MXPA01006106A

MXPA01006106A - Acoplamiento de carbohidratos derivados de lipopolisacaridos en superficies solidas.

Info

Publication number: MXPA01006106A
Application number: MXPA01006106A
Authority: MX
Inventors: Havsteen Jakobsen Mogens
Original assignee: Exiqon As
Priority date: 1998-12-15
Filing date: 1999-12-15
Publication date: 2003-07-21
Also published as: HK1043622A1; EP1141718B1; CN1335936A; EP1141718A1; AU1650100A; ATE300048T1; BR9916330A; DE69926261T2; CA2355292A1; WO2000036419A1; NZ512295A; JP2002532719A; IL143746A0; DE69926261D1; CA2355292C

Abstract

La presente invención proporciona un método para inmovilizar un polisacárido (PS) a una superficie sólida, teniendo dicho polisacárido un grupo ceto-carboxi (-C(=O)-COOH) o un grupo cetal o hemicetal correspondiente al mismo, por ejemplo, derivados de KDO (ácido 2-ceto-3-desoxi-D-monooctónico), comprendiendo dicho método los pasos de:(a) formar un enlace covalente entre el grupo carboxi del polisacárido y una molécula reportadora (RM), comprendiendo un sitio de reconocimiento/substrato, (por ejemplo, biotina o una antraquinona);(b) inmovilizándolo para propósitos de diagnóstico, por ejemplo, para la detección de infecciones bacteriales provenientes de la bacteria Gram-negati

Description

ACOPLAMIENTO DE CARBOHIDRATOS DERIVADOS DE LIPOPOLISACÁRIDOS EN SUPERFICIES SÓLIDAS Campo de la Invención La presente invención se refiere a un método para inmovilizar clases especiales de polisacáridas para superficies sólidas. Dicho método es altamente valioso en la construcción de ensayos confiables para la detección de un anticuerpo correspondiente al antígeno polisacárido. La presente invención , también se refiere a superficies sólidas modificadas y al uso de dichas superficies en diversos ensayos de diagnóstico. Adicionalmente, la presente invención se refiere a derivados KDO nuevos los cuales son intermedios valiosos en la construcción de dichas superficies sólidas modificadas. Antecedentes de la Invención Los lipopolisacáridos bacteriales (LPSs) son constituyentes característicos de la membrana exterior de la bacteria Gram-negativa. Los LPSs son ampliamente utilizados como antígenos en ensayos de d iagnóstico especialmente diseñados para la detección específica de anticuerpos en suero, plasma, jugo gástrico, saliva u otros fluidos corporales, que se originan a partir de infecciones bacteriales en humanos y animales. Los LPSs son altamente inmunogénicos y comprenden una de las características epítopes para un estiramiento bacteriano determinado. De hecho, la definición de un serotipo a menudo está basada en la antigenicidad LPS y/o del polisacárido capsular (CPS). La especificidad antígénica de la molécula LPS reside en la parte de polisacárido del LPS, el antígeno-O, mientras que la toxicidad del LPS se origina por residuos contenidos en la parte lípida del LPS, denominada el lípido A. Los LPSs son compuestos altamente amfífílicos debido a la presencia de unión de un grupo O-polisacárido hidrofílico y un grupo lípido hidrofóbico en la molécula LPS. La mayor parte de los LPSs caracterizados tienen la misma estructura principal, la cual se conserva de manera especial en el lípido A y en las partes del núcleo interno de los LPSs. El núcleo es la parte del polisacárido que comprende el enlace entre el antígeno-O y el lípido A. Este enlace está comprendido de manera invariable de un enlace quetosídico entre la función hemicetal de la parte más interna del residuo KDO y un grupo hidroxilo de un residuo GIcNAc del lípido A. El antígeno-O de un serotipo bacteriano específico varía con respecto al número de unidades de repetición y puede contener substituciones no-estoquiométricas con acetilo, fosfato, glicosilo y otros grupos. Generalmente, las moléculas LPS sin antígenos-O, esto es que llevan únicamente (partes de) los sacáridos del núcleo en adición al lípido A, son denominados LPS "ásperos", mientras que las moléculas LPS que llevan antígenos-O son denominados "suaves" (Raetz, C. R. H. en Esquerichia cotí y Salmonefla: Biología Celular y Molecular (Escherichia coli and Saimonella: Cellular and Molecular Biology) (Neidhardt, F. C. E. A., ed.) Vol. 1, 2a Ed., páginas 1035 a 1063, Sociedad Americana para Microbiología, Washington, D.C., 1996; Hitchcock et al, 1986, J. Bacteriol. 166, páginas 699 a 705). El ensayo inmunosorbente enlazado por enzima, ELISA, este es un método bien conocido para la detección de anticuerpos. En este ensayo, i los LPSs están cubiertos (o inmovilizados) en una superficie sólida (por ejemplo, una superficie de plástico) mediante adsorbción pasiva, en donde sirven como muestras para anticuerpos específicos. El método consiste de la incubación de la superficie cubierta por LPS siendo probada la presencia de anticuerpos en la muestra biológica, seguida de la incubación del complejo del anticuerpo LPS con un anticuerpo secundario etiq uetado. Anteriormente, los LPSs han sido generalmente inmovilizados en una superficie sólida sin modificación alguna de las moléculas, ya que la parte del lípido A hidrofóbico de las moléculas funciona como un "ancla" bastante eficiente que enlaza los LPSs a la superficie a través de interacciones hidrofóbicas no covalentes que dejan los polisacáridos-0 hidrofílicos apuntando hacia afuera quedando accesibles para las interacciones con componentes de enlace, por ejemplo, anticuerpos. Sin embargo, se ha mostrado que la eficiencia mediante la cual los LPS son inmovilizados en superficies hidrofóbicas depende tanto de la naturaleza de la superficie como del equilibrio entre los LPSs libres y las micelas LPS formadas. El equilibrio entre los LPSs libres y las micelas LPS formadas depende de la naturaleza amfifílica de los LPSs y varían entre LPSs de diferentes estiramientos de bacteria, así como entre diferentes serotipos LPS. Ciertos tipos de LPSs han mostrado ser muy difíciles de inmovilizar en superficies sólidas mediante enlaces no covalentes sin la adición de diversos agentes de dispersión de micelas (detergentes) para la solución de recubrimiento.

Por lo tanto, las condiciones de recubrimiento óptimas varían entre LPS de diferentes estiramientos de bacteria, así como entre serotipos de la misma bacteria, haciendo muy difícil la inmovilización simultánea de dos o más LPSs diferentes en la misma superficie. Esto se prevé debido a la capacidad de un tipo de LPS de buen recubrimiento para competir con el tipo de recubrimiento menos bueno. Este fenómeno se ilustró con Salmonella Infantis LPS, la cual mostró recubrir de manera ineficiente el plástico. En un ensayo para la detección de anticuerpos específicos de Salmonella Typhimurium y Salmonella Infantis, éste condujo a la substitución de Salmonella Infantis LPS con Salmonella Choleraesuis LPS la cual fue descubierta para recubrir mucho mejor y la cual porta los mismos serotipos antigénicos (antígenos-O) (Nielsen, B., et al, 1995, Vet. Microbiol.47, páginas 205 a 218). La tendencia del LPS para formar micelas (su agregado), se considera adicionalmente para reducir la estabilidad del recubrimiento de LPS como las interacciones entre el LPS bimolecular (su agregado o grupo) y la superficie se considera más débil después de las interacciones entre una sola molécula de LPS y la superficie. En otras palabras, la tendencia potencial del LPS para recubrir en grupos, puede conducir a una estabilidad de recubrimiento disminuida y no predecible y a reducir la estabilidad a largo plazo del recubrimiento. La Patente EP 0 101 119, describe la inmovilización de un lipopolisacárido para un portador insoluble mediante la condensación del lipopolisacárido y un grupo ya sea amino o carboxilo del portador insoluble.

La Patente JP-A-2-242448 (Resumen de Patente de Japón), describe la inmovilización de un glicósido de lípido A de ácido 3-deoxi-D-mano-2-octurosónico a la superficie de un portador insoluble a través de un enlace de amida. Los antígenos altamente hidrofílicos como por ejemplo, el polisacárido bacteriano (PS) a menudo son muy difíciles de adsorber (inmovilizar) en las superficies más comúnmente utilizadas, utilizadas en ensayos serológicos, tales como plásticos utilizados en ELISA y RIA (ensayo radioinmunológico), partículas de látex utilizadas en técnicas de aglutinación y PVDF (polivinilidenodifluoruro), así como nitrocelulosa y otros materiales utilizados para el método dip-stick, de manchado u otros ensayos rápidos. Por lo tanto, el PS recubre de manera ineficiente y demanda el uso de grandes cantidades de antígeno de polisacárido o extremos de pH y pueden no ser utilizados con mezclas de polisacáridos (Elkins et al, 1990, J. Inmunol. Met. 130, páginas 123 a 131). Por el contrario, a pesar de los inconvenientes antes mencionados, los LPSs se utilizan casi de manera exclusiva como antígenos de recubrimiento y el lípido A proporciona la hidrofobicidad requerida necesaria para el recubrimiento adecuado de las superficies sin antígeno. Los PSs han sido previamente aislados de los LPSs con el propósito de preparar conjugados de PS y substancias transportadoras, más a menudo proteínas portadoras para propósitos de vacunas (Aron et al, 1993, J. Clin. Microbiol. 31, páginas 975 a 978; Lambden y Heckels, 1982, J. Inmunol. Met. 48, páginas 233 a 240; Gupta et al, 1995, Inf. Inmun. 63, páginas 2805 a 2810).

Anteriormente, se ha mostrado que la parte de polisacárido del lipopolisacárido Salmonella Typhimurium (LPS), podría ser derivatizada con biotina e inmovilizada en una placa ELISA recubierta con estreptavidin, en donde éste podría ser reconocido mediante anticuerpos contra PS. Al utilizar el derivado de hidrazida de biotina, fue posible hacer reaccionar el PS directamente con biotin-hidrazida sin un paso de oxidación previo; la hidrazida mostró reaccionar con el hemicetal del extremo de reducción KDO del PS. Este procedimiento condujo a derivados PS biotinados antigénicamente intactos, sin embargo dio como resultado derivados que no fueron estables, y se tuvo que introducir en el ensayo un recubrimiento de avidin o estreptavidin (Wiuff, C, Lind, P., Heegaard, P., 1997, Acoplamiento regioselectivo de carbohidratos de reducción para hidrazidas para derivatización de polisacáridos bacterianos y aplicación a inmunoensayos (Regioselective coupling of reducing carbohydrates to hydrazides for derivatizatíon of bacterial polysaccharides and application to immunoassays), Proc. 2a. Comité de Ingeniería de Carbohidratos, La Rochelle, Francia, página 66). En Meikle et al (Glicoconjugado J. 7, páginas 207 a 218, 1990), se utiliza un PS en un ensayo de ELISA acoplando directamente el PS a una enzima de detección en una preparación competitiva. El acoplamiento fue llevado a cabo mediante aminación reductiva de la funcionalidad ceto del grupo ceto-carboxi de una unidad KDO del PS. No se utilizó el conjugado PS/enzima de detección para recubrimiento, sino que se utilizó en una solución en un paso posterior en el ensayo.

Generalmente, el enlace de PS a superficies sólidas requiere de modificaciones de la molécula PS, aunque en dicha forma la parte del antígeno-0 permanece sin alteración . Se ha descrito un número de dichas modificaciones para polisacáridos q ue surgen de manera natural. U n ejemplo bien conocido es el acoplamiento de polisacáridos capsulares (CPSs) , los cuales no contienen partes hidrofóbicas (o grupos), para proteínas (Laferriére et al, 1997, Vacuna 1 5, páginas 179 a 186; Beuvery et al, 1 986, Estándar de Desarrollo de Biolog ía 63, páginas 1 17 a 1 28). Posteriormente, los complejos de proteína de polisacárido capsular resultante son adsorbidos a las superficies a través de grupos hidrofóbicos en la proteína transportadora. Los polisacáridos capsulares bacterianos también han sido modificados mediante reacción no regioselectiva de grupos hidroxilo con grupos hidrofóbicos, por ejemplo, fenilo o triamina para aumentar la hidrofobicidad total de las moléculas CPS, y existentes mediante las capacidades de enlace a superficies sólidas (Kristensen y Bentzon, 1992, APMIS 100, páginas 142 a 146) . Un problema importante es que puede ser difícil retener la antigenicidad después de la derivatización del polisacárido, ya que la mayoría de los métodos no están dirigidos a la derivatización de cualquier región específica del antígeno de polisacárido, destruyendo o modificando posiblemente de esta manera los epítopes antigénicos del polisacárido. Esto ha sido superado con la presente invención , al restringir la derivatización a ciertas regiones del carbohidrato. Breve Descripción de las Figuras Figura 1: Estructura molecular esquemática de E. Coli K12 LPS. Abreviaturas: GlcN, D-glucosamina; Kdo, ácido 3-deoxi-D-mano-octulosónico; Hep, L-glicero-D-mano-heptosa; Glc, D-glucosa; Gal, D-galactosa; GIcNAc, N-acetil-D-glucosamina; Rha, L-rhamnosa; Galf, D-galactofuranosa; P, fosfato; P-Etn, fosfoetanolamina; P-P-Etn, pirofosfato etanolamina; Ac, acetato. Figura 2: Muestra el núcleo interno de la parte del lípido A del LPS procedente de una bacteria Gram-negativa típica. Figura 3: Perfil espectroscópico UV de LPS procedente de Salmonella Typhimurium. Figura 4: Perfil espectroscópico UV de LPS procedente de Salmonella Choleraesuis. Figura 5: Izquierda: Gel de poliacrilamida teñido con plata de LPS purificado procedente de Salmonella Typhimurium. Carril 1: Marcador de bajo peso molecular (BioRad); 2: Vacío; 3: 4 µg LPS; 4: 8 µg LPS; 5: 12 µg LPS; 6: 16 g LPS; 7: 20 g LPS; 8: 24 µg LPS; 9: Vacío. Derecha: Gel de poliacrilamida teñido con Coomassie de LPS procedente de Salmonella Typhimurium. Muestras aplicadas como se describió anteriormente. Figura 6: Izquierda: Gel de poliacrilamida teñido con plata de LPS purificado procedente de Salmonella Choleraesuis. Carril 1: Vacío; 2: Marcador de bajo peso molecular (BioRad); 3: Vacío; 4: 6 µg LPS; 5: 12 µg LPS; 6: 18 µg LPS; 7: 24 µg LPS; 8: 30 µg LPS; 9: 36 µg LPS; 10: Vacío. Derecha: Gel de poliacrilamida teñido con Coomassie de LPS procedente de Salmonella Choleraesuis. Muestras aplicadas tal como se describió anteriormente.

Figura 7: Ensayo de ELISA indirecto de LPS y de PS procedente de Salmonella Typhimurium. Los antígenos fueron recubiertos en una fila de titulación de 2 dobleces comenzando a partir de 0.4 µg/mL. Se utilizó suero de cerdo de Salmonella Typhimurium positiva diluido en 1/400 como anticuerpo. (Las muestras aparecen en el orden de (OD superior en primero "1"): LPS E-01, LPS E-02, PS E-02, PS E-01). Figura 8: Ensayo de ELISA indirecto de LPS y de PS procedente de Salmonella Choleraesuis. Los antígenos fueron recubiertos en una fila de titulación de 2 dobleces comenzando a partir de 0.6 µg/mL. Se utilizó suero de cerdo de Salmonella Infantis positiva diluido en 1/600 como anticuerpo. (Las muestras aparecen en el orden de (OD superior en primero "1"): LPS E-06, LPS E-08, PS E-08, PS E-06). Figura 9: Gel de poliacrilamida teñido con plata de PS purificado procedente de Salmonella Choleraesuis. 1-5: Varios lotes de PS. Se aplicó 1.5 g. Figura 10: Perfil espectroscópico UV de AQ-PS procedente de Salmonella Typhimurium. Figura 11: Perfil espectroscópico UV de AQ-PS procedente de Salmonella Choleraesuis. Figura 12: Gel de poliacrilamida teñido con plata de AQ-PS procedente de Salmonella Choleraesuis. 1-2: Dos diferentes lotes de AQ-PS. Se aplicó 1.5 µg. Figura 13. Ensayo de ELISA competitivo de Salmonella Typhimurium PS de 2 dobleces titulados en una placa recubierta con LPS de Salmonella Typhimurium, comparado con la competición con Salmonella Typhimurium LPS intacta. Ambos antígenos competitivos fueron titulados a partir de 5 mg/mL. Las placas fueron recubiertas con Salmonella Typhimurium LPS en 0.05 µ9/???. Se utilizó suero de cerdo de Salmonella Typhimurium positivo como anticuerpo a 1/400. (Curva superior: LPS, Curva inferior: PS). Figura 14. Ensayo de ELISA competitivo de Salmonella Choleraesuis PS de 2 dobleces titulada en placa recubierta con LPS de Salmonella Choleraesuis, comparada con la competición con Salmonella Choleraesuis LPS intacta. Ambos antígenos competitivos fueron titulados a partir de 5 mg/mL. Las placas fueron recubiertas con Salmonella Choleraesuis LPS en 0.5 µ9/???. Se utilizó suero de cerdo de Salmonella Choleraesuis positiva como anticuerpo en 1/600. (Curva más lisa (y OD superior en 1 y 2): PS). Figura 15: Efecto de concentración AQ-PS (Salmonella Typhimurium) en eficiencia de fotoacoplamiento. Figura 16: Efecto de concentración AQ-PS (Salmonella Choleraesuis) en eficiencia de fotoacoplamiento. Figura 17: Efecto de sales inorgánicas y pH en eficiencia de fotoacoplamiento de AQ-PS (Salmonella Typhimurium). Figura 18: Efecto de sales inorgánicas y pH en eficiencia de fotoacoplamiento de AQ-PS (Salmonella Choleraesuis). Figura 19: Efecto de tiempo de irradiación de AQ-PS (Salmonella Typhimurium) y de AQ-PS (Salmonella Choleraesuis) en eficiencia de fotoacoplamiento.

Figura 20: Prueba serológica (Ensayo de ELISA indirecto) de suero de cerdo en AQ-PS (Salmonella Typhimurium) fotoacoplado. Suero de 1 a 5: suero sin historia alguna de Salmonella (negativo). Suero de 6 a 15: suero procedente de cerdos infectados en forma experimental con Salmonella Typhimurium (positivo). Figura 21: Ensayo de ELISA en mezcla fotoacoplada de AQ-PS procedente de Salmonella Typhimurium y Salmonella Choleraesuis. Muestras 1 a 10: Suero de control negativo. Muestras: 11 a 20: Suero positivo procedente de cerdos infectados en forma experimental con Salmonella Typhimurium. Figura 22: Estabilidad de almacenamiento de AQ-PS mezclado fotoacoplado (Salmonella Typhimurium y Salmonella Choleraesuis). Suero: Blanco: suero sin historia alguna de Salmonella (negativo); Rojo, Rosa, Café, Verde: suero procedente de cerdos infectados en forma experimental con Salmonella Typhimurium (positivo); Amarillo, Azul: suero procedente de cerdos infectados en forma experimental con Salmonella Inf antis (positivo). Figura 23: Ensayo de ELISA indirecto de PS y conjugados de biotina-PS (Salmonella Typhimurium) en placas recubiertas con estreptavidin. (Columnas de la izquierda: Biotina-PS; Columnas de la derecha: PS). Figura 24: titulación de dos dobleces del conjugado APP5b PS-AQ, partiendo de 500 ng PS-AQ por depósito. La placa fue incubada con suero de cerdo APP5b positivo y un suero negativo (suero SPF) diluido a 1:400 en PBST.

Breve Descripción de la Invención La presente invención proporciona métodos nuevos para inmovilizar un polisacárido para una superficie sólida . Por lo tanto, la presente invención proporciona un método para inmovilizar un polisacárido (PS) para una superficie sólida, teniendo dicho polisacárido u n grupo ceto-carboxi (-C(=0)-COOH) o un grupo cetal o hemicetal correspondiente al mismo), en donde el método comprende los pasos de: a) formar un enlace covalente entre el grupo carboxi del polisacárido y una molécula reportadora (RM) formando de este modo un conjugado de molécula reportadora-polisacárido (PS- RM), comprendiendo dicha molécula reportadora un sitio de reconocimiento/substrato; y b) inmovilizar el conjugado de molécula reportadora-polisacárido (PS-RM), formando un enlace específico entre el sitio de reconocimiento/substrato de dicha molécula reportadora y un sitio de recepción/reactivo de la superficie sólida . La presente invención también proporciona una superficie sólida que se puede obtener de este modo, y el uso de dichas superficies sólidas para propósitos de diagnóstico. Adicionalmente, la presente invención proporciona un compuesto de la fórmula general I (o, en el caso en donde R2 es hidrógeno, opcionalmente el análogo ceto del mismo) en donde: R es seleccionado de hidrógeno y una molécula reportadora L-R, en donde L es una parte enlazadora opcional de la molécula reportadora, y R es una parte de reporte de la molécula reportadora; RN es seleccionado de hidrógeno y alquilo de C1 - ; F es seleccionado de un solo enlace, fenileno, carbonilo (C(=0)), carbonilimino (C(=0)-NH-) , tiocarbonilo ((C(=S)) e ¡mino (-N H-); R2, R7, RB son cada uno seleccionados de manera independiente de hid rógeno y grupos de protección hidroxi; R4 es seleccionado de hidrógeno, un residuo mono- o disacárido y un grupo de protección hidroxi; y R5 es seleccionado de hidrógeno, un "residuo de polísacárido protegido opcionalmente por un g rupo fu ncional" y un grupo de protección hidroxi, y un método de preparación del mismo. Por lo tanto, es un objeto especial de la presente invención proporcionar un método para el acoplamiento regioselectivo de polisacaridos bacteriales derivados de LPS para superficies sólidas, siendo genérico dicho método para todos los tipos de dichos polisacáridos bacteriales derivados de LPS, no teniendo influencia de manera adicional dicho método en la estructura antigénica del polísacárido y finalmente, no agregando componentes al soporte no específico o reactividad transversal no deseada cuando se utilice el polísacárido inmovilizado en un ensayo.

Descripción Detallada de la I nvención Tal como se mencionó anteriormente, la presente invención se refiere a un método para inmovilizar un polisacárido (PS) para una superficie sólida. En el contexto de la presente invención , el término "polisacárido" significa una entidad que comprende dos o más unidades de monosacárido enlazadas por glicosida. Preferentemente, el "polisacárido" comprende por lo menos 5, por ejemplo de 5 a 1 000, unidades de monosacárido enlazadas, tal como por lo menos 1 0, por ejemplo de 10 a 1 000, unidades de monosacárido enlazadas, en particular por lo menos 25, por ejemplo de 25 a 500, unidades de monosacárido enlazadas. El polisacárido puede ser enlazado para formar un polisacárido lineal o ramificado. Los monosacáridos individuales normalmente son monosacáridos que surgen de manera natural conocidos para los expertos en la materia, como constituyentes en los polisacáridos de origen natural. Los ejemplos de dichos monosacáridos son ribosa, deoxiribosa, arabinosa, xilosa, apiosa, fucosa, rhamnosa, fructosa, glucosa, mañosa, galactosa, glucosamina, ácido murámico, galactosamina, ácido glucorónico, ácido idurónico, ácido manurónico, ácido gulurónico, ácido galactorónico, glicero-mano-heptosa, ácido 3-deoxi-mano-octulosónico, ácido neu ram ínico (ácido 5-amino-3,5-dideoxi-D-glicero-D-galacto-nonulosónico), abecuosa, N-acetil-galactosamina , y N-acetil-galactofuranosa. Los ejemplos de particular interés son D-ribosa, D-deoxiribosa, D-arabinosa, D-xilosa, D-apiosa, L-fucosa, L-rhamnosa, D- fructosa, D-glucosa, D-manosa, D-galactosa , L-galactosa, D-glucosamina, ácido m urámico, D-galactosamina, ácido D-glucorón ico, ácido L-idurónico, ácido D-manurónico, ácido L-gulurón¡co, ácido D-galactorónico, L-glicero-D-mano-heptosa, ácido 3-deoxi-D-mano-octulosónico (KDO), ácido neuramínico (ácido 5-amino-3,5-dideoxi-D-glicero-D-galacto-nonulosónico), abecuosa, N-acetil-D-galactosamina, y N-acetil-D-galactofuranosa. Los ejemplos de mayor interés son D-glucosamina, KDO, L-glicero-D-mano-heptosa, D-glucosa, D-galactosa, N-acetil-D-glucosamina, L-rhamnosa, y D-galactofuranosa. El polisacárido puede ser esencialmente no substituido aunque debido al origen biológico típico del polisacárido, éste normalmente es no substituido en forma estequiométrica con acetilo, fosfato, pirofosfato, fosfoetanolamina, pirofosfato etanolamina , metil-O, sulfato, u otros grupos. El peso molecular del polisacárido (incluyendo cualesquiera substituyentes), preferentemente es de por lo menos 1 ,000, por ejemplo dentro del rango de 1 ,000 a 200,000, en particular por lo menos 2,000, por ejemplo dentro del rango de 2,000 a 200,000, especialmente por lo menos 5,000. Los lipopolisacáridos bacteriales que surgen de manera natural normalmente están presentes como una mezcla de moléculas que difieren en el número de unidades de repetición y, de manera consecuente, en peso molecular como se ha mostrado en forma repetida con lipopolisacáridos en algunos estiramientos bacteriales que consisten de moléculas con desde 0 hasta 40 unidades de repetición , cubriendo los pesos moleculares desde debajo de 10 hasta arriba de 100 kD (Goldman y Leive, 1980, Eur. J. Bioquim. 107, páginas 145 a 153). (Una unidad de repetición es el mono-sacárido o más comúnmente el oligosacárido siendo repetido en el polisacárido-0 (ver por ejemplo Figura 1). Los ejemplos de dichas unidades de repetición de oligosacárido de interés incluyen la unidad de repetición de tetrasacárido de Salmonella Typhimurium y la unidad de pentasacárido acetilada de Escherichia coli K12 (Raetz 1996)). Comúnmente, los pesos moleculares de LPS derivados de polisacáridos pueden estar dentro del rango de 2 a 50 kD, correspondientes a desde 0 a 40 unidades de repetición, a menudo con una distribución bimodal con una sobrerrepresentación de moléculas con cero y una unidad de repetición y de moléculas con de 25 a 35 unidades de repetición, respectivamente (Raetz 1996). A menudo es conveniente retener la distribución del peso molecular del LPS natural, con el objeto de reflejar la antigenicidad exacta de los antígenos-0 intactos. Por lo tanto, debe quedar entendido que los rangos antes descritos para los números de unidades de monosacárido y pesos moleculares se relacionan con el número promedio de monosacáridos encontrados en los LPSs que surgen de manera natural. El polisacárido que será inmovilizado, comprende un grupo ceto-carboxi (-C(=0)-COOH) o un grupo cetal o hemicetal correspondiente al mismo), el cual es un punto de ancla crucial para el establecimiento del enlace a la superficie sólida. En muchos casos (y preferentemente), este grupo ceto-carboxi es proporcionado por una unidad de monosacárido KDO (ácido 2-ceto-3-deoxi-D-mano-octónico) incluida en el polisacárido.

Uno o más KDOs están presentes en el oligosacárido de núcleo interno de todos los lipopolisacáridos Gram-negativo conocidos como uno o más (normalmente 3; ver Figura 1) monosacáridos enlazados. Uno de estos KDOs comprenden el enlace glicosídico al dímero de hexosamina del lípido A y uno, siendo el mismo monosacárido KDO u otro monosacárido KDO comprende el enlace glicosídico para el extremo de reducción del resto de la parte de polisacárido del lipopolisacárido. La Figura 1, ilustra un lipopolisacárido bacterial Gram-negativo típico procedente de E. co//K-12 (de Raetz 1996). Los polisacáridos para los cuales la presente invención es aplicable de manera especial, son polisacáridos los cuales son substancialmente idénticos a la parte de carbohidrato de un lipopolisacárido bacterial Gram-negativo (LPS). Por la "parte de carbohidrato de un lipopolisacárido bacterial Gram-negativo", se entiende toda la cadena de polisacárido, o "árbol", del lipopolisacárido excepto los monosacáridos derivados con ácidos grasos en enlaces de éster y/o amidas que comprenden la parte del lípido A. Adicionalmente, la parte de carbohidrato no necesita comprender todas las unidades KDO de toda la cadena de polisacárido (ver más adelante). El término "substancialmente idénticos" también significa de manera preferente el polisacárido que tiene substancialmente la misma actividad de enlace biológico como la parte de carbohidrato del lipopolisacárido nativo. Esto significa que la parte del núcleo externo del antígeno-O (la parte específica del serotipo) del polisacárido es preferentemente substancialmente idéntica a la del lipopolisacárido bacterial nativo, mientras que algunos monosacáridos de núcleo interno (por ejemplo una o dos, pero no todas, las u nidades KDO) pueden haber sido disociadas en forma química cuando la parte de carbohidrato es disociada en forma química de la parte del lípido A, (ver Figura 2 para los posibles puntos de ataque de un lipopolisacárido (LPS) que conduce a un polisacárido (PS)). Es importante observar que la característica del polisacárido es que la especificidad del serotipo se conserva de manera substancial, por ejemplo, que la porción del antígeno-0 del lipopolisacárido nativo (LPS) no se afecta de manera substancial por la disociación. La parte del núcleo interno de un polisacárido de lipopolisacárido es definida como el KDO bien conservado y el oligosacárido de reducción que contiene heptosa de lipopolisacárido bacterial Gram-negativo, conteniendo dicho oligosacárido el enlace entre KDO y el lípido A. El lípido A es la parte bien conservada de los lipopolisacáridos bacteriales que comprenden ácidos g rasos enlazados a un dímero de hexosamina substituido, el cual, a su vez, es la u nidad enlazada al KDO de reducción del núcleo interno en un lipopolisacárido no modificado. Preferentemente, el polisacárido es obtenido (o por lo menos se puede obtener) mediante la hidrólisis selectiva del enlace de cetal entre la parte del núcleo interno y la parte del lípido A de un lipopolisacárido bacterial Gram-negatívo. Preferentemente, los substituyentes en el polisacárido como acetilo, fosfato, pírofosfato, fosfoetanolamina, pirofosfato de etanolamina, metil-O, sulfato, u otros grupos, no son disociados durante la hidrólisis selectiva.

La "hidrólisis selectiva" significa una hidrólisis transmitida en forma química o enzimática que disocia preferentemente un enlace de glicosida seleccionado, por ejemplo, en el contexto de la presente invención, el enlace entre la parte del lípido A y la parte KDO. No obstante que la presente invención es aplicable (y conveniente) para polisacáridos PS, (por ejemplo, polisacáridos sin una parte de lípido) derivados de lipopolisacáridos bacteriales Gram-negativo (LPS), debe quedar entendido que se considera realista y posible utilizar todo el lipopolisacárido completo (LPS) de la bacteria Gram-negativa en el método de acuerdo con la presente invención, con un resultado conveniente. Se considera que es posible debido al hecho de que el lipopolisacárido comprende el grupo ceto-carboxi necesario. Esto constituye una modalidad por separado de la presente invención. Por lo tanto, la presente invención también proporciona un método, en donde el polisacárido comprende adicionalmente la parte del lípido de un lipopolisacárido bacterial Gram-negativo, por ejemplo el "polisacárido" que constituye de este modo un lipopolisacárido bacterial. La bacteria de la cual son derivados los polisacáridos (y de este modo también los lipopolisacáridos), es preferentemente la bacteria Actinobacillus pleuropneumoniae -negativa, que son patógenos humanos o veterinarios tales como enterobacteria, bacteria respiratoria, bacteria urogenital, y bacteria neuropatogénica. Los ejemplos de bacterias que son especialmente aplicables para polisacáridos dentro de la presente invención, son seleccionados de la bacteria Gram-negativa humana que comprende Haemophilus sp, Echerichia coli ssp, Salmonella sp, Klebsiella sp, Bordetella sp, Pseudomonas sp, Chlamydia sp, Neisseria sp, Vibrio cholerae, Shigella sp, Proteus sp, Brucella sp, Streptobacillus sp, Yersinia sp, Legionella pneumophila, y Serrada marcescens, especialmente Haemophilus influenzae, Salmonella entérica ssp., Klebsiella pneumoniae, Bordetella pertussis, Pseudomonas aeruginosa, Chlamydia psitacci, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhea, Vibrio cholerae, Shigella flexneri, y Shigella dysenteriae, y bacteria veterina ria o zoonótica incluyendo enterobacteria seleccionada de Escherichia coli, Salmonella Typhimurium, Salmonella Choleraesuis, Salmonella entérica, y todos los serotipos de las mismas , especialmente Salmonella Typhimurium, Salmonella Enteritidis, Salmonella Choleraesuis, Salmonella Manhattan, Salmonella Dublin, Salmonella Inf antis, Escherichia coli spp. /'ncluyendo 01 57, enfermedad de oedema q ue ca usa Escherichia coli, Yersinia enterocolitica, y Campylobacter jejuni, así como bacteria respiratoria seleccionada del g rupo HAP de bacterias especialmente Actinobacillus sp, en particu lar la bacteria del gru po HAP Actinobacillus pleuropneumoniae, Haemophilus somnus, Pasteurella haemolytica, Pasteurella multocida, Haemophilus parasuis y Mannheimia sp. Aislamiento de LPS Los LPS generalmente son a islados de la bacteria Gram-negativa med iante estractación de fenol acuosa , seg u ida de varios pasos de pu rificación (Raetz 1 996) . Estos métodos en general pueden ser aplicados a todos los tipos de LPS bacterial. Asimismo , los LPSs están disponibles en el mercado.

Caracterización de LPS El LPS aislado puede estar caracterizado por un número de diferentes métodos, tal como se describe en la Sección de experimentos. Se puede utilizar SDS-PAGE (electroforesis de gel de poliacrilamida de sulfato dodecilo de sodio) para analizar la d istribución de peso molecular del LPS. Los LPSs tanto lisos como ásperos, incluyendo materiales disponibles en el mercado, pueden ser analizados a través de este método. También se puede utilizar espectrometría de masa, RM N , Ensayo de ELI SA indirecto (ver la Sección de experimentos) , espectrometría UV (ver la Sección de experimentos) , inmuno-manchado y otros métodos. Preparación de PS Es bien conocido que el antígeno-0 intacto puede ser aislado del LPS mediante la disociación del polisacárido-0 de la parte del lípido A. Esto se realiza de manera rutinaria mediante hidrólisis de ácido (por ejemplo 0.1 M de ácido acético a una temperatura de 90°C durante 1 hora) del enlace de glicosida de ácido lábil entre los extremos de reducción del KDO en el polisacárido-O, y el GIcNAc en la parte del lípido A de LPS, seguida de extracción acuosa de cloroformo/metanol para producir el polisacárido (PS) (Raetz 1 996) . El PS aislado contiene el antígeno-0 intacto (substancialmente) del LPS. La eliminación del lípido A del PS facilita la capacidad de acceso de los anticuerpos del antígeno-0 (Munford y Hall , 1 979, I nf. Inm . 26, páginas 42 a 48) , así como la disminución de endotoxicidad del antígeno-O aproximadamente 1 000 veces en forma relativa al LPS correspondiente (van de Wiel et al, 1 987, Vacuna 5, páginas 33 a 38). Además, los PSs son moléculas hidrofílicas puras, tienen baja toxicidad y son altamente solubles en soluciones acuosas y no muestran tendencia a formar micelas. Por lo tanto, los PSs son más fáciles de manipular que los LPSs.

Otros métodos que se pueden utilizar para obtener polisacáridos LPS deslipidados, incluyen hidrólisis alcalina mediante hidrazina o NaOH, liberando ácidos grasos esterificados además de fosfato y otros ésteres, aunque no ácidos grasos enlazados por amida (Gupta et al, 1995) y degradación transmitida por fago del polisacárido-0 del LPS o PS intacto en unidades de oligosacárido más pequeñas, sin retener el monosacárido KDO terminal (Svenson et al, 1979, J . Virol. 32, páginas 583 a 592). Además del método de extracción de fase empleado en los ejemplos, es bien sabido que el PS puede ser alterado a partir de hidrólisis de ácido mediante cromatografía de permeabilidad de gel (Lambden y Heckels, 1 982). Caracterización de PS El Ps aislado puede ser caracterizado por un n úmero de diferentes métodos tal como se describe en la Sección de experimentos. Se puede utilizar SDS-PAGE (electroforesis de gel de poliacrilamida de sulfato dodecilo de sodio) para analizar el LPS restante. Así mismo se puede utilizar espectrometría de masa, NMR, Ensayo de ELISA indirecto y competitivo (ver la Sección de experimentos), espectrometría UV (ver la Sección de experimentos), inmuno-manchado y otros métodos. Preparación de Conjugados del Grupo Reportero de Polisacárido Para obtener el mejor desempeño de un antígeno de polisacárido inmovilizado en un ensayo de diagnóstico u otras aplicaciones, es necesario inmovilizar el antígeno en una orientación bien definida sobre la superficie sólida . Dentro de la presente invención , esto requiere la formación regioespecífica de un enlace químicamente estable entre una molécu la reportadora y el antígeno polisacárido. Como se mencionó anteriormente, el método de la presente invención incluye el paso de formar un enlace covalente entre el grupo carboxi del polisacárido (PS) y una molécula reportadora (RM), formando de este modo un conjugado de molécula reportadora-polisacárido (PS-RM), en donde dicha molécula reportadora comprende un sitio de reconocimiento/substrato. El término "molécula reportadora" significa una entidad química que se utiliza para establecer el enlace específico entre el polisacárido y la superficie sólida. La molécula reportadora comprende por lo menos una parte reportera que incluye el sitio de reconocimiento/substrato, y opcionalmente una parte enlazadora . El conjugado de molécula reportadora-polisacárido (PS-RM) tiene preferentemente la fórmula general PS'-C(=0)-N(RN)-F-L-R, en donde PS'-C(=0) es el polisacárido, N(RN)-F es el grupo comprendido directamente en el enlace covalente entre el polisacárido y la molécula reportadora, RN designa el hidrógeno o alquilo de C1 -4, L es la parte enlazadora de la molécula reportadora , y R es la parte reportera de la molécula reportadora . En particular, -N-F- desig na amino (-N-) , anilino (-N-Ph), hidrazido (-N-C(=0)-), semicarbizido (-N-C(=0)-N H-) , tiosemicarbizido (-N-C(=S)-N H-) , o hidrazino (-N-NH-). Preferentemente, -N-F- es amino.

El término "alquilo de C 1. " pretende cubrir metilo, etilo, propilo (1 -propilo y 2-propilo) , ciclopropilo, butilo (1 -butilo, 2-butilo, 2-metil-prop-1 -ilo y 2-metil-prop-2-ilo (tert-butilo)) . Más adelante se describen de manera general varios tipos de partes reporteras bajo "Inmovilización de conjugados de molécula reportadora-polisacárido". Los ejemplos de partes reporteras son grupos fotoquímicamente reactivos, tales como coumarins substituidos, benzofuranos, Índoles, angelicinas, psoralenos, carbeno y precursores de nitreno, cetonas, y quinonas, por ejemplo antraquinonas (AQ), fenantraquinonas y benzoquinononas; los grupos termoquímicamente reactivos tales como ácidos carboxílicos, aminas primarias, aminas secundarias, hidrazidas de ácido, semicarbizidas, tiosemicarbizidas, tioles, hidrazinas alifáticas, hidrazinas aromáticas , expóxidos y maleimidas; y una parte de un par de afinidad (preferentemente teniendo la parte el peso molecular más bajo, por ejemplo, un peso molecular de hasta 7,000) , tal como una parte de biotin/avidin , biotin/estréptavidin, biotin/NeutrAvidin™, glutationa/glutationa-S-transferasa, complejo de metal de ácido iminodiacético/péptidos y proteínas etiquetados hexa/histidina , complejo de metal de ácido nitrilotriacético/proteínas y péptidos etiquetados hexa-h istidina, LNA/LNA, LNA/ADN , LNA/ARN, ADN/ADN, ADN/ARN , ARN/ARN, PNA/ARN, PNA/ADN y anticuerpos mono- o policlonales que surgen contra un hapten/hapten específico. Preferentemente, la parte reportera comprende una biotina (una parte de un par de afinidad) o una antraquinona .

La molécula reportadora también puede incluir una parte enlazadora adecuada (L) además de una parte reportera. Dicho enlazador puede ser útil para proporcionar una suficiente flexibilidad/movilidad del polisacárido inmovilizado. La parte enlazadora opcional entre la molécula reportadora y el polisacárido, puede ser utilizada para diferentes propósitos. La parte enlazadora puede ser utilizada para distanciar el grupo reportero del polisacárido, mejorando de este modo el subsecuente paso de inmovilización. Al mismo tiempo, el distanciamiento también mejora la presentación de los epítopes del polisacárido mejorando un ensayo de diagnóstico u otras aplicaciones basadas en el polisacárido inmovilizado. Los enlazadores apropiados también pueden proporcionar porciones cargadas, no cargadas, hidrof ílicas o hidrofóbicas según se desee, para influenciar, por ejemplo, la solubilidad de la molécula espadadora del grupo reportero durante la conjugación del polisacárido, así como las propiedades de la aplicación final del polisacárido inmovilizado. Por lo tanto, el diseño del conjugado apropiado y los protocolos de conjugación optimizados son elementos clave en la capacidad de producir conjugados óptimos del grupo reportero del polisacárido para la subsecuente inmovilización a las superficies sólidas. Los ejemplos de partes enlazadoras son birradicales seleccionados de alquileno de Ci.2o que comprende opcionalmente hidrocarburos aromáticos o mono-/poliinsaturados o hidrocarburos cíclicos, oligo-oxietilenos, oligo-amidas tales como oligo-glicina, oligo-alanina, oligo-lisina y oligopéptidos en general, oligo-fosfodiésteres, oligo- fosfoamidatos, oligo-fosfodiamidas, oligo-sulfonésteres, y oligo-sulfonamidas. Además, el enlazador también puede consistir de unidades combinadas de los antes mencionados. Se prefiere que la parte enlazadora, si está presente, introduzca de 1 a 30 átomos, preferentemente de 3 a 20 átomos, entre la F y la R en la fórmula PS'-C(=0)-N(RN)-F-L-R (y en la fórmula 1 anterior). Preferentemente, la molécula reportadora tiene un peso molecular de cuando m ucho 1 0,000, tal como cuando mucho 5,000, preferentemente cuando mucho 2,500. El término "sitio de reconocimiento/substrato" de la parte reportera de una molécula reportadora, significa el sitio que es, o que incluye un sitio de reconocimiento (en forma biológica) (por ejemplo una parte de un par de afinidad) o una parte qu ímicamente reactiva o una parte fotoquímicamente reactiva la cual pretende formar un enlace específico con un sitio de recepción/reactivo de la superficie sólida. Como se mencionó anteriormente, se ha descubierto que el ácido carboxílico en una u nidad de monosacárido que contiene ceto-carboxi en un polisacarido, es una manipulación especialmente buena para regioespecíficos, así como para la formación de enlace quimioselectiva entre el polisacárido de una molécula reportadora que contiene un grupo funcional adecuado. Varios nucleófilos incluyendo aminas primarias y secundarias, hidrazinas alifáticas, hidrazinas aromáticas, semicarbizidas, tiosemicarbizidas e hidrazidas de ácido, tienen la capacidad de formar un enlace covalente estable con una porción de ácido carboxílico con la ayuda de un reactivo de acoplamiento. Por lo tanto, los grupos reporteros que contienen dichos grupos nucleofílicos tendrán la capacidad de formar enlaces covalentes estables con un ácido carboxílico. Debe quedar entendido que algunas "partes reporteras" pueden comprender por sí mismas dicho n ucleófilo. De manera alternativa dicho nucleófilo puede ser introducido directamente o a través de la parte enlazadora opcional (L). La preparación de dicho nucleófilo que contiene moléculas reporteras es bien conocida para los expertos en la materia (ver por ejemplo, Greg T. Hermanson et al, Técnicas de Ligante de Afinidad I nmovilizada (I mmobilized Affinity Ligand Techniques), Academic Press I nc. , 1 992). El reactivo de acoplamiento actúa como un activador del ácido carboxílico y un ataque subsecuente mediante el n ucleófilo conduce la formación de un enlace covalente estable. Los ejemplos de reactivos de acoplamiento son carbodiimidas tales como carbodiimida diisopropilo y carbodiimida soluble en agua (WSC, carbodiimida 1 -(3-dimetilaminopropil)-3-etilo) , sales de fosfonio tales como hexafluorofosfato benzotriazoliloxi-tris-(dimetilamino)fosfonio (BOP) y hexafluorofosfato de fosfonio (benzotriazolil)-N-oxi-pirrolidinio (PyBOP), sales de uron io tales como hexafluorofosfato O-benzotriazolil-?,?, ?', ?'-tetrametiluronio (HBTU), tetrafluoroborato 0-(3,4-dihidro-4-oxo-1 ,2,3-benzotriazinil) ? ,? , ?', ?'-tetrametiluron io (TBTU), y hexafluorofosfato de fluoroformimidinio N , N'-Tetrametilo (TFFH). Se pueden utilizar muchos otros reactivos de acoplamiento y son conocidos para los expertos en la materia (M . Bodanszky, Principios de la Síntesis de Péptidos, 2a Edición, Springer-Verlag , 1 993). La adición de nucleófilos auxiliares tales como succinimida N-hidrox¡ y benzotriazole 1 -hidroxi, pueden aumentar las cinéticas de acoplamiento, así como suprimir las reacciones laterales tales como los reacomodamientos 0->N acilo, cuando se utilizan carbodiimidas como reactivos de acoplamiento (M . Bodanszky, Principios de la Síntesis de Péptidos, 2a Edición , Springer-Verlag , 1 993). Las reacciones de acoplamiento se pueden llevar a cabo en una solución acuosa o en una mezcla de agua y un solvente orgánico que se puede mezclar en agua tal como formamida ? , ?-dimetilo, sulfóxido dimetilo, dioxano, metanol, etanol y acetona o en el solvente orgánico puro. El solvente o mezcla de solvente es seleccionado para permitir la mejor solubilidad posible de los reactivos. Cuando se utiliza agua o una mezcla de solvente orgánico de agua, el pH durante la reacción de acoplamiento puede ser controlado utilizando una solución amortiguadora. El pH seleccionado para permitir las mejores condiciones para la reacción de acoplamiento, mientras que al mismo tiempo se conserva la integridad del polisacárido y la molécula reportadora. Preferentemente, el pH se mantiene entre 5 y 9 con el objeto de conservar la acidez o los epítopes lábiles base en la cadenas-0 del polisacárido. Un ejemplo de dicho grupo lábil es acetil-0 cuyas funciones se encuentran de manera muy común en los antígenos-0 del polisacárido. El pH óptimo para la reacción de acoplamiento también depende de la naturaleza del nucleófilo. Las aminas son compuestos básicos que son protonizados a un pH bajo que los convierte en no nucleofílicos y de esta manera, las reacciones de acoplamiento que utilizan aminas se llevan a cabo de mejor manera en un pH arriba de 7. Otros nucleófilos tales como hidracinas aromáticas, semicarbacidas, tiosemicarbacidas e hidrácidas de ácido son mucho menos básicas, lo que permite que la reacción de acoplamiento se lleve a cabo en un pH neutral o aún más bajo. Otro factor que determina el pH óptimo para la reacción de acoplamiento es la hidrólisis de competencia de la porción de ácido carboxilico activada mediante la ad hesión de iones de hidróxido. Esta reacción lateral puede ser minimizada mediante el uso de un pH abajo de 8 durante el acoplamiento. En solventes orgánicos el pH durante la reacción de acoplamiento puede lograrse mediante el uso de ácidos orgánicos o inorgánicos adecuados, y de las bases que son seleccionadas de acuerdo con su solubilidad en el solvente, así como, de acuerdo con su acidez relativa o resistencia base. Tal como se describió anteriormente, las condiciones precisas se eligen como promotoras del acoplamiento covalente, mientras que al mismo tiempo se conserva la integridad del polisacárido y la molécula reportadora. Las reacciones de acoplamiento normalmente se llevan a cabo a una temperatu ra dentro del rango de -20 a 1 00°C, con frecuencia de 0 a 20°C, tal como alrededor de 5°C. Además del tiempo de reacción de los parámetros antes mencionados, así como la cantidad de polisacárido, el reactivo de acoplamiento o el grupo reportero son críticos para obtener el conjugado ideal del grupo reportero polisacárido. Los inventores han desarrollado protocolos de acoplamiento que producen conjugados reproducibles en excelentes producciones y conservando la calidad de los epítopes inmunogénicos del polisacárido, así como la integridad del grupo reportero (ver la sección de Experimentos). Dicha optimización a menudo es deseable para aplicaciones comerciales, tal como lo podrán apreciar los expertos en la materia. En una modalidad de la presente invención de interés y de especial interés comercialmente hablando, el polisacárido es un polisacárido derivado de Salmonella LPS, y la molécula reportadora que es acoplada al polisacárido a través de un enlace de amida por medio de un reactivo de acoplamiento de carbodiimida, comprende una biotina o un grupo antraquinona. En otra modalidad de la presente invención de interés y de especial interés comercialmente hablando, el polisacárido es un polisacárido derivado de Actinobacillus LPS, y la molécula reportadora que es acoplada al polisacárido a través de un enlace de amida por medio de un reactivo de acoplamiento de carbodiimida, comprende una biotina o un grupo de antraquinona. Estas modalidades se mencionan ampliamente en la sección de Experimentos. Se considera que son nuevos los intermedios producidos de acuerdo con el primer paso del método de acuerdo con la presente invención. Por lo tanto, la presente invención también proporciona un compuesto de la fórmula general I (o, en el caso donde R2 es hidrógeno, opcionalmente el análogo ceto del mismo) en donde R1 es seleccionado de hidrógeno y una molécula reportadora L-R, en donde L es una parte enlazadora opcional de la molécula reportadora , y R es u na parte de reporte de la molécula reportadora; RN es seleccionado de hidrógeno y alquilo de C1 -4; F es seleccionado de un sólo enlace, fenileno, carbonilo (C(=0)), carbonilimino (C(=0)-NH-), tiocarbonilo ((C(=S)) e ¡mino (-N H-); R2, R7, R8 son seleccionados cada uno de manera independiente de hidrógeno y grupos de protección hidroxi; R4 es seleccionado de hidrógeno, un residuo mono- o disacárido y un grupo de protección hidroxi; R5 es seleccionado de hidrógeno, un "residuo de polisacárido protegido opcionalmente por un grupo funcional" y un grupo de protección hidroxi. El término "residuo mono- o disacárido" significa un residuo que comprende u na o dos unidades de monosacárido enlazadas en forma glicosídica . Los ejemplos preferidos son KDO-2-ilo, 4-fosfoetanolamina-KDO-2-ilo, L-ramnosil-(1 ->4)-KDO-2-ilo, y KDO-(2->4)-KDO-2-ilo. El término "residuo de polisacárido" significa la parte de un polisacárido (tal como se definió anteriormente) el cual junto con la unidad del monosacárido KDO de fórmula I y cualesquiera de los substituyentes de sacárido R4 forman el polisacárido (PS). Por lo tanto, el residuo de polisacárido comprende preferentemente de 2 a 997 unidades de monosacárido enlazadas, tal como por lo menos 7, por ejemplo de 7 a Y 997 unidades de monosacárido enlazadas, en particular por lo menos 22, por ejemplo de 22 a 497, unidades de monosacárido enlazadas. Tal como se definió anteriormente para el "polisacárido", el residuo de polisacárido puede no ser substituido en forma estequiométrica. El término "protegido opcionalmente por el grupo funcional" significa que el fragmento de oligosacárido que transporta a los grupos funcionales que son reactivos bajo las condiciones que prevalecen en los pasos de acoplamiento, son protegidos opcionalmente por el grupo funcional y son conocidos en la técnica . Esto significa que los grupos tales como hidroxi, amino, carboxi, sulfono, y mercapto son protegidos opcionalmente por un grupo funcional. La protección (y desprotección) se lleva a cabo a través de métodos conocidos para los expertos en la materia (ver, por ejemplo, Greene, T.W. y Wuts, P.G . M. , "Grupos Protectores en Síntesis Orgánica" (Protective Groups in Organic Synthesis) , 2o edición , John Wiley, N .Y. (1 991 ) , y .J .Gait, Síntesis Oligonucleótida , I RL Press, 1984). Los ejemplos ilustrativos de "grupos de protección hidroxi" son trifilo opcionalmente substituido, tal como 4,4'-dimetoxitritilo (DMT) , 4- monometoxitritilo (MMT), y tritilo, 9-(9-fenil)xantenilo opcionalmente substituido (pixilo), etoxicarboniloxi opcionalmente substituido, p-fenilazo- feniloxicarboniloxi , tetraahid ropiranilo (thp) , 9-fluoronilmetoxicarbonilo (Fmoc), metoxitetrahidropiranilo (mthp), sililoxi tal como trimetilsililo (TMS) , triisopropilsílilo (TI PS) , íerí-butildimetilsihlo (TBDMS), trietilsililo, y fenildimetilsililo, benciloxicarbonilo o éteres de benciloxicarbonilo substituido tal como benciloxicarbonil 2-bromo, ferf-butiléteres, éteres alquilo tal como éter metilo, acétales (incluyendo dos grupos hidroxi) , aciloxi tal como acetilo o acetilos substituidos por halógeno, por ejemplo, cloroacetilo o fluoroacetilo, isobutirilo, pivaloilo, benzoilo y benzoilos substituidos, metoximetilo (MOM) , éteres bencilo o éteres bencilo substituidos tal como 2,6-diclorobencilo (2,6-CI2Bzl) . De manera alternativa, un grupo hidroxi puede ser protegido mediante la adhesión a un soporte sólido, opcionalmente a través de un enlazador. Los ejemplos ilustrativos de grupos de protección amino son Fmoc (fluoronilmetoxicarbonilo), BOC (ferf-butiloxicarbonilo) , trifluoroacetilo, alíloxicarbonilo (aloe, AOC) , bencil-oxicarbonilo (Z,Cbz) , benciloxicarbonilos substituidos tal como benciloxicarbonilo 2-cloro ((2-CIZ), monometoxitritilo (M T), dimetoxitritilo (D T) , ftaloilo, y 9-(9-fenil)xantenilo (pixilo) . Los ejemplos ilustrativos de grupos de protección carboxi son ésteres alílicos, ésteres metílicos, ésteres etílicos, 2-cianoetilésteres, trimetilsililetilésteres, ésteres bencílicos (Obzl) , ésteres 2-adamantílicos (?-2-Ada), ésteres ciclohexílicos (OcHex), 1 ,3-oxazolinas, oxazoles, 1 ,3-oxazolidinas, amidas e hidrazidas. Los ejemplos ilustrativos de grupos de protección mercapto son tritilo (Trt) , acetamidometilo (acm), trimetilacetamidometilo (Tacm), 2,4,6-trimetoxibencilo (Tmob) , ferf-butilsulfenilo (SrBu) , 9-fluoronilmetilo (Fm) , 3 nítro-2-piridinosulfenilo (Npys), y 4-metilbencílo (Meb). En una modalidad de interés, R1 es L-R. Además, -N-F- en la fórmula I designa preferentemente amino (-N-), anilino (-N-Ph) , hidrazido (-N-C(=0)-), semicarbacido (-N-C(=0)-NH-), tiosemicarbacido (-N-C(=S)-NH-) o hidracino (-N-NH-), en particular amino. El grupo L designa preferentemente un birradical (parte enlazadora) tal como se definió anteriormente y, además, la molécula reportadora (L-R) preferentemente también es como se describió anteriormente. Son de especial interés las variantes en donde la molécula reportadora comprende una biotina o una antraquinona (en particular una antraquinona) como una parte de la parte reportera. Adicionalmente, la presente invención proporciona un método para la preparación de un compuesto de la fórmula general I tal como se describió anteriormente, que comprende hacer reaccionar un compuesto de la fórmula general III. en donde R2, R4, R5, R6, R7, y R8 son definidas como en la fórmula I, una forma completa o parcialmente protegida por el grupo funcional, con un compuesto de nitrógeno de la fórmula general IV H-N(RN)-F-R1 IV en donde R1, F y RN son tal como se definió para la fórmula I; y desprotegiendo completa o parcialmente de manera opcional el producto obtenido de esta manera, con el objeto de obtener un compuesto de la fórmula general I . Preferentemente, el compuesto de la fórm ula general I I I se utiliza en su forma de éster activada. En particular, la reacción entre el compuesto de ácido carboxílico de la fórmula general I I I y el compuesto de nitrógeno IV, es facilitado utilizando un reactivo de acoplamiento tal como uno de los mencionados anteriormente. Por lo tanto, la presente invención también proporciona un compuesto de la fórmula I para la preparación de un aparato de ensayo para la detección de anticuerpos contra la bacteria Gram-negativa y/o antígenos-0 de la bacteria Gram-negativa. La presente invención, proporciona adicionalmente un compuesto de la fórmula I para la preparación de una superficie sólida que transporta un polisacárido inmovilizado. Análisis de conjugados de grupo reportero polisacárido Con frecuencia es valioso tener la capacidad de evaluar la calidad de los conjugados de polisacárido de grupo reportero antes de la inmovilización para las superficies sólidas. Deben estar disponibles protocolos analíticos apropiados para asegu rar que los epítopes inmunogénicos en el polisacárido estén intactos después de la conjugación a la molécula reportadora y al mismo tiempo, para asegurar que los conjugados sean reproducidos en una forma reproducible. En relación con la presente invención, se han desarrollado preparaciones en las que se puede utilizar un método de espectroscopia UV para evaluar la cantidad de grupos reporteros adheridos al polisacárido, así como para evaluar la cantidad de ADN y proteína presente en un grupo reportero de polisacárido. Por lo tanto, tal como se describe en la sección de Experimentos, se puede utilizar la medida de la absorción a 260 y 280 nm para evaluar la cantidad de ADN y proteína, mientras que la cantidad de grupos reporteros adheridos al polisacárido puede ser evaluada en una onda específica para el grupo reportero. El Ensayo de ELI SA competitivo y el Ensayo de ELISA indirecto, tal como se describe en la sección de Experimentos, es una poderosa herramienta para cuantificar la presencia de epítopes inmunogénicos intactos en diferentes preparaciones de conjugado de grupo reportero de polisacárido. Por lo tanto, la combinación de las dos técnicas analíticas desarrolladas asegura que se pueda controlar la calidad de los diferentes lotes de preparaciones de grupo reportero de polisacárido. El protocolo analítico decisivo final es la medida cuantitativa de la capacidad para inmovilizar de los conjugados de grupo reportero de polisacárido. Estos procedimientos son señalados más adelante en la sección de Experimentos. Inmovilización de los conjugados de molécula reportadora de polisacárido En u n paso subsecuente del método de acuerdo con la presente invención , el conjugado de molécula reportadora-polisacárido es inmovilizado para la superficie sólida formando un enlace específico entre el sitio de reconocimiento/substrato de dicha molécula reportadora y un sitio de recepción/reactivo de la superficie sólida.

El término "formación de un enlace específico" significa el establecimiento de un enlace covalente entre la parte reportera del conjugado de polisacárido/molécula reportadora y la superficie sólida, así como el establecimiento de un enlace no covalente que comprende un par de afinidad . En un aspecto de la presente invención, la parte reportera es un grupo fotoquímicamente reactivo que tiene la capacidad de formar un enlace covalente para una superficie sólida al momento de la irradiación con luz. Los ejemplos de grupos fotoquímicamente reactivos son coumarins substituidos, benzofuranos, índoles, angelicinas y en particular psoralenos, tal como se describe en la Patente EP 0 31 9 957. Un número de publicaciones de patente US-A-4 722 906, US-A-4 973 493, US 5 002 582 y PCT/US88/04491 , describe los grupos fotoquímicamente reactivos seleccionados de precursores de carbeno y nitreno y cetonas que tienen la capacidad de formar enlaces covalentes para superficies sólidas al momento de irradiación con luz. Una subclase particularmente preferida de grupos fotoquímicamente reactivos son las quinonas tales como las descritas en la Patente WO 96/31 557, por ejemplo antraquinonas (AQ), benzoquinonas y fenantraquinonas. El grupo de antraquínona es un grupo fotoquímicamente reactivo de particular interés. La formación fotoqu ímica del enlace covalente para la superficie sólida, normalmente comprende los sig uientes pasos: El conjugado molecular reportero de polisacárido (PS-RM) es llevado en la solución en un solvente apropiado. Preferentemente, el solvente es agua, o una mezcla de agua y un solvente orgánico que se puede mezclar en agua tal como formamida ? , ?-dimetilo, sulfóxida dimetilo, dioxano, metanol, etanol y acetona o el solvente orgánico puro. El solvente o mezcla de solvente es seleccionado para asegurar la solubilidad del conjugado de molécula reportadora-polisacárido, pero al mismo tiempo permite las mejores condiciones para el subsecuente paso de inmovilización . Utilizando agua o una mezcla de agua y un solvente orgánico que se puede mezclar en agua, se pueden agregar sales inorgán icas para mejorar el paso de acoplamiento fotoquímico para la superficie sólida y para controlar el pH de la solución. Tal como se demostró en la sección de Experimentos, la naturaleza exacta de las sales, así como la concentración del conjugado de molécula reportadora-polisacárido y el pH de la solución son parámetros que pueden ser ajustados con el objeto de obtener resultados mejorados. Con frecuencia, el proceso fotoqu ímico requiere (o es facilitado mediante) una superficie que contiene carbono. La solución del conjugado de molécula reportadora-polisacárido se pone en contacto con la superficie sólida mientras aún está en la solución y es expuesto a la luz de una longitud de onda adecuada. Preferentemente, la longitud de onda es elegida entre 200 y 700 nm pero depende del grupo específico fotoquímicamente reactivo elegido. Para antraqu inonas, la longitud de onda normalmente es de 300 a 400 nm. El tiempo de irradiación varía dependiendo de la naturaleza del conjugado de molécula reportadora-polisacárido, aunque preferentemente los tiempos de irradiación deben ser menores a 200 minutos. De manera alternativa, la solución del conjugado de la molécula reportadora de polisacárido es puesto en contacto con la superficie sólida, en solvente o mezcla de solvente es evaporado, y tal como se describe anteriormente, el conjugado finalmente es expuesto a la luz. En ambos casos, el enjuague con ag ua o una mezcla de agua/solvente adecuada se utiliza posteriormente para remover los conjugados no enlazados en forma covalente. En un seg undo aspecto de la presente invención, la parte reportera es un grupo termoq u ímicamente reactivo que tiene la capacidad de formar un enlace covalente en una forma quimioselectiva para una superficie sólida que tiene un grupo funcional adecuado. Los ejemplos de grupos termoqu ímicamente reactivos son ácidos carboxílicos, aminas primarias, aminas secundarias, hidrácidas de ácido, semicarbasidas, tiosemicarbasidas, tioles, hidracinas alifáticas, hidracinas aromáticas, epóxidos y maleimidas. A menudo, el proceso termoquímico requiere (o es facilitado mediante) una superficie que contiene carbono. El conjugado de molécula reportadora-polisacárido (PS-RM), es llevado en la solución en un solvente apropiado. Preferentemente, el solvente es agua o una mezcla de ag ua y un solvente orgánico que se puede mezclar en agua , tal como formamida ? , ?-dimetilo, sulfóxido dimetilo, dioxano, metanol, etanol y acetona o el solvente orgánico puro. El solvente o mezcla de solvente es seleccionado para asegurar la solubilidad del conjugado de molécula reportadora-polisacárido, aunque al mismo tiempo se permiten las mejores condiciones para el subsecuente paso de inmovilización. La solución del conjugado de molécula reportadora-polisacárido es puesto en contacto con la superficie sólida con el objeto de facilitar la formación de enlace covalente. Puede ser necesaria la adición de reactivos de acoplamiento adicionales con el objeto de promover la formación de enlace covalente. En la mayoría de los casos, es muy importante controlar el pH durante la formación de enlace covalente. En la solución acuosa o en la mezcla de agua y solvente que se puede mezclar en agua esto se puede lograr utilizando amortiguadores estándar. En solventes orgánicos esto se puede lograr mediante el uso de ácidos orgánicos o inorgánicos adecuados y las bases que son seleccionadas de acuerdo con su solubilidad en el solvente, así como de acuerdo con su acidez relativa o resistencia base. En todos los casos, se eligen condiciones precisas para promover el acoplamiento covalente mientras que al mismo tiempo se conserva la integridad del polisacárido y la molécula reportadora. En la mayoría de los casos se permite la formación de enlace covalente para proceder sin la evaporación del solvente, aunque en ciertos casos la evaporación puede ser conveniente. Existen muchas variedades de dichos métodos y son bien conocidos para los expertos en la materia (Greg T. Hermanson et al, Técnicas del Ligante de Afinidad Inmovilizada (Immobilized Affinity Ligand Techniques), Academic Press Inc., 1992). En un tercer aspecto de la presente invención, la molécula reportadora es una parte de un par de afinidad. Los pares de afinidad son bien conocidos para los expertos en la materia (Greg T. Hermanson et al, Técnicas del Ligante de Afinidad Inmovilizada (Immobilized Affinity Ligand Techniques), Academic Press Inc., 1992) y los ejemplos ilustrativos son biotin/avidín, biotin/estreptavidin, bíotin/NeutrAvidin, glutatione/glutatione-S-transferasa, complejo de metal de ácido iminodiacético/péptidos y proteínas etiquetadas hexa-histidina, complejo de metal de ácido nitrilotriacético/péptidos y proteínas etiquetadas hexa-histidina, ADN/ADN, ADN/ARN, ARN/ARN, y anticuerpos mono- o policlonales que surgen contra haptenos/hapteno específicos. Un ejemplo especialmente integrante de un par de afinidad son dos hebras complementarias de ácidos nucléicos asegurados (ANL, Nielsen at al, Quim. Común, 1997, 9, 825-6.). Preferentemente, la parte del par de afinidad utilizada para preparar el conjugado de grupo reportero-polisacarido es un compuesto de desde bajo peso molecular hasta peso molecular medio, preferentemente menor a 10,000, y más preferentemente menor a 7,000. El conjugado de molécula reportadora-polisacárido, es llevado en la solución en un solvente apropiado. Preferentemente, el solvente es agua, o una mezcla de agua y un solvente orgánico que se puede mezclar en agua, tal como formamida ?,?-dimetilo, sulfóxido dimetilo, metanol, etanol y acetona o el solvente orgánico puro. El solvente o mezcla de solvente es seleccionado para asegurar la solubilidad del conjugado de molécula reportadora-polisacárido, aunque al mismo tiempo permite las mejores condiciones para el subsecuente paso de inmovilización. La solución del conjugado de molécula reportadora-polisacárido es puesto en contacto con la superficie sólida que ha sido pre-recubierta con la segunda parte del par de afinidad. En la mayoría de los casos, es necesario controlar el pH, la naturaleza y concentración de iones en la solución, y en muchos casos puede ser necesario agregar detergentes con el objeto de optimizar el paso de inmovilización. Muchas variedades de dichos métodos son bien conocidos para los expertos en la materia (Greg T. Hermanson et al, Técnicas del Ligante de Afinidad Inmovilizada (Immobilized Affinity Ligand Techniques), Academic Press Inc., 1992). Una propiedad muy importante de los métodos descritos en la presente invención, es que tienen la capacidad de inmovilizar mezclas de más de un conjugado de grupo reportero-polisacárido al mismo tiempo para la misma superficie, en una forma bien definida. Tal como se describe en la sección de Experimentos, la inmovilización de los conjugados de grupo de reportero-polisacárido puede ser optimizada de manera individual y posteriormente ser llevada a cabo al final en una reacción mezclada para crear aplicaciones basadas en los conjugados mezclados. Las proporciones individuales de los conjugados inmovilizados pueden ser fácilmente optimizados de acuerdo con la aplicación específica. La superficie sólida a la cual será adherido el polisacárido, puede ser seleccionada de una amplia variedad de superficie sólidas utilizadas en los campos analíticos y de diagnóstico. Los tipos de superficie sólidas más interesantes, son aquellas de polímeros orgánicos, vidrios, silicio y óxido de silicio (sílice), así como materiales de compuesto de los mismos.

Entre los polímeros orgánicos, los ejemplos ilustrativos son poliestireno, policarbonato, polipropileno, polietileno, celulosa, nitrocelulosa, agarosa, tereftelato de polietilénglicol, polivinilacetato, polivinildifluoruro, polimetilpenteno, polivinilpirrolidinona, poliacrilato, poliacrilonitrilo, polimetilmetacrilato y polivinilcloruro, en donde el poliestireno y policarbonato son los ejemplos en especialmente interés.

Entre los vidrios y cerámicas, el vidrio de borosilicato (vidrio Pyrex) y el vidrio de soda de lima, son los ejemplos especialmente relevantes, por ejemplo en la forma de tubos para especímenes, frascos y placas deslizables para m icroscopio. El cuerpo en sí mismo, puede tener una forma o puede estar diseñado y formado para el uso que se desee en particular, por ejemplo, el cuerpo puede tener la forma de una hoja , una película, una bolita, un botón, un disco, una placa, un anillo, una varilla , una red, una membrana, un filtro, u na charola , una microplaca (una placa de microtitulación), una varilla, o una varilla de cuchillas múltiples. Los cuerpos de especial interés que serán recubiertos de acuerdo con la presente invención , son microplacas (placas de microtitulación), por ejemplo, microplacas de poliestireno (placas de microtitulación) , varillas, placas deslizables, tubos y bolitas. Una propiedad adicionalmente importante de los métodos descritos en la presente invención , es la capacidad para llevar a cabo la inmovilización de los conjugados de grupo reportero-polisacárido en una forma dirigible en forma de espacio, lo cual es muy importante en el desarrollo de bio-chips y bio-censores y otros sistemas de diagnóstico miniaturizados. En estos sistemas, es necesario que por lo menos un componente del ensayo sea inmovilizado en una posición bien definida. Esto permitirá que cada componente analítico sea identificado por la posición , permitiendo la determinación de muchos componentes analíticos al mismo tiempo en una muestra analítica.

También se considera que la inmovilización de un polisacárido, se puede llevar a cabo de acuerdo con un método alternativo en donde el enlace covalente es formado directamente entre el grupo carboxi del polisacárido y una funcionalidad química adherida a la superficie sólida, por ejemplo, una amina , una anilina, una hidracina, etc. En algunos casos, se pueden utilizar superficie sólidas comercialmente disponibles, por ejemplo, las microplacas Covalink procedentes de Nunc, Dinamarca. Se considera que este método es menos conveniente que las modalidades de acuerdo con las modalidades principales, en particular con respecto a la capacidad de reproducción . Sin embargo, se considera que el método alternativo puede ser útil para la inmovilización de la parte del lí pido disminuida por polisacárido (PS). Por lo tanto, la presente invención también proporciona un método para inmovilizar un polisacárido (PS) para una superficie sólida, teniendo dicho polisacárido un grupo ceto-carboxi (-C(=0)-COOH) o un grupo cetal o hemicetal correspondiente al mismo) , formando u n enlace covalente entre el grupo carboxi del polisacárido y una funcionalidad qu ímica de la superficie sólida. Es evidente a partir de lo anterior, que la funcionalidad química de la superficie sólida debe ser preferentemente del mismo tipo que la de los especificados anteriormente dando como resultado esencialmente el mismo tipo de tipos de enlace entre el polisacárido y la superficie sólida, como uno anteriormente especificado para el enlace entre el polisacárido y la molécula reportadora; por ejemplo, un enlace del tipo PS'-C(=0)-N(RN)-F-L-SS, en donde PS' , L, RN y F son como se definió anteriormente y SS designa la superficie sólida. Debe quedar entend ido que N( N)-F-L puede ser parte de la superficie sólida o en donde el polisacárido está acoplado o, de manera alternativa, que N(RN)-F-L puede ser acoplado al polisacárido antes del acoplamiento a la superficie sólida. En resumen, la presente invención también proporciona superficies sólidas obten idas (o que se pueden obtener) de acuerdo con los métodos descritos anteriormente. Aplicaciones de conjugados inmovilizados Las superficies sólidas a las cuales los polisacáridos derivados de LPS son inmovilizados, tienen varios usos dentro de los campos de d iagnóstico y analíticos, por ejemplo, para la detección de infecciones de Salmonella, en varios tipos de animales, por ejemplo cerdos y aves de corral. En una modalidad preferida, los polisacáridos de Salmonella inmovilizados comprende en 1 ,4,5,6, 7 y 12 antígenos-O representados por una mezcla de polisacáridos derivados de LPS acoplado por antraquinona de Salmonella Typhimurium y Salmonella Choleraesuis, acoplada a la superficie sólida como una mezcla optimizada de dos polisacáridos, tal como se describe en el ejemplo 24. Esta superficie sólida está proyectada para utilizarse en un inmunoensayo para anticuerpos contra Salmonella spp, y para antígenos-O de Salmonella de los serotipos descritos, comprendiendo el inmunoensayo el contacto de la superficie con una muestra, preferentemente una muestra líquida tal como suero, jugo gástrico, leche u otros fluidos biológicamente derivados. Posteriormente, los anticuerpos son detectados mediante un anticuerpo de detección que comprende una etiqueta de enzima, siendo llevado a cabo el ensayo completo como un ensayo inmunoabsorbente enlazado por enzima (ELISA). También se pueden utilizar otras etiquetas, por ejemplo, etiquetas fluorescentes, etiquetas para detección fluorescente resuelta con el tiempo, etiquetas radioactivas en general, radioetiquetados para conteo por centelleo de proximidad . La presente invención , proporciona el uso de una superficie sólida que transporta un polisacárido inmovilizado, tal como se describió anteriormente (o a través de otros métodos que producen el mismo resultado) en un ensayo de serotipo de diagnóstico o de antígeno, preferentemente ensayo de diagnóstico. El ensayo preferentemente es un inmunoensayo de fase sólida. En particular, el ensayo de diagnóstico es un ensayo serológico, por ejemplo, un ensayo serológ ico para la detección de anticuerpos contra microorganismos tales como bacteria Gram-negativa. Especialmente, el ensayo de diagnóstico es un ensayo serológico para la detección de anticuerpos contra Salmonella spp. La presente invención también proporciona un aparato de ensayo para la detección de anticuerpos contra una o más bacterias Gram-negativa, que comprenden una superficie sólida que tiene inmovilizado en el mismo un polisacárido, correspondiendo dicho polisacárido a la parte de carbohidrato del lipopolisacárido bacterial (LPS) de la bacteria Gram-negativa a través del grupo de ácido carboxílico de una unidad de monosacárido KDO de dicho polisacárido. El polisacárido es inmovilizado preferentemente a la superficie sólida de acuerdo con el método definido en la presente invención . La superficie sólida la cual está incluida en el aparato de ensayo normalmente tiene una forma particularmente adecuada para el ensayo en cuestión. El aparato de ensayo puede incluir adicionalmente una hoja protectora y puede estar acompañada de una hoja de instrucciones. Los aparatos de ensayo de particular interés son los utilizados para el proceso de serotipo de bacterias y para la detección de antígenos. Adicionalmente, los aparatos de ensayo incluyen más de un tipo de PS inmovilizado a la superficie de un miembro del aparato que constituye las modalidades preferidas. La presente invención, también proporciona un método para estimar el número de una bacteria específica, para el proceso de serotipo de bacterias y para la detección de antígenos (LPS/PS) utilizando los aparatos de ensayo descritos anteriormente. Las modalidades de particular interés comprenden el uso de microplacas inmovilizadas AQ-PS. Estos métodos de diagnóstico hacen posible detectar incluso pequeñas cantidades de bacterias en fluidos biológicos y proporciona la determinación de un serotipo de bacteria. Esto es de particular interés y valioso para la detección de infecciones de Salmonella y Actinobacillus. EXPERIMENTOS General Se compró cloroformo, sulfóxido dimetilo (DMSO) y metanol en Labscan y fueron de pureza HPLC, ácido acético (99-100%) en Riedel de Háen, carbodimida soluble en agua (WSC, carbodiimida 1-(3dimet¡laminopropil)-3-etilo) en NovaBiochem, succinimida N-hidroxi (96%) en Aldrich, "Slide-a-lyzer" en Pierce, H-pAla-pAla(CH2)3-NHCO-AQ · HCI fueron sintetizados tal como se describió anteriormente (Patente WO 96/31557) ( Ala sig nifica ß-alanina) . Se compraron tubos de diálisis (MWCO: 6-8000) en Spectra/Por, microplacas de poliestireno (PolySorp) en Nu nc. PBS: solución salina amortiguada por fosfato, pH 7.2 , 0.15 NaCI. PBS, Tween : PBS + 0.05% Tween 20. PBS, Tween , BSA: PBS-Tween + 1 % BSA (albúmina de suero de bovino)). Solución de substrato OPD: 0.1 M amortiguador de citrato-fosfato, pH 5.0, 0.66 mg/mL OPD (diamina de fenileno-O), 0.012% H202. Todo el suero de cerdo fue obtenido de Danish Veterinary Laboratory. Ejem plo 1 Purificación de lipopolisacárido (LPS) de Salmonella Typhimurium y Salmonella Choleraesuis Cultivo. Se utilizaron Salmonella Typhimurium no. 3389-1 /92 (O: 1 , 4, 5, 1 2) y Salmonella Choleraesuis var. Kunzendorf no. 143 (O: 6, 7) para la preparación de LPS. Para el cultivo de la placa, se utilizó agar Columbia (Oxoid , Unipath Ltd . , Basingstoke, R. U .) suplementado con 5% de sangre de bovino (agar de sangre-C) como el medio de crecimiento. Para el cultivo en potaje, las bacterias se desarrollaron en forma aeróbica a una temperatura de 37°C en matraces con agitación de 130 rpm . Las deformaciones fueron almacenadas a una temperatura de -80°C en LB-potaje suplementado con 1 0% de glicerol. Para la fermentación, se inoculó durante la noche con 800 mL del cultivo de potaje un Bioreactor Labor MBR de 7 litros (MBR Bio Reactor AG, Suiza) con un medio LB de 4 litros. La temperatura se mantuvo a 37°C y el pH se mantuvo en 7.2 durante todo el proceso y la aeración fue ajustada a 50% p02, con regulación automática rociando aire atmosférico estéril en una agitación constante de 500 rpm . Se controló la espuma mediante la ad ición de emulsión de silicón . 90 minutos después de la inoculación, se agregaron 400 ml_ de glucosa al 25%. Cinco horas después de la inoculación , la aeración fue reducida a aproximadamente 1 litro por minuto. Después de aproximadamente 1 8 horas de cultivo, se detuvo la aeración y se agregaron 1 50 mL de formalín para una concentración final de aproximadamente 3% a una temperatu ra de 20°C y a200 rpm , y se continuó con la inactivación por 20 horas bajo estas condiciones. La inactivación del cultivo se revisó sobre agar de sangre-C 6 horas después de la adición de formalín, incubando durante la noche las placas de agar de sangre-C inoculadas. Si se encontró que la inactivación estaba completada, el cultivo inactivado fue liberado para el procesamiento adicional. Extracción . Se extrajo LPS de los cultivos exterminados de formalín mediante extracción caliente de fenol acuoso, tal como lo describe Hassan et al, 1 990. De manera breve, las bacterias en 5 L del potaje de cultivo inactivado fueron lavadas en 3x4 L PBS, seguido por 4 lavados en de 5 a 1 0 volúmenes de acetona a u na temperatura de 20°C, fueron secadas y resuspendidas en agua Milli Q . Posteriormente, el LPS fue extraído de esta suspensión mediante fenol acuoso caliente (65°C) al 45% ; se ag regó a la suspensión un volumen igual de fenol acuoso precalentado al 90%, en donde posteriormente la mezcla se mantuvo a una temperatura de 65 a 68°C durante 10 minutos bajo agitación leve.

Después del enfriamiento a una temperatura de 40°C después de la centrifugación durante 30 minutos a 10.000 g, la fase acuosa superior fue recuperada cuidadosamente y dializada contra agua illi Q durante por lo menos 48 horas (con 3 cambios) a una temperatura de 4°C y subsecuentemente fue secada por congelación. La producción promedio del LPS purificado procedente de un lote de cultivo fermentado fue de 1700 mg peso seco con un rango de 1500 a 2200 mg. La pureza se evaluó a partir de geles-SDS (ver Ejemplo 3) y las mediciones del análisis de UV. Tal como se observa en la figura 5, únicamente se observaron en los geles cantidades residuales de proteínas. Las medidas de extinción a 280 nm mostraron que las soluciones de LPS acuosas (5 a 10 mg/mL de LPS) contenían aproximadamente 1.5 mg/mL de proteína. Se observó sobre el SDS-PAGE teñido con plata (ver Ejemplo 3), la distribución típica en forma de escalera de las bandas, indicando que todo el rango de pesos moleculares habían sido recuperados. Ejemplo 2 Análisis UV de LPS Se puede utilizar espectroscopia UV para analizar el contenido de ADN y proteína del LPS. El contenido de ADN puede ser medido a 260 nm y el contenido de proteína a 280 nm. De manera breve, el LPS es disuelto en agua ultra pura en una concentración de 0.5 mg/mL. El espectro UV se mide de 200 a 400 nm con agua ultra pura sola como la referencia. La figura 3, muestra un perfil UV típico de LPS derivado de Salmonella Typhimurium, mientras que la Figura 4 muestra un perfil UV típico de LPS derivado de Salmonella Choleraesuis. Ejemplo 3 Análisis SDS-PAGE de LPS Se puede utilizar electroforesis de gel poliacrilamida de sulfato dodecilo de sodio (SDS-PAGE) para el análisis de preparaciones LPS para la determinación de la distribución de peso molecular de la preparación. A través de este método las preparaciones de LPS suaves normalmente producen una "escalera" de bandas que representan las moléculas LPS de peso molecular incrementado, cada una separada por el peso molecular de la unidad de repetición del polisacárido-O. Los geles de poliacrilamida (12.5%) fueron corridos de acuerdo con el método de Laemmli (Laemmli, R.U., 1970, Naturaleza 227, 680-685, disasociación de proteínas estructurales durante el ensamble de la cabeza del bacteriófago T4 (Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4)). El LPS fue diluido en un amortiguador de muestra hasta una concentración final de 2 a 4 mg/mL de LPS (1% de SDS) y fue hervido durante 5 minutos, antes de ser aplicado a los depósitos. Para la detección de proteínas los geles fueron teñidos en 0.4% (w/w) Coomassie Brilliant Blue R250. Para la detección de LPS los geles fueron teñidos con plata de acuerdo con el método de Tsai y Frasch (Tsai, C.-M., Frasch, CE., 1982, Anal. Bioquim. 119, 115-119, Una tinción de plata sensible para detectar lipopolisacáridos en geles de Poliacrilamida (A sensitive silver stain for detecting lipopolysaccharides in Polyacrylamide gels)).

La figura 5, muestra un análisis típico de una preparación de Salmonella Typhimurium LPS y la fig ura 6 muestra un análisis típico de una preparación de Salmonella Choleraesuis LPS. Tal como se observa en las Figuras, únicamente se visualizaron cantidades residuales de proteína mediante la tinción con Coomassie Brilliant Blue, mientras que en los geles teñidos con plata se observó la distribución en forma de escalera de las bandas, indicando que todo el rango de pesos moleculares había sido recuperado. Ejemplo 4 Ensayo de ELISA indirecto para la determinación de LPS y PS Ya que el LPS intacto normalmente tiene la capacidad de enlazar en forma pasiva las microplacas a través de la parte de lípido A hidrofóbica de la molécula, se puede utilizar un Ensayo de ELISA indirecto en el cual el LPS es recubierto para determinar la cantidad de LPS en una cierta preparación de LPS . En esta misma forma, la presencia de LPS intacta en una preparación de PS puede ser analizada recubriendo la preparación de PS. El Ensayo de ELISA indirecto se llevó a cabo esencialmente de acuerdo con el protocolo previamente publicado por B. Nielsen et al, ( 1995), omitiendo únicamente el bloqueo de las placas. Las placas fueron recubiertas con una serie de dilución de dos dobleces de la preparación de LPS o PS, comenzando normalmente con 0.05 mg/depósito en 0.1 M de carbonato de sodio, 1 .0 M de NaCI, en un pH de 9.6 durante la noche a una temperatura de 4°C. Posteriormente lavando en PBS Tween, ya sea un anticuerpo monoclonal estándar dirigido contra antígenos-O de Salmonella Typhimuñum (clon MAB Hytest 1E6, 1 mg/mL, diluido 1/25000 en PBS Tween, BSA) o un suero de cerdo positivo diluido en 1/400 en PBS, Tween, BSA. En la figura 7, se utilizó un suero de cerdo positivo. Se aplicaron 100 µ?_ por depósito y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas fueron posteriormente lavadas en PBS Tween, y subsecuentemente incubadas con IgG anti ratón de conejo conjugado por HRP (PO260, DAKO diluido en 1:2,000) con el Mab o IgG de anti cerdo de conejo conjugado por HRP (P0164, DAKO diluido en 1:2,000) con el suero de cerdo; las diluciones se realizaron en PBS, Tween BSA, durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas fueron lavadas tal como se indicó anteriormente, y se agregaron 100 µ? de una solución de substrato OPD a cada depósito y se incubaron durante de 10 a 15 minutos. La reacción se detuvo con 100 µ? 0.5 M H2S04, y la densidad óptica se leyó a 490 nm substrayendo 650 nm para la corrección del procesamiento. La figura 7 muestra un ejemplo típico de una preparación de LPS y PS de Salmonella Typhimuñum analizada mediante un suero de cerdo positivo tal como se describió anteriormente y la figura 8 muestra un análisis correspondiente de una preparación de LPS de Salmonella Choleraesuis utilizando un suero de cerdo Infantis-positivo. Se debe observar que las preparaciones de LPS enlazan a las placas y son reconocidas específicamente por el anticuerpo, permitiendo su cuantificación cuando son comparadas con una preparación estándar, mientras que el PS exhibe muy poco enlace a las placas. Ejemplo 5 Determinación de Ensayo de ELISA competitivo de epítopes inmunogénicos en LPS y PS La presencia de epítopes inmunogénicos intactos en diferentes preparaciones de LPS, puede ser determinada mediante Ensayo de ELISA competitivo utilizando una concentración fija de LPS intacto para recubrir e incubar la preparación de antígeno (LPS o PS) que será investigada junto con el anticuerpo de detección. Aparte de la presencia del competidor, el Ensayo de ELISA se lleva acabo exactamente como el Ensayo de ELISA indirecto descrito en el Ejemplo 4. Normalmente, se utiliza una titulación de 2 dobleces a partir de 5 mg/mL del antígeno y el efecto competitivo es observado como una reducción en el nivel OD comparado con el nivel OD obtenido en la ausencia del antígeno de competición . La figura 13 muestra un resultado típico de la competición mediante una preparación de PS de Salmonella Typhimurium, utilizando una microplaca recubierta con LPS de Salmonella Typhimurium y una preparación LPS de Salmonella Typhimurium como el control competidor y la detección mediante un suero de cerdo de Salmonella Typhimurium positiva diluido en 1 /400 seguido de IgG anti cerdo de conejo conjugado por HRP (DAKO P0164, 1 /2000), tal como se describió en el Ejemplo 4. Se puede observar que la preparación PS en concentraciones comparables es justo tan competitiva como el LPS intacto, indicando la conservación de los epítopes antigénicos en el PS . La figura 14 ilustra la misma preparación con los antígenos de Salmonella Choleraesuis, utilizando un suero de cerdo positivo en 1 /600. Nuevamente, se observa que la antigenicidad de la preparación PS, se conserva en comparación con el LPS intacto. Ejemplo 6 Preparación de PS a partir de LPS derivado de Salmonella Typhimurium mediante deslipidación El LPS liofilizado derivado de Salmonella Typhimurium (1.55 g), se disuelve en agua ultra pura (388 mL), y posteriormente se agrega ácido acético (22 mL, 0.37 mol). La mezcla es dividida en porciones de 40 mL en tubos de plástico Nunc. Los tubos sellados son calentados en un horno (a una temperatura de 90°C, durante 60 minutos) seguido del enfriamiento en un baño de hielo durante 10 minutos permitiendo que las mezclas alcancen la temperatura ambiente. Las mezclas son reunidas en las fases acuosas combinadas extractadas con cloroformo / metanol (2:1 mezcla v/v, 4 x 580 mL). La fase acuosa es subsecuentemente dializada a una temperatura de 4°C contra agua ultra pura durante de 1 a 2 días (hasta que desaparece el olor del fenol) y finalmente es liofilizada durante de 1 a 2 días proporcionando el PS como un sólido blanco. El análisis UV (0.5 mg / mL) se lleva a cabo tal y como se describió en el Ejemplo 2. Producción: 0.520 g (34%), análisis UV: A(260 nm): 1.0; A(280 nm): 0.82. Ejemplo 7 Preparación de PS a partir de LPS derivado de Salmonella Choleraesuis mediante deslipidación. El LPS liofilizado derivado de Salmonella Choleraesuis (1.13 g), se disuelve en agua ultra pura (283 mL), y posteriormente se agrega ácido acético (16.2 mL, 0.27 mol). La mezcla es dividida en porciones de 40 míen tubos de plástico Nunc. Los tubos sellados son calentados en un horno (a una temperatura de 90°C, durante 60 minutos) seguido del enfriamiento en un baño de hielo durante 10 minutos permitiendo que las mezclas alcancen la temperatura ambiente. Las mezclas son reunidas y las fases acuosas combinadas extractadas con cloroformo / metanol (2:1 mezcla v/v, 4 x 425 mL). La fase acuosa es dializada subsecuentemente a una temperatura de 4°C contra agua ultra pura durante de 1 a 2 días (hasta que desaparece el olor del fenol) y finalmente es liofilizada durante de 1 a 2 días proporcionando el PS como un sólido blanco. El análisis UV (0.5 mg / mL) se lleva a cabo tal y como se describió en el Ejemplo 2. Producción: 0.262 g (23%), análisis UV: A(260 nm): 1.52; A(280 nm): 1.09. Ejemplo 8 Análisis SDS-PAGE de PS. Se puede utilizar SDS-PAGE visualizado por tinción de plata, para analizar el PS derivado mediante hidrólisis de LPS para la presencia de LPS residual. Ya que el PS no contiene la porción de lípido A de enlace a SDS lipídico, el PS no es complejo con SDS para formar complejos cargados que se moverían durante la electroforesis. Por lo tanto, el PS puro no daría surgimiento a bandas en el SDS-PAGE teñido con plata. El SDS-PAGE de las preparaciones PS se lleva a cabo tal y como se describió en el Ejemplo 3. La figura 9 muestra resultados típicos procedentes de cinco diferentes preparaciones PS de Salmonella Choleraesuis. Tal como se observa a partir de la figura, están presentes únicamente pequeñas cantidades de LPS en estas preparaciones PS. Ejemplo 9 * Determinación de la capacidad de PS para enlazar en forma pasiva a las microplacas. El PS derivado de LPS mediante deslipidación, pierde la capacidad de enlazar mediante adsorción pasiva a las microplacas. Por lo tanto, las preparaciones PS probadas como se describe en el Ejemplo 4, dan surgimiento a una señal OD muy pequeña comparada con una cantidad comparable de LPS, tal como se observa con Salmonella Typhimurium y Salmonella Choleraesuis en las Figuras 7 y 8 respectivamente. Ejemplo 10 Preparación de Actinobacillus pleuropneumoniae PS Condiciones del Cultivo. Se utilizaron la deformación de referencia L20 del serotipo 5b de Actinobacillus pleuropneumoniae, y la deformación de referencia Fem0 del serotipo 6 para la preparación del antígeno LPS. Las deformaciones fueron desarrolladas en placas de agar de potaje de carne suplementadas con sangre de bovino al 5% (Jacobsen, M.J. y Nielsen, J.P., 1995, Desarrollo de un medio selectivo e indicativo para el aislamiento de Actinobacillus pleuropneumoniae procedente de las amígdalas (Development of a selective and indicative médium for isolation of Actinobacillus pleuropneumoniae from tonsils). Vet. Microbiol. 47, 191-197)) con un Staphylococcus aureus no haemolítico como una deformación-enfermera de dinucleótido de adenina nicotinamida (NAD) o en placas de agar PPLO modificadas (Nicolet, J., 1971, Zentralbl.

Bacteriol. Abt. 1 Orig . 216, 487-495, Sur l 'Hemofilosa du porc I I I . Diferenciación serológica de Haemophilus parahaemolyticus (Differenciation serologic de Haemophilus parahaemolyticus. )) como el medio sólido. El medio de crecimiento líquido para la preparación de A. pleuropneumoniae consistió de 30 g/l de un potaje de soya Tripticasa (BBL 1 1 768, Becton Dickinson , Cockeysville, MD, E. U .A.) suplementado con 10 g/l de extracto de levadura (Oxoid L21 , U nipath Ltd. , Basingstoke, R. U .) y 0.03% (w/v) NAD (Sigma Chemical Co,. St. Louis, MO, USA), pH 7.2. Los cultivos líquidos de 1 I, fueron desarrollados en matraces de agitación de 2 l-Erlenmeyer a una temperatura de 37°C con agitación a 1 30 rpm . Extracción , el LPS se preparó a partir de la deformación L20 del serotipo 5b, de Actinobacillus pleuropneumoniae y la deformación Fem<l> serotipo 6 a través de un método anteriormente descrito (Nielsen, R. Andresen , L.O. y Plambeck, T. , 1996, Caracterización Serológica de deformaciones de biotipo 1 de Actinobacillus pleuropneumoniae relacionados en forma antigénica tanto para serotipo 2 como 7 (Serological characterization of Actinobacillus pleuropneumoniae biotype 1 strains antigenically related to both serotype 2 and 7). Acta Vet. Scand. 37, páginas 327-336) , excepto que el material de partida fue 10 g de células con peso húmedo procedentes de líquido en donde durante la noche los cultivos y volúmenes fueron aumentados en forma proporcional. El LPS fue precipitado como un gel mediante ultracentrifugacion a 90,000 x g . El LPS precipitado fue disuelto en 2 mL de agua desionisada y fue secado por congelación .

Preparación de PS. El PS es preparado a partir de LPS secado por congelación de los dos serotipos de Actinobacillus pleuropneumoniae, los cuales son esencialmente como se describe en los ejemplos 6 y 7 para salmonella PS. Se esperó que las producciones de PS estuvieran en el rango de 1 0 a 40% , comparada con la cantidad de LPS de partida. Ejemplo 11 Análisis UV de conjugados AQ-PS. Se puede utilizar espectroscopia UV para analizar el contenido de AQ, ADN y proteína del PS. El contenido de ADN puede ser medido a 260 nm y el contenido de proteína a 280 nm , mientras que el contenido AQ puede ser medido a 260 nm , 280 nm, y 330 nm (ver "Métodos Espectroscópicos en Química Orgánica" (Spectroscopic Methods in organic chemistry), 3era. ed. , página 31 , D. H . Williams y I . Fleming, McGraw-Hill (RU) 1 980) . Brevemente el AQ-PS es disuelto en agua ultrapura hasta una concentración final de 0.5 mg/mL. El espectro UV es medido desde 200 hasta 400 nm con agua ultrapura sola como la referencia. La Figura 1 0, muestra un perfil UV típico de AQ-PS derivado de Salmonella Typimurium, mientras que la Figura 1 1 muestra un perfil UV típico de AQ-PS derivado de Salmonella Choleraesuis. Ejemplo 1 2 Conjugación de H-pAla- Ala-(CH2)3-N HCO-AQ ¦ HCI para PS derivado procedente de Salmonella Typhimurium. Recuperación seguida del amortiguador de acoplamiento y soluciones de reactivos preparadas recientemente: Solución 1: 1mM de succinimida N-hidroxi en DMSO (6 mg de succinimida N-hidrox¡ disuelta en 50 ml_ de DMSO). Solución 2: 2 rmM de WSC en agua ultrapura (10 mg de WSC disuelta en 25 ml_ de agua). Solución 3: 2 mM de grupo reportero en agua ultrapura (para 24 mg de H-pAla-pAla-(CH2)3-NHCO-AQ ¦ HCI disuelto en 25 mL de agua). Amortiguador: amortiguador de carbonato de hidrógeno de Sodio, pH 8.0 (carbonato de hidrógeno de sodio (8.4 g) se disuelve en agua ultrapura y el pH se ajusta a 8.0 con 1M de HCI acuoso). Se pesó el PS derivado de Salmonella Typhimurium (50 mg) en un matraz con fondo redondo. Se agregó la solución 1 (3.13 mL) seguida de la adición de la solución 2 (1.56 mL), solución 3 (1.56 mL) seguida del amortiguador (6.25 mL). La solución aclarada resultante es agitada durante la noche a una temperatura de 4°C. La mezcla de reacción es dializada subsecuentemente contra agua ultrapura durante tres días a una temperatura de 4°C, cambiando el agua ultrapura cada día y liofilizada finalmente durante un día hasta obtener el conjugado PS-AQ en la forma de un sólido blanco. La preparación puede incluir el conjugado AQ-LPS así como también depende de la cantidad de LPS intacto en la preparación PS. Producción: 83%; análisis UV: A(260 nm): 1.11; A(280): 0.57; A(330 nm): 0.17. Ejemplo 12a: Conjugación de H-pAla- pAla-(CH2)3-NHCO-AQ HCI para PS derivado de Actinobacillus pleuropneumoniae serotipo 5b. Las soluciones de la 1-3 son como se describieron en el ejemplo 12.

Se pesó el PS derivado del Actinobacillus pleuropneumoniae 5b (App5b) (2 mg, 0.025 mmol - procedente del ejemplo 10) en un matraz de fondo redondo. Se agregó la solución 1 (0.125 mL) seguida de la adición de la solución 2 (0.063 mL), la solución 3 (0.063 mL) seguida del amortiguador (0.25 mL). La solución aclarada resultante es agitada durante la noche a una temperatura de 4°C. La mezcla de reacción es dializada subsecuentemente contra agua ultrapura durante tres días, cambiando el agua ultrapura una vez al día. La solución PS-AQ es liofilizada durante un día, por lo que se obtiene el conjugado PS-AQ en la forma de un sólido blanco. Las preparaciones pueden incluir cantidades menores de conjugado AQ-LPS, así como también depender de la cantidad de LPS intacto en la preparación PS. Ejemplo 13 Conjugación de H-pAla-pAla-(CH2)3-NHCO-AQ · HCI para PS derivado de Salmonella Choleraesuis. Se pesó el PS derivado de Salmonella Choleraesuis (50 mg) en un matraz de fondo redondo. Se agregó la solución 1 (3.13 mL) seguida de la adición de la solución 2 (1.56 mL), la solución 3 (1.56 mL) seguida del amortiguador (6.25 mL). La solución aclarada resultante es agitada durante la noche a una temperatura de 4°C. La mezcla de reacción es dializada subsecuentemente contra agua ultrapura durante tres días a una temperatura de 4°C, cambiando el agua ultrapura cada día, y es liofilizada finalmente durante un día hasta obtener el conjugado PS-AQ en la forma de un sólido blanco. La preparación puede incluir el conjugado AQ-LPS así como también depender de la cantidad de LPS intacto en la preparación PS. Producción: 66%; análisis UV: A (260 nm): 1 .29; A (280 nm) : 0.58; A (330 nm): 0.1 5. Ejemplo 14 Conjugación de H-pAla-pAla-(CH2)3-NHCO-AQ · HCI para PS derivado procedente de Salmonella Infantis. Se pesó el PS derivado de Salmonella Infantis (2 mg) en un matraz de fondo redondo. Se agregó la solución 1 (0.1 25 mL) seguida de la adición de la solución 2 (0.063 mL), la solución 3 (0.063 m L) seguida del amortiguador (0.25 mL) . La solución aclarada resultante es agitada durante la noche a u na temperatura de 4°C. La mezcla de reacción es dializada subsecuentemente contra agua ultrapura d urante tres días a una temperatura de 4°C , cambiando el agua ultrapura cada día, y es liofilizada finalmente durante un día hasta obtener el conjugado PS-AQ en la forma de un sólido blanco. La preparación puede incluir el conjugado AQ-LPS así como también depender de la cantidad de LPS intacto en la preparación PS. Ejemplo 1 5 Análisis SDS-PAGE de AQ-PS. Se puede utilizar SDS-PAGE visualizado mediante tinción de plata para analizar el conjugado AQ-PS para la cantidad de conjugado AQ-LPS presente. Las preparaciones AQ-PS son probadas mediante SDS-PAGE, tal como se describió en el Ejemplo 3. La Figura 1 2 m uestra un resultado típico procedente de dos preparaciones de Salmonella Choleraesuis AQ-PS.

Ejemplo 16 Determinación de Ensayo de ELISA Competitivo de epítopes inm unogénicos en AQ-PS y AQ-LPS. La presencia de epítopes inmunogénicos intactos en diferentes preparaciones AQ-PS ó AQ-LPS puede ser determinada mediante el Ensayo de ELI SA competitivo en una microplaca recubierta con LPS. Por lo tanto, las preparaciones AQ-PS/AQ-LPS diferentes son probadas ompetición e tal como se describió en el ejemplo 5, mediante la incubación de una serie de dilución de dos ompetic del AQ-PS/AQ-LPS junto con el anticuerpo de detección . La placa es tratada y leída tal y como se describe en el ejemplo 5. El resultado de este ompetic fue que las cantidades en aumento de AQ-PS agregadas a las placas, dio como resultado ompetición de señales debido a la ompetición en aumento a través del AQ-PS agregado para el anticuerpo. Esto indicó que la antigenicidad de LPS y PS aú n se conserva en AQ-PS . Ejemplo 17 Acoplamiento Fotoquímico de AQ-PS y AQ-LPS para microplacas de poliestireno. Procedimiento general. Los conjugados liofilizados de AQ-PS/AQ-LPS son disueltos en agua ultrapura hasta una concentración final de 1 mg/mL. Estas soluciones de existencia de los conjugados tienen esta habilidad a largo plazo (más de tres meses) cuando son almacenadas a una temperatura de 4°C y protegidas de la luz directa. Antes del fotoacoplamiento, las soluciones de existencia son diluidas en un 0.1 M de solución de MgCI2 en agua desmineralizada. La concentración final óptima de cada conjugada individual, el pH du rante el fotoacoplamiento y la presencia de sales orgánicas deben ser determinados de manera individual para cada aplicación (ver ejemplos 1 8 y 19). Las soluciones de fotoacoplamiento muy diluidas deben ser protegidas cuidadosamente contra la luz solar directa . Las soluciones diluidas de los conjugadas a cada depósito de una microplaca de poliestireno (1 00 µ?/depósito). La placa es colocada debajo de una fuente de luz UV apropiada y es subsecuentemente irradiada con luz UV durante 20 minutos. Las fuentes de luz UV recomendadas son Philips HPA 400 (la lámpara emite luz UV-A y UV-B de poca energía principalmente entre 300 y 400 nm (WO 96/31557)) o tubos fluorescentes Philips 25W-S que emiten luz UV entre 31 0 y 400 nm con una salida de energía máxima en 345 nm. Las condiciones óptimas para la irradiación UV, así como el tiempo de irradiación (ver ejemplo 20) , deben ser optimizadas dependiendo de la fuente de luz UV y del equipo utilizado. Después de la irradiación UV la placa es aspirada, lavada con agua desmineralizada (3x300 µ?) y finalmente secada a una temperatura de 37°C durante 30 minutos. Las placas secas deben ser almacenadas a temperatura ambiente en la oscuridad. Ejemplo 1 8 Efecto de la concentración del conjugado AQ-PS/AQ-LPS en la eficiencia del fotoacoplamiento. El AQ-PS/AQ-LPS procedente de Salmonella Thyphimurium o Salmonella Choleraesuis es inmovilizada en diferentes concentraciones sobre las microplacas, con el objeto de determinar la eficiencia de la irradiación UV para inmovilizar los conjugados. Elaboración de una solución en existencia de conjugado de AQ-PS/AQ-LPS derivada de Salmonella Typhimorium y Salmonella Choleraesuis, tal como se describe en el ejemplo 17, y se diluye cada conjugado en tubos separados hasta una concentración final de 1000, 750, 500, 250 y 100 ng/mL y Salmonella Typhimorium y 1000, 750, 500, 250 y 100 ng/mL de Salmonella Choleraesuis. Como control negativo se utiliza 0.1 M de MgCI. Se agregan las cinco soluciones individuales de los conjugados de Salmonella Typhimurium a la columna 1-2, 3-4, 5-6, 7-8, y 9-10 de una microplaca de poliestireno (100 µ/depósito) y se agrega 0.1 M de MgCI a la columna 11-12. Se agregan las cinco soluciones individuales de los conjugados de Salmonella Choleraesuis a la columna 1-2, 3-4, 5-6, 7-8 y 9-10 de una microplaca de poliestireno (100 µ/depósito) y se agrega 0.1 M de MgCI a la columna 11-12. Se colocan las microplacas debajo de la fuente de luz UV y se irradian durante 20 minutos. Después de la irradiación de UV se aspira la placa, se lava con agua desmineralizada (4x300 µ?) y se prueba directamente sin secado. Se agrega el suero de cerdo de referencia de Salmonella Typhimurium positiva diluido en PBS, Tween, BSA (1:400) a cada depósito de las filas A-B, el suero de cerdo de referencia de Salmonella Typhimurium negativa es diluido en PBS, Tween, BSA (1:400) para cada depósito de filas C-D de la primera placa (100 µ?/depósito). Se agrega el suero de cerdo de referencia de Salmonella Choleraesuis diluido en PBS, Tween, BSA (1:400) a cada depósito de las filas A-B, se diluye el suero de referencia de cerdo de Salmonella Choleraesuis negativa en PBS , Tween , BSA (1 :400) para cada depósito de las filas C-D, de la segunda placa (1 00 µ?/depósito). Se incuban a temperatura ambiente con agitación leve durante 60 minutos, se aspiran y se lavan todos los depósitos con PBS-Tween (3?300µ?) . Se agrega un IgG anticerdo de conejo etiquetado con H RP (DAKO P0164) diluido en PBS, Tween , BSA (1 :2000) para cada depósito. Se incuba durante 60 minutos a temperatura ambiente con agitación leve, se lavan los depósitos y se agrega la solución de substrato-OPD a cada depósito de la placa ( 1 00 µ?/depósito). La placa se incuba durante 20 minutos en la oscuridad y se detiene la reacción de enzimas mediante la adición de 0.5 M H2S04 (1 00 µ?/depósito). Se leen los resultados en un lector de Ensayo de ELISA a 492 nm. La figura 1 5 muestra un resultado típico utilizando un AQ-PS derivado de Salmonella Typhimurium, en la figura 16 muestra un resultado típico utilizando un AQ-PS derivado de Salmonella Choleraesuis. Ejemplo 19 Efecto de las sales inorgánicas y pH en la eficiencia de fotoacoplamiento de los conjugados AQ-PS/AQ-LPS. Se elabora el siguiente amortiguador y las soluciones de sal utilizando agua desmineralizada: 0.1 M de NaCI, 0.1 de KCI, 0.1 M de LiCI, 0.1 M de MgCI2 y PBS con un pH de 7.2. Se elabora una solución de existencia del conjugado AQ-PS derivado de Salmonella Typhimurium y Salmonella Choleraesuis tal como se describe en el ejemplo 17, y se diluye cada conjugado en tubos separados que contienen los diferentes amortiguadores y sales de solución hasta una concentración final de 5 µ?/?t?? de Salmonella Typhimurium y 10 µ9/?t??_ de Salmonella Choleraesuis. Como referencia se elaboran dos soluciones de los conjugados en agua desmineralizada como controles. Se agregan las soluciones individuales de los conjugados de Salmonella Typhimurium a la columna 1-6 de una microplaca de poliestireno (100 µ?/depósito) y los conjugados de Salmonella Choleraesuis a la columna 7-12 (100 µ?/depósito). Se coloca la microplaca debajo de la fuente de luz UV y se irradia durante 20 minutos. Después de la irradación de UV se aspira la placa, se lava con agua desmineralizada (4x300 µ?) y se prueba directamente sin secado. Se agrega el suero de cerdo de referencia de Salmonella Typhimurium positiva diluido en PBS, Tween, BSA (1:400) a cada depósito de las filas A1-C6, suero de cerdo de referencia de Salmonella Typhimurium diluida en PBS, Tween, BSA (1:400) a cada depósito de las filas D1-F6, suero de cerdo de referencia de Salmonella Choleraesuis diluido en PBS, Tween, BSA (1:400) a cada depósito de las filas A7-C12, suero de cerdo de referencia de Salmonella Choleraesuis negativa diluida en PBS, Tween, BSA (1:400) a cada depósito de las filas D7-F12, y PBS, Tween, BSA solo en las filas G y H (100 µ?/depósito). Se incuba a temperatura ambiente con agitación suave durante 60 minutos, se aspiran y se lavan todos los depósitos con PBS-Tween (3x300 µ?) y se agrega un IgG de anticerdo de conejo etiquetado con HRP (DAKO P0164) diluido en PBS, Tween, BSA (1:2000) a cada depósito de las filas A1 a la G12. Se incuba durante 60 minutos a temperatura ambiente con agitación leve, se aspiran los depósitos y se agregan una solución de substrato OPD a cada depósito de la placa (100 µ?/depósito). Se incuba la placa durante 20 minutos en la oscuridad y se detiene la reacción de enzima mediante la adición de 0.5 M de H2S04 (100 µ?/depósito). Se leen los resultados en un lector de Ensayo de ELISA a 492 nm. La figura 17 muestra un resultado típico utilizando AQ-PS derivado de Salmonella Typhimurium y la figura 18 muestra un resultado típico utilizando un AQ-PS derivado de Salmonella Choleraesuis. Ejemplo 20 Efecto del tiempo de irradiación en la eficiencia de fotoacoplamiento de los conjugados AQ-PS/AQ-LPS. El AQ-PS/AQ-LPS procedente de Salmonella Typhimurium o Salmonella Choleraesuis, es inmovilizado en las microplacas con el objeto de determinar el tiempo de irradiación de UV para inmovilizar los conjugados. Se agrega a la placa una solución diluida del conjugado AQ-PS/AQ-LPS (Salmonella Typhimurium y Salmonella Choleraesuis) diluida en 0.1M de MgCI2. Se agrega a la plata 0.1M de MgCI como control negativo la placa (tiras) es irradiada con UV durante periodos de tiempos diferentes. Después de la irradiación de UV la placa es lavada con agua desmíneralizada (4x300 µ?) y es probada directamente sin secado. Se agrega suero de cerdo de Salmonella Typhimurium positiva y suero de cerdo Salmonella Choleraesuis positiva diluida en PBS-Tween (1:400) a la placa (100 µ?/depósito). La placa es incubada a temperatura ambiente con agitación leve durante 60 minutos. La placa es lavada tres veces con PBST (300 µ?/depósito). Se agrega a la placa como un anticuerpo secundario Ig antiratón de conejo conjugado para HRP (PO260, Dako) diluido en 1:2000 en PBST. La placa es incubada durante una hora con agitación. La placa es lavada tres veces con PBST (300 µ?/depósito). Se agrega una solución de OPD-H202 a la placa (100 µ?/depósito). La placa es incubada durante 20 minutos en la oscuridad. La reacción de enzima se detiene mediante la adición de 0.5 de ácido sulfúrico (100 µ?/depósito). La placa se lee a 492nm en un lector de Ensayo de ELISA. La figura 19 muestra un resultado típico utilizando un conjugado AQ-PS derivado de Salmonella Typhimurium y un conjugado AQ-PS derivado de Salmonella Choleraesuis. Ejemplo 21 Prueba Serológica de un suero de cerdo en AQ-PS fotoacoplado derivado de Salmonella Typhimurium. El PS procedente de Salmonella Typhimurium conjugada para AQ, es inmovilizado en microplacas de poliestireno a través del siguiente método. El conjugado PS-AQ de Salmonella Typhimurium es disuelto en agua ultrapura. Las soluciones deben ser omitidas de la luz. Una alícuota de solución de conjugado PS-AQ Salmonella Typhimurium se diluye adicionalmente en 0.1 de MgCI2 con el objeto de obtener una concentración óptima. La solución diluida de Salmonella Typhimurium PS-AQ es agregada a las microplacas (100 µ?/depósito). Las placas son irradiadas en luz Uv durante 20 minutos. Después de la irradiación, las placas son lavadas para el siguiente procedimiento. La solución del conjugado PS-AQ de Salmonella Typhimurium es descargada y se agregan 300 µ? de agua utilizando un lavado. Las microplacas son lavadas subsecuentemente tres veces en agua (3?300µ?). Las microplacas son secadas a una temperatura de 37°C durante 30 minutos. Las microplacas se dejan equilibrar a temperatura ambiente durante 1 5 minutos antes de empacarlas o de usarlas posteriormente. Las placas deben ser almacenadas a temperatura ambiente. Para el suero de uso serológico y/o jugo gástrico se investigan las muestras procedentes de cerdos. El procedimiento de ensayo dice utilizado es un Ensayo de ELISA indirecto tal como se indica a continuación. Se prueba un panel apropiado del suero de referencia en cada placa en forma paralela a las muestras del espécimen . Las muestras del espécimen o suero de referencia (1 00 diluidos en PBS, Tween , BSA, se agregan a cada depósito. La placa es incubada durante una hora con agitación leve. La placa es lavada en PBS, Tween (3x300 µ?). El anticuerpo secundario conjugado para HRP (IgG anticerdo de conejo HRP, P0164, Dako) (100 µ???ß??ß??) diluido en PBS , Tween , BSA, se agrega a cada depósito. La placa es incubada durante una hora con agitación leve. La placa es lavada en PBS, Tween (3x300 µ?) . La solución OPD (100 µ?/?ß??ß???) se agrega a la placa. La placa es incubada durante de 20 a 25 minutos dependiendo de que tan rápido los controles alcanzan los valores OD adecuados. La reacción de enzimas se detiene mediante la adición de 100 µ? de 0.5 M de ácido sulfúrico. La placa es agitada en forma manual y se lee a 492 nm sobre un vector de Ensayo de ELI SA. Los resultados se muestran en la figura 20. Como se observa en la figura, los sueros del 1 al 5 son Salmonella negativa, mientras que los sueros del 6 al 15 son positivos para Salmonella Typhimurium.

Ejemplo 24 Pruebas serológicas utilizando polisacáridos de lipopolisacáridos acoplados en forma covalente: mezcla A de polisacáridos de Salmonella acoplados. En un experimento comparativo se recubrieron las placas con una mezcla de polisacáridos de Salmonella Typhimurium y Salmonella Choleraesuis tal como se describe anteriormente (mezcla covalente-ELISA) y se compararon con las placas recubiertas de manera convencional ("mezcla-Elisa" (Nielsen 1995)) con el LPS completo procedente de los mismos dos serotipos de Salmonella. Se utilizaron cuatro sueros de Salmonella Typhimurium positiva, dos de Salmonella Infantis positiva y una de Sa/mone//a-negativa, como el suero de referencia para calibrar las lecturas OD procedente de cada placa ELISA, exactamente igual que como se describió anteriormente (Nielsen 1995). La mezcla-ELISA covalente se llevó a cabo tal como se publicó anteriormente en el protocolo ix-ELISA (Nielsen et al. 1995), excepto que se omitió el paso de bloqueo (con albúmina de suero de bovino, BSA). El suero fue diluido en 1:400 en PBS, Tween, BSA. Se aplicaron e incubaron durante una hora a temperatura ambiente sin agitación duplicados de 100 µ? de cada suero. Posteriormente las placas fueron lavadas en PBS, T y subsecuentemente fueron incubadas con IgG anticerdo de conejo conjugado por HRP (P0164, DAKO), se lavaron como se indicó anteriormente y se agregaron 100 µL· de una solución de substrato OPD a cada depósito y se incubaron de 10 a 5 minutos. La reacción se detuvo con 100 µ?_ H2S04 y la densidad óptica se leyó en 490 nm, substrayendo 650 nm (corrección del procedimiento). Para probar las placas recubiertas con AQ-PS, se utilizó un panel de 20 sueros con reactividad conocida en el sistema mezcla-ELISA (20 sueros procedentes de cerdos de manadas en reproducción). En la figura 21 se muestra un resultado típico. Cuando se utiliza un corte a 10% de OD, todo el suero permanece en el mismo grupo de positivos o negativos, cuando están siendo probados en ELISA AQ-PS y mezcla-ELISA respectivamente. El nivel de OD de las muestras de baja respuesta se correlacionaron bien entre los dos sistemas. Para las muestras positivas se observó una ligera reducción en el Ensayo de ELISA-AQ-PS para algunas de las muestras, pero esta característica varió con los días. Ejemplo 25 Capacidad de reproducción de AQ-PS mezclado fotoacoplado derivado de Salmonella Typhimurium y Salmonella Choleraesuis. La capacidad de reproducción de las micropiacas inmovilizadas de AQ-PS ha sido investigada durante un período más largo. Las micropiacas han sido inmovilizadas con AQ-PS mezclado derivado de Salmonella Typhimurium y Salmonella Choleraesuis, tal como se describe anteriormente. El suero de referencia ha sido agregado a las placas en 16 duplicados en cada placa. Este procedimiento ha sido repetido en cuatro placas cada día, durante un período de cuatro días. Los resultados fueron normalizados contra un suero de referencia de control. La variación intraplaca se midió en 7.7%, mientras que la variación interplaca se midió en 5.1%.

Ejemplo 26 Estabilidad de almacenamiento de AQ-PS mezclado fotoacoplado derivado de Salmonella Typhimurium y Salmonella Choleraesuis. La estabilidad de almacenamiento de las placas de Ensayo de ELISA-AQ-PS mezcladas de Salmonella Typhimurium y Salmonella Choleraesuis, es un factor importante que se debe investigar. U na estabilidad para un largo almacenamiento, proporciona una placa que es independiente de los procedimientos de recubrimiento antes de utilizarse, y proporciona u na placa que muestra variaciones m ínimas dentro del mismo lote, así como entre lotes. La estabilidad de las microplacas inmovilizadas PS-AQ ha sido investigada durante u n período de varios meses. Las placas fueron preparadas tal como se describe en el ejemplo 23 y fueron almacenadas a temperatura ambiente en la oscuridad, y posteriormente las placas fueron probadas utilizando un panel de suero de referencia dirigido contra antígenos-0 de Salmonella Typhimurium o Salmonella Choleraesuis en PS/LPS durante un período de 71 días. Los resultados se observan en la figura 22. Tal como se puede observar en la fig ura 22, las placas fueron estables durante por lo menos 71 días. Ejem plo 27 Detección de niveles de infección de manadas de cerdos utilizando una prueba Serológica basada en AQ-PS mezclado fotoacoplado derivado de Salmonella Typhimurium y Salmonella Choleraesuis. Las microplacas fotoacopladas con AQ-PS mezclado derivado de Salmonella Typhimurium y Salmonella Choleraesuis, han sido investigadas para uso serológico. Para la vigilancia serológica de manadas de cerdos, es de gran importancia lograr una microplaca estandarizada con variaciones mínimas con el objeto de lograr una respuesta confiable y reproducible en cada ensayo. Para obtener esto, se tienen que producir placas con las cualidades descritas anteriormente. Se investigó un panel de suero de 59 manadas de cerdo convencionales (1 0 sueros de cada manada) utilizando una mezcla fotoacoplada de Salmonella Typhimurium y Salmonella Choleraesuis PS tal como se describe en el ejemplo 26. El resultado de este análisis fue comparado con el resultado del análisis de las mismas muestras en un "mezcla-ELISA" recubierto de manera convencional (Nielsen 1995) utilizando LPS procedente de los dos mismos tipos de Salmonella. Las manadas fueron clasificadas por tener una baja prevalencia de Salmonella basada en la mezcla-ELISA y basada en los principios del programa de vig ilancia de Salmonella Danish (Mousing J , Jensen PT, Halgaard C, Bager F , Feld N , Nielsen B , Nielsen J P, Bech-N ielsen S: 1997, Vigilancia y control de Salmonella entérica de diversas especies en manadas de cerdos de sacrificio Danish Prev. Vet. Med . 29: páginas 247-261 .) El procedimiento de Ensayo de ELISA utilizado en un Ensayo de ELISA indirecto, es como se indica a continuación. Se probó un panel apropiado de suero de referencia en cada placa , paralela a las muestras del espécimen. Las muestras de espécimen o el suero de referencia (1 00 diluidos en PBS, Tween , BSA, se agregaron a cada depósito. La placa es incubada durante una hora (el uso de agitación durante la incubación puede mejorar la proporción de P/N entre las muestras positivas y negativas.) La placa es lavada en PBS, Tween (3x300 µ?). El anticuerpo secundario conjugado para HRP (IgG anticerdo de conejo HRP, P0164, Dako) (100 diluido en PBS, Tween, BSA (1:2000), es agregado a cada depósito. La placa es incubada durante una hora con agitación suave. La placa es lavada en PBS, Tween (3x300 µ?). La solución OPD (100 se agrega a la placa. La placa es incubada durante de 20 a 25 minutos dependiendo de que tan rápido los controles alcanzan los valores OD apropiados. La reacción de la enzima es detenida mediante la adición de 100 µ\- de 0.5 M de ácido sulfúrico. La placa es agitada en forma manual y es leída a 492 nm en un lector ELISA. Únicamente 4 de 590 muestras fueron positivas en el ensayo fotoacoplado, manteniendo la clasificación de todas las manadas por tener una baja prevalencia de Salmonella, tal como se encontró también con el "mezcla-ELISA" convencional. Ejemplo 28 Detección de bacteria Salmonella Typhimurium utilizando una prueba de ELISA competitiva basada en AQ-PS mezclado fotoacoplado derivado de Salmonella Typhimurium y Salmonella Choleraesuis. Las microplacas fotoacopladas con AQ-PS mezcladas derivadas de Salmonella Typhimurium y Salmonella Choleraesuis, pueden utilizarse como un Ensayo de ELISA antígeno para la detección de la bacteria de Salmonella o antígeno de Salmonella. La detección de la bacteria de Salmonella en alimentos o en el ambiente, tiene un gran potencial. La detección de la bacteria de Salmonella puede ser llevado a cabo mediante el uso de Salmonella Typhimurium y Salmonella Choleraesuis de AQ-PS mezclado fotoacoplado, en la forma de un Ensayo de ELISA competitivo a través del sigu iente procedimiento. Las muestras de las bacterias se agregaron a las placas en dilusiones de dos dobleces, diluidas en PBS (50 µLdepósito) . Como en la forma de un control, el PBS se agregó (sin muestras de bacterias) a las placas (50 Se agregó a la placa un anticuerpo monoclonal (50 diluido en PBS, Tween , BSA, dirigido contra el serotipo de Salmonella relevante. En la forma de un control negativo se agregó el anticuerpo monoclonal a un depósito con PBS. En la forma de un control positivo se agregó PBS, Tween , BSA al depósito con PBS. La placa es incubada du rante una hora con agitación leve. La placa es lavada en PBS, Tween (3x300 µ?) . Se agregó a cada depósito el anticuerpo secundario conjugado para H RP (IgG antiratón de conejo H RP, PO260, Dako) (1 00 diluida en PBS, Tween , BSA. La placa es incubada durante una hora utilizando agitación. La placa es lavada en PBS, Tween (3x300 µ?), asegurando que todos los depósitos estén llenos durante cada lavado. Se ag regó a la placa una solución OPO (100 La placa es incubada durante de 20 a 25 minutos, dependiendo de que tan rápido los controles alcancen los valores OD apropiados. La reacción de la enzima es detenida mediante la adición de 1 00 µ? de 0.5 de ácido sulfúrico. La placa es agitada en forma manual y leída a 492 nm en un lector ELISA. Los depósitos con anticuerpo monoclonal (son calculados como con respuesta al 1 00%) . Los depósitos con PBS , Tween, BSA (son calculados como con respuesta del 0%) . La respuesta OD de los depósitos con muestras de bacterias son calculados en relación a los controles positivos y negativos. La disminución de la respuesta es proporcional al incremento en la positividad de la muestra. La titulación se calcula a partir de la curva de titulación. La titulación es el factor de dilución de la solución bacterial que conduce a una disminución del 50% en el valor OD comparado con el valor OD obtenido sin antígeno de competencia (respuesta del 100%). Ejemplo 29 Conjugación de biotina para PS derivado de Salmonella Typhimurium. Preparar el siguiente amortiguador de acoplamiento y las soluciones de reactivos preparadas recientemente: Solución 1: 1mM de succinimida N-hidroxi en DMSO (6mg de succinimida N-hidroxi disuelto en 50 mL de DMSO). Solución 2: 2mM de WSC en agua ultrapura (9.6 mg de WSC disuelto en 25 mL de agua). Solución 3: 2mM de biotina-amina en agua ultrapura (19 mg disueltos en 25 mL de agua). Amortiguador: Amortiguador de carbonato de hidrógeno de Sodio, de pH 8.0 (carbonato de hidrógeno de Sodio (8.4 g) es disuelto en agua ultrapura y el pH se ajusta a 8.0 con 1M de HCI acuoso). La solución aclarada resultante es agitada durante la noche a una temperatura de 4°C. La mezcla de reacción es dializada en forma subsecuente contra agua ultrapura durante 3 días cambiando el agua ultrapura cada día. El conjugado de PS-biotina finalmente es liofilisado durante la noche. El conjugado de PS-biotina liofilizado es disuelto en agua ultrapura hasta una concentración final de 1mg/ml_. La solución de existencia del conjugado PS-biotina tiene una estabilidad a largo plazo (más de tres meses), cuando es almacenada a una temperatura de 4°C y protegida de luz directa. Las soluciones de existencia son diluidas en PBS pH 7.2, 1:100 y 1:400. Las soluciones diluidas de PS-biotina son agregadas a una microplaca (100 µ?/ ???e???) recubierta con estreptavidin (Pierce). En la forma de un control, se agregaron soluciones diluidas de PS (1:100 y 1:400 en PBS) a la microplaca (100 La placa es incubada durante una hora con agitación. La placa es lavada tres veces con PBST (300 µ?/depósito). Se agrega a la placa un anticuerpo monoclonal contra Salmonella Typhimurium LPS (cadena-O) (S9, HyTest Ltd.) en una dilución de dos dobleces (diluida en PBST) 100 µ?/depósito. La placa es incubada durante una hora con agitación. La placa es lavada tres veces con PBST (300 µ?/depósito). Se agregó a la placa Ig antiratón de conejo en la forma de un anticuerpo secundario conjugado para HRP (PO260, Dako) diluido 1:2000 en PBST. La placa es incubada durante una hora con agitación. La placa es lavada tres veces con PBST (300 µ?/depósito). Se agrega una solución de OPD-H202 a la placa (100 µ?/depósito). La placa es incubada durante 20 minutos en la oscuridad. La reacción de enzima es detenida mediante la adición de 0.5 M de ácido sulfúrico (100 µ?/depósito). La placa es leída a 492 nm en un lector ELISA. Los resultados se observan en la figura 23. Tal como se observa en la figura 23, únicamente el PS conjugado por biotina enlaza a la placa de estreptavidin.

Ejemplo 30 Pruebas clínicas utilizando polisácaridos de lipopolisacáridos acoplado en forma covalente: Polisacáridos de Actinobacillus de pleuropneumoniae seroti po 5b acoplado. Los polisacáridos derivados de Actinobacillus de pleuropneumoniae de serotipo 5b (App5b) tal como se describe anteriormente (Ejemplo 10), son derivados con AQ tal como se describe para Salmonella PS en el Ejemplo 1 2a, y son subsecuentemente acoplados a inmunoplacas de PolySorp de Nunc, tal como se describe anteriormente (Ejemplo 1 7) . Las placas de microtritu racion fueron acopladas en forma covalente con el conjugado PS-AQ APP 5b en una dilución de dos dobleces desde 500 ng hasta 0.98 ng PS-AQ por depósito. Se aplicó a las placas un suero positivo y uno negativo para APP 5b diluida en 1 :400 en PBS-T. Las placas fueron incubadas durante 1 hora . Las placas fueron lavadas 3 veces en PBS-T y fueron subsecuentemente incubadas con un anticuerpo secundario (Ig de anti-cerdo de conejo H RP-conjugado) . Las placas fueron incubadas durante 1 hora y subsecuentemente lavadas 3 veces en PBS-T. Las placas fueron desarrolladas con OPD. En la figura 24 se muestran los resultados. La figura muestra que el lipopolisacárido de la Actinobacillus de pleuropneumoniae serotipo 5b derivado de polisacárido, puede ser conjugado para AQ y acoplado en forma covalente a una superficie de microplaca. La antigenicidad se retuvo ya q ue las placas recubiertas con antígeno PS-AQ mostraron una respuesta similar a la de las placas LPS recubiertas en forma pasiva. El Actinobacillus es una bacteria Gram-negativa de la familia HAP y por lo tanto no está relacionada en forma taxomomica con las deformaciones de la Salmonela. Esto indica que el LPS procedente de la bacteria Gram-negativa en general puede ser convertida de manera exitosa a los conj ugados PS-AQ . Ejemplo 31 Pruebas clínicas utilizando polisacáridos de lipopolisácarido acoplado en forma covalente: Polisacáridos de Actinobacillus de pleuropneumoniae serotipo 6 acoplado. Los polisacáridos derivados de Actinobacillus de pleuropneumoniae serotipo 6, tal como se describe anteriormente (Ejemplo 10) son derivados con AQ tal como se describió para Salmonela PS en los Ejemplos 12 y 13, y son acoplados subsecuentemente a inmunoplacas Polysorp de Nunc tal como se describió anteriormente (Ejemplo 1 7). Esta superficie es comparada con una superficie convencional preparada mediante adsorción completa de LPS procedente de la misma deformación de Actinobacillus de pleuropneumoniae (AP) en un Ensayo de ELISA de competición utilizando un anticuerpo policlonal como el anticuerpo de detección y un bloqueo mediante suero de cerdo definido en los depósitos. Brevemente, el Ensayo de ELI SA se lleva acabo tal como sigue a continuación: La concentración óptima del antígeno LPS Ap6, suero y conjugado de enzima son determinados mediante trituraciones en el tablero de revisión en las placas ELISA. Las microplacas son recubiertas con LPS diluido en 1 : 1 0.000 en PBS y son incubados durante la noche a una temperatura de 4°C. Las placas son bloqueadas con PBS con 0.05% de Tween 20 y con 1 % de albúmina de suero de bovino (PBS, T, BSA) durante 30 minutos a temperatura ambiente (RT). Los sueros de prueba son diluidos en 1 : 10 en PBS, T, BSA y son agregados a los depósitos en duplicado e incubados durante 1 hora a temperatura ambiente. Sin vaciar las placas, se agrega suero de conejos de las placas diluido en 1 :8000 durante 30 min utos a temperatura ambiente. Posteriormente las placas son incubadas con inmunoglobina anti-conejo de cerdo conj ugada con peróxidasa (Dako, Copenhagen , Dinamarca) diluida en 1 : 1000 en PBS, T, BSA. El o-fenilenediamina-H202 de la solución de substrato-tinte se deja hacer reacción du rante 1 5 minutos, y la reacción se detiene mediante la adición de 0.5 M de H2S0 . La densidad óptica a 490 nm es medida con 650 nm como la referencia. La densidad óptica de las filas que contienen PBS, T, BSA sin suero, se utiliza para él calculo del porcentaje de inhibición a través de los sueros individuales. El tiempo de dilución e incubación para el suero de prueba y para el suero de conejo, son ajustados para producir de 0 a 25% de in hibición con sueros negativos y de 80 a 100% con sueros positivos. Se espera que los resultados muestren que el polisacárido derivado de Ap puede ser acoplado en forma covalente a la superficie de microplaca mientras se detiene su antigenicidad , y que muestre un comportamiento de bloq ueo comparable o mejor al del LPS completamente recubierto en forma no covalente de manera convencional. Ejemplo 32 Conjugación de H2N-(CH2)3-NHCO-AQ HCI para KDO Se disolvió KDO (1 0 mg , 40µ????), H2N-(CH2)3-N HCO-AQ · HCI (7 mg, 20 µ????) y BOP (21 mg, 48 µ????) en DMSO. Posteriormente, se agregó trietil amina (17 µ? , 1 20 µ????) y la solución aclarada se agitó a temperatura ambiente durante 60 horas. Se agregó agua (40 m L) a la mezcla de reacción seguida de un secado por congelación . La mezcla del producto sólido fue disuelta/suspendida nuevamente en agua (1 mL) y se agregó a una colum na SeppPak C18 (1 m L)que había sido equilibrada previamente con acetonitrilo (7 mL) y agua (7 mL). La columna fue diluida con agua ( 1 0 m L) y posteriormente agua/acetonitrilo (10 mL, 1 : 1 V/V) . La primera fracción acuosa contenía principalmente KDO en exceso y otras impurezas, mientras q ue la segunda fracción de agua/acetonitrilo contenía el conjugado AQ-KDO. El TLC ( 1 -butanol/ácido acético/agua 4: 1 : 1 ): Rf = 0.33. MS (MALDI-TOF) : 545.8 (M H+ + H20) . Ejemplo 33 Se establece un método para estimar el número de bacterias específica, elaboración de serotipo de bacteria o detección de antígeno (LPS/PS), mediante el uso de microplacas inmovilizadas AQ-PS. Se agrega a las placas en una dilución de dos dobleces una solución de bacteria o una solución de antígeno (LPS/PS) . Se agrega a la placa un anticuerpo monoclonal contra Salmonela Tífimurium o Salmonela Choleraesuis diluida en PBS, Tween, BSA . La placa es incubada durante una hora con agitación suave. La placa se lava 3 veces con PBS, Tween , Se agrega a la placa un IgG antí-ratón de conejo conjugado para H RP (PO260. Dako) dilu ida en PBS, Tween , BSA (1 ??µ?/?ß??e???). La placa es incubada d urante una hora con agitación suave. La placa es lavada 3 veces con PBS, Tween (300 L/depósito) . Se agrega a la placa (1 OO^L/depósito) una solución de OPD. La placa es incubada durante 20 minutos en la oscuridad . La reacción se detiene mediante la ad ición de 0.5M de H2S0 (1 00 L/depósito). La placa se lee a 492 nm en un lector de Ensayo de ELISA. Este método proporciona la detección de pequeñas cantidades de bacterias en fluidos biológicos y proporciona la determinación de un serotipo de la bacteria.

Claims

REIVI N DICAC ION ES 1 . - Un método para inmovilizar un polisacárido (PS) para una superficie sólida, teniendo dicho polisacárido un grupo ceto-carboxi (-C(=0)-COOH) o un grupo cetal o hemicetal correspondiente al mismo), en donde el método comprende los pasos de: a) formar un enlace covalente entre el grupo carboxi del polisacárido y una molécula reportadora (RM) , formando de este modo u n conjugado de molécula reportadora-polisacárido (PS-RM), comprendiendo dicha molécula reportadora un sitio de reconocimiento/substrato; y b) inmovilizar el conjugado de molécula reportadora-polisacárido (PS-RM) formando un enlace específico entre el sitio de reconocimiento/substrato de dicha molécula reportadora y un sitio de recepción/reactivo de la superficie sólida. 2. - Un método para inmovilizar un polisacárido (PS) para una superficie sólida, teniendo dicho polisacárido un grupo ceto-carboxi (-C(=0)-COOH) o un grupo cetal o hemicetal correspondiente al mismo), formando un enlace covalente entre el grupo carboxi del polisacárido y una función qu ímica enlazada a la superficie sólida . 3. - Un método de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, en donde el grupo ceto-carboxi del polisacárido es una parte de una unidad de monosacárido KDO (ácido 2-ceto-3-deoxi-D-manno-octónico) del polisacárido. 4. - Un método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el polisacárido (PS) es substancialmente idéntico a la parte de carbohidrato de un lipopolisacárido bacterial Gram-negativo (LPS). 5. - Un método de conformidad con la reivindicación 4, en donde el polisacárido es obtenido mediante hidrólisis selectiva del enlace cetal entre la parte del núcleo interno y la parte del lípido A de un lipopolisacárido bacterial Gram-negativo. 6. - Un método de conformidad con la reivindicación 1 ó 3, en donde el polisacárido comprende adicionalmente la parte de lípido de un lipopolisacárido bacterial Gram-negativo, constituyendo de este modo un lipopolisacárido bacterial. 7. - Un método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones de la 4 a la 6, en donde el lipopolisacárido bacterial es derivado de una bacteria seleccionada de la bacteria Gram-negativa, que son patógenos humanos o veterinarios, por ejemplo enterobacteria, bacteria respiratoria, bacteria urogenital, y bacteria neuropatogenica. 8. - Un método de conformidad con la reivindicación 7, en donde la bacteria es una bacteria orzoonotica patógena veterinaria que incluye enterobacterias seleccionada de Escherichia coli, Salmonela Tipimurium, Salmonela Choleraesuis, Salmonela entérica, y todos los serotipos de las mismas, especialmente Salmonela Tipimurium, Salmonela Enteritidis, Salmonela Choleraesuis, Salmonela Manhattan, Salmonela Dublin, Salmonela Infantis, Escherichia coli spp., incluyendo 0157, enfermedad de oedema que origina Escherichia coli, Yersinia enterocolitica, y Campilobacter jejuni. 9. - Un método de conformidad con la reivindicación 7, en donde la bacteria es una bacteria respiratoria seleccionada del grupo HAP de bacteria especialmente Actinobacillus sp, en particular Actinobacillus pleuropneumoniae, Haemofilus somnus, Pasteurella haemolitica, Pasteurella multocida, Haemofilus parasuis y Mannheimia sp de bacteria HAP. 10. - Un método de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, en donde el polisacárido tiene un peso molecular de por lo menos 1000. 11. - Un método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 y de la 3 a la 10, en donde la formación del enlace covalente entre el polisacárido y la molécula reportadora es mediada utilizando un reactivo de acoplamiento. 12. - Un método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones de la 2 a la 10, en donde la formación del enlace covalente entre el polisacárido y la función química de la superficie sólida es mediada utilizando un agente de acoplamiento. 13. - Un método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 y de la 3 a la 11 , en donde la molécula reportadora comprende una parte reportera para presentar el sitio de reconocimiento/substrato y una parte enlazadora para el enlace de la parte reportera al polisacárido. 14. - Un método de conformidad con la reivindicación 13, en donde el conjugado de molécula reportadora-polisacárido (PS-RM) tiene la fórmula general PS'-C(=0)-N(RN)-F-L-R, en donde PS'-C(=0) es el polisacárido, N(RN)-F es el grupo directamente involucrado en enlace covalente entre el polisacárido y la molécula reportadora, RN designa hidrógeno o alquilo de Ci-4, L es la parte enlazadora de la molécula reportadora, y R es la parte reportera de la molécula reportadora. 15. - Un método de conformidad con la reivindicación 14, en donde -N-F-designa amino (-N-), anilino (-N-Ph), hidrazido (-N-C(=0)-), semicarbazido (-N-C(=0)-NH-), tiosemicarbazido (-N-C(=S)-NH-), o hidrazino (-N-NH-), preferentemente amino. 16. - Un método de conformidad con la reivindicación 14, en donde L designa un biradical seleccionado de alquileno C 2Q que comprende opcionalmente hidrocarburos aromáticos o mono-/poliinsaturados o hidrocarburos cíclicos, oligo-oxietilenos, oligo-amidas tales como oligo-glicina, oligo-alanina, oligo-lisina y oligopéptidos en general, oligo-fosfodiésteres, oligo-fosfoamidatos, oligo-fosfodiamidas, oligo-sulfoésteres, y oligo-sulfonamidas. 17. - Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 y de la 3 a la 16, en donde la molécula reportadora tiene un peso molecular de hasta 10,000, preferentemente de hasta 5,000, en particular de hasta 2,500. 18. - Un método de conformidad con la reivindicación 14, en donde la parte reportera es un grupo fotoquímicamente reactivo. 19.- Un método de conformidad con la reivindicación 14, en donde la parte reportera es un grupo termoquímicamente reactivo. 20. - Un método de conformidad con la reivindicación 14, en donde la parte reportera es una parte de un par definida. 21. - Un método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la superficie sólida es una superficie de un polímero orgánico, un vidrio, silicio, óxido de silicio, (sílice) o un material de compuesto de los mismos. 22. - Un método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dos o más tipos de polisácaridos son inmovilizados, en donde dichos tipos representan diferentes serotipos bacteriales. 23. - Un método de conformidad con cualesqu iera de las reivind icaciones de la 4 a la 22, en donde el LPS del cual el PS se deriva, es LPS procedente de una bacteria de Salmonela y la molécula reportadora comprende una parte reportera seleccionada de antraquinonas y biotina, preferentemente antraquinona. 24. - Un método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones de la 4 a la 22, en donde el LPS del cual el PS se deriva, es LPS procedente de una bacteria de Actinobacillus y la molécula reportadora comprende una parte reportera seleccionada de antraquinonas y biotina, preferentemente antraquinona. 25. - Una superficie sólida que se puede obtener de acuerdo con el método definido en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 24. 26. - El uso de una superficie sólida tal como se define en la reivind icación 25 en un ensayo de diagnóstico. 27.- El uso de conformidad con la reivindicación 26, en donde el ensayo de diagnóstico es un ¡nmunoensayo de fase sólida. 28.- El uso de conformidad con la reivindicación 26, en donde el ensayo de diagnóstico es un ensayo serológico, por ejemplo, un ensayo serológico para la detección de anticuerpos contra microorganismos. 29. - El uso de conformidad con la reivindicación 26, en donde el ensayo de diagnóstico es un ensayo serológico para la detección de anticuerpos contra Salmonela spp. 30. - El uso de conformidad con la reivindicación 26, en donde el ensayo de diagnóstico es un ensayo serológico para la detección de anticuerpos contra Actinobacillus spp. 31. - Un aparato de ensayo para la detección de anticuerpos contra una o más bacteria Gram-negativa, que comprende una superficie sólida que tiene inmovilizado en la misma un polisacárido (PS), correspondiendo dicho polisacárido (PS) a la parte de carbohidrato del lipopolisacárido bacterial (LPS) de la bacteria Gram-negativa, a través del grupo de ácido carboxílico de una unidad de monosacárido KDO de dicho polisacárido. 32. - Un aparato de ensayo de conformidad con la reivindicación 31, en donde el polisacárido es inmovilizado para la superficie sólida de acuerdo con el método definido en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 24. 33. - Un método para estimar el número de bacterias o para generar el serotipo del antígeno bacterial en una muestra, en donde el método comprende toda la bacteria, partes olizatos de la misma, en donde se utiliza el aparato de ensayo de conformidad con la reivindicación 31 ó 32. 34. - Un compuesto de la fórmula general I (o en el caso en donde R2 es hidrógeno, opcionalmente el análogo ceto del mismo) en donde es una molécula reportadora L-R, en donde L es una parte enlazadora opcional de la molécula reportadora, y R es una parte reportera de la molécula reportadora; RN es seleccionada de hid rógeno y alquilo F es seleccionado de un solo enlace, fenileno, carbonilo (C(=0)), carbinilimino (C(=0)-N H-), tiocarbonilo ((C(=S)) e ¡mino (-NH-); R2, R7, R8 son seleccionados cada uno independientemente de hidrógeno y grupos de protección hidroxi; R4 es seleccionado de hidrógeno, un residuo mono-odisacárido y un grupo de protección hidroxi; y R5 es seleccionado de hidrógeno, un "residuo de polisacárido protegido opcionalmente por un grupo funcional" y un grupo de protección h idroxi. 35.- Un compuesto de conformidad con la reivindicación 34, en donde R1 es L-R. 37.- Un compuesto de conformidad con la reivindicación 34, en donde -N-F- designa amino (-N-), anilino (-N-Ph) , hidrazido (-N-C(=0)-), semicarbazido (-N-C(=0)-NH-), tiosemicarbazido (-N-C(=S)-NH-), o hidrazino (-N-NH-) , preferentemente amino. 37.- Un compuesto de conformidad con la reivindicación 34, en donde L designa un biradical tal como se define en la reivindicación 16. 38. - Un compuesto de conformidad con la reivindicación 36, en donde la molécula reportadora R tiene un peso molecular de hasta 10,000, preferentemente de hasta 5,000 y más preferentemente de hasta 2,500. 39. - Un compuesto de conformidad con la reivindicación 33, en donde R4 es seleccionado de KDO-2-ilo, 4-fosfoetanolamina-KDO-2-ilo, L-rapnocil- (1->4)-KDO-ilo, y KDO-(2-<4)-KDO-ilo. 40. - Un compuesto de conformidad con la reivindicación 34, en donde el residuo polisacárido comprende preferentemente de 2 a 997 unidades de monosacárido enlazadas, tales como por lo menos 7, por ejemplo de 7 a 997 unidades de monosacárido enlazadas en particular por lo menos 22, por ejemplo de 22 a 497 unidades de monosacárido enlazadas, siendo el residuo polisacárido opcionalmente no substituido en forma estequiométrica. 41. - Un compuesto de conformidad con la reivindicación 34, para la preparación de un aparato de ensayo para la detección de anticuerpos contra la bacteria Gram-negativa. 42. - Un compuesto de conformidad con la reivindicación 34, para la preparación de una superficie sólida que transporta un polisacárido inmovilizado. 43.- Un método para la preparación de un compuesto de la fórmula general I, tal como se define en la reivindicación 34, que comprende la reacción de un compuesto de la fórmula general III. en donde R2, R4, R5, R6 R7 y R8 son como se definió en la reivindicación 34, con un compuesto de nitrógeno de la fórmula general IV, H-N(RN) -F1R1 en donde R1 , F y RN son como se definió en la reivindicación 34; y desprotegiendo opcionalmente en forma total o parcial el producto obtenido de este modo, con el objeto de obtener un compuesto de la fórmula general I . 44.- Un método de conformidad con la reivindicación 43, en donde el compuesto de la fórmula general I I I , se utiliza en su forma de éster activado. 45.- Un método de conformidad con la reivindicación 43, en donde la reacción entre el compuesto de ácido carboxílico de la fórmula general I I I , y el compuesto de nitrógeno IV, es facilitado utilizando un reactivo de acoplamiento.