CN103900981A - 一种发酵液中木聚糖酶的快速测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种发酵液中木聚糖酶的快速测定方法，包括以下步骤：将发酵液1000×g离心10min，取上清液测定木聚糖酶活性，将适当稀释的上清液、10g/L木聚糖溶液和50mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)置于39℃预热15-30min，然后向75μL稀释后的上清液中加入75μL磷酸钠缓冲液和50μL木聚糖溶液，39℃反应15-30min后，加入300μL DNS溶液终止反应。沸水浴5min后，冷却至室温。取200-300μL于干燥洁净的96孔酶标板上，用全自动酶标仪在530-550nm下检测吸光值，根据木糖的标准曲线计算木聚糖酶活性。本发明技术修订了发酵液中木聚糖酶的测定方法，可快速大量且准确的测定木聚糖酶活性，减少人为误差。同时，较少的样品量即可检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种发酵液中木聚糖酶的快速测定方法，属于生物技术领域。
背景技术
木聚糖是一种多聚五碳糖，是植物半纤维素的重要组分，它占植物碳水化合物总量的三分之一，在自然界中是继纤维素之后含量第二丰富的再生生物质资源。虽然木聚糖是一类广泛存在于植物体内的半纤维素，但是，由于木聚糖在动物消化道内不能被消化吸收，同时提高食糜的黏稠度，阻碍营养物质，尤其是脂肪和蛋白质的消化吸收，并且降低饲料的转化率，具有很强的抗营养特性，因而限制了许多饲料的应用。木聚糖酶可将木聚糖逐次降解为低聚木糖及木糖，从而消除木聚糖的抗营养作用，提高动物对饲料的利用率，降低胃肠道食糜的粘性，减少畜禽肠道疾病，增进畜禽健康，提高畜禽成活率，减少粘粪，降低空气中氨气和硫化物浓度，减少环境污染，使畜禽体重均匀。同时，木聚糖酶的应用也为缓解能量饲料资源的短缺、开辟非常规饲料资源提供了新的途径。因此，木聚糖酶在饲料资源开发和提高廉价副产品的利用率方面，具有广阔的前景。
测定木聚糖酶活力的方法主要有以下3种：黏度法、底物染色法和还原糖法。黏度法是通过测定木聚糖酶对底物黏度的降解速度来计算酶活力，这种测定分析方法有较好的实用价值，但是测定过程比较繁琐，而且重复性较差，目前很少采用。底物染色法是一种比较简便快速的测定方法，其基本原理是以木聚糖为基质，用胶联方式连接和包裹特定的染料，制成染料含量均衡，质量稳定的片剂。这种片剂容易溶于水溶液中，与木聚糖酶反应后，长链木聚糖被降解，结合的染料分子被释放到溶液中，通过测定溶液中染料浓度就可以就算出酶活。这种测定方法经常被一些检测分析专业生产生物酶的大型企业采用，但是，它只能测定特定的木聚糖酶活力，不具有代表性。还原糖法是通过测定还原糖产量来计算酶活。这种分析方法比较简便，而且重复性也比较好。国内外关于木聚糖酶的研究报告多数采用这种方法，它的不足是测定速度较慢，分光光度计每次仅能分析一个样品。
发明内容
现有木聚糖酶测定方法费时费力，一次仅能检测一个样品，所以人为误差较大。本发明的目的在于克服现有技术的缺点和不足，优化木聚糖酶检测方法，建立新的反应体系，每个反应可同时最大检测96个样品，大大提高了木聚糖酶检测速度，同时降低人为测定误差。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下。
一种发酵液中木聚糖酶的快速测定方法，具体方法为：将发酵液在1000×g离心10min，取上清液测定木聚糖酶活性，将适当稀释的上清液、10g/L木聚糖溶液和50mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)置于39℃预热15-30min，然后向75μL适当稀释的上清液中加入75μL磷酸钠缓冲液和50μL木聚糖溶液，39℃反应15-30min后，加入300μL的DNS溶液终止反应。沸水浴5min后，冷却至室温。取200-300μL于干燥洁净的96孔酶标板上，用全自动酶标仪在530-550nm下检测吸光值，根据木糖的标准曲线计算木聚糖酶活性。
进一步地，所述10g/L木聚糖溶液的配制方法为：准确称取10g木聚糖标准品溶于800mL去离子水中，然后定容至1L。
进一步地，所述50mM磷酸钠缓冲溶液为pH7.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，配制方法为：200mM磷酸氢二钠溶液，称取28.396g磷酸氢二钠，用去离子水充分溶解，并定容至1L；200mM磷酸二氢钠溶液，称取23.996g磷酸二氢钠，用去离子水充分溶解，并定容至1L；将200mM磷酸氢二钠和磷酸二氢钠溶液分别用去离子水稀释至50mM，所述磷酸氢二钠和磷酸二氢钠溶液的使用比例为61∶39。
进一步地，所述DNS溶液的配制方法为：将10g的3,5-二硝基水杨酸溶于800mL去离子水中，然后依次加入10g氢氧化钠、208g酒石酸钾钠、2.0g苯酚和0.5g亚硫酸氢钠，溶解并搅拌均匀后，定容至1L。
进一步地，所述DNS溶液需要置于棕色瓶中避光保存。
进一步地，木聚糖酶的1个酶活力单位(U)可被定义为在上述酶促反应条件下，1mL检测发酵液在1min内自标准底物木聚糖中释放1μmol木糖所需的酶量。
该发明的有益效果在于：本发明技术修订了发酵液中木聚糖酶的测定方法，可快速大量且准确的测定木聚糖酶活性，减少人为误差。同时，较少的样品量即可检测。
附图说明
图1本发明实施例中所测定的木聚糖酶活性标准曲线。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的具体实施方式进行描述，以便更好的理解本发明。
实施例
一种发酵液中木聚糖酶的快速测定方法，配制木糖标准溶液，制作测定木聚糖酶活性标准曲线，结果如图1所示。曲线关系为：Y＝95.281X+3.7833(R2＝0.9952)，其中Y为木聚糖含量(μg)，X为吸光度。
具体选择小麦秸秆、玉米秸秆、水稻秸秆和羊草四种粗饲料作为底物。称取80mg底物和量取9.0mL培养基入亨盖特培养管中，121℃湿热灭菌20min。厌氧条件下接种真菌，接种后的培养基在39℃下连续培养5天，每种底物4个重复。同时，在培养过程中每种底物都有底物空白和对照。培养5天，4℃下1000×g离心10min后，测定管中发酵液中木聚糖酶活性。结果如表1所示。
表1厌氧真菌以不同饲料为底物5天培养后对发酵液中木聚糖酶活性的影响
其中，a，b-同行数据后字母标注不同者差异显著(P<0.05)，S.E.M＝平均数标准差。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种发酵液中木聚糖酶的快速测定方法，其特征在于：具体方法为：将发酵液在1000×g离心10min，取上清液测定木聚糖酶活性，将适当稀释的上清液、10g/L木聚糖溶液和50mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)置于39℃预热15-30min，然后向75μL稀释后的上清液中加入75μL磷酸钠缓冲液和50μL木聚糖溶液，39℃反应15-30min后，加入300μL DNS溶液终止反应；沸水浴5min后，冷却至室温；取200-300μL于干燥洁净的96孔酶标板上，用全自动酶标仪在530-550nm下检测吸光值，根据木糖的标准曲线计算木聚糖酶活性。
2.根据权利要求1所述的发酵液中木聚糖酶的快速测定方法，其特征在于：所述10g/L木聚糖溶液的配制方法为：准确称取10g木聚糖标准品溶于800mL去离子水中，然后定容至1L。
3.根据权利要求1所述的发酵液中木聚糖酶的快速测定方法，其特征在于：所述50mM磷酸钠缓冲溶液为pH7.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，配制方法为：200mM磷酸氢二钠溶液，称取28.396g磷酸氢二钠，用去离子水充分溶解，并定容至1L；200mM磷酸二氢钠溶液，称取23.996g磷酸二氢钠，用去离子水充分溶解，并定容至1L；将200mM磷酸氢二钠和磷酸二氢钠溶液分别用去离子水稀释至50mM，所述磷酸氢二钠和磷酸二氢钠溶液的使用比例为61∶39。
4.根据权利要求1所述的发酵液中木聚糖酶的快速测定方法，其特征在于：所述DNS溶液的配制方法为：将10g的3,5-二硝基水杨酸溶于800mL去离子水中，然后依次加入10g氢氧化钠、208g酒石酸钾钠、2.0g苯酚和0.5g亚硫酸氢钠，溶解并搅拌均匀后，定容至1L。
5.根据权利要求5所述的发酵液中木聚糖酶的快速测定方法，其特征在于：DNS溶液需要置于棕色瓶中避光保存。
6.根据权利要求1所述的发酵液中木聚糖酶的快速测定方法，其特征在于：木聚糖酶的1个酶活力单位(U)可被定义为在上述酶促反应条件下，1mL检测发酵液在1min内自标准底物木聚糖中释放1μmol木糖所需的酶量。
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