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DE69932820T4 - Thiolester und ihre anwendungen - Google Patents

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DE69932820T
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DE69932820T2 (de
DE69932820D1 (de
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A. Jim Frederick TURPIN
Yongsheng Rockville SONG
K. John Bethesda INMAN
Mingjun Rockville HUANG
Anders Edison WALLQVIST
Andrew Frederick MAYNARD
G. David Chevy Chase COVELL
G. William Frederick RICE
Ettore Chevy Chase APPELLA
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US Department of Health and Human Services
Government of the United States of America
Original Assignee
US Department of Health and Human Services
Government of the United States of America
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Description

  • Diese Erfindung betrifft das Gebiet der Virologie und der antiviralen Therapeutika. Insbesondere betrifft diese Erfindung die Entdeckung einer neuartigen Thiolester-Familie und Anwendungen derselben.
  • Viren, insbesondere Retroviren wie HIV, können sehr schnell eine Resistenz gegen Arzneimittel entwickeln, die zur Behandlung der Infektion benützt werden. Diese extreme Anpassungsfähigkeit der Retroviren ist auf die hohe Fehlerrate des Revertase-Enzyms zurück zu führen, das für die Transkription seines RNA-Genoms verantwortlich ist. Das HIV ist ein Beispiel eines solchen hypermutablen Virus. Es hat sich in die zwei Hauptspezies HIV-1 und HIV-2 aufgespaltet, von denen jede zahlreiche Stämme, Subtypen und medikamentenresistente Variationen aufweist.
  • Zu den Strategien gegen das Auftreten viraler medikamentenresistenter Stämme gehören die medikamentösen Kombinationstherapien (Lange (1996) AIDS 10 Suppl 1: S27-530). Medikamente gegen unterschiedliche Virusproteine und Medikamente gegen mehrere Positionen auf dem selben Protein werden in der Regel als Strategie zur Überwindung der Anpassungsfähigkeit des Virus eingesetzt. Kombinationstherapien für Retroviren, die beispielsweise Protease-Hemmer und Nukleosidanaloge verwenden, wie AZT, ddI, ddC und d4T, können unwirksam werden; das Virus entwickelt in relativ kurzer Zeit eine vollständige Resistenz (Birch (1998) AIDS 12: 680-681; Roberts (1998) AIDS 12: 453-460; Yang (1997) Leukemia 11 Suppl 3: 89-92; Demeter (1997) J. Acquir. Immune Defic. Syndr. Hum. Retrovirol. 14 (2): 136-144; Kuritzkes (1996) AIDS 10 Suppl 5: S27-S31). Zudem steht zur Zeit kein wirksamer antiretroviraler Impfstoff zur Verfügung (Bolognesi (1998) Nature 391: 638-639; Bangham (1997) Lancet 350: 1617-1621).
  • Antibakterielle und antivirale Arylthio- und Dithiobisarylamid-Verbindungen (Domagala ( WO 96/04242 )) und Verbindungsklassen, welche HIV-1 durch Bekämpfung der CCHC Zinkfinger des viralen Nucleocapsid-Proteins inaktivieren (Henderson ( WO 96/09406 )), wurden offenbart.
  • Die HIV-1-bedingte AIDS-Epidemie begann vor etwa 18 Jahren. Seither hat die Zahl der neuen Fälle zugenommen. Bis Ende 1994 wurden der WHO 1'025'073 AIDS-Fälle gemeldet, bei einer 20%-Steigerung der Fallzahlen seit Dezember 1993 (Galli (1995) Q. J. Nucl. Med. 39: 147-155). Bis zum Jahr 2000 prognostiziert die WHO eine Zahl von 30 bis 40 Millionen kumulativen HIV-1-Infektionen weltweit (Stoneburner (1994) Acta Paediatr. Suppl. 400: 1-4). Es besteht somit ein dringender Bedarf nach Verbindungen, die gegen Retroviren wirksam sind, wie beispielsweise gegen HIV-1. Die vorliegende Erfindung erfüllt dieses und andere Bedürfnisse.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die Erfindung schafft eine neue Art von Verbindungen, die ein Thiolester mit folgender chemischer Struktur umfassen:
    Figure 00020001
    wobei:
    R1 ist -Y-Z;
    Y ist -(CH2)m-, wobei m eine Ganzzahl von 1 bis 6 ist;
    Z ist Pyridinio mit folgender Struktur:
    Figure 00020002
    und wobei:
    R12, R13, R14, R15 und R16 Reste sind, die unabhängig aus der Gruppe bestehend aus H, -C(=O)NH2 und substitutierten Carboxamidogruppen ausgewählt sind; R2 aus der Gruppe bestehend aus H, CH3, -C(=O)NH2 und -C(=O)OCH3-Gruppen ausgewählt ist;
    R3, R4 und R5 Reste sind, die unabhängig aus der Gruppe bestehend aus H, einem Halogen, -NO2, -C(=O)NH2, und -C(=O)OCH3-Gruppen ausgewählt sind;
    R6 aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus:
    H;
    Alkyl, wobei Alkyl sich auf ein verzweigtes oder unverzweigtes, gesättigtes oder ungesättigtes, monovalentes Kohlenwasserstoffradikal mit 1-30 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise mit 4-20 Kohlenstoffatomen und meistbevorzugt mit 6-18 Kohlenstoffatomen bezieht; CH3;
    substituiertem Alkyl, wobei substituiertes Alkyl sich auf ein Alkyl bezieht, das eine oder mehrere funktionelle Gruppen besitzt, die an jeden Kohlenstoff der Alkylkomponente gebunden sein können oder von der Alkylkette überstehend oder in diese integriert sein können;
    Aryl, wobei Aryl sich auf eine aromatische Substituente bezieht, die ein einzelner aromatischer Ring oder mehrere verschmolzene aromatische Ringe sein kann, die kovalent verbunden oder mit einer gemeinsamen Gruppe verbunden sind, die auch ein Carbonyl sein kann; substituiertem Aryl, wobei sich substituiertes Aryl auf Aryl mit einer oder mehreren funktionellen Gruppen und gesättigten sowie ungesättigten zyklischen Kohlenwasserstoffen bezieht, die zu dem (den) aromatischen Ring(en) verschmolzen sind;
    und Arylalkylgruppen, wobei sich Arylalkyl auf eine Aryl-Untergruppe bezieht, in der die Arylgruppe zusätzlich an eine Alkylgruppe gebunden ist;
    R7, R8, R10 und R11 H sind;
    R9 (O=S=O)-G' ist, wobei G' aus der Gruppe bestehend aus -NH2, -NH-Alkyl, -NH-Acylgruppen, Nitroaryl und Aryl-NH-Acyl ausgewählt ist.
  • In einem Ausführungsbeispiel ist der Thiolester der Erfindung geeignet, in vitro ein Metall-Ion von einem Zinkfinger abzuspalten. In einem anderen Ausführungsbeispiel besitzt der Thiolester der Erfindung antivirale Wirkung.
  • Die Erfindung schafft ein Verfahren zum Trennen eines Metall-Ions von einem Zinkfinger-haltigen Protein, wobei das Verfahren den Schritt des Kontaktierens des Zinkfingers mit einem Thiolester der Erfindung umfasst. In alternativen Ausführungsbeispielen ist das Metall-Ion ein Zink-Ion; der Zinkfinger umfasst ein virales Protein; das Virusprotein ist ein Nucleocapsid-Protein, ein Gag-Protein oder ein Gag-Pol-Protein; und das Zinkfinger-haltige Protein wird in einen intakten Virus eingesetzt.
  • In einem Ausführungsbeispiel wird bei dem Verfahren zum Trennen eines Metall-Ions von einem Zinkfinger-haltigen Protein das Kontaktieren des Virus mit der Verbindung in vitro durchgeführt. Das Kontaktieren des Virus mit der Verbindung kann auch in vivo durchgeführt werden. Der Zinkfinger kann ein Retrovirus-Protein umfassen, das von einer Vogelsarkom- und Leukose-Retrovirusgruppe, einer Säugetier-B-Typ-Retrovirusgrippe, einer Human-T-Zellen-Leukämie- und Rinderleukämie-Retrovirusgruppe, einer D-Typ-Retrovirusgruppe, einer Ratten-Leukämie-verwandten Gruppe oder einer Lentivirusgruppe abgeleitet ist. Das Retrovirus-Protein kann von einem HIV-1-, einem HIV-2-, einem SIV-, einem BIV-, einem EIAV-, einem Visna-, einem CaEV-, einem HTLV-1-, einem BLV-, einem MPMV-, einem MMTV-, einem RSV-, einem MuLV-, einem FeLV-, einem BaEV- oder einem SSV-Retrovirus stammen. Dieses Verfahren kann des weiteren das Feststellen der Trennung des Metall-Ions vom Zinkfinger des Virusproteins umfassen. Die Feststellung der Trennung des Metall-Ions vom Zinkfinger kann unter Anwendung einer aus folgender Gruppe ausgewählten Methode durchgeführt werden: Kapillar-Elektrophorese, Immunblotting, Kernspinresonanz (NMR), Hochdruck-Flüssig-Chromatographie (HPLC), Feststellen der Freisetzung von radioaktivem Zink-65, Feststellen von Fluoreszenz und Feststellen einer Gelmobilitätsänderung.
  • Die Erfindung schafft auch ein Verfahren zur Inaktivierung eines Virus, wobei das Verfahren die Kontaktierung des Virus mit einer Verbindung der Erfindung umfasst und das Kontaktieren des Virus mit der Verbindung das Virus inaktiviert. In diesem Verfahren kann die Verbindung ein Zink-Ion von einem Zinkfinger trennen. Das Virus kann ein Retrovirus sein, das von einem Vogelsarkom- und einer Leukose-Retrovirengruppe, einer Säugetier-B-Typ-Retro virusgruppe, einer Human-T-Zellen-Leukämie- und Rinderleukämie-Retrovirusgruppe, einer D-Typ-Retrovirusgruppe, einer Ratten-Leukämie-verwandten Gruppe oder einer Lentivirus-Gruppe abstammt. Das Retrovirus kann ein HIV-1-, ein HIV-2-, ein SIV-, ein BIV-, ein EIAV-, ein Visna-, ein CaEV-, ein HTLV-1- , ein BLV-, ein MPMV-, ein MMTV-, ein RSV-, ein MuLV-, ein FeLV-, ein BaEV- oder ein SSV-Retrovirus sein.
  • In dem Verfahren zur Inaktivierung eines Virus kann das Kontaktieren des Virus mit der Verbindung in vivo erfolgen. In diesem Ausführungsbeispiel kann die Verbindung verabreicht werden, um die Übertragung des Virus zu hemmen. Die Verbindung kann intravaginal oder intrarektal verabreicht werden, um die Übertragung des Virus zu hemmen. Die Verbindung kann einem Menschen als pharmazeutische Rezeptur verabreicht werden. Die Verbindung kann einem Tier als veterinär-pharmazeutische Rezeptur verabreicht werden. Das Verfahren kann des weiteren das Kontaktieren des Virus mit einem Non-Thiolester-Antiretrovirus-Agens umfassen. Das Antiretrovirus-Agens kann ein Nucleotid-Analog oder ein Protease-Hemmer sein. Das Nucleotid-Analog kann AZT, ddCTP oder DDI sein.
  • In dem Verfahren zur Inaktivierung eines Virus kann das Kontaktieren des Virus mit der Verbindung in vitro durchgeführt werden. In diesem Ausführungsbeispiel des Verfahrens kann das Kontaktieren des Retrovirus mit der Verbindung in einem Blutprodukt, Blutplasma, Nährmedium, Protein, einer pharmazeutischen Zubereitung, einer kosmetischen Zubereitung, einer Sperma- oder Oozytenzubereitung, Zellen, Zellkulturen, Bakterien, Viren, Lebensmitteln und Getränken durchgeführt werden.
  • Die Erfindung schafft auch ein isoliertes und inaktiviertes Virus, wobei das Virus durch ein Verfahren inaktiviert wird, welches das Kontaktieren des Virus mit einem Thiolester der Erfindung umfasst, wobei das Kontaktieren des Virus mit dem Thiolester das Virus inaktiviert. Das isolierte und inaktivierte Virus kann ferner eine Impfstoffrezeptur umfassen. Das isolierte und inaktivierte Virus kann ein Retrovirus sein, das von einer Vogelsarkom- und Leukose-Retrovirusgruppe, einer Säugetier-B-Typ-Retrovirusgruppe, einer Human-T-Zellen- Leukämie- und Rinderleukämie-Retrovirusgruppe, einer D-Typ-Retrovirusgruppe, einer Ratten-Leukämie-verwandten Gruppe oder einer Lentivirusgruppe abgeleitet ist. Das Virus kann ein HIV-1-, ein HIV-2-, ein SIV-, ein BIV-, ein EIAV-, ein Visna-, ein CaEV-, ein HTLV-1-, ein BLV-, ein MPMV-, ein MMTV-, ein RSV-, ein MuLV-, ein FeLV-, ein BaEV- oder ein SSV-Retrovirus sein.
  • Die Erfindung schafft auch ein Verfahren zur Selektion einer Verbindung, das geeignet ist, ein Metall-Ion zu trennen, das mit einem Zinkfinger eines Virusproteins ein Chelat bildet, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: Kontaktieren des Zinkfingers mit einem Thiolester; und Feststellen der Trennung des Metall-Ions vom Zinkfinger des Virusproteins. In diesem Verfahren kann das Metall-Ion ein Zink-Ion sein. In diesem Verfahren kann das Feststellen der Trennung des Metall-Ions vom Zinkfinger unter Anwendung von Kapillar-Elektrophorese, Immunblotting, Kernspinresonanz (NMR), Hochdruck-Flüssig-Chromatographie (HPLC), Feststellen der Freiwerdung von radioaktivem Zink-65, Feststellen von Fluoreszenz oder Feststellen einer Gelmobilitätsänderung erfolgen.
  • Die Erfindung schafft auch einen Ausrüstungssatz zur Auswahl einer Verbindung, die geeignet ist, ein Metall-Ion von einem Zinkfinger eines viralen Proteins zu trennen, wobei der Ausrüstungssatz ein Retrovirus-Protein und Anweisungen zum Feststellen der Trennung des Metall-Ions vom Virusprotein umfasst, wobei die Anweisungen Vorschriften für die Auswahl eines Thiolesters der Erfindung enthalten. In dem Ausrüstungssatz kann das Virusprotein mit einem Zink-Ion dotiert werden, das mit dem Zinkfinger des Virusproteins in Chelatbindung ist. Das Virusprotein kann in ein intaktes Retrovirus eingesetzt werden. Der Zinkfinger kann von einer Vogelsarkom- und Leukose-Retrovirusgruppe, einer Säugetier-B-Typ-Retrovirusgruppe, einer Human-T-Zellen-Leukämie- und Rinderleukämie-Retrovirusgruppe, einer D-Typ-Retrovirusgruppe, einer Ratten-Leukämie-verwandten Gruppe oder einer Lentivirusgruppe abgeleitet sein. Der Zinkfinger kann von einem HIV-1-, einem HIV-2-, einem SIV-, einem BIV-, einem EIAV-, einem Visna-, einem CaEV-, einem HTLV-1-, einem BLV-, einem MPMV-, einem MMTV-, einem RSV-, einem MuLV-, einem FeLV-, einem BaEV- oder einem SSV-Retrovirus abgeleitet sein. In dem Aus rüstungssatt sind die Anleitungen auf das Feststellen der Trennung des Metall-Ions vom Protein unter Verwendung der Kapillar-Elektrophorese, des Immunblottings, der Kernspinresonanz (NMR), der Hochdruck-Flüssig-Chromatographie (HPLC), das Feststellen der Freiwerdung von radioaktivem Zink-65, das Feststellen von Fluoreszenz oder das Feststellen einer Gelmobilitätsänderung angelegt.
  • Die Erfindung schafft auch eine viruzide Zusammensetzung, die einen Thiolester der Erfindung umfasst. In einem Ausführungsbeispiel umfasst die viruzide Zusammensetzung des weiteren Blutplasma, Nährmedium, Protein, eine pharmazeutischen Zubereitung, eine kosmetische Zubereitung, eine Sperma- oder Oozytenzubereitung, Zellen, Zellkulturen, Bakterien, Viren, Lebensmittel und Getränke.
  • Die Erfindung schafft auch eine pharmazeutische Rezeptur, die einen Thiolester der Erfindung umfasst. Die pharmazeutische Rezeptur kann des weiteren einen pharmazeutischen Trägerstoff umfassen.
  • Ein weiter gehendes Verständnis der Art und der Vorteile der vorliegenden Erfindung kann durch Bezugnahme auf die restlichen Teile der Spezifikation und der Ansprüche gewonnen werden. Als zusätzliche Verständnishilfe und eine noch bessere Einschätzung der vorliegenden Erfindung verweisen wir auf "Synthesis and biological properties of pyridinoalkanoyl thiolesters as anti-HIV-1 agents" (Turpin (1999)). Med. Chem. 42: 67-86), das nach dem Prioritätsdatum der vorliegenden Erfindung eingereicht und publiziert wurde.
  • Die Wirksamkeit der meisten antiviralen Agenzien ist deshalb beschränkt, weil die Viren unter Selektionsdruck für gewöhnlich zu medikamentenresistenten Stämmen mutieren. Die Entwicklung der Medikamentenresistenz stellt eine Überlebensstrategie dar, wie sie – wegen deren Fähigkeit zu schneller Mutation – besonders ausgeprägt unter Retroviren verbreitet ist. Virenstrukturen, die für die Lebensfähigkeit und das Wachstum erforderlich sind, stellen gute Medikamentenziele dar, weil ihre Inaktivierung durch Mutation nicht leicht zu überwinden ist.
  • Virenstrukturen, die für die Replikation und Lebensfähigkeit essenziell sind, stellen gute Ziele für die Medikamentenentwicklung dar. Die Brauchbarkeit dieser Ziele nimmt noch zu, wenn die Strukturen mutationsintolerant sind. Überdies können diese Strukturen zwischen Virenfamilien, Gruppen oder Gattungen von Viren konserviert und/oder erhalten werden.
  • Die Erfindung schafft eine neue Gattung von Thiolester-Zusammensetzungen. Diese Thiolester sind in der Lage, Viren mit Hilfe unterschiedlicher Mechanismen zu inaktivieren, insbesondere durch die Komplexbildung mit Metall-Ion-Komplex bildenden Zinkfingern. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel inaktivieren die Thiolester-Zusammensetzungen der Erfindung Retroviren. In der Regel findet diese Inaktivierung statt, wenn der Thiolester das Nucleocapsid- oder andere Zinkfinger-haltige Proteine des Virus kontaktiert. Ein wichtiger Aspekt dieser neuartigen Zusammensetzungen besteht darin, dass sie nicht durch die reduzierende Umgebung biologischer Flüssigkeiten beeinträchtigt werden (d. h. ihre Aktivität ist in vivo nicht wesentlich verringert). Sie stellen deshalb wichtige therapeutische Reagenzien in der Behandlung viraler, insbesondere retroviraler Agenzien dar. Die viruzide Wirkung der Zusammensetzungen der Erfindung ist auch in In-vitro-Anwendungen nützlich, wie beispielsweise für die Herstellung getöteter Viren zur Verwendung beispielsweise als Reagenzien oder Vakzine und als Sterilisierungsreagenzien.
  • Ein "Zinkfinger"-Motiv ist eine hoch konservierte und essenzielle Struktur, die in vielen Viren vorkommt, insbesondere in Retroviren. Die Gag- und Gag-Pol-Proteine in den Retroviridae, ausgenommen Spumaviren, enthalten ein hoch konserviertes Zinkfingermotiv (CCHC) im Nucleocapsid p7 (NCp7) Proteinabschnitt des Polyproteins (vgl. Definitionen, unten). Die absolute Konservierung der metallchelatbildenden Zystein- und Histidinreste zusammen mit anderen Proteinresten und deren Beteiligung an essenziellen Funktionen in der frühen und späten Virusreplikation identifiziert dieses Merkmal als ein antivirales Ziel. Mutationen der chelatbildenden Reste in den Zinkfingern ergeben ein nicht-infektiöses Virus. Da Zinkfinger in den meisten Retroviren identisch sind, haben Reagenzien, die zur Hemmung ihrer Funktion imstande sind, das Potenzial zu antiviralen therapeutischen Breitspektrum-Medikamenten.
  • Das Nucleocapsid (NC) Protein NCp7 von HIV-1 enthält zwei Zinkfinger, die von nur sieben Aminosäuren getrennt sind (Henderson (1992) J. Virol. 66:1856). Beide Finger sind essenziell für die Infektiosität (Aldovini (1990) J. Virol. 64:1920; Gorelick (1990) J. Virol. 64:3207). So ist HIV-1 Nucleocapsid ein besonders empfindliches Ziel für Zinkfinger-inaktivierende Reagenzien. Es weist alle Evidenz auf eine vollständige Konservierung der chelatbildenden Reste und einiger anderer Schlüsselreste im Finger hin. Die Mutation eines dieser Reste ergibt einen Verlust oder eine schwere Beeinträchtigung der Virus-Infektiosität. Auch Mutationen, welche die Metall-Ion-chelatbildenden Eigenschaften des Fingers bewahren (CCHC zu CCHH oder CCCC), ergeben einen Verlust von Infektiosität. Es gibt demnach keine bekannte Evidenz für einen Mutationsweg einfacher oder multipler Mutationen, der zu einer Wiederherstellung der Proteinaktivität führt.
  • Verschiedene C-Nitroso-Verbindungen und Disulfidhaltige Verbindungen, wie Cystamin, Thiamindisulfid und Disulfiram, können Zinkfinger-Cysteinthiolate oxidieren und intra- und inter-molekulare Disulfid-Vernetzung induzieren, vgl. z.B. McDonnell (1997) J. Med. Chem. 40:1969-1976; Rice (1997) Nature Medicine 3:341-345; Rice (1997) Antimicrob. Agents and Chemotherapy 41:419-426; Rice (1996) J. Med. Chem. 39:3606-3616; Rice (1996) Science 270:1194-1197; 20 Rice (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:9721-9724; Rice (1993) Nature 361:473-475. Vgl. auch Henderson, et al., WO 96/09406 . Cysteinthiole in jedem der zwei Zinkfinger werden rasch attackiert von Reagenzien wie Cu+2, Fe+3, C-Nitroso-Verbindungen, Disulfiden, Maleimiden, α-halogenierten Ketonen und Stickoxidderivaten, bei gleichzeitigem Verlust der nativen Proteinstruktur. Beispielsweise induziert die Behandlung von intaktem HIV-1 mit einem Oxidierungsmittel, wie z.B. 3-Nitroso-Benzamid, einer C-Nitroso-Verbindung, die Disulfidbindung des Nucleocapsid-Proteins und inaktiviert die virale Infektiosität durch die Oxidierung der Zinkfinger (Rice (1993) Nature 361:473; Rice (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:9721-9724). C-Nitroso-Verbindungen können auch eukaryotische CCHC Zinkfinger-haltige Poly(ADP-ribose) Polymerase inaktivieren (Buki (1991) FEBS Letters 290:181). Allerdings tendieren diese Verbindungen zur Toxizität, weisen eine schlechte Löslichkeit und Bioverfügbarkeit auf und werden in biologischen Lösungen reduziert und inaktiviert.
  • Die neuartigen Thiolester der Erfindung interagieren mit dem Zinkfinger eher über ihre Thiolester-Komponente als eine elektrophile S-S-Komponente. Den resultierenden Thiolestern fehlt es an S-S elektrophilen Komponenten. Weniger nucleophile Gruppen werden zur Markierung von Zinkfingermotiven verwendet. Folglich haben sie im Vergleich zu vielen Disulfid-Reagenzien deutlich verstärkte Eigenschaften. Sie verfügen über eine reduzierte Zelltoxizität. Sie haben eine erhöhte antivirale Aktivität und eine bessere Reaktivität mit Zinkfinger-Komponenten, insbesondere dem Zinkfinger auf dem NCp7 Nucleocapsid-Protein des HIV-1. Die Thiolester der Erfindung besitzen erhöhte Wasserlöslichkeiten. Sie bewahren die Zinkfinger-Reaktivität in Anwesenheit reduzierender Agenzien. Die Kombination verbesserter Eigenschaften, insbesondere der Widerstand gegen die Reduktion in einer biologischen Lösung, erhöht in den Thiolestern der Erfindung eindeutig deren In-vitro- und In-vivo-Verwendbarkeit und verbessert die therapeutische Anwendbarkeit.
  • Definitionen
  • Zum leichteren Verständnis der Erfindung werden nachstehend einige Termini definiert.
  • Der Ausdruck "Alkyl" bezeichnet hier ein verzweigtes oder unverzweigtes, gesättigtes oder ungesättigtes, monovalentes Kohlenwasserstoffradikal mit 1-30 Kohlenstoffatomen und vorzugsweise 4-20 Kohlenstoffatomen und meistbevorzugt 6-18 Kohlenstoffatomen. Wenn die Alkylgruppe 1-6 Kohlenstoffatome hat, wird sie als "niedriges Alkyl" bezeichnet. Geeignete Alkylradikale umfassen beispielsweise Strukturen, die ein oder mehrere Methylen-, Methin- und/oder Methyn-Gruppen enthalten. Verzweigte Strukturen besitzen ein Verzweigungsmotiv wie i-Propyl, t-Butyl, i-Butyl, 2-Ethylpropyl usw.. In diesem Zusammenhang schließt der Terminus "substituierte Alkyle" ein. "Substitutiertes Alkyl" bezieht sich auf Alkyl wie oben beschrieben, einschließlich einer oder mehrerer Funktionsgruppen, wie niedriges Alkyl, Aryl, Acyl, Halogen (d. h. Alkylhalos, z.B. CF3), Hydroxy, Amino, Alkoxy, Alkylamino, Acylamino, Thioamido, Acyloxy, Aryloxy, Aryloxyalkyl, Mercapto, Thia, Aza, Oxo, gesättigte und ungesättigte zyklische Kohlenwasserstoffe und Heterozyklen. Diese Gruppen können an jeden Kohlenstoff der Alkyl-Komponente gebunden sein. Zusätzlich können diese Gruppen an der Alkylkette hängen oder in diese integriert sein.
  • Der Ausdruck "Alkoxy" bezeichnet hier die COR-Gruppe, wobei R ein niedriges Alkyl, substituiertes niedriges Alkyl, Aryl, substituiertes Aryl, Arylalkyl oder substituiertes Arylalkyl ist, wobei die Alkyl-, Aryl-, substituierten Aryl-, Arylalkyl- und substituierten Arylalkyl-Gruppen wie hier beschrieben sind. Geeignete Alkoxyradikale sind beispielsweise Methoxy, Ethoxy, Phenoxy, substituiertes Phenoxy, Benzyloxy, Phenethyloxy, t-Butoxy usw.
  • Der Ausdruck "Alkylamino" bezeichnet sekundäre und tertiäre Amine, wobei die Alkyl-Gruppen entweder identisch oder unterschiedlich sind und so sind wie hier für "Alkylgruppen" beschrieben.
  • Der Ausdruck "Aryl" bezeichnet hier eine aromatische Substituente, die ein einzelner aromatischer Ring oder mehrere aromatische Ringe sein kann, welche verschmolzen, kovalent verknüpft oder mit einer gemeinsamen Gruppe verbunden sind, etwa einer Methylen- oder Ethylen-Komponente. Die gemeinsame Bindungsgruppe kann auch ein Carbonyl sein, wie in Benzophenon. Der aromatische Ring bzw. die aromatischen Ringe kann (können) unter anderen Phenyl, Naphthyl, Biphenyl, Diphenylmethyl und Benzophenon enthalten. Der Ausdruck "Aryl" schließt "Arylalkyl" ein. "Substituiertes Aryl" bezeichnet Aryl wie oben beschrieben, einschließlich einer oder mehrerer Funktionsgruppen, wie niedriges Alkyl, Acyl, Halogen, Alkylhalos (z.B. CF3), Hydroxy, Amino, Alkoxy, Alkylamino, Acylamino, Acyloxy, Phenoxy, Mercapto und gesättigte sowie ungesättigte zyklische Kohlenwasserstoffe, die mit dem (den) aromatischen Ring(en) verschmolzen, kovalent verknüpft oder mit einer gemeinsamen Gruppe verbunden sind, wie eine Methylen- oder Ethylen-Komponente. Die Bindungsgruppe kann auch ein Carbonyl sein, wie in Cyclohexylphenylketon. Der Ausdruck "substituiertes Aryl" schließt "substituiertes Arylalkyl" ein.
  • Der Ausdruck "Arylalkyl" bezeichnet hier eine Untergruppe von "Aryl", in der die Arylgruppe weiter an eine Alkylgruppe gebunden ist, wie hier definiert.
  • "Kontaktieren" bezeichnet hier den Vorgang, die Teilnehmer einer Reaktion in adäquate Nähe zueinander zu bringen, so dass die Reaktion stattfinden kann. Insbesondere kann der Ausdruck "Kontaktieren" hier austauschbar mit folgenden benützt werden: kombiniert mit, hinzugefügt zu, gemischt mit, übergeben, überflutet usw..
  • Der Ausdruck "Gag-Pol-Protein" bezeichnet hier das Polyprotein-Translationsprodukt von HIV-1 oder anderer Retroviren, wie z.B. beschrieben von Fehrmann (1997) Virology 235: 352359; Jacks (1988) Nature 331: 280-283. Das "Gag-Protein" wird durch eine Virusprotease verarbeitet, um reife Virusproteine zu ergeben, vgl. z.B. Humphrey (1997) Antimicrob. Agents Chemother. 41: 1017-1023; Karacostas (1993) Virology 193: 661-671.
  • Der Ausdruck "Halogen" bezeichnet hier Fluor-, Brom-, Chlor- und Iod-Atome.
  • Der Ausdruck "isoliert" bedeutet hier, wenn er sich auf ein Molekül oder eine Zusammensetzung wie beispielsweise ein Thiolester der Erfindung, ein Thiolester-komplexgebundenes Polypeptid oder Virus oder ein Thiolester-inaktiviertes Virus bezieht, dass das Molekül oder die Zusammensetzung von mindestens einer anderen Verbindung getrennt ist, wie von einem Protein, anderen Nukleinsäuren (z.B. RNAs) oder anderen Kontaminanten, mit denen es (sie) in vivo oder in seinem (ihrem) natürlichen Zustand assoziiert ist. So wird eine Verbindung, ein Polypeptid oder ein Virion als isoliert betrachtet, wenn es von einer anderen Komponente isoliert worden ist, mit dem es natürlicher Weise assoziiert ist, z.B. einer Zellmembran, wie in einem Zellextrakt, Serum. Eine isolierte Zusammensetzung kann jedoch auch im wesentlichen rein sein. Eine isolierte Zusammensetzung kann in einem homogenen Zustand und in einer trockenen oder einer wässrigen Lösung sein. Die Reinheit und Homogenität kann beispielsweise mit Hilfe analytischer chemischer Techniken festgestellt werden, wie beispielsweise Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (SDS-PAGE) oder Hochdruck-Flüssigchromatographie (HPLC).
  • Der Ausdruck "Nucleocapsid-Protein" oder "NC-Protein" bezeichnet hier das Retrovirus-Nucleocapsid-Protein, das ein integrierter Teil des Virion-Nucleocapsids ist, wo es das dimere RNA-Genom beschichtet, wie z.B. beschrieben von Huang (1997) J. Virol. 71: 4378-4384; Lapadat-Tapolsky (1997) J. Mol. Biol. 268: 250-260. Das Nucleocapsid-Protein des HIV-1 wird als "NCp7" bezeichnet, vgl. auch Demene (1994) Biochemistry 33: 11707-11716.
  • Der Ausdruck "Retrovirus" bezeichnet hier Viren der Retroviridae-Familie, die typischerweise eine durch Revertase transkribierte ssRNA aufweisen, wie beispielsweise definiert von P. K. Vogt, "Historical introduction to the general properties of retroviruses," in Retroviren, Hrsg. J. M. Coffin, S. H. Hughes und H. E. Varmus, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1997, S. 1-26; Murphy et al. (Hrsg.) Archives of Virology/Supplement 10, 586 pp (1995) Springer Verlag, Wien, NY; und die Webseite für das Committee an International Taxonomy of Viruses, Virology Division of the International Union of Microbiology Society unter http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ICTV/ für die Virenklassifikation und Taxonomie. Die Mitglieder der Familie Retroviridae, welche Zinkfingermotiv-haltige Polypeptide enthalten und deren Replikation durch die Thiolester der Erfindung gehemmt werden kann, umfassen Vogelsarkom- und Leukose-Retroviren (α-Retroviren), Säugetier-B-Typ-Retroviren (Betaretroviren) (z.B. Maus-Mammatumorviren), Human-T-Zellen-Leukämie- und Rinderleukämie-Retroviren (Deltaretroviren) (z. B. Human-T-lymphotropes Virus 1), Rattenleukämie-verwandte Gruppe (Gammaretroviren), D-Typ-Retroviren (Epsilonretroviren) (z. B. Mason-Pfizer-Affenvirus 1) und Lentiviren. Zu den Lentiviren gehören Rinder-, Pferde-, Schaf-/Ziegen- und Primaten-Lentivirusgruppen, wie das Human-Immundefizit-Virus 1 (HIV-1). Beispiele spezifischer Spezies von Viren, deren Replikationskapazität von den Thiolestern der Erfindung beeinträchtigt wird, sind HIV-1-, HIV-2-, SIV-, BIV-, EIAV-, Visna-, CaEV-, HTLV-1-, BLV-, MPMV-, MMTV-, RSV-, MuLV-, FeLV-, BaEV- und SSV-Retroviren.
  • Die Ausdrücke "Thiolester" und "Thioester" können hier austauschbar benützt werden, und sie bezeichnen eine chemische Struktur, G-S-(C=O)-G', wobei G und G' je zwei Gruppierungen von Atomen darstellen; und jede chemische Struktur, die aus einer Sauerstoff-basierten Carbonyl-Gruppe besteht, die direkt mit einem Schwefelatom im -2-Oxidationszustand verknüpft ist. Die Kohlenstoff- und Schwefelatome sind wiederum direkt mit je zwei Atomgruppierungen verknüpft; mithin: G-S-(C=O)-G'.
  • Der Ausdruck "Zinkfinger" bezeichnet hierin ein Polypeptidmotiv, bestehend aus Zysteinen und/oder Histidinen, die Metall-Ionen koordinieren und Strukturen entstehen lassen, die an Protein/Nukleinsäure- und/oder Protein/Protein-Interaktionen beteiligt sind. Die Thiolester der Erfindung sind geeignet, Metall-Ionen von einem Zinkfinger in vitro zu trennen. Typischerweise ist das Metall-Ion ein divalentes Kation, wie Zink oder Cadmium. Ein Zinkfingermotiv-haltiges Protein ist im allgemeinen eine hoch konservierte und essenzielle Struktur in Viren. Zinkfingermotive kommen im Human-Papillomavirus (HPV) vor, insbesondere in den HPV E6 und E7-Proteinen (vgl. z.B. Ullman (1996) Biochem J. 319: 229-239) und im Influenzavirus (vgl. z.B. Nasser (1996) 3. Virol. 70:8639-8644). In den meisten Unterfamilien der Retroviridae, einschliesslich Vogelsarkom- und Leukose-Retroviren, Säugetier-B-Typ-Retroviren, Human-T-Zellen-Leukämie- und Rinderleukämie-Retroviren, D-Typ-Retroviren und Lentiviren, ist das unveränderliche Zinkfingermotiv die höchstkonservierte Struktur. Retrovirus-Nucleocapsid-, Gag- und Gag-Pol-Proteine haben Zinkfingermotive. In Retroviren besteht das Zinkfingermotiv in der Regel aus 14 Aminosäuren, wobei vier Reste invariant sind: Cys(X)2Cys(X)4His(X)4 Cys, und wird daher als "CCHC-Zinkfinger" bezeichnet (Henderson (1981) J. Biol. Chem. 256:8400). Es cheliert Zink durch sein Histidinimidazol und seine Cysteinthiolate (Berg (1986) Science 232: 485; Bess (1992) 3. Virol. 66: 840; Chance (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 10041; South (1990) Adv. Inorg. Biochem. 8: 199; South (1990) Biochem. Pharmacol. 40: 123-129). CCHC-Zinkfinger nehmen essenzielle Funktionen in der Retrovirus-Infektiosität wahr, wie die Verpackung der Genom-RNA. Sie sind auch essenziell für frühe Ereignisse in der Virusinfektion.
  • Der Ausdruck "geeignet, ein Metall-Ion von einem Zinkfinger in vitro zu trennen oder besitzt antivirale Wirkung" bedeutet, dass ein Thiolester im Geltungsbereich der Erfindung ist, wenn er unter Anwendung eines In-vitro-Assays, von denen mehrere hier beschrieben sind, in der Lage ist, ein Metall-Ion von einem Zinkfinger in jedem Grad zu trennen. Die Feststellung der Trennung eines Metall-Ions von einem Zinkfinger kann beispielsweise unter Anwendung einer Kapillar-Elektrophorese, von Immunblotting, Kernspinresonanz (NMR), Hochdruck-Flüssig-Chromatographie (HPLC), Feststellen der Freiwerdung von radioaktivem Zink-65, Feststellen von Fluoreszenz und Feststellen einer Gelmobilitätsänderung durchgeführt werden. Der Ausdruck bedeutet auch, dass ein Thiolester im Geltungsbereich der Erfindung ist, wenn er in einem Assay antivirale Wirkung zeigt, z.B. in dem hier beschriebenen XTT Cytoprotektion Assay. Beispielsweise befindet sich ein Thiolester mit jedem Grad von messbarer antiviraler Wirkung im Geltungsbereich der Erfindung, auch wenn keine Metall-Ion-Trennung feststellbar ist.
  • Die Ausdrücke "hemmen die Übertragung des Virus" und "antivirale Wirkung" bezeichnen die Fähigkeit eines Thiolesters, die viral-replikative Kapazität irgendwie negativ zu beeinflussen. Eine solche Hemmung der Übertragung, z.B. der Verlust an replikativer Kapazität, kann mit jedem in der Fachwelt bekannten Mittel gemessen werden. Beispielsweise hemmt ein Thiolester der Erfindung die Übertragung des Virus (besitzt antivirale Wirkung), wenn es die Fähigkeit eines Virus verringert, Nachkommenschaft zu erzeugen, (wenn in Form eines Virions) mit einer Zelle zu verschmelzen, in eine Zelle einzudringen, aus einer Zelle hervorzugehen, intrazellulär oder extrazellulär zu überleben, sein RNA-Genom umgekehrt zu transkribieren, Virusproteine zu translatieren, Polyproteine mit Proteasen zu verarbeiten oder eine intrazelluläre Versammlung von Virenkomponenten in ein Kapsid zu bewirken. Die Fähigkeit eines Thiolesters der Erfindung, die Übertragung eines Virus zu hemmen, wird nicht von chemischen oder biologischen Mechanismen oder Wegen begrenzt. Ein Thiolester kann die Übertragung eines Virus hemmen (die replikative Kapazität verringern) z.B. durch Bindung an ein Nucleocapsid-Protein, wie NCp7; Verhinderung der Bindung von NCp7 an Virus-RNA oder eine andere Nukleinsäure; Beteiligung an einem spezifischen chemischen Angriff mit dem Ergebnis einer stabilen Adduktbildung; Bildung intrazellulärer Disulfidbindungen als Ergebnis des Zusammenbruchs instabiler NCp7-Verbindungs-Addukte; Interaktion mit anderen konservierten oder nicht-konservierten Resten im NCp7 Protein, die einen Funktionsverlust ergibt.
  • Allgemeine Verfahren
  • Die vorliegende Erfindung schafft eine neuartige Gattung von Thiolester-Verbindungen, die geeignet sind, ein Metall-Ion in vitro von einem Zinkfinger zu trennen. Der Fachmann erkennt, dass die Thiolester der Erfindung unter Zuhilfenahme einer Reihe von Verfahren und Methoden synthetisiert werden können, die in der wissenschaftlichen und in der Patentliteratur gut dokumentiert sind, z.B. Organic Syntheses Collective Volumes, Gilman et al. (Eds) John Wiley & Sons, Inc., NY; Venuti (1989) Pharm Res. 6: 867-873. Die Erfindung kann in Verbindung mit jeder in der Fachwelt bekannten Methode bzw. jedem Protokoll praktiziert werden, die in der wissenschaftlichen und in der Patentliteratur gut beschrieben sind. Deshalb werden hier nur wenige allgemeine Techniken beschrieben, bevor die spezifischen Methoden und Beispiele mit Bezug auf die neuartigen Thiolester und Methoden der Erfindung diskutiert werden.
  • Alle organischen Reagenzien und Zwischenprodukte wurden von Sigma/Aldrich (St Louis, MO) und Lancaster Synthesis, Inc. (Windham, NH) bezogen. Die Lösungsmittel und anderen Chemikalien waren analysenrein. Die Struktur und Zusammensetzung aller Verbindungen wurden mit 1H NMR und EI MS verifiziert und mit Silica-Layer-TLC analysiert, Elution mit Methanol/Essigsäure (6: 4) für Thiolester, einschließlich des Chemotyps Pyridinioalkanoyl-Thioester (PATE), und Chloroform/Methanol (9:1) für die anderen.
  • Die Thiolester der Erfindung werden zur Inaktivierung Zinkfinger-haltiger Retroviren verwendet, wie beispielsweise HIV-1, indem die Zinkfinger attackiert und das Zink von diesen ausgestossen wird. Für einschlägig bewanderte Fachleute ist es unmittelbar einleuchtend, dass ein einmal inaktivierter Retrovirus beispielsweise als Impfstoff, Prophylaktikum oder als Komponente in Standard-ELISA-Assays für die Diagnose von Retrovirusinfektionen verwendet werden kann. Die Herstellung und Verwendung dieser neuartigen Zusammensetzungen und Methoden kann die Anwendung unterschiedlicher Standardverfahren und Reagenzien mit sich bringen. Auch Ausrüstungssätze zur Identifizierung von Verbindungen, die mit HIV-1 CCHC Zinkfingern reagieren können, werden geschaffen. Zusätzlich zu den neuartigen Zusammensetzungen der Erfindung beinhalten diese Ausrüstungssätze (Kits) unterschiedliche Standardverfahren und Reagenzien.
  • Die nachstehende Diskussion der allgemeinen Methoden, die im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung angewendet werden können, hat lediglich illustrativen Charakter. Nach Prüfung dieser Offenbarung werden sich für einschlägig bewanderte Fachpersonen auch andere Methoden und Ausführungsbeispiele anbieten.
  • Synthese des Chemotyps Disulfidbenzamid, Verbindung 2D
  • Es folgt ein exemplarisches Mittel zur Synthetisierung der Verbindung 2D wie in Tabelle 1 beschrieben ("D" bezeichnet in der Notierung der Tabelle 1 eine Dimer-Form oder "D-Form") oder N,N'-(2,2'-Dithiodibenzoyl)-bis-sulfacetamid. Das Ausgangsmaterial 2,2'-Dithiodi-benzoylchlorid wurde synthetisiert wie von Katz (1953) J. Org. Chem 18: 1380-1402; Baggaley (1985) J. Med. Chem. 28: 1661-1667 beschrieben. Einer Lösung von Sulfacetamid (13 g, 60 mmol) in Pyridin (300 ml) wurde bei Raumtemperatur (RT) tropfenweise eine Lösung von 2,2'-Dithiodibenzoylchlorid (85%, 8,1 g, 20 mmol) in 1,4-Dioxan (100 ml) zugegeben. Die klare, rotbraune Lösung wurde bei RT über Nacht gerührt, dann in heftig aufgerührten Ethylether (1 L) geleert. Der visköse Flüssigkeitsniederschlag wurde von der Etherphase getrennt, in N,N-Dimethylformamid (DMF, annähernd 50 ml) gelöst und tropfenweise zu 800 ml heftig aufgerührtem, wässrigem 3 M HCl hinzugefügt. Der weisse Niederschlag wurde ausgefiltert, mit Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet. Ertrag: 11 g (78%). Das Rohprodukt (1 g) wurde in heissem Ethanol (20 ml) gelöst. Das heisse Filtrat wurde zu aufgerührtem Wasser (200 ml) hinzugefügt. Der weisse Niederschlag wurde ausgefiltert und getrocknet. Ertrag: 0,85 Gramm (85%) reine 2D. 1H NMR (DMSO-d6), (12,08 (s, 1H, HNSO2), 11,04 (s, 1H, HN-Ph), 8,01 (AB q, 4H, H-Ph), 7,87 (d, 1H, J=7,6 Hz, H-Ph), 7,81 (d, 1H, J=7,8 Hz, H-Ph), 7,59 (t, 1H, J=7,7 Hz, H-Ph), 7,46 (t, 1H, J=7,4 Hz, H-Ph), 1,97 (s, 3H, CH3); EI MS m/z 699 (MH+); Anal. Ber. (C30H26N4O8S4): C, 51,56; H, 3,75; N, 8,02. Festgestellt: C, 51,34, H, 3,84, N, 8,05.
  • Synthese von der Chemotypen von Benzoisothiazolon, Verbindungen 2B, 22, 31, 34
  • Es folgt ein exemplarisches Mittel zur Synthetisierung der Chemotypen von Benzoisothiazolon, einschließlich Verbindung 25 gemäß Beschreibung in Tabelle 1 (das "B" bezeichnet die BITA oder Benzoisothiazolon-Form) oder N-[4-(3-oxo-3H-benz[d]isothiazol-2-yl)phenylsulfonyl]acetamid. Zwei Methoden kamen zur Anwendung. In einer Methode wurde zu einer Lösung von Verbindung 2D (0,2 g, 0,28 mmol) in Pyridin (2 ml) eine Lösung von N-Bromosuccinimid (0,18 g, 1 mmol) in 1,4-Dioxan (1 ml) hinzugefügt. Die Lösung wurde bei RT 3 Stunden gerührt und zu Wasser (30 ml) hinzugefügt. Der weisse Niederschlag wurde gesammelt und per Ausfällung von heissem Ethanol und Wasser gereinigt. Ertrag: 0,17 g (87%). 1H NMR (DMSO-d6), (12,24 (s, 1H, NH), 8,14 (d, 1H, J=8,0 Hz, H-Ph), 8,10 (s, 4H, H-Ph), 8,02 (d, 1H, J=7,8 Hz, H-Ph), 7,83 (t, 1H, J=7,0 Hz, H-Ph), 7,56 (t, 1H, J=7,6 Hz, H-Ph), 2,00 (s, 3H, CH3); EI MS m/z 349 (MH+); Anal. Ber. (C15H12N2O4S2): C, 51,71; H, 3,47; N, 8,04. Festgestellt: C, 51,42, H, 3,57, N, 8,04.
  • Das zweite Verfahren diente zur Synthetisierung der Verbindung 28, Verbindung 22 BITA, Verbindung 31 BITA und Verbindung 34 BITA (vgl. Tabelle 1). Zu einer Mischung aus 2,2'-Dithiodibenzoylchlorid (0,32 g, 0,93 mmol) in CCl4 (10 ml) wurde eine Lösung von 2,5% w/v Cl2 in CCl4 (10 ml) hinzugefügt. Die Mischung wurde gerührt, bis sie sich klärte (1h). Nach dem Filtern wurde das Filtrat 1 Stunde lang mit N2 durchperlt, und ein Lösung von Sulfacetamid (0,2 g, 0,93 mmol) in N,N-Dimethylacetamid (DMA, 4 ml) wurde hinzugefügt. Die Mischung wurde 2 h lang gerührt, Ethylether (20 ml) hinzugefügt, und der Niederschlag wurde gesammelt und mit heissem Ethanol und Wasser gereinigt. Ertrag: für Verbindung 26, 0,3 g (92%); das selbe 1H NMR und EI MS wie Methode A. Anal. Ber. (C15H12N2O4S2): C, 51,71; H, 3,47; N, 8,04. Festgestellt: C, 51,34, H, 3,64, N, 7,96.
  • Synthese des Chemotyps Spaced Disulfidbenzamid/Benzoisothiazolon, exemplarische Verbindungen 23D, 24D und 25D
  • Es folgt ein exemplarisches Mittel zur Synthetisierung der Verbindungen 23D (vgl. Tabelle 1) oder N,N'-(2,2'-Dithiodibenzoyl)-bis-4-(aminomethyl)benzol sulfonamid, 24D oder N,N-(2,2'-Dithiodibenzoyl)-bis-4-(2-aminoethyl)benzolsulfonamid und 25D oder N,N'-(2,2'-Dithiodibenzoyl)-bis-4-(glycinamido)benzolsulfonamid (vgl. Tabelle 1). Diese Verbindungen wurden zubereitet aus 4-(Aminomethyl)benzolsulfonamid (Aldrich) bzw. 4-(2-Aminoethyl)benzolsulfonamid (Aldrich), und N-Glycylsulfanilamid. Die letztere Verbindung wurde zubereitet durch Behandlung von Sulfanilamid mit equimolaren Mengen Bromacetylbromid und Pyridin in DMA und Gewinnung des bromacetylierten Derivats nach Hinzufügung der Reaktionsmischung zu überschüssigem 0,5 M HBr. Das getrocknete Rohprodukt wurde aus Ethanol rekristallisiert und über eine Standard-Gabriel-Reaktion zu N-Glycylsulfanilamid konvertiert (unter Zubereitung des Phthalimidoderivats und Spaltung mit Hydrazinhydrat). Es wurden sodann die Verfahren für die Verbindung 2D gemäß voranstehender Skizzierung absolviert.
  • Verbindung 23D: 1H NMR (DMSO-d6), (9,34 (t, 1H, J=6,1 Hz, NH), 7,85 (d, 2H, J=8,3 Hz, H-Ph), 7,79 (d, 1H, J=7,6 Hz, H-Ph), 7,70 (d, 1H, J=8,0 Hz, H-Ph), 7,59 (d, 2H, J=8,3 Hz, H-Ph), 7,51 (t, 1H, J=7,7 Hz, H-Ph), 7,37 (m, 3H, NH2 und H-Ph), 4,61 (d, 2H, J=5,9 Hz, CH2); EI MS m/z 643 (MH+); Anal. Ber. (C28H26N4O6S4): C, 52,32; H, 4,08; N, 8,72. Festgestellt: C, 52,10, H, 4,25, N, 8,53.
  • Verbindung 24D: 1H NMR (DMSO-d6), (8,81 (t, 1H, J=5,2 Hz, NH), 7,81 (d, 2H, J=8,0 Hz, H-Ph), 7,66 (d, 1H, J=8,0 Hz, H-Ph), 7,61 (d, 1H, J=7,3 Hz, H-Ph), 7,54-7,46 (m, 3H, H-Ph), 7,34 (m, 3H, NH2 und H-Ph), 3,58 (q, 2H, J=6,3 Hz, CH2-N), 3,01 (t, 2H, J=7,1 Hz, CH2-Ph); EI MS m/z 671 (MH+); Anal. Ber. (C30H30N4O6S4): C, 53,71; H, 4,51; N, 8,35. Festgestellt: C, 53,43, H, 4,68, N, 8,33.
  • Verbindung 25D: 1H NMR (DMSO-d6), (10,53 (s, 1H, HN-Ph), 9,09 (t, 1H, J=5,8 Hz, HN-CH2), 7,87-7,83 (m, 5H, H-Ph), 7,72 (d, 1H, J=7,1, H-Ph), 7,55 (t, 1H, J=7,0 Hz, H-Ph), 7,39 (t, 1H, J=7,6 Hz, H-Ph), 7,31 (s, 2H, NH2), 4,18 (d, 2H, J=3,7 Hz, CH2); EI MS m/z 729 (MH+); Anal. Ber. (C30H28N6O8S4 (H2O): C, 48,25; H, 4,05; N, 11,25. Festgestellt: C, 48,54, H, 4,12, N, 11,20.
  • Synthese des Chemotyps N-terminal modifiziertes Aminophenylsulfon, exemplarische Verbindung 34D
  • Es folgt ein exemplarisches Mittel zur Synthetisierung der Verbindung 34D (vgl. Tabelle 1) oder N,N'-(2,2'-Dithiodibenzoyl)-bis-4-sulfanilyl-N-[(2-nitrobenzyl)sulfonyl)]anilin. Die Verbindung 26 wurde ähnlich wie die Verbindung 2D hergestellt, beginnend mit 3-Aminophenylsulfon und 2,2'-Dithiodibenzoylchlorid. Zu einer Lösung von Verbindung 26 (1,5 g, 1,9 mmol) in DMA (30 ml) wurde (tropfenweise) eine Lösung von 2-Nitro-toluolsulfochlorid (1,4 g, 5,9 mmol) in 1,4-Dioxan (10 ml) hinzugefügt. Die Lösung wurde über Nacht bei RT gerührt und dann in heftig aufgerührten Ethylether (300 ml) übertragen. Nach Entfernung der Etherphase wurde die visköse Flüssigkeit mit DMF (15 ml) verdünnt. Die verdünnte Lösung wurde unter Rühren zu Wasser (200 ml) hinzugefügt. Der weisse Niederschlag wurde gesammelt und per zweimaliger Ausfällung von heissem Ethanol und Ethylether gereinigt. Ertrag: Verbindung 34D: 1,92 g (84%). 1H NMR (DMSO-d6), (11,01 (s, 1H, HN-SO2), 10,74 (s, 1H, HN-CO), 8,10-7,29 (m, 16H, H-Ph), 5,11 (s, 2H, CH2); EI MS m/z 1165 (MH+); Anal. Ber. (C52H40N6O14S6): C, 53,60; H, 3,46; N, 7,21. Festgestellt: C, 53,49, H, 3,84, N, 7,13.
  • Synthese des Chemotyps 2,3-Haloalkanoamidbenzamid, exemplarische Verbindung 37
  • Es folgt ein exemplarisches Mittel zur Synthetisierung von Verbindung 37 (vgl. Tabelle 1) oder N-[2-(3-Chlorpropionamido)benzoyl]sulfacetamid. N-(2-Nitrobenzoyl)sulfacetamid wurde ähnlich hergestellt wie 2D, ausgehend allerdings von 2-Nitrobenzoylchlorid. Ein Gramm (2,7 mmol) dieses Produkts wurde in Methanol (100 ml) bei 45°C gelöst. Die Lösung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und dann mit N2 durchperlt, um die Luft zu entfernen. Zu der Lösung wurde unter N2 Palladium hinzugefügt, 10 Gewichtsprozent auf Aktivkohle, (0,22 g). Die Mischung wurde mit H2 über 1,5 h durchperlt, dann mit N2 über 0,5 h. Nach der Filtrierung wurde das Filtrat zur Trockenheit verdampft. Ertrag: 0,84 g (93%) eines weissgelben Produkts. Dieses 2-Aminobenzamidderivat wurde mit 3-Chlorpropionylchlorid unter Bedingungen zur Reaktion gebracht, die den für die Verbindung 34D beschriebenen entsprechen, woraus sich die Verbindung 37 ergab. 1H NMR (DMSO-d6), (12,06 (s, 1H, NH-SO2) 10,84 (s, 1H, NH-Ph), 10,32 (s, 1H, NH-Ph), 8,03-7,91 (m, 5H, H-Ph), 7,76 (d, 1H, J=7,7 Hz, H-Ph), 7,60 (t, 1H, J=7,8 Hz, H-Ph), 7,32 (t, 1H, J=7,6 Hz, H-Ph), 3,87 (t, 2H, J=6,1 Hz, CH2Cl), 2,86 (t, 2H, J=6,2 Hz, CH2), 2,00 (s, 3H, CH3); EI MS m/z 424 (MH+); Anal. Ber. (C18H18N3O5SC1): C, 51,00; H, 4,28; N, 9,91. Festgestellt: C, 50,85, H, 4,49, N, 9,96.
  • Synthese des Chemotyps Haloalkanoylthioester, exemplarische Verbindung 44
  • Es folgt ein exemplarisches Mittel zur Synthetisierung von Verbindung 44 (vgl. Tabelle 1) oder N-[2-(5-Bromovaleroylthio)benzoyl]sulfacetamid. N-(2-Mercaptobenzoylsulfacetamid wurde zunächst hergestellt durch Hinzufügen zu einer Lösung von 2D (2,2 g, 3,1 mmol) in 90% DMF (20 ml), tris(2-Carboxyethylphosphinhydrochlorid (1 g, 3,5 mmol) und Triethylamin (0,5 ml). Die Lösung wurde 1h gerührt und dann zu 0,5 M HCl (200 ml) hinzugefügt. Der Niederschlag wurde gesammelt und getrocknet, woraus sich 2,3 g (95%) ergaben. Zu einer Lösung dieses Produkts (0,5 g, 1,4 mmol) in DMA (5 ml) wurde unter N2 5-Bromovalerylchlorid (0,6 ml, ~4,5 mmol) hinzugefügt. Die Lösung wurde unter N2 über 1h gerührt und zu Ethylether (50 ml) hinzugefügt. Nach Abgießen der Etherphase wurde die restliche visköse Flüssigkeit in DMF (10 ml) gelöst. Die Lösung wurde zu heftig gerührtem Wasser (100 ml) hinzugefügt. Der weisse Niederschlag wurde ausgefiltert und von heißem Ethanol und Wasser gereinigt. Ertrag Verbindung 44: 0,47 g (65%). 1H NMR (DMSO-d6), (12,05 (s, 1H, HNSO2), 10,91 (s, 1H, HN-Ph), 7,94 (s, 4H, H-Ph), 7,74-7,61 (m, 4H, H-Ph), 3,48 (t, 2H, J=6,3 Hz, CH2Br), 2,74 (t, 2H, J=7,1 Hz, CH2CO), 1,96 (s, 3H, CH3), 1,90-1,64 (m, 4H, CH2CH2); EI MS m/z 515 (MH+); Anal. Ber. (C20H21N2O2S2Br): C, 46,79; H, 4,12; N, 5,46. Festgestellt: C, 47,16, H, 4,31, N, 5,60.
  • Synthese des Chemotyps Pyridinioalkanoylthioester, exemplarische Verbindung 45
  • Es folgt ein exemplarisches Mittel zur Synthetisierung von Verbindung 45 (vgl. Tabelle 1) oder N-[2-(5-Pyridinio-valeroylthio)benzoyl]sulfacetamidbromid. Eine Lösung von Verbindung 44 (0,25 g, 0,49 mmol) in Pyridin (7 ml) wurde unter N2 über Nacht aufgerührt. Ethylether (80 ml) wurde hinzugefügt, und der weisse Niederschlag wurde gesammelt und von heissem Wasser und Ether gereinigt; der Niederschlag wurde unverzüglich in Vakuum getrocknet. Ertrag: Verbindung 45, 0,21 g (72%). 1H NMR (DMSO-d6), (12,10 (br. s, 1H, HNSO2), 10,94 (s, 1H, HN-Ph), 9,12 (d, 2H, J=6,1 Hz, 2,6-H-Py), 8,65 (t, 1H, J=7,2 Hz, 4-H-Py), 8,21 (t, 2H, J=7,0 Hz, 3,5-H-Py), 7,94 (S, 4H, H-Ph), 7,74-7,58 (m, 4H, H-Ph), 4,62 (t, 2H, J=7,2 Hz, CH2-Py), 2,79 (t, 2H, J=7,2 Hz, CH2-CO), 1,92 (m, 5H, CH3 und CH2), 1,57 (Pentet, 2H, J=7,6 Hz, CH2); EI MS m/z 512 (M+); Anal. Ber. (C25H26N3O5S2Br): C, 50,68; H, 4,42; N, 7,09. Festgestellt: C, 50,54, H, 4,68, N, 7,22.
  • Synthese von Thiolestern, die durch Schema I repräsentiert sind Es folgt ein exemplarisches Mittel zur Synthetisierung der durch Schema I repräsentierten Thiolester-Verbindungen. Wie oben erörtert, kann eine Fachperson jedes synthetische Schema oder jede Variation eines exemplarischen Protokolls verwenden, um einen Thiolester der Erfindung zu erzeugen.
  • Wenn der Thiolester N-[2-(α-Pyridinio-4-toluoylthio)benzoyl]sulfacetamidchlorid ist, wurde eine Lösung von N-(2-Mercaptobenzoyl)sulfacetamid (vgl. Synthese der Verbindung 44) (0,4 g) und 4-(Chloromethyl)benzoylchlorid (0,6 ml) in Dimethylacetamid (2 ml) über 1 h unter Stickstoff gerührt und dann unter Rühren zu Ethylether (40 ml) hinzugefügt. Der visköse flüssige Niederschlag wurde mit Dimethylformamid (1 ml) verdünnt und dann zu einer Lösung von Ether (40 ml) und Heptan (40 ml) hinzugefügt. Der visköse flüssige Niederschlag wurde gesammelt und zu Pyridin (3 ml) hinzugefügt. Die Lösung wurde bei RT unter Ar 3 Tage aufgerührt und zu Ether (50 ml) hinzugefügt. Der Niederschlag wurde gesammelt und getrocknet. Das Rohprodukt wurde auf einer Silicagelsäule unter Verwendung einer isokratischen Elution mit 10% AcOH in MeOH gereinigt.
  • Wenn der Thiolester N-[2-(2-(Pyridinioacetamido)benzoylihio)benzoyl]sulfacetamidchlorid ist, wurde ein Analog der Verbindung 37 auf die gleiche Weise zubereitet, ausgenommen dass das Chloracetylchlorid für 3-Chlorpropionylchlorid ersetzt wurde. Dieses Produkt wurde in Pyridin gelöst und bei RT stehen gelassen, und das Produkt wurde wie oben für N-[2-(-Pyridinio-4-toluoylthio)benzoyl]sulfacetamidchlorid beschrieben aufgearbeitet.
  • Wenn der Thiolester N-[2-(Pyridinioacetamidoacetylthio)benzoyl]sulfacetamidchlorid ist, wird N-(2-Mercaptobenzoyl)sulfacetamid wie für Verbindung 44 beschrieben zubereitet. Chloracetylglycin kann mit der Thiol-Gruppe dieses Produkts verknüpft werden, nachdem die Glycincarbonylgruppe über ein (a) ein p-Nitrophenylesterderivat oder (b) ein mit Hilfe von Oxalylchlorid zubereitetes Säurechlorid aktiviert wurde. Die Aufarbeitung und die anschließende Reaktion mit Pyridin wird durchgeführt wie oben für N-[2-(α-Pyridinio-4-toluoylthio)benzoyl]sulfacetamidchlorid beschrieben.
  • Wenn der Thiolester N-[2-(2-(Pyridinioacetamido)isobutyrylthio)benzoyl]sulfacetamidchlorid ist, kann die Verbindung auf ähnliche Weise zubereitet werden wie N-[2-(Pyridinioacetamidoacetylthio)benzoyl]sulfacetamidchlorid gemäss Beschreibung oben, ausgenommen dass N-Chloracetyl-2-Aminoisobuttersäure (zubereitet nach Birnbaum (1952)). Biol. Chem. 194:455 und Ronwin (1953) J. Org. Chem. 18:127,) für Chloracetylglycin substituiert ist.
  • Wenn der Thiolester N-[2-(5-Dimethylsulfoniovaleroylthio)benzoyl]sulfacetamidiodid ist, wobei Z = =S+ (CH3)2 und Y = -(CH2)4-: eine Mischung der Verbindung 44 (1,10 g) und NaI (5 g) in Aceton (99,9%, 25 ml) wurde unter Stickstoff bei RT über Nacht gerührt und dann unter Rühren zu Wasser (250 ml) hinzugefügt. Der weisse Niederschlag wurde gesammelt und getrocknet. Ertrag: 1,2 g. Eine klare Lösung dieses Produkts (0,3 g) in Acetonitril (3 ml) und Methylsulfid (4 ml) wurde bei RT über Nacht aufgerührt. Die klare Lösung wurde unter heftigem Rühren zu Ethylether (250 ml) hinzugefügt. Der weisse Niederschlag wurde gesammelt, mit Ether gewaschen und getrocknet. Ertrag: 0,15 g.
  • Wenn der Thiolester N-[2-(5-Triethylammoniovaleroylthio)benzoyl]sulfacetamidiodid ist, wobei Z = -N+ (C2H5)3 und Y = -(CH2)4-: eine parallele Synthese zu N-[2-(5-Dimethylsulfoniovaleroylthio)benzoyl]sulfacetamidiodid kann durch geführt werden, wobei Triethylamin für Methylsulfid substituiert wird. Zum Abschluss der Reaktion mit Triethylamin kann ein Reflux vonnöten sein.
  • Wenn der Thiolester N-[2-(5-Tri-n-butylphosphoniovaleroylthio)benzoyl]sulfacetamidiodid ist, wobei Z = -P+(C4H9)3 und Y = -(CH2)4-: eine parallele Synthese zu N-[2-(5-Dimethylsulfoniovaleroylthio)benzoyl]sulfacetamidiodid kann durchgeführt werden, wobei Tri-n-butylphosphin für Methylsulfid substituiert wird.
  • Thiolester auf Basis des Schemas I, wobei R2-CH3 anstatt H ist, kann auf dieselbe Weise zubereitet werden wie die Verbindungen 44 und 45, indem 2,2'-Dithiobis(3-methylbenzoylchlorid) in der Zubereitung der Vorläuferverbindung 2D für 2,2'-Dithiodi-benzoylchlorid substituiert wird. Das 3-Methylderivat kann nach dem Verfahren von Collman und Groh (1982) J. Amer. Chem. Soc. 104:1391-1400 zubereitet werden.
  • Thiolester auf Basis von Schema I, wobei R6-CH3 ist, können wie beschrieben für die Verbindungen 44 und 45 zubereitet werden, ausgenommen, dass anstelle des Sulfacetamids N-Methyl-4-(4-nitrobenzolsulfonyl)anilin verwendet und zubereitet wird wie von Saxena (1989) Arzneim. Forsch. 39:1081-1084 beschrieben.
  • Design und Synthese von Thiolestern, die zur Trennung von Metall-Ionen von Zinkfingern geeignet sind
  • Virenzinkfinger, insbesondere der Zinkfinger im Nucleocapsid-Protein von NCp7 des BIV-1, werden als Modelle für das Design der neuartigen Thiolester der Erfindung verwendet. NCp7 besitzen Bereiche auf ihren Lösemittel-zugänglichen Oberflächen, wo günstige Interaktionen mit allfälligen Liganden stattfinden können. Jeder Zinkfinger besitzt zwei potenzielle hochaffine Bindungsstellen. Eine umfasst die putative mRNA-Bindungsstelle nahe Phe17 auf Finger 1 und Trp37 auf Finger 2. Die andere Stelle befindet sich nahe dem metallkoordinierenden Histidin in den Fingern, gegenüber der putativen mRNA-Stelle. Für die Zwecke eines Designs neuartiger Thiolester, die geeignet sind, Metall-Ionen von Zinkfingern zu trennen, wurde die Ligandenbindungsstelle gegenüber dem putativen mRNA-Bindungsbereich als stärkere der zwei in Frage kommenden Bindungsstellen betrachtet. Diese Bindungsbereiche wurden mit eine Reihe möglicher hydrophober und hydrophiler Atomtypen getestet. Die Typen mit den stärksten möglichen Bindungsinteraktionen wurden ausgewählt.
  • Weitere Modellstudien der Interaktionen von Liganden (Agenzien) mit NCp7 ergaben, dass sowohl Disulfidbenzamide (DIBAs) wie auch Benzoisothiazolonderivate (BITAS) mit hydrophoben Patches auf den Oberflächen beider Retrovirus-Zn-Finger so interagieren können, dass die Reaktionsgruppen dieser Agenzien in großer Nähe zu den nucleophilen Cystein-Schwefelatomen in den Fingern ausgerichtet werden. Im Unterschied dazu kam es infolge sterischen Ausschlusses zu keiner Interaktion zwischen DIBAs und den Cystein-Schwefelatomen in den Zn-Fingern des Transkriptionsfaktors GATA-1 (Huang (1998) J. M d. Chem. 41: 1371-1381). Disulfide und deren entsprechende BITA-Derivate wurden designed, synthetisiert und gereinigt, und die antiviralen und in vitro NCp7 Zinkausstossungsaktivitäten wurden untersucht.
    Figure 00260001
    Figure 00270001
    Figure 00280001
    Tabelle 4: 3,3' Bis(Aminophenyl)sulfon-Isomere
    Figure 00290001
    Figure 00300001
    Figure 00310001
    Figure 00320001
    Figure 00330001
    Figure 00340001
    Tabelle 7: Antiviraler Wirkmechanismus
    Verbindung
    (I50:Ma)
    Aktivitätb 44 45 47
    Integrase NIc NI NI
    Revertase
    rAdT NI NI NI
    rCdG NI NI NI
    Protease NI NI NI
    Zinkfingerreaktivität 1,8(13,3%) 3,6(34,7%) 4,1(17,9%)
    Anbindung NI NI NI
    Verschmelzung >100 77 99
    a 150 Konzentration der Verbindung, die 50% der indizierten Aktivität hemmt. b Alle positiven Kontrollen für individuelle Assays sind wie im Experimentellen Abschnitt vermerkt. c Keine Hemmung (NI = no inhibition) bei Hochdosistest von 100 μM. d Ausgedrückt als Rückgang der relativen Fluoreszenzeinheiten pro 30 Min. (RFU/30 Min), prozentueller Gesamtrückgang der Fluoreszenz in Klammern.
    Tabelle 8: Wirkung von Glutathion auf die antivirale Aktivität ausgewählter PATEs und 5-Bromovaleroylthioester
    Zinkfingerreaktivitäta
    Verbindung GSHb RFU/Min %Rückgang
    44 – 6,5 60,1
    + 2,4 28
    45 – 2,6 28,2
    + 3,8 36,9
    47 – 1,6 24,3
    + 1,6 21,1
    PBS Kontrolle – 0 0
    + 1,3 7,9
    a Zn-Finger-Reaktivität wurde mit Trp37-Fluoreszenz-Assay gemessen. Die Reaktivität wird ausgedrückt als durchschnittliche Änderung in Fluoreszenzeinheiten pro 30 Min (RFU/min) oder als prozentualer Gesamtrückgang während einer 30-Minuten-Inkubation (% Rückgang). b Die Verbindungen (2 mM) wurden 2 Stunden bei 37°C mit 4 mM reduziertem Glutathion behandelt. Nach der Inkubation wurden die Reaktionen auf eine abschliessende Konzentration von μM verdünnt und die Aktivität in der Trp37 Zn-Ausstossung so wie oben beschrieben bestimmt.
    Tabelle 9: Übersicht Zinkfinger-Reaktivität für Verbindungen 44, 45 und 47
    U1
    Verbindung NCp7 (Trp37) Virion Vernetzung Nukleinsäure Bindung (I50μM) Viruzide Aktivität (I50μM) Hemmung von p24 (EC50μM) Gag-Vorläufer Vernetzung
    44 + –/+ 100 12,3 94 +/–
    45 + +++ 1 13,2 42,2 +/–
    47 + –/+ 100 2,1 10,7 +++
  • Tabelle 10: Evaluierung struktureller Merkmale, umfassend die Pyridinioalkanoyl-Seitenkette der PATEs
    Figure 00360001
  • Disulfid und – wo synthetisch möglich – die BITA-Formen der Verbindungen 1 bis 36 wurden synthetisiert (Tabellen 1 bis 4), und ihre antivirale Aktivität wurde im XTT Cytoprotection Assay gemessen (Beschreibung unten).
  • Im wesentlichen alle Verbindungen, die für diese Studien generiert wurden, besaßen ein gewisses Maß an antiviraler Aktivität (XTT Cytoprotection Assay) und Zinkfinger-Reaktivität. Die Zinkfinger-Reaktivität wurde im Assay unter Anwendung eines Zn-spezifischen Fluorochroms, TSQ, N-(6-Methoxy-8-chinolyl)-p-toluolsulfonamid oder in einem Trp37 Zinkfinger-Fluoreszenz-Assay gemessen. Die Fluoreszenzmessungen des Trp37-Rests im C-terminalen Finger des rekombinierten HIV-1 NCp7 Proteins wurden wie von Rice (1995) Science 270: 1194-1197; Rice (1997) Antimicrob. Agents Chemother. 41: 419-426 beschrieben durchgeführt. Die Messung der Zn-Ausstoßung von beiden Fingern erfolgte unter Anwendung der Zn-selektiven Fluorchrom-Sonde TSQ (Molecular Probes, Eugene OR) wie beschrieben von Rice (1996) J. Med. Chem 39: 3606-3616. Die Messung der Fähigkeit von NCp7 zur Bindung an ein DNA-Oligomer, ein 44 mer: GGC GAC TGG TGA GTA CGC CAA AAA TTT TGA CTA GCG GAG GCT AG (SEQ ID NR: 1), analog zur HIV-1 RNA Verpackungsstelle wurde durchgeführt wie von Huang (1998) J. Med. Chem. 41: 1371-1381 beschrieben; vgl. auch Rossio (1998) HIV Pathogenesis and Treatment: Keystone Symposium an Molecular und Cellular Biology, Abstract # 4082. Kurz wurde 50 nM NCp7 wurde 1 Stunde lang bei RT in 10 ml Puffer mit 10% Glycerol und 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) mit Testverbindungen behandelt. Markiertes Oligomer (0,1 Pikomol, endmarkiert [32P]) wurde in gleichem Volumen Puffer mit 10% Glycerol, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 400 mM KCl und 40 mM MgCl2 hinzugefügt. Die Reaktion wurde 15 Min. bei Raumtemperatur aufrecht erhalten, und eine Gesamtmenge von 5 ml (oder 1/4 des gesamten Reaktionsvolumens) wurde auf nicht-denaturierenden 4,5% Polyacrylamidgels in 0,5X Tris-Borat-Elektrophoresepuffer getrennt. NCp7-Oligomerkomplexe wurden durch Autoradiographie visualisiert.
  • Unter den neuen Disulfid-basierten Analogen zeigten die Verbindungen 26, 31 und 34 keine Toxizität bei der hohen Testdosis von 316 μM (Mikromolar) und wiesen eine EC50 (Konzentration zur Hemmung von 50% der Virusreplikation) von 4,3, 12,2 bzw. 12,3 μM auf. Die zur Generierung der Verbindung 26 benützte Aminophenylsubstitution konvertierte den Ligand-Abschnitt der DIBA in ein Bis-(4-aminophenyl)sulfon. Die N-Acetylierung der Verbindung 26 ergab Verbindung 27 mit einem niedrigeren EC50 (1,5 μM), aber mit höherer Toxizität (160 μM). Die Konvertierung der Bis(aminophenyl)sulfonbrücke der Verbindung 26 zu einer Sulfonamido-Gruppe und Änderung des terminalen Amins in ein primäres Sulfonamid (Verbindung 22, Tabelle 1) ergab eine wesentlich höhere Zelltoxizität (43 μM). Allgemein gilt, wenn Disulfid/BITA-Paare synthetisiert werden konnten, ergab sich ein durchschnittlich 4-facher (n = 15, Bereich 1,5- bis 8-facher) Abfall im In-vitro-therapeutischen Index (IC50/EC50), hauptsächlich aufgrund eines Verlusts an antiviraler Kraft, d.h. erhöhten EC50-Werten. Es war keine erhöhte Zelltoxizität feststellbar. Keines der neuen Disulfide oder BITAS war der Verbindung 1 überlegen.
  • In der Molekülmodellierung zeigte sich, dass bessere Passungen von Agenzien auf die Atomoberflächen-bindenden Domänen der NCp7 Zn-Finger erreichbar sein könnten, wenn Methylen- (Verbindung 23) oder Ethylen-Spacers (Verbindung 24) in den Hauptketten zwischen der Benzamido-Kopfgruppe und der Benzolsulfonamid-Ligandengruppe der Verbindung 1 (Tabelle 2) hinzugefügt werden. Die antivirale Wirkung und Zn-Fingerreaktivität wurden erhalten, aber diese Modifizierungen waren verglichen mit der Stammverbindung 1 mit einem 4- bis 10-fachen Rückgang von IC50 (stärker zytotoxisch) assoziiert. Wie in Tabelle 2 dargestellt, zeigten die entsprechenden BITAs einen signifikanten Verlust an antiviraler Aktivität (Verbindung 23: 42-facher Rückgang, und Verbindung 24: 5-facher Rückgang), auch wenn die Reaktivität gegen gereinigtes NCp7 erhalten blieb. Weitere Modifikationen des Kopfgruppen-Spacers durch Hinzufügen einer Carbamyl-Gruppe zur Verbindung 23 (vgl. Verbindung 25) steigerte die Zinkfinger-Reaktivität (RFU/min 7,9 versus 3,3), aber verminderte die antivirale Kraft.
  • Optimierung von Bis(aminophenyl)sulfon-basierten Disulfid-Benzamiden
  • Die Einfügung von 4,4'-bis(Aminophenyl)sulfon in die Disulfid-Kopfgruppe ergab die Verbindung 26 mit einem terminalen Amin als synthetischen Ort für weitere Modifikationen. Mehrere Acyl-Modifikationen generierten die Verbindungen 27, 28 und 29, woraus eine erhöhte Zinkfinger-Reaktivität und eine verbesserte EC50 resultierten. Diese Zugewinne wurden teilweise (Verbindungen 27 und 29) und völlig (Verbindung 28) von Verringerungen der IC50 korrigiert. Soweit ergab die terminale Erweiterung des Liganden-Abschnitts von 26 kein signifikant verbessertes antivirales Agens.
  • Das BITA-Derivat der Verbindung 26 konnte nicht in ausreichender Reinheit oder Menge produziert werden, um seine Eigenschaften zu untersuchen. Allerdings wurde diese Einschränkung durch Austausch des terminalen NH2 von 26 für eine NO2-Gruppe, woraus die Verbindung 31 entstand, überwunden und die Produktion des Disulfids und seines entsprechenden BITA ermöglicht (Tabelle 3). Die Disulfidform der Verbindung 31 war, wie 26, nicht-toxisch und besaß eine äquivalente NCp7 Zinkfinger-Reaktivität, auch wenn die EC50 um das 2,6-fache zunahm (weniger effektiv). Die BITA-Form der Verbindung 31 war ohne antivirale Aktivität. Die Erforschung der Ligand-Erweiterungen mit nitro-aromatischen Gruppen führte zu den Verbindungen 32 bis 34, die im allgemeinen weniger Zinkfinger-Reaktivität zeigten als die einfachere Nitrogruppe, wie in Verbindung 31. Nur die Disulfid- und BITA-Formen der Verbindung 34 zeigten signifikante antivirale Aktivität.
  • Die Neuanordnung der Sulfonyl-Gruppe in 3,3'-bis(Aminophenyl)sulfonen schaffte Isomere, Verbindungen 35 und 36, Tabelle 4. Diese Verbindungen haben die antiviralen Aktivitäten verbessert (Verbindung 26 vs. Verbindung 35: EC50 4,3 zu 1 mM; 27 vs. 36: EC50 1,5 zu 0,62 mM). Allerdings war die Zinkfinger-Reaktivität signifikant reduziert (26 vs. 35: 3,3 zu 0,92 RFU/min; 27 vs. 36: 5,9 zu 2 RFU/min). Zusätzlich verringerte diese Änderung die IC50 um mindestens das 3-Fache (größere Toxizität). Mithin schafften die 3,3'-Diphenylsulfon-Isomere keine größeren Vorteile.
  • Konvertierung des Disulfids zu einem neuartigen Thiolester
  • Die Wirkung der Disulfide auf die NCp7 Zinkfinger umfasst einen Thiol-Disulfid-Austausch zwischen dem Agens und den CCHC Cystein-Schwefelatomen. Die resultierende kovalente Disulfid-Verknüpfung zwischen NCp7 und einer Hälfte des Arzneimittels ("monomerer" Abschnitt) verursacht eine Störung des Zinkchelats mit passivem Verlust von Zn 2+-Ionen von der NCp7 Struktur (vgl. z.B. Rice (1995) supra; Huang (1998) supra.
  • Für die kovalente Modifizierung von Zinkfinger-Cysteinen durch Bindungen, die stabiler sind als dies unter Verwendung einer der oben beschriebenen Verbindungen möglich wäre, wurden neuartige Thioether designt und synthetisiert. Um eine Thioether-Verknüpfung zu schaffen, wurde eine moderat aktive, SH-selektive Alkylierungsfunktion an den Ortho- oder Metapositionen der Benzamid-Kopfgruppe designt. Einfach ligandierte (monomere) Benzamide wurden über Amid- oder Thioesterbindungen mit potenziell reaktiven Haloalkanoyl-Gruppen verknüpft (vgl. Tabelle 5). Die Verbindungen 37 bis 39 stellen Amidverknüpfungen zu den Ortho- oder Metabenzamidpositionen dar. Die Substitution von Cl-(CH2)2-CO-NH- an der Ortho- (Verbindung 37) oder Metaposition (Verbindung 38) auf der Ligandenform der Verbindung 2 generierten Verbindungen mit bescheidener Zinkfinger-Reaktivität. Keine wies aber eine bemerkenswerte antivirale Aktivität auf. Die Verbindung 39, versehen mit einem Ortho Cl-CH2-CO-NH-, war komplett inaktiv. Orthoamidsubstituierte Sonden wurden unter Verwendung diverser anderer Hauptketten als Ligandenstruktur synthetisiert und ergaben äquivalente Resultate.
  • Orthopositionierte Alkanoyl-, Aroyl- und Haloalkanoyl-Thioester wurden designt und synthetisiert (Verbindungen 40 bis 52, Tabellen 5 und 6). Die Synthese der Acetyl- (Verbindung 40), Benzoyl- (Verbindung 41), 4-Methoxybenzoyl- (Verbindung 42) und der Butyroylthioester (Verbindung 43) ergab vier Verbindungen mit niedrigen μM EC50-Werten und moderater bis substanzieller Zinkfinger-Reaktivität. Aufgrund von IC50-Werten im 50-μM-Bereich näherte sich ihre antivirale Aktivität jedoch jener der BITA-Derivate an (Tabelle 1).
  • Ein neuer Thioester wurde unter Verwendung von ϖ-Haloalkanoyl-Gruppen synthetisiert. Das Ortho-5-Bromovaleroylthioester-Derivat der Verbindung 2, Verbindung 44, ergab eine signifikant reduzierte Zytotoxizität und moderate Zinkfingeraktivität. Der therapeutische Index wurde weiter erhöht durch Konvertierung der Verbindung 44 zum Pyridinioalkanoylthioester (PATE) Derivat, Verbindung 45. Das resultierende Agens zeigte effiziente Zinkfinger-Reaktivität (3,6 RFU/min), keine Toxizität bei der höchsten Testdosierung von 316 μM und eine EC50 von weniger als 10 μM.
  • Tabelle 6 zeigt, dass die PATEs als ein Chemotyp günstigere antivirale und Toxizitätsprofile als ihre Stammverbindungen aufweisen. Der von den Pyridiniovaleroylthioestern gezeigte Mangel an Toxizität wird illustriert durch ihre Zugabe zu den Monobenzamid-Hauptketten der Verbindungen 2, 31, 34, 27 und 36, wodurch die neuen Verbindungen 45, 47, 50, 51 und 52 geschaffen werden, wo die Zelltoxizität des Stamm-Monobenzamids in allen Fällen verringert ist. Auch wenn die Konvertierung der Verbindung 23 Hauptkette zum PATE Chemotyp, resultierend in der Verbindung 48, keine Selektivitätsindices (TI) der in den anderen Pyridiniovaleroylthioestern festgestellten Grössenordnung generierte und die Monobenzamid-Toxizität nicht reduzierte (Verbindung 23 BITA 53,7 μM vs. Verbindung 48 μM), verringerte die Konvertierung des Pyridiniovaleroylthioesters teilweise die mit der Disulfidform assoziierte Toxizität (IC50 der Verbindung 23D: 19,4 μM vs. Verbindung 48: 55 μM). So stellen Thiolester, und insbesondere PATEs, einen neuen Chemotyp dar, der als neuartiges chemotherapeutisches Agens mit Zielrichtung viraler Zinkfinger benützt werden kann.
  • Antivirale Aktivität von Pyridinioalkanoylthioestern (PATEs)
  • Der 5-Bromovaleroylthioester, Verbindung 44, und zwei 5-Pyridiniovaleroylthioester, Verbindungen 45 und 47, wurden in mechanistischen und Targetbasierten Assays analysiert. Diese Verbindungen haben die HIV-1-Integrase-, Revertase- oder Protease-Enzymaktivitäten nicht gehemmt (vgl. Tabelle 7). Assays für die Aktivität gegen HIV-1 Revertase rAdT (Matrize/Primer) und rCdG (Matrize/Primer) unter Verwendung rekombinierter HIV-1-Revertase (S. Hughes, ABL Basic Research NCl-FCRDC, Frederick MD) wurden durchgeführt wie von Rice (1997), supra, beschrieben. Substratabspaltung rekombinierter HIV-1-Protease in Anwesenheit von Testverbindungen unter Verwendung einer HPLC-basierten Methode mit dem künstlichen Substrat Ala-Ser-Glu-Asn-Try-Pro-Ile-Val-Amid (Multiple Peptide Systems, San Diego CA) wurden durchgeführt wie von Rice (1997), supra, beschrieben. Die Fähigkeit rekombinierter HIV-1-Integrase (S. Hughes, ABL Basic Research NCl-FCRDC, Frederick MD) zur Durchführung von 3' Verarbeitungs- und Strang-Transferaktivitäten in Anwesenheit von Testverbindungen wurde wie von Buckheit (1994) AIDS Res. Hum. Retroviruses 10: 1497-1506, und Turpin (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42: 487-494 beschrieben ausgeführt.
  • Die 5-Bromovaleroylthioester-Verbindung 44 und die zwei 5-Pyridiniovaleroylthioester-Verbindungen 45 und 47 haben ebenfalls die Virusanbindung (zellbasierter p24 Bindungs-Assay) und die Verschmelzung mit den Wirtszellen nicht gehemmt. Der zellbasierte p24 Bindungs-Assay wurde durchgeführt wie in Rice (1995) Science 270: 1194-1197 beschrieben. Viren-Inaktivierungs-Assays wurden wie in Rice (1995) Science 270: 1194-1197 und Turpin (1997), supra, beschrieben durchgeführt, mit kleineren Modifikationen. Kurz gesagt, wurden MAGI-CCR-5-Zellen 24 h lang in 2-cm-Well-Platten mit flachem Boden plattiert (4 × 104 Zellen pro Well), woraufhin das Kulturmedium entfernt und der Verbindungs-behandelte Virus hinzugefügt wurde. Das verwendete Virus wurde durch vorübegehende Transfektion von pNL4-3 in HeLa-Zellen gewonnen, was den replikationskompetenten NL4-3 Virus ergab. Virus-haltige Überstände wurden 2 h lang bei 37°C behandelt, woraufhin Verbindungsreste durch Zentrifugieren entfernt wurden (18.000 × g, 1h, 4°C). Virus-Pellets wurden resuspendiert und auf den MAGI-CCR-5-Monoschichten platziert und 48 h lang kultiviert. Monoschichten wurden fixiert und mit X-Gal-Lösung und gezählten Blauzellen gefärbt.
  • Die Bestimmung des Effekts der Testverbindungen auf die Virenverschmelzung wurde wie folgt durchgeführt. Kurz gesagt, wurden HL2/3-Zellen, welche stabil HIV-1 Tat und Zelloberfläche gp120 ausdrückten, und MAGI-CCR-5-Zellen, welche stabil CD4 und CCR5 auf ihrer Zelloberfläche ausdrückten und ein β-Galactosidase-Reportergen unter der Kontrolle des HIV-1 LTR enthielten, mit der Testverbindung 1 h lang bei 37°C vorbehandelt. Nach der Inkubation wurden die Zellen im Verhältnis 4 zu 1 gemischt (2 × 105 MAGI-CCR-5 zu 8 × 105 HL2/3 Zellen) und 18 h bei 37°C mitkultiviert; die Kulturen wurden fixiert und mit X-Gal-Lösung für β-Galactosidase-Aktivität gefärbt. Blauzellen repräsentierten die Tat Transaktivierung des 1-HIV-1 LTR nach Verschmelzung der HL2/3 und MAGI-CCR-5-Zellen über die Co-Rezeptor gp 120 Interaktion CD4/CCR5.
  • Alle drei Thiolester-Verbindungen 44, 45 und 47 förderten die Metall-Ion-(Zink)-Ausstoßung vom NCp7 Protein, wie in dem oben beschriebenen Trp37 Assay festgestellt. Diese Verbindungen störten den TSQ Fluorchrom-Assay und konnten deshalb in diesem nicht getestet werden (vgl. Tabelle 9).
  • Die Interaktion von Zinkfinger-Inhibitoren mit NCp7 kann zu einem Verlust der Proteinstruktur und ihrer Fähigkeit zur spezifischen Bindung von Oligonucleotiden führen, welche die HIV-1ψ-Verpackungsstelle repräsentieren (Huang (1998) supra; Tummino (1997) Antimicrob. Agents Chemother. 41: 394-400; South (1993) Protein Sci. 2: 3-19; Dannull (1994) EMBO J. 13: 1525-1533). Die Fähigkeit von NCp7 zur spezifischen Assoziation mit diesen Oligonucleotiden nach der Behandlung des Proteins mit einem Thiolester der Erfindung wurde getestet. Beispielsweise waren die Verbindungen 44, 45 oder 47 sehr wirksam in der Hemmung der Ncp7-Fähigkeit zur Assoziation mit Target-Oligonucleotiden, wie mit Hilfe electrophoretischer Mobility-Shift-Assays (EMSA) auf nicht-denaturierenden Polyacrylamid-Gels festgestellt wurde. Bei 1 μM hemmte die Verbindung 45 die Komplexbildung. Die Verbindungen 44 und 47 hemmten die Komplexbildung bei 100 μM (vgl. Tabelle 9).
  • Um festzustellen, ob die Bindungsaktivität der Verbindungen 44, 45 oder 47 spezifisch für CCHC Zinkfinger waren, wurde nach Behandlung der K562-Zellen-Nuklearextrakte mit den Verbindungen ein Super-Gel-Shift-EMSA durchgeführt. Diesem folgte Supershifting mit Spl-spezifischem Antikörper. Spl wurde gewählt, weil es sich um einen Zelltranskriptionsfaktor handelt, der drei Kopien eines CCHH Zinkfingermotivs vom klassischen Typ enthält, die für die Sp1-Bindung an sein DNA-Target erforderlich sind. Die drei Verbindungen 44, 45 oder 47 konnten das Supershifting-Muster von an sein DNA-Target gebundener Spl nicht ändern, was darauf hinweist, dass diese Thiolester eine Spezifität für den CCHC Retrovirus-Zn-Finger besitzen. Super-Gel-Shifting zur Bestimmung der Spezifität von Zinkfinger-reaktiven Verbindungen wurde unter Verwendung eines Sp1 Consensus-Oligomers (Stratagene, La Jolla, CA), K562 Zell-Nuklearextrakten und Antikörpern für Sp1 (Spl [PEP2]-G) durchgeführt (Extrakte und Spl Abs von Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA). Die Bindungsreaktionen von Oligonucleotiden mit K562 Nuklearextrakt sowie die elektrophoretischen Bedingungen wurden durchgeführt wie im Gelshift Buffer Kit, Stratagene, La Jolla, CA, beschrieben.
  • Die Interaktion von Zinkfinger-Inhibitoren, wie die Thiolester der Erfindung, mit zellfreien Viren kann die Modifikation des Intravirion NCp7 Proteins und Verluste an Infektiosität mit sich bringen. Virion-assoziierte NCp7 Proteine von zellfreien HIV-1MN wurden mit den Thiolester-Verbindungen 44 und 45 behandelt. Sie wurden weiter per nicht-reduzierendem Western-Blotting unter Verwendung HIV-1 NCp7-spezifischen Antikörpern evaluiert. Die PATE Verbindung 45 resultierte in extensiver Vernetzung von NCp7, wohingegen ihr Haloalkanoyl-Thioester-Vorläufer (Verbindung 44) ein sehr schlechtes Vernetzungsagens war. Intravirion NCp7 Vernetzung durch die Verbindung 45 war vergleichbar mit DIBA-1, Verbindung 1. Die Vernetzung durch Verbindung 45 erfolgte aufgrund der Bildung intermolekularer Disulfidbindungen, weil die Reduzierung mit 2-Mercaptoethanol (β-ME) die Gel-Retardation vollständig umkehrte. Die Verbindung 47 löste keine effektive NCp7 Vernetzung aus. AZT, ein Nukleosid-Revertase-Inhibitor, schaffte ebenfalls keine Vernetzung von NCp7 (vgl. Tabelle 9).
  • NCp7-Vernetzung ist mit Vireninaktivierung assoziiert. Ob die Fähigkeit zur Vernetzung des Nucleocapsid-Proteins gemäß Bestimmung durch Western-Blotting mit der Fähigkeit zur Inaktivierung der Viren korrelierte, wurde in einem Virentötungs-Assay getestet. Virenbestände von HIV-1NL4-3 wurden mit unterschiedlichen Thiolester-Verbindungen inkubiert. Das Virus wurde durch vorübergehende Transfektion eines replikationskompetenten pNL4-3 Plasmids in HeLa-Zellen gewonnen. Der Rest-Thiolester wurde durch Zentrifugieren entfernt. Das Virus-Pellet wurde in Kulturmedium resuspendiert und dazu verwendet, die MAGI-CCR-5-Zellen zu infizieren. 48 Stunden post Infektion wurden die Zellen gewaschen und mit X-Gal gefärbt. Die Verbindungen 44 und 45 waren viruzid mit I50-Werten (Konzentration ergibt 50% Virus-Inaktivierung) von 12,3 μM bzw. 13,2 μM. Obwohl die Verbindung 47 kein potenter Vernetzer von Intravirion NCp7 war, war sie bei der Inaktivierung des Virus doch 6-fach (I50 = 2,1 μM) potenter als die Verbindungen 44 und 45. Diese Daten verweisen darauf, dass Thiolester und insbesondere die Verbindung 47 stabile Addukte mit den Zinkfinger-Schwefelatomen bilden, die nicht an der Generierung intermolekularer oder intramolekularer Disulfid-Vernetzungen teilnehmen.
  • Die Analyse der 5-Pyridiniovaleriansäure (Verbindung 53) ohne Konjugation an ein Monobenzamid-Hauptkette zeigte im Trp37 Zink-Ausstossungs-Assay eine signifikante Reaktivität (4 RFU/min), auch wenn diese ohne antivirale Aktivität war (vgl. Tabelle 6). Die Verbindung 53 wurde weiter auf die Intravirion-Vernetzung von NCp7 und viruzide Aktivität untersucht. Weder Intravirion-Vernetzung von NCp7 noch viruzide Aktivität wurden entdeckt. Somit sind die Monobenzamid-Hauptketten der Verbindungen 44, 45 und 47 essenziell für die Aktivität gegen zellfreie Virionen.
  • Thiolester-Verbindungen wurden ebenfalls auf ihre Fähigkeit zur Hemmung der HIV-1-Replikation in TNFα-induzierten U1- und ACH-2-Zellen getestet. U1-Zellen wurden in Anwesenheit unterschiedlicher Konzentrationen der Thiolester 44, 45 oder 47 mit 5 ng/ml TNFα induziert. Achtundvierzig Stunden später wurden die Kulturen für die Virus p24 Antigenproduktion und Zellüberlebensfähigkeit charakterisiert. Alle drei Verbindungen hemmten die Freigabe von HIV-1-Virionen (p24) von U1-Zellen (EC50: 94, 42,2 und 10,7 μM für die Verbindungen 44, 45 und 47) (vgl. Tabelle 9). Bei der hohen Testdosis von 100 μM war keine Zelltoxizität evident. Tests mit höheren Dosierungen (300 μM) aller drei Thiolester zeigten keine Toxizität für die Verbindungen 45 und 47. Die Verbindung 44 tötete 60% der Zellen bei 200 μM. Die Visualisierung der Virusproteine von TNFα-induzierten U1-Zellen durch elektrophoretische Trennung und Immunoblotting (Western-Blotting) zeigte, dass die Verbindungen 45 und 47 die Vernetzung viraler Vorläufer-Polyproteine induzierte und die Verarbeitung dieser Vorläufer verhinderte. Die Reduzierung der U1 Proteinzubereitungen mit β-ME zeigte, dass Verbindung 45 (100 μM) und Verbindung 47 die Pr55gag-Vorläuferverarbeitung hemmte. Die Verbindung 44 induzierte auch β-ME-reversible Änderungen in der Mobilität von Zinkfingerhaltigen HIV-1-Vorläuferproteinen auf einem Zwischenniveau zwischen Verbindung 45 und 47. Die Evaluierung der Vorläuferverarbeitung wurde wie von Turpin (1997) Antivirale Chem. Chemother. 8: 60-69 beschrieben ausge führt. Demnach initiieren Thiolester-PATEs intrazelluläre Disulfid-Vernetzung von Vorläufer-Polyproteinen während der späten Phase der Virusanordnung und vermitteln über einen Angriff auf die reifen NCp7 Retrovirus-Zinkfinger im zellfreien Virus eine unmittelbar viruzide Wirkung.
  • Die Virion-Vernetzung wurde wie von Rice (1995) Science 270: 1194-1197 und Turpin (1997) Antivirale Chem. Chemother. 8: 60-67 beschrieben durchgeführt. Kurz gesagt, wurde hochgereinigtes HIV–1MN (11,8 μg Gesamtprotein) 2 Stunden lang mit Konzentrationen der Verbindung inkubiert. Die Virionen wurden konzentriert und die Restverbindung durch Zentrifugieren entfernt (18.000 × g, 1 h, 4°C). Das Virenpellet wurde in in 0,5 M Tris-HCl (pH 6,8), 50% Glycerol, 8% SDS und 0,4% Bromophenol-Blau löslich gemacht, und die Proteine durch Western-Blotting gelöst. Das Western-Blotting zur Feststellung der Expression von HIV-1-Proteinen in U1-Zellen oder Viruspellets für Virion-Vernetzungsexperimente wurde durchgeführt wie von Turpin (1996) J. Virol. 70: 6180-6189 beschrieben. 50 μg des gesamten Zellproteins für U1-Experimente oder das gesamte Virion-Pellet (11,8 μg Gesamt-Virusprotein) für NCp7 Vernetzungsstudien wurde auf 4 bis 20% Polyacrylamid-Gels in SDS mit Tris-Glycin (Novex, San Diego, CA) gelöst. Samples für reduzierte Gels wurden vor dem Laden 5 Minuten lang in Anwesenheit von 5% β-ME gekocht. Die gelösten Proteine wurden auf Polyvinyliden-Difluorid-(PVDF)-Membranen einem Elektroblotting unterzogen, und HIV-1-spezifische Proteine wurden unter Anwendung einer Mischung von Ziegen-anti-HIV-1-NCp7 und p24 oder anti-NCp7 für Virion-Proteine allein festgestellt (ein freundliches Geschenk von L. E. Henderson, AIDS Vaccine Program NCl-FCRDC, Frederick, MD). Western-Blots wurden unter Anwendung von Standard-Chemilumineszenz-Methoden entwickelt, wie sie von Dupont-NEN, Wilmington, DE, produziert und beschrieben wurden.
  • Eine signifikante Charakteristik von Thiolestern ist deren Fähigkeit zur Erhaltung der Zinkfinger-Reaktivität in Anwesenheit der reduzierenden Umgebung eines biologischen In-vivo-Fluids. Diese Eigenschaft kann z.B. durch Testen des Widerstands der Verbindung gegen eine Reduktion durch Glutathion unter physiologischen Bedingungen evaluiert werden. Dieser Widerstand gegen die Reduktion ist eine signifikante Verbesserung gegenüber allen Disulfid-haltigen Verbindungen. Beispielsweise macht sie die Disulfid-Natur von DIBAs in reduzierenden Umgebungen inhärent instabil. Dies zieht die Dissoziierung von Dimer- zu Monomerformen und gemischten Disulfiden nach sich.
  • Die Thiolester-PATE-Verbindungen 44, 45 und 47 behielten die Kapazität zum Angriff auf die Cysteinthiole in Anwesenheit eines 2-Molar-Überschusses von Glutathion. So verleiht die Konvertierung des Disulfids zum weniger nucleophilen 5-Bromovaleroylthioester, wie in Verbindung 44, oder 5-Pyridiniovaleroylthioester, wie in den Verbindungen 45 und 47, einen erheblichen Widerstand gegen reduktive Agenzien, wodurch der nachfolgende Verlust an Zinkfinger-Reaktivität verhindert wird (vgl. Tabelle 8).
  • Hinsichtlich Tabelle 10 war das Aktivitätsprofil des PATE-Chemotyps abhängig von der Länge des Alkyl-Spacers zwischen den Carbonyl- und Pyridinio-Komponenten (im Vergleich zu den Verbindungen 54, 45, und 55). Das n = 4 Spacing erscheint optimal im Hinblick auf Potenz und Toxizität. Die essenzielle Anwesenheit des Thiolesterschwefels wird demonstriert durch die inaktive Verbindung 56, wo der Schwefel durch -NH- ersetzt wird. Die Substituierung eines Chlors für Wasserstoff meta zum Stickstoff im Pyridiniumring verringert signifikant die antivirale Potenz, wahrscheinlich aufgrund elektrostatischer (Ausstossungs-) Interaktion zwischen der Chlorgruppe und den Resten 39 und 49 von NCp7.
  • Feststellen der Dissoziierung eines Metall-Ions von einem Zinkfingermotiv
  • Die Erfindung schafft eine Methode und einen Ausrüstungssatz zur Auswahl von Verbindungen, die geeignet sind, ein zweiwertiges Ion, das mit einem Zinkfingermotiv in Chelatverbindung steht, zu dissoziieren. Das Motiv kann isoliert sein oder eine Substruktur eines Virusproteins oder eines Virions. Die Methode umfasst das Kontaktieren des Zinkfingers mit einem Thiolester und die anschließende Feststellung der Dissoziierung des Metall-Ions vom Zinkfinger-Protein. Das Kation ist für gewöhnlich Zink. Jedes in der Branche bekannte Verfahren kann dazu verwendet werden, die Dissoziierung des Metall-Ions festzustellen. Exemplarische Mittel sind beispielsweise die Kapillar-Elektrophorese, Immunblotting, Kernspinresonanz (NMR), Hochdruck-Flüssig-Chromatographie (HPLC), Feststellen der Freiwerdung von radioaktivem Zink-65, Feststellen von Fluoreszenz oder Feststellen eines Gel-Mobility-Shifts sowie andere Techniken, die Fachleuten nach der Lektüre dieser Offenbarung einleuchtend erscheinen. Diese Verfahren können mit jedem in der Fachwelt bekannten Protokoll ausgeübt werden, die in der wissenschaftlichen und Patentliteratur gut dokumentiert sind. Einige exemplarische Techniken sind nachstehend ausgeführt.
  • Da die Erfindung auch eine Gattung neuartiger Thiolester schafft, die in der Lage sind, ein Metall-Ion von einem Zinkfinger in vitro zu dissoziieren, identifiziert die Feststellung der Dissoziierung des Metall-Ions eine Thiolesterspezies im Geltungsbereich der Erfindung. Der Zink-Ausstoßungs-Assay wurde als Erst-Screening zur Identifizierung von Thiolestern im Geltungsbereich der Erfindung benützt. Eine Strategie für ein solches Screening benützte den XTT Zytoprotektions-Assay zur Kontrolle der Antivirenaktivität und den Trp37 Zink-Ausstoßungs-Assay zur Identifizierung von Thiolestern, die geeignet sind, auf zellulärer Ebene auf das NCp7 Protein oder seine Gag oder Gag-Pol-Vorläufer zu wirken.
  • Ein Thiolester ist im Geltungsbereich der Erfindung, wenn er für jeden Grad der Kation-Ausstossung von einem Zinkfinger geeignet ist. Eigentlich ist ein Thiolester, der zur Zink-Ausstossung mit geringer Ausstossungsrate, also kleiner Kinetik, in der Lage ist, für einige Anwendungen vorzuziehen, insbesondere für bestimmte In-vivo-Anwendungen. Ein exemplarischer "schwacher Kation-Ausstossungs-"Thiolester der Erfindung ist die Verbindung 50 mit einer Zink-Ausstossungsrate von 0,86 RFU/min gemäß Trp37 Zinkfinger-Fluoreszenz-Assay. Aber auch Thiolester mit niedrigeren Ausstossungsraten (< 0,86 RFU/min) befinden sich im Geltungsbereich der Erfindung. Eine "hohe" Ausstossungsrate wäre im Bereich von annähernd 8 RFU/min. Thiolester mit einer Antivirenaktivität EC50 von <15 μM wurden als bevorzugte Ausführungsbeispiele ausgewählt.
  • Kapillarzonen-Elektrophorese (CZE)
  • Retrovirus-Zinkfinger-Proteinkomplex mit zwei Zink-Ionen, je mit einer formalen Ladung von +2. Reagenzien, die mit dem Protein reagieren und die Zink-Ionen entfernen, verursachen eine Änderung in der Konformation und Ladung des Proteins. Somit unterscheidet sich die elektrophoretische Mobilität des reagierten Proteins von der Mobilität des unreagierten Proteins. Änderungen in der elektrophoretischen Mobilität des Proteins können leicht durch die Standardtechnik der Kapillarzonen-Elektrophorese (CZE) festgestellt werden. Für eine allgemeine Beschreibung der CZE vgl. z.B. Capillary Electrophoresis, Theory and Practice (Academic Press, Inc. Grossman and Colburn (Hrsg.) (1992).
  • Im allgemeinen dient die elektrophoretische Mobilität des Proteins (bei einem vom Puffer in der Kapillar-Elektrophoreseröhre bestimmten pH-Wert) dazu, das Retrovirus-Protein von einer festen Ausgangsposition zu einer Elektrode zu bewegen. Die Migrationsrate kann durch UV-Absorption kontrolliert werden, z.B. bei 215 nm. Proberöhren mit einer geeigneten Menge einer Lösung, welche das Retrovirus-NC-Protein der Wahl enthält, und zwar mit und ohne die für die CCHC-Zinkfinger-Inaktivierung zu testende Thiolester-Verbindung, werden in einen automatischen Sample-Injektor gegeben. In programmierten Intervallen werden die Samples in die Kapillarröhre gezogen, und die UV-Absorption wird kontrolliert. Unmodifiziertes Retrovirus-NC-Protein ergibt eine deutliche Spitze von migrierendem Protein, das durch den Detektor geht. Modifikationen des Proteins, verursacht von der Reaktion mit der Testverbindung der Wahl, werden durch eine Änderung in der elektrophoretischen Mobilität des reagierten Proteins offenbart.
  • Die Kapillarzonen-Elektrophorese hat den Vorteil einer einfachen Automatisierung, da viele unterschiedliche Samples in aufeinanderfolgenden Durchgängen geladen und analysiert werden können. Jeder Durchgang erfordert etwa 10 Minuten, und jede Proberöhre kann mehrere Male analysiert werden. Ein Beispiel eines Ausrüstungssatzes, der CZE zur Analyse ausgewählter, auf die CCHC-Zinkfinger-Reaktivität zu testender Verbindungen benützt, würde etwa 100 Mikrogramm (μg) gereinigten Retrovirus-NC-Proteins enthalten, das mit Zink in beispielsweise 1,0 ml Wasser komplexiert ist, und könnte zum Testen von annähernd 1000 Testverbindungen verwendet werden.
  • Freigabe von radioaktivem Zink von Zink-65-markiertem NCp7
  • Gereinigtes HIV-1 NCp7 kann mit radioaktivem Zink-65 mit einer bestimmten spezifischen Aktivität rekonstituiert werden. Durch die Kontrolle der Freigabe von radioaktivem Zink-65, die durch die Reaktion einer Testverbindung mit einem Retrovirus NC Protein verursacht wird, ist es möglich, die Reaktivität der Testverbindung zu bestimmen.
  • Eine Thiolester-Testverbindung kann zu einer Lösung hinzugefügt werden, die das mit radioaktivem Zink-65 komplexierte NC Protein enthält. Nach der Reaktion kann das (reagierte oder unreagierte) Protein ausgefällt werden, beispielsweise durch Immunofällungs- oder Immunoadsorptionsmethoden unter Verwendung bekannter Antikörper oder durch Zugabe einer standardisierten Menge Nukleinsäure, so dass das NC Protein die Bindungsstellen auf der Nukleinsäurematrix sättigt. Unter Bedingungen niedriger Ionenstärke bildet der gesättigte Protein-Nukleinsäurekomplex einen Niederschlag, der durch Zentrifugieren entfernt werden kann. Alternativ dazu kann das markierte Nucleocapsid-Protein auch an eine feste Unterlage gebunden und die Testreagenzien direkt zu dem angebundenen Protein hinzugefügt werden. Alle Reaktionen, die Zink vom Protein abgeben, können durch die Freigabe von radioaktivem Zink-65 in den löslichen Überstand festgestellt werden. Dieses allgemeine Verfahren kann je nach verfügbarer Ausrüstung automatisiert werden.
  • Ein Ausrüstungssatz (Kit), der Retrovirus-Nucleocapsid-Protein und geeignete Ausfällungsmittel bereitstellt, kann dazu verwendet werden, die Fähigkeit der Testverbindungen zum Entfernen von Zink von dem Protein festzustellen.
  • Freigabe von radioaktivem Zink von Zink-65-markiertem Vollvirus
  • Zink ist im Virus in nahezu stöchiometrischen Mengen mit CCHC Zinkfinger-Arrays vorhanden (Bess (1992) J. Virol. 66: 840). Nahezu das gesamte Zink ist in den CCHC-Arrays koordiniert (Summers (1992) Protein Science 1: 563).
  • Deshalb stammt das von einem Virus abgegebene Zink von Zink, das vorher in CCHC-Arrays koordiniert wurde, und nicht von fremden Proteinen oder anderen nichtspezifischen Assoziationen mit dem Virion.
  • Gereinigter Virus kann aus Zellen gewonnen werden, die in Anwesenheit von hinzugefügtem Zink-65 kultiviert wurden. Markierter Virus kann durch Dichtegradientzentrifugierung in Anwesenheit hinzugefügter EDTA zur Entfernung von ungebundenem Zink isoliert und gereinigt werden. Der gereinigte Virus kann jeder interessante Retrovirus sein, einschliesslich HIV-1, HIV-2 oder SIV, ohne aber auf diese beschränkt zu sein.
  • Die zu testenden Verbindungen (Thiolester der Erfindung) können zu dem gereinigten, radioaktiven Virus unter Bedingungen hinzugefügt werden, die für die Testverbindung der Wahl geeignet sind (Rice (1993) Nature 361: 473-475). Nach der Reaktion, Entfernung und/oder Inaktivierung des Reagens wird der Virus durch Zugabe eines nicht-ionischen Detergentiums (z.B. Triton X-100) zerstört, und der Virenkern, welcher das mit der Nukleinsäure komplexierte NC Protein enthält, wird durch Zentrifugieren entfernt.
  • In den Überstand abgegebener radioaktiver Zink-65 zeigt, dass die Testverbindung den intakten Virus penetriert und den NC-Protein-Zink-Komplex zerstört hat. Ausrüstungssätze zur Bestimmung, ob Testverbindungen Retrovirus-NC-chelatinierten Zink entfernen können, würden beispielsweise intakte Retroviruspartikel mit in ihren NC-Proteinen integriertem, radioaktivem Zink-65, geeigneten Reaktionspufferlösungen und einem nicht-ionischen Reinigungsmittel enthalten.
  • Fluoreszenz-basierte Feststellung der Zink-Dissoziation von Protein
  • Änderungen der Eigen-Fluoreszenz aromatischer Proteinkomponenten werden in der Regel dazu verwendet, eine Reaktion zu beobachten, die eine Änderung in der Proteinkonformation beinhaltet. In der vorliegenden Erfindung kann die Fluoreszenz dazu verwendet werden, den Verlust an Metall-Ion von einem Zinkfinger zu beobachten, z.B. den Verlust von Zink von einem CCHC-Retrovirus-Zinkfinger-Protein nach dem Kontakt mit einem Thiolester der Erfindung. Die Eigen-Fluoreszenz von Trp 37 im zweiten Zinkfinger des HIV-1-NC-Proteins wurde dazu verwendet, die Nukleinsäurebindung und Konformation des Zinkfingerkomplexes zu beobachten (vgl. Summers (1992) supra).
  • Die Zinkausstossung wird anhand der Fähigkeit der Verbindungen gemessen, die Cysteine in gereinigtem NCp7 Protein chemisch anzugreifen, woraus ein Verlust an Fluoreszenz infolge der Bewegung des Tryptophan-37-Rests von einer exponierten zu einer inneren Position auf dem Protein resultiert. Die Zinkausstossung wird entweder als Prozentverringerung der Gesamtfluoreszenz oder Rückgang in relativen Fluoreszenzeinheiten pro Min. während eines 30-Minuten-Assays (RFU/min) gemessen und ausgedrückt. Ein Thiolester wird als zum Geltungsbereich der Erfindung gehörend betrachtet, wenn irgendeine Menge Zinkausstossung festgestellt wird. Die Verbindung 50 hat beispielsweise eine Zinkausstoßungsrate von 0,86 RFU/min.
  • Künstliche Fluoreszenzsonden können auch in ein Protein integriert sein, um die Feststellung von Konformationsänderungen zu ermöglichen. Z.B. kann Poly-Ethino-Adenin als Fluoreszenz-Nucleotid verwendet werden, um das Ausmaß der Thiolester-Zinkfinger-Interaktion zu messen (vgl. Karpel (1987) J. Biol. Chem. 262: 4961).
  • Schliesslich kann eine Vielzahl bekannter fluoreszierender Zink-Chelatoren, die zur Komplexbildung von freigesetztem Zink geeignet sind, zur Beobachtung des Zinkverlusts verwendet werden. Durch die Beobachtung der Zinkabgabe von den CCHC-Zinkfinger-Arrays kann die Wirkung eines gegebenen Reagens festgestellt werden (Rice (1996) J. Med. Chem. 39: 3606-3616; Rice (1996) Science 270: 1194-1197).
  • Feststellung von Disulfid-vernetztem NC-Protein durch Gel-Mobility-Shift-Assays
  • Gereinigter konzentrierter Retrovirus und Antisera gegen das gereinigte NC-Protein des Virus können dazu verwendet werden, die Fähigkeit einer spezifischen Verbindung zur Penetration des Virus und Reaktion mit dem NC-Protein durch die Ausbildung von Disulfid-Komplexen im Viruskern zu testen. Die Verbindungen werden mit dem Vollretrovirus unter Reaktionsbedingungen gemischt, die für die Verbindung geeignet sind. Das Virus wird dann per Zentrifugieren vom Reagens entfernt und zerstört, z.B. in einer Standard-SDS-PAGE-Sample-Pufferlösung mit (reduziert) und ohne (nicht-reduziert) 2-Mercaptoethanol. Die Virusproteine werden dann durch Standard-SDS-PAGE getrennt und das Sample auf die Anwesenheit oder Abwesenheit des monomeren Zinkfinger-Proteins in dem nicht-reduzierten Sample untersucht. Je nach dem in dem Experiment benützten Virus und den Bedingungen der Elektrophorese kann das Zinkfinger-Protein durch Protein-Färbungsmethoden oder durch Immunoblotmethoden sichtbar gemacht werden. Verbindungen, die mit dem Zinkfinger-Protein durch Angriffe auf die Zinkfinger-Komplexe und Ausbildung von Disulfid-vernetzten Produkten reagieren, inaktivieren das Virus. Mithin reduzieren die interessanten Verbindungen (also jene, welche Vernetzungen auslösen), einschließlich der Thiolester der Erfindung, die Menge des festgestellten monomeren Zinkfinger-Proteins. Beispielsweise ist die Thiolester-Verbindung 45 ein starker Vernetzer von Intravirion NCp7, woraus ein Totalverlust von monomerem NCp7 gemäß Detektion durch Westernblotting resultiert.
  • Die Thiolester-behandelten Virionen können auch auf Infektiosität getestet werden. Die Virionen werden in Medien suspendiert (anstatt aufgelöst) und zu Targetzellen hinzugefügt. Die Kulturen werden dann untersucht, um festzustellen, ob die Virionen noch aktiv sind. Um festzustellen, ob die behandelten Viruspartikel aktiv sind, werden die Zellen auf die Anwesenheit intrazellulär synthetisierter Viren-RNA geprüft, beispielsweise mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) (Rice (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:9721; Turpin (1996) J. Virol. 70:6180). Alternativ dazu können auch Cytoprotektion Assays angewendet werden (Weislow (1993) J. Natl. Cancer Inst. 81:577).
  • Ein Beispiel einer Verbindung, die als Kontrolle im Gel-Mobility-Shift-Assay verwendet werden kann, ist Azodicarbonamid (ADA), eine Verbindung, die im Handel bei der Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI) käuflich ist. ADA inaktiviert ebenfalls den HIV-1-Virus, wie mit dem oben beschriebenen PCR-Assay festgestellt wurde.
  • Ein Ausrüstungssatz, der das Gel-Mobility-Shift-Konzept beinhaltet, kann zur Identifizierung und Untersuchung von Thiolestern benützt werden, die in der Lage sind, intakten Virus zu penetrieren und Disulfid-Vernetzungen in die Viren-Zinkfinger-Proteine zu induzieren. Ein solcher Ausrüstungssatz würde beispielsweise gereinigten, konzentrierten Retrovirus und geeignete Grössenstandards enthalten, um die Mobilitätsänderung durch das Gel infolge von Disulfid-Vernetzung zu überwachen.
  • Per Hochdruck-Flüssig-Chromatographie (HPLC) gereinigte NC-Proteine zur strukturellen Charakterisierung von Reaktionsprodukten
  • Hochgereinigte Retrovirus-Zinkfinger-Proteine können durch Expression von Vektoren produziert werden, die mittels rekombinierter DNA-Technologie generiert wurden. Wenn diese Proteine mit Zink rekonstituiert werden, wie von Summers (1992) Protein Science 1: 563-567 beschrieben, liefern sie die Quelle der NC-Proteine, welche die Zinkfinger enthalten, die den Gegenstand des Angriffs durch die Thiolester-Verbindungen dieser Erfindung bilden. Wenn die Zinkfinger-Proteine mit identifizierten Verbindungen reagieren, produziert die Reaktion eine kovalente Änderung im Zinkfinger-Protein, und das modifizierte Protein kann vom unreagierten Protein beispielsweise durch Umkehrphase-HPLC getrennt werden.
  • Die gereinigten Proteine und diese Trennungsmethoden dienen dazu, ausreichend modifizierte Proteine (also Produkte dieser Reaktion) zur chemischen und strukturellen Analyse zu erhalten. Die gereinigten Reaktionsprodukte werden isoliert, und ihre Strukturen durch Standard-N-terminalen Edman-Abbau bestimmt. Für jedes spezifische Reagens sind die Gradienten und HPLC-Bedingungen jedoch vom NC Protein und den Reaktionsprodukten abhängig.
  • Dieses Verfahren dient zur Identifizierung von Thiolester-Verbindungen, die mit HIV-1-Zinkfingern reagieren. Die Reaktionsbedingungen und HPLC-Bedingungen für die präsentierten Daten gleichen den oben beschriebenen.
  • Ausrüstungssätze, welche diese Techniken standardisieren, können so konstruiert sein, dass sie beispielsweise gereinigte Retrovirus-Zinkfinger-Proteine enthalten.
  • Kernspinresonanz-basierte Detektion von Zinkverlust
  • NMR kann dazu verwendet werden, den Zinkverlust von Retrovirus-Zinkfinger-Proteinen zu beobachten (vgl. z.B. Rice (1993) Nature 361: 473-475; McDonnell (1997) J. Med. Chem. 40: 1969; Rice (1997) Nature Medicine 3: 341-345). Es wird erwartet, dass einer Fachperson die allgemeine Technik der NRM und deren zahlreiche Anwendungen zur Kontrolle von Protein-Ligand-Interaktionen vertraut sind. Kurz, die Atome in Retrovirus-Zinkfinger-Proteinen, die an Zink gebunden sind, haben ein anderes lokales Umfeld als Zinkfinger-Proteine, denen es an Zink fehlt. Der Unterschied im lokalen Umfeld führt zu bestimmten NMR-Spektren für Proteinmoleküle, die Zink binden, im Gegensatz zu jenen, die dies nicht tun. Durch Überwachung beispielsweise des Proton-(1H)-Spektrums eines Samples, das Metall-Ion-cheliertes Zinkfinger-Protein enthält, und einer Verbindung der vorliegenden Erfindung im Laufe der Zeit ist es möglich, zu messen, ob die Verbindung das Protein dazu bringt, sein Zink-Ion zu verlieren.
  • Da die NMR dazu verwendet werden kann, den Anteil der Proteinmoleküle zu liefern, die mit der Zeit an Zink gebunden werden, kann diese Technik auch dazu verwendet werden, die Reaktionskinetik einer bestimmten Reaktion zu definieren. Gleichermaßen kann die NMR zur Beobachtung der Wirkung von Testverbindungen auf die Bindung von Zinkfinger-Proteinen an Nukleinsäurekomplexen verwendet werden. Ausrüstungssätze, die beispielsweise gereinigte Retrovirus-Zinkfinger-Proteine und Oligonucleotide enthalten, können dazu verwendet werden, die Praxis dieser Methode zu standardisieren.
  • Bestimmung der antiviralen Aktivität von Thiolester
  • Ein Thiolester liegt im Geltungsbereich der Erfindung, wenn er irgendeine antivirale Aktivität zeigt (d.h. eine Fähigkeit, die Übertragung oder die Replikationskapazität eines Virus zu verringern). Die antivirale Aktivität kann empirisch per klinischer Beobachtung oder objektiv unter Verwendung eines Invivo- oder In-vitro-Tests oder Assays festgestellt werden, z.B. mit dem XTT-(hier beschriebenen) Cytoprotection Assay, der die Tat-induzierte Aktivität misst (wie im HeLa-CD4-LTR-beta-gal (MAGI-Zellen) Assay und Bestimmung Tat-induzierter Beta-Galaktosidase-Aktivität, vgl. z.B. Tokunaga (1998) J. Virol. 72: 6257-6259). Ein Thiolester mit irgendeinem Ausmass messbarer antiviraler Aktivität liegt auch dann im Geltungsbereich der Erfindung, wenn keine Metall-Ion-Dissoziation feststellbar ist.
  • Ein exemplarisches Mittel zur Bestimmung der antiviralen Wirksamkeit basiert auf CEM-SS-Zellen und Virus (z.B. HIV-1RF) (MOI = 0,01) unter Anwendung des XTT (2,3-bis[2-Methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl]-5-[(phenylamino)carbonyl] -2H-tetrazoliumhydroxid)-Zytoprotektions-Assays, wie von Rice (1993) PNAS 90: 9721-9724, und Rice (1997) Antimicrob. Agents Chemother. 41: 419-426 beschrieben. Kurz gesagt, werden Zellen mit HIV-1RF (oder anderen zu testenden Viren) in Anwesenheit unterschiedlicher Verdünnungen von Testverbindungen (Thiolestern und Kontrollen) infiziert. Die Kulturen werden sieben Tage lang inkubiert. Während dieser Zeit replizieren Kontrollkulturen ohne Schutzverbindungen (also Verbindungen mit antiviraler Aktivität) Viren, induzieren Synzytia und führen zu etwa 90% Zelltod. Der Zelltod wird durch XTT-Farbreduzierung gemessen. XTT ist eine lösliche Tetrazolimn-Farbe, welche die mitochondriale Energieabgabe misst, ähnlich MTT. Positive Kontrollen unter Anwendung von Dextransulfat (ein Anbindungshemmer) oder 3'-Azido-2'-3'-dideoxythymidin AZT (ein Revertase-Hemmer) werden jedem Assay hinzugefügt. Die einzelnen Assays werden unter Anwendung einer Schwesterplattenmethode dupliziert durchgeführt.
  • Die wirksamen antiviralen Konzentrationen mit 50% Zytoprotektion (EC50) und Zellwachstums-Inhibitionskonzentrationen, die 50% Zytotoxizität verursachen (IC50), werden berechnet.
  • Alternativ dazu kann jeder Virus in Kultur oder in einem In-vivo-(Tier)-Modell gezüchtet werden, in Anwesenheit oder Abwesenheit eines Thiolesters oder einer Thiolester-haltigen pharmazeutischen Rezeptur zur Prüfung auf antivirale, Virenübertragungs-hemmende Aktivität und Wirksamkeit. Jeder Virus, Assay und jedes Tiermodell, das einer Fachperson nach Lektüre dieser Offenbarung geeignet erscheint, kann verwendet werden, vgl. z.B. Lu (1997) Crit. Rev. Oncog. 8: 273-291; Neildez (1998) Virology 243: 12-20; Geretti (1998) J. Gen. Virol. 79: 415-421; Mohri (1998) Science 279: 1223-1227; Lee (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 939-944; Schwiebert (1998) AIDS Res. Hum. Retroviruses 14: 269-274.
  • Für In-vitro-Assays ist jeder messbare Rückgang der Virenbelastung einer in Anwesenheit einer Thiolester-Testverbindung gezüchteten Kultur im Vergleich zu einer positiven oder negativen Kontrollverbindung indikativ für eine antivirale, übertragungshemmende Wirkung. In der Regel wird eine mindestens 30% Reduzierung der Virenbelastung beobachtet, im allgemeinen zwischen 10% und 99%. Wie oben im Definitionsabschnitt erörtert, können alle relevanten Kriterien zur Evaluierung der antiviralen Wirksamkeit einer Thiolester-Zusammensetzung oder Thiolester-haltigen Rezeptur verwendet werden.
  • Klonen und Expression von Retrovirus-Nucleocapsid-Proteinen
  • Die neuartigen Thiolester der Erfindung sind geeignet, ein Metall-Ion von einem Zinkfinger in vitro zu dissoziieren. Zinkfinger-haltige Proteine werden dazu verwendet, die Dissoziierung eines Metall-Ions von einem Zinkfingermotiv und in den Methoden und Ausrüstungssätzen der Erfindung zu bestimmen. Allgemeine Laborverfahren für das Klonen und Exprimieren von Zinkfingermotiven und Proteine, welche diese Motive enthalten, finden sich z.B. in aktuellen Ausgaben von Sambrook, et al., Molecular Cloning A Laborstory Manual (2nd Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laborstory, Cold Spring Harbor, New York, 1989; CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel, ed. Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1987). Sequenzen und Quellen von Zinkfingern, einschließlich Nukleinsäuren, Proteine und Virenquellen, sind öffentlich erhältlich, beispielsweise über elektronische Datenbanken, wie z.B. The National Center for Biotechnology Information unter http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/ oder The National Library of Medicine unter http:/lwww.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/.
  • Die Nukleinsäure-Zusammensetzungen, die dazu verwendet werden können, Zinkfinger-haltige Proteine zu exprimieren, ob RNA, cDNA, Genom-DNA oder ein Hybrid der unterschiedlichen Kombinationen, können von natürlichen Quellen isoliert oder in vitro synthetisiert werden. (DNA)-Rekombinationstechniken können zur Produktion von Polypeptiden verwendet werden. Im allgemeinen wird die DNA, welche das interessierende Polypeptid oder Peptid codiert, zuerst geklont oder in einer zur Ligation in einen Expressionsvektor geeigneten Form isoliert. Nach der Ligation werden die Vektoren, welche die DNA-Fragmente oder Einsätze enthalten, in eine geeignete Wirtszelle zur Expression der rekombinierten Polypeptide eingeführt. Die Polypeptide werden dann von den Wirtszellen isoliert. Die Nukleinsäuren können in transformierten oder transfizierten Vollzellen, in einem transformierten oder transfizierten Zelllysat oder in teilweise gereinigter oder im wesentlichen reiner Form vorliegen. Techniken für die Nukleinsäuremanipulation von Genen, die Zinkfinger-haltige Proteine codieren, wie die Subklonierung von Nukleinsäuresequenzen in Expressionsvektoren, Markierungssonden, DNA-Hybridisierung und dergleichen werden z.B. bei Sambrook und Ausubel, supra, beschrieben.
  • Nachdem die DNAs isoliert und geklont sind, kann man die gewünschten Polypeptide in eine rekombiniert aufbereitete Zelle exprimieren, wie Bakterien-, Hefe-, Insekten- oder Säugetierzellen. Es wird angenommen, dass einschlägig bewanderte Fachleute über die zahlreichen Expressionssysteme Bescheid wissen, die zur Expression der rekombiniert produzierten Proteine zur Verfügung stehen. Es wird kein Versuch unternommen, die unterschiedlichen Methoden, die für die Expression von Proteinen in Prokaryoten oder Eukaryoten bekannt sind, im Detail zu beschreiben. Kurz zusammengefasst, wird die Expression natürlicher oder synthetischer Nukleinsäuren-codierender Polypeptide in der Regel erreicht durch die operative Verknüpfung der DNA oder cDNA mit einem Promotor (der entweder konstitutiv oder induzierbar ist), gefolgt von der Einsetzung in einen Expressionsvektor. Die Vektoren können für die Replikation und Integration in Prokaryoten oder Eukaryoten geeignet sein. Typische Expressionsvektoren enthalten Transkriptions- und Translationsterminatoren, Initiierungssequenzen und Promotoren, die für die Regulierung der Expression der DNA-codierenden rekombinierten Polypeptide verwendbar sind. Um eine hochwertige Expression ein geklonten Gens zu erreichen, ist es wünschenswert, Expressions-Plasmide zu konstruieren, die mindestens einen Promotor zur direkten Transkription, eine Ribosomen-Bindungs-Stelle für die Translations-Initiierung und einen Transkriptions/Translations-Terminator enthalten.
  • Thiolester als Nucleotid
  • Die Erfindung schafft eine Zusammensetzung, die ein bio-organisches oder anderes Material und eine Menge eines Thiolesters der Erfindung umfasst, die wirksam ist, jeden (der Inaktivierung durch einen Thiolester zugänglichen) Virus zu inaktivieren, der das Material kontaminiert oder kontaminieren kann. Das Material kann bio-organisch, wie z.B. Blutplasma, Nährstoffmedium, Protein, eine pharmazeutische, eine kosmetische, eine Sperma- oder Oocyten-Zubereitung, Zellen, Zellkulturen, Bakterien, Viren, Nahrungsmittel, Getränke sein. Es kann sich um chirurgische oder andere medizinische Materialien handeln, wie z.B. Implantationsmaterialien oder implantierbare Hilfsmittel (z.B. Kunststoffe, künstliche Herzklappen oder Gelenke, Kollagene), medizinische Materialien (z.B. Schlauchmaterial für Katheter, Intubierungen, IVs) und Behälter (z.B. Blutbeutel, Aufbewahrungsbehälter). Alternativ dazu kann ein Thiolester der Erfindung in Form einer Zusammensetzung vorliegen, die auf eines der oben genannten Materialien als Viruzidalreagens aufgebracht und vor Gebrauch des Materials entfernt wird. Die Viruzidal-Zusammensetzung kann eine Mischung aus unterschiedlichen Thiolestern der Erfindung in unterschiedlichen Mengen enthalten. Beispielsweise können Thiolester zu den Zellkulturen hinzugefügt werden, um die Wahrscheinlichkeit von Virenkontaminationen zu verringern und damit die Sicherheit der Labormitarbeiter und Mitarbeiterinnen zu verbessern.
  • Thiolester als pharmazeutische Rezepturen
  • Die Erfindung schafft zudem pharmazeutische Rezepturen, welche die Thiolester der Erfindung umfassen. Diese Thiolester werden in pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet, die sich zur Verabreichung an Säugetiere, insbesondere Menschen, zur Behandlung viraler, speziell von Retrovirus-Infektionen eignen.
  • Die Thiolester der Erfindung können als Pharmazeutika zur Verabreichung auf unterschiedliche Arten formuliert werden. Typische Verabreichungsrouten sind die enterale und die parenterale Verabreichung. Zu diesen gehören, nicht einschränkend, die subkutane, intramuskuläre, intravenöse, intraperitoneale, intramedulläre, intraperikardiale, intrabursale, orale, sublinguale, okulare, nasale, topische, transdermale, transmukosale oder rektale Verabreichung. Die Verabreichung kann z. B. durch Schlucken, Inhalieren, Injektion oder topischen Auftrag auf eine Oberfläche erfolgen (z.B. Augen, Schleimhaut, Haut). Die einzelnen Rezepturen sind typischerweise für spezifische Verabreichungsmodi geeignet. Unterschiedliche erwogene Rezepturen umfassen beispielsweise wässrige Lösungen, Feststoffe, Aerosol, liposome und transdermale Rezepturen. Details über die Rezepturs- und Verabreichungstechniken sind in der Wissenschafts- und Patentliteratur gut beschrieben, vgl. z.B. die neueste Auflage von "Remington's Pharmaceutical Sciences" (Maack Publishing Co, Easton PA).
  • Wässrige Lösungen für die enterale, parenterale oder transmucosale Verabreichung
  • Beispiele wässriger Lösungen, die in Rezepturen für enterale, parenterale oder transmucosale Arzneimittelgabe verwendet werden können, umfassen Wasser, Kochsalzlösung, Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, Hanks-Lösung, Ringer-Lösung, Dextrose/Kochsalzlösung und Glukoselösungen. Die Rezepturen können pharmazeutisch akzeptable Hilfsstoffe zur Steigerung der Stabilität, Zuführbarkeit oder Löslichkeit enthalten, wie Puffer-Agenzien, Tonizitäts-Einstellungs-Agenzien, Benetzungsmittel und Reinigungsmittel. Zuschlagstoffe können auch zusätzliche Wirkstoffe enthalten, wie bakterizide Agenzien oder Stabilisatoren. Beispielsweise kann die Lösung Natriumacetat, Natriumlactat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid, Sorbitanmonolaurat oder Triethanolamin-Oleat enthalten. Diese Zusammensetzungen können mit konventionellen, allgemein bekannten Sterilisierungstechniken sterilisiert oder steril gefiltert werden. Die resultierenden wässrigen Lösungen können zum sofortigen Gebrauch verpackt oder lyophilisiert werden, wobei die lyophilisierte Zubereitung vor der Verabreichung mit einer sterilen wässrigen Lösung kombiniert wird.
  • Wässrige Lösungen sind geeignet zur Injektion und insbesondere zur intravenösen Injektion. Die intravenös verabreichte Lösung kann Reinigungsmittel und Emulgatoren enthalten, wie Lipide. Wässrige Lösungen sind auch zur enteralen Verabreichung als Tonika und zur Verabreichung in Schleimhaut und anderen Membranen, etwa als Nasen- oder Augentropfen verwendbar. Die Zusammensetzung kann einen Thiolester in einer Menge von 1 mg/ml bis 100 mg/ml enthalten, oder mehr bevorzugt 10 mg/ml bis 50 mg/ml.
  • Rezepturen für die enterale oder transdermale Zuführung
  • Feste Rezepturen können für die enterale Verabreichung verwendet werden. Sie können beispielsweise als Pillen, Tabletten, Pulver oder Kapseln formuliert werden. Für feste Zusammensetzungen können herkömmliche nicht-toxische feste Trägerstoffe verwendet werden, zu denen beispielsweise pharmazeutische Sorten von Mannitol, Laktose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Talkum, Zellulose, Glukose, Sukrose und Magnesiumcarbonat gehören. Für die orale Verabreichung wird eine pharmazeutisch akzeptable nicht-toxische Zusammensetzung gebildet, indem einer der normal eingesetzten Trägerstoffe zugegeben wird, wie beispielsweise die oben aufgeführten Trägerstoffe, und im allgemeinen 10%-95% des Wirkstoffs.
  • Eine nicht-feste Rezeptur kann auch für die enterale (orale) Verabreichung verwendet werden. Der Trägerstoff kann aus unterschiedlichen Ölen ausgewählt werden, einschließlich solcher mit Petroleum-, Tier-, Pflanzen- oder synthetischen Ursprungs, z.B. Erdnussöl, Sojabohnenöl, Mineralöl oder Sesamöl. Vgl. Sanchez et al., US-Patent Nr. 5,494,936 . Geeignete pharmazeutische Trägerstoffe umfassen Stärke, Zellulose, Talk, Glukose, Laktose, Sukrose, Gelatin, Malz, Reis, Mehl, Kreide, Kieselgel, Magnesiumstearat, Natriumstearat, Glycerolmonostearat, Natriumchlorid, getrocknete Magermilch, Glycerol, Propylenglykol, Wasser und Ethanol. Nichtionogene Block-Copolymere, die von Ethylenoxid und Propylenoxid synthetisiert wurden, können ebenfalls pharmazeutische Trägerstoffe sein; Copolymere dieses Typs können als Emulgatoren, Benetzungsmittel, Verdickungsmittel, Stabilisatoren und Dispergiermittel dienen, vgl. z.B. Newman (1998) Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 15: 89-142.
  • Eine Einheitsdosierungsform, etwa eine Tablette, kann zwischen 50 mg/Einheit und 2 Gramm/Einheit haben, vorzugsweise zwischen 100 mg/Einheit und 1 Gramm/Einheit.
  • Topische Verabreichung: Transdermale/Transmucosale Zuführung
  • Die systemische Verabreichung kann auch auf transmucosalem oder transdermalem Wege erfolgen. Für die transmucosale oder die transdermale Verabreichung können in der Rezeptur Penetrationsmittel benützt werden, die für die zu durchdringende Barriere geeignet sind. Solche Penetrationsmittel sind in der Fachwelt bekannt und umfassen z.B. für die transmucosale Verabreichung Gallensalze und Fusidinsäurederivate. Darüber hinaus können Detergentien für die leichtere Durchdringung benützt werden. Die transmucosale Verabreichung kann beispielsweise mittels Nasensprays oder Suppositorien erfolgen.
  • Für die topische Verabreichung werden die Agenzien zu Salben, Cremes, Pudern und Gels formuliert. In einem Ausführungsbeispiel kann das transdermale Zuführungsmittel DMSO sein. Transdermale Zuführungssysteme können z.B. auch Pflaster umfassen.
  • Die Thiolester können auch in Mechanismen zur nachhaltigen oder verlangsamten Abgabe verabreicht werden, welche die Rezeptur intern zuführen können. Beispielsweise können biologisch abbaubare Mikrokügelchen oder Kapseln oder andere biologisch abbaubare Polymerkonfigurationen in den Rezepturen enthalten sein, die zur verlangsamten Abgabe einer Zusammensetzung geeignet sind (vgl. z.B. Putney (1998) Nat. Biotechnol. 16: 153-157).
  • Zuführung der Rezeptur durch Inhalation
  • Zur Inhalation kann die Thiolester-Rezeptur unter Anwendung jedes in der Fachwelt bekannten Systems zugeführt werden, einschließlich Trockenpuder-Aerosole, Flüssigkeitszuführungssysteme, Luftstrahlvernebler und Treibsystemen. Vgl. z.B. Patton (1998) Biotechniques 16: 141-143; Inhalationszuführungssysteme z.B. von Dura Pharmaceuticals (San Diego, CA), Aradigm (Hayward, CA), Aerogen (Santa Clara, CA), Inhale Therapeutic Systems (San Carlos, CA) und anderen.
  • Beispielsweise kann die pharmazeutische Rezeptur in Form eines Aerosols oder Nebels verabreicht werden. Für die Aerosol-Verabreichung kann die Rezeptur in fein zerteilter Form mit einem oberflächenaktiven Mittel zusammen und einem Treibmittel zur Verfügung gestellt werden. Das oberflächenaktive Mittel ist vorzugsweise im Treibmittel löslich. Repräsentativ für solche Mittel sind die Ester oder partiellen Ester von Fettsäuren, die von 6 bis 22 Kohlenstoffatome enthalten, wie beispielsweise Hexan-, Octan-, Laurin-, Palmitin-, Stearin-, Linol-, Linolen-, Olesterin- und Ölsäuren mit einem aliphatischen Polyol oder seinem zyklischen Anhydrid, wie beispielsweise Ethylenglykol, Glycerol, Erythritol, Arabitol, Mannitol, Sorbitol, die von Sorbitol abgeleiteten Hexitol-Anhydride und die Polyoxyethylen- und Polyoxypropylenderivate dieser Ester. Gemischte Ester, wie gemischte oder natürliche Glyceride, können verwendet werden. Das oberflächenaktive Mittel kann 0,1%-20% nach dem Gewicht der Zusammensetzung ausmachen, vorzugsweise 0,25%-5%. Der Rest der Rezeptur ist gewöhnliches Treibmittel. Verflüssigte Treibmittel sind in der Regel Gase bei Umgebungsbedingungen und unter Druck kondensiert. Unter den geeigneten verflüssigten Treibmitteln befinden sich die niedrigen Alkane mit bis zu 5 Kohlenstoffen, wie Butan und Propan; und vorzugsweise fluorierte oder fluorochlorierte Alkane. Mischungen derselben können ebenfalls verwendet werden. Bei der Produktion des Aerosols wird ein mit einem geeigneten Ventil versehener Behälter mit dem entsprechenden Treibmittel befüllt, welches die fein verteilten Verbindungen und das oberflächenaktive Mittel enthält. Die Ingredienzien werden damit auf einem erhöhten Druck gehalten, bis sie über das Ventil freigesetzt werden. Vgl. z.B. Edwards (1997) Science 276: 1868-1871.
  • Eine Vernebler- oder Aerosolisierungsgerät zur Verabreichung der Thiolester dieser Erfindung liefert typischer Weise eine inhalierte Dosis von 1 mg/m3 bis 50 mg/m3.
  • Die Inhalationsverabreichung ist besonders wirksam für die Zuführung zu Atemwegsgeweben für die Behandlung von Atemwegserkrankungen mit Entzündungskomponente.
  • Andere Rezepturen
  • Bei der Zubereitung der Arzneimittel der vorliegenden Erfindung kann eine Vielzahl unterschiedlicher Rezeptur-Modifikationen verwendet und gehandhabt werden, um die Pharmakokinetik und Bioverteilung zu beeinflussen. Fachleuten sind unterschiedliche Methoden zur Änderung von Pharmakokinetik und Bioverteilung bekannt. Für eine allgemeine Diskussion der Pharmakokinetik vgl. Remington's Pharmaceutical Sciences, supra, Kapitel 37-39.
  • Verabreichung
  • Die Thiolester der Erfindung werden für die Behandlung und Prävention viraler Infekte verwendet, insbesondere von Retrovirus-Infekten. Die dafür adäquate Thiolester-Menge ist definiert als "therapeutisch wirksame Dosis." Die Dosispläne und wirksamen Mengen für diese Verwendung, also das "Dosierungsschema", sind von unterschiedlichen Faktoren abhängig, darunter die Häufigkeit der Dosierung, das Stadium der Krankheit oder Störung, die Schwere der Erkrankung bzw. Störung, der allgemeine Gesundheitszustand des Patienten bzw. der Patientin, der körperliche Status des Patienten und sein/ihr Alter. Bei der Berechnung des Dosisschemas für die Patienten wird auch der Verabreichungsmodus berücksichtigt.
  • Das Dosierungsschema muss auch die Pharmakokinetik, d. h. die Absorptionsrate, die Bioverfügbarkeit, den Metabolismus und die Clearance des Thiolesters berücksichtigen (vgl. z.B. die neueste Remington's-Ausgabe, supra).
  • Mit den vom behandelnden Arzt ausgewählten Dosierungen und Schemata können ein- oder mehrmalige Verabreichungen der Zusammensetzungen vorgenommen werden. Auf jeden Fall sollten die pharmazeutischen Rezepturen eine Menge eines Thiolesters bereitstellen, die für eine wirksame Behandlung des Patienten ausreichen. Die wirksame Gesamtmenge eines Thiolesters der vorliegenden Erfindung kann dem Patienten als einmalige Dosis entweder in Bolusform oder per Infusion über einen relativ kurzen Zeitraum verabreicht werden, oder auch nach Maßgabe eines fraktionierten Behandlungsprotokolls, in dem die mehreren Dosierungen über einen längeren Zeitraum hinweg verabreicht werden. Eine einschlägig bewanderte Fachperson würde wissen, dass die für eine wirksame Dosis in einem Patienten oder einer Patientin erforderliche Konzentration eines Thiolesters der vorliegenden Erfindung von vielen Faktoren abhängig ist, darunter beispielsweise die Pharmakokinetik der Prodroge und deren Hydrolyseprodukt, das Alter und der allgemeine Gesundheitszustand des Patienten, die Verabreichungsroute, die Anzahl der Behandlungen und das Urteil des verschreibenden Arztes. Angesichts dieser Faktoren würde die erfahrene Fachperson die Dosis so einstellen, dass sie für eine spezifische Anwendung wirksam ist.
  • Vakzin-Rezepturen, die die Thiolester der Erfindung enthalten
  • Die Erfindung schafft auch einen isolierten und inaktivierten Virus, wobei der Virus durch eine Methode inaktiviert ist, welche das Kontaktieren des Virus mit einer Thiolester-Verbindung der Erfindung umfasst, wobei das Kontaktieren des Virus mit der Verbindung den Virus inaktiviert. In einem Ausführungsbeispiel umfasst der isolierte und inaktivierte Virus des weiteren eine Vakzin-Rezeptur. Eine Vakzin-Rezeptur der Erfindung kann auch ein isoliertes Thiolester-komplexiertes Virusprotein umfassen.
  • Die Thiolester-komplexierten, inaktivierten Viren der Erfindung werden in Vakzin-Rezepturen verwendet, die zur Verabreichung an Säugetiere, insbe sondere Menschen, geeignet sind, um unterschiedliche Virenerkrankungen zu behandeln bzw. Immunität gegen solche zu generieren, insbesondere bezüglich Retrovirus-Infektionen, wie etwa HIV-1. Die Vakzin-Rezepturen können einzeln oder in Serie verabreicht werden. Bei Serienverabreichung werden die Inokulationen nach der Erstverabreichung gegeben, um die Immunreaktion zu stärken; diese werden in der Regel als Booster-Inokulationen bezeichnet.
  • Die Vakzine der Erfindung enthalten als Wirkstoffingredienz eine immunogen wirksame Menge eines Thiolester-komplexierten, inaktivierten Virus. Anwendbare Trägerstoffe sind in der Fachwelt allgemein bekannt und umfassen z.B. Thyroglobulin, Albumine, wie etwa Humanserumalbumin, Tetanustoxoid, Polyaminsäuren, wie etwa Poly(D-lysin: D-Glutaminsäure), Influenza-, Hepatitis-B-Viruskernprotein und Hepatitis-B-Virus rekombiniertes Vakzin. Das Vakzin kann auch ein physiologisch verträgliches (akzeptables) Verdünnungsmittel, wie Wasser, phosphat-gepufferte Kochsalzlösung oder Kochsalzlösung enthalten und enthält überdies typischerweise ein Adjuvans. Adjuvantien, wie inkomplettes Freundsches Adjuvans, Aluminiumphosphat, Aluminiumhydroxid oder Aluminiumsulfat werden ebenfalls mit Vorteil zur Stärkung einer Immunreaktion benützt.
  • Anwendungen Thiolester-inaktivierter Viren und Thiolesterkomplexierter Proteine
  • Neben der Verwendung als Vakzine haben Thiolester-inaktivierte Viren und Thiolester-komplexierte Virusproteine unterschiedliche andere Nutzungen. Beispielsweise können Thiolester-komplexierte Virusproteine oder Thiolesterinaktivierte Viren als Reagenzien zur Feststellung entsprechender antiviraler Antikörper verwendet werden. Ein sehr verbreitet genutzter Test zur Feststellung, ob eine Person mit einem Virus – etwa HIV – infiziert ist, besteht im Screening auf antivirale Antikörper. Thiolester-inaktiviertes Virion- oder Thiolester-komplexiertes Virusprotein kann in diesen Bestimmungstests als Abfang-Antigen oder Kontrollantigen dienen. Vgl. z.B. Hashida (1997) J. Clin. Lab. Anal. 11: 267-286; Flo (1995) Eur. J. Clin. Microbiol. infect. Dis. 14: 504-511.
  • Thiolester-inaktiviertes Virion- oder Thiolester-komplexiertes Virusprotein kann als Kristallisierungs-Reagens für die Röntgen-Kristallisationsanalyse oder andere ultrastrukturelle Untersuchungen benützt werden, vgl. z.B. Yamashita (1998) J. Mol. Biol. 278: 609-615; Wu (1998) Biochemistry 37: 4518-4526. Sie können auch als Molekulargewichts-, pl- oder andere Kontrollen in unterschiedlichen physio-chemischen Experimenten und Methodologien verwendet werden.
  • Ausrüstungssätze und Apparate
  • In einem zusätzlichen Aspekt schafft die vorliegende Erfindung Ausrüstungssätze, welche die hier besprochenen Methoden und Apparaturen umfassen. Die Ausrüstungssätze der Erfindung umfassen optional ein oder mehrere der nachstehenden Teile: (1) einen Thiolester oder eine Thiolesterkomponente wie hier beschrieben; (2) Anleitungen zur Praktizierung der hier beschriebenen Methoden und/oder zur Anwendung des Thiolesters bzw. der Thiolesterkomponente; (3) eine oder mehrere Assay-Komponenten; (4) einen Behälter zur Aufbewahrung von Thiolestern, Assay-Komponenten oder Apparateteilen für die Manipulation von Thiolestern oder die Praktizierung der hier beschriebenen Methoden und, (5) Verpackungsmaterialien.
  • In einem weiteren Aspekt schafft die vorliegende Erfindung die Nutzung einer Verbindung, eines Apparats, eines Apparateteils oder Ausrüstungssatzes gemäß diesem Dokument zur Anwendung einer/eines hier erörterten Methode/Assays und/oder zur Verwendung eines Apparats oder Ausrüstungssatzes zur Ausführung einer der hier besprochenen Methoden bzw. eines der besprochenen Assays.
  • Nutzungen der Thiolester
  • In einem weiteren Aspekt schafft die vorliegende Erfindung die Nutzung einer Thiolester-Zusammensetzung, eines Virus, inaktivierten Virus oder einer Virenkomponente, Zelle, Zellkultur, eines Säugetiers, Apparats, eines Apparateteils oder eines Ausrüstungssatzes gemäß diesem Dokument zur Anwendung einer Methode oder eines Assays gemäß dieser Beschreibung und/oder zur Verwendung eines Apparats oder Ausrüstungssatzes zur Durchführung eines Assays oder Anwendung einer Methode dieser Beschreibung und/oder zur Nutzung von Viren, Zellen, Zellkulturen, Zusammensetzungen oder anderen hier erwähnten Funktionen als Medikament. Die Herstellung aller Komponenten dieser Beschreibung als Medikamente für die hier genannten Behandlungen wird ebenfalls bereitgestellt und ist nach Prüfung des Voranstehenden offensichtlich.
  • Eine detailliertere Beschreibung der Erfindung erfolgt mittels besonderer Beispiele. Die nachstehenden Beispiele haben nur illustrativen Charakter und sollen die Erfindung auf keine Weise beschränken oder definieren.
  • BEISPIELE
  • Beispiel 1: Kapillar-Elektrophorese
  • Ein beispielhaftes Mittel zur Bestimmung der Metall-Ion-versetzenden Fähigkeit eines Thiolesters der Erfindung bildet die Kapillar-Elektrophorese. Das NCp7 Protein komplexiert zwei Zink-Ionen, jeweils mit einer formalen Ladung von +2. Die Reagenzien, die mit dem Protein reagieren und die Zink-Ionen entfernen, verursachen eine Änderung in der Konformation und Ladung des Proteins. Deshalb unterscheidet sich die elektrophoretische Mobilität des reagierten Proteins von der Mobilität des unreagierten Proteins. Änderungen in der elektrophoretischen Mobilität des Proteins können auf einfachem Wege durch Kapillarzonen-Elektrophorese (CZE) festgestellt werden.
  • Der Kapillarsäulenpuffer ist, 001 M Natriumphosphat bei pH 3,0, und Proteine werden durch UV-Absorption bei 215 nm festgestellt. Die Proberöhren können etwa 10 oder mehr Mikroliter einer Lösung enthalten, die aus 0,25 Mikrogramm NCp7 pro ml in Wasser bei pH 7,0 besteht, mit oder ohne hinzugefügter Zinkfinger-reaktiven Zusammensetzung, z.B. ein Thiolester der Erfindung. Die Proberöhren werden in einen automatischen Probe-Injektor gestellt. In programmierten Intervallen werden 10 μL der Probe in die Kapillarsäule gezogen und die Daten als UV-Absorption pro Minute gesammelt. Unmodifiziertes p7NC ergibt einen markanten Gipfel von migrierendem Protein, das in etwa 7,95 Minuten durch den Detektor geht. Modifikationen des Proteins, verursacht durch die Reaktion mit der Testverbindung der Wahl, werden durch eine Änderung in diesem Muster offenbart.
  • Die Kapillar-Elektrophorese hat den Vorteil einer einfachen Automatisierung, da viele unterschiedliche Proben in das Probenhaltergestell geladen und in aufeinanderfolgenden Durchgängen analysiert werden können. Jeder Durchgang dauert etwa 10 Minuten, und jede Proberöhre kann viele Male analysiert werden.

Claims (37)

  1. Verbindung der Formel:
    Figure 00700001
    wobei gilt: R1 ist -Y-Z; Y ist -(CH2)m-, wobei m eine Ganzzahl von 1 bis 6 ist; Z ist Pyridinio mit folgender Struktur:
    Figure 00700002
    und wobei: R12, R13, R14, R15 und R16 Reste sind, die unabhängig aus der Gruppe bestehend aus H, -C(=O)NH2 und substituierten Carboxamidogruppen ausgewählt sind; R2 aus der Gruppe bestehend aus H, CH3, -C(=O)NH2 und -C(=O)OCH3-Gruppen ausgewählt ist; R3, R4 und R5 Reste sind, die unabhängig aus der Gruppe bestehend aus H, einem Halogen, -NO2, -C(=O)NH2 und -C(=O)OCH3-Gruppen ausgewählt sind; R6 aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus: H; Alkyl, wobei Alkyl sich auf ein verzweigtes oder unverzweigtes, gesättigtes oder ungesättigtes, monovalentes Kohlenwasserstoffradikal mit 1-30 Kohlenstoffen, vorzugsweise mit 4-20 Kohlenstoffen und meistbevorzugt 6-18 Kohlenstoffen bezieht; CH3, substituiertem Alkyl, wobei substituiertes Alkyl sich auf ein Alkyl bezieht, das eine oder mehrere funktionelle Gruppen besitzt, die an jeden Kohlen stoff der Alkylkomponente gebunden sein können oder von der Alkylkette überstehend oder in diese integriert sein können; Aryl, wobei sich Aryl auf eine aromatische Substituente bezieht, die ein einzelner aromatischer Ring oder mehrere verschmolzene aromatische Ringe sein kann, die kovalent verbunden oder mit einer gemeinsamen Gruppe verbunden sind, die auch ein Carbonyl sein kann; substituiertem Aryl, wobei sich substituiertes Aryl auf Aryl mit einer oder mehreren funktionellen Gruppen und gesättigten sowie ungesättigten zyklischen Kohlenwasserstoffen bezieht, die zu den (dem) aromatischen Ring(en) verschmolzen sind; und Arylalkylgruppen, wobei sich Arylalkyl auf eine Aryl-Untergruppe bezieht, in der die Arylgruppe zusätzlich an eine Alkylgruppe gebunden ist; R7, R8, R10 und R11 H sind; R9 (O=S=O)-G' ist, wobei G' aus der Gruppe bestehend aus -NH2, -NH-Alkyl -NH-Acylgruppen, Nitroaryl und Aryl-NH-Acyl ausgewählt ist.
  2. Verbindung nach Anspruch 1, wobei m die Ganzzahl 4 ist.
  3. Verfahren zum Trennen eines Metallions von einem Zinkfinger-haltigen Protein, wobei das Verfahren den Schritt des Kontaktierens des Zinkfingers mit einer Verbindung eines der Ansprüche 1 oder 2 umfasst und wobei das Kontaktieren des Zinkfingers mit der Verbindung in vitro erfolgt.
  4. Verfahren zur Desaktivierung eines Virus, wobei das Verfahren das Kontaktieren eines Zinkfingers des Virus mit einer Verbindung eines der Ansprüche 1 oder 2 umfasst, wobei das Virus durch das Kontaktieren mit der Verbindung und das Trennen eines Metallions vom Zinkfinger desaktiviert wird, und wobei das Kontaktieren des Zinkfingers mit der Verbindung in vitro erfolgt.
  5. Verfahren zur Herstellung eines anti-retroviralen Medikaments, wobei eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 oder 2 zu einem pharmazeutisch akzeptablen Hilfsstoff hinzugefügt wird, und wobei die Verbindung so konzipiert ist, dass sie ein Metallion von einem Zinkfinger-haltigen Protein trennt, wenn sie mit dem Zinkfinger in Kontakt kommt.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5, wobei das Metallion Zink ist.
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 6, wobei der Zinkfinger ein Virusprotein umfasst.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Virusprotein ein Nucleocapsid-Protein, ein Gag-Protein oder ein Gag-Pol-Protein ist.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 oder 8, wobei das Zinkfingerhaltige Protein in einen intakten Virus eingesetzt wird.
  10. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 9, wobei der Zinkfinger ein Retrovirus-Protein umfasst, das von einer Vogelsarkom- und Leukose-Retrovirusgruppe, einer Säugetier-B-Typ-Retrovirusgruppe, einer Human-T-Zellen-Leukämie- und Rinderleukämie-Retrovirusgruppe, einer D-Typ-Retrovirusgruppe, einer Ratten-Leukämie-verwandten Gruppe oder einer Lentivirusgruppe abgeleitet ist.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Retrovirusprotein von einem HIV-1, einem HIV-2, einem SIV, einem BIV, einem EIAV, einem Visna, einem CaEV, einem HTLV-1, einem BLV-, einem MPMV-, einem MMTV-, einem RSV-, einem MuLV-, einem FeLV, einem BaEV- oder einem SSV-Retrovirus stammt.
  12. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Retrovirusprotein ein HIV-1-Protein ist.
  13. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 12, welches des weiteren das Feststellen der Trennung des Metallions vom Zinkfinger umfasst.
  14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Feststellen der Trennung des Metallions von dem Zinkfinger unter Anwendung einer aus folgender Gruppe ausgewählten Methode durchgeführt wird: Kapillar-Elektrophorese, Immunblotting, Kernspinresonanz (NMR), Hochdruck-Flüssig-Chromatogra phie (HPLC), Feststellen der Freiwerdung von radioaktivem Zink-65, Feststellen von Fluoreszenz und Feststellen einer Gelmobilitätsänderung.
  15. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 14, wobei das Virus ein Retrovirus ist, das von einer Vogelsarkom- und Leukose-Retrovirusgruppe, einer Säugetier-B-Typ-Retrovirusgruppe, einer Human-T-Zellen-Leukämie- und Rinderleukämie-Retrovirusgruppe, einer D-Typ-Retrovirusgruppe, einer Ratten-Leukämie-verwandten Gruppe oder einer Lentivirusgruppe abgeleitet ist.
  16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei das Retrovirusprotein ein HIV-1, ein HIV-2, ein SIV, ein BIV, ein EIAV, ein Visna, ein CaEV, ein HTLV-1, ein BLV-, ein MPMV-, ein MMTV-, ein RSV-, ein MuLV-, ein FeLV, ein BaEV- oder ein SSV-Retrovirus ist.
  17. Verfahren nach Anspruch 15, wobei das Retrovirus ein HIV-1–Retrovirus ist.
  18. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 17, wobei das Verfahren des weiteren das Kontaktieren eines Virus mit einem Non-Thiolester-Antiretrovirus-Agens umfasst.
  19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei das Antiretrovirus-Agens ein Nucleotid-Analog oder ein Protease-Hemmer ist.
  20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei das Nucleotid-Analog ein AZT, ein ddCTP oder ein DDI ist.
  21. Verfahren nach einem der Ansprüche 3, 4 oder 6 bis 9, wobei das Kontaktieren des Retrovirus mit der Verbindung in mindestens einem aus der Gruppe bestehend aus einem Blutprodukt, Blutplasma, Nährmedium, Protein, einer pharmazeutischen Zubereitung, einer kosmetischen Zubereitung, einer Sperma- oder Oozytenzubereitung, Zellen, Zellkulturen, Bakterien, Viren, Lebensmitteln und Getränken durchgeführt wird.
  22. Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 oder 2 und einen pharmazeutisch akzeptablen Hilfsstoff umfasst.
  23. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 22, die des weiteren mindestens eines aus der Gruppe bestehend aus Blutplasma, Nährmedium, Protein, einer pharmazeutischen Zubereitung, einer kosmetischen Zubereitung, einer nichthumanen Sperma- oder nichthumanen Oozytenzubereitung und nichthumanen Zellen oder nichthumanen Zellkulturen, Bakterien, Viren, Lebensmitteln und Getränken umfasst.
  24. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 22 oder 23, worin die Pharmazeutische Zusammensetzung ein Antiretrovirus-Medikament ist.
  25. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 22 bis 24, wobei die Verbindung fähig ist, ein Metallion von einem Zinkfinger-haltigen Protein zu trennen, wenn der Zinkfinger mit der Verbindung in Kontakt gebracht wird.
  26. Antiretrovirus-Medikament nach Anspruch 25, wobei das Metallion Zink ist.
  27. Antiretrovirus-Medikament nach einem der Ansprüche 25 oder 26, wobei der Zinkfinger ein Virusprotein umfasst.
  28. Antiretrovirus-Medikament nach Anspruch 27, wobei das Virusprotein ein Nucleocapsidprotein, ein Gag-Protein oder ein Gag-Pol-Protein ist.
  29. Antiretrovirus-Medikament nach einem der Ansprüche 25 bis 28, wobei der Zinkfinger ein Retrovirus-Protein umfasst, das von einer Vogelsarkom- und Leukose-Retrovirusgruppe, einer Säugetier-B-Typ-Retrovirusgruppe, einer Human-T-Zellen-Leukämie- und Rinderleukämie-Retrovirusgruppe, einer D-Typ-Retrovirusgruppe, einer Ratten-Leukämie-verwandten Gruppe oder einer Lentivirusgruppe abgeleitet ist.
  30. Antiretrovirus-Medikament nach Anspruch 29, wobei das Retrovirusprotein von einem HIV-1, einem HIV-2, einem SIV, einem BIV, einem EIAV, einem Visna, einem CaEV, einem HTLV-1, einem BLV, einem MPMV, einem MMTV, einem RSV, einem MuLV, einem FeLV, einem BaEV oder einem SSV-Retrovirus stammt.
  31. Antiretrovirus-Medikament nach Anspruch 29, wobei das Retrovirusprotein ein HIV-1-Protein ist.
  32. Antiretrovirus-Medikament nach einem der Ansprüche 25 bis 31, wobei das Zinkfinger-haltige Protein in einen intakten Virus eingesetzt ist.
  33. Antiretrovirus-Medikament nach einem der Ansprüche 24 bis 32, wobei die Kontaktierung eines Virus mit der Verbindung in vivo durchzuführen ist.
  34. Antiretrovirus-Medikament nach einem der Ansprüche 24 bis 33, wobei die Verbindung zu verabreichen ist, um die Übertragung des Virus zu hemmen.
  35. Antiretrovirus-Medikament nach Anspruch 34, wobei die Verbindung intravaginal oder intrarektal zu verabreichen ist.
  36. Antiretrovirus-Medikament nach einem der Ansprüche 24 bis 35, wobei die Verbindung einem Menschen als pharmazeutische Rezeptur zu verabreichen ist.
  37. Antiretrovirus-Medikament nach einem der Ansprüche 24 bis 35, wobei die Verbindung einem Tier als veterinär-pharmazeutische Rezeptur zu verabreichen ist.
DE69932820T 1998-06-19 1999-06-18 Thiolester und ihre anwendungen Expired - Lifetime DE69932820T4 (de)

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Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002072140A2 (en) * 2001-02-27 2002-09-19 Institut Pasteur Mhc-i-restricted presentation of hiv-1 virion antigens without viral replication. application to the stimulation of ctl and vaccination in vivo; analysis of vaccinating composition in vitro
CA2456083C (en) 2001-08-03 2012-05-01 John K. Inman Acylthiols and component thiol compositions as anti-hiv and anti-retroviral agents
EP1575549A4 (de) 2002-10-08 2008-05-07 Us Gov Health & Human Serv Identifizierung von anti-hiv-verbindungen zur hemmung der virusanordnung und bindung von nucleocapsid-protein an nukleinsäure
US9126909B2 (en) * 2012-12-06 2015-09-08 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture Heavy metal remediation via sulfur-modified bio-oils
EP3290412A1 (de) 2016-08-31 2018-03-07 Università degli Studi di Siena Hiv-1-nukleocapsid-inhibitoren
CN111269159B (zh) * 2018-12-05 2021-11-02 上海交通大学 一种化工中间体2,2′-二硫代二苯酰胺类化合物的制备方法
JP7476153B2 (ja) * 2021-10-07 2024-04-30 日本電子株式会社 ホスホニウム化合物、誘導体化用試薬キット、質量分析方法、及びホスホニウム化合物の製造方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5268389A (en) * 1989-10-16 1993-12-07 Uniroyal Chemical Company, Inc. Thiocarboxylate ester compounds compositions containing the same
IE75693B1 (en) * 1990-07-10 1997-09-10 Janssen Pharmaceutica Nv HIV-inhibiting benzeneacetamide derivatives
EP0620809B1 (de) * 1991-12-30 1997-03-05 Janssen Pharmaceutica N.V. Alpha-substituierte benzenmethanamin-derivate
US5734081A (en) * 1994-08-05 1998-03-31 Warner-Lambert Company Arylthio compounds
US6001555A (en) * 1994-09-23 1999-12-14 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method for identifying and using compounds that inactivate HIV-1 and other retroviruses by attacking highly conserved zinc fingers in the viral nucleocapsid protein
US5620997A (en) * 1995-05-31 1997-04-15 Warner-Lambert Company Isothiazolones
EP1047656A4 (de) * 1998-01-16 2003-07-30 Purdue Research Foundation Nicht-nukleosidische hiv-1 reverse transkriptaseblocker mit alkenyldiarylmethanstruktur

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