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DE69434962T2 - Proteasehaltige reinigungsmittel - Google Patents

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DE69434962T2
DE69434962T2 DE69434962T DE69434962T DE69434962T2 DE 69434962 T2 DE69434962 T2 DE 69434962T2 DE 69434962 T DE69434962 T DE 69434962T DE 69434962 T DE69434962 T DE 69434962T DE 69434962 T2 DE69434962 T2 DE 69434962T2
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DE
Germany
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subtilisin
protease
mixtures
enzyme
cleaning composition
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DE69434962T
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DE69434962D1 (de
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Andre Baeck
Chanchal Kumar West Chester GHOSH
Thomas Paul Pacifico GRAYCAR
Richard Ray Burlingame BOTT
Lori Jean Millbrae WILSON
Philip Frederick Cincinnati BRODE
Bobby Lee Cincinnati BARNETT
Donn Nelton Cincinnati RUBINGH
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Procter and Gamble Co
Original Assignee
Procter and Gamble Co
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Description

  • Diese Anmeldung ist eine Teilfortsetzungsanmeldung der US-Anmeldung mit der Seriennummer 08/136,797 , eingereicht am 14. Oktober 1993, und der US-Anmeldung mit der Seriennummer 08/237,938 , eingereicht am 2. Mai 1994, die beide in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme hierin eingeschlossen sind.
  • TECHNISCHES GEBIET
  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vielfalt an Reinigungszusammensetzungen, die neuartige Proteaseenzyme umfassen, bei denen es sich um Carbonylhydrolasevarianten handelt.
  • HINTERGRUND
  • Enzyme stellen die größte Klasse natürlich vorkommender Proteine dar. Jede Enzymklasse katalysiert (beschleunigt eine Reaktion, ohne verbraucht zu werden) im Allgemeinen eine andere Art von chemischer Reaktion. Eine Klasse von Enzymen, die als Proteasen bekannt sind, ist für ihre Fähigkeit zum Hydrolysieren (Zerlegen einer Verbindung in zwei oder mehr einfachere Verbindungen mit Aufnahme der H- und OH-Teile eines Wassermoleküls auf beiden Seiten der aufgespaltenen chemischen Bindung) anderer Proteine bekannt. Diese Fähigkeit zum Hydrolysieren von Proteinen wird durch Einbeziehung natürlich vorkommender und mittels Proteintechnik erzeugter Proteasen als Zusatzstoff für Wäschewaschmittelzubereitungen genutzt. Viele Flecken auf Kleidung sind proteinhaltig, und Proteasen mit breiter Spezifität können die Entfernung solcher Flecken wesentlich verbessern.
  • Bedauerlicherweise wird der Wirksamkeitsgrad dieser Proteine in ihrer natürlichen, bakteriellen Umgebung häufig nicht in die relativ unnatürliche Waschumgebung übertragen. Genauer sind Proteaseeigenschaften wie Wärmestabilität, pH-Stabilität, Oxidationsstabilität und Substratspezifität nicht notwendigerweise zur Verwendung außerhalb der natürlichen Umgebung des Enzyms optimiert.
  • Die Aminosäuresequenz des Proteaseenzyms bestimmt die Eigenschaften der Protease. Eine Änderung der Aminosäuresequenz der Protease kann je nach Ort, Art und/oder Ausmaß der Änderung der Aminosäuresequenz die Eigenschaften des Enzyms in unterschiedlichen Graden ändern oder das Enzym sogar deaktivieren. Es wurden verschiedene Herangehensweisen angewendet, um durch Änderung der Aminosäuresequenz von Proteasen zu versuchen, ihre Eigenschaften zu verbessern, mit dem Ziel, die Wirksamkeit der Protease für Reinigungsanwendungen wie in der Waschumgebung zu steigern. Zu diesen Herangehensweisen zählt das Ändern der Aminosäuresequenz, um unter ganz unterschiedlichen Bedingungen die Wärmestabilität zu erhöhen und die Oxidationsstabilität zu verbessern.
  • Trotz der Vielfalt an im Stand der Technik beschriebenen Herangehensweisen besteht eine anhaltende Notwendigkeit für neue wirksame Proteasevarianten, die zur Reinigung einer Vielfalt an Oberflächen geeignet sind. Daher ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Reinigungszusammensetzungen bereitzustellen, die Proteaseenzyme enthalten, bei denen es sich um Carbonylhydrolasevarianten mit verbesserter proteolytischer Aktivität, Substratspezifität, Stabilität und/oder verbesserten Leistungseigenschaften handelt. Diese und andere Aufgaben werden aus der nachfolgenden ausführlichen Beschreibung leicht ersichtlich.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Reinigungszusammensetzungen, umfassend:
    • (a) eine wirksame Menge an Proteaseenzym, bei dem es sich um eine Carbonylhydrolasevariante mit einer Aminosäuresequenz handelt, die nicht in der Natur vorkommt, und die von einer Vorläufer-Carbonylhydrolase abgeleitet ist, und wobei das Proteaseenzym eine Bacillus-lentus-Subtilisinvariante ist, die ausgewählt ist aus N76D/S103A; N76D/V104I; N76D/S99D/S101R; N76D/S99D/S103A; N76D/S99D/V104I; N76D/S101R/S103A; N76D/S101R/V104I; N76D/S103A/V104I; N76D/V104I/I107V; N76D/V104Y/I107V; N76D/V104I/N123S; N76D/S99D/S101R/S103A; N76D/S99D/S101R/V104I; N76D/S99D/S103A/V104I; N76D/S101R/S103A/V104I; N76D/S103A/V104I/N123S; N76D/V104I/I107V/N123S; N76D/S99D/S101R/S103A/V104I; N76D/S99D/S103A/V104I/N123S; N76D/S99D/S101R/S103A/V104I/N123S; N76D/S103A/V104I/S128G; N76D/S103A/V104I/T260P; N76D/S103A/V104I/S265N; N76D/S103A/V104I/D197E; N76D/S103A/V104I/S105A; N76D/S103A/V104I/L135I; N76D/S103A/V104I/L126F; N76D/S103A/V104I/L107T; N76D/S103A/V104I/L126F/S265N und N76D/S103A/V104I/M222A und Mischungen davon; wobei die bezifferte Position natürlich vorkommendem Subtilisin aus Bacillus amyloliquefaciens oder äquivalenten Aminosäureresten in anderen Carbonylhydrolasen oder Subtilisinen (wie Bacillus-lentus-Subtilisin) entspricht; und
    • (b) ein oder mehrere Reinigungszusammensetzungsmaterialien, die mit dem Proteaseenzym verträglich sind.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zur Reinigung von Gegenständen, die einer Reinigung bedürfen, durch Inkontaktbringen des Gegenstands mit einem Proteaseenzym, bei dem es sich um eine Carbonylhydrolasevariante handelt, wie hier beschrieben. Daher umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Reinigung von Textilien, umfassend das Inkontaktbringen, vorzugsweise unter Hin- und Herbewegen, der Textilien mit einer wässrigen Flotte, die das Proteaseenzym enthält. Das Verfahren kann bei Temperaturen von unter etwa 60°C durchgeführt werden, jedoch ist es natürlich bei Wäschewaschtemperaturen bis hin zum Kochen sehr wirksam. Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Reinigung von Geschirr durch Inkontaktbringen von Geschirr, das einer Reinigung bedarf, mit einem Proteaseenzym, wie hier beschrieben. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung schließen auch Verfahren zur Körperreinigung ein, wobei die Verfahren das Inkontaktbringen des Körperteils eines Menschen oder niederen Tiers, der einer Reinigung bedarf, mit einem Proteaseenzym, wie hier beschrieben, umfassen.
  • KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • Die 1A–C zeigen die DNA- und die Aminosäuresequenz für Bacillus-amyloliquefaciens-Subtilisin und eine Teilrestriktionskarte dieses Gens (Seq.-ID Nr. 6).
  • 2 zeigt die konservierten Aminosäurereste in Subtilisinen von Bacillus amyloliquefaciens (BPN') und Bacillus lentus (Wildtyp).
  • Die 3A und 3B zeigen die Aminosäuresequenz von vier Subtilisinen. Die obere Reihe zeigt die Aminosäuresequenz von Subtilisin aus Bacillus amyloliquefaciens (mitunter auch als Subtilisin BPN' bezeichnet) (Seq.-ID Nr. 7). Die zweite Reihe zeigt die Aminosäuresequenz von Subtilisin aus Bacillus subtilis (Seq.-ID Nr. 8). Die dritte Reihe zeigt die Aminosäuresequenz von Subtilisin aus B. icheniformis (Seq.-ID r. 9). Die vierte Reihe zeigt die Aminosäuresequenz von Subtilisin aus Bacillus lentus (in PCT WO89/06276 auch als Subtilisin 309 bezeichnet) (Seq.-ID Nr. 10). Das Symbol* kennzeichnet die Abwesenheit von spezifischen Aminosäureresten im Vergleich zu Subtilisin BPN'.
  • 4 zeigt die Konstruktion des Plasmids GGA274.
  • 5 zeigt die Konstruktion von GGT274, welches eine Zwischenverbindung für bestimmte in dieser Anmeldung verwendete Expressionsplasmide ist.
  • Die 6A und 6B zeigen die DNA- und die Aminosäuresequenz von Subtilisin aus Bacillus lentus (Seq.-ID Nr. 11). Das reife Subtilisinprotein wird durch die Codons kodiert, die mit dem Codon GCG (334-336), welches Ala entspricht, beginnen.
  • Die 7A und 7B zeigen die DNA- und die Aminosäuresequenz einer bevorzugten Ausfürungsform der Erfindung (N76D/S103A/V104I) (Seq.-ID Nr. 12). Die DNA in dieser Figur wurde durch die beschriebenen Verfahren zur Kodierung von Aspartat an Position 76, Alanin an Position 103 und Isoleucin an Position 104 modifiziert. Das reife Subtilisinvarianten-Protein wird durch die Codons kodiert, die mit dem Codon GCG (334-336), welches Ala entspricht, beginnen.
  • 8 zeigt die Konstruktion des Vektors pBCDAICAT.
  • 9 zeigt die Konstruktion des Vektors pUCCATFNA.
  • 10 zeigt die Stabilität eines bevorzugten Mutantenenzyms im Vergleich zum Wildtyp in einer flüssigen Reinigungsmittelformulierung.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • 1. Proteaseenzyme:
  • Die Erfindung umfasst Proteaseenzyme, die keine natürlich vorkommenden Carbonylhydrolasevarianten sind und Unterschiede hinsichtlich proteolytischer Aktivität, Stabilität, Substratspezifität, pH-Profil und/oder Leistungseigenschaften im Vergleich zu der Vorläufer-Carbonylhydrolase aufweisen, von der die Aminosäuresequenz der Variante abgeleitet ist. Die Vorläufer-Carbonylhydrolase kann eine natürlich vorkommende Carbonylhydrolase oder eine rekombinierte Hydrolase sein. Genauer besitzen solche Carbonylhydrolasevarianten eine Aminosäuresequenz, die nicht in der Natur vorkommt und die durch Ersetzung einer Mehrzahl von Aminosäureresten einer Vorläufer-Carbonylhydrolase durch andere Aminosäuren abgeleitet wird. Die Mehrzahl von Aminosäureresten des Vorläuferenzyms entspricht Position +76 in Kombination mit einem oder mehreren der folgenden Reste +103, +104, wobei die bezifferte Position natürlich vorkommendem Subtilisin aus Bacillus amyloliquefaciens oder äquivalenten Aminosäureresten in anderen Carbonylhydrolasen oder Subtilisinen, wie Bacillus-lentus-Subtilisin, entspricht.
  • Die Carbonylhydrolasevarianten, die in den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung geeignete Proteaseenzyme sind, umfassen die Ersetzung von Aminosäurerest +76 in Kombination mit einer oder mehreren zusätzlichen Modifikationen. Die Varianten-Proteaseenzyme, die für die vorliegende Erfindung geeignet sind, umfassen die Substitution, Deletion oder Einfügung von Aminosäureresten in den folgenden Kombinationen: 76/103; 76/104; 76/99/103; 76/99/104; 76/101/103; 76/101/104; 76/103/104; 76/104/107; 76/104/123; 76/99/101/103; 76/99/101/104; 76/99/103/104; 76/101/103/104; 76/103/104/123; 76/104/107/123; 76/99/101/103/104; 76/99/103/104/123; 76/99/101/103/104/123; 76/103/104/128; 76/103/104/260; 76/103/104/265; 76/103/104/197; 76/103/104/105; 76/103/104/135; 76/103/104/126; 76/103/104/107; 76/103/104/210; 76/103/104/126/265 und/oder 76/103/104/222. Vorzugsweise umfassen die für die vorliegende Erfindung geeigneten Variantenenzyme die Substitution, Deletion oder Einfügung eines Aminosäurerests in der folgenden Kombination von Resten: 76/104; 76/99/104; 76/103/104; 76/104/107; 76/101/103/104; 76/99/101/103/104 und 76/101/104 von B.-amyloliquefaciens-Subtilisin.
  • Varianten-DNA-Sequenzen, die solche Carbonylhydrolase- oder Subtilisinvarianten kodieren, sind von einer Vorläufer-DNA-Sequenz abgeleitet, die ein natürlich vorkommendes oder rekombiniertes Vorläuferenzym kodiert. Die Varianten-DNA-Sequenzen werden abgeleitet durch Modifizieren der Vorläufer-DNA-Sequenz zur Kodierung der Substitution eines oder mehrerer spezifischer, durch die Vorläufer-DNA-Sequenz kodierter Aminosäurereste, die den Positionen 76, 99, 101, 103, 104, 107, 123, 27, 105, 109, 126, 128, 135, 156, 166, 195, 197, 204, 206, 210, 216, 217, 218, 222, 260, 265 und/oder 274 in Bacillus amyloliquefaciens oder einer beliebigen Kombination davon entsprechen, wobei die Variante mindestens an den Positionen 76 und 103 oder 104 substituiert sein muss. Obwohl die zur Modifikation hierin identifizierten Aminosäurereste gemäß der auf B. amyloliquefaciens anwendbaren Nummerierung identifiziert werden (welche die herkömmliche Methode zur Identifizierung von Restpositionen in allen Subtilisinen geworden ist), ist die bevorzugte Vorläufer-DNA-Sequenz, die für die vorliegende Erfindung geeignet ist, die DNA-Sequenz von Bacillus lentus, wie in 6 gezeigt (Seq.-ID Nr. 11).
  • Diese Varianten-DNA-Sequenzen kodieren die Einfügung oder Substitution des Aminosäurerests 76 in Kombination mit einer oder mehreren zusätzlichen Modifikationen. Die Varianten-DNA-Sequenzen kodieren die Substitution oder Einfügung von Aminosäureresten in den folgenden Kombinationen: 76/103; 76/104; 76/99/103; 76/99/104; 76/101/103; 76/101/104; 76/103/104; 76/104/107; 76/104/123; 76/107/123; 76/99/101/103; 76/99/101/104; 76/99/103/104; 76/101/103/104; 76/103/104/123; 76/104/107/123; 76/99/101/103/104; 76/99/103/104/123; 76/99/101/103/104/123; 76/103/104/128; 76/103/104/260; 76/103/104/265; 76/103/104/197; 76/103/104/105; 76/103/104/135; 76/103/104/126; 76/103/104/107; 76/103/104/210; 76/103/104/126/265 und/oder 76/103/104/222. Vorzugsweise kodieren die Varianten-DNA-Sequenzen für die Modifikation der folgenden Kombinationen von Resten: 76/104; 76/99/104; 76/103/104; 76/104/107; 76/101/103/104; 76/99/101/103/104 und 76/101/104. Diese rekombinierten DNA-Sequenzen kodieren Carbonylhydrolasevarianten mit einer neuartigen Aminosäuresequenz und im Allgemeinen mindestens einer Eigenschaft, die sich wesentlich von der gleichen Eigenschaft des Enzyms unterscheidet, das durch die DNA-Sequenz der Vorläufer-Carbonylhydrolase kodiert wird. Solche Eigenschaften umfassen proteolytische Aktivität, Substratspezifität, Stabilität, verändertes pH-Profil und/oder verbesserte Leistungseigenschaften.
  • Die hierin geeigneten Proteaseenzyme umfassen die Substitution beliebiger der neunzehn natürlich vorkommenden L-Aminosäuren an den bezeichneten Aminosäurerest-Positionen. Solche Substitutionen können in beliebigem Vorläufersubtilisin (prokaryotisch, eukaryotisch, von Säugetieren usw.) vorgenommen werden. In dieser gesamten Anmeldung wird durch gebräuchliche ein- und dreibuchstabige Codes auf verschiedene Aminosäuren verwiesen. Solche Codes sind in Dale, J. W., (1989), Molecular Genetics of Bacteria, John Wiley & Sons, Ltd., Anhang B, bestimmt.
  • Vorzugsweise umfasst die an den einzelnen identifizierten Aminosäurerest-Positionen vorzunehmende Substitution, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein: Substitutionen an Position 76, einschließlich D, H, E, G, F, K, P und N; Substitutionen an Position 99, einschließlich D, T, N, Q, G und S; Substitutionen an Position 101, einschließlich G, D, K, L, A, E, S und R; Substitutionen an Position 103, einschließlich Q, T, D, E, Y, K, G, R, S und A; Substitutionen an Position 104, einschließlich aller neunzehn natürlich vorkommenden Aminosäuren; Substitutionen an Position 107, einschließlich V, L, M, Y, G, E, F, T, S, A, N und I; Substitutionen an Position 123, einschließlich N, T, I, G, A, C und S; Substitutionen an Position 27, einschließlich K, N, C, V und T; Substitutionen an Position 105, einschließlich A, D, G, R und N; Substitutionen an Position 107, einschließlich A, L, V, Y, G, F, T, S und A; Substitutionen an Position 109, einschließlich S, K, R, A, N und D; Substitutionen an Position 126, einschließlich A, F, I, V und G; Substitutionen an Position 128, einschließlich G, L und A; Substitutionen an Position 135, einschließlich A, F, I, S und V; Substitutionen an Position 156, einschließlich D, E, A, G, Q und K; Substitutionen an Position 166, einschließlich aller neunzehn natürlich vorkommenden Aminosäuren; Substitutionen an Position 195, einschließlich E; Substitutionen an Position 197, einschließlich E; Substitutionen an Position 204, einschließlich A, G, C, S und D; Substitutionen an Position 206, einschließlich L, Y, N, D und E; Substitutionen an Position 210, einschließlich L, I, S, C und F; Substitutionen an Position 216, einschließlich V, E, T und K; Substitutionen an Position 217, einschließlich aller neunzehn natürlich vorkommenden Aminosäuren; Substitutionen an Position 218, einschließlich S, A, G, T und V; Substitutionen an Position 222, einschließlich aller neunzehn natürlich vorkommenden Aminosäuren; Substitutionen an Position 260, einschließlich P, N, G, A, S, C, K und D; Substitutionen an Position 265, einschließlich N, G, A, S, C, K, Y und H; und Substitutionen an Position 274, einschließlich A und S. Die besonders bevorzugte Aminosäure bzw. die besonders bevorzugten Aminosäuren, die an solchen einzelnen Positionen zu substituieren sind, sind nachstehend in Tabelle I bestimmt. Obwohl in Tabelle I spezifische Aminosäuren aufgeführt sind, sei klargestellt, dass an den identifizierten Resten eine beliebige Aminosäure substituiert werden kann. Tabelle I
    Aminosäurerest Bevorzugte zu substituierende/einzufügende Aminosäure
    +76 D, H
    +99 D, T, N, G
    +101 R, G, D, K, L, A, E
    +103 A, Q, T, D, E, Y, K, G, R
    +104 I, Y, S, L, A, T, G, F, M, W, D, V, N
    +107 V, L, Y, G, F, T, S, A, N
    +123 S, T, I
    +27 K
    +105 A, D
    +109 S, K, R
    +126 A, I, V, F
    +128 G, L
    +135 I, A, S
    +156 E, D, Q
    +166 D, G, E, K, N, A, F, I, V, L
    +195 E
    +197 E
    +204 A, G, C
    +206 L
    +210 I, S, C
    +216 V
    +217 H, I, Y, C, A, G, F, S, N, E, K
    +218 S
    +222 A, Q, S, C, I, K
    +260 P, A, S, N, G
    +265 N, A, G, S
    +274 A, S
  • Diese Proteaseenzyme, die in-vitro-Mutationen in B.-lentus-Subtilisin an einem Aminosäurerest enthalten, der zu +76 in Bacillus-amyloliquefaciens-Subtilisin äquivalent ist, bilden Subtilisinvarianten, die eine veränderte Stabilität (z. B. eine modifizierte autoproteolytische Stabilität) gegenüber Vorläufersubtilisinen aufweisen. (Siehe Tabellen IV und VI.)
  • Ebenso bilden in-vitro-Mutationen an Resten, die zu +99, +101, +103, +104, +107, +123, +27, +105, +109, +126, +128, +135, +156, +166, +195, +197, +204, +206, +210, +216, +217, +218, +222, +260, +265 und/oder +274 in Bacillus-amyloliquefaciens-Subtilisin äquivalent sind, allein oder in Kombination miteinander und in beliebiger Kombination mit +76-Mutationen Subtilisinvarianten, die eine veränderte proteolytische Aktivität, eine veränderte Wärmestabilität, ein verändertes pH-Profil, eine veränderte Substratspezifität und/oder veränderte Leistungseigenschaften aufweisen.
  • Carbonylhydrolasen sind Proteaseenzyme, die Verbindungen hydrolysieren, die
    O
    C-X
    -Bindungen enthalten, in denen X Sauerstoff oder Stickstoff ist. Sie schließen natürlich vorkommende Carbonylhydrolasen und rekombinierte Carbonylhydrola sen ein. Natürlich vorkommende Carbonylhydrolasen schließen hauptsächlich Hydrolasen ein, z. B. Peptidhydrolasen wie Subtilisine oder Metallproteasen. Peptidhydrolasen schließen α-Aminoacylpeptidhydrolase, Peptidylaminosäurehydrolase, Acylaminohydrolase, Serincarboxypeptidase, Metallcarboxypeptidase, Thiolproteinase, Carboxylproteinase und Metallproteinase ein. Serin-, Metall-, Thiol- und Säureproteasen sind eingeschlossen, ebenso wie Endo- und Exoproteasen.
  • „Rekombinierte Carbonylhydrolase" bezieht sich auf eine Carbonylhydrolase, bei der die DNA-Sequenz, welche die natürlich vorkommende Carbonylhydrolase kodiert, modifiziert wird, um eine Mutanten-DNA-Sequenz zu erzeugen, welche die Substitution, Einfügung oder Deletion einer oder mehrerer Aminosäuren in der Aminosäuresequenz der Carbonylhydrolase kodiert. Geeignete Modifikationsverfahren sind hierin und in US-Patent 4,760,025 (RE 34,606), US-Patent 5,204,015 und US-Patent 5,185,258 eingeschlossen, deren Offenbarung durch Bezugnahme hierin eingeschlossen ist.
  • Subtilisine sind Bakterien- oder Pilzcarbonylhydrolasen, die im Allgemeinen so wirken, dass Peptidbindungen von Proteinen oder Peptiden aufgespalten werden. Wie hier verwendet, bedeutet „Subtilisin" ein natürlich vorkommendes Subtilisin oder ein rekombiniertes Subtilisin. Eine Reihe von natürlich vorkommenden Subtilisinen wird bekanntermaßen von verschiedenen mikrobiellen Spezies gebildet und oftmals sezerniert. Die Aminosäuresequenzen der Mitglieder dieser Reihe sind nicht vollständig homolog. Die Subtilisine in dieser Reihe weisen jedoch die gleiche oder eine ähnliche Art von proteolytischer Aktivität auf. Diese Klasse von Serinproteasen weist eine gemeinsame Aminosäuresequenz auf, die eine katalytische Triade bestimmt, die sie von der Chymotrypsin-verwandten Klasse von Serinproteasen unterscheidet. Die Subtilisine und die Chymotrypsin-verwandten Serinproteasen weisen jeweils eine katalytische Triade auf, die Aspartat, Histidin und Serin umfasst. In den Subtilisin-verwandten Proteasen lautet die relative Reihenfolge dieser Aminosäuren, vom Amino- zum Carboxyterminus gesehen, Aspartat-Histidin-Serin. In den Chymotrypsin-verwandten Proteasen lautet die relative Reihenfolge jedoch Histidin-Aspartat-Serin. Daher bezieht sich Subtilisin hierin auf eine Serinprotease mit der katalytischen Triade von Subtilisin-verwandten Proteasen. Beispiele umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, die in 3 hierin identifizierten Subtilisine.
  • „Rekombiniertes Subtilisin" bezieht sich auf ein Subtilisin, bei dem die DNA-Sequenz, die das Subtilisin kodiert, modifiziert wird, um eine Varianten-(oder Mutanten-)DNA-Sequenz zu erzeugen, welche die Substitution, Deletion oder Einfügung einer oder mehrerer Aminosäuren in der Aminosäuresequenz von natürlich vorkommendem Subtilisin kodiert. Geeignete Verfahren zur Erzeugung einer solchen Modifikation, die mit den hierin offenbarten kombiniert werden können, schließen diejenigen ein, die in US-Patent 4,760,025 (RE 34,606), US-Patent 5,204,015 und US-Patent 5,185,258 offenbart sind.
  • „Nichtmenschliche Carbonylhydrolasen" und die DNA, die sie kodiert, können aus vielen prokaryotischen und eukaryotischen Organismen gewonnen werden. Geeignete Beispiele für prokaryotische Organismen umfassen gramnegative Organismen wie E. coli oder Pseudomonas und grampositive Bakterien wie Micrococcus oder Bacillus. Beispiele für eukaryotische Organismen, aus denen Carbonylhydrolase und deren Gene gewonnen werden können, umfassen Hefe wie Saccharomyces cerevisiae, Pilze wie Aspergillus sp. und nichtmenschliche Säugetierquellen wie beispielsweise bovine sp., aus denen das Gen, das die Carbonylhydrolase Chymosin kodiert, gewonnen werden kann. Wie bei Subtilisinen kann eine Reihe von Carbonylhydrolasen aus verschiedenen verwandten Spezies gewonnen werden, die zwar Aminosäuresequenzen aufweisen, die zwischen den Mitgliedern dieser Reihe nicht vollständig homolog sind, jedoch trotzdem die gleiche oder eine ähnliche Art von biologischer Aktivität aufweisen. Somit weist nichtmenschliche Carbonylhydrolase, wie hier verwendet, eine funktionelle Definition auf, die sich auf Carbonylhydrolasen bezieht, die direkt oder indirekt mit prokaryotischen und eukaryotischen Quellen verbunden sind.
  • Eine „Carbonylhydrolasevariante" besitzt eine Aminosäuresequenz, die von der Aminosäuresequenz einer „Vorläufer-Carbonylhydrolase" abgeleitet ist. Die Vorläufer-Carbonylhydrolasen (wie ein Subtilisin) umfassen natürlich vorkommende Carbonylhydrolasen (Subtilisin) und rekombinierte Carbonylhydrolasen (Subtilisin). Die Aminosäuresequenz der Carbonylhydrolasevariante wird durch Substitution, Deletion oder Einfügung einer oder mehrerer Aminosäuren der Vorläufer-Aminosäuresequenz von der Aminosäuresequenz der Vorläuferhydrolase „abgeleitet". Eine solche Modifikation erfolgt an der „Vorläufer-DNA-Sequenz", welche die Aminosäuresequenz der Vorläufer-Carbonylhydrolase (Subtilisin) kodiert, und nicht durch Manipulation des Vorläufer-Carbonylhydrolase-(Subtilisin-)Enzyms als solchem. Geeignete Verfahren für eine solche Manipulation der Vorläufer-DNA-Sequenz umfassen hierin offenbarte Verfahren sowie Verfahren, die Fachleuten bekannt sind (siehe zum Beispiel EP 0 328299 , WO89/06279 und die US-Patente und -Anmeldungen, auf die hierin bereits verwiesen wurde).
  • Spezifische Reste, die Position +76 in Kombination mit einer oder mehreren der folgenden Positionen +99, +101, +103, +104, +107, +123, +27, +105, +109, +126, +128, +135, +156, +166, +195, +197, +204, +206, +210, +216, +217, +218, +222, +260, +265 und/oder +274 von Bacillus-amyloliquefaciens-Subtilisin entsprechen, sind hierin für eine Mutation identifiziert. Die modifizierten Reste sind aus den folgenden Kombinationen ausgewählt: 76/103; 76/104; 76/99/103; 76/99/104; 76/101/103; 76/101/104; 76/103/104; 76/104/107; 76/104/123; 76/107/123; 76/99/101/103; 76/99/101/104; 76/99/103/104; 76/101/103/104; 76/103/104/123; 76/104/107/123; 76/99/101/103/104; 76/99/103/104/123; 76/99/101/103/104/123; 76/103/104/128; 76/103/104/260; 76/103/104/265; 76/103/104/197; 76/103/104/105; 76/103/104/135; 76/103/104/126; 76/103/104/107; 76/103/104/210; 76/103/104/126/265 und/oder 76/103/104/222; und am meisten bevorzugt sind 76/104; 76/99/104; 76/103/104; 76/104/107; 76/101/103/104; 76/99/101/103/104 und 76/101/104. Diese Amino säure-Positionsnummern beziehen sich auf diejenigen, die der in 1 dargestellten Sequenz von reifem Bacillus-amyloliquefaciens-Subtilisin zugewiesen sind. Die in der vorliegenden Erfindung geeigneten Proteaseenzyme sind jedoch nicht auf die Mutation dieses bestimmten Subtilisins beschränkt, sondern erstrecken sich auch auf Vorläufer-Carbonylhydrolasen, die Aminosäurereste an Positionen enthalten, die zu den bestimmten identifizierten Resten in Bacillus-amyloliquefaciens-Subtilisin „äquivalent" sind. Vorzugsweise ist das Vorläufersubtilisin Bacillus-lentus-Subtilisin, und die Substitutionen, Deletionen oder Einfügungen werden an dem äquivalenten Aminosäurerest in B. lentus vorgenommen, der den vorstehend aufgeführten entspricht.
  • Ein Rest (eine Aminosäure) einer Vorläufer-Carbonylhydrolase ist äquivalent zu einem Rest von Bacillus-amyloliquefaciens-Subtilisin, wenn er entweder homolog ist (d. h. der Position in der Primär- oder Tertiärstruktur entspricht) oder analog zu einem spezifischen Rest oder Teil dieses Restes in Bacillus-amyloliquefaciens-Subtilisin ist (d. h. die gleiche oder eine ähnliche funktionelle Fähigkeit zur chemischen Verbindung, Reaktion oder Interaktion aufweist).
  • Um Homologie zu der Primärstruktur festzustellen, wird die Aminosäuresequenz einer Vorläufer-Carbonylhydrolase direkt mit der Primärsequenz von Bacillus-amyloliquefaciens-Subtilisin und besonders mit einer Reihe von Resten verglichen, die bekanntermaßen in Subtilisinen, deren Sequenz bekannt ist, invariant sind. 2 hierin zeigt die konservierten Reste im Vergleich zwischen Amyloliquefaciens-Subtilisin und B.-lentus-Subtilisin. Nach der Anordnung der konservierten Reste, die notwendige Einfügungen und Deletionen ermöglicht, um die Anordnung aufrechtzuerhalten (d. h. Vermeiden der Eliminierung von konservierten Resten durch willkürliche Deletion und Einfügung), werden die Reste bestimmt, die zu bestimmten Aminosäuren in der Primärsequenz von Bacillus-amyloliquefaciens-Subtilisin äquivalent sind. Bei der Anordnung von konservierten Resten sollten vorzugsweise 100% solcher Reste konserviert werden. Die Anordnung von mehr als 75% oder nur 50% konservierten Resten ist jedoch ebenfalls zur Bestimmung von äquivalenten Resten ausreichend. Die Konservierung der katalytischen Triade Asp32/His64/Ser221 sollte aufrechterhalten werden.
  • Beispielsweise sind in 3 die Aminosäuresequenzen von Subtilisin aus Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis (carlsbergensis) und Bacillus lentus angeordnet, um für ein Höchstmaß an Homologie zwischen den Aminosäuresequenzen zu sorgen. Ein Vergleich dieser Sequenzen zeigt, dass in jeder Sequenz mehrere konservierte Reste enthalten sind. Diese konservierten Reste (im Vergleich zwischen BPN' und B. lentus) sind in 2 identifiziert.
  • Diese konservierten Reste können somit verwendet werden, um die entsprechenden äquivalenten Aminosäurereste von Bacillus-amyloliquefaciens-Subtilisin in anderen Carbonylhydrolasen wie Subtilisin aus Bacillus lentus (PCT-Veröffentlichung Nr. WO89/06279 , veröffentlicht am 13. Juli 1989), dem hierin bevorzugten Subtilisin-Vorläuferenzym, oder dem als PB92 bezeichneten Subtilisin ( EP O 328 299 ), das in hohem Maße mit dem bevorzugten Bacillus-lentus-Subtilisin homolog ist, zu bestimmen. Die Aminosäuresequenzen bestimmter dieser Subtilisine sind in den 3A und 3B zusammen mit der Sequenz von Bacillus-amyloliquefaciens-Subtilisin angeordnet, um eine maximale Homologie der konservierten Reste zu erzielen. Wie zu sehen ist, weist die Sequenz von Bacillus-lentus- im Vergleich zu Bacillus-amyloliquefaciens-Subtilisin mehrere Deletionen auf. So ist beispielsweise die äquivalente Aminosäure zu Val165 in Bacillus-amyloliquefaciens-Subtilisin in den anderen Subtilisinen von B. lentus und B. licheniformis Isoleucin.
  • So ist zum Beispiel sowohl in B. -amyloliquefaciens- als auch in B. -lentus-Subtilisin Asparagin (N) die Aminosäure an Position +76. In der bevorzugten Subtilisinvariante, die in der Erfindung geeignet ist, ist die Aminosäure, die zu +76 in Bacillus-amyloliquefaciens-Subtilisin äquivalent ist, jedoch durch Aspartat (D) substituiert. Ein Vergleich aller hierin zur Substitution identifizierten Aminosäurereste mit der bevorzugten Substitution für solche einzelnen Positionen ist in Tabelle II zu Veranschaulichungszwecken aufgeführt. Tabelle II
    +76 +99 +101 +103 +104 +107 +123
    B. amyloliquefaciens (Wildtyp) N D S Q Y I N
    B. lentus (Wildtyp) N S S S V I N
    Bevorzugteste Substitution D D R A I/Y V S
  • Für eine Vorläufer-Carbonylhydrolase, deren Tertiärstruktur durch Röntgenkristallographie bestimmt wurde, können äquivalente Reste auch durch Bestimmung der Homologie auf der Ebene der Tertiärstruktur bestimmt werden. Äquivalente Reste sind als diejenigen definiert, bei denen die Atomkoordinaten von zwei oder mehr der Hauptkettenatome eines bestimmten Aminosäurerests der Vorläufer-Carbonylhydrolase und von Bacillus-amyloliquefaciens-Subtilisin (N auf N, CA auf CA, C auf C und O auf O) nach der Anordnung innerhalb von 0,13 nm und vorzugsweise 0,1 nm liegen. Die Anordnung wird erreicht, nachdem das beste Modell so ausgerichtet und positioniert wurde, dass sich eine maximale Überlappung der Atomkoordinaten von Nichtwasserstoff-Proteinatomen der jeweiligen Carbonylhydrolase mit dem Bacillus-amyloliquefaciens-Subtilisin ergibt. Das beste Modell ist das kristallographische Modell, das den niedrigsten R-Faktor für experimentelle Diffraktionsdaten bei der höchsten verfügbaren Auflösung ergibt.
  • Figure 00160001
  • Äquivalente Reste, die funktionell analog zu einem spezifischen Rest von Bacillus-amyloliquefaciens-Subtilisin sind, sind als diejenigen Aminosäuren der Vorläufer-Carbonylhydrolasen definiert, die eine solche Konformation annehmen können, dass sie Proteinstruktur, Substratbindung oder Katalyse in einer Weise ändern, modifizieren oder dazu beitragen, die für einen spezifischen Rest des Bacillus-amyloliquefaciens-Subtilisins definiert ist und diesem zugeschrieben wird. Ferner sind sie diejenigen Reste der Vorläufer-Carbonylhydrolase (für die eine Tertiärstruktur durch Röntgenkristallographie erhalten wurde), die eine analoge Position in dem Maße einnehmen, dass, obwohl die Hauptkettenatome des bestimmten Rests möglicherweise nicht die Äquivalenzkriterien auf der Grundlage der Einnahme einer homologen Position erfüllen, die Atomkoordinaten von mindestens zwei der Seitenkettenatome des Rests auf 0,13 nm genau mit den entsprechenden Seitenkettenatomen von Bacillus-amyloliquefaciens-Subtilisin übereinstimmen. Die Koordinaten der dreidimensionalen Struktur von Bacillus-amyloliquefaciens-Subtilisin sind in der EPO-Veröffentlichung Nr. 0 251 446 (entspricht der US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 08/212,291 , deren Offenbarung durch Bezugnahme hierin eingeschlossen ist) dargelegt und können wie vorstehend umrissen zur Bestimmung von äquivalenten Resten auf der Ebene der Tertiärstruktur verwendet werden.
  • Einige der für Substitution, Einfügung oder Deletion identifizierten Reste sind konservierte Reste, andere dagegen nicht. Im Falle von Resten, die nicht konserviert sind, ist die Ersetzung einer oder mehrerer Aminosäuren auf Substitutionen beschränkt, die eine Variante mit einer Aminosäuresequenz ergeben, die nicht einer in der Natur vorkommenden entspricht. Im Falle von konservierten Resten sollten solche Ersetzungen nicht zu einer natürlich vorkommenden Sequenz führen. Die in der vorliegenden Erfindung geeigneten Carbonylhydrolasevarianten schließen die reifen Formen von Carbonylhydrolasevarianten sowie die Pro- und Präproformen solcher Hydrolasevarianten ein. Die Präproformen stellen den bevorzugten Aufbau dar, da dies die Expression, Sekretion und Reifung der Carbonylhydrolasevarianten erleichtert.
  • „Prosequenz" bezieht sich auf eine an den N-terminalen Teil der reifen Form einer Carbonylhydrolase gebundene Sequenz von Aminosäuren, deren Entfernung zum Auftreten der „reifen" Form der Carbonylhydrolase führt. Viele proteolytische Enzyme kommen in der Natur als Translations-Proenzymprodukte vor und werden auf diese Weise expressiert, wenn sie nach der Translation nicht verarbeitet werden. Eine bevorzugte Prosequenz für die Bildung von Carbonylhydrolasevarianten, besonders Subtilisinvarianten, ist die mutmaßliche Prosequenz von Bacillus-amyloliquefaciens-Subtilisin, obwohl andere Subtilisin-Prosequenzen verwendet werden können. In den Beispielen wird die mutmaßliche Prosequenz des Subtilisins aus Bacillus lentus (ATCC 21536) verwendet.
  • Eine „Signalsequenz" oder „Präsequenz" bezieht sich auf eine beliebige an den N-terminalen Teil einer Carbonylhydrolase oder an den N-terminalen Teil einer Prohydrolase gebundene Sequenz von Aminosäuren, die an der Sekretion der reifen Form oder der Proform der Hydrolase beteiligt sein kann. Diese Definition von Signalsequenz ist eine funktionelle, die alle diejenigen durch den N-terminalen Teil des Subtilisingens oder anderer sezemierbarer Carbonylhydrolasen kodierten Aminosäuresequenzen einschließen soll, die an der Bewirkung der Sekretion von Subtilisin oder anderen Carbonylhydrolasen unter nativen Bedingungen beteiligt sind. Die für die vorliegende Erfindung geeigneten Proteaseenzyme nutzen solche Sequenzen, um die Sekretion der Carbonylhydrolasevarianten, wie hier beschrieben, zu bewirken. Eine bevorzugte Signalsequenz, die in den Beispielen verwendet wird, umfasst die ersten sieben Aminosäurereste der Signalsequenz von Bacillus-subtilis-Subtilisin, fusioniert mit dem Rest der Signalsequenz des Subtilisins aus Bacillus lentus (ATCC 21536).
  • Eine „Präpro"-Form einer Carbonylhydrolasevariante besteht aus der reifen Form der Hydrolase mit einer Prosequenz, die operabel mit dem Aminoterminus der Hydrolase verbunden ist, und einer „Prä"- oder „Signal"-Sequenz, die operabel mit dem Aminoterminus der Prosequenz verbunden ist.
  • „Expressionsvektor" bezieht sich auf ein DNA-Konstrukt, das eine DNA-Sequenz enthält, die operabel mit einer geeigneten Steuersequenz verbunden ist, die in der Lage ist, die Expression der DNA in einem geeigneten Wirt zu bewirken.
  • Solche Steuersequenzen umfassen einen Promotor zur Bewirkung einer Transkription, eine fakultative Operatorsequenz zur Regulierung der Transkription, eine Sequenz, die geeignete mRNA-Ribosomenbindungsstellen kodiert, und Sequenzen, die das Ende von Transkription und Translation steuern. Der Vektor kann ein Plasmid, ein Phagenpartikel oder einfach ein potenzielles genomisches Insert sein. Sobald der Vektor in einen geeigneten Wirt transformiert wurde, kann er sich replizieren und unabhängig vom Wirtsgenom funktionieren oder sich in einigen Fällen in das Genom selbst integrieren. In der vorliegenden Beschreibung werden „Plasmid" und „Vektor" mitunter austauschbar verwendet, da das Plasmid gegenwärtig die am häufigsten verwendete Vektorform ist. Hierin eingeschlossen sind jedoch solche anderen Formen von Expressionsvektoren, die äquivalente Funktionen erfüllen und die im Stand der Technik bekannt sind oder bekannt werden.
  • Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten „Wirtszellen" sind im Allgemeinen prokaryotische oder eukaryotische Wirte, die vorzugsweise durch die in US-Patent 4,760,025 (RE 34,606) offenbarten Verfahren manipuliert wurden, damit sie keine enzymatisch aktive Endoprotease sezernieren können. Eine bevorzugte Wirtszelle zum Expressieren von Subtilisin ist der Bacillus-Stamm BG2036, der keine enzymatisch aktive neutrale Protease und alkalische Protease (Subtilisin) aufweist. Der Aufbau des Stamms BG2036 ist in US-Patent 5,264,366 ausführlich beschrieben. Andere Wirtszellen zum Expressieren von Subtilisin umfassen Bacillus subtilis I168 (ebenfalls in US-Patent 4,760,025 (RE 34,606) und US-Patent 5,264,366 beschrieben, deren Offenbarungen durch Bezugnahme hierin eingeschlossen sind) sowie einen beliebigen geeigneten Bacillus-Stamm wie B. licheniformis, B. lentus usw.
  • Wirtszellen werden mit Vektoren transformiert oder transfiziert, die mit Hilfe rekombinierter DNA-Techniken konstruiert wurden. Solche transformierten Wirtszellen sind in der Lage, entweder Vektoren zu replizieren, welche die Carbonylhydrolasevarianten kodieren, oder die gewünschte Carbonylhydrolasevariante zu expressieren. Im Falle von Vektoren, welche die Prä- oder Präproform der Carbonylhydrolasevariante kodieren, werden solche Varianten, wenn sie expressiert werden, in der Regel aus der Wirtszelle in das Wirtszellenmedium sezerniert.
  • „Operabel verbunden" bedeutet bei der Beschreibung der Beziehung zwischen zwei DNA-Regionen einfach, dass sie funktionell in Beziehung zueinander stehen. Beispielsweise ist eine Präsequenz operabel mit einem Peptid verbunden, wenn sie als Signalsequenz fungiert, die an der Sekrektion der reifen Form des Proteins beteiligt ist, die höchstwahrscheinlich die Aufspaltung der Signalsequenz einschließt. Ein Promotor ist operabel mit einer Kodierungssequenz verbunden, wenn er die Transkription der Sequenz steuert; eine Ribosomenbindungsstelle ist operabel mit einer Kodierungssequenz verbunden, wenn sie so positioniert ist, dass sie eine Translation erlaubt.
  • Die Gene, welche die natürlich vorkommende Vorläufer-Carbonylhydrolase kodieren, können nach den allgemeinen Verfahren gewonnen werden, die Fachleuten bekannt sind. Die Verfahren umfassen im Allgemeinen das Synthetisieren von markierten Sonden mit mutmaßlichen Sequenzen, welche die Regionen der jeweiligen Hydrolase kodieren, die Herstellung von Genombibliotheken von Organismen, welche die Hydrolase expressieren, und das Screening der Bibliotheken auf das jeweilige Gen durch Hybridisierung an die Sonden. Anschließend werden positiv hybridisierende Klone kartiert und sequenziert. Das in den Beispielen verwendete B.-lentus-Gen wird geklont, wie in Beispiel 1 von US-Patent 5,185,258 beschrieben, dessen Offenbarung hierin eingeschlossen ist. Das in den Beispielen verwendete BPN'-Gen wird geklont, wie in Beispiel 1 in RE 34,606 beschrieben, dessen Offenbarung hierin eingeschlossen ist.
  • Anschließend wird die geklonte Carbonylhydrolase zur Transformation einer Wirtszelle verwendet, um die Hydrolase zu expressieren. Anschließend wird das Hydrolasegen in ein High-copy-number-Plasmid ligiert. Dieses Plasmid repliziert sich in Wirten in dem Sinne, dass es die wohl bekannten Elemente enthält, die zur Plasmidreplikation erforderlich sind: einen operabel mit dem jeweiligen Gen verbundenen Promotor (der, falls er vom Wirt erkannt, d. h. transkribiert, wird, als der eigene homologe Promotor des Gens bereitgestellt werden kann), eine Region für Transkriptionsende und Polyadenylierung (in bestimmten eukaryotischen Wirtszellen für die Stabilität der durch den Wirt aus dem Hydrolasegen transkribierten mRNA erforderlich), die exogen ist oder durch den endogenen Terminatorbereich des Hydrolasegens bereitgestellt wird, und wünschenswerterweise ein Selektionsgen, wie ein Gen für Antibiotikaresistenz, das die kontinuierliche Aufrechterhaltung von Kulturen plasmidinfizierter Wirtszellen durch Wachstum in antibiotikahaltigen Medien ermöglicht. High-copy-number-Plasmide enthalten auch einen Replikationsursprung für den Wirt und ermöglichen dadurch das Erzeugen einer großen Anzahl von Plasmiden im Zytoplasma ohne Chromosomenbeschränkungen. Es liegt jedoch innerhalb des Schutzumfangs hierin, die multiplen Kopien des Hydrolasegens in das Wirtsgenom zu integrieren. Dies wird durch prokaryotische und eukaryotische Organismen erleichtert, die besonders anfällig für homologe Rekombination sind.
  • Die in den vorliegenden Beispielen verwendeten Gene sind ein natürliches B.-lentus-Gen und ein natürliches B.-amyloliquefaciens-Gen. Als Alternative kann ein synthetisches Gen, das eine natürlich vorkommende oder mutante Vorläufer-Carbonylhydrolase (Subtilisin) kodiert, hergestellt werden. Bei einer solchen Herangehensweise wird die DNA- und/oder die Aminosäuresequenz der Vorläuferhydrolase (Subtilisin) bestimmt. Danach werden multiple, überlappende synthetische Einzelstrang-DNA-Fragmente synthetisiert, die bei Hybridisierung und Ligation eine synthetische DNA bilden, welche die Vorläuferhydrolase kodiert. Ein Beispiel für die Konstruktion eines synthetischen Gens ist in Beispiel 3 von US-Patent 5,204,015 dargelegt, dessen Offenbarung durch Bezugnahme hierin eingeschlossen ist.
  • Sobald das natürlich vorkommende oder synthetische Vorläufer-Carbonylhydrolase-Gen geklont wurde, wird eine Reihe von Modifikationen durchgeführt, um die Nutzung des Gens über die Synthese der natürlich vorkommenden Vorläufer-Carbonylhydrolase hinaus zu erweitern. Solche Modifikationen umfassen die Bildung von rekombinierten Carbonylhydrolasen, wie in US-Patent 4,760,025 (RE 34,606) und in der EPO-Veröffentlichung Nr. 0 251 446 offenbart, und die Bildung von hierin beschriebenen Carbonylhydrolasevarianten.
  • Das folgende Kassettenmutagenese-Verfahren kann angewendet werden, um die Konstruktion und Identifikation der in der vorliegenden Erfindung geeigneten Carbonylhydrolasevarianten zu erleichtern, obwohl andere Verfahren, einschließlich ortsgerichteter Mutagenese, angewendet werden können. Zuerst wird das natürlich vorkommende Gen, das die Hydrolase kodiert, gewonnen und ganz oder teilweise sequenziert. Anschließend wird die Sequenz nach einer Stelle abgesucht, an der eine Mutation (Deletion, Einfügung oder Substitution) einer oder mehrerer Aminosäuren in dem kodierten Enzym vorgenommen werden soll. Die Sequenzen, die diese Stelle flankieren, werden auf das Vorhandensein von Restriktionsstellen für das Ersetzen eines kurzen Gensegments durch einen Oligonukleotid-Pool beurteilt, der verschiedene Mutanten kodiert, wenn er expressiert wird. Solche Restriktionsstellen sind vorzugsweise nur einmal vorhandene Stellen innerhalb des Hydrolasegens, um die Ersetzung des Gensegments zu erleichtern. Es kann jedoch eine beliebige geeignete Restriktionsstelle, die nicht in übermäßig hoher Anzahl in dem Hydrolasegen vorhanden ist, verwendet werden, mit der Maßgabe, dass die durch die Restriktionsverdauung erzeugten Genfragmente in der richtigen Sequenz wieder zusammengesetzt werden können. Wenn an Orten innerhalb eines angemessenen Abstands von der ausgewählten Stelle (von 10 bis 15 Nukleotide) keine Restriktionsstellen vorhanden sind, werden solche Stellen erzeugt, indem Nukleotide in dem Gen so substituiert werden, dass in dem endgültigen Aufbau weder der Leserahmen noch die kodierten Aminosäuren geändert werden. Eine Mutation des Gens, um seine Sequenz so zu ändern, dass sie mit der gewünschten Sequenz übereinstimmt, wird durch M13-Primerextension nach allgemein bekannten Verfahren erreicht. Die Aufgabe der Lokalisierung von geeigneten Flankenregionen und der Bewertung der erforderlichen Änderungen, um zwei geeignete Restriktionsstellen-Sequenzen zu finden, wird durch die Redundanz des genetischen Codes, eine Restriktionsenzymkarte des Gens und die große Anzahl verschiedener Restriktionsenzyme zur Routine. Es ist zu beachten, dass für den Fall, dass eine geeignete flankierende Restriktionsstelle verfügbar ist, das vorstehende Verfahren nur in Verbindung mit der Flankenregion angewendet werden muss, die keine Stelle enthält.
  • Sobald die natürlich vorkommende DNA oder die synthetische DNA geklont wurde, werden die Restriktionsstellen, welche die zu mutierenden Positionen flankieren, mit den entsprechenden Restriktionsenzymen verdaut, und eine Vielzahl von zu Endtermini komplementären Oligonukleotidkassetten wird in das Gen ligiert. Die Mutagenese wird durch dieses Verfahren vereinfacht, da alle Oligonukleotide so synthetisiert werden können, dass sie die gleichen Restriktionsstellen aufweisen, und keine synthetischen Linker erforderlich sind, um die Restriktionsstellen zu erzeugen.
  • Wie hier verwendet, ist proteolytische Aktivität als die Geschwindigkeit der Hydrolyse von Peptidbindungen pro Milligramm aktives Enzym definiert. Zur Messung der proteolytischen Aktivität bestehen zahlreiche wohl bekannte Verfahren (K. M. Kalisz, „Microbial Proteinases", Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Hrsg. A. Fiechter, 1988). Zusätzlich oder als Alternative zu modifizierter proteolytischer Aktivität können die Variantenenzyme der vorliegenden Erfindung andere modifizierte Eigenschaften wie Km, Kcat, das Verhältnis Kcat/Km und/oder eine modifizierte Substratspezifität und/oder ein modifiziertes pH-Aktivitätsprofil aufweisen. Diese Enzyme können auf das bestimmte Substrat zugeschnitten werden, das der Erwartung nach vorhanden ist, beispielsweise für hydrolytische Prozesse wie Wäschewaschanwendungen.
  • Eine Aufgabe kann darin liegen, eine Varianten-Carbonylhydrolase zu gewinnen, die eine veränderte proteolytische Aktivität im Vergleich zu der Vorläufer-Carbo nylhydrolase aufweist, da die Erhöhung einer solchen Aktivität (numerisch größer) ermöglicht, dass das Enzym so verwendet wird, dass es an einem Zielsubstrat wirksamer ist. Ebenfalls von Interesse sind Variantenenzyme mit einer veränderten Wärmestabilität und/oder einer veränderten Substratspezifität im Vergleich zum Vorläufer. Vorzugsweise ist die zu mutierende Carbonylhydrolase ein Subtilisin. In den Beispielen werden spezifische Aminosäuren dargestellt, die dazu geeignet sind, solche Ergebnisse bei subtilisinartigen Carbonylhydrolasen an Resten zu erzielen, die zu +76, +99, +101, +103, +104, +107, +123, +27, +105, +109, +126, +128, +135, +156, +166, +195, +197, +204, +206, +210, +216, +217, +218, +222, +260, +265 und/oder +274 oder einer beliebigen Kombination davon in Bacillus-amyloliquefaciens-Subtilisin äquivalent sind. In einigen Fällen kann eine geringere proteolytische Aktivität wünschenswert sein. Dagegen kann es in einigen Fällen wünschenswert sein, die proteolytische Aktivität des Variantenenzyms gegenüber seinem Vorläufer zu erhöhen. Darüber hinaus können Erhöhungen oder Verringerungen (Änderung) der Stabilität der Variante, ob alkalische Stabilität oder Wärmestabilität, wünschenswert sein. Erhöhungen oder Verringerungen von Kcat, Km oder Kcat/Km sind spezifisch für das Substrat, das zur Bestimmung dieser kinetischen Parameter verwendet wird.
  • Außerdem wurde festgestellt, dass zu +76 äquivalente Reste in Kombination mit einer Reihe von anderen Modifikationen in Subtilisin wichtig bei der Modulierung der Gesamtstabilität und/oder der proteolytischen Gesamtaktivität des Enzyms sind. Daher kann, wie in den Beispielen dargelegt, in den bevorzugten Proteaseenzymen das Asparagin (N) in Bacillus-lentus-Subtilisin an der äquivalenten Position +76 durch Aspartat (D) in Kombination mit der Modifikation eines oder mehrerer der folgenden Aminosäurereste +103, +104 substituiert werden, um eine verbesserte Stabilität und/oder eine verbesserte Aktivität des resultierenden Mutantenenzyms zu erzielen.
  • Die am meisten bevorzugten Proteaseenzyme, die in dieser Erfindung geeignet sind, sind in den Beispielen dargelegt. Diese schließen die folgenden spezifischen Kombinationen von substituierten Resten ein: N76D/V104I; N76D/S99D/V104I; N76D/S103A/V104I; N76D/V104I/I107V; N76D/V104Y/I107V und N76D/S101R/S103A/V104I. Diese Substitutionen werden in Bacillus-lentus-Subtilisin (rekombiniert oder nativ) vorgenommen, obwohl die Substitutionen in beliebigem Bacillus-Subtilisin vorgenommen werden können.
  • Auf der Grundlage der mit diesem und anderen Varianten-Subtilisinen erzielten Ergebnisse ist offensichtlich, dass Reste in Carbonylhydrolasen (vorzugsweise Subtilisin), die den Positionen +76, +99, +101, +103, +104, +107, +123, +27, +105, +109, +126, +128, +135, +156, +166, +195, +197, +204, +206, +210, +216, +217, +218, +222, +260, +265 und/oder +274 in Bacillus amyloliquefaciens entsprechen, wichtig für die proteolytische Aktivität, die Leistung und/oder die Stabilität dieser Enzyme und die Reinigungs- oder Waschleistung solcher Variantenenzyme sind.
  • Das Nachfolgende wird als Beispiel für die Herstellung von Proteaseenzymen, die in den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung geeignet sind, aufgeführt.
  • Proteaseherstellungsbeispiel
  • Konstruktion für die Expression des GG36-Gens in B. subtilis
  • Die Klonung und die Konstruktion für die Expression des Subtilisingens aus B. lentus werden im Wesentlichen auf dieselbe Weise durchgeführt wie in US-Patent 5,185,258 beschrieben. Das Plasmid GGA274 (in 4 hierin beschrieben) wird ferner auf die folgende Weise modifiziert, wie in 5 gezeigt. Die PstI-Stelle, die während der Konstruktion des Plasmids GGA274 eingeführt wird, wird durch die nachfolgend beschriebene Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese mit einem Oligonukleotid mit der folgenden Sequenz entfernt: 5' GAAGCTGCAACTCGTTAAA 3' (Seq.-ID Nr. 1). Der unterstrichene Rest „A" eliminiert die Erkennungssequenz des Restriktionsenzyms PstI und ändert den entsprechenden Aminosäurerest an Position 274 von Alanin in Threonin. Threonin an Position 274 ist der Wildtyp-Rest, der ur sprünglich in den geklonten Gensequenzen von B.-lentus-Subtilisin zu finden war. Das DNA-Segment, das Subtilisin kodiert, wird durch EcoRI- und BamHI-Verdau aus dem Plasmid GGA274 oder dessen Derivaten (GGT274 in 5 gezeigt) exzidiert. Das DNA-Fragment wird für die Mutagenese zurück in Vektoren, die auf dem Bakteriophagen M13 basieren, wie MP19, subgeklont. Nach der Mutagenese werden der EcoRI- und der HindIII-Verdau, gefolgt von Klonung, durchgeführt, um das mutierte Subtilisingen wieder in ein Expressionsplasmid wie GGA274 für die Expression und die Wiedergewinnung mutierter Subtilisinproteine zurückzuführen.
  • Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese
  • Eine Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese wird durchgeführt, wie in Zoller, M., et al. (1983), Methods Enzymol., 100: 468-500, beschrieben. Als Beispiel wird ein synthetisches Oligonukleotid mit der Sequenz 5' GCTGCTCTAGACAATTCG 3' (Seq.-ID Nr. 2) verwendet, um den Aminosäurerest an Position 76 von Asparagin (N) in Asparaginsäure (D), oder N76D, zu ändern. Die unterstrichenen Reste „G" und „C" kennzeichnen Änderungen gegenüber der Wildtyp-Gensequenz. CA hält das Leucin an Position +75 und ändert die Aminosäuresequenz, um eine XbaI-Erkennungsregion des XbaI-Restriktionsenzyms (TCTAGA) einzuführen, während durch die Änderung an GAC Asparagin an +76 in Aspartat geändert wird.
  • Für eine Mutagenese an den Positionen 99, 101, 103 und 104 können je nach der gewünschten Kombination von Mutationen verschiedene Oligonukleotide verwendet werden. Beispielsweise wird ein Oligonukleotid mit der Sequenz 5' GTATTAGGGGCGGACGGTCGAGGCGCCATCAGCTCGATT 3' (Seq.-ID Nr. 3) verwendet, um gleichzeitig die folgenden Änderungen vorzunehmen: S99D, S101R, S103A und V104I in einem einzigen Subtilisinmolekül. In ähnlicher Weise werden Oligonukleotide mit der Sequenz 5' TCAGGTTCGGTCTCGAGCGTTGCCCAAGGATTG 3' (Seq.-ID Nr. 4) und 5' CACGTTGCTAGCTTGAGTTTAG 3' (Seq.-ID Nr. 5) verwendet, um I107V bzw. N123S zu erzeugen. Die unterstrichenen Reste kennzeichnen wiederum Änderungen gegenüber den Wildtyp-Sequenzen, durch die gewünschte Änderun gen von Aminosäuresequenzen oder Restriktionsenzym-Erkennungssequenzen erzielt werden.
  • Proteolytische Aktivität von Subtilisinvarianten
  • Unter Befolgung der vorstehenden Verfahren der Oligonukleotid-gerichteten Mutagenese werden die in Tabelle III aufgeführten Varianten hergestellt. Die proteolytische Aktivität dieser einzelnen Subtilisinvarianten ist in Tabelle III angegeben. Die kinetischen Parameter kcat, KM und kcat/KM werden für die Hydrolyse des synthetischen Peptidsubstrats Succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-p-nitroanilid unter Anwendung des Verfahrens gemessen, das in P. Bonneau et al. (1991), J. Am. Chem. Soc., Bd. 113, Nr. 3, S. 1030, beschrieben ist. Kurz gesagt, wird ein kleiner Aliquot der Stammlösung einer Subtilisinvariante in eine 1-cm-Küvette gegeben, die in 0,1 M Tris-HCL-Puffer, pH 8,6, gelöstes und auf 25°C thermostatiertes Substrat enthält. Der Reaktionsfortschritt wird spektralphotometrisch durch Überwachung der Extinktion des Reaktionsprodukts p-Nitroanilin bei 410 nm verfolgt. Die kinetischen Parameter werden unter Anwendung eines Algorithmus für nichtlineare Regression erhalten, um die Reaktionsgeschwindigkeit und die Produktkonzentration für jede Reaktion an die Michaelis-Menten-Gleichung anzupassen. Tabelle III Kinetische Parameter kcat, KM und kcat/KM Gemessen für Bacillus lentus Subtilisin und Varianten
    Protease Nr. Enzymvarianten kcat(s –1) KM(M) kcat/KM (s–1M–1)
    - B.-lentus-Subtilisin 170 0,00078 2,18 × 105
    - N76D 219 0,0008 2,74 × 105
    1 N76D/S99D 88 0,00061 1,44 × 105
    2 N76D/S101R 371 0,0013 2,85 × 105
    3 N76D/S103A 400 0,0014 2,86 × 105
    4 N76D/V104I 459 0,0011 4,17 × 105
    5 N76D/I107V 219 0,0011 1,99 × 105
    6 N76D/N123S 115 0,0018 6,40 × 104
    7 N76D/S99D/S101R 146 0,00038 3,84 × 105
    8 N76D/S99D/S103A 157 0,0012 1,31 × 105
    9 N76D/S99D/V104I 247 0,00097 2,55 × 105
    10 N76D/S101R/S103A 405 0,00069 5,90 × 105
    11 N76D/S101R/V104I 540 0,00049 1,10 × 106
    12 N76D/S103A/V104I 832 0,0016 5,20 × 105
    13 N76D/V104I/I107V 497 0,00045 1,10 × 106
    14 N76D/V104Y/I107V 330 0,00017 1,90 × 106
    15 N76D/V104I/N123S 251 0,0026 9,65 × 104
    16 N76D/I107V/N123S 147 0,0035 4,20 × 104
    17 N76D/S99D/S101R/S103A 242 0,00074 3,27 × 105
    18 N76D/S99D/S101R/V104I 403 0,00072 5,60 × 105
    19 N76D/S99D/S103A/V104I 420 0,0016 2,62 × 105
    20 N76D/S101R/S103A/V104I 731 0,00065 1,12 × 106
    21 N76D/S103A/V104I/N123S 321 0,0026 1,23 × 105
    22 N76D/V104I/I107V/N123S 231 0,003 7,70 × 104
    23 N76D/S99D/S101R/S103A/V104I 624 0,00098 6,37 × 105
    24 N76D/S99D/S103A/V104I/N123S 194 0,0043 4,51 × 104
    25 N76D/S99D/S101R/S103A/V104I/N123S 311 0,0023 1,35 × 105
  • Die in Tabelle III aufgeführten Ergebnisse lassen darauf schließen, dass alle getesteten Subtilisinvarianten proteolytische Aktivität beibehalten. Ferner macht eine detaillierte Analyse der Daten deutlich, dass die proteolytische Aktivität bei Bacillus-lentus-Subtilisin durch die verschiedenen Kombinationen von Substitutionen an Aminosäureresten, die zu den Positionen 76, 99, 101, 103, 104, 107 und 123 in Bacillus amyloliquefaciens äquivalent sind, erheblich verändert wird.
  • Wärmestabilität von Subtilisinvarianten
  • Ein Vergleich der beobachteten Wärmestabilität für Bacillus-lentus-Subtilisin und die Varianten der vorliegenden Erfindung, die durch das vorstehende Verfahren der Oligonukleotid-gerichteten Mutagenese hergestellt wurden, ist in Tabelle IV aufgeführt. Gereinigtes Enzym, 15 μg/ml in 0,1 M Glycin, 0,01% Tween-80, pH 10,0, mit oder ohne 50 mM CaCl2, wird in kleine Röhrchen aliquotiert und bei 10°C 5 Minuten lang, bei 10°C bis 60°C über 1 Minute und bei 60°C 20 Minuten lang inkubiert. Anschließend werden die Röhrchen 10 Minuten lang auf Eis gelegt. Aliquots aus den Röhrchen werden auf Enzymaktivität getestet, indem sie in 1-cm-Küvetten gegeben werden, die 1,2 mM des synthetischen Peptidsubstrats Succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-p-nitroanilid, gelöst in 0,1 M Tris-HCL-Puffer, pH 8,6, thermostatiert auf 25°C, enthalten. Die anfängliche lineare Reaktionsgeschwindigkeit wird spektralphotometrisch durch Überwachung der Extinktion des Reaktionsprodukts p-Nitroanilin bei 410 nm als Funktion der Zeit verfolgt. Die Daten werden als prozentuale Aktivität vor dem Erhitzen angegeben. Die in Tabelle IV aufgeführten Ergebnisse lassen darauf schließen, dass unter der Testbedingung mit Zugabe von 50 mM CaCl2 eine große Mehrzahl von Varianten eine Wärmestabilität zeigt, die mit Bacillus-lentus-Subtilisin vergleichbar ist (24 von 26). Unter der Testbedingung ohne Zugabe von 50 mM CaCl2 ist eine große Mehrzahl von Varianten (19 von 26) wesentlich stabiler als Bacillus-lentus-Subtilisin. Ferner sind unter der Testbedingung ohne Zugabe von 50 mM CaCl2 die Varianten N76D/S99D, N76D/V104I, N76D/S99D/V104I, N76D/S103A/V104I, N76D/V104I/I107V, N76D/V104Y/I107V und N76D/S101R/S103A/V104I wesentlich stabiler als die Einzelsubstitutionsvariante N76D. Tabelle IV Gemessene Wärmestabilität für Bacillus-lentus-Subtilisin und Varianten Bei pH 10, 60°C, +/– Zugabe von 50 mM CaCl2
    Verbleibende anfängliche Aktivität (%)
    Enzym –CaCl, +CaCl,
    B.-lentus-Subtilisin 2 96
    N76D 34 97
    N76D/S99D 49 98
    N76D/S101R 0 82
    N76D/S103A 26 92
    N76D/V104I 58 98
    N76D/I107V 32 96
    N76D/N123S 0 97
    N76D/S99D/S101R 30 100
    N76D/S99D/S103A 36 100
    N76D/S99D/V104I 48 97
    N76D/S101R/S103A 26 100
    N76D/S101R/V104I 38 100
    N76D/S103A/V104I 58 100
    N76D/V104I/I107V 60 97
    N76D/V104Y/I107V 48 74
    N76D/V104I/N123S 0 98
    N76D/I107V/N123S 16 100
    N76D/S99D/S101R/S103A 38 100
    N76D/S99D/S101/V104I 33 100
    N76D/S99D/S103A/V104I 38 98
    N76D/S101R/S103A/V104I 40 99
    N76D/S103A/V104I/N123S 1 98
    N76D/V104I/I107V/N123S 3 99
    N76D/S99D/S101R/S103A/V104I 36 99
    N76D/S99D/S103A/V104I/N123S 2 95
    N76D/S99D/S101R/S103A/V104I/N 123S 0 100
  • Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese mit aus Phagemid erzeugter Einzelstrang-DNA-Vorlage
  • A. Konstruktion von B.-lentus-Varianten
  • Das Mutageneseprotokoll ist im Wesentlichen das gleiche wie vorstehend im Abschnitt über Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese beschrieben. Die Einzelstrang-DNA-Vorlage wird durch das Phagemid-Verfahren erzeugt. Um den Phagemid-Vektor zur Erzeugung der Einzelstrang-DNA-Vorlage zu konstruieren, wird zunächst der Vektor pBCDAICAT konstruiert. Das Flussdiagramm für die Vektorkonstruktion ist in 8 dargestellt. Zuerst wird das ClaI-ClaI-Fragment, welches das CAT-Gen aus dem Plasmid pC194 kodiert (Horinouchi, S., und Weisblum, B., J. Bacteriol., 150: 8-15, 1982) in die AccI-Stelle der Polylinker-Region von pUC19 (New England BioLabs, Beverly, MA) hineingeklont, um das Plasmid pUCCHL herzustellen, und das 0,6-kb-EcoRI-DraI-Fragment aus dem 5'-Ende der GG36DAI-kodierenden DNA wird in die Stellen EcoRI und EcoRV des Plasmids pBSKS (Stratagene, Inc., San Diego, CA) hineingeklont, um pBC2SK5 herzustellen. Die einzelne EcoRI-Stelle des Plasmids pBC2SK5 wird durch EcoRI-Verdauung eliminiert, gefolgt von Auffüllung mit T4-katalysierter DNA-Polymerase und Religation zur Erzeugung des Plasmids pBC2SK-5R, das nicht die EcoRI-Stelle aufweist. Das EcoRI-DraI-Fragment, das in pBCSK-5R hineingeklont wird, wird als ein PstI-HindIII-Fragment isoliert und in die PstI-HindIII-Stelle des pUCCHL (Teil des Polylinkers von pUC19) hineingeklont, um das Plasmid pUCCHL5R zu erzeugen. Die Kodierungssequenz des Gens GG36DAI wird als ein EcoRI-BamHI-Fragment exzidiert und in die EcoRI-BamHI-Stellen von pUCCHL5R hineingeklont, um pUCCAT herzustellen. Anschließend wird das große EcoRI-HindIII-Fragment von pUCCAT in die Stellen EcoRI und HindIII von BS2KS+ hineingeklont, um das Plasmid pBCDAICAT herzustellen.
  • Um Einzelstrang-DNA zu erzeugen, werden E.-coli-haltige pBCDAICAT nach dem Protokoll, das in Russel, M., Kidd, S., und Kelley, M. R., GENE 45: 333-338, 1986, beschrieben ist, mit dem Phagen R408 (erhältlich von Stratagene, San Diego, CA) infiziert. Sobald die Einzelstrang-DNA-Vorlage verfügbar ist, werden Standard-Mutageneseverfahren, wie vorstehend im Abschnitt über Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese beschrieben, durchgeführt. Die Konstruktion bestimmter Mutanten wird nachfolgend zu Veranschaulichungszwecken ausführlich beschrieben.
  • Für die Konstruktion von B. lentus (GG36) N76D/S103A/V104I/L217H wird ein EcoRI-BamHI-DNA-Fragment, das GG36 N76D/S103A/V104I kodiert, bei der Konstruktion von pUCCAT (siehe 8) zur Erzeugung des Plasmids pBCDAICAT verwendet. Nachdem die Einzelstrang-DNA-Vorlage nach dem vorstehend beschriebenen Protokoll hergestellt wurde, wird ein Mutagenese-Primer mit der folgenden Sequenz
    * *** ** x ClaI
    5' TAT GCC AGC CAC AAC GGT Ad T TCG ATG GCT 3' (Seq.-ID Nr. 13)
    verwendet, um L217H herzustellen. Wie zuvor kennzeichnen die unterstrichenen Reste die Nukleotidänderungen, die vorgenommen werden, und x ClaI weist daraufhin, dass die bestehende ClaI-Stelle nach der Mutagenese eliminiert wird. Das Mutageneseprotokoll entspricht dem vorstehend im Abschnitt über Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese beschriebenen. Nach der Mutagenese wird zunächst Plasmid-DNA auf die Eliminierung der ClaI-Stelle hin gescreent, und diejenigen Klone, bei denen die ClaI-Stelle fehlt, werden einer DNA-Sequenzanalyse unterzogen, um die DNA-Sequenz, welche die Änderung von L in H am 217. Aminosäurerest bewirkt hat, zu überprüfen.
  • B. Konstruktion von BPN'-Varianten und ihre Expression in B. subtilis
  • Die Konstruktion von B. amyloliquefaciens (BPN') N76D/Q103A/Y104I/Y217L wird in ähnlicher Weise durchgeführt, außer dass sie in zwei aufeinander folgenden Schritten erfolgt. Zuerst wird N76D in BPN' Y217L eingeführt, um BPN' N76D/Y217L herzustellen, und eine zweite Mutagenese wird durchgeführt, um BPN' N76D/Y217L in BPN' N76D/Q103A/Y104I/Y217L umzuwandeln. Zur Erzeugung der Einzelstrang-DNA-Vorlage für die erste Mutagenese wird ein EcoRI-BamHI-Fragment, das BPN' Y217L-Subtilisin kodiert (abgeleitet aus dem Y217L-Plasmid, das in Wells, J., et al., PNAS, 84, 5167, 1087, beschrieben ist), verwendet, um ein Plasmid pUCCATFNA zu konstruieren (siehe 9). Das Plasmid pUCCATFNA, das BPN' Y217L enthält, wird zur Konstruktion des Plasmids pBCFNACAT verwendet (9). Einzelstrang-DNA wird erzeugt, wie vorstehend beschrieben. Um BPN' N76D/Y217L zu erzeugen, wird ein Oligonukleotid-Primer mit der Sequenz
    * *** ** XbaI
    5' C ACA GTT GCG GCT CTA GAT AAC TCA ATC GGT G 3' (Seq.-ID Nr. 14)
    verwendet, um die Änderung N76D zu erzeugen. Anschließend wird Einzelstrang-DNA aus dem Plasmid pBCFNACAT, welches das BPN' N76D/Y217L enthält (das Plasmid pBCFNACAT nach N76D-Mutagenese) hergestellt und mit einem anderen Oligonukleotid mit der Sequenz
    * *** ** x PvuII
    5' GCT GAC GGT TCC GGC GCT ATT AGT TGG ATC ATT 3' (Seq.-ID Nr. 15)
    mutagenisiert, um BPN' N76D/Q103A/Y104I/Y217L zu erhalten. Alle Schritte, die in die Klonung, die Herstellung von Einzelstrang-DNA, die Mutagenese und das Screening auf Mutanten eingeschlossen sind, werden wie vorstehend beschrieben durchgeführt. Die Expression des BPN'-Gens und seiner Varianten wird erreicht, indem Plasmid-DNA (pBCFNACAT, die das BPN'-Gen der verschiedenen Varianten enthält) direkt in einen proteasearmen Stamm von Bacillus subtilis integriert wird, wie in RE 34,606 beschrieben.
  • Zahlreiche Varianten werden gemäß den Lehren dieser Beispiele für die Proteaseherstellung hergestellt. Kinetische Daten und Stabilitätsdaten werden für solche Varianten generiert. Die kinetischen Daten werden unter Anwendung der vorstehend beschriebenen Verfahren generiert und sind in Tabelle V aufgeführt. Die Stabilitätsdaten werden generiert, wie hierin ausführlich beschrieben. Die Ergebnisse sind in Tabelle VI aufgeführt.
  • Wärmestabilitätstest-Verfahren
  • Gereinigtes Enzym wird einem Pufferaustausch in 0,1 M Glycin, pH 10,0, 0,01% Tween-80 unterzogen, indem das Enzym in eine Säule aus Sephadex G-25, das mit diesem Puffer äquilibriert ist, gegeben und unter Verwendung desselben Puffers aus der Säule eluiert wird.
  • Das einem Pufferaustausch unterzogene Enzym wird in ein Röhrchen gegeben, das 0,1 M Glycin, 0,01% Tween-80, pH 10,0, thermostatiert auf 60°C, enthält, um eine endgültige Enzymkonzentration von 15 μg/ml zu ergeben.
  • Aliquots werden zu verschiedenen Zeitpunkten aus der 60°C-Inkubation entfernt und sofort auf Enzymaktivität getestet, indem sie in eine 1-cm-Küvette gegeben werden, die 1,2 mM des synthetischen Peptidsubstrats Succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-p-nitroanilid, gelöst in 0,1 M Tris-HCL-Puffer, pH 8,6, thermostatiert auf 25°C, enthält. Die anfängliche lineare Reaktionsgeschwindigkeit wird spektralphotometrisch durch Überwachung der Extinktion des Reaktionsprodukts p-Nitroanilin bei 410 nm als Funktion der Zeit verfolgt.
  • Die Halbwertszeit, bei der es sich um die Zeitdauer handelt, die für eine 50%ige Enzymdeaktivierung erforderlich ist, wird anhand des Diagramms erster Ordnung der Reaktionsgeschwindigkeit als Funktion der Inkubationszeit bei 60°C bestimmt.
  • Die Daten sind in Tabelle VI als Prozentsatz der Halbwertszeit aufgeführt, die für Bacillus-lentus-Subtilisin (GG36) unter identischen Bedingungen bestimmt wurde. Tabelle V
    Enzym kcat (s–1) KM (mM) kcat/kM (s–1M–1)
    B.-lentus-Subtilisin 170 0,78 2,20E + 05
    N76D/S103G/V104I* 380 1,4 2,70E + 05
    N76D/S103A/V104F 730 0,33 2,20E + 06
    N76D/S103A/V104N 790 2,8 2,80E + 05
    N76D/S103A/V104S 170 0,83 2,00E + 05
    N76D/S103A/V104T 370 1,9 2,00E + 05
    N76D/S103A/V104W 880 0,31 2,80E + 06
    N76D/S103A/V104Y 690 0,5 1,40E + 06
    K27R/N76D/V104Y/N123S 500 1,2 4,20E + 05
    N76D/S101G/S103A/V104I* 620 1,3 4,80E + 05
    N76D/S103A/V104I/S105A* 550 1,3 4,20E + 05
    N76D/S103A/V104I/S105D* 440 1,7 2,60E + 05
    N76D/S103A/V104T/I107A* 120 5,7 2,10E + 04
    N76D/S103A/V104T/I107L* 310 3,2 9,70E + 04
    N76D/S103A/V104I/L126A 90 2,2 4,10E + 04
    N76D/S103A/V104I/L126F 180 1,9 9,50E + 04
    N76D/S103A/V104I/L126I 100 2,4 4,20E + 04
    N76D/S103A/V104I/L126V 64 3,2 2,00E + 04
    N76D/S103A/V104I/S128G* 560 1,7 3,30E + 05
    N76D/S103A/V104I/S128L* 430 3,8 1,10E + 05
    N76D/S103A/V104I/L135A 140 0,76 1,80E + 05
    N76D/S103A/V104I/L135F 390 0,69 5,70E + 05
    N76D/S103A/V104I/L135I 110 0,73 1,50E + 05
    N76D/S103A/V104I/L135V 140 0,86 1,60E + 05
    N76D/S103A/V104I/S156E* 170 2,6 6,50E + 04
    N76D/S103A/V104I/S166D* 160 3,5 4,60E + 04
    N76D/S103A/V104I/D197E 510 1,4 3,60E + 05
    N76D/S103A/V104I/N204A* 530 1,1 4,80E + 05
    N76D/S103A/V104I/N204G* 580 1,4 4,10E + 05
    N76D/S103A/V104I/N204C* 370 1,3 2,90E + 05
    N76D/S103A/V104I/P210I* 500 1,2 4,20E + 05
    N76D/S103A/V104I/L217H* 80 0,63 1,30E + 05
    N76D/S103A/V104I/M222A 70 3,1 2,30E + 04
    N76D/S103A/V104I/M222S 80 3,1 2,60E + 04
    N76D/S103A/V104I/T260P 660 1,5 4,40E + 05
    N76D/S103A/V104I/S265N 590 1,3 4,50E + 05
    K27R/N76D/V104Y/I107V/N123S 220 1,4 1,60E + 05
    K27R/N76D/V104V/N123S/D197E 430 1,1 3,90E + 05
    K27R/N76D/V104Y/N123S/N204C 400 1,1 3,60E + 05
    K27R/N76D/V104V/N123S/Q206L 440 1,2 3,70E + 05
    K27R/N76D/V104Y/N123S/S216V 440 1,2 3,70E + 05
    K27R/N76D/V104V/N123S/N218S 760 0,98 7,80E + 05
    K27R/N76D/V104V/N123S/T260P 410 1,2 3,40E + 05
    K27R/N76D/V104V/N123S/T274A 390 1 3,90E + 05
    N76D/S103A/V104I/L126F/S265N 170 2,1 8,10E + 04
    N76D/S103A/V104I/S156E/S 166D* 40 6,3 6,40E + 03
    K27R/N76D/V104V/N123S/G195E/G197E 410 0,98 4,20E + 05
    K27R/N76D/V104V/N123S/G195E/N218S 540 0,66 8,20E + 05
    K27R/N76D/V104Y/N123S/D197E/N218S 770 0,79 9,80E + 05
    K27R/N76D/V104Y/N123S/N204C/N218S 610 0,99 6,20E + 05
    K27R/N76D/V104Y/N123S/Q206L/N218S 580 0,78 7,40E + 05
    K27R/N76D/V104Y/N123S/N218S/T260P 660 1 6,60E + 05
    K27R/N76D/V104Y/N123S/N218S/T274A 590 0,89 6,60E + 05
    K27R/N76D/V104Y/Q109S/N 123S/N218S/T274A 520 1 5,20E + 05
    K27R/N76D/V104Y/N123S/G195E/D197E/N218S 460 0,65 7,10E + 05
    B.-amyloliquefaciens-Subtilisin (BPN') 50 0,14 3,60E + 05
    BPN'-N76D/Y217L* 380 0,46 8,30E + 05
    • * Diese Mutanten werden gemäß Oligonukleotid-gerichteter Mutagenese mit aus Phagemid erzeugter Einzelstrang-DNA-Vorlage hergestellt, alle anderen werden gemäß vorstehender Oligonukleotid-gerichteter Mutagenese hergestellt.
    Tabelle VI
    Enzym Wärmestabilität (Halbwertszeit des nativen Enzyms in %)
    B.-lentus-Subtilisin 100
    N76D 590
    N76D/S99D 840
    N76D/S103A 390
    N76D/V104I 660
    N76D/I107V 710
    N76D/N123S 70
    N76D/S99D/S101R 610
    N76D/S99D/S103A 590
    N76D/S99D/V104I 910
    N76D/S101R/S103A 930
    N76D/S101R/V104I 500
    N76D/S103A/V104I 460
    N76D/S103G/V104I* 370
    N76D/S103A/V104F 480
    N76D/S103A/V104N 230
    N76D/S103A/V104S 230
    N76D/S103A/V104T 370
    N76D/S103A/V104W 280
    N76D/S103A/V104Y 400
    N76D/V104I/I107V 940
    N76D/V104Y/I107V 820
    N76D/V104I/N123S 80
    N76D/I107V/N123S 150
    K27R/N76D/V104Y/N123S 100
    N76D/S99D/S101R/S103A 570
    N76D/S99D/S101R/V104I 1000
    N76D/S99D/S103A/V104I 680
    N76D/S101G/S103A/V104I* 390
    N76D/S101R/S103A/V104I 470
    N76D/S103A/V104I/S105A* 360
    N76D/S103A/V104I/S105D* 370
    N76D/S103A/V104T/I107A* 270
    N76D/S103A/V104T/I107L* 230
    N76D/S103A/V104I/N123S 110
    N76D/V104I/I107V/N123S 220
    N76D/S103A/V104I/L126A 270
    N76D/S103A/V104I/L126F 950
    N76D/S103A/V104I/L1261 410
    N76D/S103A/V104I/L126V 320
    N76D/S103A/V104I/S128G * 640
    N76D/S103A/V104I/S128L* 760
    N76D/S103A/V104I/L135A 230
    N76D/S103A/V104I/L135F 200
    N76D/S103A/V104I/L135I 510
    N76D/S103A/V104I/L135V 500
    N76D/S103A/V104I/S156E* 120
    N76D/S103A/V104I/S166D* 590
    N76D/S103A/V104I/D197E 460
    N76D/S103A/V104I/N204A* 230
    N76D/S103A/V104I/N204G* 240
    N76D/S103A/V104I/N204C* 500
    N76D/S103A/V104I/P210I* 1370
    N76D/S103A/V104I/L217H* 60
    N76D/S103A/V104I/M222A 520
    N76D/S103A/V104I/M222S 490
    N76D/S103A/V104I/T260P 490
    N76D/S103A/V104I/S265N 360
    K27R/N76D/V104Y/I107V/N123S 210
    K27R/N76D/V104Y/N123S/D197E 120
    K27R/N76D/V104Y/N123S/N204C 110
    K27R/N76D/V104Y/N123S/Q206L 380
    K27R/N76D/V104Y/N123S/S216V 140
    IC27R/N76D/V104Y/N123S/N218S 270
    K27R/N76D/V104V/N123S/T260P 40
    K27R/N76D/V104Y/N123S/T274A 60
    N76D/S99D/S101R/S103A/V104I 590
    N76D/S99D/S103A/V104I/N123S 110
    N76D/S103A/V104I/L126F/S265N 810
    N76D/S103A/V104I/S156E/S166D* 220
    K27R/N76D/V104Y/N123S/G195E/G197E 90
    K27R/N76D/V104Y/N123S/G195E/N218S 250
    K27R/N76D/V104Y/N123S/D197E/N218S 270
    K27R/N76D/V104Y/N123S/N204C/N218S 460
    K27R/N76D/V104Y/N123S/Q206L/N218S 1400
    K27R/N76D/V104Y/N123S/N218S/T260P 310
    IC27R/N76D/V104Y/N123S/N218S/T274A 180
    N76D/S99D/S101R/S103A/V104I/N123S 90
    K27R/N76D/V104Y/Q109S/N123S/N218S/T274A 230
    K27R/N76D/V104Y/N123S/G195E/D197E/N218S 240
    B.-amyloliquefaciens-Subtilisin (BPN') 100
    BPN'-N76D/Y217L* 420
    • * Diese Mutanten werden gemäß Oligonukleotid-gerichteter Mutagenese mit aus Phagemid erzeugter Einzelstrang-DNA-Vorlage hergestellt, alle anderen werden gemäß vorstehender Oligonukleotid-gerichteter Mutagenese hergestellt.
  • 2. Reinigungszusammensetzungsmaterialien:
  • Die Reinigungszusammensetzungen der vorliegenden Erfindung umfassen außerdem zusätzlich zu dem vorstehend beschriebenen Proteaseenzym ein oder mehrere mit dem Proteaseenzym verträgliche Reinigungszusammensetzungsmaterialien. Der Ausdruck „Reinigungszusammensetzungsmaterialien", wie hier verwendet, bedeutet ein beliebiges flüssiges, festes oder gasförmiges Material, das für die gewünschte bestimmte Art von Reinigungszusammensetzung und die Form des Produkts (z. B. Flüssigkeit, Granalie, Sprühzusammensetzung) ausgewählt wird, wobei die Materialien auch mit dem in der Zusammensetzung verwendeten Proteaseenzym verträglich sind. Die spezifische Auswahl von Reinigungszusammensetzungsmaterialien erfolgt auf einfache Weise, indem die zu reinigende Oberfläche oder der zu reinigende Gegenstand oder textile Stoff und die gewünschte Form der Zusammensetzung für die Reinigungsbedingungen während der Verwendung (z. B. während der Waschmittelverwendung) berücksichtigt werden. Der Ausdruck „verträglich", wie hier verwendet, bedeutet, dass die Reinigungszusammensetzungsmaterialien die proteolytische Aktivität des Proteaseenzyms nicht in einem solchen Maße verringern, dass die Protease in Situationen des normalen Gebrauchs nicht wie gewünscht wirksam ist. Spezifische Reinigungszusammensetzungsmaterialien sind nachfolgend ausführlich beispielhaft beschrieben.
  • Eine wirksame Menge eines oder mehrerer der vorstehend beschriebenen Proteaseenzyme ist in Zusammensetzungen eingeschlossen, die zum Reinigen einer Vielfalt an Oberflächen geeignet ist, bei denen proteinhaltige Flecken entfernt werden müssen. Solche Reinigungszusammensetzungen umfassen Reinigungsmittelzusammensetzungen zum Reinigen harter Oberflächen in uneingeschränkter Form (z. B. flüssig und granulös), Waschmittelzusammensetzungen zum Reinigen von Textilien in uneingeschränkter Form (z. B. granulöse, flüssige und stückförmige Formulierungen), Geschirrspülzusammensetzungen (in uneingeschränkter Form), Mundreinigungszusammensetzungen in uneingeschränkter Form (z. B. Zahncreme-, Zahnpasta- und Mundspülformulierungen) und Zahnprothesenreinigungszusammensetzungen in uneingeschränkter Form (z. B. Flüssigkeit, Tablette). Wie hier verwendet, bezieht sich „wirksame Menge an Proteaseenzym" auf die Menge an vorstehend beschriebenem Proteaseenzym, die erforderlich ist, um die in der spezifischen Reinigungszusammensetzung erforderliche enzymatische Aktivität zu erzielen. Solche wirksamen Mengen werden vom Fachmann ohne weiteres ermittelt und basieren auf zahlreichen Faktoren, wie der verwendeten speziellen Enzymvariante, der Reinigungsanwendung, der spezifischen Zusammensetzung der Reinigungszusammensetzung und darauf, ob eine flüssige oder trockene (z. B. granulöse, stückförmige) Zusammensetzung benötigt wird, und dergleichen.
  • Vorzugsweise umfassen die Reinigungszusammensetzungen der vorliegenden Erfindung von etwa 0,0001% bis etwa 10% ein oder mehrere Proteaseenzyme, mehr bevorzugt von etwa 0,001% bis etwa 1%, noch mehr bevorzugt von etwa 0,001% bis etwa 0,1%. Mehrere Beispiele für verschiedene Reinigungszusammensetzungen, in denen die Proteaseenzyme eingesetzt werden können, werden nachfolgend ausführlicher besprochen. Alle hierin verwendeten Anteile, Prozentangaben und Verhältnisse sind auf das Gewicht bezogen, sofern nicht anders angegeben.
  • Wie hier verwendet, umfassen „Reinigungszusammensetzungen für andere Oberflächen als Textilien" Reinigungszusammensetzungen für harte Oberflächen, Geschirrspülzusammensetzungen, Mundreinigungszusammensetzungen, Zahnprothesenreinigungszusammensetzungen und Körperreinigungszusammensetzungen.
  • A. Reinigungszusammensetzungen für harte Oberflächen, Geschirr und Textilien
  • Die Proteaseenzyme können in einer beliebigen Reinigungsmittelzusammensetzung verwendet werden, bei der eine starke Schäumung und/oder eine gute Entfernung von unlöslichem Substrat gewünscht werden. Somit können die Proteaseenzyme mit verschiedenen herkömmlichen Bestandteilen verwendet werden, um vollständig formulierte Reiniger für harte Oberflächen, Geschirrspülzusammensetzungen, Zusammensetzungen zum Waschen von Textilien und dergleichen bereitzustellen. Solche Zusammensetzungen können in Form von Flüssigkeiten, Granalien, Stückformen und dergleichen vorliegen. Solche Zusammensetzungen können als moderne „konzentrierte" Reinigungsmittel, die eine so hohe Menge wie 30 Gew.-% bis 60 Gew.-% Tenside enthalten, formuliert werden.
  • Die vorliegenden Reinigungszusammensetzungen können wahlweise, und vorzugsweise, verschiedene anionische, nichtionische, zwitterionische usw. Tenside enthalten. Solche Tenside sind typischerweise in Konzentrationen von etwa 0,1% bis etwa 60%, vorzugsweise von etwa 1% bis etwa 35% der Zusammensetzungen vorhanden.
  • Nichteinschränkende Beispiele für hierin geeignete Tenside umfassen die herkömmlichen C11-C18-Alkylbenzolsulfonate und primären und statistischen Alkylsulfate, die sekundären (2,3) C10-C18-Alkylsulfate der Formeln CH3(CH2)x(CHOSO3)–M+)CH3 und CH3(CH2)y(CHOSO3 –M+) CH2CH3, worin x und (y + 1) ganze Zahlen von mindestens etwa 7, vorzugsweise mindestens etwa 9 sind und M ein wasserlöslich machendes Kation, besonders Natrium, ist, die C10-C18-Alkylalkoxysulfate (besonders EO 1-7-Ethoxysulfate), C10-C18-Alkylalkoxycarboxylate (besonders die EO 1-7-Ethoxycarboxylate), die C10-C18-Alkylpolyglycoside und ihre entsprechenden sulfatierten Polyglycoside, alphasulfonierte C12-C18-Fettsäureester, C12-C18-Alkyl- und -Alkylphenolalkoxylate (besonders Ethoxylate und gemischtes Ethoxy/Propoxy), C12-C18-Betaine und -Sulfobetaine („Sultaine"), C10-C18-Aminoxide, C8-C24-Sarcosinate (besonders Oleoylsarcosinat) und dergleichen. Die Alkylalkoxysulfate (AES) und Alkylalkoxycarboxylate (ABC) sind hierin bevorzugt. (Die Verwendung solcher Tenside in Kombination mit den oben erwähnten Aminoxid- und/oder Betain- oder Sultaintensiden ist je nach den Wünschen des Herstellers ebenfalls bevorzugt.) Andere herkömmliche geeignete Tenside sind in Standardtexten aufgeführt. Besonders geeignete Tenside schließen die C10-C18-N-Methylglucamide ein, die in US-Patent 5,194,639 , Connor et al., erteilt am 16. März 1993, durch Bezugnahme hierin eingeschlossen, offenbart sind.
  • Besonders geeignet ist die Klasse der nichtionischen Tenside, die Kondensate von Ethylenoxid mit einer hydrophoben Einheit sind, um ein Tensid mit einem durchschnittlichen Hydrophil-Lipophil-Gleichgewicht (HLB) im Bereich von 5 bis 17, vorzugsweise von 6 bis 14, mehr bevorzugt von 7 bis 12 bereitzustellen. Die hydrophobe (lipophile) Einheit kann aliphatische oder aromatische Eigenschaften aufweisen, und die Länge der Polyoxyethylengruppe, die mit einer beliebigen bestimmten hydrophoben Gruppe kondensiert wird, kann ohne weiteres eingestellt werden, um eine wasserlösliche Verbindung mit dem gewünschten Maß an Gleichgewicht zwischen hydrophilen und hydrophoben Elementen zu ergeben. Besonders bevorzugt sind die primären C9-C15-Alkoholethoxylate (oder gemischtes Ethoxy/Propoxy) mit 3-8 Mol Ethylenoxid pro Mol Alkohol, besonders die primären C14-C15-Alkohole mit 6-8 Mol Ethylenoxid pro Mol Alkohol, die primären C12-C15-Alkohole mit 3-5 Mol Ethylenoxid pro Mol Alkohol und Mischungen davon.
  • Eine große Vielfalt an anderen Bestandteilen, die in Reinigungsmittelzusammensetzungen geeignet sind, können in die vorliegenden Zusammensetzungen eingeschlossen werden, einschließlich anderer aktiver Bestandteile, Träger, hydrotroper Verbindungen, Verarbeitungshilfsmittel, Farbstoffe oder Pigmente, Lösungsmittel für flüssige Formulierungen usw. Wenn eine weitere Zunahme der Schäumung gewünscht wird, können Schaumverstärker wie die C10-C16-Alkolamide in die Zusammensetzungen eingeschlossen werden, typischerweise in Konzentrationen von etwa 1% bis etwa 10%. Die C10-C14-Monoethanol- und -Diethanolamide veranschaulichen eine typische Klasse solcher Schaumverstärker. Die Verwendung solcher Schaumverstärker mit stark schäumenden Zusatztensiden wie den oben genannten Aminoxiden, Betainen und Sultainen ist ebenfalls vorteilhaft. Falls gewünscht, können lösliche Magnesiumsalze wie MgCl2, MgSO4 und dergleichen in Konzentrationen von typischerweise von etwa 0,1% bis etwa 2% hinzugegeben werden, um für zusätzliche Schäumung zu sorgen.
  • Die vorliegenden flüssigen Reinigungsmittelzusammensetzungen können Wasser und andere Lösungsmittel als Träger enthalten. Niedermolekulare primäre oder sekundäre Alkohole, für die Methanol, Ethanol, Propanol und Isopropanol Beispiele sind, sind geeignet. Einwertige Alkohole werden für lösungsvermittelnde Tenside bevorzugt, jedoch können Polyole, wie diejenigen mit etwa 2 bis etwa 6 Kohlenstoffatomen und etwa 2 bis etwa 6 Hydroxygruppen (z. B. 1,3-Propandiol, Ethylenglycol, Glycerin und 1,2-Propandiol), ebenfalls verwendet werden. Die Zusammensetzungen können von etwa 5% bis etwa 90%, typischerweise von etwa 10% bis etwa 50% solche Träger enthalten.
  • Die vorliegenden Reinigungsmittelzusammensetzungen werden vorzugsweise so formuliert, dass während des Gebrauchs in wässrigen Reinigungsvorgängen das Waschwasser einen pH-Wert zwischen etwa 6,8 und etwa 11,0 aufweist. Endprodukte werden daher in der Regel in diesem Bereich formuliert. Verfahren zum Regulieren des pH-Werts bei empfohlenen Gebrauchskonzentrationen schließen die Verwendung von Puffer, Alkalien, Säuren usw. ein und sind Fachleuten wohl bekannt.
  • Beim Formulieren der Reinigungszusammensetzungen für harte Oberflächen und Textilreinigungszusammensetzungen der vorliegenden Erfindung kann der Hersteller nach Belieben verschiedene Builder in Konzentrationen von etwa 5 Gew.-% bis etwa 50 Gew.-% einsetzen. Typische Builder schließen die Zeolithe von 1-10 Mikrometern, Polycarboxylate wie Citrat und Oxydisuccinate, Schichtsilicate, Phosphate und dergleichen ein. Andere herkömmliche Builder sind in Standard-Formelbüchern aufgeführt.
  • Ebenso kann der Hersteller nach Belieben verschiedene zusätzliche Enzyme wie Cellulasen, Lipasen, Amylasen, Peroxidasen und Proteasen in solchen Zusammensetzungen einsetzen, typischerweise in Konzentrationen von etwa 0,001 Gew.-% bis etwa 1 Gew.-%. Verschiedene Reinigungs- und Textilpflegeenzyme sind im Stand der Technik für Wäschewaschmittel wohl bekannt.
  • Verschiedene Bleichmittelverbindungen, wie die Percarbonate, Perborate und dergleichen, können in solchen Zusammensetzungen verwendet werden, typischerweise in Konzentrationen von etwa 1 Gew.-% bis etwa 15 Gew.-%. Falls gewünscht, können solche Zusammensetzungen auch Bleichaktivatoren wie Tetraacetylethylendiamin, Nonanoyloxybenzolsulfonat und dergleichen enthalten, die ebenfalls im Stand der Technik bekannt sind. Die Gebrauchskonzentrationen liegen in der Regel im Bereich von etwa 1 Gew.-% bis etwa 10 Gew.-%.
  • Verschiedene Schmutzabweisemittel, besonders vom anionischen Oligoester-Typ, verschiedene Chelatbildner, besonders die Aminophosphonate und Ethylendiamindisuccinate, verschiedene Tonschmutzentfernungsmittel, besonders ethoxyliertes Tetraethylenpentamin, verschiedene Dispergiermittel, besonders Polyacrylate und Polyaspartate, verschiedene Aufheller, besonders anionische Aufheller, verschiedene Farbstoffübertragungshemmer, wie Polyvinylpyrrolidon, verschiedene Schaumunterdrücker, besonders Silikone und sekundäre Alkohole, verschiedene Textilweichmacher, besonders Smectittone und Tonflockungspolymere (z. B. Poly(oxyethylen)) und dergleichen können alle in Konzentrationen im Bereich von etwa 1 Gew.-% bis etwa 35 Gew.-% in solchen Zusammensetzungen verwendet werden. Standard-Formelbücher und veröffentlichte Patente enthalten viele ausführliche Beschreibungen solcher herkömmlichen Materialien.
  • Enzymstabilisatoren können in den Reinigungszusammensetzungen der vorliegenden Erfindung ebenfalls verwendet werden. Solche Enzymstabilisatoren umfassen Propylenglycol (vorzugsweise von etwa 1% bis etwa 10%), Natriumformiat (vorzugsweise von etwa 0,1% bis etwa 1%) und Calciumformiat (vorzugsweise von etwa 0,1% bis etwa 1%).
  • 1. Reinigungszusammensetzungen für harte Oberflächen
  • Wie hier verwendet, bezieht sich „Reinigungszusammensetzung für harte Oberflächen" auf flüssige und granulöse Reinigungsmittelzusammensetzungen zur Reinigung harter Oberflächen wie Fußböden, Wänden, Badezimmerfliesen und dergleichen. Erfindungsgemäße Reinigungszusammensetzungen für harte Oberflächen umfassen eine wirksame Menge eines oder mehrerer Proteaseenzyme, vorzugsweise von etwa 0,0001 Gew.-% bis etwa 10 Gew.-%, mehr bevorzugt von etwa 0,001 Gew.-% bis etwa 5 Gew.-%, noch mehr bevorzugt von etwa 0,001 Gew.-% bis etwa 1 Gew.-% der Zusammensetzung aktives Proteaseenzym. Zusätzlich dazu, dass sie ein oder mehrere Proteaseenzyme umfassen, umfassen solche Reinigungszusammensetzungen für harte Oberflächen in der Regel ein Tensid und einen wasserlöslichen maskierenden Builder. In bestimmten Spezialprodukten wie Scheibenreinigersprays werden die Tenside jedoch mitunter nicht verwendet, da sie einen film-/streifenartigen Rückstand auf der Glasoberfläche erzeugen können.
  • Der Tensidbestandteil, wenn vorhanden, kann eine so geringe Menge wie 0,1% der vorliegenden Zusammensetzungen umfassen, jedoch enthalten die Zusammensetzungen in der Regel von etwa 0,25% bis etwa 10%, mehr bevorzugt von etwa 1% bis etwa 5% Tensid.
  • In der Regel enthalten die Zusammensetzungen von etwa 0,5% bis etwa 50% einen Reinigungsbuilder, vorzugsweise von etwa 1% bis etwa 10%. Der pH-Wert sollte vorzugsweise im Bereich von etwa 8 bis 12 liegen. Herkömmliche pH-Wert-Regler wie Natriumhydroxid, Natriumcarbonat oder Salzsäure können verwendet werden, wenn eine Einstellung notwendig ist.
  • Lösungsmittel können in die Zusammensetzungen eingeschlossen werden. Geeignete Lösungsmittel umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Glycolether, wie Diethylenglycolmonohexylether, Diethylenglycolmonobutylether, Ethylenglycolmonobutylether, Ethylenglycolmonohexylether, Propylenglycolmonobutylether, Dipropylenglycolmonobutylether, und Diole, wie 2,2,4-Trimethyl-1,3-pentandiol und 2-Ethyl-1,3-hexandiol. Wenn solche Lösungsmittel verwendet werden, sind sie in der Regel in Konzentrationen von etwa 0,5% bis etwa 15%, vorzugsweise von etwa 3% bis etwa 11% vorhanden.
  • Außerdem können stark flüchtige Lösungsmittel wie Isopropanol oder Ethanol in den vorliegenden Zusammensetzungen verwendet werden, um eine schnellere Verdampfung der Zusammensetzung von Oberflächen zu erleichtern, wenn die Oberfläche nach Auftragen der Zusammensetzung „in voller Stärke" auf die Oberfläche nicht abgespült wird. Wenn flüchtige Lösungsmittel verwendet wer den, sind sie in der Regel in Konzentrationen von etwa 2% bis etwa 12% in den Zusammensetzungen vorhanden.
  • Die Ausführungsform der Reinigungszusammensetzung für harte Oberflächen der vorliegenden Erfindung wird durch die folgenden nichteinschränkenden Beispiele veranschaulicht. (In den folgenden Beispielen verweist der Bezug auf „Protease Nr." in den Beispielen auf die in den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung geeignete Variante mit der jeweiligen Nummer in der vorstehenden Tabelle III.)
  • Beispiele 1-6
  • Flüssige Reinigungszusammensetzungen für harte Oberflächen
    Beispiel Nr.
    Bestandteil 1 2 3 4 5 6
    Protease Nr. 12 0,05 0,20 0,02 0,03 0,10 0,03
    Protease Nr. 4 - - - - 0,20 0,02
    EDTA** - - 2,90 2,90 - -
    Na-Citrat - - - - 2,90 2,90
    NaC12-Alkylbenzol-sulfonat 1,95 - 1,95 - 1,95 -
    NaC12-Alkylsulfat - 2,20 - 2,20 - 2,20
    NaC12-(Ethoxy)-*** sulfa - 2,20 - 2,20 - 2,20
    Na-Cumolsulfonat 1,30 - 1,30 - 1,30 -
    Hexylcarbitol*** 6,30 6,30 6,30 6,30 6,30 6,30
    Wasser**** ad 100%
    • ** Na4-Ethylendiamindiessigsäure
    • *** Diethylenglycolmonohexylether
    • **** Alle Formulierungen auf pH 7 eingestellt
  • In den Beispielen 1-4 wird Protease Nr. 12 durch die in Tabelle III aufgeführten Proteasen Nr. 1-11 und 13-25, neben anderen, einschließlich der in den Tabellen V und VI beschriebenen zusätzlichen Proteasen, die in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, mit im Wesentlichen ähnlichen Ergebnissen substituiert.
  • In den Beispielen 5 und 6 werden Protease Nr. 12 und Protease Nr. 4 durch eine beliebige Kombination der in den Tabellen III, V und VI aufgeführten, in der vorliegenden Erfindung geeigneten Proteaseenzyme, neben anderen, mit im Wesentlichen ähnlichen Ergebnissen substituiert.
  • Beispiele 7-12
  • Sprühzusammensetzungen zur Reinigung harter Oberflächen und Entfernung von Haushaltsschimmel
    Beispiel Nr.
    Bestandteil 7 8 9 10 11 12
    Protease Nr. 12 0,20 0,05 0,10 0,30 0,20 0,30
    Protease Nr. 4 - - - - 0,30 0,10
    Natriumoctylsulfat 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00
    Natriumdodecylsulfat 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00
    Natriumhydroxid 0,80 0,80 0,80 0,80 0,80 0,80
    Silicat (Na) 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04
    Duftstoff 0,35 0,35 0,35 0,35 0,35 0,35
    Wasser ad 100%
  • Der Produkt-pH-Wert beträgt etwa 7.
  • In den Beispielen 7-10 wird Protease Nr. 12 durch die in Tabelle III aufgeführten Proteasen Nr. 1-11 und 13-25, neben anderen, einschließlich der in den Tabellen V und VI beschriebenen zusätzlichen Proteasen, die in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, mit im Wesentlichen ähnlichen Ergebnissen substituiert.
  • In den Beispielen 11 und 12 werden Protease Nr. 12 und Protease Nr. 4 durch eine beliebige Kombination der in den Tabellen III, V und VI aufgeführten, in der vorliegenden Erfindung geeigneten Proteaseenzyme, neben anderen, mit im Wesentlichen ähnlichen Ergebnissen substituiert.
  • 2. Geschirrspülzusammensetzungen
  • In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfassen Geschirrspülzusammensetzungen ein oder mehrere Proteaseenzyme. Wie hier ver wendet, bezieht sich „Geschirrspülzusammensetzung" auf alle Formen für Zusammensetzungen zur Reinigung von Geschirr, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, granulöse und flüssige Formen. Die Ausführungsform der Geschirrspülzusammensetzung der vorliegenden Erfindung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht.
  • Beispiele 13-18
  • Geschirrspulzusammensetzung
    Beispiel Nr.
    Bestandteil 13 14 15 16 17 18
    Protease Nr. 12 0,05 0,50 0,02 0,40 0,10 0,03
    Protease Nr. 4 - - - - 0,40 0,02
    C12-C14-N-Methylglucamid 0,90 0,90 0,90 0,90 0,90 0,90
    C 12-Ethoxy-(1)-sulfat 12,00 12,00 12,00 12,00 12,00 12,00
    2-Methylundecansäure 4,50 4,50 - 4,50 4,50 -
    C12-Ethoxy-(2)-carboxylat 4,50 4,50 4,50 4,50 4,50 4,50
    C12-Alkoholethoxylat (4) 3,00 3,00 3,00 3,00 3,00 3,00
    C12-Aminoxid 3,00 3,00 3,00 3,00 3,00 3,00
    Natriumcumolsulfonat 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00
    Ethanol 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00
    Mg++ (als MgCl2) 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20
    Ca++ (als CaCl2) 0,40 0,40 0,40 0,40 0,40 0,40
    Wasser ad 100%
  • Der Produkt-pH-Wert wird auf 7 eingestellt.
  • In den Beispielen 13-16 wird Protease Nr. 12 durch die in Tabelle III aufgeführten Proteasen Nr. 1-11 und 13-25, neben anderen, einschließlich der in den Tabellen V und VI beschriebenen zusätzlichen Proteasen, die in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, mit im Wesentlichen ähnlichen Ergebnissen substituiert.
  • In den Beispielen 17 und 18 werden Protease Nr. 12 und Protease Nr. 4 durch eine beliebige Kombination der in den Tabellen III, V und VI aufgeführten, in der vorliegenden Erfindung geeigneten Proteaseenzyme, neben anderen, mit im Wesentlichen ähnlichen Ergebnissen substituiert.
  • Beispiel 19
  • Granulöse Maschinen-Geschirrspülzusammensetzung
    Bestandteil A B C
    Citronensäure 15,0 - -
    Citrat 4,0 29,0 15,0
    Acrylat/Methacrylat-Copolymer 6,0 -
    Acrylsäure/Maleinsäure-Copolymer - 3,7 -
    Trockenzusatz-Carbonat 9,0 - 20,0
    Alkalimetallsilicat 8,5 17,0 9,0
    Paraffin - 0,5 -
    Benzotriazol - 0,3 -
    Termamyl 60T 1,5 1,5 1,0
    Protease Nr. 12 (4,6% Prill) 1,6 1,6 1,6
    Percarbonat (AvO) 1,5 - -
    Perboratmonohydrat - 0,3 1,5
    Perborattetrahydrat - 0,9 -
    Tetraacetylethylendiamin 3,8 4,4 -
    Diethylentriaminpentamethylphosphonsäure (Mg-Salz) 0,13 0,13 0,13
    Alkylethoxysulfat – 3-fach ethoxyliert 3,0 - -
    Nichtionisches Alkylethoxypropoxy-Tensid - 1,5 -
    Schaumunterdrücker 2,0 - -
    Nichtionisches Tensid Olin SLF18 - - 2,0
    Sulfat ad 100%
  • In den Beispielen 19 A-C wird Protease Nr. 12 durch die in Tabelle III aufgeführten Proteasen Nr. 1-11 und 13-25, neben anderen, einschließlich der in den Tabellen V und VI beschriebenen zusätzlichen Proteasen, die in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, mit im Wesentlichen ähnlichen Ergebnissen substituiert. Außerdem wird in den Beispielen 19 A-C Protease Nr. 12 durch eine beliebige Kombination der in den Tabellen III, V und VI aufgeführten, in der vorliegenden Erfindung geeigneten Proteasen, neben anderen, mit im Wesentlichen ähnlichen Ergebnissen substituiert.
  • 3. Textilreinigungszusammensetzungen
  • In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfassen Textilreinigungszusammensetzungen ein oder mehrere Proteaseenzyme. Wie hier verwendet, bezieht sich „Textilreinigungszusammensetzung" auf alle Formen für Waschmittelzusammensetzungen zur Reinigung von Textilien, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, granulöse Formen, flüssige Formen und Stückformen.
  • a. Granulöse Textilreinigungszusammensetzungen
  • Die granulösen Textilreinigungszusammensetzungen der vorliegenden Erfindung enthalten eine wirksame Menge eines oder mehrerer Proteaseenzyme, vorzugsweise von etwa 0,001 Gew.-% bis etwa 10 Gew.-%, mehr bevorzugt von etwa 0,005 Gew.-% bis etwa 5 Gew.-%, mehr bevorzugt von etwa 0,01 Gew.-% bis etwa 1 Gew.-% der Zusammensetzung aktives Proteaseenzym. Zusätzlich zu einem oder mehreren Proteaseenzymen umfassen die granulösen Textilreinigungszusammensetzungen in der Regel mindestens ein Tensid, einen oder mehrere Builder und, in einigen Fällen, ein Bleichmittel.
  • Die Ausführungsform der granulösen Textilreinigungszusammensetzung der vorliegenden Erfindung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht.
  • Beispiele 20-23
  • Granulöse Textilreinigungszusammensetzung
    Beispiel Nr.
    Bestandteil 20 21 22 23
    Protease Nr. 12 (4% Prill) 0,10 0,20 0,03 0,05
    Protease Nr. 4 (4% Prill) - - 0,02 0,05
    Lineares C13-Alkylbenzolsulfonat 22,00 22,00 22,00 22,00
    Phosphat (als Natrium-tripolyphosphate) 23,00 23,00 23,00 23,00
    Natriumcarbonat 23,00 23,00 23,00 23,00
    Natriumsilicat 14,00 14,00 14,00 14,00
    Zeolith 8,20 8,20 8,20 8,20
    Chelant (Diethylentriamin-pentaessigsäure) 0,40 0,40 0,40 0,40
    Natriumsulfat 5,50 5,50 5,50 5,50
    Wasser ad 100%
  • In den Beispielen 20-21 wird Protease Nr. 12 durch die in Tabelle III aufgeführten Proteasen Nr. 1-11 und 13-25, neben anderen, einschließlich der in den Tabellen V und VI beschriebenen zusätzlichen Proteasen, die in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, mit im Wesentlichen ähnlichen Ergebnissen substituiert.
  • In den Beispielen 22 und 23 werden Protease Nr. 12 und Protease Nr. 4 durch eine beliebige Kombination der in den Tabellen III, V und VI aufgeführten, in der vorliegenden Erfindung geeigneten Proteaseenzyme, neben anderen, mit im Wesentlichen ähnlichen Ergebnissen substituiert.
  • Beispiele 24-27
  • Granulöse Textilreinigungszusammensetzung
    Beispiel Nr.
    Bestandteil 24 25 26 27
    Protease Nr. 12 (4% Prill) 0,10 0,20 0,03 0,05
    Protease Nr. 4 (4% Prill) - - 0,02 0,05
    C12-Alkylbenzolsulfonat 12,00 12,00 12,00 12,00
    Zeolith A (1-10 Mikrometer) 26,00 26,00 26,00 26,00
    2-Butyloctansäure 4,00 4,00 4,00 4,00
    Sekundäres (2,3) C12-C14-Alkylsulfat, 5,00 5,00 5,00 5,00
    Na-Salz
    Natriumcitrat 5,00 5,00 5,00 5,00
    Optischer Aufheller 0,10 0,10 0,10 0,10
    Natriumsulfat 17,00 17,00 17,00 17,00
    Füllstoffe, Wasser, geringfügige Bestandteile ad 100%
  • In den Beispielen 24 und 25 wird Protease Nr. 12 durch die in Tabelle III aufgeführten Proteasen Nr. 1-11 und 13-25, neben anderen, einschließlich der in den Tabellen V und VI beschriebenen zusätzlichen Proteasen, die in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, mit im Wesentlichen ähnlichen Ergebnissen substituiert.
  • In den Beispielen 26 und 27 werden Protease Nr. 12 und Protease Nr. 4 durch eine beliebige Kombination der in den Tabellen III, V und VI aufgeführten, in der vorliegenden Erfindung geeigneten Proteaseenzyme, neben anderen, mit im Wesentlichen ähnlichen Ergebnissen substituiert.
  • Beispiele 28 und 29
  • Granulöse Textilreinigungszusammensetzungen
    Bestandteile Beispiel Nr.
    28 29
    Lineares Alkylbenzolsulfonat 11,4 10,70
    Talgalkylsulfat 1,80 2,40
    C14-15-Alkylsulfat 3,00 3,10
    C14-15-Alkohol, 7-fach ethoxyliert 4,00 4,00
    Talgalkohol, 11-fach ethoxyliert 1,80 1,80
    Dispergiermittel 0,07 0,1
    Silikonflüssigkeit 0,80 0,80
    Trinatriumcitrat 14,00 15,00
    Citronensäure 3,00 2,50
    Zeolith 32,50 32,10
    Maleinsäure/Acrylsäure-Copolymer 5,00 5,00
    Diethylentriaminpentamethylenphosphonsäure 1,00 0,20
    Protease Nr. 12 (4% Prill) 0,30 0,30
    Lipase 0,36 0,40
    Amylase 0,30 0,30
    Natriumsilicat 2,00 2,50
    Natriumsulfat 3,50 5,20
    Polyvinylpyrrolidon 0,30 0,50
    Perborat 0,5 1
    Phenolsulfonat 0,1 0,2
    Peroxidase 0,1 0,1
    Geringfügige Bestandteile Up to 100 Up to 100
  • Beispiele 30 und 31
  • Granulöse Textilreinigungszusammensetzungen
    Beispiel Nr.
    Bestandteile 30 31
    Lineares C12-Natriumalkylbenzolsulfonat 6,5 8,0
    Natriumsulfat 15,0 18,0
    Zeolith A 26,0 22,0
    Natriumnitrilotriacetat 5,0 5,0
    Polyvinylpyrrolidon 0,5 0,7
    Tetraacetylethylendiamin 3,0 3,0
    Borsäure 4,0 -
    Perborat 0,5 1
    Phenolsulfonat 0,1 0,2
    Protease Nr. 12 (4% Prill) 0,4 0,4
    Füllstoffe (z. B. Silicate, Carbonate, Duftstoffe, Wasser) Up to 100 Up to 100
  • Beispiel 32
  • Kompakte granulöse Textilreinigungszusammensetzung
    Bestandteile Gewichtsprozent
    Alkylsulfat 8,0
    Alkylethoxysulfat 2,0
    Mischung aus C25- und C45-Alkohol, 3- und 7-fach ethoxyliert 6,0
    Polyhydroxyfettsäureamid 2,5
    Zeolith 17,0
    Schichtsilicat/Citrat 16,0
    Carbonat 7,0
    Maleinsäure/Acrylsäure-Copolymer 5,0
    Schmutzabweisungspolymer 0,4
    Carboxymethylcellulose 0,4
    Poly(4-vinylpyridin)-N-oxid 0,1
    Copolymer aus Vinylimidazol und Vinylpyrrolidon 0,1
    PEG2000 0,2
    Protease Nr. 12 (4% Prill) 0,5
    Lipase 0,2
    Cellulase 0,2
    Tetraacetylethylendiamin 6,0
    Percarbonat 22,0
    Ethylendiamindibernsteinsäure 0,3
    Schaumunterdrücker 3,5
    Dinatrium-4,4'-bis-(2-morpholino-4-anilino-s-triazin-6-ylamino)-stilben-2,2'-disulfonat 0,25
    Dinatrium-4,4'-bis-(2-sulfostyril)-biphenyl 0,05
    Wasser, Duftstoff und geringfügige Bestandteile Up to 100
  • Beispiel 33
  • Granulöse Textilreinigungszusammensetzung
    Bestandteil Gewichtsprozent
    Lineares Alkylbenzolsulfonat 7,6
    C16-C18-Alkylsulfat 1,3
    C14-15-Alkohol, 7-fach ethoxyliert 4,0
    Kokosalkyldimethylhydroxyethylammoniumchlorid 1,4
    Dispergierm ittel 0,07
    Silikonflüssigkeit 0,8
    Trinatriumcitrat 5,0
    Zeolith 4A 15,0
    Maleinsäure/Acrylsäure-Copolymer 4,0
    Diethylentriaminpentamethylenphosphonsäure 0,4
    Perborat 15,0
    Tetraacetylethylendiamin 5,0
    Smectitton 10,0
    Poly(oxyethylen) (MG 300.000) 0,3
    Protease Nr. 12 (4% Prill) 0,4
    Lipase 0,2
    Amylase 0,3
    Cellulase 0,2
    Natriumsilicat 3,0
    Natriumcarbonat 10,0
    Carboxymethylcellulose 0,2
    Aufheller 0,2
    Wasser, Duftstoff und geringfügige Bestandteile Up to 100
  • Beispiel 34
  • Granulöse Textilreinigungszusammensetzung
    Bestandteil Gewichtsprozent
    Lineares Alkylbenzolsulfonat 6,92
    Talgalkylsulfat 2,05
    C14-15-Alkohol, 7-fach ethoxyliert 4,4
    C12-15-Alkylethoxysulfat – 3-fach ethoxyliert 0,16
    Zeolith 20,2
    Citrat 5,5
    Carbonat 15,4
    Silicat 3,0
    Maleinsäure/Acrylsäure-Copolymer 4,0
    Carboxymethylcellulase 0,31
    Schmutzabweisungspolymer 0,30
    Protease Nr. 12 (4% Prill) 0,2
    Lipase 0,36
    Cellulase 0,13
    Perborattetrahydrat 11,64
    Perboratmonohydrat 8,7
    Tetraacetylethylendiamin 5,0
    Diethylentriaminpentamethylphosphonsäure 0,38
    Magnesiumsulfat 0,40
    Aufheller 0,19
    Duftstoff, Silikon, Schaumunterdrücker 0,85
    Geringfügige Bestandteile Up to 100
  • In jedem der Beispiele 28-34 hierin wird Protease Nr. 12 durch die in Tabelle III aufgeführten Proteasen Nr. 1-11 und 13-25, neben anderen, einschließlich der in den Tabellen V und VI beschriebenen zusätzlichen Proteasen, die in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, mit im Wesentlichen ähnlichen Ergebnissen substituiert. Außerdem wird in den Beispielen 28-34 Protease Nr. 12 durch eine beliebige Kombination der in den Tabellen III, V und VI aufgeführten, in der vorliegenden Erfindung geeigneten Proteasen, neben anderen, mit im Wesentlichen ähnlichen Ergebnissen substituiert.
  • b. Flüssige Textilreinigungszusammensetzungen
  • Flüssige Textilreinigungszusammensetzungen der vorliegenden Erfindung umfassen eine wirksame Menge eines oder mehrerer Proteaseenzyme, vorzugsweise von etwa 0,0001 Gew.-% bis etwa 10 Gew.-%, mehr bevorzugt von etwa 0,001 Gew.-% bis etwa 1 Gew.-% und am meisten bevorzugt von etwa 0,001 Gew.-% bis etwa 0,1 Gew.-% der Zusammensetzung aktives Proteaseenzym. Solche flüssigen Textilreinigungszusammensetzungen umfassen in der Regel zusätzlich ein anionisches Tensid, eine Fettsäure, einen wasserlöslichen Reinigungsbuilder und Wasser.
  • Die Ausführungsform der flüssigen Textilreinigungszusammensetzung der vorliegenden Erfindung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht.
  • Beispiele 35-39
  • Flüssige Textilreinigungszusammensetzungen
    Beispiel Nr.
    Bestandteil 35 36 37 38 39
    Protease Nr. 12 0,05 0,03 0,30 0,03 0,10
    Protease Nr. 4 - - - 0,01 0,20
    C12-C14-Alkylsulfat, Na 20,00 20,00 20,00 20,00 20,00
    2-Butyloctansäure 5,00 5,00 5,00 5,00 5,00
    Natriumcitrat 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00
    C10-Alkoholethoxylat (3) 13,00 13,00 13,00 13,00 13,00
    Monoethanolamin 2,50 2,50 2,50 2,50 2,50
    Wasser/Propylenglycol/Ethanol (100:1:1) ad 100%
  • In den Beispielen 35-37 wird Protease Nr. 12 durch die in Tabelle III aufgeführten Proteasen Nr. 1-11 und 13-25, neben anderen, einschließlich der in den Tabellen V und VI beschriebenen zusätzlichen Proteasen, die in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, mit im Wesentlichen ähnlichen Ergebnissen substituiert.
  • In den Beispielen 38 und 39 werden Protease Nr. 12 und Protease Nr. 4 durch eine beliebige Kombination der in den Tabellen III, V und VI aufgeführten, in der vorliegenden Erfindung geeigneten Proteaseenzyme, neben anderen, mit im Wesentlichen ähnlichen Ergebnissen substituiert.
  • Beispiele 40-41
  • Flüssige Textilreinigungszusammensetzungen
    Beispiel Nr.
    Bestandteil 40 41
    C12-14-Alkenylbernsteinsäure 3,0 8,0
    Citronensäuremonohydrat 10,0 15,0
    C12-15-Natriumalkylsulfat 8,0 8,0
    Natriumsulfat von C12-15-Alkohol, 2-fach ethoxyliert - 3,0
    C12-15-Alkohol, 7-fach ethoxyliert - 8,0
    C12-15-Alkohol, 5-fach ethoxyliert 8,0 -
    Diethylentriaminpenta(methylenphosphonsäure) 0,2 -
    Ölsäure 1,8 -
    Ethanol 4,0 4,0
    Propandiol 2,0 2,0
    Protease Nr. 12 0,2 0,2
    Polyvinylpyrrolidon 1,0 2,0
    Schaumunterdrücker 0,15 0,15
    NaOH bis pH 7,5
    Perborat 0,5 1
    Phenolsulfonat 0,1 0,2
    Peroxidase 0,4 0,1
    Wasser und geringfügige Bestandteile ad 100 Teile
  • In jedem der Beispiele 40 und 41 hierin wird Protease Nr. 12 durch die in Tabelle III aufgeführten Proteasen Nr. 1-11 und 13-25, neben anderen, einschließlich der in den Tabellen V und VI beschriebenen zusätzlichen Proteasen, die in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, mit im Wesentlichen ähnlichen Ergebnissen substituiert. Außerdem wird in den Beispielen 40 und 41 Protease Nr. 12 durch eine beliebige Kombination der in den Tabellen III, V und VI aufgeführten, in der vorliegenden Erfindung geeigneten Proteasen, neben anderen, mit im Wesentlichen ähnlichen Ergebnissen substituiert.
  • c. Stückförmige Textilreinigungszusammensetzungen
  • Stückförmige Textilreinigungszusammensetzungen der vorliegenden Erfindung, die zur Handwäsche von verschmutzten Textilien geeignet sind, enthalten eine wirksame Menge eines oder mehrerer Proteaseenzyme, vorzugsweise von etwa 0,001 Gew.-% bis etwa 10 Gew.-%, mehr bevorzugt von etwa 0,01 Gew.-% bis etwa 1 Gew.-% der Zusammensetzung.
  • Die Ausführungsform der stückförmigen Textilreinigungszusammensetzung der vorliegenden Erfindung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht.
  • Beispiele 42-45
  • Stückförmige Textilreinigungszusammensetzungen
    Beispiel Nr.
    Bestandteil 42 43 44 45
    Protease Nr. 12 0,3 - 0,1 0,02
    Protease Nr. 4 - - 0,4 0,03
    C12-C16-Alkylsulfat, Na 20,0 20,0 20,0 20,00
    C12-C14-N-Methylglucamid 5,0 5,0 5,0 5,00
    C11-C13-Alkylbenzolsulfonat, Na 10,0 10,0 10,0 10,00
    Natriumcarbonat 25,0 25,0 25,0 25,00
    Natriumpyrophosphat 7,0 7,0 7,0 7,00
    Natriumtripolyphosphat 7,0 7,0 7,0 7,00
    Zeolith A (0,1-0,10 μ) 5,0 5,0 5,0 5,00
    Carboxymethylcellulose 0,2 0,2 0,2 0,20
    Polyacrylat (MG 1400) 0,2 0,2 0,2 0,20
    Kokos-monoethanolamid 5,0 5,0 5,0 5,00
    Aufheller, Duftstoff 0,2 0,2 0,2 0,20
    CaSO4 1,0 1,0 1,0 1,00
    MgSO4 1,0 1,0 1,0 1,00
    Wasser 4,0 4,0 4,0 4,00
    Füllstoff* ad 100%
    • * Kann aus geeigneten Materialien wie CaCO3, Talk, Ton, Silicaten und dergleichen ausgewählt werden.
  • In den Beispielen 42 und 43 wird Protease Nr. 12 durch die in Tabelle III aufgeführten Proteasen Nr. 1-11 und 13-25, neben anderen, einschließlich der in den Tabellen V und VI beschriebenen zusätzlichen Proteasen, die in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, mit im Wesentlichen ähnlichen Ergebnissen substituiert.
  • In den Beispielen 44 und 45 werden Protease Nr. 12 und Protease Nr. 4 durch eine beliebige Kombination der in den Tabellen III, V und VI aufgeführten, in der vorliegenden Erfindung geeigneten Proteaseenzyme, neben anderen, mit im Wesentlichen ähnlichen Ergebnissen substituiert.
  • B. Weitere Reinigungszusammensetzungen
  • Neben den vorstehend besprochenen Reinigungszusammensetzungen für harte Oberflächen, Geschirrspülzusammensetzungen und Textilreinigungszusammensetzungen können ein oder mehrere Proteaseenzyme in eine Vielfalt an anderen Reinigungszusammensetzungen eingeschlossen werden, bei denen die Hydrolyse eines unlöslichen Substrats erwünscht ist. Solche zusätzlichen Reinigungszusammensetzungen umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Mundreinigungszusammensetzungen, Zahnprothesenreinigungszusammensetzungen und Kontaktlinsenreinigungszusammensetzungen.
  • 1. Mundreinigungszusammensetzungen
  • In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine pharmazeutisch annehmbare Menge eines oder mehrerer Proteaseenzyme in Zusammensetzungen eingeschlossen, die zum Entfernen von proteinhaltigen Flecken von Zähnen oder Zahnprothesen geeignet sind. Wie hier verwendet, bezieht sich „Mundreinigungszusammensetzungen" auf Zahncremes, Zahnpasten, Zahngele, Zahnpulver, Mundspülungen, Mundsprays, Mundgele, Kaugummis, Pastillen, Beutel, Tabletten, Biogele, Prophylaxepasten, Zahnbehandlungslösungen und dergleichen. Vorzugsweise umfassen Mundreinigungszusammensetzungen der vorliegenden Erfindung von etwa 0,0001 Gew.-% bis etwa 20 Gew.-% ein oder mehrere Proteaseenzyme, mehr bevorzugt von etwa 0,001 Gew.-% bis etwa 10 Gew.-%, noch mehr bevorzugt von etwa 0,01 Gew.-% bis etwa 5 Gew.-% der Zusammensetzung und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger. Wie hier verwendet, bedeutet „pharmazeutisch annehmbar", dass Arzneimittel, Medikamente oder inerte Bestandteile, die der Ausdruck beschreibt, zur Verwendung in Kontakt mit den Geweben von Menschen und niederen Tieren ohne übermäßige Toxizität, Unverträglichkeit, Instabilität, Reizung, Allergiereaktion und dergleichen bei einem angemessenen Nutzen/Risiko-Verhältnis geeignet sind.
  • Typischerweise umfassen die pharmazeutisch annehmbaren Mundreinigungsträgerbestandteile der Mundreinigungsbestandteile der Mundreinigungszusammensetzungen im Allgemeinen von etwa 50 Gew.-% bis etwa 99,99 Gew.-%, vorzugsweise von etwa 65 Gew.-% bis etwa 99,99 Gew.-%, mehr bevorzugt von etwa 65 Gew.-% bis etwa 99 Gew.-% der Zusammensetzung.
  • Die pharmazeutisch annehmbaren Trägerbestandteile und fakultativen Bestandteile, die in die Mundreinigungszusammensetzungen der vorliegenden Erfindung eingeschlossen werden können, sind Fachleuten wohl bekannt. Eine große Vielfalt an Zusammensetzungsarten, Trägerbestandteilen und fakultativen Bestandteilen, die in den Mundreinigungszusammensetzungen geeignet sind, sind in US-Patent 5,096,700 , Seibel, erteilt am 17. März 1992, US-Patent 5,028,414 , Sampathkumar, erteilt am 2. Juli 1991, und US-Patent 5,028,415 , Benedict, Bush und Sunberg, erteilt am 2. Juli 1991, die alle durch Bezugnahme hierin eingeschlossen sind, offenbart.
  • Die Ausführungsform der Mundreinigungszusammensetzung der vorliegenden Erfindung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht.
  • Beispiele 46-49
  • Zahncremezusammensetzung
    Beispiel Nr.
    Bestandteil 46 47 48 49
    Protease Nr. 12 2,000 3,500 1,500 2,000
    Sorbit (70% wässrige Lösung) 35,000 35,000 35,000 35,000
    PEG-6* 1,000 1,000 1,000 1,000
    Silica-Dentalschleifmittel** 20,000 20,000 20,000 20,000
    Natriumfluorid 0,243 0,243 0,243 0,243
    Titandioxid 0,500 0,500 0,500 0,500
    Natriumsaccharin 0,286 0,286 0,286 0,286
    Natriumalkylsulfat (27,9% wässrige Lösung) 4,000 4,000 4,000 4,000
    Geschmacksstoff 1,040 1,040 1,040 1,040
    Carboxyvinylpolymer*** 0,300 0,300 0,300 0,300
    Carrageenan**** 0,800 0,800 0,800 0,800
    Wasser ad 100%
    • * PEG-6 = Polyethylenglycol mit einem Molekulargewicht von 600.
    • ** Ausgefälltes Siliciumdioxid, gekennzeichnet als Zeodent 119, angeboten von J. M. Huber.
    • *** Carbopol, angeboten von B. F. Goodrich Chemical Company.
    • **** Iota-Carrageenan, angeboten von Hercules Chemical Company.
  • In den Beispielen 46-49 wird Protease Nr. 12 durch die in Tabelle 111 aufgeführten Proteasen Nr. 1-11 und 13-25, neben anderen, einschließlich der in den Tabellen V und VI beschriebenen zusätzlichen Proteasen, die in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, mit im Wesentlichen ähnlichen Ergebnissen substituiert. Außerdem wird in den Beispielen 46-49 Protease Nr. 12 durch eine beliebige Kombination der in den Tabellen III, V, VI aufgeführten, in der vorliegenden Erfindung geeigneten Proteaseenzyme, neben anderen, mit im Wesentlichen ähnlichen Ergebnissen substituiert.
  • Beispiele 50-53
  • Mundspülungszusammensetzung
    Beispiel Nr.
    Bestandteil 50 51 52 53
    Protease Nr. 12 3,00 7,50 1,00 5,00
    SDA 40-Alkohol 8,00 8,00 8,00 8,00
    Geschmacksstoff 0,08 0,08 0,08 0,08
    Emulgator 0,08 0,08 0,08 0,08
    Natriumfluorid 0,05 0,05 0,05 0,05
    Glycerin 10,00 10,00 10,00 10,00
    Süßstoff 0,02 0,02 0,02 0,02
    Benzoesäure 0,05 0,05 0,05 0,05
    Natriumhydroxid 0,20 0,20 0,20 0,20
    Farbstoff 0,04 0,04 0,04 0,04
    Wasser ad 100%
  • In den Beispielen 50-53 wird Protease Nr. 12 durch die in Tabelle III aufgeführten Proteasen Nr. 1-11 und 13-25, neben anderen, einschließlich der in den Tabellen V und VI beschriebenen zusätzlichen Proteasen, die in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, mit im Wesentlichen ähnlichen Ergebnissen substituiert. Außerdem wird in den Beispielen 50-53 Protease Nr. 12 durch eine beliebige Kombination der in den Tabellen III, V und VI aufgeführten, in der vorliegenden Erfindung geeigneten Proteaseenzyme, neben anderen, mit im Wesentlichen ähnlichen Ergebnissen substituiert.
  • Beispiele 54-57
  • Pastillenzusammensetzung
    Beispiel Nr.
    Bestandteil 54 55 56 57
    Protease Nr. 12 0,01 0,03 0,10 0,02
    Sorbit 17,50 17,50 17,50 17,50
    Mannit 17,50 17,50 17,50 17,50
    Stärke 13,60 13,60 13,60 13,60
    Süßstoff 1,20 1,20 1,20 1,20
    Geschmacksstoff 11,70 11,70 11,70 11,70
    Farbstoff 0,10 0,10 0,10 0,10
    Maisstärkesirup ad 100%
  • In den Beispielen 54-57 wird Protease Nr. 12 durch die in Tabelle III aufgeführten Proteasen Nr. 1-11 und 13-25, neben anderen, einschließlich der in den Tabellen V und VI beschriebenen zusätzlichen Proteasen, die in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, mit im Wesentlichen ähnlichen Ergebnissen substituiert. Außerdem wird in den Beispielen 54-57 Protease Nr. 12 durch eine beliebige Kombination der in den Tabellen III, V und VI aufgeführten, in der vorliegenden Erfindung geeigneten Proteaseenzyme, neben anderen, mit im Wesentlichen ähnlichen Ergebnissen substituiert.
  • Beispiele 58-61
  • Kaugummizusammensetzung
    Beispiel Nr.
    Bestandteil 58 59 60 61
    Protease Nr. 12 0,03 0,02 0,10 0,05
    Sorbitkristalle 38,44 38,40 38,40 38,40
    Paloja-T-Kaumasse* 20,00 20,00 20,00 20,00
    Sorbit (70% wässrige Lösung) 22,00 22,00 22,00 22,00
    Mannit 10,00 10,00 10,00 10,00
    Glycerin 7,56 7,56 7,56 7,56
    Geschmacksstoff 1,00 1,00 1,00 1,00
    • * Geliefert von L. A. Dreyfus Company.
  • In den Beispielen 58-61 wird Protease Nr. 12 durch die in Tabelle III aufgeführten Proteasen Nr. 1-11 und 13-25, neben anderen, einschließlich der in den Tabellen V und VI beschriebenen zusätzlichen Proteasen, die in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, mit im Wesentlichen ähnlichen Ergebnissen substituiert. Außerdem wird in den Beispielen 58-61 Protease Nr. 12 durch eine beliebige Kombination der in den Tabellen III, V und VI aufgeführten, in der vorliegenden Erfindung geeigneten Proteaseenzyme, neben anderen, mit im Wesentlichen ähnlichen Ergebnissen substituiert.
  • 2. Zahnprothesenreinigungszusammensetzungen
  • In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfassen Zahnprothesenreinigungszusammensetzungen zum Reinigen von Zahnprothesen außerhalb der Mundhöhle ein oder mehrere Proteaseenzyme. Solche Zahnprothesenreinigungszusammensetzungen umfassen eine wirksame Menge eines oder mehrerer Proteaseenzyme, vorzugsweise von etwa 0,0001 Gew.-% bis etwa 50 Gew.-% ein oder mehrere Proteaseenzyme, mehr bevorzugt von etwa 0,001 Gew.-% bis etwa 35 Gew.-%, noch mehr bevorzugt von etwa 0,01 Gew.-% bis etwa 20 Gew.-% der Zusammensetzung, und einen Zahnprothesenreinigungsträger. Verschiedene Formate für Zahnprothesenreinigungszusammensetzungen, wie Sprudeltabletten und dergleichen, sind im Stand der Technik wohl bekannt (siehe zum Beispiel US-Patent 5,055,305 , Young, durch Bezugnahme hierin eingeschlossen) und sind im Allgemeinen für den Einschluss eines oder mehrerer Proteaseenzyme zur Entfernung proteinhaltiger Flecken von Zahnprothesen geeignet.
  • Die Ausführungsform der Zahnprothesenreinigungszusammensetzung der vorliegenden Erfindung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht.
  • Beispiele 62-65
  • Zweischichtige sprudelnde Zahnprothesenreinigungstablette
    Beispiel Nr.
    Bestandteil 62 63 64 65
    Saure Schicht
    Protease Nr. 12 1,0 1,5 0,01 0,05
    Weinsäure 24,0 24,0 24,00 24,00
    Natriumcarbonat 4,0 4,0 4,00 4,00
    Sulfaminsäure 10,0 10,0 10,00 10,00
    PEG 20.000 4,0 4,0 4,00 4,00
    Natriumhydrogencarbonat 24,5 24,5 24,50 24,50
    Kaliumpersulfat 15,0 15,0 15,00 15,00
    Natriumsäurepyrophosphat 7,0 7,0 7,00 7,00
    Pyrogenes Silica 2,0 2,0 2,00 2,00
    Tetraacetylethylendiamin 7,0 7,0 7,00 7,00
    Ricinoleylsulfosuccinat 0,5 0,5 0,50 0,50
    Geschmacksstoff 1,0 1,0 1,00 1,00
    Alkalische Schicht
    Natriumperboratmonohydrat 32,0 32,0 32,00 32,00
    Natriumhydrogencarbonat 19,0 19,0 19,00 19,00
    EDTA 3,0 3,0 3,00 3,00
    Natriumtripolyphosphat 12,0 12,0 12,00 12,00
    PEG 20.000 2,0 2,0 2,00 2,00
    Kaliumpersulfat 26,0 26,0 26,00 26,00
    Natriumcarbonat 2,0 2,0 2,00 2,00
    Pyrogenes Silica 2,0 2,0 2,00 2,00
    Farbstoff/Geschmacksstoff 2,0 2,0 2,00 2,00
  • In den Beispielen 62-65 wird Protease Nr. 12 durch die in Tabelle 111 aufgeführten Proteasen Nr. 1-11 und 13-25, neben anderen, einschließlich der in den Tabellen V und VI beschriebenen zusätzlichen Proteasen, die in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, mit im Wesentlichen ähnlichen Ergebnissen substituiert. Außerdem wird in den Beispielen 62-65 Protease Nr. 12 durch eine beliebige Kombination der in den Tabellen 111, V und VI aufgeführten, in der vorliegenden Erfindung geeigneten Proteaseenzyme, neben anderen, mit im Wesentlichen ähnlichen Ergebnissen substituiert.
  • 3. Körperreinigungszusammensetzungen
  • In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfassen Körperreinigungszusammensetzungen zum Reinigen der Haut (in flüssiger Form und in Stückform) ein oder mehrere der Proteaseenzyme. Solche Zusammensetzungen umfassen typischerweise von etwa 0,001 Gew.-% bis etwa 5 Gew.-% Proteaseenzym, vorzugsweise von etwa 0,005 Gew.-% bis etwa 2 Gew.-% und am meisten bevorzugt von etwa 0,01 Gew.-% bis etwa 0,8 Gew.-% der Zusammensetzung. Bevorzugte Körperreinigungszusammensetzungen, in die Proteaseenzyme, wie hier beschrieben, eingeschlossen werden können, werden in den US-Patentanmeldungen SN 08/121,623 und SN 08/121,624 , beide von Visscher et al., ein gereicht am 14. September 1993, deren Offenbarungen in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme hierin eingeschlossen sind, gelehrt. Solche Zusammensetzungen werden durch die folgenden Beispiele veranschaulicht.
  • Beispiel 66
  • Flüssige seifenhaltige Körperreinigungszusammensetzungen
    Bestandteil Gewichtsprozent
    Seife (K oder Na) 15,00
    30% Laurat
    30% Myristat
    25% Palmitat
    15% Stearat
    Fettsäuren (vorstehende Anteile) 4,50
    Na-Laurylsarcosinat 6,00
    Natriumlaureth-3-sulfat 0,66
    Cocamidopropylbetain 1,33
    Glycerin 15,00
    Propylenglycol 9,00
    Polyquaternium 10 0,80
    Ethylenglycoldistearat (EDTA) 1,50
    Propylparaben 0,10
    Methylparaben 0,20
    Protease Nr. 12 0,10
    KOH oder NaOH Falls zur Einstellung des pH-Werts erforderlich
    Calciumsulfat 3
    Essigsäure 3
    Wasser ad 100
  • Beispiel 67
  • Strückförmige Körperreinigungszusammensetzungen
    Bestandteil Gewichtsprozent
    Natriumcocoylisethionat 47,20
    Natriumcetearylsulfat 9,14
    Paraffin 9,05
    Natriumseife (in situ) 3,67
    Natriumisethionat 5,51
    Natriumchlorid 0,45
    Titandioxid 0,4
    Trinatrium-EDTA 0,1
    Trinatrium-Etidronat 0,1
    Duftstoff 1,20
    Na2SO4 0,87
    Protease Nr. 12 0,10
    Wasser/geringfügige Bestandteile ad 100
  • In den Beispielen 66-67 wird Protease Nr. 12 durch die in Tabelle III aufgeführten Proteasen Nr. 1-11 und 13-25, neben anderen, einschließlich der in den Tabellen V und VI beschriebenen zusätzlichen Proteasen, die in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, mit im Wesentlichen ähnlichen Ergebnissen substituiert. Außerdem wird in den Beispielen 66-67 Protease Nr. 12 durch eine beliebige Kombination der in den Tabellen III, V und VI aufgeführten, in der vorliegenden Erfindung geeigneten Proteaseenzyme, neben anderen, mit im Wesentlichen ähnlichen Ergebnissen substituiert.
  • Beispiel 68
  • Waschleistungstest
  • Die Waschleistung der in den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung geeigneten Varianten wird durch Messen der Entfernung von Flecken von EMPA 116-Gewebemustern (Blut/Milch/Ruß auf Baumwolle) (Testfabrics, Inc., Middlesex, NJ 07030) bewertet.
  • Sechs EMPA 116-Muster, zugeschnitten auf 7,3 × 11,4 cm (3 × 4 1/2 Zoll) mit gezackten Rändern werden in die einzelnen Gefäße eines Terg-O-Tometers, Modell 7243S (United States Testing Co., Inc., Hoboken, NJ), gelegt, die 1000 ml Wasser, Härte 3,9 g/l (15 gpg) (Ca++:Mg++::3:1::w:w), 7 g Waschmittel und Enzym, wie jeweils zutreffend, enthalten. Der Waschmittelgrundbestandteil ist WFK1-Waschmittel von wfk-Testgewebe GmbH, Adlerstraße 42, Postfach 13 07 62, D-47759 Krefeld, Deutschland:
    Bestandteil % der Endformulierung
    Zeolith A 25%
    Natriumsulfat 25%
    Wasserfreie Soda 10%
    Lineares Alkylbenzolsulfonat 8,8%
    Alkoholethoxylat (7-8 EO) 4,5%
    Natriumseife 3%
    Natriumsilicat (SiO2:Na2O::3,3:1) 3%
  • Zu diesem Grundwaschmittel wird Folgendes hinzugefügt:
    Bestandteil % der Endformulierung
    Natriumperboratmonohydrat 13%
    Copolymer (Sokalan CP5) 4%
    TAED (Mykon ATC Green) 3%
    Enzym 0,5%
    Aufheller (Tinopal AMS-GX) 0,2%
  • Natriumperboratmonohydrat ist von Degussa Corporation, Ridgefield-Park, NJ 07660, erhältlich. Sokalan CP5 ist von BASF Corporation, Parsippany, NJ 07054, erhältlich. Mykon ATC Green (TAED, Tetraacetylethylendiamin) ist von Warwick International, Limited, Mostyn, Holywell, Clwyd CH8 9HE, England, erhältlich. Tinopal AMS GX ist von Ciba-Geigy Corporation, Greensboro, NC 27419, erhältlich.
  • Sechs EMPA 116-Muster werden in Waschmittel mit Enzym 30 Minuten lang bei 60°C gewaschen und anschließend zweimal 5 Minuten lang jeweils in 1000 ml Wasser gespült. Die Enzyme werden in Endkonzentrationen von 0,05 bis 1 ppm für Standardkurven und 0,25 ppm für Routineanalysen hinzugegeben. Die Muster werden getrocknet und gebügelt, und der Reflexionsgrad der Muster wird anhand des L-Werts auf der L*a*b*-Skala eines Minolta-Chromameters, Modell CR-200 (Minolta Corporation, Ramsey, NJ 07446), gemessen. Die Leistung wird protokolliert als Prozentsatz der Leistung von B.-lentus-(GG36)Protease und berechnet durch Dividieren der Menge an B.-lentus-(GG36)Protease durch die Menge an Variantenprotease, die für die gleiche Fleckenentfernungsleistung benötigt wird, X 100. Die Daten sind in Tabelle VII aufgeführt. Tabelle VII
    Enzym Waschleistung
    B.-lentus-Subtilisin 100
    N76D 310
    N76D/S103A 230
    N76D7V104I 130
    N76D/V107V 160
    N76D/S99D/S101R 370
    N76D/S99D/S103A 290
    N76D/S101R/S103A 130
    N76D/S101R/V104I 300
    N76D/S103A/V104I 320
    N76D/S103G/V104I 160
    N76D/S103A/V104F 210
    N76D/S103A/V104N 110
    N76D/S103A/V104T 170
    N76D7V104I/I107V 210
    N76D/S99D/S101R/S103A 220
    N76D/S99D/S101R/V104I 140
    N76D/S101G/S103A/V104I 170
    N76D/S101R/S103A/V104I 150
    N76D/S103A/V104I/S105A 170
    N76D/S103A/V104T/I107A 120
    N76D/S103A/V104T/I107L 110
    N76D/S103A/V104I/L126F 110
    N76D/S103A/V104I/S128G 280
    N76D/S103A/V104I/L135I 160
    N76D/S103A/V104I/L135V 160
    N76D/S103A/V104I/D197E 170
    N76D/S103A/V104I/N204A 160
    N76D/S103A/V104I/N204G 150
    N76D/S103A/V104I/P210I 470
    N76D/S103A/V104I/M222A 100
    N76D/S103A/V104I/T260P 280
    N76D/S103A/V104I/S265N 190
  • Beispiel 69
  • Proteasestabilität in einer Flüssigwaschmittelformulierung
  • Ein Vergleich zwischen Proteasestabilität und -deaktivierung in einer Flüssigwaschmittelformulierung wird für Bacillus-lentus-Subtilisin und dessen Variantenenzym N76D/S103A/V104I gemäß dem hierin umrissenen Verfahren vorgenommen. Die Waschmittelformulierung für die Untersuchung ist eine im Handel erhältliche Flasche Tide Ultra-Flüssigwäschewaschmittel, die in den USA von The Procter & Gamble Company hergestellt wird. Eine Wärmebehandlung der Waschmittelformulierung ist notwendig, um Protease in situ zu deaktivieren.
  • Dies wird durch Inkubieren des Waschmittels bei 96°C für einen Zeitraum von 4,5 Stunden erreicht. Anschließend werden konzentrierte Zubereitungen des B.-lentus-Subtilisins und der Variante N76D/S103A/V104I im Bereich von 20 Gramm/Liter Enzym bei Raumtemperatur bis zu einer Endkonzentration von 0,3 Gramm/Liter Enzym in der Waschmittelformulierung zu dem wärmebehandelten Tide Ultra hinzugegeben. Anschließend wird das wärmebehandelte Waschmittel mit Protease in einem auf 50°C thermostatierten Wasserbad inkubiert. Aus den Inkubationsröhrchen werden in Zeitintervallen von 0, 24, 46, 76 und 112 Stunden Aliquots entnommen und durch Zugabe in eine 1-cm-Küvette mit 1,2 mM des synthetischen Peptidsubstrats Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pnitroanilid, gelöst in 0,1 M Tris-HCL-Puffer, pH 8,6, und auf 25°C thermostatiert, auf Enzymaktivität getestet. Die anfängliche lineare Reaktionsgeschwindigkeit wird spektralphotometrisch durch Überwachung der Extinktion des Reaktionsprodukts p-Nitroanilin bei 410 nm als Funktion der Zeit verfolgt. Wie in 10 gezeigt, wird bei der Variante N76D/S103A/V104I eine wesentlich höhere Stabilität gegenüber Deaktivierung beobachtet als bei dem nativen B.-lentus-Enzym. Die geschätzten Halbwertszeiten für die Deaktivierung in der Tide Ultra-Waschmittelformulierung betragen für die zwei Enzyme unter den angegebenen Testbedingungen 45 Stunden für B.-lentus-Subtilisin und 125 Stunden für die Variante N76D/S103A/V104I.
  • SEQUENZAUFLISTUNG
    Figure 00720001
  • Figure 00730001
  • Figure 00740001
  • Figure 00750001
  • Figure 00760001
  • Figure 00770001
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  • Figure 00790001
  • Figure 00800001
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  • Figure 00820001
  • Figure 00830001
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  • Figure 00930001
  • Figure 00940001

Claims (33)

  1. Reinigungszusammensetzung, welche Folgendes umfasst: (a) eine wirksame Menge an Proteaseenzym, bei dem es sich um eine Carbonylhydrolasevariante mit einer Aminosäuresequenz handelt, die nicht in der Natur vorkommt, und die von einer Vorläufer-Carbonylhydrolase abgeleitet ist, und wobei das Proteaseenzym eine Bacillus-lentus-Subtilisinvariante ist, die ausgewählt ist aus N76D/S103A; N76D/V104I; N76D/S99D/S103A; N76D/S99D/V104I; N76D/S101R/S103A; N76D/S101R/V104I; N76D/S103A/V104I; N76D/V104I/I107V; N76D/V104Y/I107V; N76D/V104I/N123S; N76D/S99D/S101R/S103A; N76D/S99D/S101R/V104I; N76D/S99D/S103A/V104I; N76D/S101R/S103A/V104I; N76D/S103A/V104I/N123S; N76D/V104I/I107V/N123S; N76D/S99D/S101R/S103A/V104I; N76D/S99D/S103A/V104I/N123S; N76D/S99D/S101R/S103A/V104I/N123S; N76D/S103A/V104I/S128G; N76D/S103A/V104I/T260P; N76D/S103A/V104I/S265N; N76D/S103A/V104I/D197E; N76D/S103A/V104I/S105A; N76D/S103A/V104I/L135I; N76D/S103A/V104I/L126F; N76D/S103A/V104T/L107T; N76D/S103A/V104I/L126F/S265N und N76D/S103A/V104I/M222A und Mischungen davon; wobei die bezifferte Position natürlich vorkommendem Subtilisin von Bacillus amyloliquefaciens entspricht; und (b) ein oder mehrere Reinigungszusammensetzungsmaterialien, die mit dem Proteaseenzym verträglich sind.
  2. Reinigungszusammensetzungen nach Anspruch 1, wobei die Reinigungszusammensetzungsmaterialien ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Tensiden, Lösungsmitteln, Puffer, Enzymen, Schmutzabweisemitteln, Tonschmutzentfernungsmitteln, Dispergierungsmitteln, Authellern, Schaumunterdrückern, Textilweichmachern, Schaumverstärkern, Enzymstabilisatoren, Buildern, Bleichmitteln, Farbstoffen, Duftstoffen und Mischungen davon.
  3. Reinigungszusammensetzungen nach Anspruch 1, wobei die Reinigungszusammensetzungsmaterialien mindestens etwa 1% Tensid, bezogen auf das Gewicht der Zusammensetzung, umfassen, wobei das Tensid Materialien enthält, die ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Alkylbenzolsulfonaten, primären Alkylsulfaten, sekundären Alkylsulfaten, Alkylalkoxysulfaten, Alkylalkoxycarboxylaten, Alkylpolyglycosiden und ihren entsprechenden sulfatierten Polyglycosiden, alphasulfonierten Fettsäureestern, Alkyl- und Alkylphenolalkoxylaten, Betainen und Sulfobetainen, Aminoxiden, N-Methylglucamiden, nichtionischen primären Alkoholethoxylaten, nichtionischem primärem gemischtem Alkohol-Ethoxy/Propoxy und Mischungen davon.
  4. Reinigungszusammensetzung nach Anspruch 3, die ferner mindestens 5% Builder umfasst, der ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Zeolithen, Polycarboxylaten, Schichtsilicaten, Phosphaten und Mischungen davon.
  5. Reinigungszusammensetzungen nach Anspruch 1, wobei die Reinigungszusammensetzungsmaterialien mindestens ein Bleichmittel umfassen.
  6. Reinigungszusammensetzungen nach Anspruch 5, wobei das Reinigungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Percarbonaten, Perboraten und Mischungen davon, und optional ferner mindestens einen Bleichaktivator umfasst.
  7. Reinigungszusammensetzungen nach Anspruch 1, wobei die Reinigungszusammensetzungsmaterialien mindestens ein Enzym umfassen, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Cellulasen, Lipasen, Amylasen, Proteasen, Peroxidasen und Mischungen davon.
  8. Reinigungszusammensetzungen nach Anspruch 1, wobei die Reinigungszusammensetzungsmaterialien mindestens einen Textilweichmacher umfassen.
  9. Reinigungszusammensetzung nach Anspruch 1, die ferner Reinigungszusammensetzungsmaterialien umfasst, die ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Lösungsmitteln, Puffern, Enzymen, Schmutzabweisemitteln, Tonschmutzentfernungsmitteln, Dispergierungsmitteln, Aufhellern, Schaumunterdrückern, Textilweichmachern, Schaumverstärkern, Enzymstabilisatoren, Bleichmitteln, Farbstoffen, Duftstoffen und Mischungen davon.
  10. Reinigungszusammensetzung nach Anspruch 1, die ferner mindestens ein Bleichmittel umfasst.
  11. Reinigungszusammensetzung nach Anspruch 1, die ferner mindestens ein Enzym umfasst, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Cellulasen, Lipasen, Amylasen, Proteasen, Peroxidasen und Mischungen davon.
  12. Textilreinigungszusammensetzung nach Anspruch 1 in Form einer Flüssigkeit, eines Granulats oder in Stückform.
  13. Reinigungszusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Proteaseenzym eine Subtilisinvariante ist, die ausgewählt ist aus N76D/V104I, N76D/S99D/V104I, N76D/S103A/V104I, N76D/V104I/I107V, N76D7V104V/I107V, N76D/S101R/S103A/V104I, N76D/S99D/S101R/S103A/V104I, N76D/S101R/V104I und Mischungen davon.
  14. Textilreinigungszusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Proteaseenzym eine Bacillus-subtilisin-Variante ist, die ausgewählt ist aus N76D/V104I, N76D/S103A/V104I und Mischungen davon.
  15. Textilreinigungszusammensetzung, die Folgendes umfasst: (a) von etwa 0,0001% bis etwa 10% Proteaseenzym, bei dem es sich um eine N76D/S103A/V104I-Subtilisinvariante handelt, die von Bacillus-lentus-Subtilisin abgeleitet ist; (b) mindestens etwa 5% Tensid; (c) mindestens etwa 5% Builder; und (d) optional ein oder mehrere Reinigungszusammensetzungsmaterialien, die mit dem Proteaseenzym verträglich sind und die ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Lösungsmitteln, Puffern, Enzymen, Schmutzabweisemitteln, Tonschmutzentfernungsmitteln, Dispergierungsmitteln, Aufhellern, Schaumunterdrückern, Textilweichmachern, Schaumverstärkern, Enzymstabilisatoren, Bleichmitteln, Farbstoffen, Duftstoffen und Mischungen davon.
  16. Reinigungszusammensetzung nach Anspruch 15, wobei das Tensid ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Alkylbenzolsulfonaten, primären Alkylsulfaten, sekundären Alkylsulfaten, Alkylalkoxysulfaten, Alkylalkoxycarboxylaten, Alkylpolyglycosiden und ihren entsprechenden sulfatierten Polyglycosiden, alpha-sulfonierten Fettsäureestern, Alkyl- und Alkylphenolalkoxylaten, Betainen und Sulfobetainen, Aminoxiden, N-Methylglucamiden, nichtionischen primären Alkoholethoxylaten, nichtionischem primärem gemischtem Alkohol-Ethoxy/Propoxy und Mischungen davon, und wobei ferner der Builder ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Zeolithen, Polycarboxylaten, Schichtsilicaten, Phosphaten und Mischungen davon.
  17. Textilreinigungszusammensetzung nach Anspruch 16, die ferner ein oder mehrere Reinigungszusammensetzungsmaterialien umfasst, die ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Bleichmitteln, Textilweichmachern und Enzymen.
  18. Textilreinigungszusammensetzung nach Anspruch 15 in Form einer granulösen Textilreinigungszusammensetzung, die mindestens 30% Tensid umfasst.
  19. Geschirrspülzusammensetzung, die Folgendes umfasst: (a) 0,0001% bis 10% Proteaseenzym, bei dem es sich um eine Carbonylhydrolasevariante mit einer Aminosäuresequenz handelt, die in der Na tur nicht vorkommt und die abgeleitet ist von einer Subtilisinvorläufer-Carbonylhydrolase, und wobei das Proteaseenzym eine Bacillus-lentus-Subtilisinvariante ist, die ausgewählt ist aus N76D/S103A; N76D/V104I; N76D/S99D/S103A; N76D/S99D/V104I; N76D/S101R/S103A; N76D/S101R/V104I; N76D/S103A/V104I; N76D/V104I/I107V; N76D/V104Y/I107V; N76D/V104I/N123S; N76D/S99D/S101R/S103A; N76D/S99D/S101R/V104I; N76D/S99D/S103A/V104I; N76D/S101R/S103A/V104I; N76D/S103A/V104I/N123S; N76D/V104I/I107V/N123S; N76D/S99D/S101R/S103A/V104I; N76D/S99D/S103A/V104I/N123S; N76D/S99D/S101R/S103A/V104I/N123S; N76D/S103A/V104I/S128G; N76D/S103A/V104I/T260P; N76D/S103A/V104I/S265N; N76D/S103A/V104I/D197E; N76D/S103A/V104I/S105A; N76D/S103A/V104I/L1351; N76D/S103A/V104I/L126F; N76D/S103A/V104T/L107T; N76D/S103A/V104I/L126F/S265N, wobei die bezifferte Position natürlich vorkommendem Subtilisin von Bacillus amyloliquefaciens entspricht; und N76D/S103A/V104I/M222A und Mischungen davon; (b) etwa 0,1% bis etwa 10% Tensid; und (c) optional ein oder mehrere Reinigungszusammensetzungsmaterialien, die mit dem Proteaseenzym verträglich sind, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Lösungsmitteln, Puffern, Enzymen, Dispergierungsmitteln, Schaumunterdrückern, Enzymstabilisatoren, Bleichmitteln, Farbstoffen, Duftstoffen und Mischungen davon.
  20. Geschirrspülzusammensetzung nach Anspruch 19, wobei das Proteaseenzym eine N76D/S103A/V104I-Subtilisinvariante ist, die von Bacillus-lentus-Subtilisin abgeleitet ist.
  21. Körperreinigungszusammensetzung, die Folgendes umfasst: (a) etwa 0,001 Gew.-% bis etwa 5 Gew.-% Proteaseenzym, bei dem es sich um eine Carbonylhydrolasevariante mit einer Aminosäuresequenz handelt, die in der Natur nicht vorkommt, und die von einer Vorläufer-Carbonylhydrolase abgeleitet ist, und wobei das Proteaseenzym eine Bacillus-lentus-Subtilisinvariante ist, die ausgewählt ist aus N76D/S103A; N76D/V104I; N76D/S99D/S103A; N76D/S99D/V104I; N76D/S101R/S103A; N76D/S101R/V104I; N76D/S103A/V104I; N76D/V104I/I107V; N76D/V104VY/I107V; N76D/V104I/N123S; N76D/S99D/S101R/S103A; N76D/S99D/S101R/V104I; N76D/S99D/S103A/V104I; N76D/S101R/S103A/V104I; N76D/S103A/V104I/N123S; N76D/V104I/I107V/N123S; N76D/S99D/S101R/S103A/V104I; N76D/S99D/S103A/V104I/N123S; N76D/S99D/S101R/S103A/V104I/N123S; N76D/S103A/V104I/S128G; N76D/S103A/V104I/T260P; N76D/S103A/V104I/S265N; N76D/S103A/V104I/D197E; N76D/S103A/V104I/S105A; N76D/S103A/V104I/L135I; N76D/S103A/V104I/L126F; N76D/S103A/V104T/L107T; N76D/S103A/V104I/L126F/S265N und N76D/S103A/V104I/M222A und Mischungen davon; wo die bezifferte Position natürlich vorkommendem Subtilisin von Bacillus amyloliquefaciens entspricht, und. (b) zu 0,01 Gew.-% bis 95 Gew.-% ein Tensidsystem; und (c) optional zu 0,05% bis 50% einen Enzymstabilisator.
  22. Zusammensetzung nach Anspruch 20, wobei das Proteaseenzym einen Anteil von etwa 0,001 Gew.-% bis etwa 2 Gew.-% hat.
  23. Zusammensetzung nach Anspruch 20, wobei das Proteaseenzym einen Anteil von etwa 0,01 Gew.-% bis etwa 0,8 Gew.-% hat.
  24. Zusammensetzung nach Anspruch 20, wobei das Tensidsystem ein Tensid umfasst, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus anionischen Carbo xylaten, Aminoxiden, Alkylglucosiden, Glucoseamiden, Alkylsulfaten, Alkylethersulfaten, Acylisethionaten, Alkylsulfosuccinaten, Alkylphosphatestern, ethoxylierten Phosphatestern, Alkylglycerylethersulfonaten oder Mischungen davon.
  25. Zusammensetzung nach Anspruch 20, wobei das Tensidsystem ein Tensid umfasst, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Seifen, Acylglutamaten, Alkylsarcosinaten, Lauraminoxiden, Kokosaminoxiden, Kokosamidopropylaminoxiden, Decylglucosiden, Laurylsulfaten, Laurethsulfaten, C12-C18-Acylisethionaten oder Mischungen davon.
  26. Zusammensetzung nach Anspruch 25, wobei das Tensid eine Seife mit einem Anteil von mindestens 2 Gew.-% der Zusammensetzung ist.
  27. Zusammensetzung nach Anspruch 26, wobei die Seife in einem Anteil von mindestens 10 Gew.-% der Zusammensetzung vorliegt.
  28. Zusammensetzung nach Anspruch 27, wobei die Seife in einem Anteil von mindestens 25 Gew.-% der Zusammensetzung vorliegt.
  29. Zusammensetzung nach Anspruch 25, wobei das Verhältnis von Seife zu Proteaseenzym 2.000:1 bis 8:1 ist.
  30. Zusammensetzung nach Anspruch 29, wobei das Verhältnis von Seife zu Proteaseenzym 400:1 bis 40:1 ist.
  31. Zusammensetzung nach Anspruch 25, wobei das Proteaseenzym eine Carbonylhydrolasevariante mit einer Aminosäuresequenz, die in der Natur nicht vorkommt, ist und abgeleitet ist von einer Subtilisinvorläufer-Carbonylhydrolase, und wobei das Proteaseenzym eine Bacillus-lentus-Subtilisinvariante ist, die ausgewählt ist aus N76D/S103A; N76D/V104I; N76D/S99D/S103A; N76D/S99D/V104I; N76D/S101R/S103A; N76D/S101R/V104I; N76D/S103A/V104I; N76D/V104I/I107V; N76D/V104Y/I107V; N76D/V104I/N123S; N76D/S99D/S101R/S103A; N76D/S99D/S101R/V104I; N76D/S99D/S103A/V104I; N76D/S101R/S103A/V104I; N76D/S103A/V104I/N123S; N76D/V104I/I107V/N123S; N76D/S99D/S101R/S103A/V104I; N76D/S99D/S103A/V104I/N123S; N76D/S99D/S101R/S103A/V104I/N123S; N76D/S103A/V104I/S128G; N76D/S103A/V104I/T260P; N76D/S103A/V104I/S265N; N76D/S103A/V104I/D197E; N76D/S103A/V104I/S105A; N76D/S103A/V104I/L135I; N76D/S103A/V104I/L126F; N76D/S103A/V104T/L107T; N76D/S103A/V104I/L126F/S265N und N76D/S103A/V104I/M222A; wobei die bezifferte Position natürlich vorkommendem Subtilisin von Bacillus amyloliquefaciens entspricht; und Mischungen davon.
  32. Verfahren zur Reinigung von Textilien, wobei das Verfahren das Inkontaktbringen eines textilen Stoffes, der gereinigt werden muss, mit einem Proteaseenzym, bei dem es sich um eine N76D/S103A/V104I-Subtilisinvariante handelt, die von Bacillus-lentus-Subtilisin abgeleitet ist, umfasst.
  33. Verfahren zur Reinigung von Geschirr, wobei das Verfahren das Inkontaktbringen von Geschirr, das gereinigt werden muss, mit einem Proteaseenzym, bei dem es sich um eine N76D/S103A/V104I-Subtilisinvariante handelt, die von Bacillus-lentus-Subtilisin abgeleitet ist, umfasst.
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