[go: up one dir, main page]

DE69926261T2 - Koppeln an feste phasen von kohlenhydraten, die von lipopolysacchariden abgeleitet sind - Google Patents

Koppeln an feste phasen von kohlenhydraten, die von lipopolysacchariden abgeleitet sind Download PDF

Info

Publication number
DE69926261T2
DE69926261T2 DE69926261T DE69926261T DE69926261T2 DE 69926261 T2 DE69926261 T2 DE 69926261T2 DE 69926261 T DE69926261 T DE 69926261T DE 69926261 T DE69926261 T DE 69926261T DE 69926261 T2 DE69926261 T2 DE 69926261T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
polysaccharide
lps
salmonella
reporter
reporter molecule
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
DE69926261T
Other languages
English (en)
Other versions
DE69926261D1 (de
Inventor
Havsteen Mogens JAKOBSEN
Ulrik Boas
Irene Eva JAUHO
M. Peter HEEGAARD
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Exiqon AS
Original Assignee
Exiqon AS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Exiqon AS filed Critical Exiqon AS
Application granted granted Critical
Publication of DE69926261D1 publication Critical patent/DE69926261D1/de
Publication of DE69926261T2 publication Critical patent/DE69926261T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
    • C40B40/12—Libraries containing saccharides or polysaccharides, or derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • F—MECHANICAL ENGINEERING; LIGHTING; HEATING; WEAPONS; BLASTING
    • F03—MACHINES OR ENGINES FOR LIQUIDS; WIND, SPRING, OR WEIGHT MOTORS; PRODUCING MECHANICAL POWER OR A REACTIVE PROPULSIVE THRUST, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • F03D—WIND MOTORS
    • F03D13/00—Assembly, mounting or commissioning of wind motors; Arrangements specially adapted for transporting wind motor components
    • F03D13/10—Assembly of wind motors; Arrangements for erecting wind motors
    • F—MECHANICAL ENGINEERING; LIGHTING; HEATING; WEAPONS; BLASTING
    • F03—MACHINES OR ENGINES FOR LIQUIDS; WIND, SPRING, OR WEIGHT MOTORS; PRODUCING MECHANICAL POWER OR A REACTIVE PROPULSIVE THRUST, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • F03D—WIND MOTORS
    • F03D15/00—Transmission of mechanical power
    • F03D15/20—Gearless transmission, i.e. direct-drive
    • F—MECHANICAL ENGINEERING; LIGHTING; HEATING; WEAPONS; BLASTING
    • F03—MACHINES OR ENGINES FOR LIQUIDS; WIND, SPRING, OR WEIGHT MOTORS; PRODUCING MECHANICAL POWER OR A REACTIVE PROPULSIVE THRUST, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • F03D—WIND MOTORS
    • F03D9/00—Adaptations of wind motors for special use; Combinations of wind motors with apparatus driven thereby; Wind motors specially adapted for installation in particular locations
    • F03D9/20—Wind motors characterised by the driven apparatus
    • F03D9/25—Wind motors characterised by the driven apparatus the apparatus being an electrical generator
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54353—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand attached to the carrier via a chemical coupling agent
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G01N33/56916—Enterobacteria, e.g. shigella, salmonella, klebsiella, serratia
    • H—ELECTRICITY
    • H02—GENERATION; CONVERSION OR DISTRIBUTION OF ELECTRIC POWER
    • H02K—DYNAMO-ELECTRIC MACHINES
    • H02K1/00—Details of the magnetic circuit
    • H02K1/06—Details of the magnetic circuit characterised by the shape, form or construction
    • H02K1/12—Stationary parts of the magnetic circuit
    • H02K1/14—Stator cores with salient poles
    • H02K1/146—Stator cores with salient poles consisting of a generally annular yoke with salient poles
    • H02K1/148—Sectional cores
    • H—ELECTRICITY
    • H02—GENERATION; CONVERSION OR DISTRIBUTION OF ELECTRIC POWER
    • H02K—DYNAMO-ELECTRIC MACHINES
    • H02K15/00—Processes or apparatus specially adapted for manufacturing, assembling, maintaining or repairing of dynamo-electric machines
    • H02K15/02—Processes or apparatus specially adapted for manufacturing, assembling, maintaining or repairing of dynamo-electric machines of stator or rotor bodies
    • H—ELECTRICITY
    • H02—GENERATION; CONVERSION OR DISTRIBUTION OF ELECTRIC POWER
    • H02K—DYNAMO-ELECTRIC MACHINES
    • H02K15/00—Processes or apparatus specially adapted for manufacturing, assembling, maintaining or repairing of dynamo-electric machines
    • H02K15/50—Disassembling, repairing or modifying dynamo-electric machines
    • H—ELECTRICITY
    • H02—GENERATION; CONVERSION OR DISTRIBUTION OF ELECTRIC POWER
    • H02K—DYNAMO-ELECTRIC MACHINES
    • H02K7/00—Arrangements for handling mechanical energy structurally associated with dynamo-electric machines, e.g. structural association with mechanical driving motors or auxiliary dynamo-electric machines
    • H02K7/18—Structural association of electric generators with mechanical driving motors, e.g. with turbines
    • H02K7/1807—Rotary generators
    • H02K7/1823—Rotary generators structurally associated with turbines or similar engines
    • H02K7/183—Rotary generators structurally associated with turbines or similar engines wherein the turbine is a wind turbine
    • H02K7/1838—Generators mounted in a nacelle or similar structure of a horizontal axis wind turbine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07B—GENERAL METHODS OF ORGANIC CHEMISTRY; APPARATUS THEREFOR
    • C07B2200/00—Indexing scheme relating to specific properties of organic compounds
    • C07B2200/11—Compounds covalently bound to a solid support
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/24—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • G01N2333/255—Salmonella (G)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2400/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates
    • G01N2400/10—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • G01N2400/50—Lipopolysaccharides; LPS
    • H—ELECTRICITY
    • H02—GENERATION; CONVERSION OR DISTRIBUTION OF ELECTRIC POWER
    • H02K—DYNAMO-ELECTRIC MACHINES
    • H02K2201/00—Specific aspects not provided for in the other groups of this subclass relating to the magnetic circuits
    • H02K2201/03—Machines characterised by aspects of the air-gap between rotor and stator
    • H—ELECTRICITY
    • H02—GENERATION; CONVERSION OR DISTRIBUTION OF ELECTRIC POWER
    • H02K—DYNAMO-ELECTRIC MACHINES
    • H02K2213/00—Specific aspects, not otherwise provided for and not covered by codes H02K2201/00 - H02K2211/00
    • H02K2213/12—Machines characterised by the modularity of some components
    • H—ELECTRICITY
    • H02—GENERATION; CONVERSION OR DISTRIBUTION OF ELECTRIC POWER
    • H02K—DYNAMO-ELECTRIC MACHINES
    • H02K5/00—Casings; Enclosures; Supports
    • H02K5/04—Casings or enclosures characterised by the shape, form or construction thereof
    • H02K5/10—Casings or enclosures characterised by the shape, form or construction thereof with arrangements for protection from ingress, e.g. water or fingers
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E10/00—Energy generation through renewable energy sources
    • Y02E10/70—Wind energy
    • Y02E10/72—Wind turbines with rotation axis in wind direction

Landscapes

  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Sustainable Energy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Power Engineering (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Mechanical Engineering (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Combustion & Propulsion (AREA)
  • Manufacturing & Machinery (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)

Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Immobilisierung spezieller Klassen von Polysacchariden auf festen Oberflächen. Solch ein Verfahren ist vor allem bei der Ausarbeitung von verlässlichen Tests, zur Detektion eines Antikörpers, der dem Polysaccarid-Antigen entspricht, sehr wertvoll. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem modifizierte feste Oberflächen und die Verwendung solcher Oberflächen in verschiedenen Diagnosetests. Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung neue KDO-Derivate, die wertvolle Zwischenprodukte bei der Herstellung solcher modifizierter fester Oberflächen darstellen.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Bakterielle Lipopolysaccharide (LPS) sind charakteristische Bestandteile der äußeren Membran von gramnegativen Bakterien. LPS werden gerne in Diagnosetests als Antigene verwendet, die speziell zur spezifischen Detektion von Antikörpern in Serum, Plasma, Fleischsaft, Speichel oder anderen Körperflüssigkeiten, die ihren Ursprung in bakteriellen Infektionen bei Menschen und Tieren haben, entworfen wurden. LPS sind stark immunogen und umfassen eine der Epitopcharakteristika eines vorgegebenen Bakterienstamms. Tatsächlich basierte die Definition eines Serotyps oft auf der LPS- und/oder Kapselpolysaccharid-(KPS-)Antigenität. Die Antigenspezifität des LPS-Moleküls liegt im Polysaccharidteil des LPS, dem O-Antigen, während die Toxizität des LPS durch Reste verursacht wird, die im Lipidteil des LPS enthalten sind, dem so genannten Lipid A. LPS sind aufgrund der gemeinsamen Gegenwart einer hydrophilen O-Polysaccharidgruppe und einer hydrophilen Lipidgruppe im LPS-Molekül äußerst amphiphile Verbindungen. Die meisten der charakterisierten LPS weisen die gleiche Grundstruktur auf, die vor allem im Lipid A und den inneren Kernteilen der LPS erhalten ist. Der Kern ist der Teil des Polysaccharids, der die Bindung zwischen dem O-Antigen und dem Lipid A umfasst. Diese Bindung besteht aus nahmslos aus einer Ketosidbindung zwischen der Halbketalfunktionalität des innersten KDO-Rests und einer Hydroxylgruppe eines GlcNAc-Rests des Lipids A. Das O-Antigen eines spezifischen bakteriellen Serotyps variiert je nach Anzahl an Grundeinheiten und kann nichtstöchiometrische Substitutionen mit Acetyl, Phosphat, Glykosyl oder anderen Gruppen enthalten. Im Allgemeinen werden LPS-Moleküle ohne O-Antigene, d.h. solche, die neben dem Lipid A nur (Teile der) Kernsaccharide tragen, "raue" LPS genannt, während LPS-Moleküle, die O-Antigene tragen, als "glatt" bezeichnet werden (Raetz, C. R. H., in Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology, Bd. 1, 2. Aufl., S. 1035-1063, Nedhardt, F. C. E. A. (Hrsg.), American Society for Microbiology, Washington D.C. (1996); Hitchcock et al., J. Bacteriol. 166, 699-705 (1986)).
  • Die enzymgekuppelte Immunadsorptionsbestimmung ELISA ist ein allgemein bekanntes Verfahren zur Detektion von Antikörpern. Bei diesem Test werden die LPS durch passive Adsorption auf eine feste Oberfläche (z.B. eine Kunststoffoberfläche) aufgebracht oder darauf immobilisiert, wo sie als Sonden für spezifische Antikörper dienen. Bei diesem Verfahren wird die LPS-beschichtete Oberfläche mit der biologischen Probe inkubiert und auf die Gegenwart von Antikörpern untersucht, gefolgt von einer Inkubation des LPS-Antikörper-Komplexes mit einem markierten sekundären Antikörper.
  • Früher wurden LPS im Allgemeinen ohne Modifikation der Moleküle auf einer festen Oberfläche immobilisiert, da der hydrophobe Lipid-A-Teil der Moleküle als ziemlich effizienter "Anker" fungiert, der die LPS durch nichtkovalente hydrophobe Wechselwirkungen an die Oberfläche bindet, sodass die hydrophilen O-Polysaccharide nach außen weisen und für Wechselwirkungen mit Bindungskomponenten, wie z.B. Antikörpern, zugänglich sind. Es zeigte sich jedoch, dass die Effizienz, mit der die LPS auf hydrophoben Oberflächen immobilisiert werden, sowohl von der Art der Oberfläche als auch dem Gleichgewicht zwischen freien LPS und entstandenen LPS-Mizellen abhängt. Das Gleichgewicht zwischen freien LPS und entstandenen LPS-Mizellen hängt von der amphiphilen Natur der LPS ab und variiert zwischen LPS von unterschiedlichen Bakterienstämmen sowie zwischen unterschiedlichen LPS-Seroty pen. Wie sich herausgestellt hat, sind bestimmte LPS-Arten ohne Zusatz unterschiedlicher Mizellen-Dispergiermittel (Detergentien) zur Beschichtungslösung nur schwer durch nichtkovalente Bindungen auf festen Oberflächen zu immobilisieren.
  • Somit variieren die optimalen Bedingungen zwischen LPS von unterschiedlichen Bakterienstämmen sowie zwischen Serotypen der gleichen Bakterien, was eine gleichzeitige Immobilisierung von zwei oder mehr unterschiedlichen LPS auf derselben Oberfläche schwierig macht. Das ist wahrscheinlich auf die Fähigkeit eines gut beschichteten LPS zurückzuführen, weniger gut beschichtete Typen zu verdrängen. Dieses Phänomen wurde an Salmonella-Infantis-LPS nachgewiesen, die gut auf Kunststoff aufgetragen werden können. In einem Test zur Detektion von Salmonella-Typhimurium- und Salmonella-Infantis-spezifischen Antikörpern führte dies zur Substitution von Salmonella-Infantis-LPS durch Salmonella-Choleraesuis-LPS, die viel besser aufzutragen sind und die gleichen antigenen Serotypen (O-Antigene) tragen (Nielsen, B., et al., Vet. Microbiol. 47, 205-218 (1995)). Die Neigung von LPS, Mizellen (oder Aggregate) zu bilden, verringert wahrscheinlich die Stabilität der LPS-Beschichtung, da die Wechselwirkungen zwischen bimolekularen (oder aggregierten oder Cluster-) LPS und der Oberfläche wahrscheinlich schwächer ist als die Wechselwirkungen zwischen einem einzelnen LPS-Molekül und der Oberfläche. Mit anderen Worten kann die potentielle Neigung von LPS, bei der Beschichtung Cluster zu bilden, zu einer geringeren und unvorhersehbaren Beschichtungsstabilität führen und die langfristige Stabilität der Beschichtung verringern.
  • Die EP-A-0.101.119 beschreibt die Immobilisierung eines Lipopolysaccharids auf einem unlöslichen Träger durch Kondensation des Lipopolysaccharids mit entweder einer Amino- oder Carboxylgruppe des unlöslichen Trägers.
  • Die JP-A-2-242448 (Patent Abstract of Japan) beschreibt die Immobilisierung eines Lipid-A-Glykosids von 3-Desoxy-D-manno-2-octurosonsäure auf der Oberfläche eines unlöslichen Trägers über eine Amidbindung.
  • Äußerst hydrophile Antigene, wie z.B. bakterielle Polysaccharide (PS), sind auf den am häufigsten in serologischen Tests verwendeten Oberflächen, wie z.B. bei ELISA und RIA (Radioimmunoassay) verwendeten Kunststoffen, in Agglutinationsverfahren eingesetzten Latexteilchen und PVDF (Polyvinylidendifluorid), sowie auf Nitrocellulose und anderen Materialien für Tauchstab-, Blotting- oder andere rasche Assays oft sehr schwer zu adsorbieren (immobilisieren). Demgemäß beschichten PS als solche nur unzureichend und erfordern die Verwendung großer Mengen an Polysaccharidantigen oder extreme pH-Werte und können nicht mit Polysaccharidgemischen verwendet werden (Elkins et al., J. Immunol. Meth. 130, 123-131 (1990)). Deshalb werden trotz der oben genannten Nachteile ausschließlich LPS als Beschichtungsantigene verwendet, da das Lipid A die erforderliche Hydrophobie bereitstellt, die für eine adäquate Beschichtung der Oberfläche mit Antigenen notwendig ist.
  • PS wurden bereits aus LPS isoliert, mit der Absicht, Konjugate aus PS und Trägersubstanzen herzustellen, zumeist Trägerproteine für Impfzwecke (Aron et al., J. Clin. Microbiol. 31, 975-978 (1993); Lambden und Heckels, J. Immunol. Meth. 48, 233-240 (1982); Gupta et al., Inf. Immun. 63, 2805-2810 (1995)).
  • Es wurde bereits nachgewiesen, dass der Polysaccharidteil des Salmonella-Typhimurium-Lipopolysaccharids (LPS) mit Biotin derivatisiert und auf einer streptavidinbeschichteten ELISA-Platte immobilisiert werden kann, wo es durch Antikörper gegen PS erkannt werden kann. Durch die Verwendung des Hydrazidderivats von Biotin war es möglich, das PS direkt ohne vorherigen Oxidationsschritt mit Biotinhydrazid umzusetzen; es zeigte sich, dass das Hydrazid mit dem Halbketal der KDO des reduzierenden Endes des PS reagierte. Dieses Verfahren führte zwar zu antigenisch intakten biotinylierten PS-Derivaten, ergab jedoch Derivate, die nicht stabil waren, und Avidin- oder Streptavidinbeschichtung musste in den Test eingeführt werden (Wiuff, C., Lind, P., Heegaard, P., "Tegioselective Coupling of Reducing Carbohydrates to Hydrazides for Derivatization of Bacterial Polysaccharides and Application to Immunoassays", Proc. 2nd Carbohydrate Engineering Meeting, La Rochelle, Frankreich, S. 66 (1997)).
  • In Meikle et al. (Glycoconjugate J. 7, 207-218 (1990)) wird ein PS in einem ELISA verwendet, indem das PS in einer kompetitiven Vorschrift direkt an ein Detektionsenzym gebunden wird. Die Bindung wurde durch reduktive Aminierung der Ketofunktionalität der Ketocarboxygruppe einer KDO-Einheit des PS erreicht. Das PS/Detektionsenzym-Konjugat wurde nicht zur Beschichtung verwendet, sondern in einem späteren Schritt des Assays in Lösung.
  • Im Allgemeinen erfordert die Bindung von PS an feste Oberflächen Modifikationen des PS-Moleküls, aber auf eine Weise, dass das O-Antigen unverändert bleibt. Für natürlich vorkommende Polysaccharid wurde eine Reihe solcher Modifikationen beschrieben. Ein allgemein bekanntes Beispiel ist die Kupplung von Kapselpolysacchariden (KPS), die keinen hydrophoben Teil (oder solche Gruppen) enthalten, an Proteine (Laferrière et al., Vaccine 15, 179-186 (1997); Beuvery et al., Develop. biol. Standard. 63, 117-128 (1986)). Die resultierenden Polysaccharid-Protein-Komplexe werden dann durch hydrophobe Gruppen im Trägerprotein an die Oberflächen adsorbiert. Bakterielle Kapselpolysaccharide wurden ebenfalls durch nichtregioselektive Umsetzung von Hydroxylgruppen mit hydrophoben Gruppen, z.B. Phenyl oder Thyramin, modifiziert, um die Gesamthydrophobie des KPS-Moleküle und so die Bindungsfähigkeit an feste Oberflächen zu erhöhen (Kristensen und Bentzon, APMIS 100, 142-146 (1992)).
  • Ein Hauptproblem besteht darin, dass die Antigenität nach der Derivatisierung des Polysaccharids eventuell schwer aufrechtzuerhalten ist, da die meisten Verfahren nicht auf die Derivatisierung einer spezifischen Region des Polysaccharidantigens ausgerichtet sind, wodurch möglicherweise antigene Epitope des Polysaccharids zerstört oder modifiziert werden.
  • Das wurde durch die vorliegende Erfindung gelöst, indem die Derivatisierung auf bestimmte Regionen des Kohlenhydrats eingeschränkt wurde.
  • KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
  • 1: Schematische Molekülstruktur von E.-coli-K12-LPS. Abkürzungen: GlcN, D-Glucosamin; Kdo, 3-Desoxy-D-manno-octulosonsäure; Hep, L-Glycero-D-mannoheptose; Glc, D-Glucose; Gal, D-Galactose; GlcNAc, N-Acetyl-D-glucosamin; Rha, L-Rhamnose; Galf, D-Galactofuranose; P, Phosphat; P-Etn, Phosphoethanolamin; P-P-Etn, Ethanolaminpyrophosphat; Ac, Acetat.
  • 2: Zeigt den inneren Kern- und den Lipid-A-Teil von LPS einer typischen gramnegativen Bakterie.
  • 3: UV-spektroskopisches Profil von LPS von Salmonella Typhimurium.
  • 4: UV-spektroskopisches Profil von LPS von Salmonella Choleraesuis.
  • 5: Links: silbergefärbtes Polyacrylamidgel mit gereinigten LPS von Salmonella Typhimurium. Spur 1: niedermolekularer Marker (BioRad); 2: leer; 3: 4 μg LPS; 4: 8 μg LPS; 5: 12 μg LPS; 6: 16 μg LPS, 7: 20 μg LPS, 8: 24 μg LPS, 9: leer. Rechts: coomassiegefärbtes Polyacrylamidgel mit LPS von Salmonella Typhimurium. Proben wie oben aufgetragen.
  • 6: Links: silbergefärbtes Polyacrylamidgel mit gereinigten LPS von Salmonella Choleraesuis. Spur 1: leer; 2: niedermolekularer Marker (BioRad); 3: leer; 4: 6 μg LPS; 5: 12 μg LPS; 6: 18 μg LPS, 7: 24 μg LPS, 8: 30 μg LPS, 9: 36 μg LPS; 10: leer. Rechts: coomassiegefärbtes Polyacrylamidgel mit LPS von Salmonella Choleraesuis. Proben wie oben aufgetragen.
  • 7: Indirekter ELISA von LPS und von PS von Salmonella Typhimurium. Die Antigene wurden in 2fach-Titrationsreihen aufgetragen, beginnend mit 0,4 μg/ml. Ein 1:400 verdünntes Salmonella-Typhimurium-positives Schweineserum wurde als Antikörper verwendet. (Die Proben scheinen in folgender Reihenfolge auf (höchste OD bei "1" zuerst): LPS E-01, LPS E-02, PS E-02, PS E-01).
  • 8: Indirekter ELISA von LPS und von PS von Salmonella Choleraesuis. Die Antigene wurden in 2fach-Titrationsreihen aufgetragen, beginnend mit 0,6 μg/ml. Ein 1:600 verdünntes Salmonella-Infantis-positives Schweineserum wurde als Antikörper verwendet. (Die Proben scheinen in folgender Reihenfolge auf (höchste OD bei "1" zuerst): LPS E-06, LPS E-08, PS E-08, PS E-06).
  • 9: Silbergefärbtes Polyacrylamidgel mit gereinigtem PS von Salmonella Choleraesuis. 1-5: Unterschiedliche Chargen PS. 1,5 μg aufgetragen.
  • 10: UV-spektrometrisches Profil von AQ-PS von Salmonella Typhimurium.
  • 11: UV-spektrometrisches Profil von AQ-PS von Salmonella Choleraesuis.
  • 12: Silbergefärbtes Polyacrylamidgel mit AQ-PS von Salmonella Choleraesuis. 1-2: Zwei unterschiedliche Chargen AQ-PS. 1,5 μg aufgetragen.
  • 13: Kompetitiver ELISA mit Salmonella-Typhimurium-PS, das auf mit Salmonella-Typhimurium-LPS beschichtete Platten 2fach titriert wurde, im Vergleich zum intakten Salmonella-Typhimurium-LPS. Von beiden kompetitiven Antigenen wurden 5 mg/ml titriert. Die Platten wurden mit 0,05 μg/ml Salmoneall-typhimurium-LPS beschichtet. Ein 1:400 verdünntes Salmonella-Typhimurium-positives Schweineserum wurde als Antikörper verwendet. (Obere Kurve: LPS; untere Kurve: PS.)
  • 14: Kompetitiver ELISA mit Salmonella-Choleraesuis-PS, das auf mit Salmonella-Choleraesuis-LPS beschichtete Platten 2fach titriert wurde, im Vergleich zum intakten Salmonella-Choleraesuis-LPS. Von beiden kompetitiven Antigenen wurden 5 mg/ml titriert. Die Platten wurden mit 0,5 μg/ml Salmonella-Choleraesuis-LPS beschichtet. Ein 1:600 verdünntes Salmonella-Choleraesuis-positives Schweineserum wurde als Antikörper verwendet. (Niedrigste Kurve (und höchste OD bei 1 und 2): PS.)
  • 15: Wirkung der AQ-PS-Konzentration (Salmonella Typhimurium) auf die Photokupplungseffizienz.
  • 16: Wirkung der AQ-PS-Konzentration (Salmonella Choleraesuis) auf die Photokupplungseffizienz.
  • 17: Wirkung von anorganischen Salzen und des pHs auf die Photokupplungseffizienz von AQ-PS (Salmonella Typhimurium).
  • 18: Wirkung von anorganischen Salzen und des pHs auf die Photokupplungseffizienz von AQ-PS (Salmonella Choleraesuis).
  • 19: Wirkung der Bestrahlungsdauer von AQ-PS (Salmonella Typhimurium) und von AQ-PS (Salmonella Choleraesuis) auf die Photokupplungseffizienz.
  • 20: Serologischer Test (indirekter ELISA) mit Schweineseren an photogekuppeltem AQ-PS (Salmonella Typhimurium). Seren 1 bis 5: Seren ohne Salmonellen-Vorgeschichte (negativ). Seren 6 bis 15: Seren von experimentell mit Salmonella Typhimurium infizierten Schweinen (positiv).
  • 21: ELISA mit einem photogekuppelten AQ-PS-Gemisch von Salmonella Typhimurium und Salmonella Choleraesuis. Proben 1-10: Negative Kontrollseren. Proben 11-20: Positive Seren von experimentell mit Salmonella-Typhimurium infizierten Schweinen.
  • 22: Lagerstabilität von photogekuppelten AQ-PS-Gemischen (Salmonella Typhimurium und Salmonella Choleraesuis). Seren: weiß: Seren ohne Salmonellen-Vorgeschichte (negativ); rot, rosa, braun, grün: Seren von experimentell mit Salmonella Typhimurium infizierten Schweinen (positiv); gelb, blau: Seren von experimentell mit Salmonella Infantis infizierten Schweinen (positiv).
  • 23: Indirekter ELISA mit PS und Biotin-PS-Konjugaten (Salmonella Typhimurium) an streptavidinbeschichteten Platten. (Linke Balken: Biotin-PS; rechte Balken: PS.)
  • 24: Zweifach-Titrationen des APP5b-PS-AQ-Konjugats, beginnend mit 500 ng PS-AQ pro Well. Die Platte wurde mit einem APP5b-positiven Schweineserum und einem negativen Serum (SPF-Serum), 1:400 in PBST verdünnt, inkubiert.
  • KURZBESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt neue Verfahren zur Immobilisierung eines Polysaccharids auf einer festen Oberfläche bereit.
  • Somit stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Immobilisierung eines Polysaccharids (PS) auf einer festen Oberfläche bereit, wobei das Polysaccharid eine Ketocarboxygruppe (-C(=O)COOH) oder eine entsprechende Ketal- oder Halbketalgruppe aufweist und das Verfahren folgende Schritte umfasst:
    • (a) Ausbildung einer kovalenten Bindung zwischen der Carboxygruppe des Polysaccharids und einem Reportermolekül (RM), wodurch ein Polysaccharid-Reportermolekül-Konjugat (PS-RM) gebildet wird, wobei das Reportermolekül eine Erkennungs-/Substratstelle umfasst; und
    • (b) Immobilisierung des Polysaccharid-Reportermolekül-Konjugats (PS-RM) durch Bildung einer spezifischen Bindung zwischen der Erkennungs-/Substratstelle des Reportermoleküls und einer Aufnahme-/Reagensstelle auf der festen Oberfläche.
  • Die vorliegende Erfindung stellt außerdem eine so erhältliche feste Oberfläche und die Verwendung solcher festen Oberflächen für diagnostische Zwecke bereit.
  • Außerdem stellt die vorliegende Erfindung eine Verbindung der allgemeinen Formel I, die als Zwischenprodukt in Schritt (a) des obigen Verfahrens gebildet wird:
    Figure 00100001
    (oder, wenn R2 Wasserstoff ist, gegebenenfalls deren Ketoanalog) worin:
    R1 aus Wasserstoff und einem Reportermolekül L-R ausgewählt ist, worin L ein optionaler Linkerteil des Reportermoleküls ist und R ein Reporterteil des Reportermoleküls ist;
    RN aus Wasserstoff und C1-4-Alkyl ausgewählt ist;
    F aus einer Einfachbindung, Phenylen, Carbonyl (C(=O)), Carbonylimino (C(=O)NH), Thiocarbonyl ((C(=S)) und Imino (-NH-) ausgewählt ist;
    R2, R7, R8 unabhängig voneinander aus Wasserstoff und Hydroxyschutzgruppen ausgewählt sind;
    R4 aus Wasserstoff, einem Mono- oder Dischaccharidrest und einer Hydroxyschutzgruppe ausgewählt ist; und
    R5 aus Wasserstoff, einem Polysaccharidrest, dessen funktionelle Gruppen gegebenenfalls geschützt sind, und einer Hydroxyschutzgruppe ausgewählt ist, sowie ein Verfahren zu ihrer Herstellung bereit.
  • Somit besteht ein spezielles Ziel der vorliegenden Erfindung in der Bereitstellung eines Verfahrens zur regioselektiven Kupplung von bakteriellen Polysacchariden, die von LPS stammen, an feste Oberflächen, wobei das Verfahren für alle Typen solcher bakteriellen Polysaccharide, die von LPS stammen, anwendbar ist, keinen Einfluss auf die antigene Struktur des Polysaccharids hat und keine Komponenten einbringt, die zum nichtspezifischen Hintergrund beitragen oder zu unerwünschter Kreuzreaktivität führen, wenn das immobilisierte Polysaccharid in einem Test verwendet wird.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Wie oben erwähnt betrifft die vorliegende Erfindung unter anderem ein Verfahren zur Immobilisierung eines Polysaccharids (PS) auf einer festen Oberfläche.
  • In diesem Kontext bezieht sich der Begriff "Polysaccharid" auf eine Einheit, die zwei oder mehr glykosidisch verknüpfte Monosaccharid-Einheiten umfasst. Vorzugsweise umfasst das "Polysaccharid" zumindest 5, beispielsweise 5-1000, verknüpfte Monosaccharid-Einheiten, oder zumindest 10, z.B. 10-1000, verknüpfte Monosaccharid-Einheiten, insbesondere zumindest 25 verknüpfte Monosaccharid-Einheiten. Das Polysaccharid kann so verknüpft sein, dass es ein lineares oder verzweigtes Polysaccharid bildet.
  • Ein einzelnen Monosaccharide sind typischerweise natürlich vorkommende Monosaccharide, die Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung als Polysaccharidbestandteile natürlichen Ursprungs bekannt sind. Beispiele für solche Monosaccharide sind Ribose, Desoxyribose, Arabinose, Xylose, Apiose, Fucose, Rhamnose, Fructose, Glucose, Mannose, Galactose, Glucosamin, Muraminsäure, Galactosamin, Glucuronsäure, Iduronsäure, Mannuronsäure, Guluronsäure, Galacturonsäure, Glyceromanno-heptose, 3-Desoxy-manno-octulosonsäure, Neruaminsäure (5-Amino-3,5-didesoxy-D-glycero-D-galacto-nonulosonsäure), Abequose, N-Acetylgalactosamin und N-Acetylgalactofuranose. Insbesondere interessante Beispiele sind D-Ribose, D-Desoxyribose, D-Arabinose, D-Xylose, D-Apiose, L-Fucose, L-Rhamnnose, D-Fructose, D-Glucose, D-Mannose, D-Galactose, L-Galactose, D-Glucosamin, Muraminsäure, D-Galactosamin, D-Glucoronsäure, L-Iduronsäure, D-Mannuronsäure, L-Guluronsäure, D-Galactoronsäure, L-Glycero-D-manno-heptose, 3-Desoxy-D-mannooctulosonsäure (KDO), Neuraminsäure (5-Amino-3,5-didesoxy-D-glycero-D-galactononulosonsäure), Abequose, N-Acetyol-D-galactosamin und N-Acetyl-D-galactofuranose. Am interessantesten sind D-Glucosamin, KDO, L-Glycero-D-manno-heptose, D-Glucose, D-Galactose, N-Acetyl-D-glucosamin, L-Rhamnose und D-Galactofuranose.
  • Das Polysaccharid kann im Wesentlichen unsubstituiert sein, aber aufgrund des typischen biologischen Ursprungs des Polysaccharids ist es meist nichtstöchiometrisch mit Acetyl, Phosphat, Pyrophosphat, Phosphoethanolamin, Ethanolaminpyrophosphat, O-Methyl, Sulfat oder anderen Gruppen substituiert.
  • Das Molekulargewicht des Polysaccharids (einschließlich jeglicher Substituenten) beträgt vorzugsweise zumindest 1.000, beispielsweise 1.000-200.000, insbesondere zumindest 2.000, beispielsweise 2.000-200.000„ insbesondere zumindest 5.000.
  • Natürlich vorkommende bakterielle Lipopolysaccharide sind normalerweise als Gemisch aus Molekülen vorhanden, die eine unterschiedliche Anzahl an Grundeinheiten und somit unterschiedliches Molekulargewicht aufweisen, wie wiederholt an Lipopolysacchariden in einigen Bakterienstämmen gezeigt wurde, die aus Molekülen mit 0-40 Grundeinheiten bestehen, was Molekulargewichte von unter 10 bis über 100 kD abdeckt (Goldman und Leive, Eur. J. Biochem. 107, 145-153 (1980). (Eine Grundeinheit ist das Monosaccharid oder noch häufiger das Oligosaccharid, das im O-Polysaccharid wiederholt wird (Siehe z.B. 1). Beispiele für solche interessante Oligosaccharid-Grundeinheiten umfassen die Tetrasaccharid-Grundeinheit von Salmonella Typhimurium und die acetylierte Pentasaccharid-Grundeinheit von Escherichia coli K12 (Raetz (1996)).) Normalerweise liegt das Molekulargewicht von Polysacchariden von LPS im Bereich von 2 bis 50 kD, was 0 bis 40 Grundeinheiten entspricht, oft mit einer bimodalen Verteilung mit einer übermäßigen Anzahl an Molekülen mit null und einer Grundeinheit bzw. an Molekülen mit 25-35 Grundeinheiten (Raetz (1996)). Oft ist es von Vorteil, die Molekulargewichtsverteilung der natürlichen LPS beizubehalten, um die exakte Antigenität der intakten O-Antigene widerzuspiegeln.
  • Somit versteht sich, dass sich die oben genannten Bereiche für die Anzahl an Monosacchariden und Molekulargewichte auf die mittlere Anzahl an Monosacchariden beziehen, die in natürlich vorkommenden LPS zu finden ist.
  • Das Polysaccharid, das immobilisiert werden soll, umfasst eine Ketocarboxygruppe (-C(=O)COOH) oder eine entsprechende Ketal- oder Halbketalgruppe, die einen ent scheidenden Ankerpunkt für die Ausbildung der Bindung an die feste Oberfläche darstellt. In vielen Fällen (und vorzugsweise) ist diese Ketocarboxygruppe als KDO-(2-Keto-3-desoxy-D-manno-octonsäure-)Monosaccharid-Einheit bereitgestellt, die im Polysaccharid enthalten ist. Im Oligosaccharid des inneren Kerns aller bekannten gramnegativen Lipopolysaccharide sind eine oder mehrere KDO als eine oder mehrere (typischerweise 3; siehe 1) gebundene Monosaccharide vorhanden. Eine dieser KDO umfasst die glykosidische Verknüpfung mit dem Hexosamindimer des Lipids A und eine, entweder dasselbe KDO-Monosaccharid oder ein anderes KDO-Monosaccharid, umfasst die glykosidische Verknüpfung mit dem reduzierenden Ende des Rests des Polysaccharidteils des Lipopolysaccharids.
  • 1 zeigt ein typisches gramnegativ-bakteriellen Lipopolysaccharids von E.-coli-K12 (Raetz (1996)).
  • Die Polysaccharide, für welche die vorliegende Erfindung insbesondere anwendbar ist, sind Polysaccharid, die im Wesentlichen identisch mit dem Kohlenhydratteil eines gramnegativ-bakteriellen Lipopolysaccharids (LPS) ist. Mit dem "Kohlenhydratteil eines gramnegativ-bakteriellen Lipopolysaccharids" ist die gesamte Polysaccharidkette, oder "Verzweigungsstruktur", des Lipopolysaccharids gemeint, mit Ausnahme der Monosaccharide, die mit Fettsäuren in Ester- und/oder Amidbindungen derivatisiert sind, die den Lipid-A-Teil umfassen. Außerdem muss der Kohlenhydratteil nicht notwendigerweise alle KDO-Einheiten der gesamten Polysaccharidkette umfassen (siehe weiter unten).
  • Mit "im Wesentlichen identisch" ist vorzugsweise auch gemeint, dass das Polysaccharid im Wesentlichen die gleiche biologische Bindungsaktivität aufweist wie der Kohlenhydratteil des nativen Lipopolysaccharids. Das bedeutet, dass der äußere Kernteil des O-Antigens (der serotypspezifische Teil) des Polysaccharids vorzugsweise im Wesentlichen identisch mit dem des nativen bakteriellen Lipopolysaccharids ist, während einige Monosaccharide des inneren Kerns (beispielsweise eine oder zwei, aber nicht alle KDO-Einheiten) chemisch abgespalten sein können, wenn der Kohlenhydratteil chemisch vom Lipid-A-Teil abgespalten ist (siehe 2 für die möglichen Angriffspunkte eines Lipopolysaccharids (LPS), die zu einem Polysaccharid (PS) führen)). Es sollte angemerkt werden, dass das Polysaccharid dadurch gekennzeichnet ist, dass die Serotypspezifitiät im Wesentlichen erhalten bleibt, d.h. dass der O-Antigenteil des nativen Lipopolysaccharids (LPS) von der Spaltung im Wesentlichen unbeeinflusst bleibt.
  • Der innere Kernteil eines Lipopolysaccharid-Polysaccharids ist als gut konservierte KDO und heptosehältiges reduzierendes Oligosaccharid eines gramnegativ-bakteriellen Lipopolysaccharids definiert, wobei das Oligosaccharid die Bindung zwischen KDO und Lipid A enthält.
  • Das Lipid A ist ein gut konservierter Teil von bakteriellen Lipopolysacchariden, der Fettsäuren umfasst, die an ein substituiertes Hexosamindimer gebunden sind, das wiederum die Einheit darstellt, die in einem unmodifizierten Lipopolysaccharid an die reduzierende KDO des inneren Kerns gebunden ist.
  • Vorzugsweise wird das Polysaccharid durch selektive Hydrolyse der Ketalbindung zwischen dem inneren Kernteil und dem Lipid-A-Teil eines gramnegativ-bakteriellen Lipopolysaccharids erhalten (oder kann zumindest dadurch erhalten werden). Vorzugsweise werden Substituenten auf den Polysaccharid, wie beispielsweise Acetyl, Phosphat, Pyrophosphat, Phosphoethanolamin, Ethanolaminpyrophosphat, O-Methyl, Sulfat oder andere Gruppen, während der selektiven Hydrolyse nicht abgespalten.
  • "Selektive Hydrolyse" bezieht sich auf eine chemisch oder enzymatisch vermittelte Hydrolyse, die vorzugsweise eine ausgewählte Glykosidbindung spaltet, d.h. im vorliegenden Kontext die Bindung zwischen dem Lipid-A-Teil und dem KDO-Teil.
  • Obwohl die vorliegende Erfindung für Polysaccharide (PS, d.h. Polysaccharid ohne Lipidteil) anwendbar (und vorteilhaft) ist, die von gramnegativ-batkeriellen Lipopolysacchariden (LPS) stammen, versteht sich, dass es als realistisch und möglich angesehen wird, das komplette Lipopolysaccharid (LPS) einer gramnegativen Bakterie mit gutem Ergebnis im Verfahren gemäß vorliegender Erfindung zu verwenden. Diese Annahme basiert auf der Tatsache, dass das Lipopolysaccharid als solches die erforderliche Ketocarboxygruppe umfasst. Dies stellt eine eigene Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dar. Somit stellt die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren bereit, worin das Polysaccharid weiters den Lipidteil eines gramnegativ-bakteriellen Lipopolysaccharids, umfasst, wodurch das "Polysaccharid" ein bakterielles Lipopolysaccharid darstellt.
  • Die Bakterien, von denen die Polysaccharide (und somit auch die Lipopolysaccharide) stammen, sind vorzugsweise gramnegative Bakterien, die menschliche oder tierische Pathogene darstellen, wie z.B. Enterobakterien, respiratorische Bakterien, Urogenital-Bakterien und neuropathogene Bakterien.
  • Beispiele für Bakterien, die zu insbesondere geeigneten Polysacchariden gemäß vorliegender Erfindung führen, sind aus den menschlichen gramnegativen Bakterien Haemophilus sp., Escherichia coli ssp., Salmonella sp., Klebsielle sp., Bordetella sp., Pseudomonas sp., Chlamydia sp., Neisseria sp., Vibrio cholerae, Shigella sp., Proteus sp., Brucella sp., Streptobacillus sp., Yersinia sp., Legionella pneumophila und Serratia marcescens, insbesondere Haemophilus influenzae, Salmonella enterica ssp., Klebsiella pneumoniae, Bordetella pertussis, Pseudomonas aeruginosa, Chlamydia psitacci, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhea, Vibrio cholerae, Shigella flexneri und Shigella dysenteriae, sowie tierischen oder zoonotischen Bakterien, einschließlich Escherichia coli, Salmonella Typhimurium, Salmonella Choleraesuis, Salmonella Enterica und allen Serotypen davon, insbesondere Salmonella Typhimurium, Salmonella Enteritidis, Salmonella Choleraesuis, Salmonella Manhattan, Salmonella Dublin, Salmonella Infantis, Escherichia coli spp., einschließlich O157, Ödemkrankheiten verursachenden Escherichia coli, Yersinia entercolitica und Campylobacter jejuni, und respiratorischen Bakterien der NAP-Gruppe von Bakterien, insbesondere Actinobacillus sp., insbesondere den Bakterien der HAP-Gruppe Actinobacillus pleuropneumoniae, Haemophilus somnus, Pasteurella haemolytica, Pasteurella multocida, Haemophilus parasuis und Mannheimia sp., ausgewählt.
  • Isolierung von LPS
  • LPS werden im Allgemeinen durch wässrige Phenolextraktion gefolgt von verschiedenen Reinigungsschritten aus gramnegativen Bakterien isoliert (Raetz (1996)). Diese Verfahren könne normalerweise für alle Arten von bakteriellen LPS verwendet werden. Außerdem sind LPS im Handel erhältlich.
  • Charakterisierung von LPS
  • Isolierte LPS können mithilfe verschiedener Verfahren charakterisiert werden, wie im experimentellen Teil beschrieben ist. SDS-PAGE (Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel-Elektrophorese) kann verwendet werden, um die Molekulargewichtsverteilung der LPS zu analysieren. Sowohl glatte als auch raue LPS, einschließlich im Handel erhältlicher Materialien, können durch dieses Verfahren analysiert werden. Auch Massenspektrometrie, NMR, indirekte ELISA (siehe experimenteller Teil), UV-Spektrometrie (siehe experimenteller Teil), Immun-Blotting und andere Verfahren können eingesetzt werden.
  • Herstellung von PS
  • Wie allgemein bekannt ist, kann das intakte O-Antigen durch Spaltung des O-Polysaccharids vom Lipid-A-Teil aus dem LPS isoliert werden. Dies wird routinemäßig durch Säurehydrolyse (z.B. 0,1 M Essigsäure bei 90 °C für 1 Stunde) der säurelabilen Glykosidbindung zwischen den reduzierenden Enden der KDO im O-Polysaccharid und dem GlcNAc im Lipid-A-Teil eines LPS durchgeführt, gefolgt von einer Chloroform/Methanol-Extraktion, um das Polysaccharid (PS) zu erhalten (Raetz (1996)).
  • Das isolierte PS enthält das (im Wesentlichen) intakte O-Antigen des LPS. Eine Eliminierung des Lipids A aus dem PS erleichtert die Zugänglichkeit für Antikörper zum O-Antigen (Munford und Hall, Inf. Imm. 26, 42-48 (1979)) und verringert die Endotoxizität des O-Antigens in Bezug auf das entsprechende LPS um etwa das 1000- fache (van die Wiel et al., Vaccine 5, 33-38 (1987)). Außerdem sind PS rein hydrophile Moleküle, weisen geringe Toxizität auf, sind in wässrigen Lösungen äußerst löslich und weisen keine Neigung zur Bildung von Mizellen auf. PS sind deshalb leichter handzuhaben als LPS.
  • Weitere Verfahren, die zum Erhalt von delipidierten LPS-Polysaccharid verwendet werden können, umfassen alkalische Hydrolyse durch Hydrazin oder NaOH, Freisetzung von veresterten Fettsäuren neben Phosphat- und anderen Estern, nicht aber von amidgebundenen Fettsäuren (Gupta et al. (1995)), und phagenvermittelter Abbau des O-Polysaccharids von intakten LPS oder PS in kleinere Oligosaccharideinheiten, die das terminate KDO-Monosaccharid nicht enthalten (Svenson et al., J. Virol. 32, 583-592 (1979)). Wie allgemein bekannt ist, können PS nicht nur durch das Phasenextraktionsverfahren, das in den Beispielen verwendet wird, sondern auch durch Säurehydrolyse durch Gelpermeationschromatographie bearbeitet werden (Lambden und Heckels (1982)).
  • Charakterisierung von PS
  • Isolierte PS können mithilfe verschiedener Verfahren charakterisiert werden, wie im experimentellen Teil beschrieben ist. SDS-PAGE (Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel-Elektrophorese) kann verwendet werden, um auf verbleibende LPS zu analysieren. Auch Massenspektrometrie, NMR, indirekte und kompetitive ELISA (siehe experimenteller Teil), UV-Spektrometrie (siehe experimenteller Teil), Immun-Blotting und andere Verfahren können eingesetzt werden.
  • Herstellung von Polysaccharid-Reportergruppe-Konjugaten
  • Damit ein immobilisiertes Polysaccharidantigen in einem Diagnosetest oder in anderen Anwendungen seine beste Leistung bringt, ist es erforderlich, das Antigen in einer genau definierten Ausrichtung auf der festen Oberfläche zu immobilisieren. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung erfordert dies die regiospezifische Bildung einer chemisch stabilen Bindung zwischen einem Reportermolekül und dem Polysaccharidantigen.
  • Wie oben erwähnt umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung den Schritt der Ausbildung einer kovalenten Bindung zwischen der Carboxygruppe des Polysaccharids (PS) und einem Reportermolekül (RM), wodurch ein Polysaccharid-Reportermolekül-Konjugat (PS-RM) gebildet wird, wobei das Reportermolekül eine Erkennungs-/Substratstelle umfasst.
  • Der Begriff "Reportermolekül" bezieht sich auf eine chemische Einheit, die verwendet wird, um die spezifische Bindung zwischen dem Polysaccharid und der festen Oberfläche herzustellen. Das Reportermolekül umfasst zumindest einen Reporterteil, der die Erkennungs-/Substratstelle enthält, und gegebenenfalls einen Linkerteil.
  • Das Polysaccharid-Reportermolekül-Konjugat (PS-RM) weist vorzugsweise die allgemeine Formel PS'-C(=O)-N(RN)-F-L-R auf, worin PS'-C(=O) das Polysaccharid ist, N(RN)-F die Gruppe ist, die direkt an der kovalenten Bindung zwischen dem Polysaccharid und dem Reportermolekül beteiligt ist, RN Wasserstoff oder C1-4-Alkyl ist, L der Linkerteil des Reportermoleküls ist und R der Reporterteil des Reportermoleküls ist. Insbesondere steht -N-F- für Amino (-N-), Anilino (-N-Ph), Hydrazido (-N-C(=O)-), Semicarbazido (-N-C(=O)-NH-), Thiosemicarbazido (-N-C(=S)-NH-) oder Hydrazino (-N-NH-). Vorzugsweise ist -N-F- Amino.
  • Der Begriff "C1-4-Alkyl" umfasst Methyl, Ethyl, Propyl (1-Propyl und 2-Propyl), Cyclopropyl, Butyl (1-Butyl, 2-Butyl, 2-Methyl-prop-1-yl und 2-Methyl-prop-2-yl (tert-Butyl)).
  • Weiter unten sind verschiedene Arten von Reportermolekülen in "Immobilisierung von Polysaccharid-Reportermolekül-Konjugaten" allgemein beschrieben.
  • Beispiele für Reporterteile sind photochemisch reaktive Gruppen, wie beispielsweise substituierte Cumarine, Benzofurane, Indole, Angelicine, Psoralene, Carben- und Nitrenvorläufer, Ketone und Chinone, z.B. Antrachinone (AQ), Phenanthrachinone und Benzochinone; thermochemisch reaktive Gruppen, wie beispielsweise Carbonsäuren, primäre Amine, sekundäre Amine, Säurehydrazide, Semicarbazide, Thiosemicarbazide, Thiole, aliphatische Hydrazine, aromatische Hydrazine, Epoxide und Maleimide; und ein Teil eines Affinitätspaars (vorzugsweise der Teil mit dem geringeren Molekulargewicht, z.B. einem Molekulargewicht von bis zu 7.000), wie beispielsweise ein Teil von Biotin/Avidin, Biotin-Streptavidin, Biotin/NeutrAvidinTM, Glutathion/Glutathion-S-transferase, Iminodiessigsäure-Metall-Komplex/Hexahistidin-markiere Peptide und Proteine, Nitriloessigsäure-Metall-Komplex/Hexahistidin-markierte Peptide und Proteine, LNA/LNA, LNA/DNA, LNA/RNA, DNA/DNA, DNA-RNA, RNA-RNA, PNA/RNA, PNA/DNA und mono- oder polyklonale Antikörper gegen ein spezifisches Hapten/Hapten. Vorzugsweise umfasst der Reporterteil Biotin (einen Teil eines Affinitätspaars) oder Anthrachinon.
  • Das Reportermolekül kann neben einem Reporterteil außerdem einen geeigneten Linkerteil (L) enthalten. Solch ein Linker kann bei der Bereitstellung von ausreichender Flexibilität/Mobilität des immobilisierten Polysaccharids nützlich sein.
  • Der optionale Linkerteil zwischen dem Reportermolekül und dem Polysaccharid kann für verschiedene Zwecke genutzt werden. Der Linkerteil kann verwendet werden, um die Reportergruppe vom Polysaccharid räumlich zu trennen, wodurch der darauf folgende Immobilisierungsschritt gefördert wird. Gleichzeitig fördert der Spacer auch die Präsentation der Polysaccharidepitope, wodurch Diagnosetests oder andere auf dem immobilisierten Polysaccharid basierende Anwendungen verbessert werden. Geeignete Linker können auch geladene, ungeladene, hydrophile oder hydrophobe Gruppierungen bereitstellen, um beispielsweise die Löslichkeit des Reportergruppen-Spacermoleküls während der Konjugation an das Polysaccharid sowie die Eigenschaften der Endanwendung des immobilisierten Polysaccharids wie gewünscht zu beeinflussen. Somit sind ein geeigneter Konjugataufbau und optimierte Konjugationsvorschriften Schlüsselelemente für die Fähigkeit zur Produktion von optimalen Polysaccharid-Reportergruppe-Konjugaten für eine darauf folgende Immobilisierung auf festen Oberflächen.
  • Beispiele für Linkerteile sind Biradikale, die aus C1-20-Alkylen, das gegebenenfalls aromatische oder einfach oder mehrfach ungesättigte Kohlenwasserstoffe oder zyklische Kohlenwasserstoffe umfasst, Oligooxyethylenen, Oligoamiden, wie z.B. Oligoglycin, Oligoalanin, Oligolysin und Oligopeptide im Allgemeinen, Oligophosphodiestern, Oligophosphoamidaten, Oligophosphodiamiden, Oligosulfonestern und Oligosulfonamiden ausgewählt sind. Außerdem kann der Linker aus Kombinationen dieser Einheiten bestehen.
  • Vorzugsweise führt der Linkerteil, falls vorhanden, 1-30 Atome, vorzugsweise 3-20 Atome, zwischen dem F und dem R in der obigen Formel PS'-C(=O)-N(RN)-F-L-R (und in der obigen Formel I) ein.
  • Das Reportermolekül weist vorzugsweise ein Molekulargewicht von höchstens 10.000, beispielsweise höchstens 5.000, vorzugsweise höchstens 2.500, auf.
  • Der Begriff "Erkennungs-/Substratstelle" des Reporterteils eines Reportermoleküls bedeutet, dass die Stelle eine Erkennungsstelle (d.h. einen Teil eines Affinitätspaars) oder einen chemisch reaktiven Teil oder einen photochemisch reaktiven Teil, der eine spezifische Bindung mit einer Aufnahme-/Reagensstelle auf der festen Oberfläche bilden soll, darstellt oder umfasst.
  • Wie oben erwähnt zeigte sich, dass die Carbonsäure in einer Ketocarboxy-hältigen Monosaccharid-Einheit in einem Polysaccharid einen besonders guten Angriffspunkt für die Ausbildung von regiospezifischen sowie chemoselektiven Bindungen zwischen dem Polysaccharid und einem Reportermolekül, das eine geeignete funktionelle Gruppe enthält, darstellt.
  • Verschiedene Nucleophile, einschließlich primärer und sekundärer Amine, aliphatischer Hydrazine, aromatischer Hydrazine, Semicarbazide, Thiosemicarbazide und Säurehydrazide, können mithilfe eines Kupplungsreagens eine stabile kovalente Bindung mit einer Carbonsäuregruppierung bilden. Somit sind Reportergruppen, die solche nucleophilen Gruppen enthalten, zur Bildung von stabilen kovalenten Bindungen mit einer Carbonsäure fähig. Es versteht sich, dass manche "Reporterteile" selbst solch ein Nucleophil enthalten können. Alternativ dazu kann ein solches Nucleophil direkt oder über einen optionalen Linkerteil (L) eingebracht werden. Die Herstellung solcher Nucleophile enthaltender Reportermoleküle ist Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt (siehe beispielsweise Greg T. Hermanson et al., Immobilized Affinity Ligand Techniques, Academic Press Inc. (1992)).
  • Das Kupplungsreagens agiert als Aktivator der Carbonsäure, und ein darauf folgender Angriff des Nucleophils führt zur Bildung einer stabilen kovalenten Bindung. Beispiele für Kupplungsreagenzien sind Carbodiimide, wie z.B. Diisopropylcarbodiimid und wasserlösliches Carbodiimid (WSC, 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid), Phosphoniumsalze, wie z.B. Benzotriazolyloxytris(dimethylamino)phosphoniumhexafluorophosphat (BOP) und (Benzotriazolyl)-N-oxypyrrolidiniumphosphoniumhexafluorophosphat (PyBOP), Uroniumsalze, wie z.B. O-Benzotriazolyl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat (HBTU), O-(3,4-Dihydro-4-oxo-1,2,3-benzotriazinyl)-N,N,N',N'-tetramethyluroniumtetrafluoroborat (TBTU) und N,N'-Tetramethylfluorformimidiniumhexafluorophosphat (TFFH). Auch zahlreiche andere, Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Kupplungsreagenzien können verwendet werden (M. Bodanszky, Pronciples of Peptide Synthesis, 2. Aufl., Springer-Verlag (1993)). Der Zusatz von Helfernucleophilen, wie z.B. N-Hydroxysuccinimid und 1-Hydroxybenzotriazol, kann die Kupplungskinetik fördern sowie Nebenreaktionen, wie z.B. O→N-Acyl-Umlagerungen, unterdrücken, wenn Carbodiimide als Kupplungsreagenzien verwendet werden (M. Bodanszky, Principles of Peptide Synthesis, 2. Auflag, Springer-Verlag (1993)).
  • Die Kupplungsreaktionen können in einer wässrigen Lösung oder in einem Gemisch aus Wasser und einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, wie z.B. N,N-Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Dioxan, Methanol, Ethanol und Aceton, oder im reinen organischen Lösungsmittel durchgeführt werden. Das Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch ist so gewählt, dass die bestmögliche Löslichkeit der Reaktanden gewährleistet ist.
  • Wenn Wasser oder ein Gemisch aus Wasser und einem organischen Lösungsmittel verwendet wird, kann der pH während der Kupplungsreaktion durch die Verwendung einer Pufferlösung kontrolliert werden. Der pH ist so gewählt, dass die bestmöglichen Bedingungen für die Kupplungsreaktion bereitgestellt werden, während gleichzeitig die Unversehrtheit des Polysaccharids und Reportermoleküls aufrecht erhalten wird. Vorzugsweise wird der pH zwischen 5 und 9 gehalten, um säure- oder basenlabile Epitope auf den O-Ketten des Polysaccharids zu schützen. Ein Beispiel für solch eine labile Gruppe sind O-Acetylfunktionalitäten, die häufig in Polysaccharid-O-Antigenen zu finden sind. Der optimale pH für die Kupplungsreaktion hängt auch von der Art des Nucleophils ab. Amine sind basische Verbindungen, die bei einem niedrigen pH protoniert werden und so nichtnucleophil werden, weshalb Kupplungsreaktionen unter Verwendung von Aminen am besten bei einem pH über 7 durchgeführt werden. Andere Nucleophile, wie z.B. aromatische Hydrazine, Semicarbazide, Thiosemicarbazide und Säurehydrazide, sind viel weniger basisch, weshalb die Kupplungsreaktion bei einem neutralen pH oder sogar darunter durchgeführt werden kann. Ein weiterer Faktor, der den für die Kupplungsreaktion optimalen pH beeinflusst, ist die konkurrierende Hydrolyse der aktivierten Carbonsäuregruppierung durch die Anbindung von Hydroxidionen. Diese Nebenreaktion kann durch die Verwendung eines pH unter 8 während der Kupplung minimiert werden. In organischen Lösungsmitteln kann der pH während der Kupplungsreaktion durch die Verwendung von geeigneten organischen oder anorganischen Säuren und Basen eingestellt werden, die gemäß ihrer Löslichkeit im Lösungsmittel sowie gemäß ihrer relativen Säure- oder Basenstärke ausgewählt werden. Wie oben beschrieben werden die genauen Bedingungen so gewählt, dass die kovalente Kupplung gefördert wird, während gleichzeitig die Unversehrtheit des Polysaccharid und Reportermoleküls aufrecht erhalten wird.
  • Die Kupplungsreaktionen werden typischerweise bei einer Temperatur im Bereich von -20-100 °C, oft 0-20 °C, wie z.B. bei etwa 5 °C, durchgeführt.
  • Neben den oben genannten Parametern sind auch die Reaktionsdauer sowie die Menge des Polysaccharid, des Kupplungsreagens und der Reportergruppe entscheidend, um das ideale Polysaccharid-Reportergruppe-Konjugat zu erhalten. Die Erfin der haben Kupplungsvorschriften entwickelt, die reproduzierbare Konjugate in hervorragender Ausbeute und Qualität ergeben und die immunogenen Epitope des Polysaccharids sowie die Unversehrtheit der Reportergruppe beibehalten (siehe experimenteller Teil). Solch eine Optimierung ist bei kommerziellen Anwendungen oft wünschenswert, wie für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offensichtlich ist.
  • In einer interessanten und kommerziell sehr brauchbaren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stammt das Polysaccharid von Salmonella-LPS, und das Reportermolekül, das mithilfe eines Carbodiimid-Kupplungsreagens über eine Amidbindung an das Polysaccharid gekuppelt ist, umfasst eine Biotin- oder Anthrachinongruppe.
  • In einer weiteren interessanten und kommerziell sehr brauchbaren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stammt das Polysaccharid von Actinobacillus-LPS, und das Reportermolekül, das mithilfe eines Carbodiimid-Kupplungsreagens über eine Amidbindung an das Polysaccharid gekuppelt ist, umfasst eine Biotin- oder Anthrachinongruppe.
  • Diese Ausführungsformen sind im experimentellen Teil genauer erläutert.
  • Es wird angenommen, dass die Zwischenprodukte, die gemäß dem ersten Schritt des Verfahren der vorliegenden Erfindung erzeugt werden, als solche neu sind.
  • Somit stellt die vorliegende Erfindung außerdem eine Verbindung der allgemeinen Formel I
    Figure 00230001
    (oder, wenn R2 Wasserstoff ist, gegebenenfalls deren Ketoanalog) worin:
    R1 aus Wasserstoff und einem Reportermolekül L-R ausgewählt ist, worin L ein optionaler Linkerteil des Reportermoleküls ist und R ein Reporterteil des Reportermoleküls ist;
    RN aus Wasserstoff und C1-4-Alkyl ausgewählt ist;
    F aus einer Einfachbindung, Phenylen, Carbonyl (C(=O)), Carbonylimino (C(=O)NH), Thiocarbonyl ((C(=S)) und Imino (-NH-) ausgewählt ist;
    R2, R7, R8 unabhängig voneinander aus Wasserstoff und Hydroxyschutzgruppen ausgewählt sind;
    R4 aus Wasserstoff, einem Mono- oder Dischaccharidrest und einer Hydroxyschutzgruppe ausgewählt ist; und
    R5 aus Wasserstoff, einem "Polysaccharidrest, dessen funktionelle Gruppen gegebenenfalls geschützt sind", und einer Hydroxyschutzgruppe ausgewählt ist, bereit.
  • Der Begriff "Monosaccharid- oder Disaccharidrest" bezieht sich auf einen Rest, der eine oder zwei glykosidisch verknüpfte Monosaccharid-Einheiten umfasst. Bevorzugte Beispiele sind KDO-2-yl, 4-Phosphoethanolamin-KDO-2-yl, L-Rhamnosyl-(1→4)-KDO-2-yl.
  • Der Begriff "Polysaccharidrest" bezieht sich auf den Teil eines Polysaccharids (wie oben definiert), der zusammen mit der KDO-Monosaccharid-Einheit der Formel I und einem beliebigen R4-Saccharidsubstuenten das Polysaccharid (PS) bildet. Somit umfasst der Polysaccharidrest vorzugsweise 2-997 verknüpfte Monosaccharid-Einheiten, beispielsweise zumindest 7, z.B. 7-997, verknüpfte Monosaccharid-Einheiten, insbesondere zumindest 22, z.B. 22-497, verknüpfte Monosaccharid-Einheiten. Wie oben in Bezug auf "Polysaccharide" definiert kann der Polysaccharidrest nichtstöchiometrisch substituiert sein.
  • Der Ausdruck "dessen funktionelle Gruppen gegebenenfalls geschützt sind" bedeutet, dass die funktionellen Gruppen des Oligosaccharidfragments, das funktionelle Gruppen trägt, die unter den in den Kupplungsschritten vorherrschenden Bedingun gen reaktiv sind, gegebenenfalls auf auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Weise geschützt sind. Das bedeutet, dass Gruppen, wie z.B. Hydroxy-, Amino-, Carboxy-, Sulfon- und Mercaptogruppen, gegebenenfalls ihre funktionellen Gruppen geschützt haben. Das Schützen (und das Entfernen der Schutzgruppen) wird mithilfe von Verfahren durchgeführt, die Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind (siehe beispielsweise Greene, T. W., und Wuts, P. G. M., Protective Groups in Organic Synthesis, 2. Aufl., John Wiley, N.Y., USA (1991), und M. J. Gait, Oligonucleotide Synthesis, IRL Press (1984)).
  • Veranschaulichende Beispiele für "Hydroxyschutzgruppen" sind gegebenenfalls substituiertes Trityl, wie z.B. 4,4'-Dimethoxytrityl (DMT), 4-Monomethoxytrityl (MMT) und Trityl, gegebenenfalls substituiertes 9-(9-Pheyl)xanthenyl) (pixyl), gegebenenfalls substituiertes Ethoxycarbonyloxy, p-Phenylazophenyoxycarbonyloxy, Tetraahydropyranyl (thp), 9-Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc), Methoxytetrahydropyranyl (mthp), Silyloxy, wie z.B. Trimethylsilyl (TMS), Triisopropylsilyl (TIPS), tert-Butyldimethylsilyl (TBDMS), Triethylsilyl und Phenyldimethylsilyl, Benzyloxycarbonyl oder substituierte Benzyloxycarbonylether, wie z.B. 2-Brombenzyloxycarbonyl, tert-Butylether, Alkylether, wie z.B. Methylether, Acetale (einschließlich zwei Hydroxygruppen), Acyloxy, wie z.B. acetyl- oder halogensubstituierte Acetyle, z.B. Chloracetyl oder Fluoracetyl, Isobutyryl, Pivaloyl, Benzoyl und substituierte Benzoyle, Methoxymethyl (MOM), Benzylether oder substituierte Benzylether, wie z.B. 2,6-Dichlorbenzyl (2,6-Cl2Bzl). Alternativ dazu kann eine Hydroxygruppe durch Bindung an einen festen Träger, gegebenenfalls durch einen Linker, geschützt sein.
  • Veranschaulichende Beispiele für Aminoschutzgruppen sind Fmoc (Fluorenylmethoxycarbonyl), BOC (tert-Butylcarbonyl), Trifluoracetyl, Allyloxycarbonyl (alloc, AOC), Benzyloxycarbonyl (Z, Cbz), substituierte Benzyloxycarbonyle, wie z.B. 2-Chlorbenzyloxycarbonyl ((2-ClZ), Monomethoxytrityl (MMT), Dimethoxytrityl (DMT), Phthaloyl) und 9-(9-Phenyl)xanthenyl (Pixyl).
  • Veranschaulichende Beispiele für Carboxyschutzgruppen sind Allylester, Methylester, Ethylester, 2-Cyanoethylester, Trimethylsilylester, Benzylester (Obzl), 2-Ada mantylester (O-2-Ada), Cyclohexylester (OcHex), 1,3-Oxazoline, Oxazole, 1,3-Oxazolidine, Amide und Hydrazide.
  • Veranschaulichende Beispiele für Mercaptoschutzgruppen sind Trityl (Trt), Acetamidomethyl (acm), Trimethylacetamidomethyl (Tacm), 2,4,6-Trimethoxybenzyl (Tmob), tert-Butylsulfenyl (StBu), 9-Fluorenylmethly (Fm), 3-Nitro-2-pyridinsulfenyl (Npys) und 4-Methylbenzyl (Meb).
  • In einer interessanten Ausführungsform ist R1 L-R. Außerdem ist -N-F- in Formel I vorzugsweise Amino (-N-), Anilino (-N-Ph), Hydrazido (-N-C(=O)-), Semicarbazido (-N-C(=O)-NH-), Thiosemicarbazido (-N-C(=S)-NH-) oder Hydrazino (-N-NH-), insbesondere Amino.
  • Die Gruppe L bezeichnet vorzugsweise ein Biradikal (Linerteil), wie es oben definiert ist, und das Reportermolekül (L-R) ist vorzugsweise ebenfalls wie oben definiert. Varianten, in denen das Reportermolekül ein Biotin oder ein Anthrachinon (insbesondere ein Anthrachinon) als Teil des Reporterteils umfasst, sind besonders interessant.
  • Ferner stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der allgemeinen Formel I bereit, wie sie oben definiert ist, umfassend das Umsetzen einer Verbindung der allgemeinen Formel III
    Figure 00260001
    worin R2, R4, R5, R6, R7 und R8 wie für Formel I definiert sind und alle oder ein Teil der funktionellen Gruppen geschützt sind,
    mit einer Stickstoffverbindung der allgemeinen Formel IV H-N(RN)-F-R1 IVworin R1, F und RN wie für Formel I definiert sind;
    und gegebenenfalls die teilweise oder vollständige Entfernung der Schutzgruppen des dadurch erhaltenen Produkts, um eine Verbindung der allgemeinen Formel I zu erhalten.
  • Vorzugsweise wird die Verbindung der allgemeinen Formel III in ihrer aktivierten Esterform verwendet. Die Umsetzung zwischen der Carbonsäureverbindung der allgemeinen Formel III und der Stickstoffverbindung IV wird durch die Verwendung eines Kupplungsreagens, wie sie weiter oben beschrieben sind, erleichtert.
  • Somit stellt die vorliegende Erfindung auch eine Verbindung der Formel I zur Herstellung einer Testvorrichtung zur Detektion von Antikörpern gegen gramnegative Bakterien und/oder O-Antigene von gramnegativen Bakterien bereit.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ferner eine Verbindung der Formel I zur Herstellung einer ein immobilisiertes Polysaccharid tragenden festen Oberfläche bereit.
  • Analyse von Polysaccharid-Reportergruppe-Konjugaten
  • Oft ist es von Vorteil, die Qualität der Reportergruppe-Polysaccharid-Konjugate vor der Immobilisierung auf einer festen Oberfläche zu beurteilen. Dazu müssen geeignete Analysevorschriften bereitstehen, um sicherzustellen, dass immunogene Epitope auf dem Polysaccharid auch nach der Konjugation an das Reportermolekül intakt sind und dass die Konjugate auf reproduzierbare Weise hergestellt werden.
  • In Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wurde ein UV-Spektroskopieverfahren entwickelt, das verwendet werden kann, um die Menge an Reportergruppen zu bestimmen, die an das Polysaccharid gebunden ist, sowie die Menge an DNA und Proteinen zu bestimmen, die in den Polysaccharid-Reportergruppe-Präparaten vorhanden ist. Somit kann, wie im experimentellen Teil beschrieben ist, eine Messung der Absorption bei 260 und 280 nm verwendet werden, um die Menge an DNA und Proteinen zu bestimmen, während die Menge an Reportergruppen, die an das Polysaccharid gebunden sind, bei einer Wellenlänge bestimmt werden kann, die für die Reportergruppe spezifisch ist. Ein kompetitiver ELISA und ein indirekter ELISA, wie sie im experimentellen Teil beschrieben sind, stellen ein wertvolles Werkzeug zur Quantifizierung der Gegenwart von intakten immunogenen Epitopen in verschiedenen Polysaccharid-Reportergruppe-Konjugatpräparaten dar. Somit stellt die Kombination der beiden entwickelten Analyseverfahren sicher, dass die Qualität unterschiedlicher Chargen von Polysaccharid-Reportergruppe-Präparaten kontrolliert werden kann. Das endgültig entscheidende Analysevorschrift ist die quantitative Messung der Fähigkeit zur Immobilisierung der Polysaccharid-Reportergruppe-Konjugate. Nachstehend und im experimentellen Teil findet sich ein Überblick über diese Verfahren.
  • Immobilisierung von Polysaccharid-Reportergruppe-Konjugaten
  • In einem nachfolgenden Schritt des Verfahren gemäß vorliegender Erfindung wird das Polysaccharid-Reportergruppe-Konjugat auf der festen Oberfläche immobilisiert, indem eine spezifische Bindung zwischen der Erkennungs-/Substratstelle des Reportermoleküls und einer Aufnahme-/Reagensstelle auf der festen Oberfläche ausgebildet wird.
  • Der Begriff "Ausbildung einer spezifischen Bindung" bedeutet die Herstellung einer kovalenten Bindung zwischen dem Reporterteil des Polysaccharid-Reportergruppe-Konjugat und der festen Oberfläche sowie die Herstellung einer nichtkovalenten Bindung, die ein Affinitätspaar miteinschließt.
  • In einem Aspekt dieser Erfindung ist der Reporterteil eine photochemisch reaktive Gruppe, die bei Bestrahlung mit Licht zur Ausbildung einer kovalenten Bindung an einer feste Oberfläche fähig ist. Beispiele für photochemisch reaktive Gruppen sind substituierte Cumarine, Benzofurane, Indole, Angelicine und insbesondere Psoralene, wie in der EP-A-0.319.957 geoffenbart ist. Eine Reihe von Patentveröffentlichungen, US-A-4.722.906, US-A-4.973.493, US-A-5.002.582 und PCT/US88/04491, offenbaren photochemisch reaktive Gruppen, die aus Carben- und Nitrenvorläufern ausgewählt sind, und Ketone, die bei Bestrahlung mit Licht zur Ausbildung von kovalenten Bindungen an feste Oberflächen fähig sind. Eine besonders bevorzugte Untergruppe von photochemisch reaktiven Gruppen sind Chinone, wie sie in der WO 96/31557 offenbart sind, wie z.B. Antrachinone (AQ), Benzochinone und Phenanthrachinone. Eine insbesondere interessante photochemisch reaktive Gruppe ist die Anthrachinongruppe.
  • Die photochemische Ausbildung der kovalenten Bindung an die feste Oberfläche umfasst typischerweise die folgenden Schritte: Das Polysaccharid-Reportergruppe-Konjugat (PS-RM) wird in einem geeigneten Lösungsmittel gelöst. Vorzugsweise ist das Lösungsmittel Wasser oder ein Gemisch aus Wasser und einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, wie z.B. N,N-Diemthylformamid, Diemthylsulfoxid, Dioxan, Methanol, Ethanol und Aceton, oder das reine organische Lösungsmittel. Das Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch ist so gewählt, dass die Löslichkeit des Polysaccharid-Reportergruppe-Konjugats gewährleistet ist und gleichzeitig die bestmöglichen Bedingungen für den nachfolgenden Immobilisierungsschritt bereitgestellt werden. Unter Verwendung von Wasser oder einem Gemisch aus Wasser und einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel können anorganische Salze zugesetzt werden, um den photochemische Kupplungsschritt an die feste Oberfläche zu fördern und den pH der Lösung zu kontrollieren. Wie im experimentellen Teil demonstriert wird, sind sowohl die genaue Beschaffenheit der Salze als auch die Konzentration des Polysaccharid-Reportergruppe-Konjugats und der pH der Lösung Parameter, die eingestellt werden können, um bessere Ergebnisse zu erzielen. Häufig erfordert der photochemische Vorgang eine kohlenstoffhältige Oberfläche oder wird durch eine solche unterstützt.
  • Die Lösung des Polysaccharid-Reportergruppe-Konjugats wird im gelösten Zustand in Kontakt mit der festen Oberfläche gebracht und Licht mit einer geeigneten Wellenlänge ausgesetzt. Vorzugsweise liegt die gewählte Wellenlänge zwischen 200 und 700 nm, sie hängt jedoch von der jeweiligen gewählten photochemisch reaktiven Gruppe ab. Bei Anthrachinonen beträgt die Wellenlänge typischerweise 300-400 nm. Die Bestrahlungsdauer variiert je nach Art des Polysaccharid-Reportergruppe-Konjugats, aber vorzugsweise sollte die Bestrahlungsdauer unter 200 Minuten liegen. Alternativ dazu kann die Lösung des Polysaccharid-Reportergruppe-Konjugats in Kontakt mit der festen Oberfläche gebracht, das Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch abgedampft und das Konjugat schließlich wie oben beschrieben mit Licht bestrahlt werden. In beiden Fälle wird danach mit Wasser oder einem geeigneten Wasser-Lösungsmittel-Gemisch gespült, um nichtkovalent gebundene Konjugate zu entfernen.
  • In einem zweiten Aspekt dieser Erfindung ist der Reporterteil eine thermochemisch reaktive Gruppe, die zur Ausbildung einer kovalenten Bindung auf chemoselektive Weise an eine feste Oberfläche mit einer geeigneten funktionellen Gruppe fähig ist. Beispiele für thermochemisch reaktive Gruppen sind Carbonsäuren, primäre Amine, sekundäre Amine, Säurehydrazide, Semicarbazide, Thiosemicarbazide, Thiole, aliphatische Hydrazine, aromatische Hydrazine, Epoxide und Maleimide. Häufig erfordert der thermochemische Vorgang eine kohlenstoffhältige Oberfläche oder wird durch eine solche unterstützt.
  • Das Polysaccharid-Reportergruppe-Konjugat (PS-RM) wird in einem geeigneten Lösungsmittel gelöst. Vorzugsweise ist das Lösungsmittel Wasser oder ein Gemisch aus Wasser und einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, wie z.B. N,N-Diemthylformamid, Diemthylsulfoxid, Dioxan, Methanol, Ethanol und Aceton, oder das reine organische Lösungsmittel. Das Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch ist so gewählt, dass die Löslichkeit des Polysaccharid-Reportergruppe-Konjugats gewährleistet ist und gleichzeitig die bestmöglichen Bedingungen für den nachfolgenden Immobilisierungsschritt bereitgestellt werden. Die Lösung des Polysaccharid-Reportergruppe-Konjugats wird in Kontakt mit der festen Oberfläche gebracht, um die Ausbildung der kovalenten Bindung zu erleichtern. Eventuell ist der Zusatz von weiteren Kupplungsreagenzien erforderlich, um die Ausbildung der kovalenten Bindung zu fördern. In den meisten Fällen ist es wichtig, den pH während der Ausbildung der kovalenten Bindung zu kontrollieren. In einer wässrigen Lösung oder in einem Gemisch aus Wasser und einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel kann dies unter Verwendung von herkömmlichen Puffern erreicht werden. In organischen Lösungsmitteln kann es durch die Verwendung von geeigneten organischen oder anorganischen Säuren und Basen erreicht werden, die gemäß ihrer Löslichkeit im Lösungsmittel sowie gemäß ihrer relativen Säure- oder Basenstärke gewählt. In allen Fällen werden die genauen Bedingungen so gewählt, dass die kovalente Kupplung unterstützt und gleichzeitig die Unversehrtheit des Polysaccharid und des Reportermoleküls gewährleistet wird. In den meisten Fällen wird die Ausbildung der kovalenten Bindung ohne Abdampfung des Lösungsmittel fortschreiten gelassen, aber in bestimmten Fällen kann dieses Abdampfen von Vorteil sein. Es gibt viele Varianten solcher Verfahren, die Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt sind (Greg T. Hermanson et al., Immobilized Affinity Ligand Techniques, Academic Press Inc. (1992)).
  • In einem dritten Aspekt dieser Erfindung ist das Reportermolekül Teil eines Affinitätspaars. Affinitätspaare sind Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt (Greg T. Hermanson et al., Immobilized Affinity Ligand Techniques, Academic Press Inc. (1992)), und veranschaulichende Beispiele sind Biotin/Avidin, Biotin-Streptavidin, Biotin/NeutrAvidinTM, Glutathion/Glutathion-S-transferase, Iminodiessigsäure-Metall-Komplex/Hexahistidin-markierte Peptide und Proteine, Nitriloessigsäure-Metall-Komplex/Hexahistidin-markierte Peptide und Proteine, LNA/LNA, LNA/DNA, LNA/RNA, DNA/DNA, DNA-RNA, RNA-RNA, PNA/RNA, PNA/DNA und mono- oder polyklonale Antikörper gegen ein spezifisches Hapten/Hapten. Ein besonders faszinierendes Beispiel für ein Affinitätspaar besteht aus zwei komplementären Strängen von arretierten ("locked") Nucleinsäuren (LNA, Nielsen et al., Chem. Commun. 9, 825-6 (1997)). Vorzugsweise ist der Teil des Afifnitätspaars, der zur Herstellung des Polysaccharid-Reportergruppe-Konjugats verwendet wird, eine Verbindung mit nie drigem bis mittlerem Molekulargewicht, vorzugsweise unter 10.000, insbesondere unter 7.000.
  • Das Polysaccharid-Reportergruppe-Konjugat wird in einem geeignete Lösungsmittel gelöst. Vorzugsweise ist das Lösungsmittel Wasser oder ein Gemisch aus Wasser und einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, wie z.B. N,N-Dimethylformamid, Diemthylsulfoxid, Dioxan, Methanol, Ethanol und Aceton, oder das reine organische Lösungsmittel. Das Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch ist so gewählt, dass die Löslichkeit des Polysaccharid-Reportergruppe-Konjugats gewährleistet ist und gleichzeitig die bestmöglichen Bedingungen für den nachfolgenden Immobilisierungsschritt bereitgestellt werden. Die Lösung des Polysaccharid-Reportergruppe-Konjugats wird in Kontakt mit der festen Oberfläche gebracht, die vorher mit dem zweiten Teil des Affinitätspaars beschichtet wurde. In den meisten Fällen ist es erforderlich, den pH und die Art und Konzentration von Ionen in der Lösung zu kontrollieren, und in vielen Fällen ist es notwendig, Detergentien zuzusetzen, um den Immobilisierungsschritt zu optimieren. Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung sind viele Varianten solcher Verfahren bekannt (Greg T. Hermanson et al., Immobilized Affinity Ligand Techniques, Academic Press Inc. (1992)).
  • Eine sehr wichtige Eigenschaften der hierin geoffenbarten Verfahren ist, dass sie die Immobilisierung von Gemischen aus mehr als einem Polysaccharid-Reportergruppe-Konjugat gleichzeitig auf derselben Oberfläche auf sehr genau definierte Weise ermöglichen. Wie im experimentellen Teil beschrieben kann die Immobilisierung von Polysaccharid-Reportergruppe-Konjugaten einzeln optimiert und schließlich in einer gemischten Reaktion durchgeführt werden, um Anwendungen zu schaffen, die auf Konjugatgemischen basieren. Die einzelnen Anteile der immobilisierten Konjugate können leicht je nach spezifischer Anwendung optimiert werden.
  • Die feste Oberfläche, an welche das Polysaccharid gebunden werden soll, kann aus verschiedensten festen Oberflächen ausgewählt werden, die im Analyse- und Diagnosebereich eingesetzt werden. Die interessantesten Arten von festen Oberflächen sind solche aus organischen Polymeren, Glas, Silicium und Siliciumoxid (Silica) sowie Verbundmaterialien daraus.
  • Von den organischen Polymeren sind Polystyrol, Polycarbonat, Polypropylen, Polyethylen, Cellulose, Nitrocellulose, Agarose, Polyethylenglykolterephthalat, Polyvinylacetat, Polyvinyldifluorid, Polymethylpenten, Polyvinylpyrrolidon, Polyacrylat, Polyacrylnitril, Polymethylmethacrylat und Polyvinylchlorid veranschaulichende Beispiele, worin Polystyrol und Polycarbonat besonders interessante Beispiele darstellen.
  • In Bezug auf Glas und Keramik sind Borosilicatglas (Pyrex-Glas) und Natronkalkglas insbesondere relevante Beispiele, beispielsweise in Form von Probenröhrchen, Phiolen und Objektträgern für Mikroskope.
  • Der Körper selbst kann eine Form aufweisen oder kann je nach gewünschter Verwendung entworfen und geformt werden. Beispielsweise kann der Körper die Form einer Folie, eines Films, einer Kugel, eines Pellets, einer Scheibe, einer Platte, eines Rings, eines Stabs, eines Netzes, einer Membran, eines Filters, eines Tabletts, einer Mikroplatte (Mikrotiterplatte), einer Stange oder einer Stange mit mehreren Klingen aufweisen. Insbesondere interessante Körper, die gemäß der vorliegenden Erfindung beschichtet werden können, sind Mikroplatten (Mikrotiterplatten), z.B. Polystyrolmikroplatten (-mikrotiterplatten), Stangen, Objektträger, Röhrchen und Kugeln.
  • Eine weitere wichtige Eigenschaften der hierin geoffenbarten Verfahren ist die Fähigkeit zur Immobilisierung der Polysaccharid-Reportergruppe-Konjugate auf räumlich definierte Weise, was bei der Entwicklung von Biochips und Biosensoren und anderen miniaturisierten Diagnosesystemen sehr wichtig ist. Bei diesen Systemen ist es erforderlich, dass zumindest eine Komponente des Tests an einer genau definierten Position immobilisiert ist. Das ermöglicht eine Identifikation jeder einzelnen Analysekomponente durch die Position, sodass viele Analysekomponenten gleichzeitig in einer Analyseprobe bestimmt werden können.
  • Außerdem wird angenommen, dass die Immobilisierung eines Polysaccharid gemäß einem alternativen Verfahren durchgeführt werden kann, bei dem eine kovalente Bindung direkt zwischen der Carboxygruppe des Polysaccharid und einer an die feste Oberfläche gebundenen chemischen Funktionalität, z.B. einem Amin, einem Anilin, einem Hydrazin usw., ausgebildet wird. In manchen Fällen können im Handel erhältliche feste Oberflächen verwendet werden, beispielsweise die CovaLink-Mikroplatten von Nunc, Dänemark. Es wird jedoch angenommen, dass dieses Verfahren weniger vorteilhaft ist als die wichtigsten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, insbesondere in Bezug auf die Reproduzierbarkeit. Man geht jedoch davon aus, dass dieses alternative Verfahren für die Immobilisierung von Polysacchariden (PS) nützlich sein könnte, denen der Lipidteil fehlt.
  • Somit stellt die vorliegende Erfindung außerdem ein Verfahren zur Immobilisierung eines Polysaccharids (PS) auf einer festen Oberfläche bereit, wobei das Polysaccharid eine Ketocarboxygruppe (-C(=O)-COOH) oder eine entsprechende Ketal- oder Halbketalgruppe aufweist, indem eine kovalente Bindung zwischen der Carboxygruppe des Polysaccharid und einer chemischen Funktionalität der festen Oberfläche ausgebildet wird.
  • Aus obiger Erläuterung ist ersichtlich, dass die chemische Funktionalität der festen Oberfläche vorzugsweise vom selben Typ sein sollte, wie oben spezifiziert, was zu im Wesentlichen der gleichen Art von Bindungen zwischen dem Polysaccharid und der festen Oberfläche führt wie sie oben in Bezug auf die Bindung zwischen dem Polysaccharid und dem Reportermolekül beschrieben sind, d.h. eine Bindung des Typs PS'-C(=O=-N(RN)-F-L-SS, worin PS', L, RN und F wie oben definiert sind und SS die feste Oberfläche bezeichnet. Es versteht sich, dass N(RN)-F-L Teil der festen Oberfläche oder des Objekts sein kann, an welches das Polysaccharid gekuppelt wird, oder alternativ dazu kann N(RN)-F-L vor der Kopplung an die feste Oberfläche an das Polysaccharid gekuppelt werden.
  • Zusammenfassend stellt die vorliegende Erfindung also auch feste Oberflächen bereit, die gemäß den oben beschriebenen Verfahren erhalten wurden oder erhältlich sind.
  • Anwendungen von immobilisierten Konjugaten
  • Die festen Oberflächen, auf denen von LPS stammende Polysaccharid immobilisiert werden, weisen verschiedene Anwendungen im Diagnose- und Analysebereich auf, beispielsweise zur Detektion von Salmonella-Infektionen in Tierherden, z.B. Schweinen und Geflügel.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die immobilisierten Salmonella-Polysaccharid die O-Antigene 1, 4, 5, 6, 7 und 12, die durch ein Gemisch aus von antrachinongekuppelten LPS stammenden Polysaccharid von Salmonella Typhimurium und Salmonella Choleraesuis repräsentiert sind, das als optimiertes Gemisch aus den beiden Polysacchariden an die feste Oberfläche gekuppelt ist, wie in Beispiel 24 beschrieben ist. Diese feste Oberfläche dient zur Verwendung als Immunoassay auf Antikörper gegen Salmonella spp. und auf Salmonella-O-Antigene der beschriebenen Serotypen, wobei der Immunoassay das Kontaktieren der Oberfläche mit einer Probe, vorzugsweise einer flüssigen Probe, wie z.B. einem Serum, Fleischsaft, Milch oder anderen biologisch gewonnenen Flüssigkeiten. Antikörper werden dann durch einen Detektionsantikörper detektiert, der eine Enzymmarkierung umfasst, wobei der gesamte Test als enzymgekuppelte Immunadsorptionsbestimmung (ELISA) durchgeführt wird. Andere Markierungen, beispielsweise fluoreszierende Markierungen, Markierungen für zeitlich aufgelöste Fluoreszenzdetektion, radioaktive Markierungen im Allgemeinen, radioaktive Markierungen für Proximitätsszintillationszählung, können ebenfalls verwendet werden.
  • Die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung einer festen Oberfläche, die ein wie oben beschrieben (oder durch andere Verfahren, die zum gleichen Ergebnis führen) immobilisiertes Polysaccharid trägt, in einem Diagnose- oder Antigenserotypisie rungstest, vorzugsweise einem Diagnosetest, bereit. Dieser Test ist vorzugsweise ein Festphasenimmunoassay. Genauer gesagt handelt es sich beim Diagnosetest um einen serologischen Test, beispielsweise einen serologischen Test zur Detektion von Antikörpern gegen Mikroorganismen, wie z.B. gramnegative Bakterien. Insbesondere ist der Diagnosetest ein serologischer Test zur Detektion von Antikörpern gegen Salmonella spp.
  • Die vorliegende Erfindung stellt außerdem eine Testvorrichtung zur Detektion von Antikörpern gegen eine oder mehrere gramnegative Bakterien bereit, umfassend eine feste Oberfläche mit einem darauf immobilisierten Polysaccharid, wobei das Polysaccharid dem Kohlenhydratteil des bakteriellen Lipopolysaccharid (LPS) der gramnegativen Bakterie entspricht, und zwar über die Carbonsäuregruppe einer KDO-Monosaccharid-Einheit des Polysaccharids darauf immobilisiert. Das Polysaccharid ist vorzugsweise gemäß dem hierin definierten Verfahren auf der festen Oberfläche immobilisiert. Die feste Oberfläche, die in der Testvorrichtung enthalten ist, weist typischerweise eine Form auf, die insbesondere für den betreffenden Test geeignet ist. Die Testvorrichtung kann außerdem eine Schutzfolie umfassen, und eine Anleitung kann beiliegen.
  • Insbesondere interessante Testvorrichtungen sind solche, die zur Serotypisierung von Bakterien und zur Antigendetektion verwendet werden. Außerdem stellen Testvorrichtungen, die mehr als eine auf der Oberfläche eines Vorrichtungselements immobilisierte PS-Art umfassen, bevorzugte Ausführungsformen dar.
  • Die vorliegende Erfindung stellt außerdem ein Verfahren zur Abschätzung der Anzahl bestimmter Bakterien, zur Serotypisierung von Bakterien und zur Antigendetektion (LPS/PS) unter Verwendung der oben beschriebenen Testvorrichtungen bereit. Besonders interessante Ausführungsformen umfassen die Verwendung von AQ-PS-immobilisierten Mikroplatten. Diese Diagnoseverfahren machen es möglich, sogar kleine Bakterienmengen in biologischen Flüssigkeit zu detektieren, und erlauben die Bestimmung eines bakteriellen Serotyps. Das ist vor allem in Bezug auf die Detektion von Salmonella- und Actinobacillus-Infektionen interessant und wertvoll.
  • EXPERIMENTELLER TEIL
  • Allgemeines
  • Chloroform, Dimethylsulfoxid (DMSO) und Methanol wurden von Labscan bezogen und wiesen HPLC-Reinheit auf, Essigsäure (99-100 %) von Riedel de Häen, wasserlösliches Carbodiimid (WSC, 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid) von NovaBiochem, N-Hydroxysuccinimid (96 %) von Aldrich, "Slide-a-lyzer" von Pierce, H-βAla-βAla-(CH2)3-NHCO-AQ·HCl wurden wie oben beschrieben synthetisiert (WO 96/31557) (βAla bedeutet β-Alanin). Dialyseschläuche (MWCO: 6-8000) wurden von Spectra/Por, Polystyrolmikroplatten (PolySorp) von Nunc. bezogen. PBS: phosphatgepufferte Kochsalzlösung, pH 7,2, 0,15 M NaCl. PBS, Tween: PBS + 0,05 % Tween 20. PBS, Tween, BSA: PBS-Tween + 1 % BSA (Rinderserumalbumin). OPD-Substratlösung: 0,1 M Citratphosphatpuffer, pH 5,0, 0,66 mg/ml OPD (o-Phenylendiamin), 0,012 % H2O2. Alle Schweineseren stammten vom Danish Veterinary Laboratory.
  • Beispiel 1
  • Reinigung eines Lipopolysaccharids (LPS) von Salmonella Typhimurium und Salmonella Choleraesuis
  • Kultur: Salmonella Typhimurium Nr. 3389-1/92 (O: 1, 4, 5, 12) und Salmonella Choleraesuis Var. Kunzendorf Nr. 143 (O: 6, 7) wurden zur Herstellung von LPS verwendet. Für eine Plattenkultur wurde mit 5 % Rinderblut (C-Blutagar) ergänztes Columbia-Agar (Oxoid, Unipath Ltd., Basingstoke, GB) als festes Nährmedium verwendet. Für eine Bouillonkultur wurden die Bakterien bei 37 °C aerob in Kolben gezüchtet, wobei mit 130 U/min gerüttelt wurde. Die Stämme wurden bei -80 °C in mit 19 Glycerin ergänzter LB-Bouillon gelagert.
  • Zur Fermentation wurde ein 7 l fassender MBR-Labor-Bioreactor (MBR Bio Reactor AG, Schweiz) mit 4 l LB-Medium mit 800 ml einer Übernachtbouillonkultur inokuliert.
  • Die Temperatur wurde während der ganzen Zeit bei 37 °C und der pH bei 7,2 gehalten, und bei 50 % pO2 setzte eine automatisch geregelte Belüftung ein, indem konstant mit 500 U/min gerührte sterile Atmosphärenluft durchperlen gelassen wurde. Schaumbildung wurde durch Zusatz einer Siliciumemulsion bekämpft. 90 min nach der Inokulation wurden 400 ml 25 % Glucose zugesetzt. Fünf Stunden nach der Inokulation wurde die Belüftung auf etwa 1 l pro Minute reduziert. Nach etwa 18 Stunden Kultivierung wurde die Belüftung gestoppt, und 150 ml Formalin wurden zugesetzt, um eine Endkonzentration von etwa 3 % bei 20 °C und 200 U/min zu erhalten, und die Inaktivierung wurde weitere 20 Stunden unter diesen Bedingungen fortgesetzt.
  • Sechs Stunden nach dem Zusatz von Formalin wurden die Inaktivierung der Kultur auf C-Blutagar überprüft, wobei die inokulierten C-Blutagarplatten über Nacht inkubiert wurden. Wenn sich herausstellte, dass die Inaktivierung vollständig war, wurde die inaktivierte Kultur für die Weiterbearbeitung freigegeben.
  • Extraktion: LPS wurde durch heiße wässrige Phenolextraktion aus den mit Formalin abgetöteten Kulturen extrahiert, wie von Hassan et al. (1990) beschrieben. Kurz zusammengefasst wurden die Bakterien in 5 l inaktivierter Kulturbuoillon in 3 × 4 l PBS gewaschen, dann 4-mal in 5-10 Volumina Aceton mit 20 °C gewaschen, getrocknet und in Milli-Q-Wasser resuspendiert. Dann wurde LPS durch heißes (65 °C) 45 % wässriges Phenol aus dieser Suspension extrahiert; ein gleiches Volumen an vorgeheiztem 90%igem wässrigem Phenol wurde zur Suspension zugesetzt, wonach das Gemisch 10 min lang unter leichtem Rütteln bei 65-68 °C gehalten wurde. Nachdem es auf 4 °C abgekühlt war, folgte 30-minütige Zentrifugation bei 10.000 g, wobei die obere wässrige Phase vorsichtig gewonnen und zumindest 48 h lang (mit 3 Shifts) bei 4 °C gegen Milli-Q-Wasser dialysiert und dann gefriergetrocknet wurde.
  • Die mittlere Ausbeute an gereinigtem LPS einer Charge Fermenterkultur betrug 1.700 mg Trockengewicht, wobei der Bereich von 1.500-2.000 mg reichte. Die Reinheit wurde durch SDS-Gele (siehe Beispiel 3) und UV-Analysemessungen bestimmt. Wie in 5 zu sehen ist, waren auf den Gelen nur Restmengen an Proteinen zu er kennen. Extinktionsmessungen bei 280 nm zeigten, dass wässrige LPS-Lösungen (5-10 mg/ml LPS) von LPS etwa 1,5 mg/ml Protein enthielten. Auf silbergefärbtem SDS-PAGE (siehe Beispiel 3) waren die typischen leiterartigen Anordnungen von Banden zu erkennen, was darauf hinwies, dass der gesamte Molekulargewichtsbereich gewonnen worden war.
  • Beispiel 2
  • UV-Analyse von LPS
  • UV-Spektroskopie kann durchgeführt werden, um den DNA- und Proteingehalt des LPS zu bestimmen. Der DNA-Gehalt kann bei 260 nm gemessen werden, und der Proteingehalt bei 280 nm. Kurz zusammengefasst wird das LPS in ultrareinem Wasser in einer Endkonzentration von 0,5 mg/ml gelöst. Als Vergleich wird das UV-Spektrum bei 200-400 nm von ultrareinem Wasser alleine gemessen. 3 zeigt ein typisches UV-Profil eines LPS von Salmonella Typhimurium, während 4 ein typisches UV-Profil eines LPS von Salmonella Choleraesuis zeigt.
  • Beispiel 3
  • SDS-PAGE-Analyse von LPS
  • Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) kann durchgeführt werden, um LPS-Präparate zu analysieren und die Molekulargewichtsverteilung des Präparats zu bestimmen. Bei diesem Verfahren ergeben glatte LPS-Präparate typischerweise einer "Leiter" aus Banden, die LPS-Moleküle mit steigendem Molekulargewicht darstellt, jeweils um das Molekulargewicht der Grundeinheit des O-Polysaccharids getrennt. Polyacrylamidgele (12,5 %) wurden gemäß dem Verfahren nach Laemmli (Laemmli, Cleavage of Structural Proteins During the Assembly of the Head of Bacteriophage T4, Nature 227, 680-685, U.K. (1970)) laufen gelassen. Das LPS wurde in einer Endkonzentration von 2-4 mg/ml LPS (1 % SDS) in Probenpuffer verdünnt und 5 min lang gekocht, bevor es auf die Wells aufgetragen wurde. Zur De tektion von Proteinen wurden die Gele in 0,4 Gew.-% Coomassie Brilliant Blue R250 gefärbt. Zur Detektion von LPS wurden die Gele gemäß dem Verfahren nach Tsai und Frasch (Tsai, C.-M., Frasch, C. E., A Sensitive Silver Stain for Detecting Lipopolysaccharides in Polyacrylamide Gels, Anal. Biochem. 119, 115-119 (1982)) silbergefärbt.
  • 5 zeigt eine typische Analyse eines Salmonella-Typhimurium-LPS-Präprarats, und 6 zeigt eine typische Analyse eines Salmonella-Choleraesuis-LPS-Präparats. Wie in den Figuren zu sehen ist konnten durch die Färbung mit Coomassie Brilliant Blue nur Restemengen an Proteinen visualisiert werden, während auf den silbergefärbten Gelen die leiterartige Anordnung von Banden zu erkennen ist, was darauf hinweist, dass der gesamte Molekulargewichtsbereich gewonnen wurde.
  • Beispiel 4
  • Indirekter ELISA zur Bestimmung von LPS und PS
  • Da intakte LPS normalerweise die Fähigkeit aufweisen, über den hydrophoben Lipid-A-Teil des Moleküls passiv an Mikroplatten zu binden, kann ein indirekter ELISA, bei dem LPS aufgetragen werden, zur Bestimmung der LPS-Menge in einem bestimmten LPS-Präparat verwendet werden. Genauso kann die Gegenwart von intakten LPS in einem PS-Präparat durch Auftragen des PS-Präparats analysiert werden.
  • Der indirekte ELISA wurde im Wesentlichen gemäß der von B. Nielsen et al. (1995) veröffentlichen Arbeitsvorschrift durchgeführt, wobei nur das Blockieren der Platten ausgelassen wurde. Die Platten wurden mit einer zweifachen Verdünnungsreihe des LPS- oder PS-Präparats beschichtet, typischerweise beginnend mit 0,05 mg/Well in 0,1 M Natriumcarbonat, 1,0 M NaCl, pH 0,6, über Nacht bei 4 °C. Nach dem Waschen mit PBS, Tween wird entweder ein herkömmlicher monoklonaler Antikörper gegen Salmonella-Thyphimurium-O-Antigene (MAK-Hytest-Klon 1E6, 1 mg/ml, 1:25.000 in PBS, Tween, BSA verdünnt) oder ein positives Schweineserum, 1:400 in PBS, Tween, BSA verdünnt, verwendet. In 7 wurde ein positives Schweineserum verwendet. Pro well wurden 100 μl aufgetragen und 1 h lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden dann dreimal in PBS, Tween gewaschen und danach mit HRP-konjugiertem Kaninchen-Anti-Mäuse-IgG (PO260, DAKO, 1:2.000 verdünnt) mit MAK oder HRP-konkugiertem Kaninchen-Anti-Schweine-IgG (PO164, DAKO, 1:2.000 verdünnt) mit dem Schweineserum inkubiert; die Verdünnungen wurden über den Zeitraum von 1 h bei Raumtemperatur in PBS, Tween, BSA vorgenommen. Die Platten wurden wie oben beschrieben gewaschen, und zu jedem Well wurden 100 μl OPD-Substratlösung zugesetzt und 10-15 min lang inkubiert. Die Reaktion wurde mit 100 μl 0,5 M H2SO4 gestoppt, und die optische Dichte wurde bei 490 nm abgelesen, wobei 650 nm für die Hintergrundkorrektur abgezogen wurden.
  • 7 zeigt ein typisches Beispiel für ein Salmonella-Typhimurium-LPS- und -PS-Präparat, das wie oben beschrieben mithilfe eines positiven Schweineserums analysiert wurde, und 8 zeigt eine entsprechende Analyse eines Salmonella-Choleraesuis-LPS-Präparats unter Verwendung eines Infantis-positiven Schweineserums. Es zeigt sich, dass die LPS-Präparate an die Platten binden und durch den Antikörper spezifisch erkannt werden, was ihre Quantifizierung erlaubt, wenn sie mit einem Standardpräparat verglichen werden, während PS sehr geringe Bindung an die Platten aufweisen.
  • Beispiel 5
  • Kompetitive ELISA-Bestimmung von immunogenen Epitopen in LPS und PS
  • Die Gegenwart von intakten immunogenen Epitopen in unterschiedlichen LPS-Präparaten kann durch einen kompetitiven ELISA bestimmt werden, wobei eine fixe Konzentration intakter LPS zur Beschichtung und zur Inkubation des Antigen-(LPS- oder PS-)Präparats, das untersucht werden soll, zusammen mit dem Detektionsantikörper verwendet wird. Mit Ausnahme der Gegenwart des Konkurrenten wird der ELISA genauso durchgeführt wie der indirekte ELISA, der in Beispiel 4 beschrieben ist. Typischerweise wird eine 2-fache Titration von 5 mg/ml Antigen verwendet, und die kompetitive Wirkung zeigt sich als Reduktion des OD-Werts im Vergleich zum OD-Wert, der in Abwesenheit eines konkurrierenden Antigens erhalten wird.
  • 13 zeigt ein typisches Ergebnis der Konkurrenz durch ein Salmonella-Typhimurium-PS-Präparat, wobei eine mit Salmonella-Typhimurium-LPS beschichtete Mikroplatte und ein Salmonella-Typhimurium-LPS-Präparat als Konkurrentkontrolle verwendet wurde und die Detektion durch ein Salmonella-Typhimurium-positives, 1:400 verdünntes Schweineserum stattfand, gefolgt von HRP-konkugiertem Kaninchen-Anti-Schweine-IgG (DAKO PO164, 1:2.000), wie in Beispiel 4 erläutert ist. Es zeigte sich, dass das PS-Präparat bei vergleichbaren Konzentrationen genauso kompetitiv ist wie das intakte LPS, was auf den Erhalt von antigenen Epitopen im PS hinweist. 14 zeigt die gleiche Anordnung mit Salmonella-Choleraesuis-Antigenen, wobei ein positives Schweineserum in einer Verdünnung von 1:600 verwendet wurde. Wieder zeigte sich, dass die Antigenität des PS-Präparats im Vergleich zum intakten LPS erhalten bleibt.
  • Beispiel 6
  • Herstellung eines PS aus einem von Salmonella Typhimurium stammenden LPS durch Delipidierung
  • Gefriergetrocknetes LPS von Salmonella Typhimurium (1,55 g) wird in ultrareinem Wasser (388 ml) gelöst, wonach Essigsäure (22 ml, 0,37 mol) zugesetzt wird. Das Gemisch wird in Nunc-Kunststoffröhrchen in 40 ml umfassende Portionen geteilt. Die verschlossenen Röhrchen werden dann ein einem Ofen erhitzt (90 °C, 60 min), gefolgt von einer 10-minütigen Abkühlung in einem Eisbad, wodurch die Gemische Raumtemperatur erreichen. Die Gemische werden dann gepoolt, und die vereinigten wässrigen Phasen werden mit Chloroform/Methanol (2:1-Volumsgemisch, 4 × 580 ml) extrahiert. Die wässrige Phase wird dann 1-2 Tage lang bei 4 °C gegen ultrareines Wasser dialysiert (bis der Phenolgeruch verschwunden ist) und schließlich 1-2 Tage lang gefriergetrocknet, um das PS als weißen Feststoff zu erhalten. Eine UV-Analyse (0,5 mg/ml) wird wie in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt. Ausbeute: 0,520 g (34 %), UV-Analyse: A(260 nm): 1,0; A(280 nm): 0,82.
  • Beispiel 7
  • Herstellung eines PS aus einem von Salmonella Choleraesuis stammenden LPS durch Delipidierung
  • Gefriergetrocknetes LPS von Salmonella Choleraesuis (1,13 g) wird in ultrareinem Wasser (283 ml) gelöst, wonach Essigsäure (16,2 ml, 0,27 mol) zugesetzt wird. Das Gemisch wird in Nunc-Kunststoffröhrchen in 40 ml umfassende Portionen geteilt. Die verschlossenen Röhrchen werden dann ein einem Ofen erhitzt (90 °C, 60 min), gefolgt von einer 10-minütigen Abkühlung in einem Eisbad, wodurch die Gemische Raumtemperatur erreichen. Die Gemische werden dann gepoolt, und die vereinigten wässrigen Phasen werden mit Chloroform/Methanol (2:1-Volumsgemisch, 4 × 425 ml) extrahiert. Die wässrige Phase wird dann 1-2 Tage lang bei 4 °C gegen ultrareines Wasser dialysiert (bis der Phenolgeruch verschwunden ist) und schließlich 1-2 Tage lang gefriergetrocknet, um das PS als weißen Feststoff zu erhalten. Eine UV-Analyse (0,5 mg/ml) wird wie in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt. Ausbeute: 0,262 g (23 %), UV-Analyse: A(260 nm): 1,52; A(280 nm): 1,09.
  • Beispiel 8
  • SDS-PAGE-Analyse von PS
  • Mit Silber sichtbar gemachte SDS-PAGE kann verwendet werden, um das PS, das durch Hydrolyse aus LPS erhalten wurde, auf die Gegenwart von restlichen LPS zu untersuchen. Da ein PS keine lipidische, SDS-bindende Lipid-A-Gruppierung umfasst, bildet ein PS keinen Komplex mit SDS, um geladene Komplexe zu bilden, die sich während der Elektrophorese bewegen. Somit führt reines PS bei silbergefärbter SDS-PAGE zu keinen Banden. Die SDS-PAGE von PS-Präparaten wird wie in Beispiel 3 beschrieben durchgeführt. 9 zeigt typische Ergebnisse für fünf verschiedene Salmonella-Cohleraesuis-PS-Präparate. Wie aus der Figur ersichtlich ist, sind in diesen PS-Präparaten nur noch winzige Mengen LPS vorhanden.
  • Beispiel 9
  • Bestimmung der Fähigkeit von PS, passiv an Mikroplatten zu binden Ein PS, das durch Delipidierung eines LPS erhalten wurde, verliert die Fähigkeit, durch passive Adsorption an Mikroplatten zu binden. Somit ergeben die wie in Beispiel 4 beschrieben getesteten PS-Präparate ein sehr schwaches OD-Signal im Vergleich zu einer vergleichbaren Menge LPS, wie in 7 bzw. 8 an Salmonella Typhimurium und Salmonella Choleraesuis gezeigt wird.
  • Beispiel 10
  • Herstellung eines Actinobacillus-pleuropneumoniae-PS
  • Kulturbedingungen: Der Actinobacillus-pleuropneumoniae-Serotyp-5b-Referenzstamm L20 und -Serotyp-6-Referenzstamm Femø wurden zur Herstellung des LPS-Antigens verwendet. Die Stämme wurden auf mit 5 % Rinderblut ergänzten Fleischbouillonagarplatten (Jacobsen, M. J., und Nielsen, J. P., Development of a Selective and Indicative Medium for Isolation of Actinobacillus pleuropneumoniae from Tonsils, Vet. Microbiol. 47, 191-197 (1995)), wobei nichthämolytischer Staphylococcus aereus als Nicotinamidadenindinucleotid-(NAD-)Wachstumsstamm verwendet wurde, oder auf modifizierten PPLO-Agarplatten (Nicolet, J., Zentralbl. Bacteriol. Abt. 1 Orig. 216, 487-495, Sur I'Hemophilose du porc III. Differenciation serologic de Haemophilus parahaemolyticus (1971) als festes Medium gezüchtet. Das flüssige Nährmedium für die Vermehrung von A. pleuropneumoniae bestand aus 30 g/l Trypticasesojabouillon (BBL 11768, Becton Dickinson, Cockeysville, MD, USA), die mit 10 g/l Hefeextrakt (Oxoid L21, Unipath Ltd., Basingstoke, GB) und 0,03 % (Gew./Vol.) NAD (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA), pH 7,2, ergänzt war. Flüssige Kulturen von 1 l wurden bei 37 °C in 2 l fassenden Erlenmeyer-Schüttelzylindern gezüchtet, wobei mit 130 U/min gerüttelt wurde.
  • Extraktion: LPS wurde durch ein oben beschriebenes Verfahren (Nielsen, R., Andresen, L. O., und Plambeck, T., Serological Characterization of Actinobacillus Pleuropneumoniae Biotype 1 Strains Antigenically Related to Both Serotype 2 and 7. Acta Vet. Scand. 37, 327-336 (1996)) aus Actinobacillus pleuropneumoniae Serotyp 5b, Stamm L20, und Serotyp 6, Stamm Femø hergestellt, mit der Ausnahme, dass das Ausgangsmaterial Zellen mit 10 g Nassgewicht aus flüssigen Übernachtkulturen waren und dass die Volumina proportional gewogen wurden. Das LPS wurde durch Ultrazentrifugation bei 90.000 g als Gel ausgefällt. Das ausgefällte LPS wurde in 2 ml deionisiertem Wasser gelöst und gefriergetrocknet.
  • Herstellung von PS: PS wird im Wesentlichen wie in Beispiel 6 und 7 für Salmonella-PS beschrieben aus dem gefriergetrockneten LPS der beiden Actinobacillus-pleuropneumoniae-Serotypen hergestellt. Die Erwartung für die Ausbeuten an PS liegt im Bereich von 10-40 %, bezogen auf die Ausgangsmenge an LPS.
  • Beispiel 11
  • UV-Analyse von AQ-PS-Konjugaten
  • UV-Spektroskopie kann verwendet werden, um den AQ-, DNA- und Proteingehalt des PS zu bestimmen. Der DNA-Gehalt kann bei 260 nm, der Proteingehalt bei 280 nm und der AQ-Gehalt bei 260 nm, 280 nm und 330 nm gemessen werden (siehe D. H. Williams und I. Fleming, Spectroscopic Methods in Organic Chemistry, 3. Aufl., S. 31, McGraw-Hill, GB (1980)). Kurz gesagt wird AQ-PS in ultrareinem Wasser in einer Endkonzentration von 0,5 mg/ml gelöst. Das UV-Spektrum von ultrareinem Wasser alleine von 200-400 nm wird als Vergleich gemessen. 10 zeigt ein typisches UV- Profil von AQ-PS von Salmonella Typhimurium, während 11 ein typisches UV-Profil von AQ-PS von Salmonella Choleraesuis zeigt.
  • Beispiel 12
  • Konjugation von H-βAla-βAla-(CH2)3-NHCO-AQ·HCl an PS von Salmonella Typhimurium
  • Der folgende Kupplungspuffer und die folgenden Reagenzienlösungen werden frisch zubereitet:
    Lösung 1: 1 mM N-Hydroxysuccinimid in DMSO (6 mg N-Hydroxysuccinimid gelöst in 50 ml DMSO).
    Lösung 2: 2 mM WSC in ultrareinem Wasser (10 mg WSC gelöst in 25 ml Wasser).
    Lösung 3: 2 mM Reportergruppen in ultrareinem Wasser (für 24 mg H-βAla-βAla-(CH2)3-NHCO-AQ·NCl gelöst in 25 ml Wasser).
    Puffer: Natriumhydrogencarbonatpuffer, pH 8,0 (Natriumhydrogencarbonat (8,4 g) wird in ultrareinem Wasser gelöst und der pH mit 1 M wässrigem HCl auf 8,0 eingestellt).
  • PS von Salmonella Typhimurium (50 mg) wird in einen Rundkolben eingewogen. Lösung 1 (3,13 ml) wird zugesetzt, gefolgt von Lösung 2 (1,56 ml), Lösung 3 (1,56 ml) und dem Puffer (6,25 ml). Die resultierende klare Lösung wird über Nacht bei 4 °C gerührt. Dann wird das Reaktionsgemisch drei Tage lang bei 4 °C gegen ultrareines Wasser dialysiert, wobei das ultrareine Wasser jeden Tag gewechselt wird, und schließlich einen Tag lang zum PS-AQ-Konjugat als weißen Feststoff gefriergetrocknet. Das Präparat kann auch AQ-LPS-Konjugate je nach Menge intakter LPS im PS-Präparat umfassen. Ausbeute: 83 %; UV-Analyse: A(260 nm): 1,11; A(280 nm): 0,57; A(330 nm): 0,17.
  • Beispiel 12a
  • Konjugation von H-βAla-βAla-(CH2)3-NHCO-AQ·HCl an PS von Actinobacillus pleuropneumoniae Serotyp 5
  • Die Lösungen 1-3 sind wie in Beispiel 12.
  • PS von Actinobacillus pleuropneumoniae 5b (App5b) (2 mg, 0,025 mmol – aus Beispiel 10) wird in einen Rundkolben eingewogen. Lösung 1 (0,125 ml) wird zugesetzt, gefolgt von Lösung 2 (0,063 ml), Lösung 3 (0,063 ml) und dem Puffer (0,25 ml). Die resultierende klare Lösung wird über Nacht bei 4 °C gerührt. Dann wird das Reaktionsgemisch drei Tage lang bei 4 °C gegen ultrareines Wasser dialysiert, wobei das ultrareine Wasser jeden Tag gewechselt wird, und schließlich einen Tag lang zum PS-AQ-Konjugat als weißen Feststoff gefriergetrocknet. Die Präparate können auch kleinere Mengen AQ-LPS-Konjugate je nach Menge intakter LPS im PS-Präparat umfassen.
  • Beispiel 13
  • Konjugation von H-βAla-βAla-(CH2)3-NHCO-AQ·HCl an PS von Salmonella Choleraesuis
  • PS von Salmonella Choleraesuis (50 mg) wird in einen Rundkolben eingewogen. Lösung 1 (3,13 ml) wird zugesetzt, gefolgt von Lösung 2 (1,56 ml), Lösung 3 (1,56 ml) und dem Puffer (6,25 ml). Die resultierende klare Lösung wird über Nacht bei 4 °C gerührt. Dann wird das Reaktionsgemisch drei Tage lang bei 4 °C gegen ultrareines Wasser dialysiert, wobei das ultrareine Wasser jeden Tag gewechselt wird, und schließlich einen Tag lang zum PS-AQ-Konjugat als weißen Feststoff gefriergetrocknet. Das Präparat kann auch AQ-LPS-Konjugate je nach Menge intakter LPS im PS-Präparat umfassen. Ausbeute: 66 %; UV-Analyse: A(260 nm): 1,29; A(280 nm): 0,58; A(330 nm): 0,15.
  • Beispiel 14
  • Konjugation von H-βAla-βAla-(CH2)3-NHCO-AQ·HCl an PS von Salmonella Infantis
  • PS von Salmonella Infantis (2 mg) wird in einen Rundkolben eingewogen. Lösung 1 (0,125 ml) wird zugesetzt, gefolgt von Lösung 2 (0,063 ml), Lösung 3 (0,063 ml) und dem Puffer (0,25 ml). Die resultierende klare Lösung wird über Nacht bei 4 °C gerührt. Dann wird das Reaktionsgemisch drei Tage lang bei 4 °C gegen ultrareines Wasser dialysiert, wobei das ultrareine Wasser jeden Tag gewechselt wird, und schließlich einen Tag lang zum PS-AQ-Konjugat als weißen Feststoff gefriergetrocknet. Das Präparat kann auch AQ-LPS-Konjugate je nach Menge intakter LPS im PS-Präparat umfassen.
  • Beispiel 15
  • SDS-PAGE-Analyse von AQ-PS
  • Eine durch Silber visualisierte SDS-PAGE kann verwendet werden, um das AQ-PS-Konjugat auf die vorhandene Menge AQ-LPS-Konjugat zu untersuchen. Die AQ-PS-Präparate werden wie in Beispiel 3 beschrieben durch SDS-PAGE getestet. 12 zeigt typische Ergebnisse für zwei Salmonella-Cohleraesuis-AQ-PS-Präparate.
  • Beispiel 16
  • Kompetitive ELISA-Bestimmung von immunogenen Epitopen in AQ-PS und AQ-LPS
  • Die Gegenwart von intakten immunogenen Epitopen in unterschiedlichen AQ-PS- oder AQ-LPS-Präparaten kann durch einen kompetitiven ELISA auf einer LPS-beschichteten Mikroplatte bestimmt werden. Die unterschiedlichen AQ-PS/AQ-LPS-Präparate werden im Wesentlichen wie in Beispiel 5 beschrieben getestet, indem eine Zweifachverdünnungsreihe des AQ-PS/AQ-LPS zusammen mit dem Detektionsantikörper inkubiert wird. Die Platte wird wie in Beispiel 5 beschrieben behandelt und abgelesen. Das Ergebnis dieser Analyse war, dass steigende Mengen zu den Platten zugesetzte AQ-PS aufgrund der steigenden Konkurrenz durch die zugesetzten AQ-PS für den Antikörper zu schwächeren Signalen führten. Das weist darauf hin, dass die Antigenität von LPS und PS in AQ-PS immer noch erhalten bleibt.
  • Beispiel 17
  • Photochemische Kupplung von AQ-PS und AQ-LPS an Polystyrolplatten.
  • Allgemeines Verfahren
  • Die gefriergetrockneten AQ-PS/AQ-LPS-Konjugate werden in einer Endkonzentration von 1 mg/ml in ultrareinem Wasser gelöst. Diese Stammlösungen von Konjugaten weisen langfristige Stabilität auf (mehr als 3 Monate), wenn sie bei 4 °C gelagert werden und vor direktem Licht geschützt sind. Vor der Photokupplung werden die Stammlösungen in einer 0,1 M Lösung von MgCl2 in demineralisiertem Wasser verdünnt. Die optimale Endkonzentration der einzelnen Konjugate, der pH, während der Photokupplung und die Gegenwart von anorganischen Salzen müssen für jede Anwendung individuell bestimmt werden (siehe Beispiele 18 und 19). Die stark verdünnten Photokupplungslösungen sollten gut vor direktem Sonnenlicht geschützt werden. Die verdünnten Konjugatlösungen werden zu den einzelnen Wells einer Polystyrolmikroplatte zugesetzt (100 μl/Well). Die Platte wird unter einer geeigneten UV-Lichtquelle platziert und dann 20 min lang mit UV-Licht bestrahlt. Empfohlene UV-Lichtquellen sind Philips HPA 400 (diese Lampe gibt energiearmes UV-A- und UV-B-Licht hauptsächlich zwischen 300 und 400 nm ab (WO 96/31557)) oder Philips 25W-S-Leuchtstoffröhren, die UV-Licht zwischen 310 und 400 nm mit einer maximalen Leistung bei 345 nm emittieren. Die optimalen Bedingungen für die UV-Bestrahlung sowie die Bestrahlungsdauer (siehe Beispiel 20) müssen je nach UV-Lichtquelle und verwendeter Ausrüstung angepasst werden. Nach der UV-Bestrahlung wird die Platte abgeblasen, mit demineralisiertem Wasser (3 × 300 μl) gewaschen und schließlich 30 min lang bei 37 °C getrocknet. Die trockenen Platten sollten im Dunkeln bei Raumtemperatur gelagert werden.
  • Beispiel 18
  • Wirkung der AQ-PS/AQ-LPS-Konjugatkonzentration auf die Photokupplungseffizienz
  • Die AQ-PS/AQ-LPS von Salmonella Typhimurium oder Salmonella Choleraesuis werden in unterschiedlichen Konzentrationen auf den Mikroplatten immobilisiert, um die Effizienz der UV-Bestrahlung bei der Immobilisierung der Konjugate zu bestimmen.
  • Aus dem AQ-PS/AQ-LPS-Konjugat von Salmonella Typhimurium und Salmonella Choleraesuis wird wie in Beispiel 17 beschrieben eine Stammlösung hergestellt, und jedes Konjugat wird in separaten Röhrchen auf eine Endkonzentration von 1.000, 750, 500, 250 und 100 ng/ml für Salmonella Typhimurium und 1.000, 750, 500, 250 und 100 ng/ml für Salmonella Choleraesuis verdünnt. Als negative Kontrolle wird 0,1 M MgCl verwendet. Die 5 einzelnen Lösungen von Salmonella-Typhimurium-Konjugaten werden zu den Spalten 1-2, 3-4, 5-6, 7-8 und 9-10 einer Polystyrolmikroplatte zugesetzt (100 μl/Well), und zu Spalte 11-12 wird 0,1 M MgCl zugesetzt. Dann werden die Mikroplatten unter die UV-Lichtquelle gegeben und 20 min lang bestrahlt. Nach der UV-Bestrahlung wird die Platte abgeblasen, mit demineralisiertem Wasser (4 × 300 μl) gewaschen und direkt ohne Trocknen getestet. Als Vergleich wird Salmonella-Typhimurium-positives Schweineserum, das in PBS, Tween, BSA verdünnt wurde (1:400), zu den einzelnen Wells der Reihen A-B und Salmonella-Typhimurium-negatives Schweineserum, das in PBS, Tween, BSA verdünnt wurde (1:400), zu den einzelnen Wells der Reihen C-D der ersten Platte zugesetzt (100 μl/Well). Auf der zweiten Platte wird als Vergleich Salmonella-Choleraesuis-positives Schweineserum, das in PBS, Tween, BSA verdünnt wurde (1:400), zu den einzelnen Wells der Reihen A-B und Salmonella-Choleraesuis-negatives Schweineserum, das in PBS, Tween, BSA verdünnt wurde (1:400), zu den einzelnen Wells der Reihen C-D zugesetzt (100 μl/Well). Das Ganze wird unter leichtem Rütteln bei Raumtemperatur 60 min lang inkubiert, wonach alle Wells abgesaugt und mit PBS-Tween (3 × 300 μl) gewaschen werden. In PBS, Tween, BSA (1:2.000) verdünntes, HRP-markiertes Kaninchen-Anti-Schweine-IgG (Dako PO164) wird zu jedem Well zugesetzt. Das Ganze wird 60 min lang bei Raumtemperatur unter leichtem Rütteln inkubiert, dann werden die Wells gewaschen, und eine OPD-Substratlösung wird zu den einzelnen Wells der Platte zugesetzt (100 μl/Well). Die Platte wird 20 min lang im Dunkeln inkubiert, und dann wird die Enzymreaktion durch den Zusatz von 0,5 M H2SO4 (100 μl/Well) gestoppt. Die Ergebnisse werden mithilfe eines ELISA-Ablesegeräts bei 492 nm abgelesen.
  • 15 zeigt ein typisches Ergebnis unter Verwendung eines AQ-PS von Salmonella Typhimurium, und 16 zeigt ein typisches Ergebnis unter Verwendung eines AQ-PS von Salmonella Choleraesuis.
  • Beispiel 19
  • Wirkung von anorganischen Salzen und des pH auf die Photokupplungseffizienz von AQ-PS/AQ-LPS-Konjugaten
  • Unter Verwendung von demineralisiertem Wasser werden der folgende Puffer und die folgenden Salzlösungen hergestellt: 0,1 M NaCl, 0,1 M KCl, 0,1 M LiCl, 0,1 M MgCl2 und PBS pH 7,2. Aus dem AQ-PS-Konjugat von Salmonella Typhimurium und Salmonella Choleraesuis wird wie in Beispiel 17 beschrieben eine Stammlösung hergestellt, und jedes Konjugat wird in einem separaten Röhrchen, das den jeweiligen Puffer und die jeweilige Salzlösung enthält, auf eine Endkonzentration von 5 μg/ml für Salmonella Typhimurium und 10 μg/ml für Salmonella Choleraesuis verdünnt. Als Vergleich werden zwei Lösungen der Konjugate in demineralisiertem Wasser als Kontrolle verwendet. Die einzelnen Lösungen von Salmonella-Typhimurium-Konjugaten werden zu den Spalten 1-6 einer Polystyrolmikrotiterplatte (100 μl/Well), und die der Salmonella-Choleraesuis-Konjugate zu den Spalten 7-12 (100 μl/Well) zugesetzt. Dann wird die Mikroplatte unter der UV-Lichtquelle platziert und 20 min lang bestrahlt. Nach der UV-Bestrahlung wird die Platte abgeblasen, mit demineralisiertem Wasser (4 × 300 μl) gewaschen und direkt ohne Trocknen getestet. Als Vergleich wird Salmonella-Typhimurium-positives Schweineserum, das in PBS, Tween, BSA verdünnt wurde (1:400), zu den einzelnen Wells der Reihen A1-C6, Salmonella-Typhimurium-negatives Schweineserum, das in PBS, Tween, BSA verdünnt wurde (1:400), zu den einzelnen Wells der Reihen D1-F6, Salmonella-Choleraesuis-positives Schweineserum, das in PBS, Tween, BSA verdünnt wurde (1:400), zu den einzelnen Wells der Reihen A7-C12, Salmonella-Choleraesuis-negatives Schweineserum, das in PBS, Tween, BSA verdünnt wurde (1:400), zu den einzelnen Wells der Reihen D7-F12 und PBS, Tween, BSA alleine in den Reihen G und H zugesetzt (100 μl/Well). Das Ganze wird unter leichtem Rütteln bei Raumtemperatur 60 min lang inkubiert, alle Wells werden abgesaugt und mit PBS-Tween (3 × 300 μl) gewaschen und in PBS, Tween, BSA (1:2.000) verdünntes, HRP-markiertes Kaninchen-Anti-Schweine-IgG (Dako PO164) wird zu jedem Well von A1 bis G12 zugesetzt. Das Ganze wird 60 min lang bei Raumtemperatur unter leichtem Rütteln inkubiert, alle Wells werden gewaschen, und eine OPD-Substratlösung wird zu den einzelnen Wells der Platte zugesetzt (100 μl/Well). Die Platte wird 20 min lang im Dunkeln inkubiert, und dann wird die Enzymreaktion durch den Zusatz von 0,5 M H2SO4 (100 μl/Well) gestoppt. Die Ergebnisse werden mithilfe eines ELISA-Ablesegeräts bei 492 nm abgelesen. 17 zeigt ein typisches Ergebnis unter Verwendung von eines AQ-PS von Salmonella Typhimurium, und 18 zeigt ein typisches Ergebnis unter Verwendung eines AQ-PS von Salmonella Choleraesuis.
  • Beispiel 20
  • Wirkung der Bestrahlungsdauer auf die Photokupplungseffizienz von AQ-PS/AQ-LPS-Konjugaten
  • Die AQ-PS/AQ-LPS von Salmonella Typhimurium oder Salmonella Choleraesuis werden auf Mikroplatten immobilisiert, um die UV-Bestrahlungsdauer für die Immobilisierung der Konjugate zu bestimmen.
  • Eine verdünnte Lösung eines AQ-PS/AQ-LPS-Konjugats (Salmonella Typhimurium und Salmonella Choleraesuis), die in 0,1 M MgCl2 verdünnt ist, wird zur Platte zugesetzt. Als negative Kontrolle wird 0,1 M MgCl zur Platte zugesetzt. Die Platte (Streifen) wird unterschiedlich lange mit UV bestrahlt. Nach der UV-Bestrahlung wird die Platte mit demineralisiertem Wasser (4 × 300 μl) gewaschen und direkt ohne Trocknen getestet. Salmonella-Typhimurium-positives Schweineserum und Salmonella-Choleraesuis-positive Schweineserum, die in PBS-Tween verdünnt wurden (1:400), werden zur Platte zugesetzt (100 μl/Well). Die Platte wird unter leichtem Rütteln 60 min lang bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wird die Platte 3-mal mit PBST (300 μl/Well) gewaschen. Als sekundärer Antikörper wird an HRP konjugiertes Kaninchen-Anti-Mäuse-Ig (PO260, Dako), das 1:2.000 in PBST verdünnt wurde, zur Platte zugesetzt. Die Platte wird dann unter Rütteln 1 h lang inkubiert. Dann wird die Platte 3-mal mit PBST (300 μl/Well) gewaschen. Eine OPD-H2O2-Lösung wird zur Platte zugesetzt (100 μl/Well). Dann wird die Platte 20 min lang im Dunkeln inkubiert. Die Enzymreaktion wird durch den Zusatz von 0,5 M Schwefelsäure (100 μl/Well) gestoppt. Die Platte wird mithilfe eines ELISA-Lesegeräts bei 492 nm abgelesen.
  • 19 zeigt ein typisches Ergebnis unter Verwendung eines AQ-PS-Konjugats von Salmonella Typhimurium und eines AQ-PS-Konjugats von Salmonella Choleraesuis.
  • Beispiel 21
  • Serologischer Test mit Schweineserum an photogekuppelten AQ-PS von Salmonella Typhimurium
  • An AQ konjugiertes PS von Salmonella Typhimurium wird durch folgendes Verfahren auf Polystyrolplatten immobilisiert. Das Salmonella-Typhimurium-PS-AQ-Konjugat wird in ultrareinem Wasser gelöst. Die Lösungen sollten vor Licht geschützt werden. Eine Aliquote der Salmonella-Typhimurium-PS-AQ-Konmugatlösung wird in 0,1 M MgCl2 weiter verdünnt, um eine optimale Konzentration zu erhalten. Die verdünnte Lösung von Salmonella-Typhimurium-PS-AQ wird den Mikroplatten zugesetzt (100 μl/Well). Die Platten werden 20 min lang mit UV-Licht bestrahlt. Nach der Bestrahlung werden die Platten durch folgendes Verfahren gewaschen. Die Salmonella-Typhimurium-PS-AQ-Konjugatlösung wird entfernt, und 300 μl Wasser werden mithilfe eines Waschers zugesetzt. Die Mikroplatten werden dann 3-mal in Wasser gewaschen (3 × 300 μl). Dann werden die Mikroplatten 30 min lang bei 37 °C getrocknet. Die Mikroplatten werden 15 min lang auf Raumtemperatur äquilibrieren gelassen, bevor sie gepackt oder weiter verwendet werden. Die Platten sollten bei Raumtemperatur gelagert werden. Für serologische Zwecke werden Seren und/oder Fleischsaftproben vom Schwein untersucht. Das verwendete ELISA-Verfahren ist ein indirekter ELISA. Auf jeder Platte wird parallel zu den Proben eine geeignete Zusammenstellung von Referenzseren getestet. In PBS, Tween, BSA verdünnte Proben für Referenzseren (100 μl/Well) werden zu jedem Well zugesetzt. Die Platte wird unter leichtem Rütteln 1 h lang inkubiert. Dann wird die Platte in PBS, Tween (3 × 300 μl) gewaschen. Ein sekundärer Antikörper an HRP konjugiert (Kaninchen-Anti-Schweine-IGG-HRP, PO164, Dako) (100 μl/Well), der in PBS, Tween, BSA verdünnt wurde, wird zu jedem Well zugesetzt. Die Platte wird dann unter leichtem Rütteln 1 h lang inkubiert. Dann wird die Platte mit PBS, Tween (3 × 300 μl) gewaschen. Eine OPD-Lösung (100 μl/Well) wird zur Platte zugesetzt. Dann wird die Platte 20-25 min lang inkubiert, je nachdem, wie schnell die Kontrollen die geeigneten OD-Werte erreichen. Die Enzymreaktion wird durch Zusatz von 100 μl 0,5 M Schwefelsäure ge stoppt. Die Platte wird manuell geschüttelt und bei 492 nm mithilfe eines ELISA-Lesegeräts abgelesen.
  • Die Ergebnisse sind in 20 zu sehen. Wie in der Fig. zu erkennen ist, sind die Seren 1-5 Salmonella-negativ, während die Seren 6-15 für Salmonella Typhimurium positiv sind.
  • Beispiel 24
  • Serologische Tests unter Verwendung von kovalent gekuppelten Lipopolysaccharid-Polysacchariden: Gemisch aus gekuppelten Salmonella-Polysacchariden
  • In einem Vergleichsexperiment wurden Platten wie oben beschrieben mit einem Gemisch aus Salmonella-Typhimurium- und Salmonella-Choleraesuis-Polysacchariden beschichtet (Kovalent-Mix-ELISA) und mit auf herkömmliche Weise mit ganzen LPS von den gleichen beiden Salmonella-Serotypen beschichteten Platten verglichen ("Mix-ELISA" (Nielsen (1995)). Vier Salmonella-Typhimurium-positive, zwei Salmonella-Infantis-positive und ein Salmonella-negatives Seren wurden als Referenzseren verwendet, um die OD-Ablesungen der einzelnen ELISA-Platten zu kalibrieren, und zwar genauso wie oben beschrieben (Nielsen (1995)) (siehe unten). Der Kovalent-Mix-ELISA wurde laut der Arbeitsvorschrift für den Mix-ELISA durchgeführt (Nielsen et al. (1995)), mit der Ausnahme, dass der Blockierschritt (mit Rinderserumalbumin, BSA) ausgelassen wurde. Die Seren wurden 1:400 in PBS, Tween, BSA verdünnt. 100 μl der einzelnen Seren wurden je zweifach aufgetragen und ohne Rütteln 1 h lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden dann dreimal in PBS,T gewaschen und dann 1 h lang bei Raumtemperatur mit HFP-konjugiertem Kaninchen-Anti-Schweine-IgG (PO164, DAKO) inkubiert, das 1:3.000 in PBS, Tween, BSA verdünnt worden war. Die Platten wurden dann wie vorher gewaschen, und 100 μl OD-Substratlösung wurden zu jedem Well zugesetzt und 10-15 min lang inkubiert. Die Reaktion wurde mit 100 μl H2SO4 gestoppt, und die optische Dichte wurde bei 490 nm abgelesen, wobei jene bei 650 nm abgezogen wurden (Hintergrundkorrektur).
  • Um die AQ-PS-beschichteten Platten zu testen, wurden 20 Seren mit bekannter Reaktivität im Mix-ELISA-System verwendet (20 Seren von Schweinen aus unterschiedlichen Herden). Ein typisches Ergebnis ist in 21 zu sehen. Unter Verwendung eines Cut-offs von 10 OD% bleiben alle Seren in der gleichen positiven oder negativen Gruppe, wenn sie im AQ-PS-ELISA bzw. Mix-ELISA getestet wurden. Der OD-Wert der schwach ansprechenden Proben korrelierte gut zwischen den beiden Systemen. Für die positiven Proben wurde bei manchen Proben eine leichte Reduktion im AQ-PS-ELISA beobachtet, aber dieses Merkmal variierte von Tag zu Tag.
  • Beispiel 25
  • Reproduzierbarkeit von photogekuppelten AQ-PS-Gemischen von Salmonella Typhimurium und Salmonella Choleraesuis
  • Die Reproduzierbarkeit der AQ-PS-immobilisierten Mikroplatten wurde über einen längeren Zeitraum untersucht. Mikroplatten wurden wie oben beschrieben mit AQ-PS-Gemischen von Salmonella Typhimurium und Salmonella Choleraesuis immobilisiert. Referenzseren wurden auf jeder Platte in 16 Duplikaten zugesetzt. Dieses Verfahren wurde täglich über einen Zeitraum von vier Tag auf vier Platten durchgeführt. Die Ergebnisse wurden gegen ein Kontrollreferenzserum normalisiert. Die Schwankungen innerhalb der Platten betrugen 7,7 %, während die Schwankungen zwischen den Platten 5,1 % betrugen.
  • Beispiel 26
  • Lagerstabilität von photogekuppelten AQ-PS-Gemischen von Salmonella Typhimurium und Salmonella Choleraesuis
  • Die Lagerstabilität der Salmonella-Typhimurium- und Salmonella-Choleraesuis-AQ-PS-Gemisch-ELISA-Platten ist ein wichtiger Faktor, der untersucht werden muss. Eine lange Lagerstabilität steht für eine Platte, die unabhängig von Beschichtungsverfahren vor der Verwendung ist, und eine Platte, die minimale Schwankungen innerhalb der gleichen Charge sowie zwischen unterschiedlichen Chargen aufweist. Die Stabilität der PS-AQ-immobilisierten Mikroplatten wurde über den Zeitraum mehrerer Monate untersucht. Die Platten wurden wie in Beispiel 23 beschrieben hergestellt und bei Raumtemperatur im Dunkeln gelagert, wonach die Platten unter Verwendung einer Reihe von Referenzseren gegen Salmonella-Typhimurium- und Salmonella-Choleraesuis-O-Antigenen in PS/LPS getestet wurden, und zwar über einen Zeitraum von 71 Tagen. Die Ergebnisse sind in 22 zu sehen. Wie in 22 zu erkennen ist, waren die Platten zumindest 71 Tage lang stabil.
  • Beispiel 27
  • Detektion von Infektionsgraden in Schweineherden unter Verwendung eines serologischen Tests, der auf photogekuppelten AQ-PS-Gemischen von Salmonella Typhimurium und Salmonella Choleraesuis basiert
  • Die mit AQ-PS-Gemischen von Salmonella Typhimurium und Salmonella Choleraesuis photogekuppelten Mikroplatten wurden auf ihre serologische Anwendungsmöglichkeiten geprüft. Für eine serologische Überwachung von Schweineherden ist es von großer Bedeutung, dass eine standardisierte Mikroplatte mit minimalen Schwankungen bereitgestellt wird, um in jedem Test eine verlässliche und reproduzierbare Antwort zu erhalten. Um dies zu erreichen, müssen Platten mit den vorher beschriebenen Qualitäten hergestellt werden.
  • Eine Reihe von Seren von 59 herkömmlichen Schweineherden (10 Seren aus jeder Herde) wurden wie in Beispiel 26 beschrieben mithilfe eines photogekuppelten Gemischs aus Salmonella-Typhimurium- und Salmonella-Choleraesuis-PS untersucht. Das Ergebnis dieser Analyse wurde mit dem Ergebnis einer Analyse der gleichen Proben in einem auf herkömmliche Weise beschichteten "Mix-ELISA" (Nielsen (1995)) unter Verwendung von LPS von den gleichen beiden Salmonella-Typen verglichen. Laut dem Mix-ELISA und ausgehend von den Prinzipien des dänischen Salmonella-Überwachungsprogramms (Mousing, J., Jensen, P. T., Halgaard, C., Bager, F., Feld, N., Nielsen, B., Nielsen, J. P., Bech-Nielsen, S., Nation-wide Salmonella Enterica Surveillance and Control in Danish Slaughter Swine Herds, Prev. Vet. Med. 29, 247-261 (1997) gab es nur geringe Mengen Salmonella in den Herden.
  • Das verwendete ELISA-Verfahren war der folgende indirekte ELISA. Eine geeignete Gruppe von Referenzseren wurde auf jeder Platte parallel zu den Proben getestet. Die in PBS, Tween, BSA verdünnten Proben der Referenzseren (100 μl/Well) werden zu den einzelnen Wells zugesetzt. Die Platte wird eine Stunde lang inkubiert (Rütteln während der Inkubation kann das P/N-Verhältnis zwischen positiven und negativen Proben verbessern). Die Platte wird in PBS, Tween (3 × 300 μl) gewaschen. Ein an HRP konjugierter sekundärer Antikörper (Kaninchen-Anti-Schweine-IgG-HRP, PO164, Dako) (100 μl/Well), in PBS, Tween, BSA (1:2.000) verdünnt, wird zu den einzelnen Wells zugesetzt. Die Platte wird eine Stunde lang unter leichtem Rütteln inkubiert. Dann wird die Platte in PBS, Tween (3 × 300 μl) gewaschen. Eine OPD-Lösung (100 μl/Well) wird zur Platte zugesetzt. Dann wird die Platte 20-25 min lang inkubiert, je nachdem, wie schnell die Kontrollen die geeigneten OD-Werte erreichen. Die Enzymreaktion wird durch den Zusatz von 100 μl 0,5 M Schwefelsäure gestoppt. Die Platte wird manuell geschüttelt und bei 492 nm mithilfe eines ELISA-Lesegeräts abgelesen.
  • Nur vier der 590 Proben waren im photogekuppelten Assay positiv, was aufrecht erhält, dass in allen Herden nur wenig Salmonella vorhanden ist, was sich auch im herkömmlichen "Mix-ELISA" zeigte.
  • Beispiel 28
  • Detektion von Salmonella-Typhimurium-Bakterien unter Verwendung eines kompetitiven ELISA-Tests, basierend auf photogekuppelten AQ-PS-Gemischen von Salmonella Typhimurium und Salmonella Choleraesuis
  • Die mit AQ-PS-Gemischen von Salmonella Typhimurium und Salmonella Choleraesuis photogekuppelten Mikroplatten könne als Antigen-ELISA zur Detektion von Salmonella-Bakterien oder Salmonella-Antigenen verwendet werden. Die Detektion von Salmonella-Bakterien in Nahrungsmitteln oder in der Umwelt hat großes Potenzial. Die Detektion von Salmonella-Bakterien kann durch die Verwendung von photogekuppelten AQ-PS-Gemischen von Salmonella Typhimurium und Salmonella Choleraesuis als kompetitiver ELISA in folgendem Verfahren erreicht werden.
  • Bakterienproben werden in zweifacher Verdünnung in PBS (50 μl/Well) zu den Platten zugesetzt. Als Kontrolle wird PBS (ohne Bakterienproben) zu den Platten zugesetzt (50 μl/Well). Ein in PBS, Tween, BSA verdünnter, monoklonaler Antikörper (50 μl/Well) gegen der relevanten Salmonella-Serotypen wird zur Platte zugesetzt. Als negative Kontrolle wird der monoklonale Antikörper zu einem Well mit PBS zugesetzt. Als positive Kontrolle wird PBS, Tween, BSA zu einem Well mit PBS zugesetzt. Die Platte wird eine Stunde lang unter leichtem Rütteln inkubiert. Dann wird die Platte in PBS, Tween (3 × 300 μl) gewaschen. Ein an HRP konjugierter sekundärer Antikörper (Kaninchen-Anti-Mäuse-IgG-HRP, PO260, Dako) (100 μl/Well), in PBS, Tween, BSA verdünnt, wird zu den einzelnen Wells zugesetzt. Die Platte wird eine Stunde lang unter Rütteln inkubiert. Dann wird die Platte in PBS, Tween (3 × 300 μl) gewaschen, wobei sichergestellt wird, dass bei jedem Waschdurchgang alle Wells gefüllt werden. Eine OPD-Lösung (100 μl/Well) wird zur Platte zugesetzt. Dann wird die Platte 20-25 min lang inkubiert, je nachdem, wie schnell die Kontrollen die geeigneten OD-Werte erreichen. Die Enzymreaktion wird durch den Zusatz von 100 μl 0,5 M Schwefelsäure gestoppt. Die Platte wird manuell geschüttelt und bei 492 nm mithilfe eines ELISA-Lesegeräts abgelesen. Die Wells mit dem monoklonalen Antikörper werden als 100%ige Antwort gerechnet. Die Wells mit PBS, Tween, BSA werden als 0%ige Antwort gerechnet. Die OD-Antwort der Wells mit Bakterienproben wird in Bezug auf die positiven und negativen Kontrollen berechnet. Der Rückgang der Antwort ist proportional zur Steigerung der Positivität der Probe. Aus der Titrationskurve wird der Titer berechnet. Der Titer ist der Verdünnungsfaktor der Bakterienlösung, der zu einer 50%igen Abnahme des OD-Werts im Vergleich zum OD-Wert ohne konkurrierendes Antigen (100 % Antwort) führt.
  • Beispiel 29
  • Konjugation von Biotin an PS von Salmonella Typhimurium
  • Der folgende Kupplungspuffer und die folgenden Reagenzienlösungen werden frisch zubereitet:
    Lösung 1: 1 mM N-Hydroxysuccinimid in DMSO (6 mg N-Hydroxysuccinimid gelöst in 50 ml DMSO).
    Lösung 2: 2 mM WSC in ultrareinem Wasser (9,6 mg WSC gelöst in 25 ml Wasser).
    Lösung 3: 2 mM Biotinamin in ultrareinem Wasser (19 mg gelöst in 25 ml Wasser). Puffer: Natriumhydrogencarbonat-Puffer, pH 8,0 (Natriumhydrogencarbonat (8,4 g) wird in ultrareinem Wasser gelöst und der pH mit 1 M wässrigem HCl auf 8,0 eingestellt).
  • Die resultierende klare Lösung wird über Nacht bei 4 °C gerührt. Dann wird das Reaktionsgemisch drei Tage lang gegen ultrareines Wasser dialysiert, wobei das ultrareine Wasser jeden Tag gewechselt wird. Schließlich wird das PS-Biotin-Konjugat über Nacht gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete PS-Biotin-Konjugat wird in ultrareinem Wasser in einer Endkonzentration von 1 mg/ml gelöst. Diese Stammlösung eines PS-Biotin-Konjugats weist eine langfristige Stabilität auf (mehr als 3 Monate) wenn es bei 4 °C gelagert wird und vor direktem Licht geschützt ist. Die Stammlösungen werden in PBS pH 7,2 1:100 und 1:400 verdünnt. Die verdünnten PS-Biotin-Lösungen werden zu einer Mikroplatte (100 μl/Well) zugesetzt, die mit Streptavidin beschichtet ist (Pierce). Als Kontrolle werden verdünnte PS-Lösungen (1:100 und 1:400 in PBS) zur Mikroplatte zugesetzt (100 μl/Well). Die Platte wird 1 h lang unter Rütteln inkubiert. Dann wird die Platte 3-mal mit PBST (300 μl/Well) gewaschen. Ein monoklonaler Antikörper gegen Salmonella-Typhimurium-LPS (O-Kette) (S9, HyTest Ltd.) wird in zweifacher Verdünnung (verdünnt in PBST) (100 μl/Well) zur Platten zugesetzt. Die Platten wird 1 h lang unter Rütteln inkubiert. Die Platte wird 3-mal mit PBST (300 μl/Well) gewaschen. Als sekundärer Antikörper wird an HRP konjugiertes Kaninchen-Anti-Mäuse-Ig (PO260, Dako), das 1:2.000 in PBST verdünnt wurde, zur Platte zugesetzt. Die Platte wird dann unter Rütteln 1 h lang inkubiert. Dann wird die Platte 3-mal mit PBST (300 μl/Well) gewaschen. Eine OPD-H2O2-Lösung wird zur Platte zugesetzt (100 μl/Well). Dann wird die Platte 20 min lang im Dunkeln inkubiert. Die Enzymreaktion wird durch den Zusatz von 0,5 M Schwefelsäure (100 μl/Well) gestoppt. Die Platte wird mithilfe eines ELISA-Lesegeräts bei 492 nm abgelesen. Die Ergebnisse sind in 23 zu sehen. Wie in 23 zu erkennen ist, bindet nur das biontinkonjugierte PS an die Streptavidinplatte.
  • Beispiel 30
  • Klinische Tests unter Verwendung von kovalent gekuppelten Lipopolysaccharid-Polysacchariden: Gekuppelte Actinobacillus-pleuropneumoniae-Serotyp-5b-Polysaccharide
  • Polysaccharide vom Actinobacillus pleuropneumoniae Serotyp 5b (App5b), wie sie oben beschrieben wurden (Beispiel 10), werden wie in Beispiel 12a für Salmonella-PS beschrieben mit AQ derivatisiert und danach wie oben beschrieben (Beispiel 17) an PolySorp-Immunplatten von Nunc gekuppelt. Die Mikrotiterplatten wurden kovalent mit dem App5b-PS-AQ-Konjugat in zweifacher Verdünnung von a500 ng auf 0,98 ng PS-AQ pro Well gekuppelt. Ein positives und ein negatives Serum für App5b, 1:400 in PBS-T verdünnt, wurden auf die Platten aufgetragen. Die Platten wurden 1 h lang inkubiert. Dann wurden die Platten 3-mal in PBS-T gewaschen und danach mit einem sekundären Antikörper (Kaninchen-Anti-Schweine-Ig, HRP-konju giert) inkubiert. Die Platten wurden 1 h lang inkubiert und danach 3-mal in PBS-T gewaschen. Dann wurden die Platten mit OPD entwickelt.
  • Die Ergebnisse sind in 24 dargestellt. Die Figur zeigt, dass das vom Actinobacillus-pleuropneumoniae-Serotyp-5b-Lipopolysaccharid stammende Polysaccharid an AQ konjugiert und kovalent an eine Mikroplattenoberfläche gekuppelt werden kann. Die Antigenität wurde aufrecht erhalten, da die PS-AQ-Antigen-beschichteten Platten eine ähnliche Antwort aufweisen wie passiv beschichtete LPS-Platten. Der Actinobacillus ist eine gramnegative Bakterie der HAP-Familie und deshalb taxonomisch nicht eng mit Salmonella-Stämmen verwandt. Das weist darauf hin, dass LPS von gramnegativen Bakterien im Allgemeinen erfolgreich in PS-AQ-Konjugat übergeführt werden können.
  • Beispiel 31
  • Klinische Tests unter Verwendung von kovalent gekuppelten Lipopolysaccharid-Polysacchariden: Gekuppelte Actinobacillus-pleuropneumoniae-Serotyp-6-Polysaccharide
  • Polysaccharide vom Actinobacillus pleuropneumoniae Serotyp 6, wie sie oben beschrieben wurden (Beispiel 10), werden wie in Beispiel 12-13 für Salmonella-PS beschrieben mit AQ derivatisiert und danach wie oben beschrieben (Beispiel 17) an PolySorp-Immunplatten von Nunc gekuppelt. Diese Oberfläche wird mit einer herkömmlichen Oberfläche verglichen, die durch Adsorption von ganzen LPS vom gleichen Actinobacillus-pleuropneumoniae-(Ap-)Stamm in einem kompetitiven ELISA unter Verwendung eines polyklonalen Antikörpers als Detektionsantikörper und einer Blockade durch genau definiertes Schweineserum erhalten wurde. Die optimale Konzentration des Ap5-LPS-Antigens, Serums und Enzymkonjugats werden durch Schachbrett-Titrationen auf ELISA-Platten bestimmt. Die Mikroplatten werden mit 1:10.000 in PBS verdünnten LPS beschichtet und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Dann werden die Platten mit PBS mit 0,05 % Tween 20 und mit 1 % Rinderserum albumin (PBS, T, BSA) 30 min lang bei Raumtemperatur (RT) blockiert. Testseren werden 1:10 in PBS, T, BSA verdünnt und in doppelter Ausführung zu den Wells zugesetzt und 1 h lang bei RT inkubiert. Ohne die Platten zu leeren, wird 1.8.000 verdünntes Kaninchenserum über 30 min bei RT zugesetzt. Danach werden die Platten mit peroxidasekonjugiertem Schwein-Anti-Kaninchen-Immunoglobulin (Dako, Kopenhagen, Dänemark) inkubiert, das 1:1.000 in PBS, T, BSA verdünnt wurde. Die Substrat-Farbstoff-Lösung o-Phenylendiamin-H2O2 wird 15 min lang umsetzen gelassen, und dann wird die Reaktion durch den Zusatz von 0,5 M H2SO4 gestoppt. Die optische Dichte bei 490 nm wird mit 650 nm als Referenz gemessen. Die optische Dichte der Reihen mit PBS, T, BSA ohne Serum wird zur Berechnung der prozentuellen Hemmung der einzelnen Seren verwendet. Die Verdünnung und Inkubationsdauer für das Testserum und das Kaninchenserum werden so eingestellt, dass negative Seren 0-25 % Hemmung und positive Seren 80-100 % Hemmung aufweisen.
  • Die Ergebnisse sollten zeigen, dass das von Ap stammende Polysaccharid kovalent an die Mikroplattenoberfläche gekuppelt werden kann, wobei es seine Antigenität beibehält und ein Blockierverhalten aufweist, das mit dem von auf herkömmliche Weise nichtkovalent beschichteten ganzen LPS vergleichbar oder sogar besser ist.
  • Beispiel 32
  • Konjugation von H2N-(CH2)3-NHCO-AQ·HCl an KDO
  • KDO (10 mg, 40 μmol), H2N-(CH2)3-NHCO-AQ·HCl (7 mg, 20 μmol) und BOP (21 mg, 48 μmol) wurden in DMSO gelöst. Dann wurde Triethylamin (17 μl, 120 μmol) zugesetzt, und die klare Lösung wurde 60 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Wasser (40 ml) wurde zum Reaktionsgemisch zugesetzt, das dann gefriergetrocknet wurde. Das feste Produktgemisch wurde in Wasser (1 ml) gelöst/resuspendiert und zu einer SeppPak-C18-Säule zugesetzt (1ml), die vorher mit Acetonitril (7 ml) und Wasser (7 ml) äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit Wasser (10 ml) und dann Wasser/Acetonitril (10 ml, 1:1 (Vol./Vol)) eluiert. Die erste wässrige Frak tion enthielt hauptsächlich überschüssige KDO und andere Verunreinigungen, während die zweite Wasser/Acetonitril-Fraktion das AQ-KDO-Konjugat enthielt. DC (1-Butanol/Essigsäure/Wasser 4:1:1): Rf = 0,33. MS (MALDI-TOF): 545,8 (MH+ + H2O).
  • Beispiel 33
  • Verfahren zur Abschätzung der Anzahl an bestimmten Bakterien, Serotypisierung von Bakterien oder Antigen-(LPS/PS-)Detektion durch Verwendung von AQ-PS-immobilisierten Mikroplatten
  • Eine Bakterienlösung oder Antigenlösung (LPS/PS) wird in Zweifachverdünnung zu den Platten zugesetzt (50 μl/Well). Ein in PBS, Tween, BSA verdünnter, monoklonaler Antikörper gegen Salmonella Typhimurium oder Salmonella Choleraesuis (50 μl/Well) wird zur Platte zugesetzt. Die Platte wird eine Stunde lang unter leichtem Rütteln inkubiert. Dann wird die Platte 3-mal mit PBS, Tween (300 μl/Well) gewaschen. An HREP konjugiertes Kaninchen-Anti-Mäuse-IgG (PPO260, Dako), in PBS, Tween, BSA verdünnt, wird zur Platte zugesetzt (100 μl/Well). Die Platte wird eine Stunde lang unter leichtem Rütteln inkubiert. Dann wird die Platte 3-mal mit PBS, Tween gewaschen (300 μl/Well). Eine OPD-Lösung wird zur Platten zugesetzt (100μl/Well). Die Platte wird dann 20 min lang im Dunkeln inkubiert. Die Reaktion wird durch den Zusatz von 0,5 M H2SO4 gestoppt (100 μl/Well). Die Platte wird bei 492 nm in einem ELISA-Ablesegerät abgelesen. Dieses Verfahren ermöglicht die Detektion kleiner Bakterienmengen in biologischen Flüssigkeiten und die Bestimmung von Bakterien-Serotypen.

Claims (40)

  1. Verfahren zur Immobilisierung eines Polysaccharids (PS) auf einer festen Oberfläche, wobei das Polysaccharid eine Ketocarboxygruppe (-C(=O)COOH) oder eine entsprechende Ketal- oder Halbketalgruppe aufweist und das Verfahren folgende Schritte umfasst: (a) Ausbildung einer kovalenten Bindung zwischen der Carboxygruppe des Polysaccharids und einem Reportermolekül (RM), wodurch ein Polysaccharid-Reportermolekül-Konjugat (PS-RM) gebildet wird, wobei das Reportermolekül eine Erkennungs-/Substratstelle umfasst; und (b) Immobilisierung des Polysaccharid-Reportermolekül-Konjugats (PS-RM) durch Bildung einer spezifischen Bindung zwischen der Erkennungs-/Substratstelle des Reportermoleküls und einer Rezeptions-/Reagensstelle auf der festen Oberfläche.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Ketocarboxygruppe des Polysaccharids Teil einer KDO-(1-Keto-3-desoxy-D-manno-octonsäure-)Monosaccharid-Einheit des Polysaccharids ist.
  3. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das Polysaccharid (PS) im Wesentlichen identisch mit dem Kohlenhydratteil eines grampositiv-bakteriellen Lipopolysaccharids (LPS) ist.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, worin das Polysaccharid durch selektive Hydrolyse der Ketalbindung zwischen dem inneren Kernteil und dem Lipid-A-Teil eines gramnegativ-bakteriellen Lipopolysaccharids erhalten wird.
  5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin das Polysaccharid weiters den Lipidteil eines gramnegativ-bakteriellen Lipopolysaccharids umfasst, wodurch ein bakterielles Lipopolysaccharid gebildet wird.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5, worin das bakterielle Lipopolysaccharid von einer Bakterie stammt, die aus gramnegativen Bakterien ausgewählt ist, die menschliche oder tierische Pathogene sind, wie z.B. Enterobakterien, respiratorische Bakterien, Urogenital-Bakterien und neuropathogene Bakterien.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, worin die Bakterie eine tierisch-pathogene oder zoonotische Bakterie ist, einschließlich aus Escherichia coli, Salmonella Typhimurium, Salmonella Choleraesuis, Salmonella Enterica und allen Serotypen davon ausgewählter Enterobakterien, insbesondere Salmonella Typhimurium, Salmonella Enteritidis, Salmonella Choleraesuis, Salmonella Manhattan, Salmonella Dublin, Salmonella Infantis, Escherichia coli spp., einschließlich O157, Ödemkrankheiten verursachende Escherichia coli, Yersinia entercolitica und Campylobacter jejuni.
  8. Verfahren nach Anspruch 6, worin die Bakterie eine respiratorische Bakterie ist, die aus der HAP-Gruppe von Bakterien ausgewählt ist, insbesondere Actinobacillus sp., insbesondere die NAP-Bakterie Actinobacillus pleuropneumoniae, Haemophilus somnus, Pasteurella haemolytica, Pasteurella multocida, Haemophilus parasuis und Mannheimia sp.
  9. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Polysaccharid ein Molekulargewicht von zumindest 1.000 aufweist.
  10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, worin die Ausbildung der kovalenten Bindung zwischen dem Polysaccharid und dem Reportermolekül durch Verwendung eines Kupplungsreagens mediiert wird.
  11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, worin die Ausbildung der kovalenten Bindung zwischen dem Polysaccharid und der chemischen Funktionalität der festen Oberfläche durch Verwendung eines Kupplungsmittels mediiert wird.
  12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, worin das Reportermolekül einen Reporterteil zur Präsentation der Erkennungs-/Substratstelle und einen Linkerteil zum Verbinden des Reporterteils mit dem Polysaccharid umfasst.
  13. Verfahren nach Anspruch 12, worin das Polysaccharid-Reportermolekül-Konjugat (PS-RM) die allgemeine Formel PS'-C(=O)-N(RN)-F-L-R aufweist, worin PS'-C(=O) das Polysaccharid ist, N(RN)-F die Gruppe ist, die direkt an der kovalenten Bindung zwischen dem Polysaccharid und dem Reportermolekül beteiligt ist, RN Wasserstoff oder C1-4-Alkyl ist, L der Linkerteil des Reportermoleküls ist und R der Reporterteil des Reportermoleküls ist.
  14. Verfahren nach Anspruch 13, worin -N-F- für Amino (-N-), Anilino (-N-Ph), Hydrazido (-N-C(=O)-), Semicarbazido (-N-C(=O)-NH-), Thiosemicarbazido (-N-C(=S)-NH-) oder Hydrazino (-N-NH-), vorzugsweise Amino, steht.
  15. Verfahren nach Anspruch 13, worin L für ein Biradikal steht, das aus C1-20-Alkylen, das gegebenenfalls aromatische oder einfach oder mehrfach ungesättigte Kohlenwasserstoffe oder zyklische Kohlenwasserstoffe umfasst, Oligooxyethylenen, Oligoamiden, wie z.B. Oligoglycin, Oligoalanin, Oligolysin und Oligopeptide im Allgemeinen, Oligophosphodiestern, Oligophosphoamidaten, Oligophosphodiamiden, Oligosulfonestern und Oligosulfonamiden ausgewählt ist.
  16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, worin das Reportermolekül ein Molekulargewicht von höchstens 10.000, vorzugsweise höchstens 5.000, insbesondere höchstens 2.500, aufweist.
  17. Verfahren nach Anspruch 13, worin der Reporterteil eine photochemisch reaktive Gruppe ist.
  18. Verfahren nach Anspruch 13, worin der Reporterteil eine thermochemisch reaktive Gruppe ist.
  19. Verfahren nach Anspruch 13, worin der Reporterteil Teil eines Affinitätspaars ist.
  20. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die feste Oberfläche eine Oberfläche eines organischen Polymers, eines Glases, von Silicium, von Siliciumoxid (Silica) oder eines Verbundmaterials daraus ist.
  21. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin zwei oder mehr Polysaccharid-Typen immobilisiert werden, worin solche Typen unterschiedliche bakterielle Serotypen darstellen.
  22. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 21, worin das LPS, von dem das PS herrührt, ein LPS von einer Salmonella-Bakterie ist und das Reportermolekül einen Reporterteil umfasst, die aus Anthrachinonen und Biotin, vorzugsweise Anthrachinon, ausgewählt ist.
  23. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 21, worin das LPS, von dem das PS herrührt, ein LPS von einer Actinobacillus-Bakterie ist und das Reportermolekül einen Reporterteil umfasst, der aus Anthrachinonen und Biotin, vorzugsweise Anthrachinon, ausgewählt ist.
  24. Feste Oberfläche, die gemäß einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 23 erhältlich ist.
  25. Verwendung einer festen Oberfläche nach Anspruch 24 in einem Diagnosetest.
  26. Verwendung nach Anspruch 25, worin der Diagnosetest ein Festphasenimmuntest ist.
  27. Verwendung nach Anspruch 25, worin der Diagnosetest ein serologischer Test ist, z.B. ein serologischer Test zur Detektion von Antikörpern gegen Mikroorganismen.
  28. Verwendung nach Anspruch 25, worin der Diagnosetest ein serologischer Test zur Detektion von Antikörpern gegen Salmonella spp. ist.
  29. Verwendung nach Anspruch 25, worin der Diagnosetest ein serologischer Test zur Detektion von Antikörpern gegen Actinobacillus spp. ist.
  30. Testvorrichtung zur Detektion von Antikörpern gegen eine oder mehrere gramnegative Bakterien, umfassend eine feste Oberfläche mit einem Polysaccharid (PS), das durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 23 über die Carbonsäuregruppe einer KDO-Monosaccharid-Einheit des Polysaccharids darauf immobilisiert ist, wobei das Polysaccharid (PS) dem Kohlenhydratteil des bakteriellen Lipopolysaccharids (LPS) der gramnegativen Bakterie entspricht.
  31. Verfahren zur Abschätzung der Anzahl an Bakterien oder zur Serotypisierung von bakteriellem Antigen in einer Probe, die vollständige Bakterien oder Teile oder Lysate davon umfasst, worin eine Testvorrichtung nach Anspruch 30 oder 31 verwendet wird.
  32. Verbindung der allgemeinen Formel I, die als Zwischenprodukt in Abschnitt (a) eines Verfahrens nach Anspruch 1 gebildet wird:
    Figure 00690001
    (oder, wenn R2 Wasserstoff ist, gegebenenfalls deren Ketoanalog) worin: R1 ein Reportermolekül L-R ist, worin L ein optionaler Linkerteil des Reportermoleküls ist und R ein Reporterteil des Reportermoleküls ist; RN aus Wasserstoff und C1-14-Alkyl ausgewählt ist; F aus einer Einfachbindung, Phenylen, Carbonyl (C(=O)), Carbonylimino (C(=O)NH), Thiocarbonyl ((C(=S)) und Imino (-NH-) ausgewählt ist; R2, R7, R8 unabhängig voneinander aus Wasserstoff und Hydroxyschutzgruppen ausgewählt sind; R4 aus Wasserstoff, einem Mono- oder Dischaccharidrest und einer Hydroxyschutzgruppe ausgewählt ist; und R5 aus Wasserstoff, einem Polysaccharidrest, dessen funktionelle Gruppen gegebenenfalls geschützt sind, und einer Hydroxyschutzgruppe ausgewählt ist.
  33. Verbindung nach Anspruch 32, worin -N-F- für Amino (-N-), Anilino (-N-Ph), Hydrazido (-N-C(=O)-), Semicarbazido (-N-C(=O)-NH-), Thiosemicarbazido (-N-C(=S)-NH-) oder Hydrazino (-N-NH-), vorzugsweise Amino, steht.
  34. Verbindung nach Anspruch 32, worin L für ein Biradikal wie in nach Anspruch 15 definiert steht.
  35. Verbindung nach Anspruch 32, worin das Reportermolekül (R) ein Molekulargewicht von höchstens 10.000, vorzugsweise höchstens 5.000, insbesondere höchstens 2.500, aufweist.
  36. Verbindung nach Anspruch 32, worin R4 aus KDO-2-yl, 4-Phosphoethanolamin-KDO-2-yl, L-Rhamnosyl-(1->4)-KDO-2-yl und KDO-(2->4)-KDO-2-yl ausgewählt ist.
  37. Verbindung nach Anspruch 32, worin der Polysaccharidrest vorzugsweise 2-997 verbundene Monosaccharideinheiten, beispielsweise zumindest 7, z.B. 7-997, verbundene Monosaccharideinheiten, insbesondere zumindest 22, z.B. 22-497, verbun dene Monosaccharideinheiten, umfasst, wobei der Polysaccharidrest gegebenenfalls nichtstöchiometrisch substituiert ist.
  38. Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 32 zur Herstellung einer Testvorrichtung zur Detektion von Antikörpern gegen gramnegative Bakterien.
  39. Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 32 zur Herstellung einer ein immobilisiertes Polysaccharid tragenden festen Oberfläche.
  40. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der allgemeinen Formel I nach Anspruch 32, umfassend das Umsetzen einer Verbindung der allgemeinen Formel III
    Figure 00710001
    worin R2, R4, R5, R6, R7 und R8 wie in Anspruch 32 definiert sind, mit einer Stickstoffverbindung der allgemeinen Formel IV H-N(RN)-F-R1 IVworin R1, F und RN wie in Anspruch 32 definiert sind; und gegebenenfalls die teilweise oder vollständige Entfernung der Schutzgruppen des dadurch erhaltenen Produkts, um eine Verbindung der allgemeinen Formel I zu erhalten.
DE69926261T 1998-12-15 1999-12-15 Koppeln an feste phasen von kohlenhydraten, die von lipopolysacchariden abgeleitet sind Expired - Lifetime DE69926261T2 (de)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DK165598 1998-12-15
DKPA199801655 1998-12-15
PCT/DK1999/000704 WO2000036419A1 (en) 1998-12-15 1999-12-15 Coupling of lipopolysaccharide-derived carbohydrates onto solid surfaces

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE69926261D1 DE69926261D1 (de) 2005-08-25
DE69926261T2 true DE69926261T2 (de) 2006-05-24

Family

ID=8106943

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE69926261T Expired - Lifetime DE69926261T2 (de) 1998-12-15 1999-12-15 Koppeln an feste phasen von kohlenhydraten, die von lipopolysacchariden abgeleitet sind

Country Status (13)

Country Link
EP (1) EP1141718B1 (de)
JP (1) JP2002532719A (de)
CN (1) CN1335936A (de)
AT (1) ATE300048T1 (de)
AU (1) AU1650100A (de)
BR (1) BR9916330A (de)
CA (1) CA2355292C (de)
DE (1) DE69926261T2 (de)
HK (1) HK1043622A1 (de)
IL (1) IL143746A0 (de)
MX (1) MXPA01006106A (de)
NZ (1) NZ512295A (de)
WO (1) WO2000036419A1 (de)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2001277635A1 (en) * 2000-03-14 2001-10-08 Exiqon A/S New methods for separation and isolation of subpopulations of cells in biological samples
ES2284681T3 (es) * 2000-08-25 2007-11-16 Aventis Pasteur Limited Epitopos de oligosacaridos del nucleo de lipopolisacaridos de maemophilus influenzae como vacunas para la prevencion de infecciones por haemophilus influenzae.
FR2825095B1 (fr) * 2001-05-28 2003-09-26 Dev Des Antigenes Combinatoire Dispositif de presentation de polypeptides, utilisable comme "puce" pour la detection miniaturisee de molecules
CA2565247C (en) * 2004-05-14 2014-03-25 National Research Council Canada Conserved inner core lipopolysaccharide epitopes as multi-species vaccine candidates
EP1715344A1 (de) * 2005-04-22 2006-10-25 Universiteit Utrecht Holding B.V. Immobilisierung der Antigenkohlenhydrate, zum der pathogenen Mikroorganismen zu ermitteln
JP4791866B2 (ja) * 2006-03-24 2011-10-12 国立大学法人秋田大学 下痢原性大腸菌感染症の判別に用いられる固相等
US8795680B2 (en) * 2006-07-21 2014-08-05 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods for conjugation of oligosaccharides or polysaccharides to protein carriers through oxime linkages via 3-deoxy-D-manno-octulsonic acid
PL217758B1 (pl) 2008-09-29 2014-08-29 Inst Immunologii I Terapii Doświadczalnej Pan Sposób otrzymywania złoża do chromatografii powinowactwa i zastosowanie otrzymanego tym sposobem złoża
KR101150749B1 (ko) 2009-11-18 2012-06-08 주식회사 한국감염관리본부 탈부착이 용이한 감염성 병원균 검출용 카드형 플레이트
WO2013060335A1 (en) 2011-10-24 2013-05-02 Danmarks Tekniske Universitet Improved coupling of bacterial polysaccharides to macromolecules and solid supports
WO2013115897A2 (en) * 2011-11-16 2013-08-08 Ues, Inc. Pathogen detection using metal enhanced fluorescence
EP2617833A1 (de) * 2012-01-18 2013-07-24 Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) Verfahren zum spezifischen Nachweisen von lebenden Bakterien

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1204667A (en) * 1982-10-04 1986-05-20 Masashi Kodama Blood treating material
JPH04126073A (ja) * 1990-09-14 1992-04-27 Bio Material Kenkyusho:Kk キラー細胞の誘導方法
US5610075A (en) * 1995-01-17 1997-03-11 Stahl-Rees; Marianne Competitive electrochemiluminescence assays for endotoxins using a ruthenium label
US6033784A (en) * 1995-04-07 2000-03-07 Jacobsen; Mogens Havsteen Method of photochemical immobilization of ligands using quinones
DE19621488C2 (de) * 1996-05-29 1998-05-14 Gerlach Gerald F Prof Dr Diagnostisches Verfahren zur Erkennung subklinisch an Paratuberkulose erkrankter Säuger

Also Published As

Publication number Publication date
CA2355292A1 (en) 2000-06-22
DE69926261D1 (de) 2005-08-25
JP2002532719A (ja) 2002-10-02
MXPA01006106A (es) 2003-07-21
BR9916330A (pt) 2001-09-11
HK1043622A1 (zh) 2002-09-20
EP1141718A1 (de) 2001-10-10
WO2000036419A1 (en) 2000-06-22
ATE300048T1 (de) 2005-08-15
EP1141718B1 (de) 2005-07-20
AU1650100A (en) 2000-07-03
IL143746A0 (en) 2002-04-21
CN1335936A (zh) 2002-02-13
NZ512295A (en) 2003-07-25
CA2355292C (en) 2007-02-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69926261T2 (de) Koppeln an feste phasen von kohlenhydraten, die von lipopolysacchariden abgeleitet sind
EP0788605B1 (de) Nachweiss von antikörper gegen bakterielle antigene durch fluoreszenz-polarisation
US4238473A (en) Artificial oligosaccharide antigenic determinants
US4762824A (en) Compositions and methods useful for uropathogenic bacterial identification or diagnosis and inhibition of adherence of uropathogenic bacteria to cells having a structural element similar to that of the active principle of the invention
US4868289A (en) Glycosidic derivatives
DE2808539A1 (de) Reaktionsfaehige derivate von hs-gruppen enthaltenden polymeren
DMIITRIEV et al. Somatic Antigens of Pseudomonas aeruginosa: The Structure of the Polysaccharide Chain of Ps. aeruginosa O‐Serogroup 7 (Lanyi) Lipopolysaccharide
US6881549B2 (en) Method for introduction of reporter groups into bacterial lipopolysaccharide-derived carbohydrates and the subsequent coupling of such derivatives onto solid surfaces
Jauho et al. New technology for regiospecific covalent coupling of polysaccharide antigens in ELISA for serological detection
Lindahl et al. Binding of K99 fimbriae of enterotoxigenic Escherichia coli to pig small intestinal mucin glycopeptides
DE69713514T2 (de) Festphasenträgeroberfläche die toxin-bindende oligosaccharide enthalten
CN111467368A (zh) 含庚糖链的寡糖化合物在制备幽门螺旋杆菌疫苗中的应用
Grossman et al. Salmonella O antigen-specific oligosaccharide-octyl conjugates activate complement via the alternative pathway at different rates depending on the structure of the O antigen
Subramani et al. Demystifying a hexuronic acid ligand that recognizes Toxoplasma gondii and blocks its invasion into host cells
DE4425098A1 (de) 7-0-Carbamoyl-Heptose-Derivate, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung sowie Screening-Verfahren zu deren Bestimmung
Pallarola et al. An efficient method for conjugation of a lipopolysaccharide from Salmonella enterica sv. Minnesota with probes bearing hydrazine or amino functional groups
EP0051593A1 (de) Isolierung von kohlehydraten aus zellgeweben
Dutta et al. Chemical Synthesis of the Pentasaccharide Related to the Exopolysaccharide of Aeromonas veronii bv. Sobria Strain K49
US20230304998A1 (en) Cellular material detection probes
DE4018523A1 (de) Verfahren zur aktivierung von polystyrenfestkoerperoberflaechen
Beckmann et al. Immunochemical investigations of antigens isolated from Bacteroides ovatus strain ATCC 8483
DE69822190T2 (de) Sucrose-detektion durch enzymgebundene immunoassays (elisa)
CA1214101A (en) Preparation to be used in diagnosis of chlamydial infections
DE2421789C3 (de) Biologisch aktive Produkte und Verfahren zu ihrer Herstellung
CN116920084A (zh) 一种与载体蛋白质共价结合的多组分壁磷壁酸多糖的缀合物

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition