DE69901377T2

DE69901377T2 - Nichtinvasive Impfung durch die Haut

Info

Publication number: DE69901377T2
Application number: DE69901377T
Authority: DE
Inventors: Gregor Cevc; Amia Chopra
Original assignee: Idea AG
Current assignee: Idea AG
Priority date: 1999-01-27
Filing date: 1999-01-27
Publication date: 2003-01-02
Anticipated expiration: 2019-01-28
Also published as: SI1031346T1; CA2360692C; KR20070094662A; CN1230151C; EP1031346A1; HU225170B1; KR20010112252A; DE69901377D1; DK1031346T3; ATE216875T1; HUP0200315A2; EP1146858A1; EP1031346B1; PT1031346E; MXPA01007657A; US7867480B1; ES2173678T3; CA2360692A1; HK1030363A1; AU778972B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Impfstoffe für die nichtinvasive, transkutane Verabreichung von Antigenen, die zum Zwecke der prophylaktischen oder therapeutischen Impfung mit ultradeformierbaren Trägern assoziiert sind. Die Impfstoffe umfassen (a) einen transdermalen Träger, der ein Durchdringungsmittel ist, das in einem wäßrigen Lösungsmittel suspendiert oder dispergiert ist, in der Form eines winzigen Flüssigkeitstropfens, der von einer membranähnlichen Hülle aus einer oder mehreren Schichten von mindestens zwei verschiedenen Stoffen oder zwei verschiedenen Formen eines Stoffes mit der Tendenz zu aggregieren umgeben ist, wobei die Stoffe oder Formen eines Stoffes sich mindestens um den Faktor 10 in der Löslichkeit in einem vorzugsweise wäßrigen, flüssigen Medium unterscheiden, so daß der mittlere Durchmesser von Homoaggregaten des/der löslicheren Stoffes oder Form des Stoffes oder der mittlere Durchmesser der Heteroaggregate, bestehend aus beiden Stoffen oder Formen des Stoffes, kleiner ist als der mittlere Durchmesser der Homoaggregate des/der weniger löslichen Stoffes oder Form des Stoffes, und/oder wobei die löslichere Komponente die Tendenz hat, den durchdringenden Tropfen zu solubilisieren, und wobei der Gehalt einer solchen Komponente bis zu 99 mol-% der Konzentration beträgt, die zum Solubilisieren des Tropfen erforderlich ist, oder ansonsten bis zu 99 mol-% der Sättigungskonzentration in dem nicht solubilisierten Tropfen entspricht, was auch immer höher ist, und/oder wobei die elastische Deformationsenergie des Tropfens, der die membranähnliche Hülle umgibt, mindestens fünffach niedriger ist, vorzugsweise mindestens zehnfach niedriger und idealerweise mehr als zehnfach niedriger ist als diejenige von roten Blutzellen oder von Phospholipid-Doppelschichten mit flüssigen, aliphatischen Ketten, (b) eine Verbindung, die spezifisch Cytokin- oder Anti-Cytokin-Aktivität freisetzt oder induziert oder selbst solch eine Aktivität zeigt; und (c) ein Antigen oder Allergen. Die Erfindung betrifft weiterhin Verfahren für die entsprechende therapeutische oder prophylaktische Impfung von Säugern.
Die Haut ist der am besten zugängliche, wegen der Anwesenheit des Stratum corneum aber auch der schwierigste Zugang in den Körper. Die Hornschicht der Haut ist eine evolutionär optimierte Schranke, die der Blutgefäßwand ähnelt, indem sie weiche, dicht gepackte und lateral überlappende Zellen umfaßt, wobei das grundlegende Zellstapel-Motiv im Stratum corneum 20-30 mal wiederholt wird. Darüber hinaus werden die Kontakte zwischen den Zellen in der Haut mit einer dicht gepackten und gut organisierten Mischung an Lipiden verschlossen. Dadurch schützt das Stratum corneum den Organismus nicht nur vor Infektionen, sondern verhindert auch eine wirksame Aufnahme von Antigenen durch die Haut. Diese Tatsache, die vom Gesichtspunkt der Allergie von Vorteil ist, verhinderte bis heute eine erfolgreiche Immunisierung oder Impfung durch die intakte Haut.
Die größten Wirkstoffe, die in einer transdermalen Zufuhrvorrichtung auf dem Markt sind, sind kleiner als 350 Da (Cevc, G. Drug delivery across the skin, Exp. Opin. Invest. Drugs (1997) 6: 1887-1937), da nur solche Moleküle die winzigen, sich selbst verschließenden Poren in der Haut durchqueren können. Die letzteren sind weniger als 1 nm groß, wenn sie hydrophil sind, oder enger, wenn sie hydrophob sind. Organismen wie Helminthen gewinnen daher dadurch Zugang zum Körper, daß sie die Haut unter Verwendung ihrer biochemischen Maschinerie zum Zwecke des 'Bohrens von Löchern' durch das Organ durchdringen. Natürlicherweise vorkommende Mikroläsionen und Shunts (wie Haarfollikel) sind ebenfalls in der Haut vorhanden. Sie bedecken jedoch nur 0,1% bis 0,5% der Hautoberfläche und tragen folglich nicht viel zum transkutanen Transport bei, trotz der Tatsache, daß Bakterien typischerweise einen solchen Weg für eine topischen Infektion ausnutzen (Strange, P., Skov, L, Lisby, S., Nielsen, P. L., Baadsgard, O. Staphylococcal enterotoxin B applied on intact normal and intact atopic skin induces dermatoma. Arch. Dermatol. (1996) 132: 27-33).
Nur wenige Haptene, die auf die Haut einwirken, rufen eine kutane Immunantwort hervor. Dies bestätigt, daß nur ausreichend kleine Moleküle von einer großen Anzahl der topisch abgelagerten Haptene in merklicher Menge ihren Weg in die Haut finden können. Solche Haptene reizen das Organ zunächst und können letztlich Hypersensitivität und Kontaktdermatitis verursachen (Kondo, S., Sauder, D. N. Epidermal cytokines in allergic contact dermatitis. J. Am. Acad. Dermatol. (1995) 33: 786-800; Nasir, A., Gaspari, A. A. Contact dermatitis. Clinical perspectives and basic mechanisms. Clin. Rev. Allergy and Immunol. (1996) 14: 151-184). Das Problem ist sehr ernst bei Chemikalien mit niedrigem Molekulargewicht oder bei pharmazeutisch wirksamen Stoffen, die mit Reizstoffen der Haut kombiniert sind, wie Verstärker der Permeation der Haut (Cevc, 1997 op. cit.). Große Moleküle sind wegen ihrer beschränkten Fähigkeit, die Barriere zu durchqueren, selten allergen für die Haut. Eine Th2-Antwort auf ein hoch immunogenes Ovalbumin (Wang, L.-F., Lin, J.-Y., Hsieh, K.-H., Lin, R.-H. Epicutaneous exposure of protein antigen induces a predominant Th2-like response with IgE production in mice. J. Immunol. (1996) 156: 4079- 4082.) oder auf Cholera-Toxin (Glenn, G. M., Rao, M. Matyas, (1998) 391: 851; Glenn, G. M., Scharton-Karsten T. Vasell R., Mallet C. P., Hale T. L. und Alving C. R. Transcutaneous Immunization with Cholera toxin Protects Mice Against Lethal Mucosal Toxin Challenge. J. Immunol. (1998) 161: 3211-3214) war nur nach epikutanem Einwirken einer großen Menge solcher Proteine möglich und war ziemlich schwach. Darüber hinaus war die Entfernung des Stratum corneum von der Haut Vorraussetzung für die Produktion nachweisbarer Mengen an spezifischen Antikörper gegen Adenoviren, die das menschliche carcinoembryonale Antigen oder das menschliche GM-CSF-Gen codieren, bei 96% bzw. 43% von epikutan behandelten C57BL/6-Mäusen (Deng, H., Qun, L., Khavari, P. A. Sustainable cutaneous gene delivery. Nature Biotechnology (1997) 15: 1388-1390.).
Bis heute wurde über keinen Schutz gegen die vorstehend erwähnten oder anderen, epikutan verabreichten Antigene berichtet. Antikörper gegen Diphtherie- oder Tetanus-Toxoid und Rinderserumalbumin, die durch Aufbringung des Antigens auf die Haut von BALB/c- Mäusen in Kombination mit Cholera-Toxin (vgl. Glenn et al., 1998) erzeugt wurden, resultierten ohne das Adjuvans in einer sehr schwachen Immunantwort. Selbst nach der Einbeziehung von Cholera-Toxin (CT) war der durchschnittliche spezifische Antikörpertiter für die Diphtherie- und Tetanus-Antigene etwa 50-fach und zwischen 70-fach und 4000-fach (in Abhängigkeit von der Einbeziehung individueller Meßpunkte) geringer als der, der durch das Cholera-Toxin per se hervorgerufen wurde (Glenn et al., 1998 op. cit.). Die entsprechenden, absoluten jeweiligen Titerwerte waren 14 ± 17 und 8 ± 16; der anti-BSA-Titer war ungefähr 11 ± 11 (der Mittelwert +/- Standardabweichung wurde aus den publizierten Figuren berechnet). Für diese niedrigen Titer wurde kein therapeutischer oder prophylaktischer Effekt gezeigt, was zeigt, daß der Weg zu einer einfachen nichtinvasiven Impfung keineswegs einfach ist. Das kürzlich von derselben Gruppe publizierte Papier (Glenn et al., 1998b) zeigte Schutz gegen CT nach transnasaler Verabreichung, was keinerlei Rückschluß bezüglich einem Schutz zuläßt, der mittels transdermaler Impfung erhalten werden kann.
Frühere Publikationen berichten über die Zufuhr von Proteinen durch die Haut als um mehrere Größenordnungen effizienter als in der vorstehend erwähnten Untersuchung, wie mittels der Titer beurteilt wurde, wobei mechanosensitive oder hydrosensitive, sich selbst regulierende Träger (Transfersomen) verwendet wurden (für einen Überblick vgl. Cevc, 1997, op. cit.). Bei starken Antigenen induzierte dieses Verfahren Antikörpertiter, die mit denen vergleichbar waren, die durch subkutane Proteininjektionen hervorgerufen wurden: im Falle von BSA war der absolute Titer von IgG in jedem Fall etwa 200 (Paul, A., Cevc, G. Non- invasive administration of protein antigens. Epicutaneous immunisation with the bovine serum albumin. Vaccine Res. (1995) 4: 145-164), und für das gap junction-Protein wurden Titer zwischen 15.000 und 100.000 gemessen (Paul, A., Cevc, G., Bachhawat, B. K. Transdermal immunisation with large proteins by means of ultradeformable carriers. Eur. J. Immunol. (1995) 25: 3521-3524; Paul, A., Cevc, G., Bachhawat, B. K. Transdermal immunisation with an integral membrane component, gap junction protein, by means of ultradeformable drug carriers, Transferosomes. Vaccine (1997) 16: 188-195). Der Überblick " Transferosomes, liposomes and other lipid suspensions on the skin" (Critical Rev. Therap. Drug Carrier 13, 257-388, 1996) diskutiert unter anderem DRV-Liposomen, wie beschrieben in WO 92/04009, als Immunadjuvantien an sich. Es wird jedoch auch offenbart, daß Liposomen-vermitteltes Eindringen des Cytokins IFN-gamma in die Haut ineffizient und wahrscheinlich auf Haarfollikel beschränkt ist. WO 91/01146 betrifft immunogene Konjugate, die ein Kohlenhydrat-haltiges oder ein anderes Antigen umfassen, das an ein Cytokin, ein Lymphokin, Hormon oder einen Wachstumsfaktor gebunden oder damit genetisch fusioniert ist. Die Schaffung einer schützenden Immunantwort wurde jedoch in keiner dieser Publikationen gezeigt, und keine dieser Publikationen stellt Mittel und Verfahren zur Erzeugung einer therapeutischen oder prophylaktischen Immunantwort bereit.
Wie heute bekannt ist, spielt die Aktivität von Th1- oder Th2-Zellen eine wichtige Rolle bei der Immunantwort: Th1-Zellen fördern vor allem die Zell-vermittelte Immunität, die Phagocyten-vermittelte Wirtabwehr, aber auch die Produktion von Antigen-spezifischem IgG2a in Mäusen. Im Gegensatz dazu tendieren Th2-Zellen vorzugsweise dazu, die von Phagocyten unabhängige Wirtantwort der Erzeugung von IgG-, IgE und IgA-Immunglobulin zu unterstützen.
Die Th1- oder Th2-Basis einer Immunantwort, das heißt die Differenzierung in die Th-Zell-Subtypen, hängt nicht nur von Cytokinen und der Aktivität anderer Regulationsmoleküle ab (Luger, T. A., Schwarz, T. The role of cytokines and neuroendocrine hormones in cutaneous immunity and inflammation. Allergy (1995) 50: 292-302; Lohoff, M., Gessner, M., Bogdan, C., Roellinghoff, M. The Th1/Th2 paradigm and experimental murine Leishmaniasis. Int. Arch Allergy Immunol. (1998) 115: 191-202.); die Natur der Antigenpräsentierenden Zellen und die Menge an verwendetem Antigen spielen auch eine wichtige Rolle. Cytokine werden transient von fast allen eukaryontischen Zellen produziert und wirken über spezifische Zelloberflächenrezeptoren. In der Tat kann jede Zelle in der Haut nach geeigneter Stimulierung solche (Glyco)Proteinfaktoren freisetzen oder ihre Rezeptoren exprimieren. Die meisten Cytokine sind pluripotent und können sich gegenseitig induzieren oder auch die Expression der relevanten Rezeptoren beeinflussen. Dies erlaubt, daß Cytokine in synergistischer, additiver oder antagonistischer Weise im Rahmen der sogenannten Cytokin-Kaskade wirken (Luger & Schwarz, 1995, op. cit.).
Die Rolle von verschiedenen Zellen bei der Immunaktivierung nach kutaner Antigeneinwirkung ist bis jetzt unvollständig verstanden (Luger & Schwarz, 1995, op. cit.; Lohoff et al., 1998, op. cit.). Man vermutet, daß Langerhans-Zellen, die im suprabasilaren Hautbereich liegen, die Hauptrolle bei der Immunpräsentation spielen. Diese Zellen binden zunächst und prozessieren die Antigene, dann wandern sie von der Epidermis in die lymphatischen Gefäße und weiter in den nächsten drainierenden Lymphknoten, wobei sie die verdauten Antigene mit sich tragen. Während des Prozesses erleiden die Langerhans-Zellen phänotypische und funktionelle Veränderungen und differenzieren sich in (lymphoide) dendritische Zellen, die letztlich die Antigene naiven CD4&spplus;-Zellen anbieten, die durch die hohen Endothelvenen in die Lymphknoten eingedrungen sind. Im Gegensatz dazu benötigen die beiden anderen Haupttypen von Antigenpräsentierenden Zellen in der Haut, die Makrophagen und die B-Lymphocyten, zunächst die Aktivierung, um Antigene zu präsentieren und T-Zellen zu stimulieren. Antikörper können T-Zellen durch die Endothelzellen der Venen präsentiert werden, und vielleicht auch durch gewisse Basalzellen der Haut.
Es ist zum Beispiel klar, daß Keratinocyten die lokale Entzündung durch die Produktion einer Plethora von pro-entzündlichen Cytokinen erhöhen können, einschließlich IL-1α, GM-CSF und TNFα ((Pastore, S., Fanales-Belaso, E., Abbanesi, C., Chinni, L. M., Giannetti, A., Girolomoni, G. Granulocyte macrophage colony stimulating factor is overproduced by keratinocytes in atopic dermatitis: Implications for sustained dendritic cell activation in the skin. J. Clin. Invest. (1997) 99: 3009-3017.). Von Keratinocyten abgeleitete Cytokine sind auch kritisch für die Reifung von Langerhans-Zellen in effiziente Antigenpräsentierende Zellen (Nasir & Gaspari, 1996, op. cit.) Das Ausmaß, mit dem die vorstehenden Zellen direkt bei der Antigen-Präsentation beteiligt sind (Kondo & Sauder, 1995, op. cit.) ist unbekannt, aber die Produktion von inhibitorischen Cytokinen wie IL-10, nichtfunktionellem IL-12 und TGFβ durch Keratinocyten ist eine bewiesene Tatsache (Nasir & Gaspari, 1996, op. cit.).
Der Pool an Fibroblasten in der Haut enthält auch zelluläre Unterklassen, die in die Prozessierung von Antigenen eingeschalten sind. Zum Beispiel wird eine Unterklasse von Fibroblasten selektiv von Cytokinen an der Entzündungsstelle bei der Sklerodermie rekrutiert (Fries, K. M., Blieden, T., Looney, R. J., Sempowski, G. D., Silvera, M. R., Willis, R. A., Phipps, R. P. Evidence of fibroblast heterogeneity and the role of fibroblast subpopulations in fibrosis. Clin. Immunol. Immunopathol. (1994) 72: 283-292.).
Es wurde kürzlich berichtet, daß die epikutane Antigenanwendung eine andere Immunantwort produziert als die mehr herkömmlichen Verabreichungswege durch den Mundraum oder die Nase. Zum Beispiel ist nach wiederholter epikutaner Einwirkung von Ovalbumin auf die Haut anti-Ovalbumin-IgE vorhanden (Wang et al., 1996, op. cit.). Unter Verwendung von Rinderserumalbumin als Modellantigen auf der Haut wurde kürzlich eine außergewöhnlich starke IgA-Produktion beobachtet (Paul et al., 1997, op. cit.), aber es entwickelte sich bis heute kein übereinstimmendes Bild der Abhängigkeit zwischen den Feinheiten der epikutanen Antigenpräsentation und der resultierenden Immunantwort.
Zahlreiche und verschiedene Zellen nehmen am Aufbau einer Immunantwort gegen kutan verabreichte Makromoleküle teil. Wie vorstehend festgestellt wurde, haben die bisher genommenen Wege nicht zur Etablierung einer überzeugenden Strategie für die Erzeugung einer schützenden Immunantwort geführt. Dies kann auch wegen der Tatsache sein, daß die Strategien des Stands der Technik wie die Antigeninjektion nicht dabei geholfen haben, die Immunantwort, die durch Anwendung eines Antigens auf die Haut erhalten werden kann, in einem Maße zu zergliedern, die es erlaubt, eine zielgerichtete und schützende Immunantwort zu planen. Zum Beispiel ist bekannt, daß die Injektion eines Antigens wie jede Läsion oder andere Art von Störung der Haut einschließlich der Anwesenheit von chemischen Reizmitteln verschiedene Cytokine aus der Haut freisetzt (welche nicht nur das schwerste Organ des Körpers ist, sondern auch den wichtigsten Teil des Immunsystems des Körpers ausmacht). Dies maximiert die Stärke, verhindert aber die Feinabstimmung der kutanen Immunantwort, die auch sensitiv gegenüber der Natur der verwendeten Antigene ist. Die Zufuhr von Impfstoffen mit hoher Vehemenz profitiert von diesem Effekt.
Der Materialtransport durch die Haut mittels ultradeformierbarer Träger ist genau das Gegenteil des besagten Weges der Zufuhr von Impfstoffen mit hoher Vehemenz, da er bekanntermaßen die Haut nicht betrifft. Man glaubt, daß dies wegen der Tatsache ist, daß solche hydrosensitiven, ultradeformierbaren Körper - sogenannte TransfersomenTM (Cevc, 1997, op. cit.) durch 'virtuelle Kanäle' zwischen Corneocyten, die an die Form der Zellen angepaßt sind, in das Stratum corneum eindringen (Schätzlein, A., Cevc, G. Non-uniform cellular packing of the stratum corneum and permeability barrier function of intact skin: a high-resolution confocal laser scanning microscopy study using highly deformable vesicles (Transfersomes). Br. J. Dermatol. (1998) 138: 583-592.). Es ist vorgeschlagen worden, daß die Transfersomen während des Prozesses die Zellen in der Haut und die interzellulären Lipide auseinanderdrängen, vorzugsweise an der Stelle des schwächsten Kontakts. Die so geschaffenen Durchgänge scheinen im Durchschnitt etwa 20-30 nm groß zu sein. Sie bedecken mehrere Prozent (~4%) der Hautoberfläche (Schätzlein & Cevc, 1998, op. cit.), die Drainage der benachbarten Oberfläche nicht eingeschlossen. Das ist viel mehr als die normale Shuntoberfläche (~0,1%), was die quantitativen Unterschiede zwischen den anti-BSA-Titern erklärt, die nach der Verabreichung des Antigens mit ultradeformierbaren Trägern (Paul & Cevc, 1995, op. cit.) oder unter Verwendung von Cholera-Toxin als Adjuvans (Glenn et al., 1998a, b, op. cit.) gemessen wurde.
Virtuelle Kanäle in der Haut, die durch die Träger geöffnet werden, scheinen ausreichend groß zu sein, um die Träger und das mit ihnen assoziierte Material durch die Barriere durchzulassen, ohne das Organ signifikant zu stören. Es wurde jedoch gefunden, das eine wiederholte Zufuhr von Insulin durch die Haut mittels ultradeformierbarer Träger keine Antikörper gegen das Protein induzierte (Cevc, G., Gebauer, D., Schätzlein, A. Blume, G. Ultraflexible Vesicles, Transfersomes, Have an Extremely Low Permeation Resistance and Transport Therapeutic Amounts of Insulin Across the Intact Mammalian Skin. Biochim. Biophys. Acta (1998) 1368: 201-215.).
Das der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende technische Problem war daher, ein Mittel bereitzustellen, das die erfolgreiche Induzierung einer medizinisch nützlichen transdermalen Immunantwort erlaubt. Die Lösung des besagten technischen Problems wird durch die Bereitstellung der Ausführungsformen erreicht, die in den Ansprüchen charakterisiert sind.
Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung einen transdermalen Impfstoff, umfassend (a) einen transdermalen Träger, der ein Durchdringungsmittel ist, das in einem wäßrigen Lösungsmittel suspendiert oder dispergiert ist, in der Form eines winzigen Flüssigkeitstropfens, der von einer membranähnlichen Hülle aus einer oder mehreren Schichten von mindestens zwei verschiedenen Stoffen oder zwei verschiedenen Formen eines Stoffes mit der Tendenz zu aggregieren umgeben ist, wobei die Stoffe oder Formen eines Stoffes sich mindestens um den Faktor 10 in der Löslichkeit in einem vorzugsweise wäßrigen, flüssigen Medium unterscheiden, so daß der mittlere Durchmesser von Homoaggregaten des/der löslicheren Stoffes oder Form des Stoffes oder der mittlere Durchmesser der Heteroaggregate, bestehend aus beiden Stoffen oder Formen des Stoffes, kleiner ist als der mittlere Durchmesser der Homoaggregate des weniger löslichen Stoffes oder Form des Stoffes, und/oder wobei die löslichere Komponente die Tendenz hat, den durchdringenden Tropfen zu solubilisieren, und wobei der Gehalt einer solchen Komponente bis zu 99 mol-% der Konzentration beträgt, die zum Solubilisieren des Tropfen erforderlich ist, oder ansonsten bis zu 99 mol-% der Sättigungskonzentration in dem nicht solubilisierten Tropfen entspricht, was auch immer höher ist, und/oder wobei die elastische Deformationsenergie des Tropfens, der die membranähnliche Hülle umgibt, mindestens fünffach niedriger ist, vorzugsweise mindestens zehnfach niedriger und idealerweise mehr als zehnfach niedriger ist als diejenige von roten Blutzellen oder von Phospholipid-Doppelschichten mit flüssigen, aliphatischen Ketten, (b) eine Verbindung, die spezifisch Cytokin- oder anti-Cytokin-Aktivität freisetzt oder induziert oder selbst solch eine Aktivität zeigt, wobei beide in der gewünschten, medizinisch nützlichen Immunantwort resultieren; und (c) ein Antigen oder Allergen.
In Hinblick auf die vorstehend zitierten Werte von bis zu 99% sollte festgehalten werden, daß Werte von unter 50% der vorstehenden relativen Konzentration oft verwendet werden. Noch vorteilhafter werden Werte von unter 40 rel-% oder sogar etwa und unter 30 rel-% ausgewählt, während bei den Tropfen diejenigen, die durch die relativen Konzentrationen der löslicheren Komponente, die die vorstehenden mit einem Faktor von bis zu 2 übersteigen, nicht solubilisiert werden können, bevorzugt werden.
Im Kontext dieser Erfindung betrifft der Ausdruck "Pathogen" eine Einheit, die mittels ihrer Anwesenheit im oder am Körper zu einem pathologischen Zustand führt oder diesen fördert, der im Prinzip einer präventiven, kurativen oder Adjuvans-Immuntherapie zugänglich ist oder davon profitieren könnte. Diese umfaßt Pathogene, die mikrobielle Krankheiten verursachen, wie extrazelluläre Bakterien einschließlich Eiter-bildende Kokken wie Staphylococcus und Streptococcus, Gram-negative Bakterien wie Meningococcus- und Gonococcus-Arten, Arten von Neisseria, Gram-negative Bakterien einschließlich Darmorganismen wie E. coli, Salmonella, Shigella, Pseudomonas, Diptheria, Bordetella Pertussis und Gram-positive Bakterien (z. B. Bacillus pestis, BCG), besonders anaerobe wie die Clostridium-Arten; eine Anzahl an Bakterien und alle Viren, die in Wirtszellen überleben und sich replizieren; diese letztere Gruppe umfaßt die Mycobakterien (z. B. M. tuberculosis) und Listeria monocytogenes, Retro- und Adenoviren einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Hepatitisvirus, (menschlicher) Immundefizienzvirus, Herpesviren, Windpocken (Hühnerpocken)-, Influenza-, Masern-, Mumps- und Polioviren, Cytomegalievirus, Rhinovirus usw., und verschiedene Pilze, die innerhalb von Wirtszellen gedeihen; Parasiten einschließlich tierischer Parasiten wie Protozoen und Helminthen, und Ectoparasiten wie Zecken und Milben. Die Pathogene umfassen weiterhin Brucella-Arten einschließlich des Cholera verursachenden Mittels, Haemophilus-Arten ebenso wie Pathogene, die Parathyphus, Pest, Tollwut, Tetanus und Röteln auslösen. Die Pathogene dieser Erfindung sollen weiterhin eukaryontische Zellen oder ihre Teile umfassen, die verschiedene Neoplasien, Autoimmunerkrankungen und andere pathologische Zustände des tierischen oder menschlichen Körpers verursachen, die nicht von mikrobiellen Infektionen resultieren, sind aber nicht beschränkt darauf. Teile gewisser Pathogene, insbesondere verschiedene mikrobielle Toxine, haben Porin-ähnliche Eigenschaften und demzufolge eine gewisse Fähigkeit, die Mucosa zu durchqueren oder die Flexibilität der zu durchdringenden Membranen zu erhöhen.
Der Ausdruck "spezifisch" in Kombination mit "Freisetzungen" oder "induziert" bedeutet die Tatsache, daß die Verbindung mit Zellen wechselwirkt, die in der Lage sind, Cytokine durch ein Rezeptor-vermitteltes Auslösen dieser Cytokinfreisetzung oder -induktion freizusetzen. Diese spezifische Freisetzung oder Induktion steht im Gegensatz zu einer unspezifische Freisetzung oder Induktion, die zum Beispiel mittels intradermaler Injektion erhalten wird.
Der Ausdruck "Allergen" wird in dieser Erfindung verwendet, um Substanzen endogenen oder xenogenen, d. h. tierischen oder pflanzlichen Ursprungs zu beschrieben, welche in einer unerwünschten Immunantwort des Körpers resultieren, der einem solchen Allergen ausgesetzt ist, was oft in einer akuten hypersensitiven Reaktion resultiert. Allergenisierende Mikroben oder Teile davon (z. B. einer Milbe), Teile von Pflanzen (z. B. Pollen) oder Tieren (z. B. Haare und Hautteile), aber auch vom Menschen hergestellte und anorganische Verbindungen gehören zu dieser Gruppe. Auf der anderen Seite kann nahezu jeder Teil des menschlichen Körpers, wenn er durch das Immunsystem des Körpers inkorrekt prozessiert ist oder diesem ausgesetzt ist, in einer Autoimmunantwort resultieren und zu der allergischen Reaktion auf eine solche Verbindung führen. In der engeren Interpretation, verwendet, wenn es so festgehalten ist, ist ein Allergen eine Verbindung, eine Gruppe oder eine Anordnung von Verbindungen, die eine unmittelbare hypersensitive Reaktion im Körper hervorruft, die durch eine Immuntherapie, sei sie nichtinvasiv durch die Haut oder nicht, vermindert oder sogar eliminiert werden könnte.
Der Ausdruck "(therapeutische) Impfung" beschreibt im Kontext dieser Erfindung jede Art von therapeutischer Immunisierung, entweder nach bereits erfolgter Manifestation einer Krankheit, um die klinische Situation zu verbessern oder auch zum Zwecke der Verhinderung einer Krankheit. Eine solche Impfung kann eine einzige oder wiederholte Verabreichung(en) des Impfstoffs der Erfindung umfassen. Eine therapeutische Impfung wird entweder eine pathologische Situation verhindern und/oder eine klinische Situation verbessern. Wenn es als präventives Mittel angewendet wird, wird es im allgemeinen in einer schützenden Immunantwort resultieren.
Immunisierung bedeutet jede Art des Hervorrufens einer Immunantwort, unabhängig davon, ob diese Antwort therapeutisch oder nicht therapeutisch ist.
Ein "Antikörper" oder ein "Immunglobulin" bedeutet IgA, IgD, IgE, IgG oder IgM, einschließlich aller Subtypen wie IgA1 und IgA2, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4. Ihre "Derivate" umfassen chemische, biochemische oder anders erhältliche Derivate wie gentechnisch hergestellte Antikörperderivate. Fragmente umfassen z. B. Einzelkettenfragmente, Fc-, Fab- F(ab')&sub2;- und andere Teile von Igs, unabhängig davon, ob sie endogenen, xenogenen, (semi)synthetischen oder rekombinanten Ursprungs sind. Ebenfalls von der Erfindung umfaßt sind Komplexe von zwei oder mehr der vorstehend zitierten Antikörper, Derivate oder Fragmente.
Ein "Antigen" ist ein Teil eines Pathogens oder ein Allergen in seiner natürlichen Form oder nach Fragmentierung oder Derivatisierung. Allgemeiner bedeutet das Wort Antigen ein Makromolekül oder ein Fragment davon, jede Haptengruppe (zum Beispiel ein einfaches Kohlenhydrat, komplexes Kohlenhydrat, Polysaccharid, Desoxyribonucleinsäure), kurz gesagt, jedes Molekül, das vom Antikörperrepertoire eines Körpers erkannt wird und möglicherweise nach Anwendung im System zur Induktion von Antikörpern in der Lage ist.
Der Ausdruck "Cytokin", wie in der vorliegenden Erfindung verwendet, bezeichnet Cytokine wie IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17 und IL-18 mit allen Subtypen wie IL-1α und IL-1β, Tumornekrosisfaktor (TNF), transformierenden Wachstumsfaktor (TGF-β und -α), Typ I- und II-Interferone (IFN-α1, IFN-α2, (IFN-ω), IFN-β, IFN-γ), Wanderungsinhibierungsfaktor, MIF, c-kit-Ligand, Granulocyten-Makrophagen-Koloniestimulierungsfaktor (GM-CSF), Monocyten-Makrophagen-Koloniestimulierungsfaktor (M-CSF), Granulocyten- Koloniestimulierungsfaktor (G-CSF), Chemokine usw., ebenso wie alle funktionellen Derivate aller dieser Moleküle.
Cytokine, die die natürliche Immunität besonders gut vermitteln, umfassen Typ 1- Interferone (IFN-α und IFN-β), Tumornekrosisfaktor (TNF), Interleukin-1 (IL-1α und IL-1β), Interleukin-6 (IL-6) und Leukocyten anziehende und aktivierende Chemokine. Dieser Prozeß beruht unter anderen auf einer antiproliferativen (z. B. mit IFNs), pro-inflammatorischen (z. B. mit TNF, IL-1) oder co-stimulatorischen (z. B. mit IL-6) Wirkung. Die Cytokine, die am besten Lymphocytenaktivierung, -wachstum und -differenzierung vermitteln, umfassen Interleukin-2 (IL-2), Interleukin-4 (IL-4) und transformierenden Wachstumsfaktor (TGF). Solche Cytokine können daher nicht nur das Wachstum des Ziels beeinflussen, sondern darüber hinaus die Aktivierung von den Zellen, die letztlich eine Rolle bei der therapeutischen Wirkung spielen, und damit die Produktion von anderen Cytokinen.
Die Cytokine, die eine Immun-vermittelte Entzündung vermitteln, die stark von der Zell-vermittelten Antwort abhängig ist, sind Interferon-gamma (IFN-γ), Lymphotoxin (TNF-β, Interleukin-10 (IL-10), Interleukin-5 (IL-5), Interleukin-12 (IL-12) und wahrscheinlich der Wanderungsinhibierungsfaktor. Das Wachstum und die Differenzierung von Leukocyten werden am meisten von Interleukin-3 (IL-3), dem c-kit-Ligand, Granulocyten-Makrophagen- Koloniestimulierungsfaktor (GM-CSF), Makrophagen- oder Granulocyten- Koloniestimulierungsfaktor (M-CSF oder G-CSF) und Interleukin-7 (IL-7) beeinflußt.
Der Ausdruck "Immunadjuvans" wird hier verwendet, um jede Verbindung zu beschreiben, die die erwünschte Immunantwort, entweder vom zellulären oder humoralen Typ, unterstützt, verstärkt, stimuliert, aktiviert, potenziert oder moduliert, spezifisch im Falle von prophylaktischer Behandlung durch Erhöhung der Antigen-spezifischen Immunantwort jeglicher Art und im Falle von therapeutischer Behandlung oft durch Unterstützung der Zell- vermittelten Immunität. Dies kann durch die Zugabe von geeigneten Cytokinen, ihrer Mischung oder Antagonisten oder weniger direkt durch chemische Reizung der Haut erreicht werden, wenn dies direkt oder indirekt zu der Freisetzung von Cytokinen von der Haut oder von anderen betroffenen peripheren Geweben beiträgt, oder auch durch die Katalyse oder Förderung der Biosynthese der Moleküle in dem Gewebe, die dann zu einer solchen Wirkung führen, mit der Maßgabe, daß das letztliche Ergebnis ein verbesserter Erfolg der Impfung ist, das heißt eine prophylaktische und/oder therapeutische Wirkung des verwendeten Antigens. Die Klasse an Immunadjuvantien, die indirekt zu dem nützlichen Cytokin-Pool beitragen, umfassen kleine chemische Einheiten mit einem allergenen Potential wie gewisse allergene (Metall) Ionen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, LiCl, HgCl&sub2;, Molybdän, Säuren, Basen und andere reizende Verbindungen wie Dicyclohexylmethan-4,4'-diisocyanat, Ditrocarb (Diethyldithiocarbamat), 2,4-Dinitrochlorbenzol, Isoprinosin, Isophorondiisocyanat, Levamisol, (Phenyl)Oxazolon und dergleichen, Swansonin, Sizofran, Phthalsäureanhydrid, Thymopentin, (Fett)Alkohole, (Fettsäure)Amine, (Fett)Ether, Ricin oder andere geeignete Amphiphile, viele oberflächenaktive Mittel und chemische Verstärker der Hautdurchdringung ebenso wie Derivate oder Kombinationen davon; darüber hinaus Fragmente (mit niedrigem Molekulargewicht) oder Derivate von Mikroben einschließlich Lipopolysaccharide (wie LPS), Cordfaktor (Trehalose-Dimycolat) und andere Polysaccharide, die an Membranen gebunden sind, wenn sie in ausreichender Menge verwendet werden; Acetylmuramyl-alanyl-isoglutamin und Arger-Fragmente von Mikroben einschließlich bakterieller Exo- und Endotoxine oder Enterotoxine wie Cholera-Toxin und das hitzelabile Toxin von E. coli und ihre makromolekularen Fragmente wie A-Ketten-Derivate, von denen die meisten, wenn nicht alle, eine ADP ribosylierende Aktivität zu haben scheinen, das Immunadjuvans hoher Potenz LT-Holotoxin, usw., das Zellwandskelett, attenuierte Bakterien wie BCG usw. Weniger etablierte Beispiele umfassen Clostridium-Toxin, gereinigtes Proteinderivat von M. tubercolosis, LT-R192G, Fibronectin bindendes Protein I von Streptococcus pyrogenes, das äußere Membranprotein von Gruppe B Neisseria meningitidis (GBOMP), verschiedene andere Peptidoglycane, usw. Mit anderen Worten umfassen Immunadjuvantien Moleküle, die die Aufnahme oder Präsentation von Antigenen verändern, die Proliferation von Antigen-spezifischen Lympocyten aktivieren oder erhöhen oder mit dem dominanten Kontrollmechanismus bei der Immunantwort interferieren, nicht nur in der Haut, sondern auch in den anderen immunkompetenten Geweben. (Die mucosale Adjuvans-Aktivität von ADP-ribosylierenden bakteriellen Enterotoxinen ist ein gut etabliertes und bekanntes Beispiel dafür). Andererseits sind auch Moleküle, die die (relativen) Konzentrationen von Cytokinen und anderen Immunadjuvantien wie anti-Immunadjuvans-Antikörper oder andere Agonisten oder Antagonisten von Immunadjuvantien, auch Immunadjuvantien im Sinne dieser Erfindung. Das gleiche trifft auf Moleküle zu, die die Rückkehr ("homing") von Lymphocyten beeinflussen, wie verschiedene Selectine (LECAMS, z. B. verschiedene CD62s) GlyCAM-1, MadCAM-1, VCAM-1, ICAM-1, Hyluronat usw., und andere Chemokine wie RANTES oder MCP-1. Die endogene Gruppe von Immunadjuvantien umfaßt weiterhin Histamine, Transferfaktor, Tuftsin usw.. Da viele der vorstehend erwähnten Immunadjuvantien keine ausreichende Wirksamkeit haben, um den erwünschten Effekt nach der nichtinvasiven Immunisierung bei zu niedrigen und manchmal zu hohen Konzentrationen allein sicherzustellen, umfaßt die in dieser Arbeit verwendete funktionelle Definition eines Adjuvans eine per Gewalt ausreichende und derartige Modulation der Cytokinkonzentration und - verteilung im Körper, die in der Erzeugung der erwünschten therapeutischen oder prophylaktischen Antwort im Körper resultiert. Wenn eine Klarstellung erforderlich ist, muß die besagte Modulation und ihr Ausmaß in einem speziellen Experiment bestimmt werden, in dem zum Beispiel die spezifischen Cytokinspiegel bestimmt werden.
"Immunadjuvans-Manipulierung" bezeichnet eine nicht-chemische Behandlung der Haut wie Reiben, Pressen, Erhitzen, Einwirken eines elektrischen oder mechanischen Feldes, z. B. Ultraschall, usw. oder sogar die Injektion einer nicht-immunogenen Formulierung in die Haut, unter der Maßgabe, daß eine solche Behandlung Immunadjuvans-Verbindungen von der Haut oder anderen peripheren immunaktiven Geweben freisetzt oder auch die Konzentration/Dauer der Wirkung von Antagonisten gegen die gewünschte Impfung reduziert.
Der Ausdruck "Immunogen" bezeichnet ein Hapten, das an einen immunologischen Träger oder ein Antigen gekoppelt ist, das frei oder mit einem Träger assoziiert ist, das in der Lage ist, eine Immunantwort zu induzieren.
"Immuntoleranz" bezeichnet das Fehlen oder allgemeiner die Reduktion einer unerwünschten Immunantwort auf ein Antigen.
Th1 (T-Helferzelle Typ 1)-verwandte Antikörper umfassen IgG2a, IgG2b und IgG3.
Th2 (T-Helferzelle Typ 2)-verwandte Antikörper umfassen die Klassen von IgG1, IgG4 und IgE.
Der Ausdruck "zwei Formen einer Verbindung" bedeutet in Verbindung mit dieser Erfindung zwei Ionisierungszustände oder Salzformen derselben Verbindung, zwei verschiedene Komplexe einer solchen Verbindung usw..
"Nichtinvasive Verabreichung" oder "Nichtinvasive Zufuhr" bedeutet Anwendung auf oder Transport durch eine intakte Barriere, bei den biologischen Anwendungen, die in dieser Offenbarung behandelt werden, durch die intakte Haut.
"Ein- bzw. Durchdringen" beschreibt eine nicht-diffuse Bewegung von relativ großen Einheiten durch eine Barriere. Dieser Prozeß hängt üblicherweise von der Durchdringsadaption an die ansonsten beschränkenden Poren in der Barriere ab und kann auch eine vom Durchdringen induzierte Abnahme des Widerstands der Barriere umfassen, wie eine Porenerweiterung oder Kanalöffnung; der Prozeß hängt jedoch nicht primär von dem Konzentrationsgradienten des durchdringenden Mittels über die Barriere ab.
"Permeation" betrifft eine diffuse Bewegung über semipermeable Barrieren. Das wichtige Beispiel dafür ist der Transport von Molekülen oder molekularen Aggregaten unter dem Einfluß eines Konzentrationsgradienten der durchquerenden Spezies über die Barriere.
Ein Durchdringungsmittel ist folglich eine Einheit, die ein einzelnes Molekül oder eine Anordnung an Molekülen umfaßt, das oder die zu groß ist/sind, durch die Barriere zu permeieren, aber wegen der Fähigkeit des Durchdringungsmittels, sich an die Form und/oder den Durchmesser der ansonsten beschränkenden Durchgänge (Poren) anzupassen, in der Lage sind, die Barriere zu durchqueren. Diese Anpassungsfähigkeit wird zum Beispiel an der Tatsache gesehen, daß Durchdringungsmittels, die mehr als doppelt so groß sind als der Porendurchmesser, die Doppelschicht durchqueren werden, ohne auf die Porengröße verkleinert zu werden. Ein Durchdringungsmittels auf der anderen Seite ist eine Einheit, die eine semipermeable Barriere wie die Haut permeieren kann. Ein Durchdringungsmittel in einem externen Feld erfährt eine Antriebskraft, die proportional zu der nominalen Größe des Durchdringungsmittels und dem angelegten Feld ist, was natürlicherweise passieren kann. Eine solche Kraft, von der man annimmt, daß sie bei der intakten, nicht verstopften Haut von dem Gradienten der Wasserkonzentration über das Stratum corneum herrührt, kann in einer Durchdringungsbewegung durch die Barriere einschließlich der Haut resultieren, wenn die Kraft stark genug ist, um entweder das Durchdringungsmittel zu deformieren oder die Durchgänge in der Barriere ausreichend aufzuweiten, um das Problem des Größenausschlusses zu überwinden, oder beides.
Für weitere Definitionen, insbesondere solche, die Durchdringungsmittel bezüglich komplexer Körperdeformierbarkeit, der zugrundeliegenden Wirkungsmechanismen, der Listen von interessanten Bestandteilen von Durchdringungsmitteln oder ausgewählten Mitteln betreffen, wird Bezug genommen auf die erteilten oder anhängigen Patente (DE 41 07 152, PCT/EP91/01596, PCT/EP96/04526, DE 44 47 287). Detaillierte Information bezüglich des Herstellungsverfahrens, der Beladung des Durchdringungsmittels mit den antigenen (Makro)Molekülen und/oder Immunadjuvantien, die zu groß sind, um durch die Barriere zu permeieren, können in der internationalen Patentanmeldung PCT/EP98/06750 gefunden werden.
Typischerweise ist die weniger lösliche unter den aggregierenden Verbindungen, die einen Träger bilden, ein Lipid oder ein Lipid-ähnliches Material, insbesondere ein polares Lipid, wohingegen die Verbindung, die in der suspendierenden Flüssigkeit löslicher ist und die die Anpassungsfähigkeit des Tropfens erhöht, zu den grenzflächenaktiven Stoffen gehört oder ähnliche Eigenschaften wie ein grenzflächenaktiver Stoff hat. Der erste Inhaltsstoff ist typischerweise ein Lipid oder ein Lipid-ähnliches Material von einer biolgische Quelle oder ein entsprechendes synthetisches Lipid oder eine Modifikation davon, wobei solche Lipide oft zu der Klasse der reinen Phospholipide mit der chemischen Formel
gehören, wobei R&sub1; und R&sub2; eine aliphatische Kette sind, typischerweise ein C&sub1;&sub0;&submin;&sub2;&sub0;-Acyl- oder Alkylrest oder ein teilweise ungesättigter Fettsäurerest, insbesondere eine Oleoyl-, Palmitoeloyl-, Elaidoyl-, Linoleyl, Linolenyl-, Linolenoyl-, Arachidoyl, Vaccinyl-, Lauroyl-, Myristoyl-, Palmitoyl- und Stearoylkette, und wobei R&sub3; ein Wasserstoffatom, eine 2- Trimetylamino-1-ethyl-, eine 2-Amino-1-ethyl-, eine C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl-, eine carboxysubstituierte C&sub1;&submin; &sub5;-Alkyl-, eine hydroxysubstituierte C&sub2;&submin;&sub5;-Alkyl-, eine carboxy- und hydroxysubstituierte C&sub2;&submin;&sub5;- Alkyl- oder eine carboxy- und aminosubstituierte C&sub2;&submin;&sub5;-Alkylgruppe, Inosit, Sphingosin oder Salze der Verbindungen ist, wobei das Lipid auch Glyceride, Isoprenoid-Lipide, Steroide, Sterine oder Sterole, oder Schwefel oder Kohlenhydat enthaltende Lipide oder jedes andere, eine Doppelschicht bildende Lipid, insbesondere halbprotonierte flüssige Fettsäuren umfaßt, und vorzugsweise ausgewählt ist aus der Gruppe aus Phosphatidylcholinen, Phosphatidylethanolaminen, Phosphatidylglycerinen, Phosphatidylinositen, Phosphatidsäuren, Phosphatidylserinen, Sphingomyelinen oder anderen Sphingophospholipiden, Glycosphingolipiden (einschließlich Cerebrosiden, Ceramidpolyhexosiden, Sulphatiden, Sphingoplasmalogenen), Gangliosiden oder anderen Glycolipiden oder synthetischen Lipiden, insbesondere mit oder zusätzlich mit entsprechenden Sphingosinderivaten, oder allen anderen Glycolipiden, wobei zwei ähnliche oder verschiedene Ketten mit dem Rückgrat (wie in Diacyl- und Dialkenoylverbindungen) verestert sein können oder über eine Etherbindung mit dem Rückgrat verbunden sein können, wie in Dialkyllipiden.
Der verwendete grenzflächenaktive Stoff ist normalerweise nichtionisch, zwitterionisch, anionisch oder kationisch, insbesondere eine Fettsäure oder Fettalkohol, ein Alkyl-tri/di/methyl-Ammoniumsalz, ein Alkylsulfatsalz, ein einwertiges Salz von Cholat, Desoxycholat, Glycocholat, Glycodesoxycholat, Taurodesoxycholat, Taurocholat usw., ein Acyl- oder Alkanoyl-dimethyl-aminoxid, insbesondere ein Dodecyl-dimethyl-aminoxid, ein Alkyl- oder Alkanoyl-N-methylglucamid, N-Alkyl-N,N-dimethylglycin, 3- (Acyldimethylammonio)-alkansulfonat, N-Acyl-sulfobetain, ein Polyethylenglycoloctylphenylether, insbesondere ein Nonaethylen-glycol-octylphenylether, ein Polyethylenacylether, insbesondere ein Nonaethylen-dodecylether, ein Polyethylen-glykol-isoacylether, insbesondere ein Octaethylen-glykol-isotridecylether, Polyethylen-acylether, insbesondere ein Octaethylendodecylether, Polyethylen-glykol-sorbitan-acylester wie Polyethylenglykol-20- monolaurat (Tween 20) oder Polyethylenglykol-20-sorbitan-monooleat (Tween 80), ein Polyhydroxyethylen-acylether, insbesondere ein Polyhydroxyethylen-lauryl-, -myristoyl-, -cetylstearyl- oder -oleoylether wie in Polyhydroxyethylen-4 or 6 or 8 or 10 or 12, usw., -laurylether (wie in Brij-Serien) oder in dem entsprechenden Ester, z. B. vom Polyhydroxyethylen-8-stearat-(Myrj 45), myristat-, -laurat-, linoleat-, linolenat-, palmitoleat- or -oleat-Typ, oder in polyethoxyliertem Castor-Öl 40, ein Sorbitan-monoalkylat (z. B. in Arlacel oder Span), insbesondere Sorbitan-monolaurat, -myristat, -linoleat, -linolenat, -palmitoleat- oder -oleat, ein Acyl- or Alkanoyl-N-methylglucamid, insbesondere in oder Decanoyl- oder Dodecanoyl-N-methylglucamide, ein Alkylsulfat (Salz), z. B. in Lauryl-, Myristoyl-, Palmitoyl-, Oleoyl-, Palmitoleoyl-, Linolenyl-, Linoleoyl-, Vaccinyl- oder Elaidoylsulfat, Natriumdesoxycholat, Natriumglycodesoxycholat, Natriumoleat, Natriumtaurat, ein Fettsäuresalz mit ähnlicher Bevorzugung aliphatischer Ketten wie vorstehend, ein Lysophospholipid wie n-Octadecylen(=oleoyl)-glycerophosphatidsäure, -phosphorylglycerin oder -phosphorylserin, n-Acyl-, z. B. Lauryl-, Myristoyl-, Palmitoyl-, Oleoyl-, Palmitoleoyl-, Elaidyl-, Vaccinyl-, Linoleyl-, Linolenyl-glycerophosphatidsäure, -phosphorylglycerin oder -phosphorylserin, oder ein entsprechendes kurzes doppelkettiges Phospholipid wie Dodecyl-phosphatidylcholin, oder sonst ist es ein grenzflächenaktives Polypeptid. Es ist jedoch wichtig zu erkennen, daß Komplexe von polaren Lipiden mit anderen amphipatischen Stoffen bei der Beschichtung eines Trägers oft die Rolle der grenzflächenaktiven Stoffe übernehmen können und daß verschiedene Ionisierungs- oder Salzzustände von polaren Lipiden in ihren Eigenschaften große Unterschiede haben. Es ist daher logisch, daß zwei verschiedene physikalisch-chemische Zustände desselben (polaren) Lipids, die in einer Membran zusammengemischt sind, einen hoch deformierbaren Träger bilden, der die Bedingungen dieser Arbeit erfüllt.
Eine allgemeinere Information über Lipidsuspensionen kann in einem Handbuch gefunden werden, das sich mit 'Liposomen' beschäftigt (Gregoriadis, G., Hrsg., CRC Press, Boca Raton, Fl., Bände 1-3, 1987), in dem Buch 'Liposomes as drug carriers' (Gregoriadis, G., Hrsg., John Wiley & Sons, New York, 1988) oder in dem Laborhandbuch 'Liposomes. A Practical Approach' (New, R., Oxford-Press, 1989). Die Eigenschaften von Phospholipiden, die einfach verwendet werden können, um biokompatible Immundurchdringungsmittel herzustellen, sind zusammengestellt in 'Phospholipids Handbook' (Cevc, G., Hrsg., Dekker, New York, 1995).
Es kann angebracht sein, den pH-Wert der Formulierung unmittelbar nach der Herstellung oder kurz bevor ihrer Anwendung einzustellen. Eine solche Einstellung sollte die Zerstörung einzelner Komponenten des Systems und/oder Wirkstoffträger unter den ursprünglichen pH-Bedindungen verhindern, ohne die physiologische Verträglichkeit zu opfern. Um die Suspension eines Durchdringungsmittels zu neutralisieren, ist es sinnvoll, zur Herstellung von Puffern mit pH-Werten zwischen 3 und 12, häufig zwischen 5 und 9 und meistens zwischen 6 und 8 biokompatible Säuren oder Basen zu verwenden. Physiologisch verträgliche Säuren sind zum Beispiel verdünnte wässrige Lösungen von Mineralsäuren wie Salzsäure, Schwefelsäure oder Phosphorsäure oder organische Säuren wie Carboxyalkansäuren, z. B. Essigsäure. Physiologisch verträgliche Basen sind zum Beispiel verdünnte Natronlauge, geeignet ionisierte Phosphorsäure usw.
Falls erforderlich kann die Immunsuspension vor der Anwendung verdünnt oder konzentriert werden (z. B. durch Ultrazentrifugation oder Ultrafiltration); zu dieser Zeit oder davor können auch Zusatzstoffe zu der Suspension zugegeben werden. Die Zusatzstoffe werden oft aus Verbindungen ausgewählt, die die Empfindlichkeit der Formulierung gegen Umgebungsstreß reduzieren, einschließlich mikrobizide Mittel, Antioxidantien, Antagonisten einer unerwünschten Enzymwirkung, ggf. Kälteschutzmittel, Verdickungsmittel usw. Nach jeder Systemmanipulation sollten jedoch die Trägercharakteristika überprüft und, falls erforderlich, neu eingestellt werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde überraschenderweise gefunden, daß makromolekulare Antigene, die mit den hier beschriebenen ultradeformierbaren Lipidaggregaten assoziiert sind (Immun-Durchdringungsmittel), künstliche poröse Barrieren ebenso wie die Haut durchqueren können, ungeachtete der Tatsache, daß der mittlere Durchmesser der besagten Durchdringungsmittel den mittleren Poren-/Kanaldurchmesser übersteigt und daß solche Immun-Durchdringungsmittel eine therapeutische oder prophylaktische Immunantwort hervorrufen können, mit der Maßgabe, daß die besagten Immun-Durchdringungsmittel mit Verbindungen assoziiert sind, die eine Cytokin-Aktivität zeigen oder die Bildung in und/oder die Freisetzung von Cytokinen von der Haut und/oder anderen immunkompetenten Organen des Körpers induzieren. In einer anderen Ausführungsform haben die besagten Verbindungen eine antagonistische Aktivität zu dem Cytokin. Die letztere Ausführungsform lenkt die Immunantwort vorteilhafterweise in eine Th1- oder Th2-abhängige Immunantwort, indem sie den entsprechenden anderen Weg blockiert. Die in dieser Erfindung beschriebenen Antigenträger behalten vor dem Prozeß und während des Prozesses eine ausreichende Stabilität. Es wurde weiterhin überraschenderweise gefunden, daß die resultierende Immunantwort der angewendeten Dosis nicht direkt proportional ist, was nahelegt, daß die Menge an Antigen variiert werden kann. Die Menge sollte für eine optimale Wirkung gut ausgewählt werden. Die Auswahl der optimalen Menge oder des optimalen Bereichs an Antigen ist im Können des Durchschnittsfachmanns auf dem Fachgebiet unter Berücksichtigung der Lehren dieser Beschreibung.
Die Immun-Aggregate aus mindestens zwei Komponenten, die in den Impfstoffen dieser Erfindung als Träger verwendet werden, ragen durch ihre hohe Deformierbarkeit hervor und haben meistens die Form von Vesikeln mit einer hoch flexiblen Membran. Obwohl solche Träger schon zuvor bei Immunisierungsprotokollen verwendet wurden, war es unerwartet, daß das zuvor postulierte Träger-Immunadjuvanssystem nicht die Notwendigkeit eliminiert, Verbindungen mit Cytokin-Aktivität oder die entsprechenden Antagonisten dazu einzuschließen, vorzugsweise von IL-4, IL-10, TGF-β, IL-5, IL-6, IL-9 und IL-13; oder nach der vorherigen Stimulierung des T-Zell-Rezeptors auch von IL-1, um die erwünschte schützende Immunantwort zu erhalten. Mit demselben Argument werden vorteilhafterweise IL-12, IFN-γ und Lymphotoxin (LT oder TNF-β) eingeschlossen, um die Th1-Antwort zu fördern und somit die Zell-vermittelte Immunantwort zu favorisieren und Mittel zur Behandlung viraler und anderer Parasitenkrankheiten oder zur Verstärkung der Immuntoleranz bereitzustellen. Zum Beispiel kann man von einer Kombination von IFN-γ, IL-12 und anti-IL- 4 erwarten, daß die Th2-Antwort zum Th1-Typ verändert wird. Allgemeiner gesagt wird vorgeschlagen, daß die Erhöhung der relativen Mengen an IL-12 und IL-4 am Anfang einer Immunantwort zugunsten des ersteren auch im Fall einer von einem Durchdringungsmittel vermittelten Immunisierung für die Förderung der Th1-Antwort von Nutzen ist, wohingegen vice versa IL-2 das Wachstum von NK- und B-Zellen fördert, die Antikörpersynthese stimuliert und allgemein den Umfang der T-Zell-vermittelten Immunantwort beeinflußt. Während der Stand der Technik zeigte, daß die Antikörpertiter unter Verwendung geeigneter Träger in Kombination mit Antigen und gegebenenfalls Immunadjuvantien induziert werden konnten, konnte nicht gezeigt werden, daß die erhaltenen Immunantworten schützend waren.
Ein besonderer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist der Tatsache zuzuschreiben, daß überraschenderweise gefunden wurde, daß der Transfer der in dieser Erfindung beschriebenen Durchdringungsmittel nicht zu einer essentiellen Störung der Cytokinzusammensetzung innerhalb der Haut führt. Mit anderen Worten induziert der Transfer dieser Träger durch die Haut per se keine wesentliche Freisetzung an Cytokinen. Es ist daher möglich, durch Einschluß einer Verbindung, die spezifisch Cytokine induziert und ihre Freisetzung von Zellen der Haut oder anderen Organen, die zur Freisetzung solcher Cytokine fähig sind, bewirkt, in den Impfstoff der Erfindung nunmehr eine gewünschte Immunantwort zu untersuchen und auszulösen. Damit kann auch die Feinabstimmung einer gewünschten Immunantwort möglich sein. In einer anderen Ausführungsform kann eine Verbindung, die eine Cytokin-Aktivität hat oder ausübt, in die Impfstoffe der Erfindung eingeschlossen werden. Weiterhin kann ein Antagonist der Cytokin-Aktivität verwendet werden, der spezifisch die Wirkung solcher Cytokine verhindert. Bei dieser Ausführungsform kann die Immunantwort vorteilhafterweise zum Th1- oder Th2-Weg gelenkt werden. Es ist wichtig festzuhalten, daß diese Verbindungen in Abhängigkeit von den Eigenschaften des Antigens spezifisch Cytokine induzieren oder freisetzen. Sie sind somit unterscheidbar von Adjuvantien, die gemäß der vorliegenden Erfindung eine Immunantwort unspezifisch und breit unterstützen.
Die Anwendung des Impfstoffs der vorliegenden Erfindung erlaubt folglich die Feinabstimmung einer gewünschten Immunantwort auf ein gegebenes Antigen, dessen Natur natürlich auch eine bestimmte Rolle spielt. Diese Immunantwort kann durch eine unspezifische Immunantwort verstärkt werden, die zum Beispiel durch ein Adjuvans ausgelöst wird. Die Option der Feinabstimmung einer Immunantwort ist von besonderem Vorteil gegenüber dem Stand der Technik, die nur die Injektion von Impfstoffen verwendet, weil das Injektionsverfahren per se die relativen Cytokinkonzentrationen in der Haut schwer und unspezifisch stört.
Die Berücksichtigung der vorstehend erwähnten Kriterien stellt nicht nur die Basis für eine geeignete Art der Immunpräsentation für die Zellen der Haut und des peripheren Immunsystems (durch die Träger) bereit, sondern stellt auch eine solche Immunverarbeitung sicher, die entweder vorwiegend Antigen-neutralisierende Antikörper im Körper erzeugt, eine Zell-vermittelte Immunantwort hervorruft oder sonst in der stufenweisen Entwicklung von Toleranz gegen die Antigene oder in der spezifischen Förderung der Zell-vermittelten Immunität resultiert.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde auch gefunden, daß das Ergebnis der nichtinvasiven transkutanen Impfung stark von der Zusammensetzung des Immundurchdringungsmittels (Antigenträger) beeinflußt wird. Die Verwendung von Antigenen verschiedener Reinheit resultierte unerwarteterweise in sehr unterschiedlichen Immunantworten. Dies spiegelt sich in der Beobachtung wider, daß Organismen mit ähnlichem Gesamttiter verschiedene Ausmaße an Schutz zeigten, wahrscheinlich wegen der verschiedenen Muster an endgültigem Antigenisotyp.
Darüber hinaus machte die Zugabe eines herkömmlichen Immunadjuvans mit niedrigem Molekulargewicht, Monophosphoryl-Lipid A, nicht nur das Ergebnis der epikutanen Immunisierung stabiler, wie durch die kleinere Standardabweichung bei den gemessenen Antikörpertitern dokumentiert, die zuvor publiziert wurden. Die Verwendung dieses Immunadjuvans in Immunträgern erhöhte unerwarteterweise und im Gegensatz zu früheren Experimenten in Mäusen die Sekretion von IgG2b und weniger stark von IgG2a, erhöhte aber nicht die IgA-Produktion. Da gefolgert wird, daß die Anwesenheit von IgG1, welches ein Th1-ähnliches Immunglobulin ist, essentiell ist zumindest für den murinen Schutz gegen das Tetanus-Toxin, wurde somit die Rolle von Lipid A oder von bakteriellen Antigenen zum ersten mal offengelegt. Für die zukünftige medizinische und kommerzielle Verwendung der Lehren, die in dieser Erfindung offenbart werden, ist es wichtig zu erkennen, daß ein hoher (spezifischer) Antikörpertiter nicht notwendigerweise ein gutes Schutzergebnis impliziert; um den gewünschten und ausreichenden Schutz zu erreichen ist die richtige Art und relative Menge gewisser Antikörper-Isotypen erforderlich, so daß vorwiegend Immunantworten vom Th1- oder Th2-Typ erreicht werden (vgl. die vorstehende Diskussion), wie erforderlich.
Grundlegende Formulierungen zur Erreichung des erwünschten Ziels sind im Stand der Technik bekannt; vgl. z. B. DE 41 07 152, PCT/EP91/01596, PCT/EP96/04526 und DE 44 47 287 für detailliertere oder ergänzende Information. Der Impfstoff dieser Erfindung ist nicht nur für eine prophylaktische oder therapeutische Impfung von Nutzen, sondern darüber hinaus anwendbar für die Behandlung von Allergie und zur Erreichung von Immunität gegen Mikroben, einschließlich extrazellulärer und intrazellulärer Bakterien, Viren und Parasiten in der Human- und Tiermedizin.
In Kombination mit den vorstehend erwähnten Durchdringungsmitteln wird ein Antigen wie eine immunaktive Verbindung in der Form eines physikalischen oder chemischen Komplexes mit dem ersteren durch die Barriere transportiert.
Um von dem Pool an Cytokinen zu profitieren, der in der Haut vorhanden ist, wird ein besonders nützliches Verfahren einer Impfung vorgeschlagen, bei dem ein Immunogen nach Vorbehandlung des Organs mittels einer Immunadjuvans-Manipulation, wie vorstehend definiert, auf die Haut aufgetragen wird.
Es ist von besonderem Vorteil, die Ergebnisse der vorstehend erwähnten lokalen Immunantwort auf einen Pflastertest anzuwenden, um die Details und den Verlauf der weiteren Allergenverabreichung zu optimieren, um somit das Ergebnis der therapeutischen oder prophylaktischen Impfung positiv zu beeinflussen. Man nimmt an, daß ein solcher Weg vorteilhafterweise verwendet werden könnte, um eine Immuntoleranz des getesteten Individuums gegen ein angewendetes Allergen zu erreichen oder zu verbessern.
Wenn die Primärimmunisierung invasiv vorgenommen wird, typischerweise unter Verwendung einer subkutanen Injektion oder eines anderen geeigneten Verfahrens zur Perforierung/Zerstörung der Hautbarriere, erwartet man, hohe IgM-Spiegel zu erhalten, aber die anschließenden Booster-Immunisierungen können dann nichtinvasiv vorgenommen werden, wie in dieser Erfindung beschrieben.
Letztlich werden mehrere Optimierungsverfahren vorgeschlagen, die verwendet werden können, um Immunogene und die Impfung auf der Basis von hoch deformierbaren Durchdringungsmitteln zu verbessern. Bevorzugt ist ein Verfahren, worin der Fluß der Durchdringungsmittel, die mit einem Immunogen assoziiert sind, durch die verschiedenen Poren in einer gut definierten Barriere als eine Funktion einer geeigneten Antriebskraft oder eines geeigneten Druckes über die Barriere bestimmt wird und die Daten dann einfach durch eine charakteristische Kurve beschrieben werden, die wiederum verwendet wird, um die Formulierung oder Anwendung weiter zu optimieren. Entscheidend ist die Bestimmung des Flusses von Immun-Durchdringungsmitteln durch die Poren in einer gut definierten Barriere als Funktion einer geeigneten Antriebskraft oder eines geeigneten Druckes, der über die Barriere wirkt, und die Analyse der resultierenden Daten in der Form einer charakteristischen Kurve, die wiederum verwendet werden kann, um die Formulierung oder Anwendung weiter zu optimieren, basierend auf dem Vergleich verschiedener Datensätze. Dies umfaßt den Vergleich mit den Ergebnissen, die die Immunogen-freien Durchdringungsmittelsuspensionen mit bekannter Hautdurchdringungsfähigkeit betreffen, die zum Beispiel von Cevc et al., (1988 op. cit.) berichtet werden. In einer ergänzenden, bevorzugten Ausführungsform werden verschiedene Kombinationen von Immunmodulatoren oder immunmodulierenden Verfahren im Hinblick auf vor allem die Th1- oder Th2-bezogene Cytokin-Produktion bezüglich getestet, und die Ergebnisse werden dann verwendet, um eine geeignete Auswahl für die endgültige therapeutische oder prophylaktische Anwendung zu treffen.
Die Impfung wird typischerweise bei Umgebungstemperatur vorgenommen, aber niedrigere oder höhere Temperaturen können auch geeignet sein. Dies macht insbesondere Sinn bei Formulierungen, die synthetische Verbindungen umfassen, die zwischen der Raumtemperatur und der Temperatur der Haut oder der anderen Barriere starr sind. Die Herstellungstemperatur wird normalerweise im Bereich von 0 bis 95ºC gewählt.
Vorzugsweise arbeitet man im Temperaturbereich von 10-70ºC, am häufigsten bei Temperaturen zwischen 15ºC und 45ºC, unter allen Umständen unterhalb der Temperatur, bei der irgendein wichtiger Bestandteil der Formulierung eine irreversible Veränderung bei der Zusammensetzung oder dem physikalischen Zustand erleiden würde. Die Hauttemperatur ist normalerweise 32ºC. Andere Temperaturbereiche sind jedoch möglich, ganz besonders bei Systemen, die gefrierbare oder nichtflüchtige Komponenten, Kälte- oder Hitze-stabilisierte Formulierungen usw. enthalten.
Wenn es erforderlich ist, die Integrität und die gewünschten Eigenschaften einzelner Systemkomponenten zu erhalten, können die Trägerformulierungen mit oder ohne einem assoziiertem Antigen in der Kälte (z. B. bei 4ºC) aufbewahrt werden. Die Herstellung und Lagerung unter einer inerten Atmosphäre, z. B. unter Stickstoff, ist möglich und manchmal angezeigt. Die Lagerzeit von Immunogen-Formulierungen kann auch unter Verwendung von Verbindungen mit nur einer kleinen Zahl an Doppelbindungen verlängert werden, das heißt durch ein niedriges Maß an Unsättigung, durch die Zugabe von Antioxidantien, Chelatoren und anderer stabilisierender Mittel oder durch die Herstellung der Immun- Durchdringungsmittel ad hoc oder in situ aus einem gefriergetrockneten oder trockenen Gemisch.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Impfstoffs gemäß der Erfindung sind die Verbindung, die Moleküle mit Cytokin- oder anti-Cytokin-Aktivität spezifisch freisetzt oder spezifisch induziert, und das Antigen mit dem Durchdringungsmittel assoziiert.
In einer weiterhin bevorzugten Ausführungsform des Impfstoffs gemäß der Erfindung ist das weniger lösliche, selbstaggregierende Molekül ein polares Lipid und die löslichere Komponente ein grenzflächenaktiver Stoff oder ein grenzflächenaktives Stoffähnliches Molekül ist oder ansonsten diejenige Form eines polaren Lipides, die genügend löslich für den Zweck der Erfindung ist.
In einer zusätzlichen bevorzugten Ausführungsform des Impfstoffs gemäß der Erfindung ist der mittlere Durchmesser des Durchdringungsmittels zwischen 30 nm und 500 nm, vorzugsweise zwischen 40 nm und 250 nm, stärker bevorzugt zwischen 50 nm und 200 nm und besonders bevorzugt zwischen 60 nm und 150 nm.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung einen Impfstoff, wobei das Gesamtgewicht der Tropfen in der Formulierung zum Gebrauch auf menschlicher oder tierischer Haut 0,01 Gewichts-% bis 40 Gewichts-% der gesamten Masse, insbesondere zwischen 0,1 Gewichts-% und 30 Gewichts-% und am meisten bevorzugt zwischen 5 Gewichts-% und 20 Gewichts-% ist.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des Impfstoffs gemäß der Erfindung ist die Gesamtantigenkonzentration zwischen 0,001 Gewichts-% und 40 Gewichts-% der gesamten Masse des Durchdringungsmittels, insbesondere zwischen 0,01 Gewichts-% und 30 Gewichts-%, besser zwischen 0,1 Gewichts-% und 20 Gewichts-% und am meisten bevorzugt zwischen 0,5 Gewichts-% und 10 Gewichts-%.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des Impfstoffs gemäß der Erfindung umfaßt die Formulierung weiterhin (da) ein chemisches Reizmittel mit niedrigem Molekulargewicht und/oder (db) oder eine Verbindung mit niedrigem Molekulargewicht aus einem Pathogen oder ein Fragment oder ein Derivat davon.
In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform des Impfstoffs gemäß der Erfindung ist die Cytokin-Aktivität aufweisende Verbindung IL-4, IL-2, TGF, IL-6, TNF, IL- 1α und IL-1β, ein Typ I-Interferon, vorzugsweise IFN-α oder IFN-β, IL-12, IFN-γ, TNFβ, IL- 5 oder IL-10.
In einer mehr bevorzugten Ausführungsform des Impfstoffs gemäß der Erfindung ist die anti-Cytokin-Aktivität aufweisende Verbindung ein anti-Cytokin-Antikörper oder das entsprechende aktive Fragment, ein Derivat oder ein Analog davon.
Der Ausdruck "aktives Fragment oder Derivat davon" bedeutet in diesem Zusammenhang, daß die vorstehend zitierte Aktivität durch die verwendete Verbindung im Wesentlichen aufrechterhalten oder imitiert wird.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des Impfstoffs gemäß der Erfindung ist das Antigen von einem Pathogen abgeleitet.
In einer anderen besonders bevorzugten Ausführungsform des Impfstoffs gemäß der Erfindung ist das Pathogen ausgewählt aus extrazellulären Bakterien, einschließlich eiterbildenden Kokken wie Staphylococcus und Streptococcus, Gram-negativen Bakterien wie Meningococcus- und Gonococcus-Arten, Neisseria-Arten, Gram-negativen Bakterien, einschließlich Darmorganismen wie E. coli, Salmonella, Shigella, Pseudomonas, Diptheria, Bordetella Pertussis, und Gram-positiven Bakterien (z. B. Bacillus pestis, BCG), besonders anaeroben, wie die Clostridium-Arten, Bakterien und Viren, die innerhalb von Wirtszellen überleben und sich replizieren, umfassend Mycobakterien (z. B. M. tuberculosis) und Listeria monocytogenes, Retroviren und Adenoviren, einschließlich Hepatitisvirus, (menschlicher) Immundefizienzvirus, Herpesviren, Pocken- (Windpocken), Influenza-, Masern-, Mumps- und Polio-Viren, Cytomegalievirus, Rhinovirus, usw., und Pilzen, die innerhalb von Wirtszellen gedeihen, Parasiten, einschließlich tierischer Parasiten wie Protozoen und Helminthen und Ectoparasiten wie Zecken und Milben oder Brucella-Arten, einschließlich des Cholera verursachenden Agens, Haemophilus-Arten ebenso wie Pathogenen, die Parathyphus, Pest, Tollwut, Tetanus und Röteln auslösen, und Pathogenen, die verschiedene Neoplasien, Autoimmunkrankheiten oder die mit anderen pathologischen Zuständen des tierischen oder menschlichen Körpers verwandt sind, verursachen, die nicht notwendigerweise von pathogenen Infektionen herrühren.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Impfstoffs gemäß der Erfindung ist das Allergen xenogenen oder endogenen Ursprungs, stammt von einem Mikroorganismus, einem Tier oder einer Pflanze und führt zu einer akuten hypersensitiven Reaktion des Körpers, der dem Allergen ausgesetzt ist, wobei viele solche Allergene von Milben, Pollen, tierischem Haar oder Hautteilen abstammen, oder es gehört zu der Gruppe künstlicher und/oder reizender anorganischer Stoffe oder zu solchen Teilen oder Komponenten des menschlichen Körpers, die fälschlicherweise durch das Körperimmunsystem prozessiert oder dem Körperimmunsystem exponiert wurden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Impfstoffs gemäß der vorliegenden Erfindung ist die Konzentration jeder verwendeten Verbindung, die Cytokin- Aktivität aufweist, bis zu 1000-fach höher gewählt ist als das Konzentrationsoptimum, das in den entsprechenden Versuchen mit dem Antigen und dem gewählten Immunadjuvanz etabliert wurde, durchgeführt mittels subkutaner Injektion der Formulierung oder durch in vitro- Versuche, und vorzugsweise bis zu 100-fach, öfters bis zu 50-fach und noch besser bis zu 20- fach höher ist.
In einer verschiedenen bevorzugten Ausführungsform des Impfstoffs gemäß der vorliegenden Erfindung ist der Pathogenextrakt oder die Verbindung ein Lipopolysaccharid, Cordfactor (Trehalose-Dimycolat), Muramyldipeptid oder ein anderes (Poly)Saccharid oder (Poly)Peptid, identisch mit oder ähnlich einem immunologisch aktiven Teil einer Membran eines Pathogens; ein Extrakt eines Pathogens, einschließlich bakterieller Exo- und Endotoxine, vorzugsweise Cholera-Toxin und das hitzelabile Toxin von E. coli, ein A-Kette-Derivat, eine Komponente mit einer ADP-ribosylierenden Aktivität, ein Peptidoglycan, ein von Clostridium stammendes Toxin oder ein gereinigtes Proteinderivat von M. tuberculosis, LT-R192G, Fibronectin bindendes Protein 1 von Streptococcus pyrogenes oder ein äußeres Membranprotein von Gruppe B-Neisseria meningitidis (GBOMP).
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Lipopolysaccharid Lipid A oder ein Derivat ist und eine Modifikation davon wie Monophosphoryl-Lipid A oder sein Analog wie ein Fettderivat von Saccharose.
In einer anderen besonders bevorzugten Ausführungsform des Impfstoffs gemäß der vorliegenden Erfindung ist die Konzentration der Pathogenverbindung, die von einem Pathogen stammt, zwischen 10-fach niedriger und bis zu 1000-fach höher als diejenige, die sonst bei den entsprechenden injizierten Formulierungen unter Verwendung eines ähnlichen Antigens verwendet wird, wobei die epikutan verabreichte Immunadjuvanskonzentration sich öfter von der injizierten Immunadjuvanskonzentration durch den Faktor zwischen 0,5 und 100 unterscheidet, oder besser durch den Faktor zwischen 1 und 50 und im besten Fall zwischen 2 und 25.
In noch einer anderen besonders bevorzugten Ausführungsform des Impfstoffs gemäß der vorliegenden Erfindung ist das Reizmittel mit niedrigem Molekulargewicht ausgewählt aus den Klassen von allergenen Metallionen, Säuren, Basen, reizenden Flüssigkeiten, (Fett)Alkoholen, (Fett)Aminen, (Fett)Ethern, (Fett)Sulfonaten, (Fett)Phosphaten, usw. oder anderen geeigneten Lösemitteln oder Amphiphilen oder aus der Gruppe von grenzflächenaktiven Stoff-ähnlichen Molekülen, oft mit die Hautpermeation verstärkenden Eigenschaften, sowie Derivaten oder Kombinationen davon.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Impfstoffs gemäß der vorliegenden Erfindung ist die Konzentration des Reizmittels mit niedrigem Molekulargewicht um mindestens den Faktor 2, öfters um den Faktor 5, noch besser um den Faktor 10 oder mehr unterhalb der Konzentration gewählt, die in unabhängigen Versuchen an demselben oder an einem vergleichbaren Individuum auf Grund der lokalen Reizung als nicht akzeptabel angesehen wird, ermittelt durch die Methoden und Standards, die gewöhnlich zur Untersuchung eines solchen Reizmittels verwendet werden.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform des Impfstoffs gemäß der vorliegenden Erfindung gehört das Allergen zu der Klasse der Inhalationsallergene, einschließlich verschiedener Pollen, Sporen, Stückchen von Tierhaaren, von Haut, Feder, natürlichen und synthetischen Textilien, Weizen, (Haus)Staub, einschließlich Milben; Nahrungsmittel- und Arzneistoffallergene; Kontaktallergene; Injektions-, Invasions- oder Depotallergene wie verschiedene (gastrointestinale) Würmer, Echinokokken, Trichinen, usw., ein Teil eines Implantationsmaterials usw.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Impfstoffs gemäß der vorliegenden Erfindung unterscheidet sich die angewendete Dosis eines Antigens um den Faktor 0,1 bis 100 von der Dosis, die sonst im Verfahren der Immunisierung injiziert worden wäre, ist aber öfters im Bereich zwischen 0,5 bis 50, noch besser zwischen 1 und 20 und idealerweise weniger als 10-fach höher ist als diejenige, die bei einer Injektion verwendet wird.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des Impfstoffs gemäß der vorliegenden Erfindung ist die verabreichte Durchdringungsdosis zwischen 0,1 mg/cm² und 15 mg/cm², sogar noch öfters im Bereich zwischen 0,5 mg/cm² und 10 mg/cm² und vorzugsweise zwischen 1 mg/cm² und 5 mg/cm². Es kann auch von Vorteil sein, für den Zweck verschiedene Verabreichungsflächen zu verwenden, um die verabreichte Dosis des Immunogens zu kontrollieren, wobei leicht zugängliche oder geschützte Körperflächen (wie Brust- oder Rückenbereiche, Arme, die Seite des Nackens, z. B. hinter den Ohren, oder sogar im Schädelbereich) verwendet werden können.
In einer verschiedenen bevorzugten Ausführungsform des Impfstoffs gemäß der vorliegenden Erfindung ist das Antigen ein reines oder gereinigtes Antigen. Die Verwendung von hoch gereinigten Antigenen bei den Impfstoffen der Erfindung hat sich bei der Erzeugung einer schützenden Immunantwort als besonders vorteilhaft herausgestellt.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin einen Kit, umfassend mindestens eine Dosis des Impfstoffes in Flaschen- oder anderweitig verpackter Form.
In einer bevorzugten Ausführungsform gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt der Kit mindestens eine injizierbare Dosis des vorstehend beschriebenen Antigens.
Die vorliegenden Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Erzeugung einer schützenden Immunantwort in einem Säuger, umfassend die Impfung des Säugers mit einem vorstehend beschriebenen Impfstoff.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung werden verschiedene Behandlungsflächen ausgewählt, um die verabreichte Immunogendosis und das Ergebnis der therapeutischen Impfung zu kontrollieren.
In einer stärker bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Suspension von antigenfreien Durchdringungsmitteln mit dem Antigen während des Tages vor der Verabreichung, vorzugsweise 360 Minuten, stärker bevorzugt 60 Minuten und noch mehr bevorzugt 30 Minuten vor der Verabreichung der entstehenden Formulierung auf die Haut beladen, um sie mit dem Antigen zu verbinden.
In einer verschiedenen bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung wird der Impfstoff der vorliegenden Erfindung auf die Haut verabreicht, nachdem das Organ durch eine Immunadjuvansmanipulation vorbehandelt worden ist, wobei die Manipulation z. B. darin besteht, daß man die Haut reibt, drückt, erwärmt, einem elektrischen oder mechanischen Feld, z. B. Ultraschall-Feld, aussetzt, usw., oder eine nicht-immunogene Formulierung in die Haut injiziert worden ist, mit der Maßgabe, daß jede dieser Behandlungen Immunadjuvansverbindungen aus der Haut oder anderen peripheren, immunaktiven Geweben freisetzt oder sonst die Konzentration/Dauer der Wirkung von Antagonisten auf die gewünschte Impfung reduziert.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung wird das Immunogen in einem nicht-okklusiven Pflaster verabreicht. Diese Ausführungsform kann auch zum Zwecke der Bewertung der Hautreaktion auf ein epikutan verabreichtes Immunogen in der Durchdringungsmittelsuspension verwendet werden, auf das diese, zumindest ursprünglich, allergisch ist und das daher Anlaß ist zu einer akuten lokalen Hypersensitivitätsreaktion, wie zum Beispiel an der resultierenden Entzündung, Reizung usw. gesehen wird.
In einer anderen Ausführungsform des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung wird mindestens eine Dosis des Impfstoffs verabreicht.
Diese Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung umfaßt die wiederholte Verabreichung des Impfstoffs der Erfindung. Die wiederholte Verabreichung umfaßt die wiederholte Verabreichung auf die Haut oder eine oder mehrere Verabreichungen auf die Haut in Kombination mit z. B. parenteralen Verabreichungen. In diesem Zusammenhang kann der Kit der Erfindung vorteilhafterweise verwendet werden, der einen oder mehrere Behältnisse oder Ampullen umfaßt, die den Impfstoff der Erfindung enthalten.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung wird der Impfstoff als Booster-Impfung verabreicht.
In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung wird die primäre Immunisierung invasiv vorgenommen, typischerweise durch subkutante Injektion oder eine andere geeignete, die Hautbarriere perforierende/zerstörende Methode, und wobei mindestens eine folgende Booster- Immunisierung nichtinvasiv vorgenommen wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung wird der Impfstoff zwischen 2 und 10, vorzugsweise zwischen 2 und 7, noch stärker bevorzugt bis zu 5 und am meisten bevorzugtesten bis zu 3 mal verabreicht, wenn ein nicht- allergenes Antigen verwendet wird, oder im Falle eines Allergens, entweder so oft vorgenommen, wie erforderlich ist, um die gewünschte Immuntoleranz zu erreichen, festgestellt durch ein geeignetes Bestimmungsverfahren, oder sonst den Versuch als gescheitert anzusehen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung wird das Zeitintervall zwischen den aufeinanderfolgenden Impfungen zwischen 2 Wochen und 5 Jahren gewählt, öfters zwischen 1 Monat und bis zu 3 Jahren, häufiger zwischen 2 Monaten und 1,5 Jahren. In einer weiterhin bevorzugten Ausführungsform wird die wiederholte Immunogen-Verabreichung verwendet, um die letztliche Wirkung der therapeutischen Impfung zu maximieren. Es wird vorgeschlagen, zwischen 2 und 10, oft zwischen 2 und 7, typischer bis zu 5 und am meisten bevorzugt bis zu 3 Immunisierungen zu verabreichen, wenn ein nicht-allergenes Antigen verwendet wird, oder im Falle eines Allergens entweder so oft, wie erforderlich ist, um die gewünschte Immuntoleranz zu erreichen, festgestellt, wie vorstehend beschrieben, oder durch ein anderes geeignetes Bestimmungsverfahren, oder sonst den Versuch als gescheitert anzusehen. Das Zeitintervall zwischen den aufeinanderfolgenden Impfungen sollte vorzugsweise zwischen 2 Wochen und 5 Jahren sein, öfters zwischen 1 Monat und bis zu 3 Jahren, häufiger zwischen 2 Monaten und 1,5 Jahren, wenn ein Individuum zum ersten mal immunisiert wird. Nager wie Mäuse und Kaninchen werden vorteilhafterweise in 2-wöchigen Intervallen immunisiert, Primaten, z. B. Affen und oft Menschen, benötigen eine Booster-Impfung in einem 3-6-Monatsintervall.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung wird der Fluß der Durchdringungsmittel, die ein Immunogen durch die verschiedenen Poren in einem definierten Hindernis tragen, als eine Funktion einer geeigneten Antriebskraft oder eines Druckes, die oder der über das Hindernis hinweg wirken, bestimmt, und die Daten werden dann in geeigneter Weise über eine charakteristische Kurve beschrieben, die wiederum dazu verwendet wird, die Formulierung oder Anwendung weiter zu optimieren.
Die Erfindung betrifft letztlich die Verwendung des transdermalen Trägers, der Verbindung, die spezifisch Cytokin- oder anti-Cytokin-Aktivität freisetzt oder induziert oder eine solche Aktivität zeigt, des Antigens oder Allergens und gegebenenfalls eines Extrakts oder einer Verbindung eines Mikroorganismus oder eines Fragments oder eines Derivats davon und/oder eines chemischen Reizmittels mit niedrigem Molekulargewicht gemäß der vorstehenden Definition zur Herstellung eines Impfstoffes zur Induktion einer schützenden oder toleranzerzeugenden Immunantwort.
Der Offenbarungsgehalt der im Verlauf der Beschreibung zitierten Dokumente wird hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen. Weiterhin wird durch Bezugnahme der vollständige Offenbarungsgehalt der ebenfalls anhängigen Anmeldung eingeschlossen, die im Namen von Innovative Dermale Applikationen GmbH eingereicht wurde und die den Titel trägt "Transnasal transport/immunisation with highly adaptable carriers".
Die Figuren zeigen:
Fig. 1 zeigt die Daten über das Überleben von Tieren, die epikutan mit gemischten Micellen oder Transfersomen, die mit TT beladen waren, immunisiert worden waren, um den Effekt der Aggregatgröße (Stabilität) zu zeigen, da die über-destabilisierten Transfersomen normalerweise in gemischte Lipid-Micellen zerfallen.
In Fig. 2 wird der Vergleich zwischen der Immunantwort auf herkömmliche Lipid- Vesikel (Liposome) und ultradeformierbare Lipid-Vesikel (Transfersome) gezogen, die 11 tragen und auf die Haut aufgetragen wurden, wobei die Information über die Konzentrationen der entsprechenden spezifischen Antikörper im Serum (als Absorption ausgedrückt) im oberen Teil dargestellt ist.
Fig. 3 zeigt den Effekt von steigenden Dosen an Antigen auf das Ergebnis einer epikutanen Immunisierung mittels Transfersomen, wobei das Ergebnis als Absorptionsänderung, Antikörpertiter oder das Überleben von Tieren zusammen mit den entsprechenden Daten über die Isotypen der spezifischen Antikörper dargestellt wird.
Fig. 4 beleuchtet den Effekt der Reinheit des Antigens auf das Ergebnis einer epikutanen Immunisierung mit Tetanus-Toxoid in Transfersomen, einschließlich der Information über die Zeitabhängigkeit des Überlebens von Tieren.
Fig. 5 vergleicht das Ergebnis einer wiederholten invasiven (subkutanen) und nichtinvasiven (epikutanen) Immunisierung mittels TT in Transfersomen, einschließlich des Überlebens von Tieren, der Serumkonzentration (in Form der Absorption), des spezifischen Antikörpertiters und von Werten für das Muster der Antikörperverteilung.
Fig. 6 zeigt den Effekt einer Vorbehandlung der Haut (unspezifische Challenge) auf die Immunantwort nach erfolgter Transfersomen-vermittelter TT-Zufuhr durch die Haut.
Fig. 7 fokussiert den Adjuvans-Effekt eines Immun-Stimulators, Monophosphoryl- Lipid A (LA), mit relativ niedrigem Molekulargewicht, der zusammen mit TT in Transfersomen über die intakte Haut zugeführt wurde.
Fig. 8 zeigt die Immunadjuvans-Wirkung eines Cytokins, Interleukin-12 (IL-12), das zusammen mit TT mittels Transfersomen über die Haut transportiert wurde.
Fig. 9 beschäftigt sich mit der Immun-Modulierung der murinen Antwort gegen das TT-Antigen, das in Transfersomen nichtinvasiv durch die Haut zugeführt wurde, durch verschiedene Cytokine.
Fig. 10 stellt einen experimentellen Beweis für die Stimulierung der Immunantwort von Mäusen dar, die mit TT in Transfersomen auf der Haut behandelt wurden, wenn die Träger auch Cholera-Toxin (CT) enthielten, um die spezifische Antikörperproduktion und somit den Schutz von Tieren gegen eine ansonsten tödliche Challenge mit Tetanus-Toxin zu unterstützen.
Die in dieser Beschreibung zitierten Dokumente werden durch Bezugnahme eingeschlossen.
Die Beispiele illustrieren die Erfindung, definieren aber nicht ihre Grenzen.

Allgemeiner experimenteller Aufbau und Probenherstellung

Mäuse des Stamms Swiss albino (18-20 g) wurden vom National Institute of Nutrition (Hyderabad, Indien) erhalten. Sie waren zum Zeitpunkt der ersten Immunisierung 8 bis 12 Wochen alt und wurden normalerweise in Gruppen von 4 bis 6 in Ausschlußkäfigen gehalten. Die Tiere hatten freien Zugang zu Standardfutter und Wasser. Einen Tag vor einer Immunisierung wurde die Anwendungsfläche auf dem Rücken der Maus sorgfältig rasiert. Das Antigen wurde mit einer Pipette hoher Präzision auf die Hautoberfläche aufgebracht, und man ließ es teilweise austrocknen. Um den Abrieb des Immunogens zu vermeiden, wurden die Tiere in Einzelkäfige transferiert, in denen sie nach jeder epikutanen Materialverabreichung 18 Stunden gehalten wurden.
Eine allgemeine Anästhesie wurde verwendet, um die Testtiere während der Manipulationen einschließlich der Immunisierung streßfrei und ruhig zu halten. Eine Injektion eines Gemischs von Ketavet und Rompun (0,3 ml pro Maus einer isotonischen NaCl-Lösung, die 0,0071% Rompun (Bayer, Leverkusen, Deutschland) und 14,3 mg/ml Ketavet (Parke- Davis, Rochester, N. Y.) enthielt) in den Bauchraum wurde für diesen Zweck verwendet. Dies hielt die Tiere typischerweise etwa zwei Stunden schlafend.

Immunogene

Ultradeformierbare Immun-Träger oder Immun-Durchdringungsmittel (Immun- Transfersomen), die in dieser Arbeit untersucht wurden, hatten typischerweise die Form von (Oligo)Doppelschicht-Vesikeln. Sie enthielten biokompatible (Phospho)Lipide wie Phosphatidylcholin und grenzflächenaktive (Bio)Stoffe wie Natriumcholat oder Polysorbat (Tween 80), wobei verschiedene Zusammensetzungen möglich waren, um die hohe Deformierbarkeit der Aggregate zu erhalten. Zusätzliche Inhaltsstoffe waren Monophosphoryl-Lipid A mit einer vielseitigen Immunadjuvans-Aktivität und Antigene, wie es erforderlich war und spezifiziert ist.
Herkömmliche Vesikel, Liposomen, umfaßten Soja-Phosphatidylcholin (SPC; Nattermann Phospholipids, Rhone-Poulenc Rorer, Köln, Deutschland) und wurden, wie nachstehend beschrieben, hergestellt. Eine organische Lipidlösung mit oder ohne dem Adjuvans Monophosphoryl-Lipid A (MLA) mit 0,04 Mol-% relativ zu SPC wurde zunächst unter Vakuum (10 Pa, übernacht) getrocknet. Der resultierende Lipidfilm wurde mit einer Lösung von Tetanus-Toxoid (2,0 mg/ml, Accurate antibodies, NY, USA) in Phosphatpuffer (pH = 6,5) hydratisiert, um eine Lipidsuspension von 10 Gew.-% zu erhalten. Eine rohe Suspension von Lipidvesikeln wurde durch eine Reihe von Polycarbonatmembranen mit Poren von 800 nm, 400 nm und 200 nm gepreßt, um die endgültige Vesikelgrößenverteilung einzuengen.
Hochdeformierbare Vesikel, Transfersomen, wurden, wie früher beschrieben, hergestellt (Paul et al., 1995, op. cit.). Kurz gesagt wurde eine ethanolische SPC-Lösung mit Natriumcholat (Merck, Darmstadt, Deutschland) (3,75/l Mol/Mol) und, falls erforderlich, dem Adjuvans gemischt. Das Gemisch wurde in 10 mM Phosphatpuffer (pH = 6,5) dispergiert. Dies wurde in der Anwesenheit von Tetanus-Toxoid in der Lösung getan, um, wie erforderlich, eine Suspension von zwischen 0,25 mg und 2,0 mg Protein pro 1 ml zu ergeben. Die Vesikel-Suspension wurde dann dreimal eingefroren und aufgetaut. Anschließend wurde die Formulierung unter Druck durch ein mikroporöses Filter (200 nm; Poretics, CA) geschickt. Um die Reproduzierbarkeit der Vesikelherstellung zu überprüfen wurde bei jeder Herstellung die optische Dichte bei 400 nm gemessen, und es wurde bestätigt, daß sie annähernd konstant war.
Durch Variierung des Verhältnisses des grenzflächenaktiven Stoffes zu Lipid wurde die Defomierbarkeit der vesikulären Aggregate kontrolliert, bis zu der Konzentration, bei der die Membranen wegen der hohen Konzentration an grenzflächenaktivem Stoff instabil wurden und sich in eine micelläre Form umwandeln. Die Lipid-Vesikel ohne Zusatz von grenzflächenaktivem Stoff, die im allgemeinen als Liposomen bekannt sind und die mindestens 10fach weniger flexible Membranen haben als die Transfersomen, wurden als negative Kontrollen verwendet.
Die Gesamtkonzentration an Lipid war typischerweise 10 Gew.-%, außer anders festgehalten. Die Antigenkonzentration war typischerweise, aber nicht notwendigerweise, in der Größenordnung von 1 mg/ml. Ein Puffer, der ein Mikrobizid enthielt, stellte die Hauptphase bereit. Für andere geeignete Zusammensetzungen wird der Experte ausdrücklich auf andere Publikationen und Patente aus unserem Labor verwiesen,
Die Immunisierungen wurden mit verschiedenen Formulierungen vorgenommen, einschließlich ultradeformierbarer Vesikel ohne Antigene; solche Vesikel enthielten dann das Tetanus-Toxoid (mit oder ohne Lipid A) und freies Immunogen. Jede Formulierung wurde in sechs Mäusen getestet, außer es ist anders festgehalten.
Im Falle der subkutanen Immunisierung wurden 40 ug Immunogen pro Maus injiziert. Für die nichtinvasive Verabreichung wurden Tetanus-Toxoid-Dosen zwischen 1 ug und 80 ug, assoziiert mit verschiedenen Trägern, pro Maus auf die intakte Haut am oberen Rücken aufgebracht. Alle nicht-injizierten Formulierungen wurden mit einer Pipette hoher Präzision aufgebracht und trocknen gelassen; während dieser Periode wurden die Mäuse in getrennten Käfigen gehalten, um das Abtragen des aufgebrachten Materials zu minimieren, wie es aus dem Reiben der Rücken der Mäuse aneinander resultieren könnte. Die Tiere wurden alle zwei Wochen einer Boosterung unterzogen, das heißt an den Tagen 14 und 28; das gesamte Immunisierungsschema bestand somit aus drei Dosen und umfaßte eine Primärimmunisierung und zwei Boosterungen.
Den Tieren wurde an den Tagen 7, 21 und 35 retro-orbital Blut entnommen. Das gesammelte Blut durfte zunächst verklumpen. Nach einer kurzen Zentrifugation in einer Mikro-Zentrifuge wurde das Serum abgetrennt, bei 56ºC 30 Minuten dekomplementiert und dann bei -20ºC aufbewahrt, bis die Gesamtkonzentration an Antikörper und die spezifischen Antikörperisotypen bestimmt wurden.
Absorptionsmessungen wurden unter Verwendung von Standard-UV-Vis- Spektrometern vorgenommen.
Die Messung von Tetanus-Toxoid (TT)-spezzifischen Antikörpern im Serum durch ELISA. Die Spiegel von anti-Tetanus-Antikörpern wurde mittels ELISA in herkömmlicher Weise durchgeführt, typischerweise doppelt. Kurz gesagt wurden ELISA-Platten (maxisorp: NUNC, Deutschland) mit einem Teilvolumen (100 ul, die 10 ug TT/ml enthielten) in Beschichtungspuffer (Na&sub2;CO&sub3;/NaHCO&sub3;, pH = 9,6) drei Stunden bei 37ºC beschichtet. Die Mulden wurden zunächst dreimal mit 200 ul/Mulde mit Waschpuffer gewaschen und dann mit 2% Milch in Waschlösung (für 1000 ml 8 g NaCl, 1,45 g Na&sub2;HPO&sub4;·2H&sub2;O, 0,2 g KH&sub2;PO&sub4;, 0,2 g KCl und 0,05% Tween-20) 3 Stunden bei 37ºC blockiert. Nach einem einzelnen Waschvorgang mit 200 ul/Mulde Waschpuffer wurden die Platten mit verschiedenen Verdünnungen (1/50 bis 1/6400) Testserum inkubiert. Nach einer Inkubation über Nacht bei 4ºC wurden die Platten dreimal mit 200 ul/Mulde Waschpuffer gewaschen und mit 100 ul sekundärem Antikörper inkubiert. Zur Bestimmung der Mengen an IgG, IgA oder IgM wurde Meerrettichperoxidase (hrp) verwendet, die mit dem entsprechenden anti-Ig konjugiert war. Nach 3 Stunden Inkubation bei 37ºC wurden die Platten dreimal mit 200 ul/Mulde mit Waschpuffer gewaschen und die Farbe wurde unter Verwendung von o-Phenyldiamin als hrp- Substrat entwickelt. 0,4 mg/mi o-Phenyldiamin in Phosphat-Citrat-Puffer (pH 4,5) mit 0,4 ul H&sub2;O&sub2; pro ml wurden für diesen Zweck verwendet. Nach 2 Minuten wurde die Reaktion durch Zugabe von 50 ul 2N H&sub2;SO&sub4; gestoppt. Die Absorption wurde bei 492 nm gemessen.
Das Verfahren, das zum Nachweis der verschiedenen Isotypen verwendet wurde, basierte ebenfalls auf ELISA. Es beruhte auf Peroxidase-markierten, Affinitäts-gereinigten sekundären Antikörpern, die spezifisch für IgG1 (1 : 1000), IgG2a (1 : 1000), IgG2b (1 : 1000) und IgG3 (1 : 200) waren, die alle von ICN ImmunoBiologicals erhalten wurden. Weitere sekundäre Antikörper umfaßten IgA (1 : 1000) und IgM (1 : 1000), verknüpft mit Meerrettichperoxidase (Sigma, Neu-Ulm, Deutschland). Das entsprechend markierte anti- Maus-IgE wurde bei PharMingen (San Diego, CA) gekauft. Den Antigenen wurde erneut gestattet, an Testplatten zu absorbieren, und sie wurden mit dem Testserum inkubiert, nachdem überschüssiges Antigen weggewaschen worden war. Anschließend wurden 100 ul der geeigneten Lösung an spezifischem sekundärem Antikörper zu einer der sechs verschiedenen Platten zugegeben, um anti-IgG1, -IgG2a, -IgG2b, -IgG3, -IgA bzw. -IgM zu bestimmen. Die Platten wurden dann 3 Stunden bei 37ºC inkubiert und weiter verarbeitet, wie in den vorstehenden Kapiteln beschrieben.
Challenge mit Antigen (dem Tetanus-Toxin) in vivo. Am Tag 35 wurden Testtiere durch subkutane (s.c.) Injektion der 50fachen LD&sub5;&sub0; des Tetanus-Toxins einer Challenge unterworfen. (Der aktuelle Wert der LD&sub5;&sub0; wurde in separaten Experimenten festgestellt, während derer eine Gruppe von 16 Tieren mit übereinstimmendem Gewicht s.c. mit wachsenden Mengen an Toxin einer Challenge unterworfen wurden und die Zahl an überlebenden Tieren bestimmt wurde). Um die akute TT-Toxizität bei geimpften Tieren zu bestimmen, wurde der klinische Status solcher Testmäuse nach der ersten Challenge 4 Tage lang bestimmt.
Nicht-geschützte Mäuse zeigten nach 24 Stunden Anzeichen von Paralyse, die spätestens nach 36 Stunden zum Tod führten. Tiere, die über 4 Tage nach der Challenge keine Anzeichen von Paralyse oder andere Anomalien entwickelten, wurden als immun gegen Tetanus eingestuft.
Die Langzeit-Immunität wurde durch Challenge aller immunisierten Mäuse auf monatlicher Basis für mindestens ein halbes Jahr mit einer Dosis an Toxin getestet, die der 50fachen LD&sub5;&sub0; entsprach.

Beispiele 1-2:

Effekt der Aggregatgröße (Stabilität)

Hoch deformierbare Vesikel (TransfersomenTM: IDEA):
87,4 mg Phophatidylcholin von Sojabohne (SPC)
12,6 mg Natriumcholat (NaChol)
0,04 Mol-% Monophosphoryl-Lipid A (MLA, LA) im Verhältnis zu SPC
0,9 ml Phosphatpuffer, 10 mM, pH 6,5
0,1 ml Ethanol
(Gemischte Lipid-)Micellen:
65 mg Phophatidylcholin von Sojabohne (SPC)
35 mg Natriumcholat (NaChol)
0,04 Mol-% Monophosphoryl-Lipid A (MLA) im Verhältnis zu SPC
0,9 ml Phosphatpuffer, 10 mM, pH 6,5
0,1 ml Ethanol
Tetanus-Toxoid (2 mg/ml, Accurate Antibodies) wurde mit einer Dosis von 40 ug (20 ul) oder 80 ug (40 ul) TT pro Maus und Immunisierung verwendet.
Anwendungsfläche: 1 cm² oder 2 cm² für 40 kg oder 80 ug TT pro Maus auf dem oberen Rücken.
Um den Effekt der Stabilität der Formulierung auf die immunologischen Eigenschaften verschiedener, epikutan verabreichter Formulierungen zu testen, wurden zwei Arten von Aggregaten hergestellt: relativ große Vesikel (Durchmesser zwischen 100 nm und 200 nm) und relativ kleine Micellen (Durchmesser unter 50 nm). Die letzteren wurden mit der Erwartung ausgewählt, daß unter suboptimalen Bedingungen (wegen des Abbaus von Lipid oder einer ungeeigneten Aggregatzusammensetzung) die letzteren aus den ersteren entstehen könnten.
Antikörpertiter, wie widergespiegelt in der Serumabsorption bei 492 nm, sind in Fig. 1 gezeigt. Sie zeigen, daß die gemischten Lipid-Micellen weniger effiziente Antigenträger sind als die ultradeformierbaren gemischten Lipid-Vesikel (Tfs), die mit derselben Menge an TT beladen waren. Die gemischten Micellen, die weniger potente Detergentien entielten (mit einer geringeren Fähigkeit, die Durchdringung der Haut zu steigern), waren sogar noch weniger effiziente Mediatoren der Immunantwort.
Die Schutzergebnisse bei Tieren zeigen einen ähnlichen Trend, wie gezeigt im unteren Teil von Fig. 1.

Beispiele 3-4:

Effekt der Deformierbarkeit der Aggregate

Herkömmliche Lipid-Vesikel (Liposomen)
100 mg Phophatidylcholin von Sojabohne (SPC)
0,4 Mol-% Monophosphoryl-Lipid A (MLA) im Verhältnis zu SPC
0,5 ml Phosphatpuffer, 10 mM, pH 6,5
2 mg/ml Tetanus-Toxoid (Accurate Antibodies)
Hochdeformierbare Vesikel (TransfersomenTM)
87,4 mg Phophatidylcholin von Sojabohne (SPC)
12,6 mg Natriumcholat (NaChol)
0,04 Mol-% Monophosphoryl-Lipid A (MLA) im Verhältnis zu SPC
0,9 ml Phosphatpuffer, 10 mM, pH 6,5
0,1 ml Ethanol
Tetanus-Toxoid wurde mit einer Dosis von 40 ug oder 80 ug TT/Maus/Immunisierung verwendet.
Anwendungsfläche: 1 cm² oder 2 cm² für 40 ug oder 80 ug TT/Maus/Immunisierung auf dem oberen Rücken.
Ergebnisse, die mit den herkömmlichen Vesikeln erhalten wurden, unterschieden sich von den Daten, die mit hoch deformierbaren Vesikeln gemessen wurden: einfache Liposomen, die die engen Poren in einer Barriere nicht durchqueren, rufen auch keinen wesentlichen Antikörpertiter hervor. Umgekehrt erzeugen die Vesikel mit einer hoch flexibilen und deformierbaren und daher besser anpaßbaren Membran, von denen separat gezeigt wurde, daß sie sich leichter durch die engen Poren in einer Membran bewegen, gemäß den Resultaten der Messungen der Absorption im Serum (vgl. Fig. 2), eine merkliche Menge an Antikörper, wenn sie auf die intakte Haut aufgetragen werden.

Beispiele 5-10:

Wirkung der Antigendosis

Hochdeformierbare Vesikel:
86,3 mg Phophatidylcholin von Sojabohne (SPC)
13,7 mg Natriumcholat (NaChol)
0,04 Mol-% Monophosphoryl-Lipid A (MLA) im Verhältnis zu SPC
0,9 ml Phosphatpuffer, 10 mM, pH 6,5
0,1 ml Ethanol
Tetanus-Toxoid (TT: Accurate Antibodies, New York, USA)-Konzentration:
leer, 0,25 mg/ml, 0,5 mg/ml, 1 mg/ml, 2 mg/ml, was 0 ug, 10 ug, 20 ug, 40 ug oder 80 ug TT/Maus/Immunisierung ergab.
Anwendungsfläche: 1 cm² für 0 ug, 10 ug, 20 ug und 40 ug und 2 cm² für 80 ug TT/Maus/Immunisierung auf dem oberen Rücken.
Die Ergebnisse dieser Serie an Experimenten sind in Fig. 3 dargestellt. Sie zeigt klar das Anwachsen der Immunantwort auf epikutan verabreichtes Tetanus-Toxoid in ultradeformierbaren Trägern mit wachsender TT-Dosis. Dies spiegelt sich in der Serumabsorption (bis zu der Dosis von 20 ug/Immunisierung), in dem spezifischen Antikörpertiter (bis zu der Dosis von 40 ug/Immunisierung) und in den Überlebensdaten (die bei Dosen von bis zu 80 ug/Immunisierung keine Sättigung erreichten), wider.
Weniger Klarheit findet sich im Muster der Isotyp-Verteilung außer für IgG1 (mit einem starken Hinweis auf Sättigung der Antwort) und für IgG2b (vielleicht mit einer Sättigung zwischen 40 ug und 80 ug pro Immunisierung). IgM zeigt eine ähnliche Dosisabhängigkeit zu der von IgG1. Das für IgG2a erhaltene Bild ist verwirrend.

Beispiele 11-13:

Effekt der Antigenreinheit

Hochdeformierbare Vesikel:
Wie beschrieben bei den Beispielen 5-10 (außer, daß die Gruppe, die mit unreinem TT behandelt wurde, kein Lipid A als Immunadjuvans erhielt)
Tetanus-Toxoid: 2 mg/ml, entsprechend 80 ug TT pro Maus/Immunisierung
Anwendungsfläche: 2 cm² auf dem oberen Rücken.
Die Antigenreinheit beeinfluß das Niveau des Schutzes der Maus gegen Tetanus- Toxin, wenn das Toxoid nichtinvasiv auf die Haut aufgetragen wird. (Ähnliche Ergebnisse, die mit injiziertem Antigen erhalten wurden, sind nicht gezeigt).
Um die vorstehend erwähnte Feststellung zu substantiieren wurde das Mediumfiltrat von einer Kultur von Clostridium tetani, in vitro gezüchtet, zunächst als unreines Antigen verwendet. Um partiell gereinigtes Antigen zu erhalten, wurde ein solches Filtrat durch eine Membran mit einer Ausschlußgrenze von 10 kDa gegeben und sorgfältig mit Phosphatpuffer, pH 6,5, gewaschen; bei dem Verfahren wurde das Kulturfiltrat 15fach konzentriert. Gereinigtes Toxoid wurde bei Accurate Antibodies, NY, USA, gekauft.
Swiss albino-Mäuse (n = 6) wurden mit einer identischen, nominalen Dosis von unreinem Antigen, mit partiell gereinigtem Antigen, das mit Monophosphoryl-Lipid A ergänzt war oder mit gereinigtem Antigen mit zugesetztem Monophosphoryl-Lipid A immunisiert. Das Antigen war immer mit ähnlichen Transfersomen assoziiert. Die Zusammensetzung und das Verfahren der Herstellung des letzteren waren dieselben, wie bei den vorstehenden Beispielen beschrieben. Die Details des Immunisierungszeitplans, der Zeitpunkte der Blutentnahme und der Challenge ebenso wie die Details der Analyse waren auch ähnlich zu den vorstehend erwähnten.
Die Ergebnisse sind in Fig. 4 dargestellt. Sie zeigen, welche Rolle die Reinheit des Antigens bei der Bestimmung der Qualität ebenso wie der Stärke einer Immunantwort gegen TT spielt. Die in Fig. 4 gezeigten Daten zeigen darüber hinaus, daß die Absorption von sogar dem spezifischen Antikörpertiter keine verläßliche Vorhersage des therapeutischen, das heißt prophylaktischen Effekts, einer epikutanen Impfung zuläßt. Das liegt an den großen Unterschieden bei den spezifischen Antikörperisotypen, die nur einen wesentlichen Anteil von Th1-ähnlichem IgG2b enthalten im Vergleich mit der Th2-ähnlichen IgG1-Komponente, wenn ausreichend reines Antigen verwendet wird (vgl. auch Seite 12).

Beispiele 14-15:

Vergleich von epikutaner und subkutaner Verabreichung

Hochdeformierbare Vesikel, TransfersomenTM (IDEA):
wie in den Beispielen 5-10 beschrieben
Tetanus-Toxoid-Dosis:
80 ug TT pro epikutaner Immunisierung
(unter Verwendung von 2 mg TT/ml und einer Anwendungsfläche von 2 cm²)
40 ug TT pro subkutaner Injektion (unter Verwendung von 2 mg TT/ml)
Unter Verwendung desselben experimentellen Verfahrens, wie bei den Beispielen 1-4 beschrieben, wurden, wenn angezeigt, der Antikörper-spezifische Serumtiter, das Ausmaß des Schutzes der Tiere gegen Tetanus-Toxin und das relative Vorkommen verschiedener, spezifischer Antikörper-Isotypen bestimmt.
Die Resultate sind in Fig. 5 dargestellt. Während das von der Immunisierung abhängige Anwachsen der Serumabsorption nach invasiver und nichtinvasiver Antigenverabreichung vergleichbar ist, ist der Titer im letzteren Fall nach der primären Immunisierung um den Faktor 6 und um den Faktor 8 nach der zweiten Boosterung etwas niedriger. Während die TT-spezifischen Spiegel von Th2 anzeigendem IgG1 bei beiden Ausführungen des Experiments ähnlich sind, sind in ähnlicher Weise die spezifischen Messungen für andere Antikörper-Subtypen, insbesondere für IgG2a und zu frühen Zeitpunkten auch für IgG2b um den Faktor 25 bzw. 3, höher nach Antigeninjektionen. Die Wahrscheinlichkeit, daß die Testmäuse einen anschließende Challenge mit einer normalerweise tödlichen Dosis an injiziertem Tetanus-Toxin überleben, ist jedoch zumindest im Rahmen dieser Serie an Experimenten unabhängig vom Verabreichungsweg des Antigens.

Beispiele 16-17:

Effekt der Adjuvans-Behandlung der Haut (Präinjektion)

Hochdeformierbare Vesikel, TransfersomenTM (IDEA):
89,3 mg Phophatidylcholin von Sojabohne (SPC)
10,7 mg Natriumcholat (NaChol)
0,04 Mol-% Monophosphoryl-Lipid A (MLA) im Verhältnis zu SPC
0,9 ml Phosphatpuffer, 10 mM, pH 6,5
0,1 ml Ethanol
Tetanus-Toxoid, 2 mg/ml, entsprechend 80 ug TT pro Maus/Immunisierung von 6 Swiss albino-Mäusen pro Gruppe unter Verwendung von unreinem Antigen
Anwendungsfläche: 2 cm² auf dem oberen Rücken.
Transkutaner Transport von Makromolekülen, die mit Transfersomen assoziiert sind, über die Haut scheint extrem schonend zu sein; wenn das Antigen mit niedriger Menge oder unrein verwendet wird, ist er daher nicht in der Lage, das Immunsystem in Richtung einer Th2-ähnlichen Immunantwort anzustoßen. Um diese Situation zu verändern, kann die Haut vor der aktuellen nichtinvasiven Antigenverabreichung mittels ultradeformierbarer Vesikel (prä)stimuliert werden, um die entsprechenden Botenmoleküle von dem Organ freizusetzen. Zu diesem Zweck haben wir die Anwendungsstelle mit 0,1 ml Salzlösung oder einer milden Formulierung von nicht-antigenen Vesikeln präinjiziert, die aus biologisch abbaubarem Material von ähnlicher Zusammensetzung wie die Antigen tragenden Vesikel hergestellt worden waren, und zwar einen Tag vor der Verwendung der letzteren. Zur zusätzlichen Kontrolle wurde in verschiedene Tiere 24 Stunden vor der Verabreichung der Immun-Träger auf die Haut auch unvollständiges Freundsches Adjuvans injiziert.
Illustrative Beispiele der Ergebnisse sind in Fig. 6 dargestellt. Sie offenbaren höhere Titer an spezifischen Antikörpern, insbesondere mit einem verbesserten Schutz für die Mäuse, die durch Injektionen anstatt durch Trägerformulierung auf der Haut, wobei diese als Kontrolle dienten, vorbehandelt wurden. Der Effekt von unvollständigem Freundschen Adjuvans ist überraschend schwach.
Es ist bemerkenswert, daß die Serumabsorption oder der spezifische Antikörpertiter und das Überleben der Tiere, was ein schützender Impfeffekt ist, nicht korreliert sind.

Beispiele 18-21:

Effekt von Adjuvans mit niedrigem Molekulargewicht (Lipid A)

Hochdeformierbare, immun-modulierte TT-TransfersomenTM (IDEA):
86,3 mg Phophatidylcholin von Sojabohne (SPC)
13,7 mg Natriumcholat (NaChol)
0,04 Mol-% Monophosphoryl-Lipid A (LA) im Verhältnis zu SPC
0,9 ml Phosphatpuffer, 10 mM, pH 6,5
0,1 ml Ethanol
Hochdeformierbare Standard-Immun-Vesikel, TT- TransfersomenTM (IDEA):
wie vorstehend, aber ohne Zusatz von LA
Tetanus-Toxoid: 2 mg/ml, mit 20 ul oder 40 uI entsprechend 40 ug oder 80 ug TT pro Immunisierung
Anwendungsfläche: 1 cm² bzw. 2 cm² auf dem oberen Rücken.
Wir glauben, daß immunaktive, typischerweise immun-verstärkende Moleküle zum Zeitpunkt der Antigenpräsentation an den Körper mittels TT-Trägern, die die Barriere durchquert haben, in der Haut anwesend sein müssen, um die erwünschte immunologische Wirkung des Antigens zu erreichen. Um diesen Schluß zu substantiieren, verglichen wir das Ergebnis der nichtinvasiven Immunpräsentation von TT mittels Transfersomen mit oder ohne einem wohl bekannten Immunstimulans, Monophosphoryl-Lipid A (LA), von dem bekannt ist, daß es zum Beispiel die Bildung von TNF im Körper stimuliert. Zwei verschiedene Antigendosen wurden verwendet. In beiden Fällen wurden wesentliche Titer und meßbare prophylaktische Immunantworten (partielle Immunität) erreicht.
Die Absorption des Serums erhöht sich, wie man erwarten würde (vgl. Fig. 7). Im Gegensatz dazu ist die Wirkung von LA bei der niedrigeren verwendeten Dosis besser zu sehen als bei der höheren. Das kann an der experimentellen Variabilität liegen oder sonst die nicht-Linearität der Dosis/Wirkungs-Kurve für die typischen Immunisierungsdaten widerspiegeln. Es ist zum Beispiel möglich, daß das Adjuvans nur im niedrigen Dosierungsbereich effizient ist, wohingegen bei einem hohen Dosierungsschema das System quasi gesättigt ist und wenig Möglichkeit für das Adjuvans besteht, im Bereich des experimentellen Aufbaus die Immunantwort weiter zu erhöhen. Ein vollständiger Schutz der Tiere gegen eine normalerweise tödliche Challenge mit 50 LD&sub5;&sub0; wurde in der Testserie mit der höheren TT-Dosis in Kombination mit LA allein erreicht.
Es wurde weiter beobachtet, daß Th1-Cytokin-IgG2b bei den LA-Gruppen höher war im Vergleich mit den Gruppen, die kein LA erhielten. Dieser Unterschied war bei den niedrigen Dosen um den Faktor 4 ausgeprägter als bei den hohen Dosen, bei denen nur eine Erhöhung um den Faktor 2 beobachtet wurde. Th2-Cytokin-IgG1 war vorwiegend anwesend, außer in der Gruppe mit niedriger Dosis mit LA, bei der IgG2b vergleichbar beitrug.

Beispiele 22-23:

Effekt von Adjuvans mit hohem Molekulargewicht, IL-12-Cytokin

Hochdeformierbare Vesikel, TransfersomenTM (IDEA):
wie bei den Beispielen 5-10 beschrieben, plus
0,01 mg IL-12 pro ml Immunogensuspension
Tetanus-Toxoid: 2 mg/ml, entsprechend 80 ug TT pro Maus/Immunisierung
(partiell gereinigt, wie bei den Beispielen 9-11 beschrieben)
Anwendungsfläche: 2 cm² auf dem oberen Rücken von Swiss albino-Mäusen.
Um die Wirkung von Cytokinen auf die Ergebnisse von nichtinvasiver, epikutaner Impfung mit Tetanus-Toxoid zu untersuchen, wurde eine Kombination von Monophosphoryl- Lipid A mit 0,4 ug IL-12 pro Maus verwendet. 80 ug IL-12 wurden pro Maus in Assoziation mit Transfersomen verabreicht, die mit Tetanus-Toxoid und Monophosphoryl-Lipid A beladen waren. Die Details des Immunisierungszeitplans, der Zeiträume zwischen Blutentnahmen oder der letztlichen Challenge mit Tetanus-Toxin waren dieselben, wie vorstehend erwähnt.
Die Resultate der experimentellen Serien sind in Fig. 8 dargestellt. Sie bestätigen den Schluß, daß die Anwesenheit von pro-Th2-Cytokinen in der Haut während der Immunpräsentation nach epikutaner TT-Verabreichung das Ergebnis der Impfung positiv beeinflußt. Dies wird bei der Serumabsorption, dem spezifischen Antikörpertiter ebenso wie bei der Überlebenswahrscheinlichkeit der Testtiere gesehen.
Der Effekt, der bei den Beispielen 22-23 diskutiert wurde, wurde durch den Einbau von anderen Cytokinen als IL-12 in Immunogenformulierungen bestätigt. Die Resultate sind in Fig. 9 gezeigt.

Beispiele 24-25:

Wirkung von Adjuvantien mit hohem Molekulargewicht (IFN-γ und GM-CSF + IL-4)

Hochdeformierbare Vesikel, TransfersomenTM (IDEA):
wie bei den Beispielen 5-8 beschrieben, plus 0,05 mg IFN-γ und 0,004 mg GM-CSF und 0,004 mg IL-4 pro ml Immunogensuspension
Tetanus-Toxoid, 2 mg/ml, entsprechend 80 ug TT pro Maus/Immunisierung (unrein)
Anwendungsfläche: 2 cm² auf dem oberen Rücken von Swiss albino-Mäusen.
Der Effekt, der bei den Beispielen 22-23 diskutiert wurde, wurde auch mit einer anderen Mischung an Cytokinen bestätigt. Die Ergebnisse sind in Fig. 10 gezeigt.

Beispiele 28-29:

Booster-Effekt (Reifung der Immunantwort)

Bei den meisten vorstehenden Beispielen wurde ein konsistentes Muster beobachtet, wann immer die Absorption im Verlauf der Immunisierung gemessen wurde. Die Immunantwort erhöhte sich bei jeder Boosterung im Vergleich mit der Antwort, die nach der primären Immunisierung erhalten wurde (vgl. Fig. 3, 4, 5, 6, 7, 8). Die primäre Antwort wurde durch die Vorherrschaft von IgM charakterisiert, gefolgt von graduellem Erscheinen von IgG nach der ersten Boosterung und Erscheinen von noch größeren Mengen an IgG nach der zweiten Boosterung mit einem gleichzeitigen Verschwinden von IgM. Dieses typische Muster an Isotypie zeigt die Affinitätsreifung bei der Immunantwort. Während des Prozesses erhöht sich die durchschnittliche Affinität eines Gemischs von spezifischen Antikörpern bei wiederholten Immunisierungen.
Die Resultate von verschiedenen Experimenten mit epikutaner Impfung legen nahe, daß es von Vorteil sein kann, eine invasive Primärimpfung mit einer nichtinvasiven sekundären (Boosterung) Immunisierung zu kombinieren.

Beispiele 30-72:

Freisetzung von Cytokinen von der Haut in vitro durch Transfersomen

Hochdeformierbare Vesikel (Transfersomen Typ C):
87,4 mg Phophatidylcholin von Sojabohne (SPC)
12,6 mg Natriumcholat (NaChol)
0,9 ml Phosphatpuffer, 50 mM, pH 7,3
davon 2,5 ul
Hochdeformierbare Vesikel (Transfersomen Typ T):
50 mg Phophatidylcholin von Sojabohne (SPC)
50 mg Polysorbat (Tween 80)
0,9 ml Phosphatpuffer, 50 mM, pH 6,5
davon 2,5 ul

Positive Kontrolle A

2,5 ul 5% Natriumdodecylsulfat (SDS)

Positive Kontrolle B

100 ul Lipopolysaccharid (LPS; 10&sup5; U/ml)

Negative Kontrolle

2,5 ul phosphatgepufferte Salzlösung (PBS)
Alle Produkte wurden unverdünnt getestet.
Zelltypus: Normale menschliche Keratinocyten, die ein vielschichtiges Epithel mit einer kompakten Stratum corneum bilden, wurden verwendet; die Histologie zeigte eine große Ähnlichkeit mit menschlicher Epidermis in vivo.
Verfahren: Keratinocyten wurden auf Polycarbonatfiltereinschüben von 0,63 cm² in chemisch definiertem, ergänztem Medium inokuliert und 17 Tage an der Grenzfläche Luft-Flüssigkeit gezüchtet.
Testmessungen: gegebene Mengen von jedem getesteten Produkt wurden mit einer Mikropipette über die Oberfläche der Stratum corneum von acht rekonstituierten Epidermisproben gegeben und unter Verwendung einer kleinen sterilen Vorrichtung gleichmäßig darauf verteilt. Die Kulturen wurden bei 37ºC, 5% CO&sub2; 24 Stunden inkubiert. Vierfache Kulturen (außer bei den LPS-behandelten Zellen, die doppelt inkubiert wurden) wurden mit 0,5 ml PBS gewaschen und auf 300 ul von 0,5 mg/ml MTT 3 Stunden bei 37ºC, 5 % CO&sub2; inkubiert.
Die Freisetzung der Entzündungsmediatoren (IL1α, IL2, IL4, IL8, IL10, IFN-γ und TNF-α) in das Medium, das unter dem Gewebe lag, wurde mittels ELISA-Kits (R&D systems UK; Quantikine) quantifiziert, die spezifisch für jeden Typ an Immunmodulator waren, der gemessen werden sollte.
Die relativ große Standardabweichung (SD), die mit Transfersomen O beobachtet wurde, kann mit der Tatsache erklärt werden, daß das Produkt schwer gleichförmig auf der Stratum corneum der rekonstituierten Epidermis zu verteilen war.
Der Spiegel an TNF-α wurde auf den Spiegel von 113,43 pg/ml erhöht, wenn die Zellen in Kontakt mit den positiven Kontrollen waren, die LPS enthielten, welches ein etabliertes Immunadjuvans ist.
Die IL-8-Konzentration nach der Inkubation der Zellen mit Transferosomen überschritt die untere Nachweisgrenze gerade um den Faktor 2, was in einem Fall nicht und in dem anderen kaum signifikant ist bei einer statistischen Sicherheit von 95%, in jeder Situation aber vernachlässigbar ist im Vergleich mit dem Zuwachs, der bei der positiven Kontrolle beobachtet wurde, die das Immunadjuvans LPS enthielt und die einen 167fach höheren Wert ergab.
Das nicht-spezifische Reizmittel SDS setzte in vitro eine große Menge an IL-1α von den Hautzellen in das Badmedium frei. Es besteht die Möglichkeit, daß eine Menge vergleichbarer Quantität von den Zellen freigesetzt wurde, die mit den Transfersomen O inkubiert wurden, die die potentiell reizende Oleinsäure in hoher Konzentration enthielten; eine klare Folgerung wird aber durch die große Standardabweichung bei den Resultaten verhindert, die im letzteren Testsystem erhalten wurden.
Die IL-1α-Konzentration in den anderen getestet Transfersomen vom Typ A und Typ B änderte sich auf etwa das 2fache des Hintergrundniveaus. Dieser Unterschied ist statistisch signifikant im Vergleich mit den negativen Kontrollen, aber praktisch vernachlässigbar, wenn man bedenkt, daß der mit der positiven Kontrolle, die LPS enthielt, beobachtete Anstieg mehr als 60fach höher war.
IFN-γ, IL2, IL4 oder IL10 wurden nicht auf ein meßbares Niveau angehoben, was das Fehlen einer Freisetzung dieser Cytokine unter jeder anderen Testbedingung nahelegt.
Zusammengenommen legen die vorstehend erwähnten Befunde nahe, daß Transfersomen Cytokine nicht aus Hautzellen freisetzen oder die Bildung solcher Moleküle in den Hautzellen induzieren. Dies erklärt die Notwendigkeit der Verwendung von Immunadjuvantien/Modulatoren, wenn Antigene oder Allergene mit solchen Trägern durch die Haut zugeführt werden sollen, um eine therapeutische oder prophylaktische Immunantwort hervorzurufen.

Beispiele 73-82:

Eine Bakterienwandkomponente, Cholera-Toxin, als spezifisches Immunadjuvans:

Hochdeformierbare Vesikel, TransfersomenTM:
86,3 mg Phophatidylcholin von Sojabohne (SPC)
13,7 mg Natriumcholat (NaChol)
0,9 ml Phosphatpuffer, 10 mM, pH 6,5
Cholera-Toxin (CT; Sigma, Neu-Ulm), 10 ug/Immunisierung plus, falls erforderlich,
Tetanus-Toxoid (TT, rein; Accurate Antibodies) 2 mg/ml.
Volumendosen, die 0 ug TT/Maus/Immunisierung (negative Kontrolle), 1 ug TT/Maus, 5 ug TT/Maus, 10 ug TT/Maus, 20 ug TT/Maus, 40 ug TT/Maus (im Falle der Verwendung von CT) und 80 ug TT/Maus (ohne CT) entsprechen, wurden epikutan über eine Fläche von bis zu 2 cm² auf den oberen Rücken von 4-6 Swiss albino-Mäusen verwendet; 20 ug TT/Maus/Immunisierung wurden subkutan an der entsprechenden Stelle in der positiven Kontrollgruppe injiziert. Nicht immunisierte Mäuse wurden als andere negative Kontrolle verwendet.
Der schützende Effekt der epikutanen Antigenverabreichung war exzellent, wenn Cholera-Toxin in Kombination mit dem Tetanus-Toxoid in die Testformulierung eingeschlossen war. Formulierung ohne das Immunadjuvans ergab schlechteren Schutz, gezeigt durch die Tatsache, daß 1 Tier von 4 (25%) nach der Herausforderung mit Tetanus- Toxin paralysiert war.
Die in Fig. 10 gezeigten Resultate zeigen, daß die Antigendosen, die über 20 ug/Immunisierung hinausgehen, einen vollständigen Schutz sicherstellten, was bei den anderen getesteten Adjuvantien oder Adjuvansbehandlungen nicht der Fall war (vgl. die vorstehenden Beispiele). Eine niedrigere Dosierung an Antigen gab einen qualitativ ähnlichen Effekt, war aber nicht ausreichend, um das Überleben aller Testmäuse zu garantieren, außer in der Testgruppe, die 5 ug TT/Immunisierung erhielt. (Dies legt nahe, daß TT-Dosen zwischen 1 ug/Immunisierung und 15 ug/Immunisierung zum Übergangsbereich gehören). Andere Dosen an Cholera-Toxin könnten jedoch gleich oder sogar nützlicher sein.

Literatur

Cevc, G. Drug delivery across the skin. Exp. Opin. Invest. Drugs (1997) 6: 1887-1937.
Cevc, G., Gebauer, D., Schätzlein, A. Blume, G. Ultraflexible Vesicles, Transfersomes, Have an Extremely Low Permeation Resistance and Transport Therapeutic Amounts of Insulin Across the Intact Mammalian Skin. Biochim. Biophys. Acta (1998) 1368: 201-215.
Deng, H., Qun, L., Khavari, P. A. Sustainable cutaneous gene delivery. Nature Biotechnology (1997) 15: 1388-1390.
Fries, K. M., Blieden, T., Looney, R. J., Sempowski, G. D., Silvera, M. R., Willis, R. A., Phipps, R. P. Evidence of fibroblast heterogeneity and the role of fibroblast subpopulations in fibrosis. Clin. Immunol. Immunopathol. (1994) 72 : 283-292.
Glenn, G. M., Rao, M. Matyas, G. R., Alving, C. R. Skin immunisation made possible by Cholera toxin. Nature (1998a) 851: 391.
Glenn, G. M., Scharton-Karsten T, Vasell R, Mallet C. P., Hale T. L. und Alving C. R. Transcutaneous Immunization with Cholera toxin Protects Mice Against Lethal Mucosal Toxin Challenge. J. Immunol. (1998b) 161: 3211-3214.
Kondo, S., Sauder, D. N. Epidermal cytokines in allergic contact dermatitis. J. Am. Acad. Dermatol. (1995) 33: 786-800.
Lohoff, M., Gessner, M., Bogdan, C., Roellinghoff, M. The Th1/Th2 paradigm and experimental murine Leishmaniasis. Int. Arch. Allergy Immunol. (1998) 115: 191-202.
Luger, T. A., Schwarz, T. The role of cytokines and neuroendocrine hormones in cutaneous immunity and inflammation. Allergy (1995) 50: 292-302.
Nasir, A., Gaspari, A. A. Contact dermatitis. Clinical perspectives and basic mechanisms. Clin. Rev. Allergy and Immunol. (1996) 14: 151-184.
Pastore, S., Fanales-Belaso, E., Abbanesi, C., Chinni, L. M., Giannetti, A., Girolomoni, G. Granulocyte macrophage colony stimulating factor is overproduced by keratinocytes in atopic dermatitis: Implications for sustained dendritic cell activation in the skin. J. Clin. Invest. (1997) 99: 3009-3017.
Paul, A., Cevc, G. Non-invasive administration of protein antigens. Epicutaneous immunisation with the bovine serum albumin. Vaccine Res. (1995) 4: 145-164.
Paul, A., Cevc, G., Bachhawat, B. K. Transdermal immunisation with large proteins by means of ultradeformable drug carriers. Eur. J. Immunol. (1995) 25: 3521-3524.
Paul, A., Cevc, G., Bachhawat, B. K. Transdermal immunisation with an integral membrane component, gap junction protein, by means of ultradeformable drug carriers, Transfersomes. Vaccine (1997) 16: 188-195.
Schätzlein, A., Cevc, G. Non-uniform cellular packing of the stratum corneum and permeability barrier function of intact skin: a high-resolution confocal laser scanning microscopy study using highly deformable vesicles (Transfersomes). Br. J. Dermatol. (1998) 138: 583-592.
Strange, P., Skov, L, Lisby, S., Nielsen, P. L., Baadsgard, O. Staphylococcal enterotoxin B applied on intact normal and intact atopic skin induces dermatoma. Arch. Dermatol. (1996) 132: 27-33.
Wang, L.-F., Lin, J.-Y., Hsieh, K.-H., Lin, R.-H. Epicutaneous exposure of protein antigen induces a predominant Th2-like response with IgE production in mice. J. Immunol. (1996) 156: 4079-4082.

Claims

1. Transdermaler Impfstoff, umfassend

(a) einen transdermalen Träger, der ein Durchdringungsmittel ist, das in einem wäßrigen Lösungsmittel suspendiert oder dispergiert ist, in der Form eines winzigen Flüssigkeitstropfens, der von einer membranähnlichen Hülle aus einer oder mehreren Schichten von mindestens zwei verschiedenen Stoffen oder zwei verschiedenen Formen eines Stoffes, mit der Tendenz zu aggregieren umgeben ist, wobei die Stoffe oder Formen eines Stoffes sich mindestens um den Faktor 10 in der Löslichkeit in einem vorzugsweise wäßrigen, flüssigen Medium unterscheiden, so daß der mittlere Durchmesser von Homoaggregaten des löslicheren Stoffes oder Form des Stoffes oder der mittlere Durchmesser der Heteroaggregate bestehend aus beiden Stoffen oder Formen des Stoffes kleiner ist als der mittlere Durchmesser der Homoaggregate des weniger löslichen Stoffes oder Form des Stoffes, und/oder wobei die löslichere Komponente die Tendenz hat, den durchdringenden Tropfen zu solubilisieren, und wobei der Gehalt einer solchen Komponente bis zu 99 mol-% der Konzentration beträgt, die zum Solubilisieren des Tropfen erforderlich ist, oder ansonsten bis zu 99 mol-% der Sättigungskonzentration in dem nicht solubilisierten Tropfen entspricht, was auch immer höher ist, und/oder wobei die elastische Deformationsenergie des Tropfens, der die membranähnliche Hülle umgibt, mindestens fünffach niedriger ist, vorzugsweise mindestens zehnfach niedriger und idealerweise mehr als zehnfach niedriger ist als diejenige von roten Blutzellen oder von Phospholipid-Doppelschichten mit flüssigen, aliphatischen Ketten;

(b) eine Verbindung, die spezifisch Cytokin- oder Anti-Cytokin-Aktivität freisetzt oder induziert oder selbst solch eine Aktivität zeigt; und

(c) ein Antigen oder ein Allergen.

2. Impfstoff nach Anspruch 1, wobei die Verbindung, die Cytokin- oder Anti- Cytokin-Aktivität aufweist oder induziert, und das Antigen mit dem Durchdringungsmittel verknüpft sind.

3. Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei das weniger lösliche, selbstaggregierende Molekül ein polares Lipid ist und die löslichere Komponente ein grenzflächenaktiver Stoff oder ein grenzflächenaktives Stoffähnliches Molekül ist oder ansonsten diejenige Form eines polaren Lipides, die genügend löslich für den Zweck der Erfindung ist.

4. Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der mittlere Durchmesser des Durchdringungsmittels zwischen 30 nm und 500 nm ist, vorzugsweise zwischen 40 nm und 250 nm, bevorzugt zwischen 50 nm und 200 nm und besonders bevorzugt zwischen 60 nm und 150 nm ist.

5. Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Gesamtgewicht der Tropfen in der Formulierung zum Gebrauch auf menschlicher oder tierischer Haut 0,01 Gewichtsprozent bis 40 Gewichtsprozent der gesamten Masse, insbesondere zwischen 0,1 Gewichtsprozent und 30 Gewichtsprozent und vorzugsweise zwischen 5 Gewichtsprozent und 20 Gewichtsprozent ist.

6. Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Gesamtantigenkonzentration zwischen 0,001 und 40 Gewichtsprozent der gesamten durchdringenden Masse ist, im besonderen zwischen 0,01 Gewichtsprozent und 30 Gewichtsprozent, besser zwischen 0,1 Gewichtsprozent und 20 Gewichtsprozent und am meisten bevorzugt zwischen 0,5 Gewichtsprozent und 10 Gewichtsprozent ist.

7. Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 6, ferner umfassend (da) ein chemisches Reizmittel mit niedrigem Molekulargewicht; und/oder (db) einen Extrakt oder eine Verbindung aus einem Pathogen oder ein Fragment oder ein Derivat davon.

8. Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Cytokin-Aktivität aufweisende Verbindung IL-4, IL-2, TGF, IL-6, TNF, IL-1α und IL-1β, ein Typ I-Interferon, vorzugsweise IFN-α oder IFN-β, IL-12, IFN-γ, TNF-β, IL-5 oder IL- 10 ist.

9. Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Anti-Cytokin-Aktivität aufweisende Verbindung ein Anti-Cytokin-Antikörper oder das entsprechende aktive Fragment, ein Derivat oder ein Analog davon ist.

10. Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Antigen von einem Pathogen stammt.

11. Impfstoff nach Anspruch 10, wobei das Pathogen ausgewählt ist aus extrazellulären Bakterien, einschließlich eiterbildenden Kokken, wie Staphylococcus und Streptococcus, gram-negativen Bakterien, wie Meningococcus und Gonococcus-Arten, Neisseria-Arten, gram-negativen Bakterien, einschließlich Darmorganismen wie E. coli, Salmonella, Shigella, Pseudomonas, Diptheria, Bordetella Pertussis, und gram-positiven Bakterien (z. B. Bacillus pestis, BCG), besonders anaeroben, wie die Clostridium-Arten, Bakterien und Viren, die innerhalb von Wirtszellen überleben und sich replizieren, umfassend Mycobakterien (z. B. M. tuberculosis) und Listeria monocytogenes, Retroviren und Adenoviren, einschließlich Hepatitisvirus, (menschlicher) Immundefizienzvirus, Herpesviren, Pocken- (Winpocken), Influenza-, Masern-, Mumps- und Polio-Viren, Cytomegalovirus, Rhinovirus, usw., und Pilzen, die innerhalb von Wirtszellen gedeihen, Parasiten, einschließlich tierischen Parasiten, wie Protozoen und Helminthen, und Ectoparasiten, wie Zecken und Milben, oder Brucella-Arten, einschließlich des Cholera verursachenden Agens, Haemophilus-Arten, ebenso wie Pathogenen, die Parathyphus, Pest, Tollwut, Tetanus und Röteln auslösen, und Pathogenen, die verschiedene Neoplasien, Autoimmunkrankheiten oder die mit anderen pathologischen Zuständen des tierischen oder menschlichen Körpers verwandt sind, verursachen, die nicht notwendigerweise von pathogenen Infektionen herrühren.

12. Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei das Allergen xenogenen oder endogenen Ursprungs ist, von einem Mikroorganismus, einem Tier oder einer Pflanze stammt, oder zu der Gruppe künstlicher und/oder reizender inorganischer Stoffe gehört, oder zu solchen Teilen oder Komponenten des menschlichen Körpers gehören, die fälschlicherweise durch das Körperimmunsystem prozessiert oder dem Körperimmunsystem exponiert wurden.

13. Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die Konzentration jeder verwendeten Verbindung, die Cytokin-Aktivität aufweist, bis zu 1000-fach höher gewählt ist als das Konzentrationsoptimum, das in den entsprechenden Versuchen mit der Antigendosis und dem gewählten Immunadjuvanz etabliert wurde, durchgeführt mittels Injektion der Formulierung oder durch in vitro-Versuche, und vorzugsweise bis zu 100- fach, öfters bis zu 50-fach und noch besser bis zu 20-fach höher ist.

14. Impfstoff nach einem der Ansprüche 7 bis 13, wobei der Pathogenextrakt oder die Verbindung ein Lipopolysaccharid, Cordfactor (Trehalose- Dimycolat), Muramyldipeptid, oder ein anderes (Poly)saccharid oder (Poly) peptid identisch mit oder ähnlich einem immunologisch aktiven Teil einer Membran eines Pathogens ist; ein Extrakt eines Pathogens, einschließlich bakteriellen Exo- und Endotoxinen, vorzugsweise Choleratoxin und das hitzelabile Toxin von E. coli, ein A-Kette-Derivat, eine Komponente mit einer ADP-ribosylierenden Aktivität, ein Peptidoglycan, ein von Clostridium stammendes Toxin, oder ein gereinigtes Proteinderivat von M. tuberculosis, LT-R192G, Fibronectin bindendes Protein 1 von Streptococcus pyrogenes, oder ein äußeres Membranprotein von Gruppe B-Neisseria meningitidis (GBOMP).

15. Impfstoff nach Anspruch 14, wobei das Lipopolysaccharid Lipid A oder ein Derivat ist und Modifikationen davon, wie Monophosphoryl-Lipid A, oder sein Analog, wie ein Fettderivat von Saccharose.

16. Impfstoff nach einem der Ansprüche 7 bis 13, wobei die Konzentration der Pathogenverbindung, die von einem Pathogen stammt, zwischen 10-fach niedriger und bis zu 1000-fach höher ist als diejenige, die sonst mit den entsprechenden injizierten Formulierungen unter Verwendung eines ähnlichen Antigens verwendet wird, wobei die epikutan verabreichte Immunadjuvantkonzentration sich öfter von der injizierten Immunadjuvantkonzentration durch den Faktor zwischen 0,5 und 100 unterscheidet, oder besser, durch den Faktor zwischen 1 und 50 und im besten Fall zwischen 2 und 25.

17. Impfstoff nach einem der Ansprüche 7 bis 16, wobei das Reizmittel mit niedrigem Molekulargewicht ausgewählt ist aus den Klassen von allergenen Metallionen, Säuren, Basen, reizenden Flüssigkeiten, Fettalkoholen, Fettaminen, Fettäthern, Fettsulfonaten, Fettphosphaten, usw., oder anderen geeigneten Lösemitteln oder Amphiphilen, oder aus der Gruppe von grenzflächenaktiven Stoff-ähnlichen Molekülen, oft mit die Hautdurchdringung verstärkenden Eigenschaften, sowie Derivaten oder Kombinationen davon.

18. Impfstoff nach einem der Ansprüche 7 bis 17, wobei die Konzentration des Reizmittels mit niedrigem Molekulargewicht um mindestens den Faktor 2, öfters um den Faktor 5, besser um den Faktor 10 oder mehr, unterhalb der Konzentration gewählt ist, die in unabhängigen Versuchen am selben oder an einem vergleichbaren Subjekt auf Grund der lokalen Reizung als nicht akzeptabel angesehen wird, ermittelt durch die Methoden und Standards, die gewöhnlich zur Untersuchung eines solchen Reizmittels verwendet werden.

19. Impfstoff nach einem der Ansprüche 7 bis 16, wobei das Allergen zu der Klasse von Inhalationsallergenen gehört, einschließlich, aber nicht beschränkt auf verschiedene Pollen, Sporen, Stückchen von Tierhaar, Haut, Feder, natürlichen und synthetischen Textilien, Weizen, (Haus)-Staub, einschließlich Milben, ferner Nahrungsmittel- und Medikamentenallergene, Kontaktallergene, Injektions-, Invasions- oder Depotallergene, wie verschiedene (gastrointestinale) Würmer, Echinokokken, Trichinen, usw., ein Teil eines Implantationsmaterials.

20. Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 19, wobei die verabreichte Dosis eines Antigens sich um den Faktor 0,1 bis 100 von der Dosis, die sonst im Verfahren der Immunisierung injiziert worden wäre, unterscheidet, aber öfters im Bereich zwischen 0,5 bis 50, besser zwischen 1 und 20, und idealerweise weniger als 10-fach höher ist als diejenige, die mit einer Injektion verwendet wird.

21. Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 20, wobei die verabreichte durchdringende Dosis zwischen 0,1 mg/cm² und 15 mg/cm², öfters im Bereich 0,5 mg/cm² und 10 mg/cm², und vorzugsweise zwischen 1 mg/cm² und 5 mg/cm² ist.

22. Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 21, wobei das Antigen ein reines oder gereinigtes Antigen ist.

23. Kit, umfassend mindestens eine Dosis des Impfstoffes nach einem der Ansprüche 1 bis 22, in Flaschen- oder anderweitig verpackter Form.

24. Kit nach Anspruch 23, weiterhin umfassend mindestens eine injizierbare Dosis des in Anspruch 11 definierten Antigens oder des in Anspruch 12 definierten Allergens.

25. Verwendung eines Impfstoffes nach einem der Ansprüche 1 bis 22 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Erzeugung einer schützenden Immunantwort in einem Säuger.

26. Verwendung nach Anspruch 25, wobei verschiedene Behandlungszonen ausgewählt werden, um die verabreichte Immunogendosis und das Ergebnis der therapeutischen Impfung zu kontrollieren.

27. Verwendung nach den Ansprüchen 25 oder 26, wobei eine Suspension von antigenfreien Durchdringungsmitteln mit dem Antigen beladen wird, um sie mit dem Antigen am Tag vor der Verabreichung zu verbinden, vorzugsweise 360 Minuten, bevorzugter 60 Minuten, und noch mehr bevorzugt 30 Minuten vor der Verabreichung der entstandenen Verbindung auf die Haut.

28. Verwendung nach einem der Ansprüche 25 bis 27, wobei der Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 22 auf die Haut verabreicht wird, nachdem das Organ durch eine Immunadjuvantmanipulation vorbehandelt worden ist, wobei die Manipulation z. B. darin besteht, daß man die Haut reibt, drückt, erwärmt, einem elektrischen oder mechanischen, z. B. Ultraschall-Feld aussetzt, usw., oder das Injizieren einer nicht-immunogenen Formulierung in die Haut, mit der Maßgabe, daß jede dieser Behandlungen Immunadjuvantverbindungen aus der Haut oder anderen peripheren, immunaktiven Geweben freisetzt, oder sonst die Konzentration/Dauer der Wirkung von Antagonisten auf die gewünschte Impfung reduziert.

29. Verwendung nach einem der Ansprüche 25 bis 28, wobei das Immunogen in einem nicht-okklusiven Pflaster verabreicht wird.

30. Verwendung nach einem der Ansprüche 25 bis 29, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine Dosis des Impfstoffes verabreicht wird.

31. Verwendung nach Anspruch 30, wobei der Impfstoff als eine Booster-Impfung verabreicht wird.

32. Verwendung nach Anspruch 31, wobei die primäre Immunisierung invasiv vorgenommen wird, typischer Weise durch subkutante Injektion oder eine andere geeignete, die Hautbarriere durchdringende/zerstörende Methode, und wobei mindestens eine folgende Booster-Immunisierung nicht invasiv vorgenommen wird.

33. Verwendung nach einem der Ansprüche 25 bis 32, wobei der Impfstoff zwischen 2 und 10, vorzugsweise zwischen 2 und 7, bevorzugt bis zu 5 und am bevorzugtesten bis zu 3 mal verabreicht wird, wenn ein nicht-allergenes Antigen verwendet wird, oder im Falle eines Allergens, so oft vorgenommen wird, wie erforderlich ist, um die gewünschte Immuntoleranz zu erreichen, festgestellt durch ein geeignetes Bestimmungsverfahren, oder sonst, den Versuch als gescheitert anzusehen.

34. Verwendung nach Anspruch 33, wobei das Zeitintervall zwischen den aufeinander folgenden Impfungen zwischen 2 Wochen und 5 Jahren gewählt ist, öfters zwischen 1 Monat und bis zu 3 Jahren, häufiger zwischen 2 Monaten und 1,5 Jahren.

35. Verwendung nach einem der Ansprüche 25 bis 34, wobei der Fluß der Durchdringungsmittel, die ein Immunogen durch die verschiedenen Poren in einem definierten Hindernis tragen, als eine Funktion einer geeigneten Antriebskraft oder eines Druckes, die oder der über das Hindernis hinweg wirken, bestimmt wird, und die Daten dann in geeigneter Weise über eine charakteristische Kurve beschrieben werden, die wiederum dazu verwendet wird, die Formulierung oder Anwendung weiter zu optimieren.

36. Verwendung des transdermalen Trägers, der Verbindung, die spezifisch Cytokin- oder Anti-Cytokin-Aktivität induziert oder freisetzt oder solche Aktivität zeigt, des Antigens oder Allergens, und gegebenenfalls eines Extrakts oder einer Verbindung eines Mikroorganismus oder eines Fragments oder eines Derivats davon, und/oder eines chemischen Reizmittels mit niedrigem Molekulargewicht, gemäß der Definition in einem der vorangegangenen Ansprüche zur Herstellung eines Impfstoffes zur Induktion einer schützenden oder toleranten Immunantwort.