzten freien Sterine wurden auch durch GC auf einer 30 m großen DB-5-Säule analysiert; GC-Temperaturprogramm: Anfangstemperatur: 180°C, Erhöhung bei 10°C/min. auf 300 °C, und Halten bei dieser Temperatur während 15 Minuten. Der Sterinester-Gehalt wurde als ein Prozentsatz der TLE aufgeführt; d. h. FAMEs, welche aus Sterinestern freigesetzt wurden, berechnet als Anteil der FAMEs, welche durch Transmethylierung des Gesamtlipidextraktes (TLE, total lipid extract) freigesetzt wurden.
Konstruktion eines Pflanzentransformationsvektors, enthaltend das Wildtyp-DGAT-Gen, für Überexpression in WT-A. thaliana, und Komplementation der A. thaliana-AS11-Mutante:
Zwei Primer
Gen 1 (GAGAGGATCCACGCTCACGACCCATTCTTCCCG; [SEQ ID NO: 21]) und
Gen 2 (AAGAAGGATCCATCCCCAAPACGGGACCACCAA; [SEQ ID NO: 22]) wurden in Übereinstimmung mit Sequenzen stromaufwärts und stromabwärts des TAG1-Gens synthetisiert. Diese Primer wurden verwendet, um ein genomisches Fragment von 5,1 kb aus Wildtyp-A. thaliana mittels PCR zu amplifizieren. Das PCR-Fragment wurde gereinigt und mit BamHI verdaut und in die entsprechende Stelle im Plasmid pRD400 (Datla et al., 1992) inseriert, um den Pflanzentransformationsvektor DGATg-pRD400 zu erzeugen.
Konstruktion eines DGAT-cDNA-Pflanzentransformationsvektors zur samenspezifischen Expression:
Die klonierte Volllängen-DGAT-cDNA wurde als eine Matrize zur PCR-Amplifizierung mit den Primern DGATXbaI (CTAGTCTAGAATGGCGATTTTGGA; SEQ ID NO: 12) und DGATXhoI (GCGCTCGAGTTTCATGACATCGA; SEQ ID NO: 13) verwendet, um neue Restriktionsstellen auf jedem Ende der Sequenz bereitzustellen. Das PCR-Profil war wie folgend: 94°C 1 Minute; 30 Zyklen von 94°C 30 Sekunden, 55°C 30 Sekunden, 72°C 1 Minute; und 72°C 5 Minuten. Das PCR-Produkt wurde dann in den PCR-2.1-Vektor (Invitrogen) ligiert. Ein 1,6 kb großes Fragment wurde durch XbaI/KpnI-Verdau herausgeschnitten und in die entsprechenden Stellen des pSE129-Vektors (bereitgestellt von Dr. P. Covello, PBI/NRC) ligiert. pSE129A ist ein Vektor, abgeleitet aus dem Pflanzentransformationsvektor pRD400 (Datla et al., 1992). Der Vektor pSE129A enthält den samenspezifischen Napin-Promotor und den nos-Terminator, kloniert in die EcoRI- und HindIII-Stellen des pRD400-Plasmids (siehe 9). In dem DGAT-pSE129A-Konstrukt steht die Arabidopsis-DGAT-cDNA somit unter der Regulation bzw. Kontrolle des Napin-Promotors. Die Integrität des Konstruktes wurde durch Sequenzierung bestätigt.
Transformation von Agrobacterium mit Pflanzen-DGAT-Vektorkonstrukten:
Elektrokompetente Agrobacterium-Zellen, Stamm GV3101 (pMP90), wurden wie folgend hergestellt: Eine Agrobacterium-Kultur wurde 24 bis 48 h in 2YT gezüch tet, und als die Absorption bei 600 nm 0,5 bis 0,7 erreichte, wurden die Zellen auf Eis abgekühlt und durch Zentrifugation (5000 × g, 10 Minuten in einem GSA-Rotor bei 4°C) pelletiert. Das Pellet wurde in 1, 0,5 und 0,02 Volumina kaltem 10%igem sterilem Glycerin gewaschen und in 0,01 Volumen kaltem 10%igem Glycerin resuspendiert. Die elektrokompetenten Zellen wurden dann in flüssigen N₂ gefroren und bei –70 °C aufbewahrt. Die Agrobacterium-Zellen wurden durch Elektroporation mit 20-50 ng transformierender DNA (entweder DGATg-pRD400 oder DGAT-pSE129A) gemäß den Anweisungen des Herstellers transformiert, auf einem Selektivmedium (LB mit 50 μg/ml Kanamycin) ausplattiert und über Nacht bei 28°C inkubiert. Einzelne transformierte Zellen wurden über Nacht (28°C, 225 U/min) in 5 ml LB mit 50 μg/ml Kanamycin und 25 μg/ml Gentamycin wachsen gelassen. DNA-Extraktion und -Reinigung wurden mit einem Qiaprep-Zentrifugations-Miniprep-Kit (Qiagen) durchgeführt. Die Echtheit bzw. Originaltreue des Konstruktes wurde vor der Pflanzentransformation nochmals durch DNA-Sequenzierung überprüft.
Transformation von Arabidopsis thaliana:
Das Transformationsprotokoll wurde von demjenigen aus angepasst, das von Clough und Bent (1998) beschrieben wird. Samen von Arabidopsis thaliana, Ökotyp Columbia, und Mutante AS11 (Katavic et al., 1995) wurden bei 22°C unter Fluoreszenz-Beleuchtung (120 μE.m^–2·s^–1) in einer Betriebsweise von 16 h Licht/8 Stunden Dunkelheit gezüchtet. Typischerweise wurden vier bis sechs Pflanzen in einem 10 cm² großen Blumentopf in befeuchteter Terra-lite Redi-Erde (W.R. Grace & Co. Canada Ltd. Ajax, ON, Canada) gezüchtet. Um zu verhindern, dass das Erdbodengemisch im Blumentopf in das Inokulationsmedium fällt, wurde die Erde zu einem Erdhügel als eine Plattform geformt, wobei die Samen auf der Oberseite ausgesät wurden, und der gesamte Blumentopf wurde mit einem Nylon-Fenstergitter bedeckt und mittels eines Gummibandes gesichert. Pflanzen wurden in einer Agrobacterium-Suspension vakuum-infiltriert, als die Öffnung der ersten Blüten begann.
Um Agrobacterium zu züchten, wurde eine 5-ml-Suspension in LB-Medium, enthaltend 50 μg/ml Kanamycin und 25 μg/ml Gentamycin, über Nacht bei 28°C kultiviert. Am Tag vor der Infiltration wurde diese "Animpf-Kultur" in vier Kolben aufgeteilt, welche 250 ml LB-Medium enthielten, das mit 50 μg/ml Kanamycin und 25 μg/ml Gentamycin ergänzt worden war. Diese Kulturen wurden über Nacht bei 28°C wachsen gelassen. Am nächsten Morgen, nachdem die Extinktion bei 600 nm überprüft worden war (ungefähr = 1,0), wurden die Zellen mittels Zentrifugation (5000 × g, 10 Minuten in einem GSA-Rotor bei Raumtemperatur) geerntet und in dem Infiltrationsmedium (Saccharose 5 %; Silwet-77 0,005 % in Wasser) resuspendiert, um eine optische Dichte bei 600 nm von 0,8 zu erhalten. Die Agrobacterium-Suspension wurde dann in ein Becherglas gegossen, und die eingetopften Pflanzen wurden in das Becherglas umgekehrt, sodass die Blüten und Stiele untergetaucht wurden. Das Becherglas wurde dann in ein großes Bell-Gefäß gebracht, und ein Vakuum wurde unter Verwendung einer Vakuumpumpe angelegt, bis sich Bläschen auf den Stängeloberflächen bildeten, und die Lösung damit anfing, in geringfügiger Weise Blasen zu werfen, und dann wurde das Vakuum rasch aufgehoben. [Man bemerke: Die notwendige Zeit und der Druck werden von einem Laboransatz zum nächsten schwanken, aber eine gute Infiltration ist als gleichmäßig gedunkeltes, wassergetränktes Gewebe visuell offenkundig.] Die Töpfe wurden aus dem Becherglas entnommen, in einer Kunststoffschale auf ihre Seite gelegt und mit einer Kunststoffhaube abgedeckt, um die Feuchtigkeit beizubehalten. Am folgenden Tag wurden die Pflanzen freigelegt, aufrecht gestellt und ungefähr vier Wochen lang in einer Wachstumskammer unter kontinuierlichen Lichtbedingungen wachsen gelassen, wie beschrieben von Katavic et al. (1995). Als die Schoten reif und trocken waren, wurden Samen geerntet und hinsichtlich positiver Transformanten selektiert.
Selektion von mutmaßlichen Transformanten (transgenen Pflanzen) und Analyse von transgenen Pflanzen:
Für jedes Konstrukt wurden Samen in großer Menge geerntet. Die Samen wurden durch Eintauchen derselben in einer Lösung, welche 20% Bleichmittel und 0,01% Triton X-100 enthielt, während 20 Minuten oberflächensterilisiert, gefolgt von drei Spülungen mit sterilem Wasser. Sterilisierte Samen wurden dann ausplattiert, indem sie in sterilem 0,1 % Phytagar bei Raumtemperatur resuspendiert wurden (etwa 1 ml Phytagar für jeweils 500-1000 Samen), und dann ein Volumen, welches 2000-4000 Samen enthielt, auf eine 150 × 15 mm große Kanamycin-Selektionsplatte aufgetragen wurde. Die Platten wurden 2 Tage lang in der Kälte ohne Licht inkubiert und danach 7-10 Tage lang in einer regulierten Umgebung (22 °C unter Fluoreszenzbeleuchtung (120 μE·m^–2·s^–1) in einem Betriebsschema von 16 h Licht/8 Stunden Dunkelheit) wachsen gelassen. Die Selektionsmedien enthalten ½ MSG Medium, 0,8 % Phytagar, 3 % Saccharose, 50 μg/ml Kanamycin und 50 μg/ml Timentin. Petrischalen und Deckel wurden mit einem Micropore^TM-Chirurgie-Band (3M Canada, London, ON, Canada) versiegelt. Nach 7-10 Tagen wurden arzneimittelresistente Pflanzen, welche grüne Blätter und gut ausgebildete Wurzeln innerhalb des Mediums aufwiesen, als Transformanten identifiziert, und beim 3-5-Blatt-Stadium wurden selektierte Transformanten in flache Schalen umgepflanzt, welche mit stark befeuchtetem Erdbodengemisch gefüllt waren. Transformanten wurden bis zur Reife herangezogen, und reife Samen (T₂-Generation, wie definiert in Katavic et al. (1994)) wurden aus individuellen Pflanzen geerntet und weiter analysiert.
DNA-Isolierung aus und Analyse von Transformanten
Genomische DNA wurde aus individuellen T₁-Pflanzen unter Befolgung des Protokolls von Dellaporta et al. (1983) isoliert. Eine PCR-Amplifikation unter Verwendung der vorangehend beschriebenen gepaarten Primer für die DGAT-cDNA oder das DGAT-Gen wurde ausgeführt, um das Vorhandensein der cDNA bzw. des Gens in den T₁-Transformanten zu bestätigen. Southern-Analysen (Southern, 1975) wurden ausgeführt, um die Transformanten zu selektieren, welche eine einzelne Kopie des inserierten Fragmentes enthielten. DNA-Proben wurden mit Restriktionsenzymen verdaut (BglII für die DGAT-cDNA, und EcoRI für das DGAT-Gen), durch Elektrophorese auf einem 1%igen Agarosegel aufgetrennt, und Southern-Blotting wurde unter Verwendung eines Nylon-Filters (Hybond-N+, Amersham) gemäß Sambrook et al. (1989) durchgeführt. Das DGAT-cDNA-Fragment, welches mit α-[³²P]-dCTP (NEN/DuPont) unter Verwendung des "Random Primer"-DNA-Markierungs-Kits (Gibco BRL) markiert worden war, wurde als eine Sonde verwendet. Die Hybridisierung wurde bei 60°C gemäß Church und Gilbert (1984) durchgeführt. Der Filter wurde dann an Kodak X-OMAT-AR-Film exponiert.
HINTERLEGUNGSINFORMATION
Das folgende biologische Material ist bei der American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia, 20110-2209, USA, hinterlegt worden. Alle diese Hinterlegungen wurden zugunsten des Anmelders/Rechtsnachfolgers (National Research Council of Canada) gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrages an den angegebenen Daten vorgenommen, und ihnen wurden die nachstehend gezeigten Zugangsnummern erteilt.
Die Hinterlegungs-Empfangsbestätigungen sind später in dieser Beschreibung gezeigt.
SEQUENZAUFLISTUNG, FREIER TEXT
Die nachstehend angegebene Sequenzauflistung enthält freie Texteinträge in Bezug auf SEQ ID NO: 12 bis 22. Der in der Sequenzauflistung verwendete freie Text wird wie folgend wiederholt:
SEQ ID NO: 12 Primer von DGATXbaI
SEQ ID NO: 13 Primer von DGATXhoI
SEQ ID NO: 14 Primer DGAT1
SEQ ID NO: 15 Primer DGAT2
SEQ ID NO: 16 Primer DGAT3
SEQ ID NO: 17 Primer DGAT 4
SEQ ID NO: 18 Primer A
SEQ ID NO: 19 Primer B
SEQ ID NO: 20 Primer C
SEQ ID NO: 21 Primer Gen 1
SEQ ID NO: 22 Primer Gen 2.
Eine Zusammenfassung von allen aufgelisteten Sequenzen ist nachstehend zur Leichtigkeit der Übersicht bereitgestellt:

SEQ ID NO: 1 – (pDGAT; Vektor, enthaltend isolierte und gereinigte Desoxyribonukleinsäure cDNA; ATCC Nr. PTA-989), Genbank/EMBL-Zugangs-Nr. AJ238008.
SEQ ID NO: 2 – Die abgeleitete Aminosäuresequenz des Arabidopsis-DGAT (AtTAG1)-Proteins.
SEQ ID NO: 3 – (p-genomisches DGAT; Vektor, enthaltend isolierte und gereinigte genomische Desoxyribonukleinsäure (genomische DNA) ATCC Nr. PTA-988).
SEQ ID NO: 4 – MDGAT, Maus-DGAT [GenBank/EMBL-Zugangs- Nr. AF078752 (Cases et al., 1998)].
SEQ ID NO: 5 – HARGP1, humanes ARGP1-Protein [Gen-Bank/EMBL-Zugangs-Nr. AF059202; Oelkers et al., 1998].
SEQ ID NO: 6 – Exprimierter Sequenz-Tag (EST) aus Arabidopsis thaliana [Zugangs-Nr. AA042298].
SEQ ID NO: 7 – Ein Diacylglycerin/Phorbolester-Bindungsmotiv, gefunden in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8 und SEQ ID NO: 9 (⁴¹⁴HKWMVRHIYFP⁴²⁴).
SEQ ID NO: 8 – B. napus-DGAT-Aminosäuresequenz Gen-Bank/EMBL-Zugangs-Nr. AF155224.
SEQ ID NO: 9 – B. napus-DGAT-Aminosäuresequenz Gen-Bank/EMBL-Zugangs-Nr. AF164434.
SEQ ID NO: 10 – Targeting-Motiv, typisch für Mitglieder der SnRK1-Protein-Kinase-Familie, gefunden in SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 8 und SEQ ID NO : 9 X-L¹⁰⁰-X-K²⁰²-X-X-S²⁰⁵-X-X-X-V²⁰⁹
SEQ ID NO: 11 – Eine 27-Aminosäuren-Insertions-Wiederholungseinheit in SEQ ID NO: 2, welche sich in der Arabidopsis thaliana-AS11-Mutante findet.
¹³¹SHAGLFNLCVVVLIAVNSRLIIENLMK¹⁵⁷
SEQ ID NO: 12 – CTAGTCTAGAATGGCGATTTTGGA (Nukleotidsequenz von Primer DGATXbaI).
SEQ ID NO: 13 – GCGCTCGAGTTTCATGACATCGA (Nukleotidsequenz von Primer DGATXhoI).
SEQ ID NO: 14 – AGACACGAATCCCATTCCCACCGA (Nukleotidsequenz von Primer DGAT1).
SEQ ID NO: 15 – AGTGGTGACAACGCAGGGATGATG (Nukleotidsequenz von Primer DGAT2).
SEQ ID NO: 16 – ATGGTCGCTCCCACATTGTGT (Nukleotidsequenz von Primer DGAT3).
SEQ ID NO: 17 – CATACAATCCCCATGACATTTATCA (Nukleotidsequenz von Primer DGAT4).
SEQ ID NO: 18 – CGACCGTCGGTTCCAGCTCATCGG (Nukleotidsequenz von Primer A).
SEQ ID: NO: 19 – GCGGCCAATCTCGCAGCGATCTTG (Nukleotidsequenz von Primer B).
SEQ ID NO: 20 – TAAACAGTAGACTCATCATCG (Nukleotidsequenz von Primer C).
SEQ ID NO: 21 – GAGAGGATCCACGCTCACGACCCATTCTTCCCG (Nukleotidsequenz von Primer Gen1).
SEQ ID NO: 22 – AAGAAGGATCCATCCCCAAAACGGGACCACCAA (Nukleotidsequenz von Primer Gen2).
SEQ ID NO: 23 – AS11-Mutanten-DGAT – cDNA-Nukleotidsequenz.
SEQ ID NO: 24 – AS11-Mutanten-DGAT – genomische DNA-Nukleotidsequenz.
SEQ ID NO: 25 – Die abgeleitete Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 23.

FÜR DIE ERFINDUNG RELEVANTE DRUCKSCHRIFTEN

Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. and Lipman, D.J (1990) Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215, 403-410.
Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A., and Stuhl, K., eds (1995). Current Protocols in Molecular Biology, Vols 1, 2, and 3. Wiley, New York.
Bechtold, N., Ellis, J., and Pelletier, G. (1993) In planta Agrobacterium-mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants. C R Acad Sci Paris, Sciences de la vie/Life sciences 316: 1194-1199.
Becker, D., Brettschneider, R. and Lörz, H. (1994) Fertile transgenic wheat from microprojectile bombardment of scutellar tissue. Plant J. 5: 299-307.
Bernerth R, Frentzen M (1990) Utilization of erucoyl-CoA by acyltransferases from developing seeds of Brassica napus (L.) involved in triacylglycerol biosynthesis. Plant Sci 67: 21-28.
Bradford M.M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254.
Budziszewski, G.J., Croft, K.P.C. and Hildebrand, D.F. (1996) Uses of biotechnology in modifying plant lipids. Lipids 31: 557-569.
Cao, Y-Z and Huang, AHC (1986) Diacylglycerol acyltransferase in maturing oil seeds of maize and other species. Plant Physiol. 82: 813-820.
Cao Y-Z, Huang AHC (1987) Acyle coenzyme A preference of diacylglycerol acyltransferase from maturing seeds of Cuphea, maize, rapeseed and canola. Plant Physiol. 84: 762-765
Cases, S., Smith, J.S., Zheng, Y-W., Myers, H.M., Lear, S.R., Sande, E., Novak, S., Collies, C., Welch, C.B., Lusis, A.J., Erickson, S.K. and Farese, R.V., JR. (1998) Identification of a gene encoding a acyl CoA: diacylglycerol acyltransferase, a key enzyme in triacylglycerol synthesis. Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 95, 13018-13023.
Chang, T.Y., Chang, C.C.Y. and Cheng, D. (1997) Acyl-Coenzyme A: Cholesterol Acyltransferase. Annu. Rev. Biochem. 66, 613-38.
Church, G.M. and Gilbert, W. (1984) Genomic sequencing. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 81, 1991-95.
Clough, S.J. and Bent, A.F. (1998) Floral dip: a simplified method for Agrobacteriummediated transformation of Arabidopsis thaliana. The Plant Journal 16, 735-43
Datla, R.S.S., Hammerlindl, J.K., Panchuk, B., Pelcher, L.E. and Keller, W.A. (1992) Modified binary plant transformation vectors with the wild-type gene encoding NPTII. Gene 211: 383-384.
Datla, R.S.S., Bekkaoui, F., Hammerlindl, J., Pilate, G., Dunstan, D.I. and Crosby, W.L. (1993) Improved high-level constitutive foreign gene expression in plants using an AMV RNA4 untranslated leader sequence. Plant Sci. 94: 139-149.
Datla, R., Anderson, J.W. and Selvaraj, G. (7997) Plant promoters for transgene expression. Biotechnology Annual Review 3: 269-296.
DeBlock, M., DeBrouwer, D. and Tenning P. (1989) Transformation of Brassica napus and Brassica oleracea using Agrobacterium tumefaciens and the expression of the bar and neo genes in the transgenic plants. Plant Physiol. 91: 694-701.
De Lange, P., Van Blokland, R., Kooter, J.M. and Mol, J.M.N. (1995) Suppression of flavenoid flower pigmentation genes in Petunia hybrida by the introduction of antisense and sense genes. In: Gene Silencing in Higher Plants and Related Phenomena in Other Eukaryotes. P.Meyer (Ed.), Springer-Verlag, Berlin, pp. 55-75.
Dellaporta, S.L., Wood, J. and Hicks, J.B. (1983) A plant DNA minipreparation:Version II. Plant Mol. Biol. Rep. 1, 19-21
Elble, R. (1992). A simple and efficient procedure for transformation of yeasts. Biotechniques 13, 18-20.
Focks, N. and Benning, C. (1998) wrinkled1: A novel, low-seed-oil mutant of Arabidopsis with a deficiency in the seed-specific regulation of carbohydrate metabolism. Plant Physiol. 118, 91-101.
Frentzen M (1993) Acyltransferases and triacylglycerols. In: Moore, Jr. TS, editor, Lipid Metabolism in Plants, pp. 195-230. CRC Press, Ann Arbor,.
Giraudat, J., Hauge, B.M., Valon, C., Smalle, J., Parcy, F., Goodman, H.M. (1992) Isolation of the Arabidopsis ABI3 gene by positional cloning. Plant Cell 4, 1251-1261.
Goodman, H.M., Ecker, J.R. and Dean, C. (1995) The genome of Arabidopsis thaliana. Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 92: 10831-10835.
Hadjeb N and Berkowitz GA (1996) Preparation of T-over-hang vectors with high PCR product cloning efficiency. Biotechniques 20: 21-22.
Halford, N.G. and Hardie, D.G. (1998) SNF1-related protein kinases: global regulators of carbon metabolism in plants? Plant Mol. Biol. 37, 735-748.
Hitz, W.D., Mauvis, C.J., Ripp, K.G., Reiter, R.J., DeBonte, L. and Chen, Z. (1995) The use of cloned rapeseed genes for cytopiastic fatty acid desaturases and the plastid acyl-ACP thioesterases to alter relative levels of polyunsaturated and saturated fatty acids in rapeseed oil. Proc. 9th Intemat'nal Cambridge Rapeseed Congress UK, pp. 470-472.
Ichihara, K. and Noda, M. (1981) Lipid synthesis in germinating safflower seeds and protoplasts. Phytochemistry 20, 1245-1249.
Ichihara, K., Takahashi, T. and Fujii, S. (1988) Diacylglycerol acyltransferase in maturing safflower seeds: its influences on the fatty acid composition of the triacylglycerol and on the rate of triacylglycerol synthesis. Biochim. Biophys. Acta 958, 125-129.
Jorgensen, R.A. and Napoli, C.A. (1994) Genetic engineering of novel plant phenotypes. U.S. Patent No. 5283184.
Josefsson, L-G, Lenman M, Ericson ML and Rask L (1987) Structure of a gene encoding the 1.7S storage protein, napin, from Brassica napus. J biol Chem 262: 12196-12201.
Katavic, V., Haughn, G.W., Reed, D., Martin, M. and Kunst, L. (1994) In plants transformation of Arabidopsis thaliana. Mol. Gen. Genet. 245: 363-370.
Katavic, V., Reed, D.W., Taylor, D.C., Giblin, E.M., Barton, D.L., Zou, J-T., MacKenzie, S.L., Covello, P.S. and Kunst, L. (1995) Alteration of fatty acid composition by an EMS-induced mutation in Arabidopsis thaliana affecting diacylglycerol acyltransferase activity. Plant Physiol. 108, 399-409.
Kinney, A.J. (1995) Improving soybean seed quality. In: Induced Mutations and Molecular Techniques for Crop Improvement. International Atomic Energy Agency, Vienna, Austria., pp. 101-113.
Kinney, A.J. (1997) Genetic engineering of oilseeds for desired traits. In: Genetic Engineering, Vol. 19 (J.K. Setlow, ed.), Plenum Press, NY., pp. 149-166.
Kishore G.M. and Somerville, C.R. (1993) Genetic engineering of commercially useful biosynthetic pathways in transgenic plants. Current Opinion in Biotechnology. 4: 152-158.
Knutzon, D.S., Thompson, G.A., Radke, S.E., Johnson, W.B., Knauf, V.C., and Kridl, J.C. (1992) Modification of Brassica seed oil by anti-sense expression of a stearoylacyl carrier protein desaturase gene. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 89: 2624-2628.
Knutzon, D.S., Lardizabal, K.D., Nelson, J.S., Bleibaum, J.L., Davis, H.M and Metz, J. (1995) Cloning of a coconut endosperm cDNA encoding a 1-acyl-sn-glycerol-3-phosphate acyltransferase that accepts medium chain length substrates. Plant Physiol. 109, 999-1006.
Kwanyuen, P. and Wilson, R.F. (1986) Isolation and purification of diacylglycerol acyltransferase from germinating soybean cotyledons. Biochim. Biophys. Acta 877, 238-245.
Lacey DJ, Hills MJ (1996) Heterogeneity of the endoplasmic reticulum with respect to lipid synthesis in developing seeds of Brassica napes L. Plants 199: 545-551.
Lagercrantz, U., Putterill, J., Coupland, G. and Lydiate, D. (1996) Comparative mapping in Arabidopsis and Brassica, fine scale genome collinearity and congruence of genes controlling flowering. Plant J. 9: 13-20.
Lassner, M.W., Levering, C.K, Davis, H.M. and Knutzon, D.S. (1995) Lysophosphatidic acid acyltransferase from meadowfoam mediates insertion of erucic acid at the sn-2 position of triacylglycerol in transgenic rapeseed oil. Plant Physiol. 109, 1389-1394.
Lassner, M.W., Lardizabal, K, and Metz, J.G. (1996) A jojoba β-ketoacyl-CoA synthase cDNA complements the canola fatty acid elongation mutation in transgenic plants. The Plant Cell, 8: 281-292.
Lewin TM, Wang P and Coleman RA (1999) Analysis of amino acid motifs diagnostic for the sn-glycerol-3-phosphate acyltransferase reaction. Biochemistry 38: 5764-5771.
Lindstrom J.T. and Vodkin L.O. (1991) A soybean cell wail protein is affected by seed colour genotype. Plant Cell 3:561-571 Little D, Weselake RJ, Pomeroy MK, Furukawa-Stoffer T and Bagu J (1994) Solubilization and characterization of diacylglycerol acyltransferase from microsporederived cultures of oilseed rape. Biochem J 304: 951-958.
Lloyd, A.M., Walbot, V. and Davis, R.W. (1992) Arabidopsis and Nicotiana anthocyanin production activated by maize regulators R and C1. Science 258: 1773-1775.
MacKenzie, S.L. and Jain, R.K. (1997) Improvement of oils crops via biotechnology. Recent Res. Dev. In Oil Chem. 1: 149-158.
Mayorek, N, Grinstein I, and Bar-Tana J (1989) Triacylglycerol synthesis in cultured rat hepatocytes. The rate-limiting role of diacylglycerol acyltransferase. Eur J Biochem 182: 395-400.
Meyer, P. (1995) Understanding and controlling transgene expression. Trends in Biotechnology, 13: 332-337.
Meyerowitz, E.M. (1987) Arabidopsis thaliana. Ann. Rev. Genet. 21: 93-111.
Meyerowitz, E.M. and Chang, C. (1985) Molecular biology of plant growth and development: Arabidopsis thaliana as an experimental system. In: Developmental Biology, Vol. 5, Plenum Press, NY., pp. 353-366.
Mogami, K., O'Donnell, P.T., Bernstein, S.I., Wright, T.R.F and Emerson, C.P., JR. (1986) Mutatlons of the Drosophila myosin heavy-chain gene: effects an transcription, myosin accumulation, and muscle function. Proc. Nat'l. Acad. Scl. USA 83, 1393-1397.
Mol, J.M.N.. Van der Krol, A.R., Van Tunen, A.J., Van Blokland, R., De Lange, P. and Stuitje, A.R. (1990) Regulation of plant gene expression by antisense RNA FEBS Lett. 268: 427-430.
Moloney, M.M., Walker, J.M. and Sharma, K.K (1989) High efficiency transformation of Brassica napus using Agrobacterium vectors. Plant Call Rep. 8: 238-242.
Nagiec, M.M., Wells, G.B., Laster, R.L, and Dickson, RC. (1993). A suppressor gene that enables Saccharomyces cerevisiae to grow without making sphingolipids encodes a protein that resembles an Escherichia toll fatty acyltransferase. J. Biol Chem. 268, 22156-22163.
Nehra, N.S., Chibbar, R.N., Leung, N., Caswell, K., Mallard, C., Stelnhauer, L. Baga, M. and Kartha K.K. (1994) Self-fertile transgenic wheat plants regenerated from isolated scutellar tissues following microprojectile bombardment with two distinct gene constructs. Plant J 5: 286-297.
Nykiforuk C, Laroche A and Weselake RJ (1999) Isolation and sequence analysis of a novel cDNA encoding a pulative diacylglycerol acyltransferase from a microsporederived cell suspension culture of Brassica napus L. cv Jet Neuf (Accession No. AF155224).), Plant Physiology 120: 1207.
Oelkers, P., Behar, A., Cromley. D., Billheimer, J.T. and Sturley, S.T. (1998) Characterization of two human genes encoding acyl Coenzyme A: cholesterol acyltransferase-related enzymes. J. Biol. Chem. 273, 26765-2677.
Okagaki, R.J., Neuffer, M.G. and Wessler, S.R. (1991) A deletion common to two independently denved Waxy mutations In maize. Genetics 128, 425-431.
Okuley, J., Lightner, J., Feldmann, K., Yadav, N., Lark, E. and Browse, J. (1994) Arabidopsis fad2 gene encodes the enzyme that is essential for polyunsaturated lipid synthesis. The Plant Cell 6: 147-158.
Perry, H.Y. and Harwood, J.L. (1993a) Changes in the lipid content of developing seeds of Brassica napus. Phytochemistry 32: 1411-1415.
Perry, H.Y. and Harwood, J.L. (1993b) Use of [2-3H] glycerol precursor in radiolabelling studies of acyl lipids in developing seeds of Brassica napus. Phytochemistry 34: 69-73.
Poirier, Y., Dennis DE, Klomparens K and Somerville C (1992) Polyhydroxybutyrate, a biodegradable thermoplastic produced in transgenic plants. Science 256: 520-523.
Poirier, Y., Nawrath C and Somerville C (1995) Production of polyhydroxyalkanoates, a family of biodegradeable plastics and elastomers in bacteria and plants butyrate, a biodegradable thermoplastic produced in transgenic plants. Bio-Technology, 13: 142-150.
Poirier, Y., Ventre, G and Caldelari, D(1999) Increased flow of fatty acids toward β oxidation in developing seeds of Arabidopsis deficient in diacylglycerol acyltransferase activity or synthesizing medium-chain-length fatty acids. Plant Physiology 121: 1359-1366.
Potrykus, I. (1991) Gene transfer to plants: Assessment of published approaches and results. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42: 205-225.
Radke SE, Andrews BM, Moloney MM, Crouch ML, Kridl JC, and Knauf VC (1988) Transformation of Brassica napus L. using Agrobacterium tumefaciens: developmentally regulated expression of a reintroduced napin gene. Theor. Appl. Genet. 75: 685-694.
Rhodes, C.A., Pierce, D.A., Mettler, I.J., Mascarenhas, D. and Detmer, J.J. (1988) Genetically transformed maize plants from protoplasts. Science 240: 204-207.
Rutar, V. (1989) Magic angle sample spinning NMR spectroscopy of liquids as a nondestructive method for studies of plant seeds. J. Agric. Food. Chem. 37, 67-70.
Sambrook J., Fritsch E.F. and Maniatis T. (1989) In Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Sauford, J.C., Klein, T.M., Wolf, E.D. and Allen, N. (1987) Delivery of substances into cells and tissues using a particle bombardment process. J. Part. Sci. Technol. 5: 27-37.
Settlage, SH, Wilson RF and Kwanyuen, P. (1995) Localization of diacylglycerol acyltransferase to oil body associated endoplasmic reticulum. Plant Physiol. Biochem. 33: 399-407.
Shimamoto, K., Terada, R., Izawa, T. and Fujimoto, H. (1989) Fertile transgenic rice plants regenerated from transformed protoplasts. Nature 338: 274-276.
Somerville, C.R. (1993) Future prospects for genetic modification of the composition of edible oils from higher plants. Am. J. Clin. Nutr. 58 (2 Suppl.): 270S-275S.
Songstad, D.D., Somers, D.A. and Griesbach, R.J. (1995) Advances in alternative DNA delivery techniques. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 40: 1-15.
Southern E.M. (1975) Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gele electrophoresis. J. Mol. Biol. 98: 503-517.
Sparace S.A., Kleppinger-Sparace K.F., Stahl R.J., Xue L. and Qi, Q. (1992) Lipid biosynthesis in pea root plastids and some effects of glycolytic intermediates. In SL MacKenzie and DC Taylor, eds. Seed Oils for the Future, AOCS Press, Champaign, IL. pp 52-60.
Stark, D.M., Timmerman, K.P., Barry, G.F., Preiss, J. and Kishore, G.M. (1992) Regulation of the amount of starch in plant tissues by ADP glucose pyrophosphorylase. Science 258: 287-292.
Stobart AK, Stymne S, Höglund S. (1986) Safflower microsomes catalyse oil accumulation in vitro: A model system. Planta 169: 33-37.
Stymne, S. and Stobart, A.K. (1987) Triacylglycerol Biosynthesis. In Stumpf, P.K. ed, The Biochemistry of Plants, Academic Press, New York. 9, 175-214.
Taylor. CB. (1998) Comprehending cosuppression. The Plant Cell 9: 1245-1249.
Taylor, D.C., Weber, N., Barton, D.L., Underhill, E.W., Hogge, L.R., Weselake, R.J. and Pomeroy, M.K. (1991) Triacylglycerol bioassembly in microspore-derived embryos of Brassica napus L. cv. Reston. Plant Physiol. 97, 65-79.
Taylor, D.C., Barton, D.L., Rioux, K.P., MacKenzie, S.L., Reed, D.W., Underhill, E.W., Pomeroy, M.K. and Weber, N. (1992) Biosynthesis of acyl lipids containing very-long chain fatty acids in microspore-derived embryos of Brassica napus L. cv. Reston. Plant Physiol. 99, 1609-1618.
Tijburg, LB, Geelen, MJ and van Golde LM (1989) Rgulation of the biosynthesis of triacylglycerol, phosphatidylcholine and phosphatidylethanloamine in the liver. Biochim Biophys Acta 1004: 1-19.
Tzen TC, Cao Y, Laurent P, Ratnayake C and Huang HC (1993) Lipids, proteins and structures of seed oil bodies from diverse species. Plant Physiol. 101: 267-276.
Vasil, I.K. (1994) Molecular improvement of cereals. Plant Mol. Biol. 25: 925-937.
Vaucheret, H., Béclin C, Elmayan T, Feuerbach, F., Godon C, Morel J-B, Mourrain, P., Palauqui, J-C and Vernhettes S (1998) Transgene-induced gene silencing in plants. The Plant Journal 16: 651-659.
Voelker, T.A., Worrell. A.C.. Anderson, L., Bleibaum, J., Fan, C., Hawkins, D.J., Radke, S.E.. and Davies, H.M. (1992) Fatty acid biosynthesis redirected to medium chains in transgenic oilseed plants. Science 257: 72-74.
Voelker, T.A., Hayes, T.R., Cramner, A.M., Turner, J.C., and Davies, H.M. (1996) Genetic engineering of a quantitative trait: metabolic and genetic parameters influencing the accumulation of laurate in rapeseed. The Plant Journal 9: 229-241.
Vogel, G and Browse, J (1996) Cholinephosphotransferase and diacylglycerol acyltransferase: Substrate specificities at a key branch point in seed lipid metabolism. Plant Physiol. 110: 923-931.
Walden, R. and Wingender, R. (1995) Gene-transfer and plant regeneration techniques. Trends in Biotechnology 13: 324-331.
Weselake, R.J., Taylor, DC, Pomeroy, M.K., Lawson SL, and Underhill EW (1991) properties of diacylglycerol acyltransferase from microspore-derived embryos of Brassica napus L. Phtochemistry: 30: 3533-3538.
Weselake, R.J., Pomeroy, M.K, Furukawa, T.L., Golden, J.L., Little, D.B. and Laroche, A. (1993) Developmental profile of diacylglycerol acyltransferase In maturing seeds of oilseed rape and safflower and micro-spore-derived cultures of oilseed rape. Plant Physiol. 102, 565-571.
Wilson, R.F. and Kwanyuan P. (1986) Triacylglycerol synthesis and metabolism in germinating soybean cotyledons. Biochim. Biophys. Acta 877, 231-237.
Yang, H., Bard, M., Bruner, D.A, Gleeson, A, Dekelbaum, R.J.. Aljinovic, G., Pohl, T.M., Rothstein, R. and Sturley, S.L. (1997) Sterol esterification in yeast: a two-gene process. Science 272, 1353-1356.
Yu, C., Kennedy, N.J., Chang, C.C.Y. and Rothblatt, J.A. (1996) Molecular cloning and characterization of two isoforms of Saccharomyces cerevisiae Acyl-CoA: Sterol Aryltransferase. J. Biol. Chem. 271, 24167-24163.
Zou, J-T., Katavic. V., Giblin, E.M., Barton, D.L, MacKenzie, S.L., Keller, W.A, Hu, X. and Taylor, D.C. (1997) Modification of seed oil content and acyl composition in the Brassicaceae by expression of a yeast sn-2 acyltransferase gene. The Plant Cell 9: 909-923.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isolierte Desoxyribonukleinsäure (DNA), dadurch gekennzeichnet, dass die DNA eine Sequenz nach SEQ ID NO: 1 beinhaltet und, wenn in Pflanzen exprimiert, ein Protein mit Diacylglycerolacyltransferase (DGAT)-Aktivität kodiert.
Vektor zur Transformation von Pflanzenzellen, dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor eine Desoxyribonukleinsäure-Sequenz nach SEQ ID NO:1 enthält und, wenn in Pflanzen exprimiert, ein Protein mit DGAT-Aktivität kodiert.
Vektor zur Transformation von Pflanzenzellen, dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor eine Desoxyribonukleinsäure-Sequenz nach SEQ ID NO: 23 enthält.
Vektor nach Anspruch 2 oder Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz in dem Vektor in einer Sense-Orientierung vorliegt.
Vektor nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz in dem Vektor in einer Antisense-Orientierung vorliegt.
Plasmid pDGATcDNA der Hinterlegungssnummer ATCC PTA-989.
Pflanze mit einem Genom, dadurch gekennzeichnet, dass das Genom eine eingeführte rekombinante Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 1 enthält und, wenn in Pflanzen exprimiert, ein Protein mit DGAT-Aktivität kodiert.
Pflanzensamen mit einem Genom, dadurch gekennzeichnet, dass das Genom eine eingeführte rekombinante Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 1 enthält und, wenn in Pflanzen exprimiert, ein Protein mit DGAT-Aktivität kodiert.
Genetisch transformierte Pflanze, dadurch gekennzeichnet, dass die Pflanze ein Genom aufweist, welches durch einen Vektor nach Anspruch 2 oder Anspruch 3 transformiert wurde.
Genetisch transformierter Pflanzensamen, dadurch gekennzeichnet, dass der Samen ein Genom aufweist, welches durch einen Vektor nach Anspruch 2 oder Anspruch 3 transformiert wurde.
Pflanzensamen nach Anspruch 8 oder Anspruch 10, gekennzeichnet durch das Aufweisen eines veränderten Samenöl-Gehalts, verglichen mit einem Durchschnitt von mindestens 10 Samen von genomisch unmodifizierten Pflanzen des gleichen Genotyps, die unter identischen Bedingungen zur gleichen Zeit gezogen wurden.
Pflanzensamen nach Anspruch 8 oder Anspruch 10, gekennzeichnet durch das Aufweisen eines veränderten Diacylglycerol-Gehalts in seinem Samenöl, verglichen mit einem Durchschnitt von mindestens 10 Samen von genomisch unmodifizierten Pflanzen des gleichen Genotyps, die unter identischen Bedingungen zur gleichen Zeit gezogen wurden.
Pflanzensamen nach Anspruch 8 oder 10, gekennzeichnet durch das Aufweisen eines Samenöls mit einer veränderten Fettsäureacyl-Zusammensetzung, verglichen mit einem Durchschnitt von mindestens 10 Samen von einer genomisch unmodifizierten Pflanze des gleichen Genotyps, die unter identischen Bedingungen zur gleichen Zeit gezogen wurde.
Pflanze nach Anspruch 7 oder 9, gekennzeichnet durch das Aufweisen einer gesteigerten Biomasse, verglichen mit einem Durchschnitt von mindestens 10 genomisch unmodifizierten Pflanzen des gleichen Genotyps, die unter identischen Bedingungen zur gleichen Zeit gezogen wurden.
Samen nach Anspruch 8 oder 10, gekennzeichnet durch das Aufweisen einer gesteigerten Biomasse, verglichen mit einem Durchschnitt von mindestens 10 genomisch unmodifizierten Pflanzen des gleichen Genotyps, die unter identischen Bedingungen zur gleichen Zeit gezogen wurden.
Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen durch das Einführen einer rekombinanten Nukleotidsequenz in ein Genom der Pflanze, dadurch gekennzeichnet, dass die in das Genom eingeführte Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 1 beinhaltet und, wenn in der Pflanze exprimiert, ein Protein mit DGAT-Aktivität kodiert, oder SEQ ID NO: 23 beinhaltet.
Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Pflanze ein Mitglied der Brassicaceae ist.
Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Pflanze aus der Gruppe, bestehend aus Arabidopsis thaliana, Borretsch (Borago spp.), Canola, Rizinus (Ricinus communis), Kakaobohne (Theobroma cacao), Mais (Zea mays), Baumwollpflanze (Gossypium spp.), Crambe spp., Cuphea spp., Flachs (Linumspp.), Lesquerella und Limnanthes spp., Linola, Kapuzinerkresse (Tropaeolum spp.), Oenothera spp., Olive (Olea spp.), Palme (Elaeis spp.), Erdnuss (Arachis spp.), Rübsamen, Saflor (Carthamus spp.), Sojabohne (Glycine und Soja spp.), Sonnenblume (Helianthus spp.), Tabak (Nicotiana spp.), Vernonia spp., Weizen (Triticum spp.), Gerste (Hordeum spp.), Reis (Oryza spp.), Hafer (Avena spp.), Sorghum (Sorghum spp.), Roggen (Secale spp.) und anderen Mitgliedern der Gramineae, ausgewählt ist.
Verfahren zum Verändern des Ölgehalts, der Acyl-Zusammensetzung oder der Diacylglycerol/Triacylglycerol-Verhältnisse des Samenöls von Pflanzensamen durch das Einführen eines rekombinanten Sense- oder Antisense-Nukleinsäure-Konstrukts in einen Pflanzen-Transformationsvektor, das Verwenden des Vektors, um das Genom einer Pflanze oder eines Pflanzensamens zu transformieren, und dann das Züchten der Pflanze oder des Pflanzensamens und das Extrahieren des Öls aus dem Pflanzensamen, dadurch gekennzeichnet, dass die rekombinante Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 23 umfasst.
Isolierte DNA-Sequenz, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz SEQ ID NO: 23 umfasst.
Protein, gekennzeichnet durch die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 und, wenn in Pflanzen exprimiert, mit DGAT-Aktivität.
Protein nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein die Consensus-Sequenz von SEQ ID NO: 10 enthält.
Isolierte Desoxyribonukleinsäure (DNA), dadurch gekennzeichnet, das die DNA ein Protein nach Anspruch 21 oder Anspruch 22 kodiert.
Vektor zur Transformation von Pflanzenzellen, dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor eine Desoxyribonukleinsäure-Sequenz nach Anspruch 23 enthält.
Genetisch transformierte Pflanze, dadurch gekennzeichnet, dass die Pflanze ein Genom aufweist, welches durch einen Vektor nach Anspruch 24 transformiert wurde.
Genetisch transformierter Pflanzensamen, dadurch gekennzeichnet, dass der Samen ein Genom aufweist, weiches durch einen Vektor nach Anspruch 24 transformiert wurde.
Protein mit DGAT-Aktivität, wenn in Pflanzen exprimiert, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein die Consensus-Sequenz von SEQ ID NO: 10 beinhaltet.