-
Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Kultivieren von
Hepatozyten. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren für die effiziente Primärkultur
und das Subkultivieren von Hepatozyten, die als Forschungsmaterial
in den Bereichen Zellbiologie und Molekularbiologie für Entwicklungs-, Differenzierungs- und Vermehrungsprozesse
von Hepatozyten oder deren karzinogene Mechanismen oder als medizinisches
Material zur Entwicklung therapeutischer Techniken für verschiedene
Lebererkrankungen von Nutzen sein können.
-
Ein
Tier ist ein vielzelliger Organismus, der durch wiederholte Teilung
eines befruchteten Eis und Differenzierung zu verschiedenen Strukturen
(Zellanhäufungen),
die verschiedene Funktionen erfüllen, entsteht.
Jede den Körper
eines Organismus bildende Struktur erhält das Individuum durch Erzeugung von
Zellen mit aktiver Differenzierungsfähigkeit durch ständige Teilung
und Wachstum einzelner Zellen. Um daher die biologischen Fakten
in Bezug auf Tiere und Menschen zu verstehen oder therapeutische
Techniken durch Erhellung der karzinogenen Mechanismen zu entwickeln,
wird die Durchführung
einer detaillierten Analyse der Zellen, die einzelne Strukturen
bilden, als wichtig angesehen, um die Entwicklungs- und Differenzierungsprozesse
sowie die Vermehrungsmechanismen durch zellbiologische oder molekularbiologische
Techniken zu klären.
-
Einige
Verfahren sind seit langem gut eingeführt: Ein Mittel für die detaillierte
Analyse der Zellen von Strukturen in vivo zum Kultivieren von in
vitro entnommenen Zellen und zur weiteren Teilung bzw. zum weiteren
Wachstum der kultivierten Zellen, um deren Überleben durch Subkulturen
zu gewährleisten.
Das Subkultivieren von Primärhepatozyten,
die aus erwachsenen Individuen isoliert wurden, wurde jedoch als
undurchführbar
angesehen, wenn Hepatozyten von Ratten und Mäusen verwendet werden. Dies
bedeutet, dass adhäsionsabhängige, ausgereifte
Hepatozyten beim Ablösen
von einem Kultursubstrat beim Subkultivieren schwer geschädigt werden
und dass diese Zellen des Weiteren nur schwer zum Wiederanwachsen
an ein Kultursubstrat veranlasst werden können, sodass es nicht möglich ist,
die Entwicklungs-, Differenzierungs- und Vermehrungsprozesse von
Hepatozyten im Subkultursystem zu studieren.
-
Die
Erfinder haben diese Schwierigkeit durch Entwicklung von Bestandteilen
u.dgl. in einem Kulturmedium überwunden
und somit ist ihnen das Subkultivieren von Primärzellen, die aus der Leber
einer erwachsenen Ratte isoliert wurden, gelungen, und dieses Kultivierungsverfahren
wurde bereits zum Patent angemeldet (japanische Patentanmeldung
Nr. 89056/1996).
-
Des
Weiteren haben die Erfinder Parenchymhepatozyten hergestellt, die über eine
klonale Wachstumsfähigkeit
verfügen
und bei denen das Vorhandensein von Lebervorläuferzellen angenommen wird,
deren Anwesenheit damals noch nicht bestätigt war, und sie haben ein
Verfahren zu deren Herstellung und ein Verfahren zu deren Subkultivierung
entwickelt, für
das die Erfinder ein Patent angemeldet haben (japanische Patentanmeldung
Nr. 21368611995).
-
Ferner
haben die Erfinder festgestellt, dass sich eine kleine Anzahl Hepatozyten
durch den Zusatz eines Kulturüberstands
(konditioniertes Medium: KM) von 3T3-Zellen zu einem Kulturmedium für Hepatozyten
oder durch Co-Kultivierung von Hepatozyten mit 3T3-Zellen auf effiziente
Weise vermehren lassen, und diese Kultivierungsverfahren wurden zum
Patent angemeldet (japanische Patentanmeldung Nr. 133985/1996).
-
Dementsprechend
liegt dieser Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes Verfahren
zum effizienten Kultivieren von Hepatozyten durch Spezifizierung
eines durch 3T3-Zellen herstellbaren, das Hepatozytenwachstum fördernden
Faktors und Anwendung dieses wachstumsfördernden Faktors bereitzustellen.
-
Als
Folge ihres gründlichen
Studiums zur Spezifizierung eines durch 3T3-Zellen herstellbaren, das
Hepatozytenwachstum fördernden
Faktors erkannten die Erfinder diesen erfindungsgemäßen Faktor
als Pleiotrophin.
-
Daher
betrifft die erste Ausführungsform
dieser Erfindung ein Verfahren zur Primärkultur von Hepatozyten, umfassend
das Kultivieren von Hepatozyten, die aus der Leber eines erwachsenen
Säugetiers isoliert
sind, enthaltend Pleiotrophin, fötales
Rinderserum und Nikotinamid oder ein Analoges, um die Primärkolonien
der Hepatozyten zu bilden.
-
Die
zweite Ausführungsform
ist ein Verfahren zum Subkultivieren von Hepatozyten, umfassend:
- (a) Kultivieren von Hepatozyten, die aus der
Leber eines erwachsenen Säugetiers
isoliert sind, in einem Medium enthaltend fötales Rinderserum und Nikotinamid
oder ein Analoges, um die Primärkolonien
der Hepatozyten zu bilden;
- (b) Ablösen
der Koloniezellen vom Medium durch Verwendung einer EDTA und Trypsin
enthaltenden Lösung
zum Dispergieren der Zellen;
- (c) Rekultivieren der dispergierten Hepatozyten in einem Medium
enthaltend Pleiotrophin, fötales Rinderserum
und Nikotinamid oder ein Analoges, zum Bilden von Sekundärkolonien
der Hepatozyten; und optional
- (d) Wiederholen der Schritte (b) und (c) zum Bilden mehrgenerierter
(multigenerated) Kolonien der Hepatozyten.
-
Die
dritte Ausführungsform
ist ein Verfahren zum Subkultivieren von Hepatozyten, umfassend:
- (a) Kultivieren von Hepatozyten, die aus der
Leber eines erwachsenen Säugetiers
isoliert sind, in einem Medium enthaltend Pleiotrophin, fötales Rinderserum
und Nikotinamid oder ein Analoges, um die Kolonien der Hepatozyten
zu bilden;
- (b) Ablösen
der Koloniezellen vom Medium durch Verwenden einer EDTA-Trypsin-Lösung zum
Dispergieren der Zellen;
- (c) Rekultivieren der dispergierten Hepatozyten im gleichen
Medium wie in Schritt (a), zum Bilden von Sekundärkolonien der Hepatozyten;
und optional
- (d) Wiederholen der Schritte (b) und (c) zum Bilden mehrgenerierter
(multigenerated) Kolonien der Hepatozyten.
-
Bei
bevorzugten Ausführungsformen
dieser Verfahren enthält
das Medium ferner Ascorbinsäure oder
ein Analoges und ist das Medium ein DMEM-Medium, enthaltend einen
Epidermis-Wachstumsfaktor (epidermal growth factor) und DMSO. Das bei
den erfindungsgemäßen Verfahren
verwendete Pleiotrophin liegt im Wesentlichen vorzugsweise in reiner
Form vor.
-
1 zeigt
das Resultat der Trennung von aus 3T3-Zellen abgeleiteten wachstumsfördernden Faktoren
durch eine Heparin-Sepharose-Säule. –: Absorptionsvermögen bei
280 nm;
:BrdU
eingearbeitet; ---: NaCl-Konzentration.
Der rechte Teil bezeichnet Proteine, die aus Röhrchen 5 und 9 auf SDS-PAGE
getrennt wurden.
-
2 zeigt
die Gelfiltrationschromatographie von Fraktion II, ermittelt durch
Heparin-Affinitätschromatographie. –: Absorptionsvermögen bei
280 nm;
:
das Hepatozytenwachstum fördernde
Aktivität.
Der rechte Teil bezeichnet Proteine, die aus Röhrchen 10 auf SDS-PAGE getrennt
wurden.
-
3 zeigt
den Grad der DNA-Synthese von Hepatozyten durch PTNs.
:
Aus 3T3-Zell-KM gereinigtes PTN; O: synthetisches Human-PTN; ☐:
rekombinantes Human-PTN;
:
synthetisches Human-Midkin.
-
Hepatozyten,
die der Primärkultur
gemäß dem ersten
Anspruch unterworfen werden sollen, können alle Zellen sein, die
die Leber eines erwachsenen Säugetiers
bilden, und solche Zellen können aus
der Leber eines Tiers nach einem dem Fachmann bekannten Verfahren
isoliert werden und anschließend
können
Zellen, die in einer mittels langsamer Zentrifugierung (50 G) ausgefällten Fraktion
enthalten sind, kultiviert werden. Für diese Kultur bedient sich
die erste Ausführungsform
eines Mediums, dem Pleiotrophin (PTN), fötales Rinderserum (FBS) und
Nikotinamid oder ein Analoges zugesetzt wurden. Vorzugsweise enthält das Medium
des Weiteren eine Ascorbinsäure
oder ein Analoges (zum Beispiel L-Ascorbinsäurephosphat).
-
Während also
gemäß einer
Ausführungsform
des Kultivierungsverfahrens gemäß der Anmeldung
nach dem bisher bekannten Stand der Technik (japanische Patentanmeldung
Nr. 133985/1996) Hepatozyten in einem gemischten Medium kultiviert werden,
das aus einem FBS und Nikotinamid oder ein Analoges enthaltendem
Medium als koloniebildende Bestandteile für Hepatozyten und einem KM von
3T3-Zellen als wachstumsförderndem
Faktor für Hepatozyten
besteht, ist das erfindungsgemäße Verfahren
dadurch gekennzeichnet, dass dem Medium nach der genannten Anmeldung
gemäß dem bekannten
Stand der Technik PTN anstelle eines KM von 3T3-Zellen zugesetzt
wird.
-
Die
Verbindung PTN ist ein Heparin-bindendes Protein und seine Wirkung
als Wachstumsfaktor und trophischer Faktor für Nervenzellen ist bekannt. Einige
Wissenschaftler haben über
seine Wirksamkeit bei der Förderung
der Teilung von Körperzellen wie
Fibroblasten, Endothelzellen, Epithelzellen usw. berichtet, aber
in anderen Berichten wird eine solche Wirkung in Abrede gestellt,
sodass die Wirkung von PTN auf Körperzellen
nicht nachgewiesen ist (The Journal of Biological Chemistry 267,
Nr. 36, S. 25889-25897, 1992). Insbesondere war seine physiologische
Wirksamkeit in Bezug auf Hepatozyten bisher nicht bekannt.
-
Die
Verbindung PTN ist im Handel als rekombinantes Human-PTN (R&D Systems Inc.)
erhältlich und
dieses kommerzielle Produkt kann auch bei dem erfindungsgemäßen Verfahren
zum Einsatz kommen. Mit Hilfe der nachstehend beschriebenen Isolierungs-
und Reinigungsverfahren kann PTN auch aus einem KM von 3T3-Zellen,
das in gleicher Weise aufbereitet wird wie in der früheren Patentanmeldung (japanische
Patentanmeldung Nr. 133985/1996), oder aus einem Kulturüberstand
von anderen tierischen Zellen hergestellt werden. Alternativ kann
von 3T3-Zellen abgeleitetes PTN hergestellt werden, indem ein Teil
einer bekannten Aminosäuresequenz von
PTN als Sonde zur Isolierung einer Codiersequenz von PTN aus einer
bestehenden cDNA-Bibliothek verwendet und diese Codiersequenz dann
in einem geeigneten Wirt-Vektor-System
ausgedrückt wird.
-
Das
Medium, dem PTN, FBS, Ascorbinsäure oder
ein Analoges und Nikotinamid oder ein Analoges als wesentliche Bestandteile
zugesetzt werden, ist vorzugsweise DMEM-Medium, welches Epidermis-Wachstumsfaktor
und DMSO enthält.
Der Epidermis-Wachstumsfaktor (EGF) und DMSO sind für eine Koloniebildung
nicht wesentlich, werden dem Medium jedoch wegen ihrer die Koloniebildung
fördernden
Wirkung bevorzugt zugesetzt. Eine durch Zentrifugieren bei niedriger
Drehzahl hergestellte Fraktion enthält neben Hepatozyten Endothelzellen, Kupffer-Sternzellen,
Sternzellen, Gallengang-Epithelzellen
und soll Hepatozyten mit einer spezifischen Umgebung bereitstellen,
und das genannte Nikotinamid oder ein Analoges, die Ascorbinsäure oder ein
Analoges und DMSO hemmen das Wachstum dieser Nichtparenchymzellen,
wodurch ein selektives Kultivieren und Vermehren von Parenchymhepatozyten
möglich
wird. Die Mengen dieser dem Medium zugesetzten Bestandteile können beispielsweise etwa
0,1 ng/ml bis 10 μg/ml
für PTN,
5 bis 30% für FBS,
0,1 bis 1,0 mM für
Ascorbinsäure
oder ein Analoges, 1 bis 100 ng/ml für EGF, 1 bis 20 mM für Nikotinamid
oder ein Analoges und 0,1 bis 2% für DMSO betragen. Das Kultivieren
geht vorzugsweise in einer 5%igen CO2-Atmosphäre bei einer
Temperatur von etwa 37°C
vonstatten.
-
Die
Primärkolonien
von Hepatozyten können nach
dem oben beschriebenen Kulturverfahren hergestellt werden. Zellen,
die diese Kolonien bilden, können
nach dem Verfahren gemäß der früheren Patentanmeldung
(japanische Patentanmeldung Nr. 133985/1996) weiter gescreent werden,
wobei Parenchymhepatozyten und Nichtparenchymzellen identifiziert
werden können.
-
Nachstehend
wird das erfindungsgemäße Verfahren
zum Subkultivieren von Hepatozyten (zweite und dritte Ausführungsform)
beschrieben.
-
Diese
Subkulturverfahren beinhalten das Ablösen von Kolonien von in einer
Primärkultur
hergestellten Hepatozyten (primärkultivierten
Zellen) aus einem Gefäß und das
Neukultivieren der Zellen in einem anderen Gefäß zwecks Zellvermehrung. Als
Primärkulturverfahren
(zweite Ausführungsform)
kann das gleiche Verfahren wie bei der genannten früheren Patentanmeldung
(japanische Patentanmeldung Nr. 213686/1995) oder das Primärkulturverfahren nach
der ersten Ausführungsform
angewandt werden (dritte Ausführungsform).
Um Kolonien von primärkultivierten
Zellen, die nach einem dieser Verfahren hergestellt wurden, abzulösen, wird
das Medium aus dem Gefäß entfernt
und anschließend
werden die Kolonien für
etwa 10 Minuten vorzugsweise mit einer Lösung von EDTA (0,002 bis 0,2%)
und Trypsin (0,005 bis 0,5%) behandelt, wodurch die Kolonien in Hepatozyten
und Nichtparenchymzellen getrennt werden können. Die diese separierten
Zellen enthaltende Flüssigkeit
kann mit einem Filter (Porendurchmesser: etwa 20 μm) filtriert
werden, um kleine Agglomerationen zu entfernen, sodass die Zellen
dispergiert werden können.
-
Bei
den erfindungsgemäßen Subkulturverfahren
werden die so dispergierten Zellen wieder in einem Medium kultiviert,
dem PTN, FBS und Nikotinamid oder ein Analoges zugesetzt wurden.
Vorzugsweise werden dem Medium ferner Ascorbinsäure oder ein Analoges zugesetzt.
Mit dieser Subkultur können
Kolonien effizient gebildet werden, wenn die Zellen mit geringer
Zelldichte (zum Beispiel etwa 1 × 104 Zellen/35
mm-Schale) eingeimpft werden. Die spezifischen Bestandteile im Medium
können
die gleichen sein wie bei der ersten Ausführungsform.
-
Die
oben beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren
können
bei Hepatozyten von allen Säugetieren,
auch vom Menschen, angewandt werden, sodass die Hepatozyten (Parenchymhepatozyten)
mit klonaler Wachstumsfähigkeit,
die von verschiedenen Tierspezies gewonnen wurden, zur Bildung von
Kolonien einer Primärkultur
unterworfen und diese primärkultivierten
Zellen weiter subkultiviert werden können. Die subkultivierten Zellen
mit klonaler Wachstumsfähigkeit
von Parenchymhepatozyten, die aus der menschlichen Leber hergestellt wurden,
können
zur Herstellung einer künstlichen Hybridleber
usw. verwendet werden, und es wird erwartet, dass sie bei Techniken
zur Behandlung von Lebererkrankungen ebenfalls neue Entwicklungen herbeiführen werden.
-
Wie
oben im Einzelnen beschrieben, erlaubt die Erfindung eine effiziente
Bildung von Hepatozytenkolonien von einem erwachsenen Säugetier
und deren anschließende
Subkultur. Dementsprechend erlaubt die Erfindung eine detaillierte
Untersuchung der Entwicklungs- und Differenzierungsprozesse von Hepatozyten
und der Vermehrungsmechanismen und Funktionsausdrucksformen derselben,
und sie stellen daher ein neues Mittel zur Erklärung des Mechanismus von Lebererkrankungen
beim Menschen, einschließlich
Hepatomen, sowie zur Entwicklung therapeutischer Verfahren dar.
-
Nachstehend
wird das erfindungsgemäße Subkulturverfahren
im Einzelnen und unter besonderer Bezugnahme auf Beispiele beschrieben,
die jedoch die Erfindung in keiner Weise einschränken sollen.
-
Beispiel 1: Herstellung
von PTN
-
In
ein Gefäß (5 × 103 Zellen/10 cm-Schale) eingeimpfte 3T3-Zellen
wurden in 10%iges FBS, Penicillin und Streptomycin enthaltendem
DMEM-Medium kultiviert, bis die Zellen konfluierend wurden. Dann
wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen, das Medium wurde durch
FBS-freies DMEM-Medium ersetzt und die Zellen wurden bei 37°C in einer
5%igen CO2-Atmosphäre für 48 Stunden kultiviert. Dieses
Medium (3T3-KM) wurde in einem Filter mit einem Porendurchmesser
von 0,45 μm filtriert
und durch eine Ultramembran 50-fach konzentriert.
-
Dann
wurde dieses konzentrierte 3T3-KM mittels einer Heparinsäule fraktioniert.
Die Heparinsäule
wurde zuvor mit PBS-Puffer ausbalanciert. Die an der Säule adsorbierten
Proteine wurden mit NaCl eluiert. Die daraus resultierenden Fraktionen
wurden mittels Filtration durch einen Filter mit einem Porendurchmesser
von 0,22 μm
sterilisiert und jede Fraktion wurde dem DMEM-Medium (10% FBS, 44 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 0,5 mg/l Insulin, 10–7 M Dexamethason,
30 mg/l L-Prolin, Penicillin, Streptomycin, 10 mM Nikotinamid, 10
ng/ml EGF und 0,2 mM L-Ascorbinsäurephosphat)
zugesetzt, und darin wurden für
4 Tage Hepatozyten kultiviert. Anschließend wurde dem Medium BrdU
zugesetzt und nach 48 Stunden wurde die DNA-Synthese durch die Hepatozyten
bestimmt, indem ihre BrdU-Aufnahme in ELISA untersucht wurde. Infolgedessen
wurde, wie in 1 dargestellt, die mitogene
Aktivität
in zwei Fraktionen separiert: Fraktion I (Röhrchen Nummer 3 bis 5) wurde
mit NaCl von 0,2 M auf 0,6 M eluiert und Fraktion II (Röhren Nummer
7 bis 10) wurde mit NaCl von 0,8 M auf 1,4 M eluiert. Die Aufnahme
von BrdU in die Hepatozyten nahm also zu, wenn dem Medium eine mit
wenigstens 0,8 M NaCl eluierte Fraktion zugesetzt wurde, sodass
die Förderung
der DNA-Synthese bestätigt
wurde, und dadurch zeigte sich, dass in dieser Fraktion ein das
Hepatozytenwachstum fördernder
Faktor vorhanden war.
-
Daher
wurden die mit NaCl von 0,8 M auf 1,4 M eluierten Fraktionen II
den aus der Heparinsäule stammenden
Fraktionen entnommen und wurden mittels Gelfiltrationschromatographie
weiter separiert. Die Säule
wurde zuvor mit PBS-Puffer
ausbalanciert und die an der Säule
adsorbierten Proteine wurden mit dem gleichen Puffer eluiert. Durch
Anwendung der in gleicher Weise wie oben gemessenen BrdU-Aufnahme
wurde eine Mehrzahl der daraus resultierenden Proteine auf ihre
Vermehrungsaktivität
untersucht und, wie in 2 dargestellt, wurden die die
Aktivität
zeigenden Eluate der Röhrchen 10
bis 15 zusammengebracht, entsalzt, konzentriert und einer SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese unterzogen.
Das Ergebnis wurde im rechten Teil von 2 dargestellt.
Wie aus 2 ersichtlich, wurde ein einzelnes
Band von Molekulargewichten zwischen 10.000 und 20.000 erzielt und
aus diesem Band wurde ein Protein aufbereitet.
-
Durch
Bestimmung der Aminosäuresequenz dieses
Proteins wurde festgestellt, dass 15 benachbarte Aminosäuren in
dieser Aminosäuresequenz vollständig mit
einer bekannten Aminosäuresequenz von
Maus-PTN (Biochemical and Biophysical Communications 173, Nr. 1,
S. 246–251,
1990) übereinstimmten
und damit wurde bestätigt,
dass dieses Protein ein von 3T3-Zellen abgeleitetes PTN war.
-
Beispiel 2: Erfassung
von Hepatozyten und Primärkultur
-
Hepatozyten
wurden 10 Wochen alten Fisher-Ratten mittels eines Collagenaseperfusionsverfahrens
entnommen und bei niedriger Drehzahl (50 g, 3 × 1 min) zentrifugiert, um
eine Parenchymzellenfraktion als Präzipitate zu erhalten. Diese
Zellen wurden in ein Kulturgefäß von 3,5
cm Durchmesser (4 × 104 Zellen/ Gefäß) eingeimpft und bei 37°C in einer 5%igen
CO2-Atmosphäre für 2 bis 3 Stunden in DMEM-Medium
(10% FBS, 44 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 0,5
mg/l Insulin, 10–7 M Dexamethason, 30 mg/l
L-Prolin, Penicillin und Streptomycin) kultiviert. Dann wurde das
Kulturmedium durch DMEM-Medium ersetzt, welches durch Zusatz von
PTN (10 ng/ml) gemäß Beispiel
1, 10 mM Nikotinamid, 10 ng/ml EGF und 0,2 mM L-Ascorbinsäurephosphat zum
obigen Medium hergestellt wurde, und am 4. Tag der Kultur wurde
dem Medium 1% DMSO zugesetzt und das Kultivieren wurde fortgesetzt.
Getrennt davon wurden Hepatozyten in Anwesenheit von handelsüblichem
Human-PTN (R&D
Systems Inc.) anstelle des von 3T3-Zellen abgeleiteten PTN oder
in Abwesenheit von PTN (Kontrolle) kultiviert und der Umfang der
Hepatozytenvermehrung wurde als BrdU-Aufnahme bestimmt.
-
Infolgedessen
wurde bestätigt,
dass (sowohl aus 3T3-Zellen abgeleitetes als auch handelsübliches)
PTN die Vermehrung von Hepatozyten förderte.
-
Des
Weiteren wurde die DNA-Synthese von Hepatozyten durch PTN gemessen.
Hepatozyten (4 × 103 Zellen/cm2) wurden
6 Tage lang in 1,6 cm-Schächten
in 0,4 ml verschiedene Mengen PTN oder Midkin enthaltendem HCGM
kultiviert. Am 4. Tag wurden die Medien aufgefüllt. Die DNA-Synthese wurde
durch Inkubation der Zellen mit BrdU für wenigstens 2 Tage gemessen.
Die Resultate wurden in 3 dargestellt. Unter den PTNs
war das aus 3T3-Zellen-KM aufbereitete PTN für die Stimulation der DNA-Synthese
von Hepatozyten am effektivsten.
-
Beispiel 3: Subkultur
von Hepatozyten
-
Bei
der Primärkultur
nach Beispiel 2 wurde das Medium aus dem Gefäß entfernt, nachdem sich Hepatozytenkolonien
gebildet hatten, und die Kolonien wurden mit 0,02% EDTA und 0,05%
Trypsin behandelt und in einer Lösung
dispergiert. Diese Zelldispersion wurde durch Pipettieren in Hepatozytendispersionen
geteilt. Anschließend
wurde jede Dispersion in einem Filter mit einem Porendurchmesser von
20 μm filtriert,
um kleine Zellanhäufungen
daraus zu entfernen, und die meisten Zellen wurden dadurch dispergiert.
Diese dispergierten Zellen wurden in einer dünnen Schicht auf ein Gefäß ausplattiert
und wieder in DMEM-Medium (10% FBS, 44 mM NaHCO3,
20 mM HEPES, 0,5 mg/l Insulin, 10–7 M
Dexamethason, 30 mg/l L-Prolin, Penicillin und Streptomycin), dem
nach Beispiel 1 hergestelltes PTN zugesetzt worden war, kultiviert
und die Bildung von Kolonien sowie die Zellenzahl pro Kolonie wurden
bestimmt. Getrennt davon wurden die Zellen auf gleiche Weise in
frischem DMEM-Medium, das kein Kontroll-PTN enthielt, kultiviert
und die Bildung von Kolonien sowie die Zellenzahl wurden bestimmt.
-
Das
Resultat deutete darauf hin, dass die in dem PTN enthaltenden Medium
kultivierten Hepatozyten mehr Kolonien produzierten als im Kontroll-Medium,
und des Weiteren, dass die Zellenzahl pro Kolonie signifikant größer war
als im Kontroll-Medium.