DE69900998T2

DE69900998T2 - Verfahren zur diagnose adenokarzinom oder benigne pathologie der vorsteherdrüse

Info

Publication number: DE69900998T2
Application number: DE69900998T
Authority: DE
Inventors: Jean-Philippe Charrier; Michel Jolivet; Carole Tournel
Original assignee: Biomerieux SA
Current assignee: Biomerieux SA
Priority date: 1998-07-03
Filing date: 1999-07-05
Publication date: 2002-11-07
Anticipated expiration: 2019-07-06
Also published as: CA2336174C; AU4623599A; EP1095276B1; WO2000002052A1; US6929918B1; JP2002519701A; ATE214161T1; FR2780791B1; FR2780791A1; CA2336174A1; DE69900998D1; EP1095276A1; JP4364437B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Erkennungs- oder Diagnoseverfahren, das es ermöglicht, ohne die Durchführung einer Biopsie das Vorhandensein eines Prostatakrebses oder einer gutartigen Prostatahypertrophie (BPH) bei einem Patienten nachzuweisen.
In der Tat ist das prostataspezifische Antigen, im allgemeinen als PSA bezeichnet, der Hauptmarker des Prostatakrebses, wovon in der westlichen Welt einer von sechs Männern im Laufe seines Lebens betroffen ist. Diese Protease aus der Familie der Kallikreine, die im wesentlichen durch das Prostataepithel sekretiert wird, läßt sich in der Samenflüssigkeit in einer Konzentration von 0,5 bis 5 mg/ml, und im Serum eines Patienten in einer Konzentration, die 1 Million Mal geringer ist, finden. Dieser Serumspiegel des PSA steigt bei Vorliegen eines Prostatakrebses deutlich, und bei gutartigen Veränderungen, wie z. B. BPH, akuter Prostataentzündung..., moderat an.
Jedoch ist der Überschneidungsbereich zwischen den verschiedenen Krankheiten für einen erheblichen Mangel an Sensibilität und Spezifität verantwortlich. So werden 30 bis 45% der Krebserkrankungen, die an die Drüse angrenzen, und ein Früh- und potentiell heilbares Stadium darstellen, mit der üblichen Schwelle von 4 ng/ml nicht erkannt, während drei von vier Patienten zu unrecht verdächtigt werden.
Darüber hinaus wurde kürzlich gezeigt, daß das PSA in dem Serum an Proteaseinhibitoren, wie z. B. dem α-I-Antichymotrypsin (ACT) bindet, und das Verwenden des Verhältnisses von freiem PSA zu gesamtem PSA die Spezifität der Diagnose verbessert.
Der Stand der Technik zeigt folglich, daß Techniken vorhanden sind, die es ermöglichen, die Entwicklung eines Prostatakrebses bei Patienten zu diagnostizieren. So beansprucht die Patentanmeldung WO-A-97/12245 ein Verfahren, das es ermöglicht, ein Adenokarzinom der Prostata (CAP) ohne Biopsie zu diagnostizieren. Dieses Verfahren besteht darin, im Serum oder Blut der Patienten die Gesamtmenge von PSA zu messen. Wenn dieser Wert zwischen 2,5 und 20 ng/ml liegt, wird gleichermaßen die Konzentration von freiem PSA gemessen. Anschließend wird das Verhältnis von freiem PSA zu gesamtem PSA berechnet. Wenn dieses Verhältnis kleiner als 7% ist, richtet sich die Diagnose auf ein Adenokarzinom der Prostata.
- Allerdings ist die Verwendung einer 7-%-Schwelle für die Diagnose eines Prostatakrebses bei zahlreichen Autoren umstritten, wie dies die Publikation von Lein et al. "Relation of free PSA/total PSA in serum for differentiating between patients with prostatic cancer and benign prostate hyperglasia: which cutoff should be used?" dargestellt. In diesem Dokument, das in der Zeitschrift Cancer Investigation, 16(1), 45-49, 1998, publiziert wurde, wurde demonstriert, daß es schwierig ist, auf dem Umweg über dieses Verhältnis einen Krebs oder ein Adenokarzinom der Prostata systematisch von einem BPH zu unterscheiden.
Unter anderem zeigt die Publikation von Catalona et al., "Prostate Cancer Detection in Men With Serum PSA Concentrations of 2.6 to 4.0 ng/ml and Benign Prostate Examination", publiziert in JAMA am 14. Mai 1997-Vol 277, Nr. 18, daß für eine frühzeitige Erkennung eines Prostatakrebses eine niedrigere Konzentration als 4 ng/ml in Erwägung gezogen werden muß.
Darüber hinaus kann in der Samenflüssigkeit das PSA interne Spaltstellen aufweisen, die wegen des Vorhandenseins von fünf Disulfidbrücken, die die verschiedenen Fragmente des Moleküls miteinander verbinden, nicht dessen dreidimensionalen Zusammenhalt beeinflussen. Das so gespaltene PSA verliert seine enzymatische Aktivität und seine Kapazität, an Proteaseinhibitoren zu binden. Im allgemeinen wird aber im Stand der Technik eine gespaltene Form im Serum nicht erwähnt.
Bis heute wurde bei gutartigen Pathologien der Prostata über keine gespaltene Form berichtet, und Interesse an gespaltenen Formen zu Zwecken der Diagnose bestand bislang nicht.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ermöglicht das vorgeschlagene Diagnoseverfahren die Behebung des Mangels an der Effektivität der Tests im Konzentrationsbereich von größer als 2 ng/ml gesamtem PSA. Zu diesem Zweck wurden die molekularen Formen von Serum-PSA von Patienten, die von Krebs oder BPH betroffen waren, mittels zweidimensionaler Elektrophorese, verbunden mit der Detektion mittels Chemolumineszenz kartographiert, um die Gesamtheit von freiem, komplexiertem und gespaltenem PSA zu erfassen.
Folglich sind die Profile des Krebsserums relativ homogen, während jene von BPH einen relativ großen Anteil von gespaltenen Formen und von schwach basischen Spots enthalten können.
Es wird demnach demonstriert, daß die Erhöhung des Verhältnisses von freiem PSA zu gesamtem PSA bei BPH mit dem Vorhandensein von gespaltenem, enzymatisch inaktivem PSA in Zusammenhang steht, das nicht an ACT binden kann, oder in enger Beziehung zu freiem schwach basischem PSA steht, das der inaktiven Zymogenform entsprechen könnte.
Zu diesem Zweck betrifft die vorliegende Erfindung ein erstes Analyseverfahren für die Diagnose eines Adenokarzinoms der Prostata bei einem männlichen menschlichen Patienten, ohne Vornahme einer Prostatablopsie, bei dem das in einer Blut-, Serum-, Urin- oder Samenflüssigkeitsprobe des Patienten vorhandene PSA(prostataspezifische Antigen)-Protein verwendet wird, dadurch gekennzeichnet, daß es besteht aus:
- dem Messen des Niveaus von gesamtem freien PSA, also gespaltenem und nicht-gespaltenem PSA,
- dem Messen des Niveaus des gesamten oder Teilen des gespaltenen freien PSA,
- dem Berechnen des Verhältnisses von gespaltenem freien PSA zu gesamtem freien PSA, und
- dem Unterscheiden von zwei Fällen, nämlich:
-- dieses Verhältnis hat einen Wert, der kleiner oder gleich einem Referenz- oder Unterscheidungswert ist, der sich bei Patienten mit einem Adenokarzinom der Prostata ergibt, so daß der Patient von einem Adenokarzinom der Prostata betroffen ist,
-- dieses Verhältnis hat einen Wert, der größer als der Referenzwert ist, der sich bei Patienten mit gutartiger Pathologie der Prostata ergibt, so daß der Patient von einer gutartigen Pathologie der Prostata, wie z. B. einer gutartigen Prostatahypertrophie, betroffen ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein zweites Analyseverfahren für die Diagnose eines Adenokarzinoms der Prostata bei einem männlichen menschlichen Patienten, ohne Vornahme einer Prostatablopsie, bei dem das in einer Blut-, Serum-, Urin- oder Samenflüssigkeitsprobe des Patienten vorhandene PSA(prostataspezifische Antigen)-Protein verwendet wird, dadurch gekennzeichnet, daß es besteht aus:
- dem Messen des Spiegels von nicht-gespaltenem freien PSA,
- dem Messen des Niveaus des gesamten oder Teilen des gespaltenen freien PSA,
- dem Berechnen des Verhältnisses von gespaltenem freien PSA zu nicht-gespaltenem freien PSA, und
- dem Unterscheiden von zwei Fällen, nämlich:
-- dieses Verhältnis hat einen Wert, der kleiner oder gleich einem Referenz- oder Unterscheidungswert ist, der sich bei Patienten mit einem Adenokarzinom der Prostata ergibt, so daß der Patient von einem Adenokarzinom der Prostata betroffen ist,
-- dieses Verhältnis hat einen Wert, der größer als der Referenzwert ist, der sich bei Patienten mit gutartiger Pathologie der Prostata ergibt, so daß der Patient von einer gutartigen Pathologie der Prostata, wie z. B. einer gutartigen Prostatahypertrophie, betroffen ist.
In diesen beiden ersten Fällen liegt der Referenzwert bei 2 bis 12% und vorzugsweise bei 5 bis 8%.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein drittes Analyseverfahren für die Diagnose eines Adenokarzinoms der Prostata bei einem männlichen menschlichen Patienten, ohne Vornahme einer Prostatablopsie, bei dem das in einer Blut-, Serum-, Urin- oder Samenflüssigkeitsprobe des Patienten vorhandene PSA(prostataspezifische Antigen)-Protein verwendet wird, dadurch gekennzeichnet, daß es besteht aus:
- dem Messen des Niveaus von gesamtem freien PSA, also gespaltenem und nicht-gespaltenem PSA,
- dem Messen des Niveaus des gesamten oder Teilen des nichtgespaltenen freien PSA,
- dem Berechnen des Verhältnisses von nicht-gespaltenem freien PSA zu gesamtem freien PSA, und
- dem Unterscheiden von zwei Fällen, nämlich:
-- dieses Verhältnis hat einen Wert, der größer oder gleich einem Referenz- oder Unterscheidungswert ist, der sich bei Patienten mit einem Adenokarzinom der Prostata ergibt, so daß der Patient von einem Adenokarzinom der Prostata betroffen ist,
-- dieses Verhältnis hat einen Wert, der kleiner als der Referenzwert ist, der sich bei Patienten mit einer gutartigen Pathologie der Prostata ergibt, so daß der Patient von einer gutartigen Pathologie der Prostata, wie z. B. einer gutartigen Prostatahypertrophie, betroffen ist.
In diesem dritten Fall liegt der Referenzwert bei 88 bis 98% und vorzugsweise bei 93 bis 95%.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein viertes Analyseverfahren für die Diagnose eines Adenokarzinoms der Prostata bei einem männlichen menschlichen Patienten, ohne Vornahme einer Prostatablopsie, bei dem des in einer Blut-, Serum-, Urin- oder Samenflüssigkeitsprobe des Patienten vorhandene PSA(prostataspezifische Antigen)-Protein verwendet wird, dadurch gekennzeichnet, daß es besteht aus:
- dem Messen des Niveaus von gesamtem PSA, also komplexiertem und freiem PSA (gespalten oder nicht-gespalten),
- dem Messen des Niveaus des gesamten oder Teilen des gespaltenen freien PSA,
- dem Berechnen des Verhältnisses von gespaltenem freien PSA zu gesamtem PSA, und
- dem Unterscheiden von zwei Fällen, nämlich:
-- dieses Verhältnis hat einen Wert, der kleiner oder gleich einem Referenz- oder Unterscheidungswert ist, der sich bei Patienten mit einem Adenokarzinom der Prostata ergibt, so daß der Patient von einem Adenokarzinom der Prostata betroffen ist,
-- dieses Verhältnis hat einen Wert, der größer als der Referenzwert ist, der sich bei Patienten mit gutartiger Pathologie der Prostata ergibt, so daß der Patient von einer gutartigen Pathologie der Prostata, wie z. B. einer gutartigen Prostatahypertrophie, betroffen ist.
In diesem vierten Fall liegt der Referenzwert bei 0,1 bis 2% und vorzugsweise bei 0,4 bis I %.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein erstes Analyseverfahren für die Diagnose eines Adenokarzinoms der Prostata bei einem männlichen menschlichen Patienten, ohne Vornahme einer Prostatablopsie, bei dem das in einer Blut-, Serum-, Urin- oder Samenflüssigkeitsprobe des Patienten vorhandene PSA(prostataspezifische Antigen)-Protein verwendet wird, dadurch gekennzeichnet, daß es besteht aus:
- dem Messen des Niveaus von komplexiertem PSA,
- dem Messen des Niveaus des gesamten oder Teilen des gespaltenen freien PSA,
- dem Berechnen des Verhältnisses von gespaltenem freien PSA zu komplexiertem PSA, und
- dem Unterscheiden von zwei Fällen, nämlich:
-- dieses Verhältnis hat einen Wert, der größer oder gleich einem Referenz- oder Unterscheidungswert ist, der sich bei Patienten mit einem Adenokarzinom der Prostata ergibt, so daß der Patient von einem Adenokarzinom der Prostata betroffen ist,
-- dieses Verhältnis hat einen Wert, der kleiner als der Referenzwert ist, der sich bei Patienten mit gutartiger Pathologie der Prostata ergibt, so daß der Patient von einer gutartigen Pathologie der Prostata, wie z. B. einer gutartigen Prostatahypertrophie, betroffen ist.
In diesem fünften Fall liegt der Referenzwert bei 0,1 bis 2,2% und vorzugsweise bei 0,6 bis 1,2%.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein sechstes Analyseverfahren für die Diagnose eines Adenokarzinoms der Prostata bei einem männlichen menschlichen Patienten, ohne Vornahme einer Prostatablopsie, bei dem das in einer Blut-, Serum-, Urin- oder Samenflüssigkeitsprobe des Patienten vorhandene PSA(prostataspezifische Antigen)-Protein verwendet wird, dadurch gekennzeichnet, daß es besteht aus:
- dem Messen des Niveaus von nicht-gespaltenem freien PSA,
- dem Messen des Niveaus des gesamten oder Teilen des gespaltenen freien PSA,
- dem Messen des Niveaus von freiem PSA,
- dem Messen des Niveaus von gesamtem PSA,
- dem Berechnen des Verhältnisses von gespaltenem freien PSA zu nicht-gespaltenem freien PSA, das erstes Verhältnis genannt wird,
- dem Berechnen des Verhältnisses von freiem PSA zu gesamtem PSA, das zweites Verhältnis genannt wird, und
- dem Unterscheiden von vier Fällen, nämlich:
-- dieses erste Verhältnis hat einen Wert, der kleiner oder gleich einem ersten Referenz- oder Unterscheidungswert ist, und dieses zweite Verhältnis hat einen Wert, der kleiner oder gleich einem zweiten Referenz- oder Unterscheidungswert ist, so daß der Patient von einem Adenokarzinom der Prostata betroffen ist,
-- dieses erste Verhältnis hat einen Wert, der größer oder gleich einem ersten Referenz- oder Unterscheidungswert ist, und dieses zweite Verhältnis hat einen Wert, der größer oder gleich einem zweiten Referenz- oder Unterscheidungswert ist, so daß der Patient von einer gutartigen Pathologie der Prostata, wie z. B. einer Prostatahypertrophie, betroffen ist,
-- dieses erste Verhältnis hat einen Wert, der kleiner oder gleich einem ersten Referenz- oder Unterscheidungswert ist, und dieses zweite Verhältnis hat einen Wert, der größer oder gleich einem zweiten Referenz- oder Unterscheidungswert ist, so daß der Patient mit hoher Wahrscheinlichkeit von einem Adenokarzinom der Prostata betroffen ist, und mit geringer Wahrscheinlichkeit von einer gutartigen Pathologie der Prostata, wie z. B. einer gutartigen Prostatahypertrophie, betroffen ist,
-- dieses erste Verhältnis hat einen Wert, der größer oder gleich einem ersten Referenz- oder Unterscheidungswert ist, und dieses zweite Verhältnis hat einen Wert, der kleiner oder gleich einem zweiten Referenz- oder Unterscheidungswert ist, so daß der Patient mit hoher Wahrscheinlichkeit von einer gutartigen Pathologie der Prostata, wie z. B. einer gutartigen Prostatahypertrophie, betroffen ist, und mit einer geringen Wahrscheinlichkeit von einem Adenokarzinom der Prostata betroffen ist.
In diesem sechsten Fall liegt der erste Referenzwert bei 1 bis 18%, vorzugsweise bei 5 bis 18%, und beträgt genauer etwa 6,3%, und der zweite Referenzwert liegt bei 10 bis 20%, vorzugsweise bei 13 bis 17%, und beträgt genauer etwa 15%.
Vorzugsweise liegt bei dem sechsten Fall die hohe Wahrscheinlichkeit, von einem Adenokarzinom der Prostata betroffen zu sein, bei 80 bis 95% und vorzugsweise bei 84 bis 87%, und die geringe Wahrscheinlichkeit, von einer gutartigen Pathologie der Prostata betroffen zu sein, liegt bei 5 bis 20% und vorzugsweise bei 13 bis 16%, während die hohe Wahrscheinlichkeit, von einer gutartigen Pathologie der Prostata betroffen zu sein, bei 80 bis 95% und vorzugsweise bei 82 bis 85% liegt und die geringe Wahrscheinlichkeit, von einem Adenokarzinom der Prostata betroffen zu sein, bei 5 bis 20% und vorzugsweise bei 15 bis 18% liegt.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein Analyseverfahren für die Diagnose eines Adenokarzinoms oder einer gutartigen Pathologie der Prostata bei einem Patienten, bei dem die Kombination von zumindest zwei der oben beschriebenen Verfahren verwendet wird.
Gemäß einer Ausführungsform wird das Verfahren dann angewendet, wenn die Gesamt-PSA-Konzentration in dem Blut oder in dem Serum größer als 2 ng/ml ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft schließlich ein Verfahren, in dem ein Verfahren verwendet wird, das soeben beschrieben wurde, und das besteht aus:
- dem Detektieren des Vorhandenseins und dem Quantifizieren des Niveaus von zwei der nachfolgenden Parameter: freies PSA in gespaltener Form, freies PSA in nicht-gespaltener Form, komplexiertes PSA und gesamtes PSA,
- dem Bestimmen des Wertes des Verhältnisses von:
-- gespaltenem freien PSA zu gesamtem freien PSA,
-- gespaltenem freien PSA zu nicht-gespaltenem freien PSÄ,
-- nicht-gespaltenem freien PSA zu gesamtem freien PSA,
-- gespaltenem freien PSA zu gesamten PSA, oder
-- gespaltenem freien PSA zu komplexiertem PSA, und
- dem Vergleichen dieses Verhältnisses mit einem Referenzwert für die Diagnose eines Adenokarzinoms der Prostata bei einem männlichen menschlichen Patienten.
Zuvor und vorzugsweise: läßt man die Proteine, die aus dem Blut, dem Serum, dem Urin oder der Samenflüssigkeit des Patienten stammen, migrieren.
Vorzugsweise wird die Migration mittels zweidimensionaler Elektrophorese durchgeführt.
Vorzugsweise wird der prozentuale Anteil des gesamten PSA bestimmt.
Schließlich und bevorzugt wird die Detektion mittels Chemolumineszenz nach Darstellung mittels Westernblot durchgeführt.
Die beiliegenden Figuren dienen der beispielhaften Erklärung und haben keinen einschränkenden Charakter. Sie ermöglichen es, die Erfindung besser zu verstehen.
Fig. 1 stellt eine vergleichende Abbildung der Positionierung der Seren von verschiedenen Patienten einerseits in bezug auf ihre Konzentration von gesamtem PSA, die bei 2,1 bis 30 ng/ml liegt (Abszissenachse), und andererseits in bezug auf ihr Verhältnis von freiem PSA zu gesamtem PSA (Ordinatenachse) dar. Diese Abbildung start aus einem Artikel "Free to total Prostate-Specific Antigen (PSA) ratio is superior to total-PSA in differentiating Benign Prostate Hypertrophy from prostate cancer", Vol. 156, 1964-1968, Dec 1996 gemäß P.J. Van Cangh et al. Die schwarzen Kreise stellen Krebsfälle und die weißen Kreise BPH-Fälle dar.
Fig. 2 stellt eine zweidimensionale Elektrophorese dar, bei der die Migration des PSA in verschiedenen Formen einerseits in Abhängigkeit des isoelektrischen Punkts auf der Abszisse, und andererseits in Abhängigkeit des Molekulargewichts auf der Ordinate durchgeführt wurde.
Fig. 3 stellt eine zweidimensionale Elektrophorese eines Serums eines von einer BPH betroffenen Patienten dar, wobei das Serum 3,9 ng/ml PSA enthielt.
Fig. 4 stellt eine zweidimensionale Elekrophorese eines Serums eines von einem Adenokarzinom betroffenen Patienten dar, wobei das Serum 4000 ng/ml PSA enthielt.
Fig. 5 stellt eine vergleichende Abbildung der Positionierung von Seren von verschiedenen Patienten einerseits in bezug auf ihre Konzentration von gesamtem PSA, die bei 1 bis 34 ng/ml liegt (Abszissenachse), und andererseits in bezug auf ihr Verhältnis von gespaltenem freien PSA zu der Konzentration von nicht-gespaltenem freien PSA (Ordinatenachse) dar. Die weißen Quadrate stellen Krebsfälle und die schwarzen Kreise BPH-Fälle dar.
Schließlich stellt Figur. 6 eine vergleichende Abbildung der Positionierung von Seren von verschiedenen Patienten einerseits in bezug auf ihr Verhältnis von der Konzentration von freiem PSA zu der Konzentration von gesamtem PSA (Abszissenachse), und andererseits in bezug auf ihr Verhältnis von der Konzentration von gespaltenem freien PSA zu nicht-gespaltenem freien PSA (Ordinatenachse) dar. Die weißen Quadrate stellen Krebsfälle und die schwarzen Kreise BFH-Fälle dar.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren für die Diagnose von Prostatakrebs oder einer gutartigen Pathologie der Prostata, wie z. B. BPH, durch die nachfolgende Behandlung von 100 ul der Probe:
- Zugabe von 50 ul einer wäßrigen Lösung von 10% Natriumdodecylsulfat (SDS) und 2,3% Dithiothreitol (DTT);
- Erwärmung für 5 Minuten in einem kochenden Wasserbad;
Verdünnen in QSP 350 ul einer wäßrigen Lösung von 8,3 M Harnstoff, 2 M Schwefelharnstoff, 4% 3-[(3-Cholamidpropyl)-dimethylammonio]-1-propansulfolat (CHAPS), 100 mM DTT, 2% Servalyt 4-9 (Serva, Heidelberg, Deutschland), 0,1 g/1 Orange G;
- Rehydrieren eines trockenen Streifens von Immobilin, der einen immobilisierten nicht-linearen pH-Gradienten von pH = 3 bis pH = 10 (Pharmacia, Uppsalla, Schweden) aufweist, in einem Teströhrchen unter Paraffinöl für 6 bis 72 Stunden bei Raumtemperatur mittels 500 ml der verdünnten Probe;
- Migration und Fokussierung der Proteine der Probe in Abhängigkeit ihres isoelektrischen Punktes in dem Immobilinstreifen mittels des Multiphore II-Systems (Pharmacia), entsprechend den Empfehlungen der Lieferfirma bei 15ºC und bei 100 kV/h ± 10% bis 6000 V, um eine Trennung gemäß einer ersten Dimension zu erzielen;
- Einfrieren des fokussierten Immobilinstreifens bei - 30ºC (fakultativ);
- Äquilibrieren des Immobilinstreifens für 15 Minuten in einer 1,5 M Lösung von Tris(hydroxymethyl)aminomethan, Salzsäure von pH = 8,8 mit zugesetztem 6 M Harnstoff, 2% SDS, 30% Glycerin, 50 mg/ml Bromphenolblau und 10 mg/ml DTT;
- Äquilibrieren des Immobilinstreifens für 15 Minuten in einer 1,5 M Lösung von Tris(hydroxymethyl)aminomethan, Salzsäure von pH = 8,8 mit zugesetztem 6 M Harnstoff, 2% SDS, 30% Glycerin, 50 mg/ml Bromphenolblau und 480 mg/ml Iodacetamid;
- Abtropfenlassen des Überschusses von Äquilibrierungslösung für 5 bis 10 Minuten, indem auf den Rand des Immobilinstreifens aufgesetzt wird;
- Aufsetzen des Immobilinstreifens auf den Oberteil eines Polyacrylamidgels von 16 · 20 cm mit C = 2,8%, T = 12%;
- Bedecken des Immobilinstreifens mit einer 0,5%igen Lösung von aufgeschmolzener Agarose in einem Puffer aus 25 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethan, 192 mM Glycin, 1% SDS bei pH = 8,4;
- Migration der zuvor in dem Immobilinstreifen fokussierten Proteine in Abhängigkeit ihres Molekulargewichts in dem Polyacrylamidgel mittels des Protean II xi-Systems (Bio-Rad, Hercules, USA) entsprechend den Empfehlungen der Lieferfirma, um eine Trennung gemäß einer zweiten Dimension zu erzielen;
- Transfer der Proteine des zweidimensionalen Gels auf eine Immobilon-P-Membran (Millipore, Bedford, USA) mittels des Trans-blot-Systems (Bio-Rad) in einer Lösung von 10 mM 3-[Cyclohexylamino]-1-propansulfosäure (CAPS), 10% Methanol mit pH = 11 für 16 bis 24 Stunden bei 400 mA;
- Passivierung der auf der Membran verbliebenen freien Bindestellen für eine Stunde mittels der TNTM-Lösung (15 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethan, 0,14 M NaCl, 0,5 mg/ml Tween 20, pH = 8, mit 5% zugesetztem Magermilchpulver);
- Inkubation der Membran für 1 Stunde in einer Lösung von 10 ug/ml monoklonaler Antikörper von Mäusen des Klons 13C9E9D6G8 (Bio-Merieux) in TNTM-Lösung;
- dreimaliges Waschen der Membran für 10 Minuten in TNTM-Lösung;
- Inkubation der Membran für 1 Stunde in einer 1 : 5000- Verdünnung von polyklonalen Anti-Maus-Fc-Antikörpern aus der Ziege, die an Meerrettich-Peroxydase gekoppelt sind (Jackson ImmunoResearch, West Grove, USA) in TNTM-Lösung;
- zweimaliges Waschen der Membran für 10 Minuten in TNTM-Lösung;
- Waschen der Membran für 10 Minuten in einer Lösung von 0,1 M Tris(hydroxymethyl)aminomethan, Salzsäure mit pH = 7,6;
- Nachweis mittels des chemolumineszenten Substrats der Meerrettich-Peroxydase Super-Signal-Ultra (Pierce, Rockford, USA) gemäß den Empfehlungen der Lieferfirma;
- Detektion des emittierten Lichts mittels des FluorS- Multi-Imager-Systems (Bio-Rad) für 1 Minute bis 1 Stunde mit einer 4096 Graustufen-Skala;
- Quantifizierung der Formen von gespaltenem und nicht-gespaltenem freien PSA mittels der Multi-Analyst-Software (Bio-Rad);
- Berechnen der Verhältnisse von gespaltenem freien PSA zu gesamtem freien PSA, oder von nicht-gespaltenem freien PSA zu gesamtem freien PSA, oder von gespaltenem freien PSA zu nicht-gespaltenem freien PSA, oder von gespaltenem PSA zu gesamtem PSA, oder von gespaltenem PSA zu komplexiertem PSA;
- Bestimmung der Diagnose des Prostatakrebses nach den zuvor beschriebenen Referenzwerten.
Die vorliegende Erfindung betrifft demnach ein Verfahren zur Diagnose eines Adenokarzinoms der Prostata, aber gleichermaßen ein Verfahren, das es ermöglicht, einen von einem Adenokarzinom der Prostata betroffenen Patienten von einem von einer gutartigen Pathologie der Prostata betroffenen Patienten, wie bspw. von einer gutartigen Prostatahypertrophie (BPH), zu unterscheiden.
Demzufolge sind, wie dies gut in Fig. 1 dargestellt ist, schwarze Kreise und weiße Kreise dargestellt. Die schwarzen Kreise stellen Krebsfälle dar, während die weißen Kreise BPH betreffen. Man bemerkt vor allem, daß eine vollständige Vermischung von Krebsfällen mit den BPH-Fällen vorliegt. Mit einem Verhältnis von freiem PSA zu gesamtem PSA ist es folglich schwierig, zu berechnen, ob es sich tatsächlich um Krebs oder um BPH handelt. Es gibt trotz allem einen wichtigen Punkt festzuhalten, und zwar, daß die überwiegende Mehrzahl von Krebs- und BPH-Fällen, die im folgenden dargestellt werden, oberhalb einer Konzentration von 2,1 ng/ml gesamtem PSA liegen. Dies ist der Fall bei 74 der 75 getesteten Patientenseren. Allein Patient 35 weist einen niedrigeren Wert von 1,27 ng/ml auf. Im allgemeinen erscheint es deshalb als logisch anzunehmen, daß unterhalb dieser Schwelle die Krebs- oder BPH-Fälle weniger häufig sind. Die Patienten mit einer Konzentration von gesamtem PSA von weniger als 2 ng/ml werden als gesund angesehen. Das Risiko, daß diese Patienten von BPH betroffen sind, ist nicht quantifizierbar, denn die Anzahl der analysierten Fälle ist zu gering, um signifikant zu sein.
Die vorliegende Erfindung besteht folglich darin, Krebs von BPH zu unterscheiden. Hierzu wird eine zweidimensionale Elektrophorese durchgeführt, wie dies z. B. in Fig. 2 dargestellt ist. In dieser Elektrophorese sind drei Proteine oder Polypeptide mit verschiedenen Größen feststellbar. Zunächst findet man im oberen Bereich ein Protein von etwa 34 kD, ± 20%, welches in der Tat dem nicht-gespaltenen PSA-Protein entspricht.
Unterhalb sind zwei Massen dargestellt, nämlich von etwa 26 kD und 21 kD, ± 20%, die jeweils einer gespaltenen Form des PSA entsprechen. Zwischen den gespaltenen und nicht-gespaltenen Formen des freien PSA besteht ein bestimmtes Verhältnis, das dazu verwendet werden kann, um Krebs von BPH zu unterscheiden.
Demzufolge ist der Patient im Falle der Fig. 3 von einer BPH betroffen und dessen Serum enthält selbstverständlich mehr als 2,1 ng/ml gesamtem PSA, d. h. genaugenommen 3,9 ng/ml. Wenn diese Konzentration von gesamtem PSA mit der Fig. 1 in Bezug gebracht wird, dann wird bemerkt, daß in diesem Bereich sowohl BPH-Fälle als auch Krebsfälle liegen. Es hat sich gezeigt, daß bei der Messung des gesamten freien PSA, d. h. gespaltenem und nicht-gespaltenem PSA, d. h. man mißt auch das gespaltene PSA, ein Verhältnis von gespaltenem freien PSA zu gesamtem freien PSA gebildet werden kann, welches die Diagnose ermöglicht, daß der Patient entweder von Krebs betroffen ist, wenn dieses Verhältnis unterhalb oder oberhalb eines Referenzwertes liegt, oder von einer gutartigen Pathologie der Prostata betroffen ist, wenn dieses Verhältnis oberhalb oder unterhalb dieses Wertes liegt.
Solche Werte wurden bereits oben beschrieben und ein solches Verfahren zur Diagnose kann auch angewendet werden:
- mit einem Verhältnis der Konzentration von nichtgespaltenem freien PSA zu der Konzentration von gesamtem freien PSA, oder
- mit einem Verhältnis der Konzentration von gespaltenem freien PSA zu der Konzentration von nicht-gespaltenem freien PSA, oder
- mit einem Verhältnis der Konzentration von gespaltenem freien PSA zu der Konzentration von gesamtem PSA, oder schließlich
- mit einem Verhältnis der Konzentration von gespaltenem freien PSA zu der Konzentration von komplexiertem PSA.
Es ist gleichermaßen möglich, ein Verhältnis dieser Verhältnisse zu verwenden, wie dies bspw. in Fig. 6 der Fall ist, mit dem Verhältnis zwischen dem Verhältnis der Konzentration von freiem PSA zu der Konzentration von gesamtem PSA in Abhängigkeit des Verhältnisses der Konzentration von gespaltenem freien PSA zu der Konzentration von nicht-gespaltenem freien PSA. Dies wird weiter unten näher ausgeführt.
Im allgemeinen ist eines dieser Verfahren durchzuführen, wenn die Konzentration von gesamtem PSA im Blut oder im Serum größer oder gleich 2 ng/ml ist.
Das Verfahren besteht folglich darin, daß man die Proteine migrieren läßt, die aus dem Blut, dem Serum, dem Urin oder der Samenflüssigkeit des Patienten stammen, das Vorhandensein des freien PSA in gespaltener Form oder nicht-gespaltener Form detektiert und quantifiziert wird, und in Abhängigkeit der zuvor erhaltenen Ergebnisse bestimmt wird, ob der Patient gesund ist oder von einem Adenokarzinom der Prostata oder einer anderen gutartigen Pathologie der Prostata betroffen ist.
Die Migration erfolgt im allgemeinen durch zweidimensionale Elektrophorese und die Detektion durch Chemolumineszenz mit einem Nachweis mittels des Westernblots. Trotz allem ist es durchaus möglich, eine Technik in Betracht zu ziehen, die Antikörper verwendet, welche entweder spezifisch für freies PSA in gespaltener Form sind, oder spezifisch für freies PSA in nichtgespaltener Form, oder eventuell für gebundenes PSA sind, und die vor der Detektion dieser Formen keine Migration erfordert.
Sämtliche der erhaltenen Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengefaßt:
Es handelt sich um eine vergleichende Studie zwischen den Seren von 75 verschiedenen Patienten.
Zum besseren Verständnis der obigen Tabelle sei erwähnt, daß die Konzentrationen von gesamtem PSA (TPSA), freiem PSA (fPSA) und gespaltenem PSA (cPSA) in ng/ml angegeben sind. Die Verhältnisse werden in Prozent angegeben.
Diese Tabelle ermöglicht es rasch, die Verhältnisse darzustellen, die zwischen folgendem bestehen können:
- der Konzentration von gesamtem PSA, nachfolgend mit TPSA bezeichnet,
- der Konzentration von an Proteaseinhibitoren, wie z. B. dem ACT, gebundenem PSA, nachfolgend mit bPSA bezeichnet,
- der Konzentration von freiem PSA, nachfolgend mit fPSA bezeichnet,
- der Konzentration von nicht-gespaltenem freien PSA, nachfolgend mit ncPSA bezeichnet, und
- der Konzentration von gespaltenem freien PSA, nachfolgend mit cPSA bezeichnet.
Es ist festzuhalten, daß in der rechten Spalte die Konzentration von nicht-gespaltenem PSA (ncPSA) verwendet wird. Selbst wenn diese nicht gegeben ist, läßt sie sich leicht aus folgender Gleichung herleiten:
ncPSA = fPSA - cPSA
Wenn man das Verhältnis fPSA/TPSA betrachtet, so stellt man fest, daß dieses Verhältnis in keiner Weise charakteristisch ist. Somit zeigen bei den ersten sechs Patienten lediglich Patient 1 und 5 ein charakteristisches Verhältnis, d. h. ein solches Verhältnis, welches es ermöglichen könnte, einen Krebsfall von einem BPH-Fall zu unterscheiden.
In den anderen Fällen liegen die Verhältnisse bei 11,00 bis 14,59. Eine Unterscheidung zwischen Krebs und BPH ist folglich nicht möglich. Dies gilt gleichermaßen für die anderen Patientenseren. Es ist bspw. sehr schwierig, Patient 8 von 9, 12 von 15, etc. zu unterscheiden.
Besonders überraschende Beispiele sind die Fälle der Patienten 22, 40 und 52, die mit einem Verhältnis fPSA/TPSA von stets unter 11 von einer BPH betroffen sind, während zur gleichen Zeit die Patienten 26, 31, 49 und 63 von Krebs betroffen sind und ein Verhältnis von stets über 22 aufweisen. Zwischen diesen Werten 11 und 22 gibt es folglich, was die Diagnose betrifft, einen unscharfen Bereich. Es liegen jedoch zahlreiche Seren in diesem Bereich (selbst über diesem Bereich, wie dies der Fall bei den sieben Patienten ist, die soeben beschrieben wurden). Die Anzahl der Seren, die in diesem Bereich liegt, beträgt 31, das bedeutet, es gibt insgesamt 38 Seren, die nicht mit einer effizienten Wahrscheinlichkeit diagnostiziert werden können. Dies bedeutet, es gibt einen Fehler von etwa 50,67%. Die Verwendung des Verhältnisses von fPSA/TPSA ist in diesem Fall für die Unterscheidung zwischen BPH und Krebs ungeeignet.
Dies verdeutlicht die Grenzen dieser Technik.
Wenn hingegen das Verhältnis verwendet wird, das zwischen cPSA/bPSA, cPSA/TPSA, ncPSA/fPSA, cPSA/fPSA und cPSA/ncPSA vorherrscht, und stets auf die ersten sechs Patientenseren Bezug genommen wird, so ist festzustellen, daß ein deutlicher Unterschied zwischen den Verhältnissen der Patienten 1 und 2 vorliegt, die von einer BPH betroffen sind, und den Patienten 3 bis 6, die von Krebs betroffen sind.
Diese Verhältnisse, bei denen die gespaltenen und/oder nicht-gespaltenen Formen des PSA verwendet werden, sind folglich für den wirklichen Zustand eines Patienten wesentlich repräsentativer.
Demzufolge ist im Rahmen der in der Tabelle gegebenen Beispiele das Verhältnis cPSA/TPSA im Fall einer BPH stets größer oder gleich 1,2%, und im Fall von Krebs ist dieses Verhältnis stets kleiner als 0,54%.
Das Verhältnis cPSA/bPSA ist im Fall einer BPH stets größer als 1,34%, und im Fall von Krebs ist das Verhältnis stets kleiner als 0,63%.
Das Verhältnis ncPSA/fPSA ist im Fall einer BPH stets kleiner als 89,2%, und im. Fall von Krebs ist das Verhältnis stets größer als 95,88%.
Das Verhältnis cPSA/fPSA ist im Fall einer BPH stets größer als 10,8%, und im Fall von Krebs ist das Verhältnis stets kleiner als 4,12%.
Schließlich ist das Verhältnis cPSA/ncPSA im Fall einer BPH stets größer als 12,11%, und im Fall von Krebs ist das Verhältnis stets kleiner als 4,3%.
Die nicht repräsentativen Verhältnisse sind die Verhältnisse ncPSA/TPSA, ncPSA/bPSA und fPSA/TPSA, da die Verhältnisse von drei Patienten 3, 4 und 6, die von Krebs betroffen sind, in dem Intervall liegen, das durch die Verhältnisse der Patienten 1 und 2 begrenzt wird, die von einer BPH betroffen sind.
Daher kann es besonders interessant sein, eine Kombination der unterschiedlichen Verhältnisse cPSA/TPSA, cPSA/bPSA, ncPSA/fPSA, cPSA/fPSA und cPSA/ncPSA, oder gar von sämtlichen dieser Verhältnisse zu verwenden, um eine gutartige Pathologie der Prostata von einem Prostatakrebs zu unterscheiden.
Wenn man die Patienten 22, 40 und 52 herausgreift, so stellt man fest, daß deren Verhältnis cPSA/ncPSA jeweils 7,13 - 8,62 - 11,65 beträgt. Was die Patienten 26, 31, 49 und 63 betrifft, so beträgt deren. Verhältnis cPSA/ncPSA dann jeweils 0,86 - 0,97 - 0,00 - 0,00.
Dieses Verhältnis ist demnach vollkommen für die Diagnose geeignet, die Ärzte durchführen möchten.
Wenn nun auf Fig. 5 Bezug genommen wird, so stellt man fest, daß oberhalb einer horizontalen Geraden, die einem Wert von 6,5% des Verhältnisses cPSA/ncPSA entspricht, nahezu sämtlich BPH-Fälle, außer zwei Fälle, dargestellt sind. Es handelt sich um die Patienten 7 und 19, deren Verhältnisse 1,37 und 4,64 betragen, d. h. dies sind zwei Fälle von dreiunddreißig, was bedeutet, daß der. Fehler etwa 6% beträgt, was deutlich niedriger ist als bei dem klassischen Verhältnis fPSA/TPSA, das zuvor dargestellt wurde.
Es ist außerdem festzustellen, daß unterhalb dieser horizontalen Referenzgeraden, die bei 6,5% des Verhältnisses cPSA/ncPSA liegt, praktisch sämtliche Krebsfälle, mit Ausnahme von zwei Fällen, dargestellt sind. Es handelt sich um die Patienten 14 und 24, deren Verhältnisse 13,74 und 24,80 betragen, d. h. dies sind zwei Fälle von zweiundvierzig, was bedeutet, daß der Fehler etwa 4,77% beträgt.
Fig. 6 zeigt noch Weitergehendes. Man erkennt zwei Geraden, wobei die eine vertikal und die andere horizontal verläuft, die sich beide kreuzen. Die vertikale Gerade entspricht dem Wert 15,1% des Verhältnisses fPSA/TPSA, und die horizontale Gerade entspricht dem Wert 6,2% des Verhältnisses cPSA/ncPSA. Vier sich darstellende Fälle können hergeleitet werden, wobei es sich um folgende handelt:
- das Verhältnis cPSA/ncPSA hat einen Wert von kleiner oder gleich 6,2%, und das Verhältnis fPSA/TPSA hat einen Wert von kleiner oder gleich 15,1%, so daß der Patient von einem Adenokarzinom der Prostata betroffen ist,
- das Verhältnis cPSA/ncPSA hat einen Wert von größer als 6,2%, und das Verhältnis fPSA/TPSA hat einen Wert von größer als 15,1%, so daß der Patient von einer gutartigen Pathologie der Prostata, wie z. B. einer gutartigen Prostatahypertrophie, betroffen ist,
- das Verhältnis cPSA/ncPSA hat einen Wert von kleiner oder gleich 6,2%, und das Verhältnis fPSA/TPSA hat einen Wert von größer als 15,1%, so daß der Patient mit hoher Wahrscheinlichkeit von einem Adenokarzinom der Prostata, und mit geringer Wahrscheinlichkeit von einer gutartigen Pathologie der Prostata, wie z. B. einer gutartigen Prostatahypertrophie, betroffen ist,
- das Verhältnis cPSA/ncPSA hat einen Wert von größer als 6,2%, und das Verhältnis fPSA/TPSA hat einen Wert von kleiner oder gleich 15,1%, so daß der Patient mit hoher Wahrscheinlichkeit von einer gutartigen Pathologie der Prostata, wie z. B. einer gutartigen Prostatahypertrophie, betroffen ist, und mit geringer Wahrscheinlichkeit von einem Adenokarzinom der Prostata betroffen ist.
Selbst wenn die Referenzwerte mit 6,2 und 15,1% gegeben sind, ist es möglich, daß mit einer anderen Gruppe von Seren oder einer unterschiedlichen Anzahl von Seren diese Zahlen variieren. Folglich liegt vorzugsweise der erste Referenzwert bei 1 bis 18%, vorzugsweise bei 5 bis 8%, und der zweite Referenzwert liegt bei 10 bis 20%, vorzugsweise bei 13 bis 17%.
Was die weiter oben erwähnten Wahrscheinlichkeiten in dem oben beschriebenen dritten Fall betrifft, so liegt die hohe Wahrscheinlichkeit, von einem Adenokarzinom der Prostata betroffen zu sein, bei 84 bis 87%, und die geringe Wahrscheinlichkeit, von einer gutartigen Pathologie der Prostata betroffen zu sein, liegt bei 13 bis 16%. Folglich kommen zwei BPH- Fälle auf insgesamt 14 Fälle. Trotzdem können sich für diesen dritten und vierten Fall die Werte aufgrund der Tatsache verbreitern, daß sich mit anderen Proben eine breitere Spanne finden läßt, bspw. 80 bis 95% bezüglich der hohen Wahrscheinlichkeit, und 5 bis 20% bezüglich der geringen Wahrscheinlichkeit.
Im vierten Fall liegt die hohe Wahrscheinlichkeit, von einer gutartigen Pathologie der Prostata betroffen zu sein, bei 82 bis 85%, und die geringe Wahrscheinlichkeit, von einem Adenokarzinom der Prostata betroffen zu sein, bei 15 bis 18%. Dies entspricht zwei Fällen von Krebs auf insgesamt 12 Fälle.
Trotzdem können sich für diesen dritten und vierten Fall die Werte aufgrund der Tatsache verbreitern, daß sich mit anderen Proben eine breitere Spanne finden läßt, bspw. 80 bis 95% bezüglich der hohen Wahrscheinlichkeit, und 5 bis 20% bezüglich der geringen Wahrscheinlichkeit.
Es gibt drei unabhängige Variablen:
- A = bPSA, d. h. komplexiertes oder an Inhibitoren (ACT...) gebundenes PSA
- B = ncPSA, d. h. nicht-gespaltenes freies PSA
- C = cPSA, d. h. gespaltenes freies PSA
mit den Konzentrationen A > > B > > C
Folglich können die verschiedenen Verhältnisse auf die nachfolgende Art und Weise geschrieben werden und zu den folgenden Abschätzungen führen:
4. ncPSA/bPSA = B/A
5. cPSA/bPSA = C/A
8. cPSA/ncPSA =C/B
Es scheint demnach so, daß die Verhältnisse 1, 2 und 4 zum selben Ergebnistyp führen. Verhältnis 1 wurde bereits im Stand der Technik beschrieben, der zuvor diskutiert wurde, und führt zu zahlreichen fehlerhaften Diagnosen, weshalb folglich die Verhältnisse 2 und 4 nicht interessant sind.
Die Verhältnisse 6, 7 und 8 sind über eine exakte mathematische Relation miteinander verbunden, weshalb gesagt werden kann, daß diese zu einem identischen Ergebnis führen.
Die Verhältnisse 3 und 5 liefern ein äquivalentes Ergebnis, das sich von den vorherigen Verhältnissen unterscheidet.
Die Verhältnisse 3 und 5 bis 8 sind folglich repräsentativ.
Es gibt mehrere Strategien, das gespaltene oder nichtgespaltene freie PSA zu bestimmen.
Das gespaltene PSA zeigt die folgenden Charakteristiken. Erstens beeinflussen die internen Fragmentierungsstellen aufgrund des Vorhandenseins von fünf Disulfidbrücken, die die verschiedenen Fragmente miteinander verbinden, nicht den dreidimensionalen Zusammenhalt des Moleküls. Zweitens werden die Disulfidbrücken nach der Reduktion aufgebrochen und die verschiedenen PSA-Fragmente dissoziieren. Drittens verändert die Fragmentierung die Konformation des PSA und führt zum Verlust seiner enzymatischen Aktivität und seiner Kapazität, an Proteaseinhibitoren zu binden.

I - Bestimmung der gespaltenen Formen nach der Reduktion der Probe:

Nach der Fragmentierung oder Spaltung und Reduktion werden interne Bereiche des PSA demaskiert und auf dem gesamten PSA werden unzugängliche Epitope freigegeben. Gespaltenes und reduziertes PSA oder Peptide, die sich vor und nach den Spaltstellen befinden, weisen diese Epitope auf. Immunisierungen mit diesen Peptiden oder dem gespaltenen und reduzierten PSA ermöglichen es, Antikörper zu erhalten, die gegen die gesuchten Epitope gerichtet sind. Nach der Reduktion der zu analysierenden Probe wird durch einen Test, bei dem solche Antikörper verwendet werden, spezifisch das gespaltene PSA bestimmt.
Folglich wurde ein Immunogen von gespaltenem und reduziertem PSA erhalten und charakterisiert. Peptide, die sich vor oder hinter den Spaltstellen befinden, wurden synthetisiert. Bei Mäusen wurde eine Immunisierung mit gespaltenem und reduziertem PSA durchgeführt. Es wurden 10 Klone von monoklonalen Antikörpern erhalten, die rein für Epitope an gespaltenem PSA spezifisch sind.

II - Bestimmung der gespaltenen Formen ohne Reduktion der Probe:

Das gespaltene PSA ist inaktiv und kann eine konformationelle Modifikation aufweisen, die für den Aktivitätsverlust verantwortlich ist. Eine Immunisierung von Mäusen mit diesem PSA ermöglicht es, Antikörper zu erhalten, die gegen diese konformationellen Epitope gerichtet sind. Mit einem Test, bei dem diese Antikörper verwendet werden, kann direkt und spezifisch das gespaltene PSA bestimmt werden.
Das größtenteils gespaltene inaktive PSA wurde von einer Lieferfirma bezogen. Es wurde eine Immunisierung von Mäusen durchgeführt.

III - Bestimmung des nicht-gespaltenen PSA nach der Reduktion der Probe:

Nach der Reduktion der Probe fragmentiert das gespaltene PSA, während die Aminosäurenkette des nicht-gespaltenen PSA intakt bleibt. C-terminale und N-terminale Peptide ermöglichen einen spezifischen Nachweis von Antikörpern, die gegen den C- terminalen Teil oder den N-terminalen Teil gerichtet sind, oder auch nach der Immunisierung diese zu erhalten. Nach der Reduktion der Probe wird es durch einen Sandwich mit einem solchen Antikörper, der gegen den C-terminalen Teil, und einem Antikörper, der gegen den C-terminalen Teil (***???) gerichtet ist, möglich, ausschließlich das vollständige PSA zu erkennen.
Es wurden C-terminale und N-terminale Peptide des PSA hergestellt. Diese Peptide wurden verwendet, um Immunisierungen von Mäusen nachzuweisen, die mit Samen-PSA durchgeführt würden, oder um Mäuse direkt zu immunisieren. Es wurden Antikörper nachgewiesen, um Paare zu definieren, die das nicht-gespaltene reduzierte PSA, und nicht das gespaltene reduzierte PSA erkennen.
Wir verfügen über einige Antikörperpaare, die die erwarteten Eigenschaften aufweisen, wie dies deutlich in der nachfolgenden Tabelle dargestellt ist.

IV - Bestimmung von nicht-gespaltenem PSA unter nichtreduzierenden Bedingungen:

Das nicht-gespaltene PSA kann bestimmte andere konformationelle Epitope umfassen als das gespaltene PSA (siehe Kapitel II). Peptide, die die Fragmentierungsstellen überdecken, können solche Epitope aufweisen. Eine Immunisierung von Mäusen mit diesen Peptiden oder mit dem nicht-gespaltenen PSA ermöglicht es, Antikörper zu erhalten, die gegen diese Epitope gerichtet sind. Durch einen Test, bei dem diese Antikörper verwendet werden, wird direkt und spezifisch das nicht-gespaltene PSA bestimmt.
Die Peptide wurden synthetisiert. Es wurde eine Immunisierung von Mäusen mit größtenteils nicht-gespaltenem PSA durchgeführt.

V - Bestimmung von enzymatisch aktivem PSA:

Das nicht-gespaltene PSA in dem Serum kann enzymatisch aktiv sein. Folglich wurde demonstriert, daß das gespaltene PSA enzymatisch inaktiv war, nicht aber umgekehrt. Mittels Phagendisplay und/oder der Modifizierung von natürlichen Sequenzen kann ein Peptidinhibitor konstruiert werden, der eine starke Affinität zu dem aktiven PSA zeigt. Das so konstruierte Peptid kann dazu verwendet werden, um selektiv das enzymatisch aktive PSA einzufangen, und ermöglicht folglich dessen Bestimmung.
Das nachfolgende Protokoll ermöglicht die spezifische Bestimmung des nicht-gespaltenen PSA. Es besteht aus folgenden durchzuführenden Operationen:
- Beschichtung von ELISA-Mikroplatten mit 100 uI VOn Antikörpern zu 20 ug/ml in 0,2 M Tris-Maleat-Puffer, pH = 6,2
- Inkubation für eine Nacht bei Raumtemperatur
- Waschen mit dreimal 300 ul 0,2 M Tris-Maleat-Puffer, 0,5% Tween 20, pH = 6,2
- Passivierung für 1 Stunde mit 200 ul 0,2 M Tris- Maleat-Puffer, 3% fötalem Kälberserum, pH = 6,2
- Waschen mit dreimal 300 ul 0,2 M Tris-Maleat-Puffer, 0,5% Tween 20, pH = 6,2
- Verdünnen des PSA auf 100 ng/ml in 0,2 M Tris- Maleat-Puffer, 3% fötalem Kälberserum, pH = 6,2
- Inkubation von 100 ul PSA für 1 Stunde bei 37ºC
- Waschen mit dreimal 300 ul 0,2 M Tris-Maleat-Puffer, 0,5% Tween 20, pH = 6,2
- Inkubation von 100 ul biotinylierten Anti-PSA- Antikörpern 3A1B5, 1 : 1000 verdünnt in 0,2 M Tris- Maleat-Puffer, 3% fötalem Kälberserum, pH = 6,2; für 1 Stunde bei 37ºC
- Waschen mit dreimal 300 ul 0,2 M Tris-Maleat-Puffer; 0,5% Tween 20, pH = 6,2
- Inkubation von 100 ul Streptavidin-alkalischer Phosphatase, 1 : 500 verdünnt in 0,2 M Tris, 0,1 M NaCl, 1 mM MgCl&sub2;, 0,1 mM ZnCl&sub2;, 3% fötalem Kälberserum, pH = 6,5
- Waschen mit dreimal 300 ul 0,2 M Tris-Maleat-Puffer, 0,5% Tween 20, pH = 6,2
- 15minütige Nachweisreaktion bei 37ºC mit 100 ul des Substrates pNPP
- Blockierung der Reaktion mittels 100 ul 1 N Natriumcarbonat
- Ablesen am Photospektrometer bei 405 nm, Abziehen des Hintergrundsignals bei 630 nm.

Claims

1. Analyseverfahren für die Diagnose eines Adenokarzinoms der Prostata bei einem männlichen menschlichen Patienten, ohne. Vornahme einer Prostatablopsie, bei dem das in einer Blut-, Serum-, Urin- oder Samenflüssigkeitsprobe des Patienten vorhandene PSA(prostataspezifische Antigen)-Protein verwendet wird, dadurch gekennzeichnet, daß es besteht aus:

- dem Messen des Niveaus von gesamtem freien PSA, also gespaltenem und nicht-gespaltenem PSA,

- dem Messen des Niveaus von gespaltenem freien PSA,

- dem Berechnen des Verhältnisses von gespaltenem freien PSA zu gesamtem freien PSA, und

- dem Unterscheiden von zwei Fällen, nämlich:

-- dieses Verhältnis hat einen Wert, der kleiner oder gleich einem Referenz- oder Unterscheidungswert ist, der sich bei Patienten mit einem Adenokarzinom der Prostata ergibt, so daß der Patient von einem Adenokarzinom der Prostata betroffen ist,

-- dieses Verhältnis hat einen Wert, der größer als der Referenzwert ist, der sich bei Patienten mit gutartiger Pathologie der Prostata ergibt, so daß der Patient von einer gutartigen Pathologie der Prostata, wie z. B. einer gutartigen Prostatahypertrophie, betroffen ist.

2. Analyseverfahren, für die Diagnose eines Adenokarzinoms der Prostata bei einem männlichen menschlichen Patienten, ohne Vornahme einer Prostatablopsie, bei dem das in einer Blut-, Serum-, Urin- oder Samenflüssigkeitsprobe des Patienten vorhandene PSA(prostataspezifische Antigen)-Protein verwendet wird, dadurch gekennzeichnet, daß es besteht aus:

- dem Messen des Niveaus von nicht-gespaltenem freien PSA,

- dem Messen des Niveaus von gespaltenem freien PSA,

- dem Berechnen des Verhältnisses von gespaltenem freien PSA zu nicht-gespaltenem freien PSA, und

- dem Unterscheiden von zwei Fällen, nämlich:

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Referenzwert bei 2 bis 12% und vorzugsweise bei 5 bis 8% liegt.

4. Analyseverfahren für die Diagnose eines Adenokarzinoms der Prostata bei einem männlichen menschlichen Patienten, ohne Vornahme einer Prostatablopsie, bei dem das in einer Blut-, Serum-, Urin- oder Samenflüssigkeitsprobe des Patienten vorhandene PSA(prostataspezifische Antigen)-Protein verwendet wird, dadurch gekennzeichnet, daß es besteht aus:

- dem Messen des Niveaus von nicht-gespaltenem freien PSA,

- dem Berechnen des Verhältnisses von nicht-gespaltenem freien PSA zu gesamtem freien PSA, und

- dem Unterscheiden von zwei Fällen, nämlich:

-- dieses Verhältnis hat einen Wert, der größer oder gleich einem Referenz- oder Unterscheidungswert ist, der sich bei Patienten mit einem Adenokarzinom der Prostata ergibt, so daß der Patient von einem Adenokarzinom der Prostata betroffen ist,

-- dieses Verhältnis hat einen Wert, der kleiner als der Referenzwert ist, der sich bei Patienten mit einer gutartigen Pathologie der Prostata ergibt, so daß der Patient von einer gutartigen Pathologie der Prostata, wie z. B. einer gutartigen Prostatahypertrophie, betroffen ist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Referenzwert bei 88 bis 98% und vorzugsweise bei 93 bis 95% liegt.

6. Analyseverfahren für die Diagnose eines Adenokarzinoms der Prostata bei einem männlichen menschlichen Patienten, ohne Vornahme einer Prostatablopsie, bei dem das in einer Blut-, Serum-, Urin- oder Samenflüssigkeitsprobe des Patienten vorhandene PSA(prostataspezifische Antigen)-Protein verwendet wird, dadurch gekennzeichnet, daß es besteht aus:

- dem Messen des Niveaus von gesamtem PSA, also komplexiertem und freiem, gespaltenem und nicht-gespaltenem PSA,

- dem Messen des Niveaus von gespaltenem freien PSA,

- dem Berechnen des Verhältnisses von gespaltenem freien PSA zu gesamtem PSA, und

- dem Unterscheiden von zwei Fällen, nämlic h:

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Referenzwert bei 0,1 bis 2% und vorzugsweise bei 0,4 bis 1% liegt.

8. Analyseverfahren für die Diagnose eines Adenokarzinoms der Prostata bei einem männlichen menschlichen Patienten, ohne Vornahme einer Prostatablopsie, bei dem das in einer Blut-, Serum-, Urin- oder Samenflüssigkeitsprobe des Patienten vorhandene PSA(prostataspezifische Antigen)-Protein verwendet wird, dadurch gekennzeichnet, daß es besteht aus:

- dem Messen des Niveaus von komplexiertem PSA,

- dem Messen des Niveaus von gespaltenem freien PSA,

- dem Berechnen des Verhältnisses von gespaltenem freien PSA zu komplexiertem PSA, und

- dem Unterscheiden von zwei Fällen, nämlich:

-- dieses Verhältnis hat einen Wert, der kleiner als der Referenzwert ist, der sich bei Patienten mit gutartiger Pathologie der Prostata ergibt, so daß der Patient von einer gutartigen Pathologie der Prostata, wie z. B. einer gutartigen Prostatahypertrophie, betroffen ist.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Referenzwert bei 0,1 bis 2,2% und vorzugsweise bei 0,6 bis 1,2% liegt.

10. Analyseverfahren für die Diagnose eines Adenokarzinoms der Prostata bei einem männlichen menschlichen Patienten, ohne Vornahme einer Prostatablopsie, bei dem das in einer Blut-, Serum-, Urin- oder Samenflüssigkeitsprobe des Patienten vorhandene PSA(prostataspezifische Antigen)-Protein verwendet wird, dadurch gekennzeichnet, daß es besteht aus:

- dem Messen des Niveaus von nicht-gespaltenem freien PSA,

- dem Messen des Niveaus von gespaltenem freien PSA,

- dem Messen des Niveaus von freiem PSA,

- dem Messen des Niveaus von gesamtem PSA,

- dem Berechnen des Verhältnisses von gespaltenem freien PSA zu nicht-gespaltenem freien PSA, das erstes Verhältnis genannt wird,

- dem Berechnen des Verhältnisses von freiem PSA zu gesamtem PSA, das zweites Verhältnis genannt wird, und

- dem Unterscheiden von vier Fällen, nämlich:

-- dieses erste Verhältnis hat einen Wert, der kleiner oder gleich einem ersten Referenz- oder Unterscheidungswert ist, und dieses zweite Verhältnis hat einen Wert, der kleiner oder gleich einem zweiten Referenz- oder Unterscheidungswert ist, so daß der Patient von einem Adenokarzinom der Prostata betroffen ist,

-- dieses erste Verhältnis hat einen Wert, der größer oder gleich einem ersten Referenz- oder Unterscheidungswert ist, und dieses zweite Verhältnis hat einen Wert, der größer oder gleich einem zweiten Referenz- oder Unterscheidungswert ist, so daß der Patient von einer gutartigen Pathologie der Prostata, wie z. B. einer Prostatahypertrophie, betroffen ist,

-- dieses erste Verhältnis hat einen Wert, der kleiner oder gleich einem ersten Referenz- oder Unterscheidungswert ist, und dieses zweite Verhältnis hat einen Wert, der größer oder gleich einem zweiten Referenz- oder Unterscheidungswert ist, so daß der Patient mit hoher Wahrscheinlichkeit von einem Adenokarzinom der Prostata betroffen ist, und mit geringer Wahrscheinlichkeit von einer gutartigen Pathologie der Prostata, wie z. B. einer gutartigen Prostatahypertrophie, betroffen ist,

-- dieses erste Verhältnis hat einen Wert, der größer oder gleich einem ersten Referenz- oder Unterscheidungswert ist, und dieses zweite Verhältnis hat einen Wert, der kleiner oder gleich einem zweiten Referenz- oder Unterscheidungswert ist, so daß der Patient mit hoher Wahrscheinlichkeit von einer gutartigen Pathologie der Prostata, wie z. B. einer gutartigen Prostatahypertrophie, betroffen ist, und mit einer geringen Wahrscheinlichkeit von einem Adenokarzinom der Prostata betroffen ist.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der erste Referenzwert bei 1 bis 18%, vorzugsweise bei 5 bis 8% liegt und genauer etwa 6,3% beträgt, und daß der zweite Referenzwert bei 10 bis 20%, vorzugsweise bei 13 bis 17% liegt und genauer etwa 15% beträgt.

12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß die hohe Wahrscheinlichkeit, von einem Adenokarzinom der Prostata betroffen zu sein, bei 80 bis 95% und vorzugsweise bei 84 bis 87%, und die geringe Wahrscheinlichkeit, von einer gutartigen Pathologie der Prostata betroffen zu sein, bei 5 bis 20% und vorzugsweise bei 13 bis 16% liegt, und daß die hohe Wahrscheinlichkeit, von einer gutartigen Pathologie der Prostata betroffen zu sein, bei 80 bis 95% und vorzugsweise bei 82 bis 85% liegt, und die geringe Wahrscheinlichkeit, von einem Adenokarzinom der Prostata betroffen zu sein, bei 5 bis 20% und vorzugsweise bei 15 bis 18% liegt.

13. Analyseverfahren für die Diagnose eines Adenokarzinoms oder einer gutartigen Pathologie der Prostata bei einem Patienten, bei dem die Kombination von zumindest zwei Verfahren verwendet wird, wobei jedes Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2 oder 3, oder auch 4 oder 5, oder auch 6 oder 7, oder auch 8 oder 9, oder auch 10 oder 11 oder 12 gebildet wird.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß es dann angewendet wird, wenn die Gesamt- PSA-Konzentration in dem Blut oder in dem Serum größer als 2 ng/ml ist.

15. Verfahren, in dem ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9 verwendet wird, dadurch gekennzeichnet, daß es besteht aus:

- dem Detektieren des Vorhandenseins und dem Quantifizieren des Niveaus von zwei der nachfolgenden Parameter: freies PSA in gespaltener Form, freies PSA in nicht-gespaltener Form, komplexiertes PSA und gesamtes PSA,

- dem Bestimmen des Wertes des Verhältnisses von:

-- gespaltenem freien PSA zu gesamtem freien PSA,

-- gespaltenem freien PSA zu nicht-gespaltenem freien PSA,

-- nicht-gespaltenem freien PSA zu gesamtem freien PSA,

-- gespaltenem freien PSA zu gesamten PSA, oder

-- gespaltenem freien PSA zu komplexiertem PSA,

und

- dem Vergleichen dieses Verhältnisses mit einem Referenzwert für die Diagnose eines Adenokarzinoms der Prostata bei einem männlichen menschlichen Patienten.

16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man zuvor die Proteine, die aus dem Blut, dem Serum, dem Urin oder der Samenflüssigkeit des Patienten stammen, migrieren läßt.

17. Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Migration mittels zweidimensionaler Elektrophorese durchgeführt wird.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß zuvor der prozentuale Anteil des gesamten PSA bestimmt wird.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 oder 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Detektion mittels Chemolumineszenz nach Darstellung mittels Westernblot durchgeführt wird.