Gebiet der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren unter Verwendung thermostabiler Enzyme
aus Microtetraspora flexuosa-Stämmen und neuartige thermostabile Xylanase-Enzyme
von Microtetraspora flexuosa, die über einen breiten alkalischen Bereich und bei hohen
Temperaturen aktiv sind. Alkalisch thermostabile Xylanasen sind besonders in der
Zellstoff- und Papierindustrie geeignet.
Hintergrund der Erfindung
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Holz ist ein komplexes Material, das aus Cellulose, Hemicellulose und Lignin sowie
anderen kleineren Komponenten besteht. Lignin ist mit Cellulose und Hemicellulose
assoziiert und wahrscheinlich kovalent an Cellulose und Hemicellulose gebunden.
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Im Papierherstellungsverfahren wird Lignin im Allgemeinen aus dem Holzzellstoff
entfernt, da es eine bräunliche Farbe verleiht, die Festigkeit beeinträchtigt und dem fertigen
Produkt andere unerwünschte Eigenschaften verleiht. Die Entfernung von Lignin kann
auf unterschiedliche Weise erfolgen.
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Ein Großteil des Lignins wird anfangs durch chemischen Aufschluss (z. B. das
Kraftverfahren) aus Holzzellstoff entfernt. Im nachfolgenden Bleichungsprozess wird chemischer
Zellstoff routinemäßig mit Chlor und anderen delignifizierenden Chemikalien
umgesetzt, um Lignin weiter zu entfernen, und dann mit Bleichmitteln umgesetzt, um das
Lignin aus Zellstoff zu modifizieren, wodurch ein stabiler aufgehellter Zellstoff entsteht.
Die Behandlung mit Chlor ist jedoch vom Umweltstandpunkt aus ungünstig, da die
resultierenden Abwässer eine große Menge an toxischen Verbindungen enthalten (z. B.
chlorierte Phenole). Sorgen über die schädlichen Umweltauswirkungen von
Zellstoffbleichen mit chlorhaltigen Chemikalien führten die Industrie dazu, alternative
Bleichverfahren zu entwickeln.
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Versuche, Enzyme aus Pilzen Und Bakterien zu verwenden, um die Delignifizierung
und Aufheilung zu verstärken, während die Verwendung von Chlorchemikalien
reduziert oder eliminiert wurde, sind in der Literatur beschrieben. Es wurden jedoch sehr
wenige Enzymsysteme entdeckt, die selektiv auf Zellstoff einwirken, den
Cellulosegehalt von Zellstoff aber nicht negativ beeinflussen.
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Xylanasen sind Hemicellulase-Enzyme, welche die Hydrolyse von Xylan, einer
Hauptkomponente von Hartholz- und Weichholz-Hemicellulose, katalysieren und sind
üblicherweise mit den Cellulose- und Ligninkomponenten von Pflanzenzellwänden
assoziiert. Xylanase erwies sich als wertvolles Enzym zum Vorbleichen des Zellstoffs zwecks
Förderung der Delignifizierung von Holzzellstoff durch Erleichterung der Entfernung
von Lignin aus dem Zellstoff. Ein zweiter Mechanismus dafür umfasst das Solubilisieren
von Xylan in der Kochflüssigkeit während des Kraftaufschlusses. Im späteren Stufe des
Kochvorgangs wird Xylan auf den Zellstofffasern gefällt. Bei Verwendung von Xylanasen
zum Vorbleichen von Zellstoff macht die partielle Hydrolyse dieser gefällten
Xylanfraktionen die Zellstoffoberfläche für die Ligninentfernung durchlässiger. Deshalb führt
das Xylanase-Vorbleichen zum Einsatz geringerer Mengen an Bleichchemikalien als das
nicht-enzymatische Bleichen. Die meisten bereits in der Literatur beschriebenen
Enzympräparate sind in sauren pH-Bereichen aktiv, wobei optimale Temperaturen 50ºC
erreichen.
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Für industrielle Anwendungen, insbesondere in der Zellstoffbleichindustrie, wo die
Prozesse bei hohen Temperaturen und alkalischen pH-Werten ablaufen, wäre es sehr
vorteilhaft, wenn Xylanasen verfügbar wären, die bei hohen Temperaturen über einen
breiteren pH-Bereich als derzeit möglich, insbesondere pH 7-10, aktiv sind.
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Die aus Microtetraspora flexuosa gereinigten Xylanasen sind hervorragende Kandidaten
zum Vorbleichen von Zellstoff, da sie bei hohen Temperaturen und alkalischen pH-
Werten aktiv sind und auf die Hemicellulose/Cellulose-Matrix des Zellstoffs einwirken,
mit der das Lignin assoziiert oder verbunden ist, sodass nach der Enzymbehandlung das
Lignin durch ein geeignetes Extraktionsmittel freigesetzt und/oder freisetzbar gemacht
wird.
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In jüngster Zeit wurden verschiedene thermophile Xylanasen aus Pilz- und
Bakterienmikroorganismen identifiziert. Beispielsweise wurde eine thermophile Xylanase aus
Actinomadura isoliert (als Microtetraspora reklassifiziert, optimaler pH-Wert 6,0-7,0,
Temperaturbereich 70-80ºC; Holtz, C. et al., Antonie von Leewenhoek 59, 1-7 (1991)). EP-
A-0.473.545 offenbart, dass der Bakterienstamm Thermomonospora fusca thermostabile
Xylanasen produziert, die bei Temperaturen von 10-90ºC, vorzugsweise 50-80ºC, über
einen breiten pH-Bereich, d. h. etwa 5-10, vorzugsweise 6,6-9,5, aktiv sind. Außerdem
offenbart die WO 92/18612 ein Xylanaseenzym, das von der Gattung Dictyoglomus
abgeleitet ist und Aktivität über einen breiten pH-Bereich (5,0-9,0) und Thermostabilität
bei Temperaturen von 60-90ºC aufweist.
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Obwohl thermostabile Xylanasen, die im alkalischen Bereich aktiv sind, in der Literatur
beschrieben wurden, besteht nach wie vor die Notwendigkeit, neuartige Xylanasen zu
identifizieren, die in Anwendungen wirksamer sind, die das Delignifizieren und
Aufhellen von Zellstoff betreffen (wirksamer als derzeit erhältliche herkömmliche Bleichmittel
und Xylanasen). Außerdem war zum Zeitpunkt der durch die Anmelder gemachten
Erfindung nicht bekannt, dass viele Xylanasen aus Microtetraspora flexuosa optimale
Xylanase-Aktivität im alkalischen Bereich aufweisen.
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EP-A-0.188.050 offenbart einen aus drei Komponenten bestehenden Xylanasekomplex.
Der pH-Bereich, in dem der Komplex funktioniert, reicht von 3 bis 6, das pH-Optimum
liegt bei pH 5. Die optimale Temperatur des Komplexes liegt bei 80ºC.
Zusammenfassung der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung bietet drei alkalische thermostabile Xylanasen aus
Mikroorganismen, die hohen Temperaturen und alkalischen Bedingungen standhalten können
(hierin als Xylanasen 3 bis 5 bezeichnet). Dies ist in Zellstoffbleichungs-Anwendungen
von besonderer Relevanz. Ferner stellte sich heraus, dass Voll-Kulturlösungs-Überstand
von Microtetraspora flexuosa-Mikroorganismen thermotolerante und basen-tolerante
Eigenschaften besitzen, welche diese Xylanase-Gemische zu hervorragenden Kandidaten
für Zellstoffbleichungs-Anwendungen machen. Diese neuartigen Xylanasen kommen
auch in anderen Bereichen in Frage, z. B. in der Tierfutter- und Treibstoffindustrie.
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Gemäß einem Aspekt der Erfindung sind Xylanaseenzyme geoffenbart, die aus
Microtetraspora flexuosa isolierbar sind und die in den Ansprüchen 1 bis 3 dargelegten
Eigenschaften besitzen.
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Insgesamt fünf Xylanasen wurden in diesem Mikroorganismus festgestellt, d. h. Xylanase
1 bis Xylanase 5, und bis zur Homogenität gereinigt, gemessen anhand von
silberfärbenden isoelektrischen Fokussiergelen. Die Xylanasen wurden durch eine Kombination
von Ionenaustausch-Chromatographie und Hydrophob-Chromatographie gereinigt. Jede
gereinigte Xylanase ist dadurch gekennzeichnet, über einen breiten pH-Bereich
thermostabil zu sein. Genauer gesagt behält jede Xylanase mehr als 80% Aktivität im
pH-Bereich von 6-9 bei.
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Die Xylanasen können wie folgt näher charakterisiert werden:
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Xylanase 1 besitzt eine scheinbare Molekülmasse von etwa 33.100 Dalton, einen pl von
etwa 8,5, ein pH-Optimum von etwa 7,0-7,5 und weist optimale Temperturaktivität bei
etwa 70ºC auf.
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Xylanase 2 besitzt eine scheinbare Molekülmasse von etwa 13.300 Dalton, einen pl
von etwa 7,5, ein pH-Optimum von etwa 7,0-7,5 und weist ihr Aktivitätsoptimum bei
einer Temperatur von etwa 65ºC auf.
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Xylanase 3 besitzt eine scheinbare Molekülmasse von etwa 31.000 Dalton, einen pl von
etwa 6,2, ein pH-Optimum von etwa 7,5 und weist ihr Aktivitätsoptimum bei einer
Temperatur von etwa 65ºC auf.
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Xylanase 4 besitzt eine scheinbare Molekülmasse von etwa 30.000 Dalton, einen pl von
etwa 5,8, ein pH-Optimum von etwa 7.3 und weist ihr Aktivitätsoptimum bei einer
Temperatur von etwa 65ºC auf.
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Xylanase 5 besitzt eine scheinbare Molekülmasse von etwa 35.0000 Dalton, einen pl
von etwa 5,3, ein pH-Optimum von etwa 7,5 und weist bei einer Temperatur von etwa
70ºC ihr Aktivitätsoptimum auf.
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Die oben beschriebenen Microtetraspora flexuosa können selektiv für eine Vielzahl an
Zellstoffen bei höheren Temperaturen und alkalischen Bedingungen verwendet werden,
wodurch die Delignifizierung gefördert, der Ligninanteil reduziert, der Aufhellungseffekt
verstärkt und der Celluloseanteil des Zellstoffs nicht verändert wird. Gemäß dem zweiten
Aspekt der Erfindung werden ein oder mehrere der in Ansprüchen 1 bis 3 dargelegten
Xylanaseenzyme dazu verwendet, chemischen Zellstoff nach Aufschluss oder
Sauerstoffdelignifizierung zu behandeln, um die Aufhellung zu verstärken und/oder die
Delignifizierung des behandelten Zellstoffs zu verbessern.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
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Fig. 1 zeigt das Aktivitätsprofil der fünf gereinigten Xylanasen aus Microtetraspora
flexuosa.
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Fig. 2 zeigt das Aktivitäts/Temperatur-Profil der fünf gereinigten Xylanasen aus
Microtetraspora flexuosa.
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Fig. 3 zeigt das Temperaturstabilitätsprofil der fünf gereinigten Xylanasen aus
Microtetraspora flexuosa.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
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Wie oben erwähnt, betrifft die Erfindung allgemein Xylanasen, die aus dem Stamm
Microtetraspora flexuosa isoliert wurden, sowie Verfahren zur Verwendung dieser
neuartigen Xylanasen. Bei Verwendung bei den richtigen pH-Werten, Temperaturen und
Dosierungsbedingungen sind diese einzigartigen Xylanasen aus Microtetraspora flexuosa
besonders wirksam, die Helligkeit zu erhöhen und Zellstoff zu delignifizieren, ohne die
Qualität des Zellstoffs zu beeinträchtigen. Diese neuartigen Xylanasen sind auch
hervorragende Kandidaten als Tierfutter und Additive zu landwirtschaftlichem Abfall zur
Herstellung von Alkoholtreibstoffen.
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Vor einer ausführlichen Beschreibung der Erfindung werden die folgenden Ausdrücke
definiert.
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Der Ausdruck "Xylanasezahl" bezieht sich auf eines der fünf gereinigten
Xylanase-Enzyme, die aus Microtetraspora spp-Kulturlösung isoliert wurden. Die jeder der fünf
Xylanasen zugewiesenen Zahlen entsprechen den isoelektrischen Fokussierpunkten
(pl-Werten) jeder Xylanase, wobei die niedrigste Zahl (1) den am stärksten alkalischen pl-Wert
und die höchste Zahl (5) den am schwächsten alkalischen pl-Wert darstellt.
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Der Ausdruck "Vollüberstands-Xylanasen" bezieht sich auf die Kulturlösung von
Microtetraspora ssp., worin die Zellen bereits durch Zentrifugation entfernt wurden. Der
vollständige Xylanase-Überstand enthält somit ein Gemisch der obigen Xylanasen 1 bis 5.
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Der Ausdruck "Bleichen" bezieht sich auf die Behandlung chemischer Zellstoffe,
umfassend das Delignifizieren und Aufhellen des Zellstoffs. Bei besonders geeigneten
Zellstof
fen sind etwa 90 bis 99% ihres Lignins entfernt; sie werden im Wesentlichen behandelt,
um restliches Lignin, z. B. chemisch modifiziertes Lignin, zu entfernen.
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Gemäß der Erfindung wurden fünf neuartige, in Kulturen von Microtetraspora flexuosa
produzierte Xylanasen bis zu scheinbarer Homogenität isoliert und biochemisch
charakterisiert. Die Xylanasen der Erfindung können aus allen auf dem Gebiet bekannten
Microtetraspora ssp. stammen. Vorzugsweise stammen die Xylanasen aus Microtetraspora
flexuosa. Ein bevorzugter Stamm ist ATCC 35864, der bei der American Type Culture
Collection, Bethesda, MD, USA, erhältlich ist. Die Isolierung der neuartigen Xylanasen
umfasst die Reinigung der extrazellulären Xylanasen durch eine Kombination von
Ionenaustausch-Chromatographie (IEC) und Hydrophob-Chromatographie (HIC) in einer
der beiden Reihenfolgen (je nach der zu reinigenden Xylanase). Fünf Xylanasen wurden
aus Microtetraspora isoliert und mit den Zahlen 1 bis 5 versehen, die dem
isoelektrischen Fokussierpunkt jeder Xylanase entsprechen, wobei Xylanase 1 die alkalischste
und Xylanase 5 die am wenigsten alkalische ist.
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Die beiden Reinigungsverfahren zum Isolieren und Charakterisieren der fünf chemisch
unterschiedlichen Xylanasen sind nachstehend dargestellt. In beiden Verfahren werden
Microtetraspora flexuosa-Zellen durch Zentrifugation entfernt und die Kulturlösung
mittels Ultrafiltration aufkonzentriert. Im ersten Verfahren werden Xylanase 1 (pl 8,5),
Xylanase 2 (pl 7,5) und Xylanase 4 (pl 5,8) aufgetrennt und gereinigt. Das zellfreie
Vollkulturlösungs-Präparat wird auf eine Anionenaustauschsäule aufgebracht, gewaschen
und mit einem steigenden Salzgradienten (NaCl) eluiert. Nach dem Abnehmen der
Fraktionen wird Xylanase-Aktivität mittels eines mit Remazol Brilliantblau gefärbten
Brichwood-Xylanassay (RBB-Xylanassay) gemessen. Xylanase 1 und Xylanase 2 eluieren im
Säulendurchschlag. Der Ausflussdurchschlag wird gesammelt und erneut auf eine
Hydrophob-Chromatographie-Säule (Phenylsepharose) aufgebracht. Xylanase 1 und
Xylanase 2 trennen sich voneinander auf, indem die Säule mit steigenden Konzentrationen von
Ethylenglykol eluiert wird. Xylanase 4 bindet sich an die Anionenaustauschsäule und
eluiert im Salzgradienten mit den anderen gebundenen Xylanasen (Xylanasen 3 und 5).
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Xylanase 4 wurde von den anderen Xylanasen mittels HIC getrennt (weitere
Informationen in Beispiel 4). Die gereinigten Xylanasen 1, 2 und 4 wurden durch isoelektrisches
Fokussieren und Massenspektrophotometrie (MS) oder
Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE) weiter analysiert.
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Im zweiten Verfahren wurde die oben beschriebene zellfreie Vollkulturlösung in einem
ersten Schritt HIC unterzogen, um Xylanase 3 (pl 6,2) und Xylanase 5 (pl 5,3) zu
reinigen. Beide Xylanasen co-eluieren bei der gleichen Konzentration von Ammoniumsulfat.
Um Xylanase 3 und Xylanase 5 voneinander zu trennen, wurde auf dem gesammelten
eluierten aktiven Enzymmaterial IEC durchgeführt. Xylanase 3 eluiert bei einer
niedrigeren Salzkonzentration aus einer Anionenaustauschsäule als Xylanase 5. Beide gereinigte
Xylanasen wurden durch isoelektrisches Fokussieren und MS oder SDS-PAGE näher
charakterisiert.
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Alle Xylanasen wurden anhand ihrer typischen biochemischen Eigenschaften, z. B.
Molekulargewicht, pl, optimaler Temperatur und pH-Wert, Hydrophobie und
Temperaturstabilität voneinander unterschieden. Alle fünf Xylanasen können hohen Temperaturen
(von 70ºC bis 90ºC) und alkalischen Bedingungen (von etwa pH 7,0 bis 10,0)
standhalten. Die fünf gereinigten Xylanasen besitzen eine Halbwertszeit bei 80ºC von 35 bis
110 Minuten (Fig. 3). Eine weitere Charakterisierung jeder der fünf bis zur Homogenität
gereinigten Xylanasen ist in Beispiel 5 beschrieben.
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In einer weiteren Ausführungsform erfüllen die Xylanasen der Erfindung den Zweck, die
Delignifizierung und/oder Bleichung von Zellstoff zu fördern. Das Verfahren umfasst das
In-Kontakt-Bringen des Zellstoffs mit Vollüberstands-Xylanlase oder einer oder mehrerer
der oben beschriebenen gereinigten Xylanasen und und hängt von Faktoren wie z. B. pH-
Wert, Temperatur, Behandlungszeit, Enzymdosierung und Menge und Art des Zellstoffs
ab.
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Das obige Verfahren erfolgt vorzugsweise bei einer Temperatur und einem pH-Wert, die
bzw. der die enzymatische Aktivität erhöht. Temperaturen können von 50-90ºC
reichen, wobei 70-85ºC bevorzugt werden. Der bevorzugte pH-Wert für das Verfahren
reicht von etwa 6-10, vorzugsweise von etwa 7 bis etwa 9, am bevorzugten von über 7
bis etwa 9. Es ist charakteristisch für die gereinigten Xylanasen der Erfindung, dass sie
über einen breiten alkalischen pH-Bereich aktiv sind und hohe Aktivität im bevorzugten
pH-Bereich von etwa 7 bis etwa 9 aufweisen.
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Die bevorzugte Behandlungsdauer zur Verwendung der gereinigten Xylanasen der
Erfindung reicht von etwa 30 Minuten bis zu etwa 4 Stunden, was von Faktoren wie den
gewünschten Ergebnissen, der Quantität und Qualität des behandelten Zellstoffs, der
Enzymkonzentration und dergleichen abhängt.
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Eine geeignete Enzymdosierung beträgt etwa 0,10 bis 200 Einheiten/g trockener
Zellstoff, noch bevorzugter 0,50 bis 50 Einheiten/g. Die Xylanase-Aktivität der
Enzympräparate wird wie folgt bestimmt: 1,8 m) Xylanlösung (0,6% Sigma Nr. X-0627, gebildet in
0,05 m Natriumacetatpuffer und mit Essigsäure auf pH 5,3 eingestellt) werden 0,200 ml
geeigneterweise verdünntes Enzym im gleichen Puffer zugegeben. Die Lösung wird
exakt 30 min lang bei 40ºC inkubiert. Die Reaktion wir dann durch Zugabe von 3 ml
DNS-Reagens (3,5-Dinitrosalicylat 10 g/l,; Na-, K-Tartrat 300 g/l,) abgebrochen und die
Farbe durch fünfminütiges Aufkochen der Probe entwickelt. Das Absorptionsvermögen
wird dann bei einer Wellenlänge von 540 nm gemessen. Eine Enzymeinheit setzt unter
Assaybedingungen 1 uMol reduzierenden Zucker, berechnet als Xylose, pro Minute frei.
Die Aktivität wird anhand einer Enzymverdünnung berechnet, die 4 uMol
reduzierenden Zucker unter Assaybedingungen freisetzt.
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Die Erfindung kann dazu dienen, eine Vielzahl verarbeiteter Zellstoffe zu verbessern
oder ihre Verbesserung zu unterstützen, d. h. Zellstoffe, die bereits in unterschiedlicher
Weise behandelt wurden, um ihren Ligninanteil zu reduzieren, und erfindungsgemäß
behandelt werden, um die Ligninentfernung durch chemische Verfahren weiter zu
stei
gern. Die Erfindung kann zur Behandlung von Hartholz- und Weichholz-Kraftzellstoffen
herangezogen werden, um die Ligninentfernung zu fördern und die Zellstoffe
aufzuhellen. Die Erfindung eignet sich besonders für chemische Zellstoffe, d. h. jene, in denen
die Ligninkomponente chemisch durch verschiedene chemische Behandlungen
modifiziert wurde, z. B. durch Sulfatverfahren (Kraftverfahren) und Sauerstoffdelignifizierung,
vor allem für Kraftzellstoffe. In einem bevorzugten Verfahren werden die Enzyme der
Erfindung dem Zellstoff nach dem Kraftaufschluss oder Sauerstoffdelignifizierung, jedoch
vor der Bleichung zugeführt. Wenn sowohl Kraftaufschluss als auch
Sauerstoffdelignifizierung mit dem gleichen Zellstoff durchgeführt werden, wird das Enzym nach dem
Kraftaufschluss, vor der Sauerstoffdelignifizierung oder nach der
Sauerstoffdelignifizierung zugeführt. Die Erfindung eignet sich auch für ozongebleichte Zellstoffe.
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Der resultierende Zellstoff wird behandelt, um die freisetzbare Ligninkomponente
mittels eines geeigneten Extraktionsmittels zu entfernen. In einer weiteren Ausführungsform
kann mit den Enzymen der Erfindung behandelter Zellstoff anschließend mit
ligninabbauenden Chemikalien wie Chlor, Chlordioxid und -peroxid behandelt und mit einem
geeigneten Extraktionsmittel weiter extrahiert werden. In einer weiteren
Ausführungsform kann der enzymbehandelte Zellstoff mit einem geeigneten Extraktionsmittel
behandelt werden, gefolgt von Ligninabbau und einer Endbehandlung mit einem geeigneten
Extraktionsmittel. Solche Extraktionsmittel solubilisieren im Wesentlichen die betroffene
Ligninkomponente; zu geeigneten Extraktionsmitteln zählen u. a. Basen wie etwa
Alkalimetallhydroxide (E), EMF, Dioxan, Aceton und Alkohol. Hvdroxiclextraktionen können
mit Wasserstoffperoxid (Ep) oder Sauerstoff (Eo) kombiniert werden. Der resultierende
Zellstoff kann durch eine chemische Bleichsequenz wie etwa Chlordioxid (DED) oder
-peroxid (P-P) bis zur gewünschten Helligkeit weiter gebleicht werden, wodurch man im
Vergleich zu Zellstoff, der durch die gleiche Sequenz, jedoch ohne Anwendung der
Enzymbehandlung bis zur gleichen Helligkeit gebleicht wurde, deutlich an Chemikalien
einsparen kann. Die Reduktion von chlorhaltigen Chemikalien oder Peroxid wird auf
diese Weise erreicht. Mittels Durchführung der Erfindung mit den oben dargelegten
En
zymen kann man die gleiche Menge an Bleichungschemikalien dem Zellstoff zuführen
und im behandelten Zellstoff trotzdem höhere Helligkeit erzielen.
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In einer weiteren Ausführungsform bietet die Erfindung zusätzliche Anwendungen der
oben beschriebenen gereinigten Enzyme oder von vollständigem Xylanase-Überstand
von Microtetraspora ssp. für eine Vielzahl gewerblicher Anwendungen. Genauer gesagt
können die gereinigten Xylanasen oder der von Microtetraspora ssp. produzierte und
oben beschriebene vollständige Xylanase-Überstand dazu dienen, (1)
landwirtschaftlichen Abfall zur Produktion von Alkoholtreibstoffen und anderen wichtigen
Industriechemikalien enzymatisch abzubauen oder (2) Tierfutter oder Futterkomponenten
enzymatisch zu modifizieren oder Tierfuttermitteln zugegeben zu werden, um die
Hemicellulose-Fraktion in vivo abzubauen.
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Um die Erfindung und ihre Vorteile näher zu beschreiben, werden die folgenden
konkreten Beispiele gegeben, welche die Erfindung lediglich veranschaulichen und nicht
einschränken sollen.
Beispiel 1
Enzymbehandlung von sauerstoffdelignifiziertem Weichholz-Kraftzellstoff
vor D-E-D-Bleichung
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Sauerstoffdelignifizierter Weichholz-Kraftzellstoff (Kappa-Zahl: 16,4) wurde unter den
folgenden Bedingungen mit Vollüberstands-Xylanasen aus Microtetraspora flexuosa
behandelt:
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Enzymdosierung 5 DNS U/g Zellstoff (d.s.)
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pH 7,5, 8,9 oder 10
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Temperatur 70ºC, 80ºC oder 90ºC
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Reaktionszeit 2 Stunden
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Zellstoffkonsistenz 10%
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Vor der Zugabe der Enzymlösung in das Zellstoffgemisch wurde der pH-Wert des
Zellstoffs mit Schwefelsäure auf den gewünschten Wert eingestellt und das Zellstoffgemisch
in einem Mikrowellenofen vorgeheizt, um die erforderliche Reaktionstemperatur zu
erreichen. Nach der pH-Einstellung und dem Vorheizen des Zellstoffgemisches wurde das
Enzym gründlich in das Zellstoffgemisch eingemischt und 2 Stunden lang auf der
gewünschten Temperatur im Wasserbad gehalten.
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Nach der Enzymbehandlung wurde das Zellstoffgemisch in einem Büchnertrichter
filtriert und der Zellstoff mit Wasser gewaschen.
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Die Bezugszellstoffe wurden in jeder oben beschriebenen
pH-Wert/Temperatur-Kombination ohne Zugabe von Enzym behandelt.
Chemische Bleichung
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Nach der Enzym- oder Bezugsbehandlung wurden die Zellstoffproben unter Anwendung
der Bleichungssequenz D-E-D chemisch gebleicht. In beiden D-Stadien (Chlordioxid)
wurde 100% Chlordioxid verwendet.
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Die Reaktionsbedingungen in der chemischen Bleichung waren wie folgt:
Tabelle 1
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Nach der chemischen Bleichung wurden die Zellstoffproben bei Raumtemperatur mit
wässrigem SO&sub2; auf einen pH-Wert von 3,5 angesäuert.
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Die gebleichten Zellstoffe wurden gemäß SCAN-C11:75 hinsichtlich Helligkeit (ISO)
analysiert. Die Delignifizierung wurde als Veränderung der Kappa-Zahl nach der Stufe
der Laugenextraktion gemessen. Eine niedrigere Kappa-Zahl ist wünschenswert, da sie
anzeigt, dass eine geringere Ligninmenge im Zellstoff vorhanden ist.
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Die Kappa-Zahl ist das Volumen (in ml) von 0,1 N Kaliumpermanganatlösung, das 1 g
feuchtigkeitsfreier Zellstoff unter den in diesem Beispiel angeführten Bedingungen
verbraucht. Die Ergebnisse sind auf 50º10 Verbrauch des zugegebenen Permanganats
korrigiert. Das folgende Standardverfahren wurde angewandt: TAPPI-Testverfahren (Tappi,
Atlanta, GA, USA), Bd. 1, 1988 "Kappa number of pulp - T236 cm85"). Die Ergebnisse
sind aus Tabelle 2 ersichtlich.
Tabelle 2
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Die in obiger Tabelle 2 gezeigten Ergebnisse deuten an, dass bei einem Bezugswert der
Zellstoffhelligkeit von 74,4% eine 4,9%ige Zunahme der Endhelligkeit des Zellstoffs
durch Enzymbehandlung bei pH 7,5 und einer Temperatur von 70ºC vor der
chemischen Bleichung erzielt wurde.
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Außerdem führen bei hohen Temperaturen wie 80ºC uncl einem alkalischen pH-Wert
von 7,5 die sauerstoffdelignifizierten Weichholz-Zellstoffproben, die mit
Vollüberstands-Xylanasen aus Microtetraspora flexuosa behandelt wurden, noch immer zu einer
deutlichen Zunahme der Zellstoff-Endhelligkeit gegenüber (cm Bezugszellstoff. Selbst
bei extremen Temperaturen (90ºC) und alkalischen Bedingungen (pH 7,5) bleiben
Voll
überstands-Xylanasen aktiv, wobei eine 0,4%ige Zunahme der ISO-Einheiten im
behandelten Zellstoff im Vergleich zum Bezugszellstoff festgestellt wurde.
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Unter stark alkalischen Bedingungen, d. h. pH 9,0, und bei 70ºC wurde eine deutliche
Aufhellung des Zellstoffs gegenüber dem Bezugszellstoff erzielt. Unter extremen
alkalischen Bedingungen, d. h. pH 10 und 70ºC, sind die Vollüberstands-Xylanasen noch
immer aktiv, wobei man im Zellstoff im Vergleich zum Bezugszellstoff eine Zunahme von
0,9% an ISO-Einheiten feststellte.
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Wie man anhand der Kappa-Zahlen erkennt, kann die Delignifizierung in der
Extraktionsstufe selbst unter alkalischen pH-Bedingungen und hohen Temperaturen durch
Enzymbehandlung deutlich gesteigert werden.
Beispiel 2
Enzymbehandlung von sauerstoffdelignifiziertem Weichholz-Kraftzellstoff
vor der Peroxidbleichung
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Sauerstoffdelignifizierter Weichholz-Kraftzellstoff (Kappa-Zahl 15,7) wurde mit
Vollüberstands-Xylanaseenzym aus Microtetraspora flexuosa Unter den folgenden Bedingungen
behandelt:
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Enzymdosierung 10 DNS U/g Zellstoff (d.s.)
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pH 7
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Temperatur 50ºC, 60ºC, 70ºC oder 80ºC
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Reaktionszeit 2 Stunden
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Zellstoffkonsistenz 10%
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Vor der Zugabe der Enzymlösung zum Zellstoffgemisch wurde der pH-Wert des
Zellstoffs mit Schwefelsäure auf den gewünschten Wert eingestellt und das Zellstoffgemisch
in einem Mikrowellenofen vorgeheizt, um die erforderliche Reaktionstemperatur zu
er
reichen. Nach der pH-Einstellung und Vorheizen des Zellstoffgemischs wurde das
Enzym gründlich in das Zellstoffgemisch eingemischt und 2 Stunden in einem Wasserbad
auf der gewünschten Temperatur gehalten.
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Nach der Enzymbehandlung wurde das Zellstoffgemisch mittels Büchnertrichter filtriert
und der Zellstoff mit Wasser gewaschen. Die Bezugszellstoffe wurden in jeder oben
beschriebenen pH/Temperatur-Kombination ohne Zusatz von Enzym behandelt.
Chemische Bleichung
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Nach der Enzym- oder Bezugsbehandlung wurden die Zellstoffproben mit EDTA
behandelt, um Metallionen, die bei der Peroxidbleichung von Zellstoff schädlich sind, zu
chelieren und zu entfernen.
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Die Reaktionsbedingungen bei der Chelatbildungsstufe waren wie folgt:
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EDTA 0,2% Zellstoff (d.s.)
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Temperatur 85ºC
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pH 4
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Zellstoffkonsistenz 3%
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Nach der Chelatbildungsstufe wurden die Zellstoffe mittels der Sequenz P-P chemisch
gebleicht. Die bei der chemischen Bleichung herrschenden Reaktionsbedingungen sind
aus der folgenden Tabelle ersichtlich.
Tabelle 3
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Nach der chemischen Bleichung wurden die Zellstoffproben bei Raumtemperatur mit
wässrigem SO&sub2; auf einen pH-Wert von 3,5 angesäuert.
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Die gebleichten Zellstoffe wurden gemäß SCAN-C11:75 auf Helligkeit (ISO) analysiert.
Die Delignifizierung wurde als Änderung der Kappa-Zahl nach Stufe P2 gemessen. Die
Ergebnisse sind in Tabelle 4 veranschaulicht.
Tabelle 4
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Die Tabelle zeigt, dass im Vergleich zu Bezugszellstoff eine deutliche Zunahme der
endgültigen Zellstoffhelligkeit nach Peroxidbleichung durch Behandeln des Zellstoffs
mit Vollüberstands-Xylanasen aus Microtetraspora flexuosa bei 70ºC und pH 7 vor der
Peroxidbehandlung erzielt wird. Bei hohen Temperaturen von 80ºC bleiben die
Vollüberstands-Xylanasen aktiv, wobei man im behandelten Zellstoff im Vergleich zum
Bezugszellstoff eine 0,4%ige Zunahme an ISO-Einheiten feststellte.
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Gemäß den Kappa-Zahlen wird die Delignifizierung durch die Enzymbehandlung
erheblich verbessert.
Beispiel 3
Enzymbehandlung von mit Sauerstoff delignifiziertem Hartholz-Kraftzellstoff
vor D-E-D-Bleichung
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Sauerstoffdelignifizierter Hartholz-Kraftzellstoff (Kappa-Zahl 1 0,9) wurde mit gereinigter
Xylanase 1 oder Xylanase 2 aus Microtetraspora flexuosa unter den folgenden
Bedingungen behandelt:
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Enzymdosierung 3 DNS U/g Zellstoff (d.s.)
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pH 5, 7 oder 8
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Temperatur 70ºC oder 90%
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Reaktionszeit 2 Stunden
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Zellstoffkonsistenz 10%
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Vor der Zugabe der Enzymlösung Zum Zellstoffgemisch wurde der pH-Wert des
Zellstoffs mit Schwefelsäure auf den gewünschten Wert eingestellt und das Zellstoffgemisch
in einem Mikrowellenofen vorgeheizt, um die erforderliche Reaktionstemperatur zu
erreichen. Nach der pH-Einstellung und Vorheizen des Zellstoffgemisches wurde das
Enzym gründlich in das Zellstoffgemisch eingemischt und in einem Wasserbad 2 Stunden
lang auf der gewünschten Temperatur gehalten.
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Nach der Enzymbehandlung wurde das Zellstoffgemisch in einem Büchner-Trichter
filtriert und der Zellstoff mit Wasser gewaschen. Die Bezugszellstoffe wurden in jeder der
oben beschriebenen pH-Wert/Temperatur-Kombinationen ohne Zusatz von Enzym
behandelt.
Chemisches Bleichen
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Nach der Enzym- oder Bezugsbehandlung wurden die Zellstoffproben unter
Anwendung der Bleichreihenfolge D-E-D chemisch gebleicht. In beiden D-Stufen (Chlordioxid)
wurde 10%iges Chlordioxid verwendet.
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Die beim chemischen Bleichen herrschenden Reaktionsbedingungen waren wie folgt:
Tabelle 5
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Nach dem chemischen Bleichen wurden die Zellstoffproben mit wässrigem SO&sub2; bei
Raumtemperatur auf einen pH-Wert von 3,5 angesäuert.
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Die gebleichten Zellstoffe wurden gemäß SCAN-C11:75 hinsichtlich Helligkeit (ISO)
analysiert. Die Delignifizierung wurde als Änderung der Kappa-Zahl nach Stufe E
gemessen. Die Ergebnisse sind aus Tabelle 6 ersichtlich.
Tabelle 6
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Die Ergebnisse von Tabelle 6 zeigen die deutliche Zunahme der endgültigen
Zellstoffhelligkeit nach D-E-D-Bleichung aufgrund der Behandlung des Zellstoffs mit der
gereinigten Xylanase 1 oder Xylanase 2 aus Microtetraspora flexuosa bei einer Temperatur
von 70ºC und einem pH-Wert von 7 vor dem chemischen Bleichen. Selbst bei hohen
Temperaturen von 90ºC und alkalischem pH-Wert (pH 80) bleibt Xylanase 2 mit einer
0,3% gen ISO-Zunahme im Vergleich zum Bezugszellstoff aktiv.
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Unter Reaktionsbedingungen (pH 7/70ºC) wird die Delignifizierung in Stute E durch
enzymatische Behandlung deutlich gesteigert. Selbst unter extremen Bedingungen von
PH 8/90ºC kann durch Enzymbehandlung eine Verringerung der Kappa-Zahl nach
Stufe E erzielt werden.
Beispiel 4
Reinigung von fünf von Microtetraspora flexuosa produzierten Xylanasen
Xylanase-Assays
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Die Gegenwart von Xylanase wurde unter Verwendung von Brilliantblau-gefärbtem
Birkenholz-Xylan- (RBB-Xylan-) Substrat bestimmt (Megazyme aus Australien ist die
Bezugsquelle des Substrats). 200 ul-Proben werden mit 250 ul Substratlösung (2% [w/v]
RBB-Xylan in 50 mM Natriumcitrat, pH 6,5) vermischt und 10 min lang bei 37ºC
inkubiert. Nicht gespaltenes Xylan wird durch Zugabe von 1 ml 95%igem Ethanol gefällt
und durch Zentrifugation entfernt. In Lösung bleibender freigesetzter Farbstoff wird
durch Spektralphotometrie (OD&sub5;&sub9;&sub0;) gegenüber Ethanol als Blindprobe quantifiziert und
ist proportional zur Xylanase-Aktivität. Die Aktivität kann mittels einer Standardkurve
quantifiziert werden und wird als XAU/ml angegeben (Xylanase-Aktivitätseinheiten pro
ml).
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Ein Gelüberlagerungsverfahren zum Nachweis der Gegenwart mehrerer Xylanasen und
zur Bestimmung ihrer isoelektrischen Punkte (pl) wurde auch unter Verwendung von
RBB-Xylansubstrat entwickelt. Isoelektrische Fokussiergele (IEF-Gele; pH-Gradient 3-9)
werden mit einer geschmolzenen Agarose/Substrat-Suspension (4% [w/v] Agarose, 7
mg/ml RBB-Xylan, 0,5% [v/v] Glycerin in 50 mM Natriumcitrat, pH 6,5) überlagert und bei
37ºC inkubiert. Nach etwa 1 Stunde wird die Xylanase-Aktivität in Form von geklärten
Zonen offensichtlich. Die Gele werden vollständig getrocknet und können gelagert
werden. Der Xylanase-pl wird durch Vergleich mit identisch laufen gelassenen IEF-Gelen,
die silbergefärbte pl-Standards enthalten, bestimmt.
Probe
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Fermentationskulturlösung von Microtetraspora flexuosa (ATCC 35864) (etwa 14
XAU/ml) wurde mittels Ultrafiltration auf das Fünffache aufkonzentriert (Amicron Rührzelle,
350 ml, PM-10-Membran). Alle Proben wurden steril filtriert. Die Proteinkonzentration
betrug 12,5 mg/ml und wurde durch ein BCA-Verfahren (Pierce) ermittelt. Die
Gelüberlagerungsanalyse zeigte die Gegenwart von fünf Xylanasen pl 8,5, 7,5, 6,2, 5,8 und
5,3). Diese fünf Xylanasen werden in der gesamten Beschreibung als Xylanasen 1-5
bezeichnet.
Reinigungsverfahren
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Eine Kombination von Ionenaustausch-Chromatographie (IEC) und
Hydrophob-Chromatographie (IEC bzw. HIC) dienten dazu, alle fünf Xylanasen wie folgt zu reinigen:
Reinigung der Xylanasen 1 und 2
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In einem ersten Schritt wurden die Xylanasen 1 und 2 mittels IEC gereinigt.
Konzentrierte Probe wurde vollständig gegen 10 mM Tris-HCl (pH 9,0; Puffer A) dialysiert. 50 ml
wurden auf eine Standard-Chromatographiesäule (Pharmacia C 16/40 aufgebracht
(gepackt mit 72 ml Q-Sepharose HP [Pharmacia], äquilibriert mit Puffer A bei 1 ml/min
unter Verwendung eines Pharmacia FPLC-Systems). Die Säule wurde mit 50 ml Puffer A
gewaschen und dann mit einem linear ansteigenden 400 ml-Salzgradienten eluiert (von
Puffer A zu 0,25 M NaCl in Puffer A). Mit 2 M NaCl in Puffer A wurde verbleibendes
gebundenes Protein aus der Säule gewaschen. 10 ml-Fraktionen wurden abgenommen
und wie oben beschrieben untersucht.
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Die Xylanasen 1 und 2 co-eluierten aus der Säule nur dem anfänglichen Ausfluss,
während der überwiegende Rest von Protein an die Säule gebunden wurde. (Die Xylanasen
1 und 2 stellen die ungebundenen Säulenfraktionen dar.)
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HIC wurde als zweiter Schritt eingesetzt, um Xylanasen 1 und 2 zu reinigen und zu
isolieren. Aktive Fraktionen wurden vereinigt und durch Zugabe von 2 M Ammoniumsulfat
auf eine endgültige Ammoniumsulfat-Konzentration von 0,2 M gebracht. 50 mM
Natriumcitrat (pH 6,5) wurden bis zu einer Endkonzentration von 10 mM zugegeben
und das Material (etwa 100 ml) auf eine Standard-Chromatographiesäule (Pharmacia C
16/20), gepackt mit 36 ml Phenylsepharose C-4B (Pharmacia), äquilibriert mit 0,2 M
Ammoniumsulfat-10 mM Natriumcitrat (pH 6,5; Puffer B), bei 0,5 ml/min aufgebracht.
Die Säule wurde mit 60 ml Puffer B gewaschen und dann durch Abstufen der
Salzkonzentration auf 10 mM Natriumcitrat (pH 6,5; Puffer C), 70 ml, Abstufen auf 10%
(v/v) Ethylenglykol (EG) in Puffer C, 50 ml, Aufbringen eines linearen 200
ml-Gradienten: 10-32% EG, Waschen mit 32% EG, 80 ml, Aufbringen eines 150 ml-Gradienten:
32-38% EG und schließlich durch Hinaufstufen auf 50% EG, 70 ml, eluiert, um die
Säule vollständig auszuwaschen. 10 ml-Fraktionen wurden abgenommen und wie oben
untersucht. Unter diesen Bedingungen eluiert homogene Xylanase 2 mit der 32%-EG-
Waschlösung, während homogene Xylanase 1 am Ende des 32-38% EG-Gradienten
eluiert.
Reinigung von Xylanase 4
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Unter Anwendung des oben beschriebenen ersten Schritts (IEC) zur Reinigung der
Xylanasen 1 und 2 co-eluierten die Xylanasen 4 und 5 bei etwa 0,16 M NaCl in Puffer A.
Aktive Fraktionen wurden vereinigt und wie oben auf 0,4 M Ammoniumsulfat-10 mM
Natriumcitrat (pH 6,5; Puffer D) gebracht. Material (etwa 100 ml) wurde mit 1 ml/min
auf oben beschriebene HIC-Säule aufgebracht, die mit Puffer D äquilibriert worden war:
Die Säule wurde mit 50 ml Puffer D gewaschen, mit linearem 130 ml-Gradienten Puffer
D zu Puffer C eluiert, unmittelbar gefolgt von einem linearen 200 ml-Gradienten Puffer
C zu 50% EG. 10 ml-Fraktionen wurden abgenommen und wie oben untersucht.
Xylanase 4 eluiert bei etwa 20% EG.
Reinigung der Xylanasen 3 und 5
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Im Fall der Xylanasen 3 und 5 wurde HIC als erster Schritt angewendet. Konzentrierte
Probe wurde in Puffer C durch Zugabe von 2 M Ammoniumsulfat und 50 mM
Natrium
citrat (H 6,5; wie oben) auf 0,5 M Ammoniumsulfat gebracht. Material wurde filtriert,
um Niederschlagsspuren zu entfernen, und ein 50 ml-Volumen bei 1 ml/min auf die
oben beschriebene HIC-Säule aufgebracht, die mit 0,5 M Ammoniumsulfat in Puffer C
(Puffer E) äquilibriert worden war. Die Säule wurde als nächstes mit 87,5 ml Puffer E
gewaschen und dann mit einem linearen 147 ml-Gradienten Puffer E zu Puffer C eluiert.
10 ml-Fraktionen wurden abgenommen und wie oben untersucht. Die Xylanasen 3 und
5 co-eluierten bei etwa 0,05 Ammoniumsulfat.
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IEC diente dazu, die Xylanasen 3 und 5 zu isolieren und zu reinigen. Aktive
HIC-Fraktionen wurden vereinigt (70 ml), vollständig gegen 10 mM Tris-HCl (pH 8,0; Puffer F)
dialysiert und durch obiges Verfahren auf etwa 20 ml eingeengt. Material wurde bei
1 ml/min auf die oben beschriebene mit Puffer F äquilibrierte IEC-Säule aufgebracht.
Die Säule wurde mit 150 ml Puffer F gewaschen und mit einem linearen 150
ml-Gradienten Puffer F zu 0,25 M NaCl in Puffer F eluiert. 10 ml-Fraktionen wurden
abgenommen und wie oben untersucht. Xylanase 3 eluierte bei etwa 0,05 M NaCl, während
Xylanase 5 bei etwa 0,15 M NaCl eluierte.
Beispiel 5
Charakterisierung der fünf von Microtetraspora flexuose produzierten Xylanasen
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Nach der Reinigung wurde jede Xylanase gemäß dem nachstehend beschriebenen
Verfahren isolektrischem Fokussieren und einer Molekulargewichtsbestimmung
unterzogen. Die Ergebnisse der biochemischen Charakterisierung der Xylanasen sind in Tabelle
7 aufgelistet.
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Isoelektrische Fokussiertechniken erfolgten unter Verwendung eines PhastSystems
(Pharmacia Biotech) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Marker zur pl-Bestimmung
waren ein Set mit pH 3,5-9,3 und ein Breitband-pl-Set (Pharmacia Biotech). Das sichtbar
Machen der Proteine erfolgte gemäß den Anweisungen durch
PhastSystem-Entwicklungs-Silberfärbung.
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Molekulargewichtsbestimmungen wurden nach zwei Verfahren durchgeführt:
Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE) und Massenspektroskopie
(MS). SDS-PAGE und das anschließende sichtbar Machen durch Silberfärbung erfolgten
mittels des gleichen PhastSystems wie oben. Die verwendeten
Molekulargewichtsmarker stammten von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Die Massenspektroskopie
erfolgte durch Charles Evans und Kollegen (301 Chesapeake Drive, Redwood City, CA 94063,
USA).
Tabelle 7 Microtetraspora flexuosa XYLANASEN
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Das pH-Optimum wird mittels des oben beschriebenen RBB-Assays bestimmt, außer
dass die Puffer je nach den gemessenen pH-Bereichen variieren, d. h. pH 4,5-12,0 (siehe
Fig. 1). Es ist für Fachleute auf dem Gebiet möglich, den geeigneten Puffer für den
jeweils gewählten pH-Wert des Assays herzustellen.
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Die Temperaturstabilität stellt die Zeit bei einer bestimmten Temperatur dar, bei der die
Hälfte der Aktivität bestehen bleibt. Die Aktivität wird bei etwa 18-37ºC gemessen. Die
Probe wird bei einer bestimmten Temperatur inkubiert und die Aktivität mittels RBB-
Assay gemessen. Die Halbwertszeit ist die Zeit in Minuten, bei der die Hälfte der
Aktivität verloren geht (siehe Fig. 3).
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Das Temperaturoptimum ist die Temperatur, bei der die höchste Aktivität festgestellt
wird. Fig. 2 zeigt das Temperaturprofil der Xylanasen 1-3 (gemessen unter Anwendung
des RBB-Assays). Sowohl in Fig. 1 als auch in Fig. 2 steht der Prozentsatz der
maximalen Aktivität mit der Messung der höchsten Aktivität in Zusammenhang (sie erhält den
Wert 100%, und alle anderen Zahlen werden relativ zu dieser Standardisierung
gemessen).