DE69711188T2

DE69711188T2 - Dibenzodihydropyridincarbonsäureester und ihre anwendung in chemolumineszenz-untersuchungsverfahren

Info

Publication number: DE69711188T2
Application number: DE69711188T
Authority: DE
Inventors: Marjorie Jacquemijns; Gijsbert Zomer
Original assignee: Nederlanden Staat
Current assignee: Nederlanden Staat
Priority date: 1996-07-16
Filing date: 1997-07-15
Publication date: 2002-09-05
Anticipated expiration: 2017-07-16
Also published as: DE69711188D1; CA2261032A1; ES2171964T3; JP3338061B2; EP0915851A1; US6030803A; PT915851E; ATE214697T1; DK0915851T3; JPH11514006A; EP0915851B1; WO1998002421A1; CA2261032C

Description

Die Erfindung betrifft neue Dibenzodihydropyridincarbonsäureester, insbesondere Acridancarbonsäureester, und deren Verwendung als ein chemilumineszierendes Substrat bei Peroxidase-Bestimmungsverfahren.
Aromatische Acridanester sind seit mehr als 20 Jahren bekannt (McCapra, Acc. Chem. Res., Bd. 9 (1976), S. 201). Die Chemilumineszenz von Acridanestern ergibt sich in dipolaren aprotischen Lösungsmitteln nach Zugabe einer starken Base. Bezüglich des Mechanismus wird angegeben, dass eine Umsetzung des entsprechenden Carbonions, das durch Zugabe einer Base entsteht, mit Sauerstoff beteiligt ist. EP-A-625 510 beschreibt bestimmte aromatische Acridanester, insbesondere p-Hydroxyphenyl-10- methylacridan-9-carboxylat, die als Teil eines Signalreagenz für das Enzym Meerrettich-peroxidase (HRP) verwendet werden können. Das Signalreagenz enthielt auch ein Verstärkungsmittel, z. B. p-Iodphenol, ein chelatbildendes Mittel (EDTA), ein nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel und Wasserstoffperoxid. Gemäß EP-A-625 510 kann HRP mit großer Empfindlichkeit in einem optimalen pH-Bereich von 8-9 nachgewiesen werden. Stärker chemilumineszierende Polyfluorphenylester von Acridan-9- carbonsäure werden in WO-95/23971 beschrieben und Phenylthioester werden in WO-95/28495 beschrieben.
Das pH-Optimum für HRP liegt bei etwa 5. Somit ist es offensichtlich unbefriedigend, dass das pH-Optimum für den Chemilumineszenznachweis von HRP bei 8-9 liegt. Dieser pH-Wert stellt vermutlich einen Kompromiss zwischen dem günstigsten pH-Wert für das Enzym und den optimalen pH-Wert für die Chemilumineszenz des als Zwischenprodukt gebildeten Acridiniumesters, die bei basischen pH-Werten auftritt, dar (Akhavan- Tafti et al., Bioluminescence and Chemiluminescence Fundamentals and Applied Aspects, Proceedings of the Bth International Symposium on Bioluminescence and Chemiluminescence, Cambridge, September 1994, Herausgeber Campbell, Kricka, Stanley, John Wiley and Sons, (1994) S. 199).
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Enzymtests und von Reagenzien hierzu, mit denen eine höhere Empfindlichkeit als mit dem herkömmlichen Test und den herkömmlichen Reagenzien ermöglicht wird. Die vorliegende Erfindung beruht auf dem überraschenden Befund, dass bestimmte aliphatische Acridanester und Phenanthridanester bei Umsetzung mit Wasserstoffperoxid und bestimmten Verstärkungsmitteln zu einer sehr intensiven und anhaltenden Chemilumineszenz befähigt sind. Diese Umsetzung verläuft innerhalb eines breiten pH-Bereiches (optimaler pH-Bereich 6-8) und ohne die Notwendigkeit der Zugabe von chelatbildenden Mitteln (EDTA) oder oberflächenaktiven Mitteln. Außerdem liefern diese aliphatischen Ester eine sehr geringe Hintergrundlumineszenz, d. h. ohne Enzym.
Somit betrifft die Erfindung Dibenzodihydropyridincarbonsäureester der Formeln 1 oder 2
worin
R¹ substituiertes Alkyl oder Cyano bedeutet;
R² und R³ unabhängig voneinander Wasserstoff, Alkyl, substituiertes Alkyl, Aryl und substituiertes Aryl bedeuten;
R&sup4; unter Wasserstoff, Alkyl, substituiertem Alkyl, Aryl und substituiertem Aryl ausgewählt ist;
R&sup5; und R&sup6; unabhängig voneinander Alkyl, Alkoxy, Halogen, und andere Substituenten, die gegen eine Oxidation relativ widerstandsfähig sind, gemäß der nachstehenden Beschreibung bedeuten;
m und n ganze Zahlen von 0 bis 4 bedeuten; wobei, wenn m oder n mindestens 2 bedeuten, zwei Gruppen R&sup5; oder R&sup6; miteinander verbunden sein können; und
Z Sauerstoff oder Schwefel bedeutet;
wobei die Substituenten und Aryl der Definition in der nachstehenden Beschreibung und in den Ansprüchen entsprechen.
Bei den erfindungsgemäßen Dibenzodihydropyridincarbonsäureestern kann es sich um Acridan-9-carbonsäureester der Formel 1 oder um Phenanthridan-6-carbonsäureester der Formel 2 handeln.
Ein grundlegendes Merkmal der erfindungsgemäßen Verbindungen besteht darin, dass es sich beim α-Kohlenstoffatom der Esteralkylgruppe um ein aliphatisches Kohlenstoffatom handelt. Es kann mit verschiedenen aliphatischen oder anderen Gruppen substituiert sein, die in den vorstehenden Formeln 1 und 2 mit R¹, R², und R³ bezeichnet sind.
In den erfindungsgemäßen Verbindungen bedeutet "Alkyl" geradkettiges oder verzweigtes, gesättigtes oder ungesättigtes C&sub1;-C&sub2;&sub4;-Alkyl, vorzugsweise C&sub1;-C&sub1;&sub2;-Alkyl und insbesondere C&sub1;-C&sub4;-Alkyl, wie Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl und Decyl. "Substituiertes Alkyl" bedeutet Alkyl gemäß der vorstehenden Definition, das ein oder mehr Substituenten enthält, z. B. Halogen, Hydroxy, Alkoxy, Alkanoyl, Carboxyl, Alkoxycarbonyl, Alkanoyloxy, Aryl, Aryloxy, Aroyl, Aroyloxy, Cyano und Nitro und insbesondere Halogen, Hydroxy, Alkoxy und Aryl. Die Substituenten selbst können ebenfalls substituiert sein, z. B. mit Halogen, Alkyl oder Alkoxy. "Aryl" bedeutet Phenyl, Naphthyl, Furyl, Thienyl, Pyrrolyl, Imidazolyl, Thiazolyl, Oxazolyl, Pyridyl, Pyrimidyl und Chinolyl. "Substituiertes Aryl" bedeutet Aryl gemäß der vorstehenden Definition, das einen oder mehrere Substituenten gemäß den vorstehenden Angaben für substituiertes Alkyl enthält. Zu Beispielen hierfür gehören Chlorphenyl, Trifluormethylphenyl, Methoxyphenyl, Methylendioxyphenyl und Hydroxypyrridyl. Bei "Alkoxy" kann der Alkylteil der vorstehenden Definition entsprechen. Zu Beispielen hierfür gehören Methoxy, Ethoxy, tert.-Butoxy, 2-Chlorethoxy, 2-Methoxyethoxy, Hexafluorisopropoxy, Benzyloxy und 2-Phenylethoxy.
Unter Substituenten, die gegenüber einer Oxidation relativ beständig sind, sind Substituenten zu verstehen, die den enzymatischen Oxidationsvorgang nicht stören. Hierbei handelt es sich um Halogen, Alkyl, Halogenalkyl, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Alkoxy, Carboxyl, Alkoxycarbonyl, Alkanoyl, Alkanoyloxy, Cyano, Nitro, Carbamoyl, Acylamino, Sulfo, Phospho und Aryl gemäß der vorstehenden Definition.
Vorzugsweise handelt es sich bei mindestens einem der Reste R¹, R² und R³ um eine Gruppe, die elektronenziehende Substituenten enthält, wie Halogen, Nitro, Sulfo, Cyano, Acyl, Sulfonyl und Carboxyl. Eine geeignete Gruppe mit elektronenziehenden Substituenten ist Halogenalkyl, wie Mono-, Di- und Trichlormethyl, Mono-, Di- und Trifluormethyl, Tri- oder Pentafluorethyl, Heptafluorpropyl und höhere Homologe. Besonders bevorzugt werden Trifluormethylgruppen für R¹ und gegebenenfalls auch für R². R³ kann dann beispielsweise Wasserstoff, niederes Alkyl, Halogenalkyl, Phenyl oder Halogenphenyl bedeuten. R¹ kann auch Cyano bedeuten, wobei in diesem Fall R² beispielsweise Wasserstoff, Methyl, Phenyl oder Trifluormethyl und R³ beispielsweise Wasserstoff bedeuten können.
Die Art des durch R&sup4; repräsentierten Substituenten ist nicht sehr kritisch. Aus Zweckmäßigkeitsgründen kann es sich bei R&sup4; um niederes Alkyl, vorzugsweise um Methyl handeln, es kann sich aber auch beispielsweise um Wasserstoff, substituiertes Alkyl (Beispiele: Carboxymethyl, Hydroxyethyl und Benzyl), Phenyl oder substituiertes Phenyl handeln.
Die Substituenten R&sup5; und R&sup6; sind vorzugsweise in den m- und/oder p- Stellungen bezüglich des Ringstickstoffatoms gebunden, insbesondere in den p-Stellungen. Kombinationen von Substituenten R&sup5; oder R&sup6; (m oder n bedeuten eine Zahl mit einem Wert von 2 oder mehr), die aneinander gebunden sein können, umfassen C&sub1;-C&sub6;-Alkylen und andere zweiwertige Gruppen, die zusammen mit den Benzogruppen, an die sie gebunden sind, einen zusätzlichen Ring bilden, z. B. Cyclopenta ((R&sup5;)&sub2; = (CH&sub2;)&sub3;), Cyclohexa ((R&sup5;)&sub2; = (CH&sub2;)&sub4;), Furo ((R&sup5;)&sub2; = CH&sub2;-O-CH&sub2;), Dioxolo ((R&sup5;)&sub2; = O-CH&sub2;-O), Benzo ((R&sup5;)&sub2; = CH=CH-CH=CH), Pyrido ((R&sup5;)&sub2; = N=CH-CH=CH oder CH=N-CH=CH) und dergl. Bevorzugte Gruppen R&sup5; und/oder R&sup6; sind Chlor, Fluor, Brom, Methoxy und Methylendioxy. Die besonders bevorzugte Bedeutung von R&sup5; ist Chlor.
Die erfindungsgemäßen Dibenzodihydropyridincarbonsäureester lassen sich nach an sich bekannten Verfahren herstellen. Ein allgemeines Herstellungsschema für die Acridanester, das in den Beispielen näher erläutert wird, kann folgendermaßen ausgestaltet sein:
Ein in geeigneter Weise substituiertes Anilin (I) der Formel (R&sup5;)mC&sub6;H(5-m)NH&sub2; wird in das Acetanilid (II) umgewandelt, das dann mit einem geeignet substituierten Phenylbromid (III) der Formel (R&sup6;)nC&sub6;H(5-n)Br in Gegenwart von Kupferjodid unter Bildung des Diphenylamins (IV) der Formel (R&sup5;)mC&sub6;H(5-m)-NH-C&sub6;H(n-5)(R&sup6;)n umgesetzt wird. Diphenylamin (IV) wird durch Umsetzung mit Oxalsäurechlorid in Gegenwart einer Lewis-Säure in die Acridin-9-carbonsäure (V) umgewandelt. Nach der Veresterung mit dem entsprechenden Alkohol R¹R²R³COH oder Thiol R¹R²R³CSH und N-Alkylierung wird die 9-Alkoxycarbonyl- oder 9- Alkylthiocarbonylacridiniumverbindung der Formel 3 erhalten, die dann unter Bildung des gewünschten Acridanesters der Formel 1 reduziert werden kann.
Die Herstellung der Phenanthridanester verläuft auf analoge Weise, ausgehend von einem gegebenenfalls substituierten 2-Aminobiphenyl. Durch Acetylierung und Ringschluß erhält man (substituiertes) 5- Methylphenanthridin. Die 6-Carboxygruppe wird durch Umsetzung des (substituierten) 5-Methylphenanthridins mit Formaldehyd eingeführt, wonach man durch Oxidation (substituiertes) 6-Carboxy-5- methylphenanthridin erhält. Durch Veresterung mit dem entsprechenden Alkohol oder Thiol und anschließende N-Alkylierung erhält man die 6- Alkoxycarbonyl- oder 6-Alkylthiocarbonylphenanthridiniumverbindung der Formel 4.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Bestimmung einer Peroxidase, wobei ein Dibenzodihydropyridincarbonsäureester gemäß den vorstehenden Ausführungen als ein chemilumineszierendes Substrat verwendet wird. Das Verfahren kann zur Bestimmung des Peroxidase-Enzyms selbst oder zur Bestimmung eines mit der Peroxidase markierten Analyten herangezogen werden. Das Verfahren ist so empfindlich, dass Peroxidase- Konzentrationen von nur 10&supmin;²&sup0; Mol zuverlässig bestimmt werden können.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird der erfindungsgemäße Dibenzodihydropyridincarbonsäureester mit einer Probe, die die Peroxidase oder den mit der Peroxidase markierten Analyten enthält, und mit einem Peroxid und gegebenenfalls mit einem Verstärkungsmittel zur Erzeugung von Licht in Kontakt gebracht. Das Licht wird vermutlich durch einen angeregten Zustand des Dihydropyridons, das sich aus der Umsetzung mit Peroxid ergibt, erzeugt. Bei der bevorzugten Peroxidase handelt es sich um Meerrettich-peroxidase (HRP). Beim bevorzugten Peroxid handelt es sich um Wasserstoffperoxid. Zu weiteren geeigneten Peroxiden gehören Harnstoffperoxid, Perborate und dergl. Beim bevorzugten Verstärkungsmittel handelt es sich um p-Phenylphenol, wobei aber auch andere phenolische Verstärkungsmittel, wie p-Iodphenol, p- Thiazolylphenol, p-Hydroxyzimtsäure, weitere substituierte Phenole und gegebenenfalls substituierte Naphthole, Hydroxybenzothiazole, Hydroxybenzoxazole und Hydroxyfluorenone ebenfalls verwendet werden können. Der beim erfindungsgemäßen Verfahren anzuwendende pH-Wert kann innerhalb eines breiten Bereiches variieren, beispielsweise von 4-10. Der bevorzugte pH-Bereich beträgt 5,5-8 und insbesondere 6-7,5. Das Verfahren wird vorzugsweise in einem gepufferten wässrigen System durchgeführt. Der Dibenzodihydropyridincarbonsäureester kann in einer Konzentration von 10&supmin;&sup7; bis 10&supmin;&sup4; molar und das Verstärkungsmittel in einer ähnlichen oder in einer etwas höheren Konzentration (z. B. 10&supmin;&sup7; bis 10&supmin;³ molar) verwendet werden. Das Peroxid kann in einer Konzentration von beispielsweise 10&supmin;&sup5; bis 10&supmin;² zugesetzt werden. Das Enzym kann im Attomolbereich (10&supmin;¹&sup8; Mol) oder noch weniger vorhanden sein. Die Anwesenheit von oberflächenaktiven Mitteln, wie Poly-(ethylenoxiden), oder chelatbildenden Mitteln, wie EDTA, ist nicht erforderlich, so dass vorzugsweise darauf verzichtet wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch zur Bestimmung von Peroxiden, wie Wasserstoffperoxid, herangezogen werden, die unter der Einwirkung von Dehydrogenase- oder oxidase-Enzymen in Lösung entstehen, oder es kann zur Bestimmung von molekularem Sauerstoff in einer Lösung in einem aprotischen Lösungsmittel, wie Acetonitril, Nitromethan, Dimethylsulfoxid und dergl., verwendet werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann ferner zur Bestimmung von hydrolytischen Enzymen, wie Phosphatasen und Glycosidasen, herangezogen werden, indem man ein phosphoryliertes oder glycosyliertes Phenol verwendet, das nach hydrolytischer Spaltung der Phosphat- oder Glycosylgruppe als Verstärkungsmittel bei einer Peroxidase-Reaktion dient.
Die Erfindung betrifft ferner eine Testpackung zur Bestimmung der Peroxidase-Aktivität, die einen Dibenzodihydropyridincarbonsäureester gemäß den vorstehenden Ausführungen und gegebenenfalls ein Peroxid, ein phenolisches Verstärkungsmittel und/oder weitere Bestandteile zur Bestimmung des vorstehend beschriebenen Tests umfasst. Die Testpackung kann ferner einen Analyten, z. B. einen Antikörper, der mit einem Peroxidase-Enzym, wie HRP, markiert ist, enthalten. Bei Verwendung zum Peroxidnachweis kann die Testpackung auch eine Peroxidase als solche enthalten.
Die Erfindung betrifft ferner neue Dibenzopyridiniumverbindungen (Acridinium- und Phenanthridiniumverbindungen) der Formeln 3 oder 4
worin R¹ Halogenalkyl oder Cyano bedeutet und R² bis R&sup6; und Z die vorstehend für die Verbindungen 1 und 2 definierten Bedeutungen haben. Beim Gegenion X&supmin; kann es sich um beliebige geeignete, relativ inerte Ionen handeln, wie Halogenid, Sulfat, R&sup7;-Sulfonat, wobei R&sup7; beispielsweise Alkyl, Halogenalkyl oder Aryl bedeutet, Tetrafluorborat und dergl. Vorzugsweise bedeutet R¹ Trifluormethyl oder Cyano, R² Trifluormethyl und R³ Wasserstoff, Trifluormethyl, Phenyl oder substituiertes Phenyl. R&sup5; und/oder R&sup6; bedeuten vorzugsweise Halogen oder Methoxy. m und n haben vorzugsweise den Wert 0, 1 oder 2 und insbesondere hat mindestens einer dieser Indices den Wert 1.
Die Dihydropyridiniumsalze können als eine direkte Markierung zum Nachweis des Vorliegens von Analyten, wie Antikörpern, Antigenen, DNA- Sonden und anderen Substanzen von biologischem Interesse gemäß EP-A- 324 202, verwendet werden. Geeignete Verbindungen der Formeln 3 und 4 weisen Substituenten auf, die einen Rest enthalten, der zur chemischen Umsetzung mit (Bio)molekülen befähigt ist. Beispiele hierfür sind Carboxy-, Aldehyd-, Alkohol-, Amino- oder Thiolfunktionen, die in einem der Reste R¹ bis R&sup6; vorhanden sein können und insbesondere in R&sup4;, z. B. wenn R&sup4; Carboxymethyl bedeutet.

Beispiele

Herstellung von Acridanderivaten GZ-1/GZ-12

Die in der nachstehenden Tabelle I aufgeführten Verbindungen wurden hergestellt. Dabei wurde das folgende allgemeine Syntheseverfahren herangezogen:

Acetanilid (II):

Das spezielle aromatische Amin I (20 g), Essigsäureanhydrid (20 ml), Essigsäure (Eisessig, 20 ml) und Zinkpulver (0,1 g) wurden vermischt und unter Rückfluss erwärmt. Nach 30 Minuten wurde die Lösung in 500 ml Eiswasser gegossen. Der Niederschlag wurde abfiltriert und getrocknet. Man erhielt das Acetanilid.

Diphenylamin (IV):

Das Acetanilid II (13,5 g), das spezielle aromatische Bromid III (25 g), Kaliumcarbonat (13,2 g) und Kupferjodid (1,9 g) wurden über Nacht erwärmt (190ºC) und gerührt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurde Toluol zugegeben. Der Niederschlag wurde abfiltriert. Die Lösung wurde eingeengt und überschüssiges Bromid wurde durch Destillation unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde in Ethanol (200 ml) gelöst. Nach Zugabe von Kaliumhydroxyd (10,3 g) wurde das Gemisch über Nacht unter Rückfluss erwärmt. Nach Abdampfen des Ethanols wurde der Rückstand in Dichlormethan gelöst und mit Kochsalzlösung gewaschen. Die organische Phase wurde über MgSO&sub4; getrocknet und eingeengt. Man erhielt das rohe Diphenylamin. Tabelle I

Acridin-9-carbonsäure (GW):

Eine Lösung von Oxalsäurechlorid (5 g) in Dichlormethan wurde tropfenweise mit einer Lösung des Diphenylamins IV (5 g) versetzt und 30 Minuten unter Rückfluss erwärmt. Sodann wurde die Lösung eingeengt (50%) und portionsweise mit Aluminiumtrichlorid (8 g) versetzt. Anschließend wurde das Gemisch 45 Minuten unter Rückfluss erwärmt. Der nach dem Abdampfen des Lösungsmittels erhaltene Rückstand wurde mit Salzsäure in Eiswasser (1 molar) versetzt. Der rot gefärbte Niederschlag wurde abfiltriert. Sodann wurde der Niederschlag in Kaliumhydroxid (10% in Wasser) gelöst, über Nacht unter Rückfluss erwärmt und sodann in Salzsäure in Eiswasser (5 molar) gegossen. Die gelbe Acridin-9- carbonsäure (GW) wurde abfiltriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet.

Acridin-9-carbonsäureester (GX):

Die Acridin-9-carbonsäure GW (1 g) wurde mit Thionylchlorid (20 ml) vermischt und bis zur Bildung einer klaren Lösung unter Rückfluss erwärmt. Die Lösung wurde eingeengt und überschüssiges Thionylchlorid wurde zusammen mit Toluol abgedampft. Der erhaltene Rückstand wurde mit Pyridin (20 ml), Dimethylaminopyridin (1 g) und einem Überschuss des speziellen Alkohols (oder Thiols) R¹R²R³COH(-SH) versetzt. Das Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, in Salzsäure in Eiswasser (1 molar) gegossen und mit Dichlormethan extrahiert. Die organische Phase wurde mit Wasser gewaschen, über MgSO&sub4; getrocknet und eingeengt. Das rohe Produkt wurde durch Flash-Chromatographie (66% Hexane/Essigsäureethylester) gereinigt.

10-Methylacridinium-9-carbonsäureester-trifluormethansulfonat (GY):

Der Acridin-9-carbonsäureester GX (100 mg) wurde in Dichlormethan (5 ml) gelöst. Die Lösung wurde mit einem Überschuss an Methyltrlfluormethansulfonat versetzt. Das Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Nach Zugabe von Diethylether wurde der erhaltene Niederschlag abfiltriert, mit Diethylether gewaschen und getrocknet.

10-Methylacridan-9-carboxylat (GZ):

Das 10-Methylacridinium-9-carbonsäureester-trifluormethansulfonat GY (100 mg) wurde in Dichlormethan (100 ml) gelöst. Diese Lösung wurde mit Perchlorsäure (20 Tropfen) und Zinkpulver (6 g) versetzt. Das Gemisch wurde 3 Stunden in ein Ultraschallbad gestellt und filtriert. Die Lösung wurde mit Wasser (1x) und Salzsäure (2x, 0,1 molar) gewaschen, über MgSO&sub4; getrocknet und eingeengt.

Beispiel 1

Herstellung von GZ-1

Hexafluorisopropylacridin-9-carboxylat (GX-1)

¹H-NMR (Aceton-d&sub6;) δ 7,2 (m, 1H), 7,8-8,3 (m, 8H)

9-Hexafluorisopropoxycarbonyl-10-methylacridiniumtrifluormethansulfonat (GY-1)

¹H-NMR (Aceton-d&sub6;) δ 5,3 (s, 3H), 7,4 (m, 1H), 8,2-9,2 (m, 8H)
¹³C-NMR (Aceton-d&sub6;) δ 38,3, 41,4, 70,4, 120,5, 121,6, 124,2, 125,3, 127,8, 131,6, 141,2, 144,1, 146,4, 149,4, 163,4, 165,2

Hexafluorisopropyl-10-methylacridan-9-carboxylat (GZ-1)

¹H-NMR (Aceton-d&sub6;) δ 3,5 (s, 3H), 5,4 (s, 1H) 6,2 (m, 1H), 6,9-7,4 (m, 8H)

Beispiel 2

Herstellung von GZ-2

2,7-Dimethoxyacridin-9-carbonsäure (GW-2)

¹H-NMR (Aceton-d&sub6;) δ 4,0 (s, 6H), 7,1-8,2 (m, 6H)

Hexafluorisopropyl-2,7-dimethoxyacridin-9-carboxylat (GX-2)

¹H-NMR (CDCl&sub3;) δ 4,0 (s, 6H), 6,4 (m, 1H), 7,0-8,1 (m, 6H)

9-Hexafluorisopropoxycarbonyl-2,7-dimethoxy-10- methylacridiniumtrifluormethansulfonat (GY-2)

¹H-NMR (Aceton-d&sub6;) δ 4,1 (s, 6H), 5,2 (s, 3H), 7,2 (d, 2H-acr), 7,3 (m, 1H), 8,1 (dd, 2H-acr), 9,0 (d, 2H-acr)

Hexafluorisopropyl-2,7-dimethoxy-10-methylacridan-9-oarboxylat (GZ-2)

¹H-NMR (Aceton-d&sub6;) δ 3,4 (s, 3H), 3,7 (s, 6H), 5,3 (s, 1H), 6,2 (m, 1H), 6,8-7,0 (m, 6H)

Beispiel 3

Herstellung von GZ-3

2,3-Dimethoxyacridin-9-carbonsäure (GW-3)

¹H-NMR (DMSO-d&sub6;) δ 3,9 (s, 3H), 4,0 (s, 3H), 7,2-8,1 (m, 6H)

Hexafluorisopropyl-2,3-dimethoxyacridin-9-carboxylat (GX-3)

¹H-NMR (Aceton-d&sub6;) δ 4,0 (s, 3H), 4,1 (s, 3H), 7,1 (s, 1H-acr), 7,2 (m, 1H), 7,5-8,2 (m, 5H-acr)

9-Hexafluorisopropoxycarbonyl-2,3-dimethoxy-10- methylacridiniumtrifluormethansulfonat (GY-3)

¹H-NMR (Aceton-d&sub6;) δ 4,2 (s, 3H), 4,4 (s, 3H), 5,1 (s, 3H), 7,3 (s, 1H-acr), 7,4 (m, 1H), 8,1-8,9 (m, 5H-acr)

Hexafluorisopropyl-2,3-dimethoxy-10-methylacridan-9-carboxylat (GZ- 3)

¹H-NMR (Aceton-d&sub6;) δ 3,5 (s, 3H), 3,8 (s, 3H), 3,9 (s, 3H), 5,3 (s, 1H), 6,2 (m, 1H), 6,8-7,3 (m, 6H)

Beispiel 4

Herstellung von GZ-4

2-Fluoracridin-9-carbonsäure (GW-4)

¹H-NMR (CDCl&sub3;) δ 7,7-8,4 (m, 7H)

Hexafluorisopropyl-2-fluoracridin-9-carboxylat (GX-4)

¹H-NMR (CDCl&sub3;) δ 6,3 (m, 1H), 7,5-8,4 (m, 7H)
¹³C-NMR (CDCl&sub3;) δ 67,5 (m), 106,5 (d), 118,3, 122,4 (d), 122,5 (d), 122,9, 123,7, 128,9, 130,4 (d), 133,3 (d), 146,0, 148,0 (d), 159,4, 163,1, 164,2

9-Hexafluorisopropoxycarbonyl-2-fluor-10- methylacridiniumtrifluormethansulfonat (GY-4)

¹H-NMR (Aceton-d&sub6;) δ 5,3 (s, 3H), 7,3 (m, 1H), 7,9-9,3 (m, 7H)

Hexafluorisopropyl-2-fluor-10-methylacridan-9-carboxylat (GZ-9)

¹H-NMR (CDCl&sub3;) δ 3,4 (s, 3H), 5,1 (s, 1H), 5,5 (m, 1H), 6,9-7,4 (m, 7H)
¹³C-NMR (CDCl&sub3;) δ 33,4 (d), 48,8 (d), 76,3 (m), 112,9, 113,8 (d), 115,4 (2xd), 118,0, 119,9, 120,0, 121,0 (q), 122,2, 128,9 (d), 138,8, 142,2, 155,8, 159,3, 168,0

Beispiel 5

Herstellung von GZ-5

2-Chloracridin-9-carbonsäure (GW-5)

¹H-NMR (DMSO-d&sub6;) δ 7,7-8,3 (m, 7H)

Hexafluorisopropyl-2-chloracridin-9-carboxylat (GX-5)

¹H-NMR (CDCl&sub3;) δ 6,3 (m, 1H), 7,7-8,3 (m, 7H)
¹³C-NMR (CDCl&sub3;) δ 67,6 (m), 118,3, 122,6, 124,0, 128,9, 130,5, 130,8, 131,6, 131,9, 146,8, 148,6, 164,1

9-Hexafluorisopropoxycarbonyl-2-chlor-10- methylacridiniumtrifluormethansulfonat (GY-5)

¹H-NMR (Aceton-d&sub6;) δ 5,3 (s, 3H), 7,4 (m, 1H), 8,3-9,2 (m, 7H)

Hexafluorisopropyl-2-chlor-10-methylacridan-9-carboxylat (GZ-5)

¹H-NMR (Aceton-d&sub6;) δ 3,4 (s, 3H), 5,5 (s, 1H), 6,2 (m, 1H), 7,0-7,5 (m, 7H)

Beispiel 6

Herstellung von GZ-6

2,3,6,7-Tetramethoxyacridin-9-carbonsäure (GW-6)

¹H-NMR (DMSO-d&sub6;) δ 3,8 (s, 6H), 3,9 (s, 6H), 7,3 (s, 2H), 7,4 (s, 2H)

Hexafluorisopropyl-2,3,6,7-tetramethoxyacridin-9-carboxylat (GX-6)

¹H-NMR (CDCl&sub3;) δ 4,0 (s, 6H), 4,1 (s, 6H), 6,4 (m, 1H), 7,1 (s, 2H), 7,5 (s, 2H)

9-Hexafluorisopropoxycarbonyl-2,3,6,7-tetramethoxy-10- methylacridiniumtrifluormethansulfonat (GY-6)

¹H-NMR (Aceton-d&sub6;) δ 4,1 (s, 6H), 4,3 (s, 6H), 5,0 (s, 3H), 7,2 (s, 2H), 7,3 (m, 1H), 8,1 (s, 2H)

Beispiel 7

Herstellung von GZ-8

α,α-Bis-(trifluormethyl)-benzyl-2-chloracridin-9-carboxylat (GX-8)

¹H-NMR (CDCl&sub3;) δ 7,5-8,3 (m, 12H)

9-[α,α-Bis-(trifluormethyl)-benzyloxycarbonyl]-2-chlor-10- methylacridiniumtrifluormethansulfonat (GY-8)

¹H-NMR (Aceton-d&sub6;) δ 5,3 (s, 3H), 7,1-9,3 (m, 12H)

α,α-Bis-(trifluormethyl)-benzyl-2-chlor-10-methylacridan-9- carboxylat (GZ-8)

¹H-NMR (CDCl&sub3;) δ 3,39 (s, 3H), 5,07 (s, 1H), 6,8-7,4 (m, 12H)
¹³C-NMR (CDCl&sub3;) δ 165,6, 141,8, 140,9, 129,9, 129,2, 129,0, 128,7, 128,5, 128,2, 127,8, 126,8, 126,3, 126,0, 125,7, 123,5, 121,1, 120,6, 119,3, 118,5, 115,0, 114,5, 114,0, 112,9, 49,8, 33,2

Beispiel 8

Herstellung von GZ-9

α,α-Bis-(trifluormethyl)-benzyl-2,3-dimethoxyacridin-9-carboxylat (GX-9)

¹H-NMR (CDCl&sub3;) δ 4,0 (s, 3H), 4,1 (s, 3H), 7,5-8,2 (m, 11H)

9-[α,α-Bis-(trifluormethyl)-benzyloxycarbonyl]-2,3-dimethoxy-10- methylacridiniumtrifluormethansulfonat (GY-9)

¹H-NMR (Aceton-d&sub6;) δ 4,1 (s, 3H), 4,4 (s, 3H), 5,1 (s, 3H), 7,5-8,9 (m, 11H)

Beispiel 9

Herstellung von GZ-10

Hexafluorisopropyl-3-methozcyacridin-9-carboxylat (GX-10)

¹H-NMR (CDCl&sub3;) δ 4,0 (s, 3H), 6,3 (m, 1H), 7,3-8,2 (m, 7H)

9-Hexafluorisopropoxycarbonyl-3-methoxy-10- methylacridiniumtrifluormethansulfonat (GY-10)

¹H-NMR (Aceton-d&sub6;) δ 4,4 (s, 3H), 5,0 (s, 3H), 7,3 (m, 1H), 7,7-9,0 (m, 7H)

Beispiel 10

Herstellung von GZ-11

Perfluor-tert.-butyl-2-chloracridin-9-carboxylat (GX-11)

¹H-NMR (CDCl&sub3;) δ 7,6-7,9 (m, 5H), 8,2-8,3 (m, 2H)

9-Perfluor-tert.-butoxycarbonyl-2-chlor-10- methylacridiniumtrifluormethansulfonat (GY-11)

¹H-NMR (Aceton-d&sub6;) δ 5,3 (s, 3H), 8,2-9,3 (m, 7H)

Perfluor-tert.-butyl-2-chlor-10-methylacridan-9-carboxylat (GZ-11)

¹H-NMR (CDCl&sub3;) δ 3, 4 (s, 3H), 5,1 (s, 1H), 6,9-7,4 (m, 7H)
¹³C-NMR (CDCl&sub3;) δ 163,9, 141,7, 140,8, 129,3, 128,9, 128,5, 125,7, 121,4, 121,2, 119,7, 117,8, 117,1, 114,0, 113,0, 49,5, 33,1

Beispiel 11

Chemilumineszenzmessungen unter Verwendung von GZ-8

Chemilumineszenzmessungen (CL-Messungen) wurden in "Lumaküvetten" unter Verwendung eines Lumac Biocounter M2010-Geräts durchgeführt. Ein chemiluminogenes Signalreagenz bestand aus einer Lösung von Phenylphenol (9·10&supmin;&sup5; M), GZ-8 (4·10&supmin;&sup6; M) in PBS-Puffer (pH-Wert 7,2, 0,01 M). Diese Lösung wurde mit 250 Attomol HRP versetzt. Die Lumaküvette wurde in den Luminometer eingesetzt und die CL-Reaktion wurde durch Zugabe von Wasserstoffperoxid (4·10&supmin;&sup4; M) gestartet. Die CL-Reaktion wurde 22 Minuten lang verfolgt. Das erhaltene kinetische CL-Profil ist in Fig. 1 dargestellt.

Beispiel 12

HRP-Eichkurve unter Verwendung von GZ-8

In einem ähnlichen Versuch wie in Beispiel 12 wurden verschiedene Mengen an HRP (0-250 amol) mit Phenylphenol (9·10&supmin;&sup5; M), GZ-8 (4·10&supmin;&sup6; M) in PBS-Puffer (pH-Wert 7,2, 0,01 M) inkubiert. Sämtliche Röhrchen wurden mit Wasserstoffperoxid (4·10&supmin;&sup4; M) versetzt. Nach 16 Minuten wurde die CL gemessen. Die CL-Zählergebnisse, die bezüglich des Hintergrunds korrigiert waren, wurden gegen die Mengen an HRP aufgetragen, wodurch man eine HRP-Eichkurve erhielt. Ein Beispiel für eine derartige Eichkurve ist in Fig. 2 dargestellt.

Beispiel 13

Chemilumineszenzmessungen unter Verwendung von GZ-11

In einem ähnlichen Versuch wie in Beispiel 12 wurde eine kinetische Kurve für die CL-Reaktion von HRP (25 amol) mit GZ-11 aufgestellt. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 dargestellt. Bei einem Vergleich der Fig. 1 und 3 ist ersichtlich, dass die Verwendung von GZ-11 als Teil des CL- Reagenz einen wesentlich rascheren Anstieg des CL im zeitlichen Verlauf verursacht. Innerhalb von 2 Minuten erreicht die Kurve den halbmaximalen Wert. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 dargestellt.

Beispiel 14

HRP-Eichkurve unter Verwendung von GZ-11

Eine HRP-Eichkurve wurde nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 13 aufgestellt. Man erhielt die in Fig. 4 dargestellte Eichkurve.

Beispiel 15

Vergleich der Chemilumineszenz von GZ-8 und GZ-11 mit der Chemilumineszenz einer herkömmlichen Verbindung

Die Verbindung 5e von WO-95/23971 (2,3,6-Trifluorphenyl-10- methylacridan-9-carboxylat, auch als Lumigen PS-3 bezeichnet) wurde gemäß dem allgemeinen Herstellungsverfahren unter Verwendung von 9- Acridincarbonsäure und 2,3,6-Trifluorphenol als Ausgangsverbindungen hergestellt.
¹H-NMR (CDCl&sub3;): 3,44 (s, 3H), 5,29 (s, 1H), 6,76-7,4 (m, 10H)
Die CL-Messungen von GZ-8 und GZ-11 wurden wie in den Beispielen 12 bzw. 14 durchgeführt, wobei ferner 25 amol HRP für GZ-8 verwendet wurden.
Die CL-Messungen von PS-3 wurden unter Verwendung eines Signalreagenz durchgeführt, das PS-3 (0,05 mM), p-Iodphenol (1,1 mM), Tween 20 (0,5%), EDTA (1 mM) und H&sub2;O&sub2; (0,4 mM) in Tris-Puffer (0,1 M, pH 8) enthielt. Nach Zugabe von 25 amol HRP wurde die CL 17 Minuten lang aufgezeichnet. Die Ergebnisse finden sich in Fig. 5, worin S/B das Signal/Hintergrund-Verhältnis bezeichnet.

Claims

1. Dibenzodihydropyridincarbonsäureester der Formeln 1 oder 2

worin

R¹ C&sub1;-C&sub2;&sub4;-Alkyl, das durch Halogen, Nitro, Sulfo, Cyano, Acyl, Sulfonyl oder Carboxyl substiutiert ist, oder Cyano bedeutet;

R², R³ und R&sup4; unabhängig voneinander Wasserstoff, Alkyl, Aryl oder durch Halogen, Hydroxy, Alkoxy, Alkanoyl, Carboxyl, Alkoxycarbonyl, Alkanoyloxy, Aryl, Aryloxy, Aroyl, Aroyloxy, Cyano oder Nitro substituiertes Alkyl oder Aryl bedeuten;

R&sup5; und R&sup6; unabhängig voneinander, Halogen, Alkyl, Halogenalkyl, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Alkoxy, Carboxyl, Alkoxycarbonyl, Alkanoyl, Alkanoyloxy, Cyano, Nitro, Carbamoyl, Acylamino, Sulfo, Phospho oder Aryl bedeuten;

wobei Alkyl, Alkoxy und Alkanoyl 1 bis 24 Kohlenstoffatome aufweisen und unter "Aryl" Phenyl, Naphthyl, Furyl, Thienyl, Pyrrolyl, Imidazolyl, Thiazolyl, Oxazolyl, Pyridyl, Pyrimidyl oder Chinolyl zu verstehen ist;

m und n ganze Zahlen von 0 bis 4 bedeuten; wobei, wenn m oder n mindestens 2 bedeuten, zwei Gruppen R&sup5; oder R&sup6; miteinander verbunden sein können; und

Z Sauerstoff oder Schwefel bedeutet.

2. Dibenzodihydropyridincarbonsäureester nach Anspruch 2, wobei R¹ eine C&sub1;-C&sub1;&sub2;-Halogenalkylgruppe bedeutet.

3. Dibenzodihydropyridincarbonsäureester nach Anspruch 1, wobei R¹ eine Trifluormethylgruppe bedeutet.

4. Dibenzodihydropyridincarbonsäureester nach Anspruch 2 oder 3, wobei R² eine C&sub1;-C&sub1;&sub2;-Halogenalkylgruppe und insbesondere eine Trifluormethylgruppe bedeutet.

5. Dibenzodihydropyridincarbonsäureester nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei R³ Wasserstoff, C&sub1;-C&sub1;&sub2;-Alkyl oder Halogenalkyl, Phenyl oder Halogenphenyl bedeutet.

6. Dibenzodihydropyridincarbonsäureester nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei R&sup5; und R&sup6; unabhängig voneinander Methoxy, Chlor und/oder Fluor bedeuten und m und n unabhängig voneinander 0 oder 1 bedeuten.

7. Dibenzodihydropyridincarbonsäureester nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei Z Sauerstoff bedeutet.

8. Verfahren zur Bestimmung einer Peroxidase, wobei ein Dibenzodihydropyridincarbonsäureester nach einem der Ansprüche 1 bis 7 als ein chemilumineszierendes Substrat verwendet wird.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei ein pH-Wert von 6 bis 7,5 angewendet wird.

10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, wobei ein Phenol und insbesondere p-Phenylphenol als Verstärkungsmittel verwendet wird.

11. Testpackung zur Bestimmung der Peroxidase-Aktivität, enthaltend einen Dibenzodihydropyridincarbonsäureester nach einem der Ansprüche 1 bis 7 und gegebenenfalls ein Peroxid, ein phenolisches Verstärkungsmittel sowie gegebenenfalls eine Peroxidase.

12. Dibenzopyridiniumverbindung der Formeln 3 oder 4

worin

R¹ C&sub1;-C&sub2;&sub4;-Halogenalkyl oder Cyano bedeutet;

R&sup5; und R&sup6; unabhängig voneinander Halogen, C&sub1;-C&sub2;&sub4;-Alkyl, Halogenalkyl, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Alkoxy, Carboxyl, Alkoxycarbonyl, Alkanoyl, Alkanoyloxy, Cyano, Nitro, Carbamoyl, Acylamino, Sulfo, Phospho, Phenyl, Pyridyl oder ein anderes Aryl bedeuten;

m und n ganze Zahlen von 0 bis 4 bedeuten; wobei, wenn m oder n mindestens 2 bedeuten, zwei Gruppen R&sup5; und R&sup6; miteinander verbunden sein können;

X ein inertes Gegenion bedeutet; und

Z Sauerstoff oder Schwefel bedeutet.

13. Dibenzopyridiniumverbindung nach Anspruch 12, wobei in den Formeln 3 oder 4 mindestens einer der Indices m und n den Wert 1 oder 2 hat.