DE69926053T2

DE69926053T2 - Verfahren zur Herstellung von Säugetier-Zellinien

Info

Publication number: DE69926053T2
Application number: DE69926053T
Authority: DE
Inventors: Serge Braun; Frederic Peraud
Original assignee: Transgene SA
Current assignee: Transgene SA
Priority date: 1999-04-27
Filing date: 1999-04-27
Publication date: 2006-04-27
Anticipated expiration: 2019-04-28
Also published as: AU3012400A; CA2307108A1; ES2241246T3; EP1048725B1; ATE299178T1; JP2001000184A; AU772042B2; US6555377B1; EP1048725A1; DE69926053D1; DK1048725T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen Verfahren zur Herstellung von Säuger-Zelllinien, insbesondere menschlichen Zelllinien und vorzugsweise menschlichen Muskel-Zelllinien, durch dieses Verfahren hergestellte Zelllinien und die Anwendungen dieser Zelllinien, insbesondere in der Gentherapie.
Zelllinien werden weithin als in-vitro-Modelle zur Untersuchung der Vorgänge, die während der Zell- oder Gewebeentwicklung eine Rolle spielen, verwendet. Zum Beispiel können Vorgänge bei der Muskelentwicklung während der Differenzierung der Muskel-Zelllinien reproduziert werden. Entsprechend wären permanente Säuger-Zelllinien, insbesondere menschliche Zelllinien, von erheblichem Wert für die Bereitstellung nützlicher Werkzeuge zur Analyse der molekularen und biochemischen zellulären Vorgänge, zur Identifizierung und Testung neuer Wirkstoffe für Erkrankungen von Säugern wie Dystrophien, für die Untersuchung der Myogenese etc..
Die Fähigkeit zur Etablierung bestimmter Zelllinien in Kultur, die weiterhin charakteristische Eigenschaften der Zellen in dem Gewebe, aus dem sie stammen, exprimieren, hätte offensichtliche Vorteile für die Untersuchung der Wirkungen von Wirkstoffen und potenziell toxischen Substanzen oder für die Entwicklung der zellulären Gentherapie. Viele, jedoch nicht alle Zelltypen wurden in Kultur vermehrt und einige behalten ihre ursprünglichen Charakteristika, obwohl viele ihren differenzierten Phänotyp nach kontinuierlicher Passage in Kultur verlieren. Die beiden wesentlichen Eigenschaften von Zelllinien sind ihre Fähigkeit, sich zu vermehren und zu differenzieren.
Viele Untersuchungen haben gezeigt, dass die Wirkung von verschiedenen Oncogenen ausreichend ist, um primäre Zellen in immortalisierte transformierte Zellen umzuwandeln. Zum Beispiel zeigten Fogel und Defendi, 1967, PNAS, 58, 967-973, dass menschliche Myoblasten für die Infektion mit Wildtyp-SV40 empfänglich waren und dass permanente Zelllinien nach Infektion hergestellt werden konnten; jedoch verloren diese schnell die Eigenschaft zur Differenzierung.
WO 92/17569 offenbart ein Verfahren zur Immortalisierung menschlicher Endothelzellen, worin die angehefteten Endothelzellen in einem Wachstumsmedium, enthaltend Hydrocortison, welches sie zum Wachstum benötigen, gezüchtet werden und sie werden durch die Einführung von DNA, welche das SV40-lange-T-Antigen codiert, immortalisiert.
EP-A1 802 257 offenbart eine immortalisierte Zelllinie epithelialer Kolonzellen. Die Zelllinie wird durch Bereitstellung einer Kultur primärer Epithelzellen des menschlichen Kolons, Infektion der Zellen mit einem rekombinanten Virus und Kultivieren der immortalisierten Zellen in einem Medium, das unter anderem Hydrocortison enthält, hergestellt.
WO 98/06827 offenbart ein Verfahren zur Immortalisierung von Zellen, in dem primäre tierische Nicht-Nager-Zellen durch Einführung einer p53 codierenden Nucleinsäure unter Kontrolle des Metallothionein-Promotors, transformiert werden.
Entsprechend ist der Stand der Technik nicht in der Lage, ein zufriedenstellendes Mittel zur Etablierung von unsterblichen Zelllinien vom Säuger und insbesondere vom Menschen bereitzustellen. Die vorliegende Erfindung erfüllt diese lang bestehende Notwendigkeit und den Wunsch im Fachgebiet.
Die vorliegende Erfindung stellt ein verbessertes Verfahren zur Etablierung einer Langzeit-Säuger-Zelllinie aus primären, aus Gewebebiopsie oder aus primärer Zellkultur isolierten menschlichen Myoblasten bereit, die insbesondere aus Muskelbiopsien von Patienten mit Duchenne-Muskeldystrophie sowie von normalen Dystrophin-positiven Individuen erhalten werden. Die erfindungsgemäß erhaltenen Zelllinien zeigen eine hohe proliferative Kapazität und können sich als wertvoll für in-vitro-Untersuchungen, betreffend die zellulären und molekularen Metabolismen, das Screening nach neuen Wirkstoffen oder für Verfahren zur Prüfung der zellulären Toxizität oder von Zellschädigungen erweisen.
Gemäß einer ersten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Verfahren die Schritte:

a) Herstellen einer Kultur aus den primären menschlichen Myoblasten,
b) Vorbehandeln der Kultur aus Schritt a) mit mindestens einem Glucocorticoid,
c) Herstellen einer Suspension der vorbehandelten Kultur aus Schritt b),
d) Transferieren von mindestens einem Nucleinsäurevektor, welcher nicht retroviralen Ursprungs ist und welcher in der Lage ist, die vorbehandelten Zellen zu immortalisieren, in die vorbehandelten Zellen der Suspension aus Schritt c), und
e) Kultivieren der transferierten Zellen aus Schritt d).

Gemäß einer zweiten Ausführungsform umfasst das Verfahren die Schritte:

a) Herstellen einer Kultur aus den primären menschlichen Myoblasten,
b) Herstellen einer Suspension der kultivierten primären menschlichen Myoblasten aus Schritt a),
c) Vorbehandeln der Suspension aus Schritt b) mit mindestens einem Glucocorticoid,
d) Transferieren von mindestens einem Nucleinsäurevektor, welcher nicht retroviralen Ursprungs ist und welcher in der Lage ist, die vorbehandelten Zellen zu immortalisieren, in die vorbehandelten Zellen der Suspension aus Schritt c), und
e) Kultivieren der transferierten Zellen aus Schritt d).

Gemäß der vorliegenden Erfindung sollte der Transferschritt an einer Zellsuspension durchgeführt werden. Entsprechend sollte das Verfahren im speziellen Fall, bei dem die kultivierten primären Säugerzellen aus Schritt a) nicht in Form einer Suspension vorliegen, einen spezifischen Schritt umfassen, der in der Herstellung einer Suspension kultivierter primärer Säugerzellen oder einer vorbehandelten Kultur davon besteht.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird die Zellsuspension extemporiert vor dem Transferschritt hergestellt.
„Suspension von Zellen" bedeutet, dass die Zellen nicht an einem festen Untergrund anhaften.
Verfahren zur Herstellung einer Suspension von Zellen werden in der Literatur offenbart und können eine Behandlung einer primären Säuger-Zellkultur oder von Gewebe durch mechanische Werkzeuge (Schaben, Zerdrücken, ...) oder durch chemische Behandlung mit mindestens einer Verbindung, die in der Lage ist, die Zellorganisation aufzulösen, zum Beispiel einem Enzym, ausgewählt aus einer Gruppe, bestehend aus Pancreatin, Kollagenase, Dispase, Trypsin, Hyaluronidase und Äquivalente davon, mit EDTA oder durch Veränderung der Temperatur (z. B. Behandlung bei 4°C) umfassen. Die Verbindung oder ihr Äquivalent umfasst alle natürlichen, modifizierten Verbindungen oder einen Teil der Verbindung oder des Enzyms, das immer noch in der Lage ist, die Zellorganisation aufzulösen und isolierte Zellen herzustellen, die leicht suspendiert werden können. Diese mechanischen oder chemischen Behandlungen werden weithin verwendet, wurden in der Literatur berichtet (Tissue dissociation Guide, Worthington Biochemical Corporation) und können vom Fachmann leicht erhalten oder angepasst werden.
Zum Beispiel kann die Zellorganisation durch aufeinanderfolgende Behandlungen mit Trypsin, zum Beispiel 0,05% Trypsin – EDTA bei 37°C in einer Trypsinierungsflasche unter konstantem Rühren dissoziiert werden. Die Zellen, die aus dem Überstand nach der Trypsinbehandlung gesammelt werden, werden vereinigt und auf Eis auf 4°C gekühlt. Kälberserum wird in einer Endkonzentration von 10% (Vol./Vol.) zugegeben, um weitere Proteaseaktivität zu beenden. Die dissoziierten Zellen werden dann zentrifugiert und das Zellsediment wird in konditioniertem Medium resuspendiert und entweder in Kultur ausplattiert, in flüssigem Stickstoff eingefroren oder dem erfindungsgemäßen Verfahren unterzogen. Gemäß einer speziellen Ausführungsform können die interessierenden primären Säugerzellen unter Verwendung eines im Fachgebiet weithin verwendeten Verfahrens der Anreicherung, wie Zellreinigung unter Verwendung monoclonaler Antikörper oder Vorplattierungsverfahren basierend auf Anheftungseigenschaften, auf mehr als 70%, vorzugsweise mehr als 90% und stärker bevorzugt mehr als 99% Reinheit angereichert werden.
Gemäß Schritt a) des Verfahrens wird eine Kultur primärer Säugerzellen hergestellt. Zellkulturverfahren werden weithin im erfindungsgemäßen technischen Gebiet verwendet und der Fachmann kann leicht die Medien und Wachstumsbedingungen angepasst an die verwendete anfängliche Probe primärer menschlicher Myoblasten auswählen.
Die Erfindung basiert auf einem spezifischen Schritt, umfassend eine Vorbehandlung der kultivierten primären menschlichen Myoblasten, letztendlich in Form einer Suspension, mit mindestens einem Glucocorticoid. Im Allgemeinen kann ein beliebiges Glucocorticoid im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. Repräsentative Beispiele nützlicher Glucocorticoide umfassen Dexamethason, Betamethason, Budesonid, Hydrocortison, Prednison, Prednisolon, Triamcinolon und Flunisolid. Das Glucocorticoid kann entweder in einer lipidlöslichen Form, einer ethanollöslichen Form oder einer wasserlöslichen Form vorliegen und kann weiterhin entweder ein synthetisches oder ein nicht-synthetisches Glucocorticoid sein.
Der Vorbehandlungsschritt besteht genauer ausgeführt darin, dass die kultivierten primären menschlichen Myoblasten oder eine Suspension davon mit mindestens einem Glucocorticoid in Kontakt gebracht werden. Diese Vorbehandlung primärer menschlicher Myoblasten kann mindestens 3 Stunden, vorzugsweise mindestens 24 Stunden und stärker bevorzugt mindestens 48 Stunden vor dem Transferschritt angewendet werden.
Die Glucocorticoidkonzentration im Schritt der Vorbehandlung der Zellen reicht von 10^–4 M bis 10^–10 M. Im spezifischen Fall, bei dem das Glucocorticoid Dexamethason oder Hydrocortison ist, sollte die Glucocorticoidkonzentration vorzugsweise im Bereich nahe 10^–6 M beziehungsweise 10^–5 M liegen.
Obwohl das erfindungsgemäße Verfahren gemäß einer spezifischen Ausführungsform mindestens eine Glucocorticoid-Vorbehandlung der Zellen vor dem Transferschritt umfassen sollte, ist es auch möglich, sich die Verwendung des Glucocorticoids in den Schritten der Herstellung der Zellsuspension oder des Transfers des Nucleinsäurevektors vorzustellen.
Ein anderer notwendiger Schritt des Verfahrens, das zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Säuger-Zelllinie führt, besteht in der Einführung eines Nucleinsäurevektors in die vorbehandelten Zellen, welcher in der Lage ist, die vorbehandelten Zellen zu immortalisieren.
„Nucleinsäuresequenzen, die in Lage sind, Zellen zu immortalisieren" bedeutet, dass aufgrund der Expression einer Nucleinsäuresequenz, die in der Lage ist, Zellen zu immortalisieren, die Zellen zum Wachstum in vitro für mindestens 100 Verdopplungen im Vergleich zur normalen Situation, in der nach 30 Verdopplungen Seneszenz auftritt, fähig sind, sie als unsterblich angesehen werden. Transformierende Oncogene sind zum Beispiel jene, welche Foci transformierter Zellen in einer einlagigen Zellschicht von NIH3T3-Zellen produzieren.
In der Literatur werden viele Beispiele solcher Nucleinsäuren bereitgestellt, die in der Lage sind, Zellen zu immortalisieren (Katakura et al., 1998, Methods Cell Biol., 57, 69-91). Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform, umfasst dieser Nucleinsäurevektor mindestens eine Nucleinsäuresequenz, codierend ein oncogenes Polypeptid, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus myc, SV40-T-Antigen, SV40-t-Antigen, Papillomaviren E6 und E7, Polyoma Large-T-Gen, EBV, ras, Adenovirus E1, p53 und oncogene Teile davon.
Um die Einführung und Expression der immortalisierenden Nucleinsäure in die Zielzelle zu erlauben, wird sie in einen Nucleinsäurevektor, umfassend genetische Elemente, die für die Expression des Nucleinsäuresequenz in der Zelle notwendig sind, eingebaut.
Erfindungsgemäß bedeutet „Nucleinsäurevektor" ein Nucleinsäurekonstrukt, das entweder eine DNA und/oder RNA, einzel- oder doppelsträngig, linear oder zirkulär, natürlich oder synthetisch, modifiziert oder nicht (vgl. US-A-5,525,711; US-A-4,711,955; US-A-5,792,608 oder EP-A-302,175 für Beispiele von Modifikationen), durch ein Fragment oder einen Teil einer Nucleinsäure ohne Größenbeschränkung definiert ist. Sie kann unter anderem eine genomische DNA, eine cDNA, eine mRNA, eine Antisense-RNA, ein Ribozym oder DNA, die solche RNAs codiert, sein. Der „Nucleinsäurevektor" kann in Form eines linearen Nucleinsäurekonstrukts und vorzugsweise in Form eines Plasmids sein. Gemäß der Erfindung sollte der „Nucleinsäurevektor" vorzugsweise als nacktes Nucleinsäurekonstrukt (Wolff et al., Science 247 (1990), 1465-1468) oder als ein Nucleinsäurekonstrukt, zubereitet mit mindestens einer Verbindung wie Polypeptide, vorzugsweise virale Polypeptide oder kationische Lipide oder kationische Polymere, die an der Aufnahme des Nucleinsäurekonstrukts in die Zelle beteiligt sein können (vgl. Ledley, Human Gene Therapy 6 (1995), 1129-1144 mit einer Übersicht) verstanden werden. Erfindungsgemäß sollte der „Nucleinsäurevektor" mindestens eine Nucleinsäuresequenz enthalten, die in der Lage ist, Zellen, die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren vorbehandelt wurden, zu immortalisieren. Da diese spezielle Sequenz mindestens ein Polypeptid codiert, das an der zellulären Immortalisierung beteiligt ist, sollte der „Nucleinsäurevektor" weiterhin Elemente enthalten, die für die Expression der Nucleinsäuresequenz notwendig sind. Transkriptionelle Promotoren, die für die Verwendung in verschiedenen Vertebratensystemen geeignet sind, sind wohlbekannt. Zum Beispiel umfassen geeignete Promotoren virale Promotoren wie RSV, MPSV, SV40, CMV oder 7.5k, Vaccinia-Promoter, induzierbare Promotoren, Metallothionein-Promotor, etc.. Gemäß einer bestimmten bevorzugten Ausführungsform können die für die Expression der Nucleinsäuresequenz notwendigen Elemente durch Glucocorticoid aktiviert werden (Geley et al., 1996, Review of Physiology, Biochemistry and Pharmacology, 128, 1-97). Der „Nucleinsäurevektor" kann weiterhin Intronsequenzen, Targetingsequenzen, Transportsequenzen und Sequenzen, die bei der Replikation oder Integration beteiligt sind, oder eine selektive Sequenz, die zum Beispiel eine Antibiotikaresistenz (Ampicillin, Phleomycin, Chloramphenicol, ...) codiert, beinhalten. Beispiele solcher Sequenzen wurden in der Literatur berichtet und sie können leicht vom Fachmann erhalten werden. Der „Nucleinsäurevektor" kann auch modifiziert werden, um mit spezifischen Komponenten wie Spermin stabilisiert zu werden.
Der Nucleinsäurevektor könnte weiterhin mindestens eine zweite Nucleinsäuresequenz, die ein therapeutisches oder prophylaktisches Polypeptid ganz oder teilweise codiert, umfassen. Beispiele solcher Polypeptide sind Enzyme, Hormone, Cytokine, Membranrezeptoren, zielgerichtete Polypeptide, Strukturpolypeptide, Transportpolypeptide, Tumorantigene, virale oder infektiöse Antigene, Adhäsine, Albumin, Liganden, Transkriptionsfaktoren, Translationsfaktoren, Replikationsfaktoren, Stabilisierungsfaktoren, Antikörper, E6 oder E7 aus HPV, MUC1, BRCA1, Interferone, Interleukin (IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-12), GM-CSF (Granulocyten-Macrophagen Kolonie-stimulierender Faktor), das tk-Gen aus Herpes Simplex Typ-1-Virus (HSV-1) oder VEGF. Die Nucleinsäuresequenz könnte Dystrophin ganz oder teilweise codieren. Weiterhin kann die DNA ein Polypeptid, welches ein Immunität übertragendes Polypeptid ist und als endogenes Immunogen fungiert, um eine humorale oder zelluläre Antwort, oder beides, gegen infektiöse Agenzien, einschließlich Viren, und auch gegen Tumorzellen hervorzurufen, ganz oder teilweise codieren. Ein „Immunität übertragendes Polypeptid" bedeutet, dass das Polypeptid, wenn es exprimiert wird, an einer Immunantwort in einem behandelten Patienten beteiligt sein kann. Das Polynucleotid kann auch einen Antikörper codieren. In dieser Hinsicht umfasst ein Antikörper ganze Immunglobuline jeglicher Klasse, chimäre Antikörper und Hybridantikörper mit dualen oder multiplen Antigen- oder Epitopspezifitäten und Fragmente wie F(ab)'₂, Fab', Fab einschließlich Hybridfragmente und Anti-Idiotypen (US-A-4,699,880).
Gemäß dem Transferschritt wird die Nucleinsäuresequenz oder weiter gefasst der Nucleinsäurevektor, umfassend die Sequenz, in eine vorbehandelte Zelle in Suspension durch eine beliebige einer breiten Vielfalt von Arten transferiert, einschließlich eines Verfahrens ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus Adenovirus-Infektion, Transfektion mit Nucleinsäure-beschichteten Partikeln wie Lipoplexen (kationische Lipid-/Nucleinsäurekomplexe) oder Polyplexen (kationische Polymer-/Nucleinsäurekomplexe) oder Ähnlichem, Calciumphosphat-Transfektion eines Plasmids, Transfektion mit nackter Nucleinsäure, Elektroporationsverfahren und/oder eine beliebige Kombination davon. Das bestimmte Verfahren zur Einführung der fremden Nucleinsäuresequenz ist für die Erfindung jedoch nicht entscheidend.
In einer bestimmten Ausführungsform wird der Transferschritt in Gegenwart von mindestens einem Glucocorticoid ausgeführt. Das in dem Transferschritt verwendete Glucocorticoid kann identisch oder verschieden von demjenigen sein, das im zellulären Vorbehandlungsschritt verwendet wurde.
Üblicherweise wird die Nucleinsäurekonzentration im Transferschritt im Bereich von 0,1 bis 100 μg/10⁶ Zellen ausgewählt.
Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt es, Zelllinien herzustellen, deren Zellen in einem Arzneimittel enthalten sein können. Die in dem Arzneimittel enthaltenen Zellen können verkapselt sein. Das Zelleinschlussverfahren, welches die Transplantation verkapselter Zellen in der Behandlung der Parkinsonschen Krankheit (Tresco et al., 1992, ASAIO J., 38, 17-23) oder der Amyotrophen Lateralsklerose (Aebischer et al., 1996, Hum. Gene Ther., 7, 851-860) erlaubt, wurde zuvor beschrieben. Gemäß der spezifischen Ausführungsform werden die Zellen durch spezifische Verbindungen verkapselt, die eine mikroporöse Membran bilden, und die eingeschlossenen Zellen können weiterhin in vivo implantiert werden. Kapseln von etwa 1 cm Länge, enthaltend die interessierenden Zellen, können unter Anwendung von mikroporösen Hohlmembranen, hergestellt aus Polyethersulfon (PES) (Akzo Nobel Faser AG, Wuppertal, Deutschland; Deglon et al., 1996, Hum. Gene Ther., 7, 2135-2146), hergestellt werden. Diese Membran hat eine Molekulargewichts-Ausschlussgrenze von mehr als 1.000.000 Da, was einen freien Durchtritt von Proteinen und Nährstoffen zwischen dem Kapselinneren und -äußeren erlaubt, während der Kontakt von transplantierten Zellen mit Wirtszellen verhindert wird. Die eingeschlossenen Zellen können auf intradermalen, subdermalen, intravenösen, intramuskulären, intranasalen, intracerebralen, intratrachealen, intraarteriellen, intraperitonealen, intravesikalen, intrapleuralen, intrakoronaren oder intratumoralen Wegen implantiert werden.
Entsprechend können die Zellen der gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Zelllinien wie oben beschrieben für die Herstellung einer Zusammensetzung zur Verabreichung in menschliches Gewebe verwendet werden. Solch eine hergestellte Zusammensetzung kann in einer Form zur Verabreichung in ein Gewebe von Vertebraten vorliegen. Diese Gewebe umfassen solche von Muskel, Haut, Nase, Lunge, Leber, Milz, Knochenmark, Thymus, Herz, Lymphe, Knochen, Knorpel, Bauchspeicheldrüse, Niere, Gallenblase, Magen, Darm, Hoden, Ovarien, Uterus, Rektum, Nervensystem, Auge, Drüsen, Bindegewebe, Blut, Tumor etc.. Die Verabreichung kann durch intradermale, subdermale, intravenöse, intramuskuläre, intranasale, intracerebrale, intratracheale, intraarterielle, intraperitoneale, intravesikale, intrapleurale, intrakoronare oder intratumorale Injektion mit einer Spritze oder anderen Vorrichtungen erfolgen. Außerdem wurde herausgefunden, dass Myoblastenzellen von der ursprünglichen Verabreichungsstelle zu anderen Stellen, insbesondere verletzten Stellen, z. B. degenerierenden Foci, migrieren. Dieses Migrationsphänomen erlaubt die Behandlung von verletzten Stellen durch Injektion von Myoblasten in den Patienten, der dies benötigt, insbesondere in Gewebe, üblicherweise Muskelgewebe, proximal zu den Verletzungen, obwohl eine Injektion in die Zirkulation oder an einer distalen Stelle auch möglich sein kann. Durch Anwendung von genetisch veränderten Myoblasten kann man eine zielgerichtete Verabreichung von interessierenden Produkten an die verletzte Region bereitstellen. Üblicherweise besteht die Zellinjektion aus etwa 10⁴ bis 10⁷ Zellen (modifiziert oder nicht) pro cm³ zu behandelndem Muskelgewebe. In diesem speziellen Fall kann die erfindungsgemäße Zusammensetzung auch einen pharmazeutisch verträglichen injizierbaren Träger umfassen. Der Träger ist vorzugsweise isotonisch, hypotonisch oder schwach hypertonisch und hat eine relativ geringe Ionenstärke, so wie sie von einer Saccharoselösung geliefert wird. Es umfasst ein beliebiges relevantes Lösungsmittel, einen wässrigen oder teilweise wässrigen flüssigen Träger umfassend steriles Pyrogen-freies Wasser, Dispersionsmedien, Beschichtungen und/oder Äquivalente. Das Arzneimittel wird auf einen geeigneten pH-Wert eingestellt und gepuffert.
Außerdem können die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Zelllinien in ein Diagnostik-Kit für die in-vitro-Untersuchung der muskulären zellulären Toxizität oder von Schäden von Wirkstoffkandidaten oder kommerziell erhältlichen pharmazeutischen Molekülen (vorklinische Tests) oder für das in-vitro-Screening neuer Wirkstoffe eingeschlossen werden. Die Zelllinien können auch als Werkzeug zur Analyse der Physiopathologie von zellulären Erkrankungen dienen.
BEISPIELE
Etablierung menschlicher Zelllinien aus (i) einem gesunden Spender und (ii) einem Patienten mit Duchenne-Muskeldystrophie durch das erfindungsgemäße Verfahren.
1. Materialien
Die Plasmid-DNA (pPHMT 1), die in den Transferschritten verwendet wird, enthält T- und t-Antigene codierende Regionen aus SV40 unter der Kontrolle des Maus-Metallothionein-II-Promotors. Das Selektionsgen ist das prokaryotische Phleomycin-Resistenzgen unter der Kontrolle des LTR-Promotors aus RSV.
2. Verfahren der Erfindung
a) Kultivieren primärer menschlicher Myoblasten
Myoblasten wurden aus Muskelbiopsien eines metabolisch gesunden Patienten nach orthopädischer Operation oder aus einem DMD-Patienten erhalten. Die Zellen werden aus Explantatkulturen geerntet und in Ham's F14 Medium (Life Technologies), versetzt mit 10% fötalem Kälberserum (Hyclone, Logan, UT), 10 g/ml Insulin, 10 ng/ml epidermalem Wachstumsfaktor (beides von Sigma), 10 ng/ml Basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (Pepro Tech, Rocky Hill, NJ), 2 mM Glutamin (bioMerieux, Marcy l'Etoile, Frankreich) und 40 g/ml Gentamycin (Schering Plough, Kenilworth, NJ) gezüchtet. Das Verfahren wird an Myoblasten durchgeführt, die nach maximal 12 Passagen gewonnen und auf mit 0,1% Gelatine beschichteten Schalen (100 mm Durchmesser) ausgesät (3000 Zellen/cm²) werden. Die Muskelzellen werden mittels Immuncytochemie auf Desmin, Dystrophin (NCL Anti-menschliches Dystrophin-monoclonale Antikörper, Novocastra) und ihre Fähigkeit, zu fusionieren und Myotuben zu bilden, charakterisiert. Der Anteil der Myoblasten in der Kultur, die für den nächsten Schritt des Verfahrens verwendet wird, liegt zwischen 70 und 90%.
b) Vorbehandlung der Kultur mit Dexamethason.
Zwei Tage vor dem Transfektionsschritt werden 5,10E5-Zellen in Schalen mit einem Durchmesser von 100 mm in Kulturmedium, versetzt mit 10⁶ M Dexamethason (Sigma), verdünnt in Ethanol, ausgesät.
c) Herstellung einer Suspension der vorbehandelten Kultur.
Die vorbehandelte Kultur wird einem Trypsinierungsschritt unter Verwendung einer 0,25%-igen Trypsinzubereitung unterzogen. Das Kulturmedium wird entfernt und die Zellen in einschichtiger Lage werden schnell mit wenigen ml der Trypsinzubereitung (Gibco) gespült. 0,5 ml der vorgewärmten (37°C) Trypsinzubereitung werden zugegeben. Der Trypsinierungsschritt wird für etwa 5 Minuten bei 37°C durchgeführt und wird durch Beobachtung der Zellen in der einlagigen Zellschicht mit dem Umkehrmikroskop überprüft. Die Zellen von allen Schalen werden durch Zentrifugation gesammelt und in 20 ml des Dexamethason enthaltenden Kulturmediums resuspendiert, mechanisch auseinandergerissen, um den Trypsinierungsschritt zu vervollständigen, und auf zwei sterile Röhrchen verteilt.
d) Calciumphosphat-Transfektionsschritt
1 ml des Calciumphosphat-Präzipitats (20 μg DNA/ml) wird in jedes Röhrchen gegeben und eine 100 mm-Kulturschale wird mit 11 ml des Transfektionsgemischs (Zellen + präzipitierte Plasmid-DNA) für etwa 24 Stunden bei 37°C, 5% CO₂ ausgesät.
Die transfizierten Zellen werden dann in einem Kulturmedium gemäß konventioneller Kulturverfahren gezüchtet. Die transfizierten Klone werden durch Zugabe von 50 g/ml Phleomycin nach 24 Std. selektioniert. Dexamethason wird ebenfalls bei jedem Austausch des Kulturmediums bis zur Selektion der Klone zugegeben. Die Selektion der Klone wird mittels Immunfluoreszenzfärbung durchgeführt.
Gemäß dieses Selektionsverfahrens werden die transfizierten Zellen in Lab-Tek Objektträgerkammern (Nunc, Naperville, IL, USA) für 2 Tage gezüchtet und mit Methanol-Aceton (1:1) für 10 Min. bei –20°C fixiert. Die Objektträger werden dann mit Anti-SV40-T-Antigen-Maus-monoclonaler-Antikörper (PAB-419; Chemicon) für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert, mit PBS-Puffer gespült und Kaninchen-anti-Maus-IgG FITC-konjugierte Antikörper (ICN ImmunoBiologicals, Lisle, IL, USA) werden anschließend für 1 Std. bei Raumtemperatur aufgebracht. Die Objektträger werden mit einer Lösung von Mowiol fixiert und unter einem Epifluoreszenzmikroskop (Nikon) untersucht.
3. Ergebnisse
Bei menschlichen Myoblasten ist die Unempfänglichkeit dieser Zellen (gesunde sowie mit DMD) für Transfektion ein großes Problem. Die Transfektionseffizienz ist sehr niedrig, wenn klassische Transfektionsverfahren verwendet werden (etwa 10^–7). Es konnte jetzt in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung gezeigt werden, dass die Kombination einer Glucocorticoid-Vorbehandlung von Zielzellen zusammen mit einem Transfektionsschritt an suspendierten Zellen die Herstellung von immortalisierten Klonen erlaubt (Effizienz 10^–5). Für menschliche DMD-Myoblasten wurden mehr als 15 Klone erhalten, von denen 3 im Hinblick auf ihre Fähigkeit zur Bildung von Myotuben ausgewählt wurden. Außerdem wurde beobachtet, dass um eine gute Proliferationsrate beizubehalten, die Klone vorzugsweise bei etwa 30% Konfluenz ausgesät werden sollten. Die isolierten Klone werden vorzugsweise in DMEM-Basalmedium, 20% SVF, Insulin, EGF, bFGF, Dexamethason und Zinksulfat gezüchtet.
Immunfluoreszenzuntersuchungen von Klonen zeigte die Expression von SV40-T-Ag in allen Zellen. Der natürliche Myoblastenmarker „Desmin" war ebenfalls vorhanden und einige der Klone waren in der Lage zu fusionieren.
Die Transfizierbarkeit der isolierten Zelllinien wurde auch durch Calciumphosphat-Transfektion unter Verwendung eines Plasmids, welches das Beta-Galactosidasegen (Beta-Gal) exprimiert, getestet.
Zwei der identifizierten Klone wurden effizient transfiziert: der Klon MyohTG1 (gesund) (CNCM N°I-2128) und MyohTGD24 (Duchenne) (CNCM N°I-2127), welche 1 bis 10% Beta-Gal exprimierende Zellen nach transienter Transfektion zeigten.
Diese beiden Klone sind in der Lage, sich zu vermehren, zu differenzieren und Eigenschaften zu exprimieren, die charakteristisch für Muskelzellen sind, und können effizient mit einem Nucleinsäurevektor, der nützlich für die Expression eines interessierenden Gens ist, in die Zellen transfiziert werden.
Die Klone MyohTG1 und MyohTGD24 wurden am 16. Februar 1999 bei der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur, 25, Rue du Docteur Roux, F-75724 Paris Cedex 15 hinterlegt und ihnen wurde die CNCM-Zugangsnummer I-2128 beziehungsweise I-2127 zugewiesen.

Claims

Verfahren zur Herstellung einer Säuger-Zelllinie aus primären menschlichen Myoblasten, umfassend die Schritte: a) Herstellen einer Kultur aus den primären menschlichen Myoblasten, b) Vorbehandeln der Kultur aus Schritt a) mit mindestens einem Glucocorticoid, c) Herstellen einer Suspension der vorbehandelten Kultur aus Schritt b), d) Transferieren von mindestens einem Nucleinsäurevektor, welcher nicht retroviralen Ursprungs ist und welcher in der Lage ist, die vorbehandelten Zellen zu immortalisieren, in die vorbehandelten Zellen der Suspension aus Schritt c), und e) Kultivieren der transferierten Zellen aus Schritt d).
Verfahren zur Herstellung einer Säuger-Zelllinie aus primären menschlichen Myoblasten umfassend die Schritte: a) Herstellen einer Kultur aus den primären menschlichen Myoblasten, b) Herstellen einer Suspension der kultivierten primären menschlichen Myoblasten aus Schritt a), c) Vorbehandeln der Suspension aus Schritt b) mit mindestens einem Glucocorticoid, d) Transferieren von mindestens einem Nucleinsäurevektor, welcher nicht retroviralen Ursprungs ist und welcher in der Lage ist, die vorbehandelten Zellen zu immortalisieren, in die vorbehandelten Zellen der Suspension aus Schritt c), und e) Kultivieren der transferierten Zellen aus Schritt d).
Verfahren nach den Ansprüchen 1 oder 2, wobei die Suspension hergestellt wird durch die Behandlung der kultivierten primären menschlichen Myoblasten oder der vorbehandelten Kultur mit mindestens einer Verbindung, die in der Lage ist, Zellorganisation aufzulösen.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Verbindung ein Enzym ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Pancreatin, Collagenase, Dispase, Trypsin, Hyaluronidase und Äquivalenten eines davon.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Glucocorticoid Dexamethason, Betamethason, Budesonid, Hydrocortison, Prednison, Prednisolon, Triamcinolon oder Flunisolid ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Glucocorticoid in einer lipidlöslichen Form, einer ethanollöslichen Form oder einer wasserlöslichen Form vorliegt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Glucocorticoid ein synthetisches oder ein nicht-synthetisches Glucocorticoid ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Vorbehandlung darin besteht, die Kultur aus primären menschlichen Myoblasten oder eine Suspension davon mit mindestens einem der Glucocorticoide in Kontakt zu bringen.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Vorbehandlung mindestens 3 Stunden, bevorzugt mindestens 24 Stunden und vorteilhafter Weise mindestens 48 Stunden vor dem Transferschritt durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, wobei die Glucocorticoid-Konzentration im Vorbehandlungsschritt im Bereich von 10^–4 M bis 10^–10 M liegt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei der Nucleinsäurevektor, der in der Lage ist, Zellen zu immortalisieren, mindestens eine Nucleinsäuresequenz enthält, die ein oncogenes Polypeptid codiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus myc, SV40 T-Antigen, SV40 t-Antigen, Papillomaviren E6 und E7, Polyoma Large T-Gen, EBV, ras, Adenovirus E1, p53 und oncogene Teile eines davon.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei der Nucleinsäurevektor ferner Elemente umfasst, die zur Expression der Nucleinsäuresequenz notwendig sind.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Elemente, die zur Expression der Nucleinsäuresequenz notwendig sind, durch Glucocorticoide aktivierbar sind.
Verfahren nach den Ansprüchen 12 oder 13, wobei der Nucleinsäurevektor ein Plasmid ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 14, wobei der Nucleinsäurevektor ferner eine zweite Nucleinsäuresequenz umfasst, die ein vollständiges oder Teile eines therapeutischen oder prophylaktischen Polypeptids codiert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die Nucleinsäuresequenz, die in der Lage ist Zellen zu immortalisieren, in vorbehandelte Zellen der Suspension transferiert wird durch ein Verfahren, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus viraler Infektion, kationischer Lipid- oder kationischer Polymertransfektion, Calciumphosphatransfektion, Elektroporation und Kombinationen dieser.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei der Transferschritt in Gegenwart von mindestens einem Glucocorticoid durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei die Nucleinsäurekonzentration im Transferschritt im Bereich von 0,1 bis 100 μg/10⁶ Zellen liegt.