DE69430314T2

DE69430314T2 - Ein aglucon isoflavon angereichertes pflanzliches molkeprotein, das molkeprotein und ein verfahren zur herstellung

Info

Publication number: DE69430314T2
Application number: DE69430314T
Authority: DE
Inventors: A. Bryan; L. Shen
Original assignee: Protein Technologies International Inc
Current assignee: Archer Daniels Midland Co
Priority date: 1993-10-12
Filing date: 1994-09-21
Publication date: 2002-11-14
Anticipated expiration: 2014-09-22
Also published as: RU2130073C1; EP0723536B2; CN1135214A; BR9407822A; WO1995010512A1; DE69430314T3; DE69430314D1; JP2006087440A; CA2173999C; JP3787844B2; EP0723536B1; JPH09506077A; EP0723536A1; US5637561A; EP0723536A4; AU680554B2; JP2007119491A; BR1101108A; KR100303909B1; CA2173999A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die gegenwärtige Erfindung bezieht sich auf die Herstellung einer Aglucon Isoflavon angereicherten Pflanzenproteinmolke und Molkeprotein durch Umsetzen einer Pflanzenproteinmolke, enthaltend Protein und Isoflavone, mit einem oder mehreren beta-Glucosidase Enzymen oder Säure unter Umwandeln von im wesentlichen aller der Glucon Isoflavone zu Agluconen und dadurch zur Verfügung stellen der Aglucon angereicherten Molke. Ein Aglucon angereichertes Molkeprotein wird auch erhalten durch Gewinnung des Proteins aus der angereicherten Molke.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Isoflavone treten in einer Mannigfaltigkeit von Hülsenpflanzen, einschließlich Pflanzenproteinmaterialien, wie Sojabohnen, auf. Diese Verbindungen schließen ein Daidzin, 6-OAc Daidzin, 6"-OMal Daidzin, Daidzein, Genistin, 6"-OAc Genistin, 6"-OMal Genistin, Genistein, Glycitin, 6"-OAc-Glycitin, 6"-OMal-Glycitin, Glycitein, Biochanin A, Formononetin und Coumestrol. Typischerweise sind diese Verbindungen mit dem inhärenten bitteren Aroma von Sojabohnen assoziiert, und bei der Herstellung von kommerziellen Produkten wie Isolaten und Konzentraten ist der Fokus gewesen, diese Materialien zu entfernen. Beispielsweise werden in einem konventionellen Verfahren für die Herstellung einer Sojabohnenproteinisolierung, in der Sojabohnenflocken mit einem wäßrigen alkalischen Medium extrahiert werden, viel der Isoflavone in dem Extrakt solubilisiert und verbleibt solubilisiert in der Molke, die üblicherweise im Anschluß an Säurefällung des Proteins verworfen wird, unter Bilden einer Isolierung. Restliche Isoflavone, belassen in der Säure gefällten Proteinisolierung, werden üblicherweise durch umfassendes Waschen der Isolierung entfernt.
Es ist kürzlich erkannt worden, daß die in Pflanzenproteinen enthaltenen Isoflavone, wie Sojabohnen, das Wachstum von Humankrebszellen, wie Brustkrebszellen und Prostatakrebszellen, inhibieren können, wie in den folgenden Artikeln beschrieben:
"Genistein Inhibition of the Growth of Human Breast Cancer Cells, Independence from Estrogen Receptors and the Multi-Drug Resistance Gene" von Peterson und Barnes, Biochemical and Biophysical Research, Communications, Band 179, Nr. 1, Seiten 661-667, August 30, 1991: "Genistein and Biochanin A Inhibit the Growth of Human Prostate Cancer Cells but not Epidermal Growth Factor Receptor Tyrosine Autophosphorylation" von Peterson und Barnes, The Prostate, Band 22, Seiten 335-345 (1993) und "Soybeans Inhibit Mammary Tumors in Models of Breast Cancer" von Barnes et al. Mutagens and Carcinogens in the Diet, Seite 239-253 (1990).
Von den zuvor angegebenen Isoflavonen existieren verschiedene als Glucoside oder als Glucone, mit einem Glucosemolekül angefügt an der sieben Position, wie in der Formel im nachfolgenden veranschaulicht. Verschiedene der Glucone, wie das 6"-OAc Genistin, enthalten eine Acetatgruppe, angefügt an die sechs Position des Glucosemoleküls selbst. Während alle die Isoflavone, einschließlich der Glucoside, von Interesse in medizinischer Bewertung sind, sind die spezifischen Isoflavone von meistem Interesse die Aglucone, wobei das Glucosemolkül nicht angefügt ist. Diese Isoflavone sind nicht so wasserlöslich wie die Glucone oder Glucoside. Spezifische Isoflavone in dieser Kategorie sind Daidzein, Genistein und Glycitein. Diese Aglucone haben die folgende allgemeine Formel:
wobei R&sub1;, R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; ausgewählt sein können aus der Gruppe, bestehend aus H, OH und OCH&sub3;. Die gegenwärtige Erfindung richtet sich deshalb auf die Aglucone und Anreicherung einer Pflanzenproteinmolke oder Molkeprotein mit diesen Materialien.
Verfahren sind in der Technik zum Umwandeln von Glucon Isoflavonen zu Aglucon Isoflavonen bekant, wie in Japanischer Patentanmeldung 258 669 von Obata et al. beschrieben. Derartige Verfahren erzielen nur ein mäßiges Umwandlungsausmaß und sind deshalb nicht wünschenswert, insbesondere für kommerzielle Verfahren in großem Umfang. Zusätzlich lehren bekannte Verfahren, wie in der '669 Anmeldung beschrieben, Entfernen der Isoflavone aus dem Proteinmaterial und beschreiben nicht, wie eine Aglucon Isoflavon angereicherte Proteinmolke herzustellen ist. Deshalb besteht ein Verlangen nach einem Verfahren zum Umwandeln mindestens einer Mehrheit und vorzugsweise im wesentlichen aller Glucon Isoflavone zu Aglucon Isoflavonen und zum Herstellen einer Aglucon Isoflavon angereicherten Molke und Molkeprotein.
Matsuura et al.: 'β-Glucosidase from Soybeans Hydrolyse Daidzin and Genistin', Journal of Food Science, Band 58, Nr. 1, 1993, Seite 144-147 offenbart Verwenden von sterilisierter Sojabohnenmilch als ein Substrat zum Testen der Aktivität von β-Glucosidase Enzymen. Experimente in dieser Entgegenhaltung zeigen, daß die Isoflavon Glucoside Daidzin und Genistin in Sojabohnenmilch durch β-Glucosidase Enzyme hydrolysiert werden. In einem Beispiel waren die Prozent Hydrolyse 28% für Daidzin und 29% für Genistin.
US-A-4064277 offenbart, daß residuales β-Glucosidaseenzym, enthalten in ganzen Sojabohnen, mit Glycosidsubstraten unter Bilden von beispielsweise Daidzein und Glycitein reagiert. Diese Entgegenhaltung lehrt, daß Verarbeiten von Sojabohnen, bevor die β-Glucosidase inaktiviert wird, in der Anwesenheit eines konkurrierenden Inhibitors für β-Glucosidase bewirkt werden sollte, um ein Sojabohnenprodukt zur Verfügung zu stellen, das kein Kehle-zuschnürendes Gefühl erzeugt.
US-A-4889921 offenbart ein Verfahren zum Herstellen einer Pflanzenproteinisolierung, insbesondere aus Rapssamen oder Canolamaterial, durch Extrahieren mit einem wäßrigen Lösungsmittel unter Bilden einer Extraktionslösung, Einstellen des pH unter Fällen von Proteinen aus der Lösung und Trennen des gefällten Proteins durch Ultra- oder Diafiltration unter Bilden einer Pflanzenproteinisolierung.
Coward et al.: 'Genistein, Daidzein and their β-Glycoside Conjugates: Antitumor Isoflavones in Soybean Foods from American and Asian Diets', Journal of Agricultural Food Chemistry, Band 41, Nr. 11, 1993, Seite 1961-1967 offenbart, daß Sojabohnenproteinisolierung, hergestellt durch Solubilisierung von Proteinen und löslichen Kohlehydraten aus Sojabohnenmehl durch eine alkalische (pH 9,5) Extraktionsstufe und anschließende Säurefällung (pH 4,5) des extrahierten Proteins Isoflavon Konzentrationen enthält, die 4-6 fach geringer als in Sojabohnenmehl oder Sojabohnenproteinkonzentrat sind, wenn als Milligramm pro Gramm Protein ausgedrückt.
Es ist deshalb eine Aufgabe der gegenwärtigen Erfindung, eine Aglucon Isoflavon angereicherte Proteinmolke, Molkeprotein und ein Verfahren zum Herstellen dieser zur Verfügung zu stellen. Dieses und andere Aufgaben werden insbesondere in der detaillierten Beschreibung der gegenwärtigen Erfindung, im nachfolgenden dargestellt, erzielt.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die gegenwärtige Erfindung liefert Verfahren zum Herstellen einer Aglucon Isoflavon angereicherten Pflanzenproteinmolke, umfassend Erhalten einer Pflanzenproteinmolke, umfassend Glucon Isoflavone, und Umsetzen der Glucon Isoflavone mit einer ausreichenden Menge von mindestens einem von beta-Glucosidase und Esterase für eine Zeitdauer, Temperatur und pH, ausreichend, eine Mehrheit der Glucon Isoflavone in der Molke zu Aglucon Isoflavonen umzuwandeln und dadurch eine Aglucon Isoflavon angereicherte Molke herzustellen. Die gegenwärtige Erfindung liefert auch Verfahren zum Herstellen derartiger Molke, wobei ergänzende beta-Glucosidase und/oder Esterase zu der Molke hinzugefügt wird unter Herstellen von Aglucon Isoflavon angereicherter Molke. Die gegenwärtige Erfindung liefert auch Verfahren zum Herstellen derartiger Molke durch Behandlung mit einer oder mehreren Säuren. Zusätzlich liefert die gegenwärtige Erfindung Aglucon Isoflavon angereicherte Pflanzenproteinmolke und Molkeprodukte. Zusätzlich liefert die gegenwärtige Erfindung auch Verfahren zum Gewinnen in relativ hohen Anteilen Isoflavone in Molke und Molkeprotein aus Pflanzenproteinmaterialien.

BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Obwohl die gegenwärtige Erfindung im Hinblick auf Sojabohnenmolke beschrieben wird, und obwohl das Verfahren besonders geeignet für die Herstellung von Aglucon Isoflavon angereicherten Molke aus Sojabohnenmaterialien ist, ist das Verfahren nichtsdestoweniger allgemein anwendbar auf die Herstellung von Aglucon angereicherten Molken aus einer Mannigfaltigkeit von Pflanzenproteinquellen, die Isoflavone enthalten. Ein Beispiel einer derarigen Quelle ist ein Pflanzenproteinmaterial, umfassend Sojabohne oder Sojabohnenmaterialien. Der Ausdruck "Sojabohnenmaterial", wie hier verwendet, bezieht sich auf Sojabohnen oder irgendein Sojabohnenderivat.
Das Ausgangsmaterial in Übereinstimmung mit der bevorzugten Ausführungsform ist Sojabohnenflocken, wovon das Öl durch Lösungsmittelextraktion entfernt worden ist. Die Flocken werden mit einem wäßrigen Extraktionsmittel mit einem pH über etwa dem isoelektrischen Punkt des Proteinmaterials, vorzugsweise einem pH von etwa 6,0 bis etwa 10,0 und am bevorzugtesten einem pH von etwa 6,7 bis etwa 9,7, extrahiert. Typische alkalische Reagenzien können gewünschtenfalls verwendet werden, den pH des wäßrigen Extraktionsmittels, einschließend Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid und Calciumhydroxid, zu erhöhen. Die gewünschten Isoflavon Verbindungen werden typischerweise in dem wäßrigen Extrakt solubilisiert. Es ist auch wünschenswert, um Gewinnung dieser Verbindungen in dem wäßrigen Extrakt zu maximieren, daß das Gewichtsverhältnis von Extrakt zu Sojabohnenflocken auf spezifische Spiegel kontrolliert wird, um so viel der inhärenten Isoflavone in dem Proteinmaterial wie möglich zu solubilisieren.
Extraktion der Proteine und Isoflavone kann in einer Mannigfaltigkeit von Wegen, einschließlich Gegenstromextraktion der Flocken bei einem Gewichtsverhältnis von wäßrigem Extraktionsmittel zu Flocken von etwa 8 : 1 bis 16 : 1 durchgeführt werden, wobei der anfängliche Extrakt verwendet wird, die Flocken zu extrahieren und einen wäßrigen Extrakt von Protein und Isoflavonen zur Verfügung zu stellen. Alternativ kann ein Zwei-Stufen Extraktionsverfahren verwendet werden, bei dem das Gewichtsverhältnis von Extraktionsmittel zu Flocken in der anfänglichen Stufe etwa 10 : 1 umfaßt, und dann eine zweite Extraktion der Flocken mit frischem Extraktionsmittel bei einem Gewichtsverhältnis von Extraktionsmittel zu Flocken von etwa 6 : 1 stattfindet, so daß das kombinierte Gewichtsverhältnis von Extraktionsmittel zu Flocken in beiden Stufen nicht ein Gesamtgewichtsverhältnis von Extraktionsmittel zu Flocken von etwa 16 : 1 übersteigt.
Der pH des sich ergebenden Proteinextrakts mit solubilisierten Isoflavonen wird dann auf etwa den isoelektrischen Punkt des Proteins eingestellt, um das Protein zu fällen. Der pH wird auf etwa den isoelektrischen Punkt des Proteins durch die Zugabe einer eßbaren Säure, wie Essigsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Salzsäure oder irgendeines anderen geeigneten Reagenzes eingestellt. Der isoelektrische Punkt für Sojabohnenprotein ist typischerweise etwa 4,4 bis 4,6. Das Proteinmaterial wird in der Form eines Quarks gefällt, der von dem wäßrigen Extrakt getrennt werden kann. Auf den verbleibenden wäßrigen Extrakt des Ausgangsmaterials wird als die "Molke" von was auch immer einer Pflanzenproteinquelle, die als das Ausgangsmaterial verwendet wird, bezug genommen. Die Isoflavone verbleiben für den meisten Teil solubilisiert in der Molke, und zum Maximieren von Gewinnung in der Molke kann zusätzliches Waschen des gefällten Proteins wünschenswert sein, vollständige Gewinnung der Isoflavone zu gewährleisten.
Glucon Isoflavone in der Molke werden zu Aglucon Isoflavonen durch Reaktion mit Enzym oder Reaktion mit Säure umgewandelt. Umwandlung unter Verwenden eines Enzyms ist wie folgt. Glucon Isoflavone in Molke werden in einem Reaktionsverfahren mit einer ausreichenden Menge eines oder mehrerer beta-Glucosidase Enzyme unter Umwandeln einer Mehrheit und vorzugsweise im wesentlichen aller Isoflavone in Gluconform zu Agluconen umgesetzt. Das beta-Glucosidase Enzym kann natürlich in dem Sojabohnenmaterial vorhanden sein oder von mikrobiellem Wachstum vorhanden sein, auf das hier als "residuales" Enzym bezug genommen wird, oder kann zu der Molke hinzugefügt werden. Auf hinzugefügtes Enzym wird hier als "ergänzendes Enzym" bezug genommen. Allgemein, wenn die Konzentration von residualem Enzym in der Molke unzureichend ist, eine Mehrheit und vorzugsweise im wesentlichen alle der Isoflavone in Gluconform zu Agluconform umzuwandeln, dann sollte ergänzendes Enzym hinzugefügt werden. Die Menge von Enzym, ausreichend, die Umwandlung von Isoflavonen durchzuführen, variiert bei Vielheit von Faktoren, einschließlich der Arten von vorhandenen Enzymen, Verteilung von Enzymkonzentrationen, pH des Systems und Aktivitäten von vorhandenen Enzymen. Sowie einmal ausreichende Konzentrationen von Enzymen vorhanden sind, entweder über residuale Enzyme, ergänzende Enzyme oder beide, wird die Molke mit solubilisierten Isoflavonen mit den beta-Glucosidase Enzymen für eine Zeitdauer, Temperatur und pH, ausreichend eine Mehrheit und vorzugsweise im wesentlichen alle der Glucon Isoflavone, enthalten in der Molke, zu der Agluconform umzuwandeln, umgesetzt.
Bevorzugte ergänzende beta-Glucosidase Enzyme schließen ein Biopectinase 100L und 300L, Biopectinase OK 70L, Lactase F und Lactozyme. Lactase F ist erhältlich von Amano International Enzyme Co., Inc., P.O. Box 1000 Troy, VA 22974, welche einen optimalen pH Bereich von etwa 4 bis etwa 6 hat, und Lactozyme ist erhältlich von Novo Industries, Enzyme Division, Novo Alle, DK 2880 Bagsvaerd, Dänemark, welche einen optimalen pH Bereich von etwa 7 hat. Biopectinase 100L, Biopectinase 300L und Biopectinase OK 70L sind erhältlich von Quest International, Sarasota, Florida. Ergänzende Enzyme werden in Mengen hinzugefügt, ausreichend, eine Mehrheit und vorzugsweise im wesentlichen alle der solubilisierten Glucon Isoflavone, enthalten in der Molke, zu Agluconen umzuwandeln. In Fällen, wo es notwendig ist, ergänzende Enzyme hinzuzufügen, beträgt die Menge von hinzugefügtem Enzym etwa 0,5 Gew.-% bis etwa 5 Gew.-% der Molkefeststoffe auf einer Trockenbasis.
Eine andere Klasse von Enzymen, geeignet für Verabreichung als ergänzende Enzyme, sind Esteraseenzyme. Von diesen Enzymen nimmt man an, daß sie gut geeignet für die hier beschriebenen Verfahren bevorzugter Ausführungsform sind, da sie die Acetat- und Malonat-Konjugate zu Glucon Isoflavonen umwandeln durch Entfernen der Acetat- und Malonatgruppen von den Isoflavonkonjugaten. In der bevorzugtesten Ausführungsform werden beide Arten von Enzymen, beta-Glucosidase und Esterase Enzyme, verwendet.
Die Verfahren der bevorzugten Ausführungsform sind vorzugsweise Einstufen-Verfahren und erzielen sehr hohe Umwandlungsgrade von Isoflavonen (von Gluconform zu Agluconform) in relativ kurzen Zeitdauern und mit relativer Leichtigkeit und Ökonomie. Der Ausdruck "Einstufen" Reaktionsverfahren, wie hier verwendet, bezieht sich auf ein Reaktionsverfahren, bei dem bestimmte Verfahrensparameterwerte allgemein über den Verlauf des Reaktionsverfahrens erhalten bleiben. Diese Verfahrensparameter schließen ein pH und Temperatur.
Die sehr hohen Umwandlungsgrade sind derartig, daß eine Mehrheit und vorzugsweise im wesentlichen alle der Isoflavone in Gluconform, vorhanden in der Molke, zu Agluconform umgewandelt werden. Der Ausdruck "eine Mehrheit" bezieht sich auf das Umwandlungsausmaß von Glucon Isoflavonen zu Aglucon Isoflavonen von mindestens etwa 50%. Der Ausdruck "im wesentlichen alles" bezieht sich auf das Umwandlungsausmaß von Glucon Isoflavonen zu Aglucon Isoflavonen von mindestens etwa 80%, und am bevorzugtesten mindestens etwa 90%.
Obwohl es nicht gewünscht ist, durch irgendeine bestimmte Theorie gebunden zu sein, wird angenommen, daß die überraschend und unerwartet hohen Umwandlungsgrade der hier beschriebenen Verfahren aus einer Kombination von Verfahrensparametern, verwendet während des Einstufen- Reaktionsverfahrens, herrühren. Es ist bevorzugt, daß pH des Reaktionssystems aufrechterhalten bleibt oder annähernd so bei einem Wert von etwa 4 bis etwa 8 und am bevorzugtesten bei einem Wert, bei dem das (die) Enzym(e) äußerst aktiv vor Reaktion mit dem (den) Isoflavonkonjugat(en) während des Einstufen- Reaktionsverfahrens sind.
Der pH der Molke wird typischerweise auf etwa den pH Bereich eingestellt, bei dem das spezifische Enzym äußerst aktiv vor Reaktion mit dem Enzym ist. Es ist bevorzugt, daß die Temperatur des Reaktionssystems erhalten bleibt, oder annähernd so, bei einer Temperatur von etwa 40ºC bis etwa 60ºC und am bevorzugtesten bei einer Temperatur von etwa 60ºC während des Einstufen-Reaktionsverfahrens. Allgemein sind die Zeitdauern, notwendig zum Erzielen von Umwandlung von im wesentlichen allen Glucon Isoflavonen zu Agluconen über die hier beschriebenen Einstufen-Verfahren von etwa 2 Stunden bis etwa 24 Stunden. In einigen Fällen kann es wünschenswert sein, Zeitdauern größer als 24 Stunden, wie 48 Stunden, zu verwenden.
Ein alternatives Verfahren für Zwecke der gegenwärtigen Erfindung für Umwandlung von Glucon Isoflavonen zu Aglucon Isoflavonen besteht darin, die Molke mit einer oder mehreren eßbaren Säuren bei einem pH, Zeit und Temperatur, ausreichend, eine Mehrheit und vorzugsweise im wesentlichen alle der Glucon Isoflavone zu Aglucon Isoflavonen umzuwandeln, auszusetzen. Dieses tendiert auch dazu, das Protein unlöslich zu machen, wodurch es dem Protein ermöglicht wird, von der verbleibenden Molke getrennt zu werden. Ein bevorzugter pH Bereich für dieses Verfahren beträgt etwa 1,0 bis etwa 2,0, typische Temperaturen sind von etwa 80ºC bis etwa 90ºC oder höher, und typische Zeitdauern sind von etwa 30 bis etwa 180 Minuten oder länger. Die Umwandlung von Glucon Isoflavonen zu Aglucon Isoflavonen kann auch bei einem höheren pH auftreten. Wirksame Reaktionen können bei pH Werten so hoch wie etwa pH 4,5 auftreten. Aber die Reaktion ist viel langsamer und benötigt viel längere Zeiten. Beispielsweise ist bei einem pH von 4,5 und Temperatur von 50ºC eine Zeitdauer von etwa 24 Stunden notwendig.
Im Anschluß an Umwandlung der Glucon Isoflavone zu Aglucon Isoflavonen kann die flüssige Molke wie gewünscht verwendet werden ohne Trocknen oder Entfernung des Proteins, oder alternativ, das Molkeprotein kann gewonnen werden unter Konzentrieren der Aglucon Isoflavone in dem Protein, weil die Aglucon Isoflavone weniger löslich als die Glucon Isoflavone sind. Gewinnung von Molkeprotein, angereichert mit Aglucon Isoflavonen, kann mittels herkömmlicher Verfahren, einschließlich Entwässern, Hitzekoagulation und Ultrafiltration, durchgeführt werden. Das sich ergebende angereicherte Molkeprotein kann entwässert und gerocknet werden mittels herkömmlicher Mittel unter zur Verfügung stellen eines getrockneten Molkeproteins, angereichert mit Aglucon Isoflavonen. Ein Beispiel eines Aglucon Isoflavon angereicherten Pflanzenmolkeproteins in Übereinstimmung mit der bevorzugten Ausführungsform hat einen Trockenbasisgenisteingehalt von etwa 2,6 bis etwa 8,7 mg/g und einen Trockenbasisdaidzeingehalt von etwa 2,5 bis etwa 6,0 mg/g.
Die gegenwärtige Erfindung liefert auch Verfahren zum Gewinnen von Isoflavonen in Molke und Molkeprotein in sehr hohen Anteilen aus einem Pflanzenproteinmaterial wie einem Sojabohnenmaterial. Die Gewinnungsspiegel, erhältlich durch die hier beschriebenen Verfahren, sind typischerweise mindestens 50%, vorzugsweise 65% und am bevorzugtesten 80%, basierend auf dem Gesamten aller Formen des bestimmten Isoflavons in dem Ausgangspflanzenproteinmaterial. Obwohl es nicht gewünscht ist, an irgendeine bestimmte Theorie gebunden zu sein, wird angenommen, daß die hohen Gewinnungen aus den hier beschriebenen Umwandlungsreaktionen, gekoppelt mit den verschiedenen auch beschriebenen Verarbeitungsverfahren, stammen. Durch Umwandeln von Glucon Isoflavon Konjugaten, die relativ löslich sind, zu weniger löslichen Agluconformen, ist es bei einer bestimmten Verarbeitungsstufe möglich, in dem sich ergebenden Produkt einen hohen Prozentsatz der Isoflavone in dem Beschickungsmaterial zu gewinnen.
Die folgenden Beispiele beschreiben spezifische, aber nicht beschränkende Ausführungsformen der gegenwärtigen Erfindung.

EXPERIMENTELLES

Proben von 16% wäßrigen Suspensionen von sprühgetrockneter Molke wurden in 0,02 N Phosphatpuffer (pH 7) hergestellt und 0, 3 und 24 Stunden bei 45ºC mit und ohne hinzugefügte Enzympräparationen inkubiert. Die Proben, die ergänzendes Enzym aufnahmen, erhielten Biopectinase 100L in einer Konzentration von 0,4 Gew.-%. Alle Proben wurden in bezug auf Isoflavon Gehalt analysiert. Die Prozent Verteilung der Isoflavone, festgestellt über den Verlauf des Experiments, ist in Tabelle 1 im nachfolgenden angegeben. TABELLE 1
Aglucon Isoflavon Konzentration von Proben, in die kein Enzym hinzugefügt war, war nach 24 Stunden Inkubation relativ niedrig, beispielsweise Genistein 10%, Daidzein 6% und Glycitein 8%. Die günstige Wirkung der Zugabe von ergänzendem Enzym wird durch die beträchtlich höheren Konzentrationen von Genistein und Daidzein gezeigt, beispielsweise 70% und 66%. Die Konzentration jedes Typs von hier beschriebenem Isoflavon basiert auf dem Gesamten aller Formen jenes Isoflavontyps.
In einem anderen Experiment wurden Proben von Molke auf pH 7 eingestellt. Proben wurden bei 45ºC inkubiert. Nach 24 Stunden Inkubation wurden in einer Hälfte der Proben ausreichende Mengen eines ergänzenden beta-Glucosidase Enzyms hinzugegeben, Biopectinase 100L. Alle Proben wurden bei 45ºC angeordnet und zusätzliche 22 Stunden inkubiert. Unterproben wurden bei t = 0, 5, 24 und 46 Stunden genommen und analysiert. Alle Proben wurden im Hinblick auf Isoflavon Gehalt analysiert. Die Prozente jedes Isoflavon, gefunden über den Experimentverlauf, sind in Tabellen 2A und 2B, im nachfolgenden dargestellt, angegeben. Tabelle 2A faßt den Isoflavongehalt von Proben zusammen, in denen kein ergänzendes beta-Glucosidase Enzym hinzugefügt war. Tabelle 2B gibt die Isoflavonverteilung in Proben an, die ursprünglich 24 Stunden inkubiert worden waren, ohne irgendein ergänzendes Enzym hinzugefügt zu haben, die dann eine ausreichende Menge von Biopectonase 100L erhielten. Somit sind die in Tabelle 2B angegebenen Zeiten in bezug auf das Ereignis des Hinzufügens von ergänzendem Enzym zu den Proben. Beispielsweise wurden die Proben, angegeben für t = 0 Stunden in Tabelle 2B, tatsächlich 24 Stunden ohne irgendein Enzym inkubiert. Und die in Tabelle 2B bei t = 22 Stunden aufgelisteten Proben wurden 22 Stunden im Anschluß an die Zugabe des ergänzenden Enzyms inkubiert und 24 Stunden vor der Zugabe von ergänzendem Enzym inkubiert. TABELLE 2A TABELLE 2B
Die Daten in Tabelle 2A veranschaulichen Proben mit marginal ausreichenden Konzentrationen von residualem Enzym, weil die Genistein, Daidzein und Glycitein Konzentrationen nach Inkubation für 24 und 46 Stunden weniger als 50% sind. Die Daten in Tabelle 2B veranschaulichen die Nutzen von Hinzufügen von ergänzendem Enzym, weil nach Zugabe des Enzyms Umwandlung 100% für Genistein und Daidzein und 87% für Glycitein betrug.
In einer anderen Serie von Experimenten wurden Proben von Molke auf einen pH von 4,5 eingestellt und mit ergänzendem Enzym Lactase F inkubiert. Die Konzentration von Lactase F betrug 0,02 Gramm Lactase F pro 100 g Molke. Proben wurden bei t = 0, 1,5, 5 und 17 Stunden während Inkubation bei 52ºC genommen. Tabelle 3 zeigt die Änderung und Verteilung der Isoflavone über den Verlauf des Experiments. TABELLE 3
Die Daten in Tabelle 3 zeigen betröchtliche Umwandlung zu Glycitein nach 17 Stunden.
In einem anderen Experiment wurden Proben von Molke autoklaviert unter Zerstören von residualen Enzymen und Kontaminatmikroben, pH eingestellt auf 4,5, die Proben in zwei Gruppen gespalten und Enzym wie folgt hinzugegeben. Zu der ersten Gruppe von Proben wurde 0,1 g Präparation von ergänzendem Enzym pro jeweils 100 g primärer Molke in den Proben hinzugegegeben. Zu der zweiten Gruppe wurden 0,001 Gramm Präparation von ergänzendem Enzym pro jeweils 100 g Molke (Enzym wurde 1 zu 100 für diese Verwendung verdünnt) hinzugegeben. Molkeproben wurden bei entweder 40ºC oder 60ºC 23 Stunden lang inkubiert. Unterproben wurden bei t = 0, 1, 2, 4, 6 und 23 Stunden gezogen. Das ergänzende Enzym Biopectinase 300L wurde von Quest International zur Verfügung gestellt. Alle Proben wurden in bezug auf Isoflavon Gehalt analysiert. Die Verteilung der Isoflavone, gefunden über den Verlauf des Experiments, ist im nachfolgenden in Tabelle 4 dargestellt. Biopectinase 300L wandelte Isoflavon Konjugate zu Agluconen zu 90% Genistein, 86% Daidzein und 60% Glycitein bei pH 4,5, 60ºC nach 23 Stunden unter Verwenden von 0,1 g Enzympräparation pro 100 Gramm Molke um. Beträchtliche Umwandlung war nach nur 1 Stunde bei 60ºC mit Biopectinase 300L aufgetreten, wie durch 70% Genistein, 62% Daidzein und 44% Glycitein gezeigt. Die Umwandlungsgeschwindigkeit und der Dosisspiegel von 0,1 Gramm Enzympräparation pro 100 Gramm Molke war sowohl bei 40ºC wie bei 60ºC wirksam. Die Dosisrate von ergänzendem Enzym 100fach verdünnter (0,001 Gramm pro 100 Gramm primäre Molke) war nicht 100fach langsamer. TABELLE 4
Die Daten in Tabelle 4 zeigen das beträchtliche Umwandlungsausmaß, das erzielbar ist durch die Verfahren der gegenwärtigen Erfindung.
In einer anderen Serie von Experimenten wurden Proben von Molke pH eingestellt auf 7 und auf 8, und 0,05 g Lactase F oder Lactozyme wurden pro 5 g primärer Molke (5% Enzym, bezogen auf Gewicht, von geschätzten 2% Feststoffen in der primären Molke) hinzugegeben. Proben wurden bei 40ºC und bei 60ºC inkubiert. Eine Probe wurde gezogen, bevor Enzym hinzugefügt war (t = 0) und nach 24 Stunden Inkubation bei Zieltemperatur. Die Enzympräparation wurde wie folgt hergestellt. Kontrollen waren Proben, inkubiert ohne hinzugefügte Enzyme. Alle Proben wurden in bezug auf Isoflavon Gehalt analysiert. Die Änderung in Prozent Verteilung von Isoflavon in Molke nach der 24 Stunden Inkubationsdauer mit entweder Lactase F oder Lactozyme ist in Tabelle 5, im nachfolgenden dargestellt, gezeigt. Die Proben wurden nicht sterilisiert, bevor hinzuzufügende Enzyme in mikrobiellem Kontaminantenwachstum nicht in irgendeiner Weise inhibiert waren. TABELLE 5
Unter Bezugnahme auf Tabelle 5 trat ein Anstieg an Umwandlung zu Genistein von 40% bis 79% bei pH von 7 und nach 24 Stunden Inkubation durch Erhöhen der Inkubationstemperatur von 40ºC bis 60ºC auf. In ähnlicher Weise können sogar größere Umwandlungen durch Erhöhen von pH, wie von 7 auf 8, durchgeführt werden. Im Hinblick auf Genistein erhöhte sich Umwandlung von 79% auf 93% durch jene pH Änderung bei einer Temperatur von 60ºC und Zeit von 24 Stunden.
In einer anderen Serie von Experimenten wurden die Prozent Gewinnung von Genistein und Daidzein in einem Molkeprotein, abstammend von Sojabohnen, untersucht. Die Prozent Gewinnung wurden gefunden durch Bestimmen der Menge von Genistein (oder Daidzein) in dem Molkeprotein und Ausdrücken jener Menge als einen Prozentsatz, basierend auf der Gesamtmenge aller Formen von Genistein (oder Daidzein) in dem Sojabohnenausgangsmaterial. 100 g entfettetes Sojabohnenmehl wurden mit 1000 g Wasser bei 32ºC 15 Minuten lang extrahiert. Der pH der Aufschlämmung betrug 6,7. Dieses lieferte ein Verhältnis von Extraktionsmittel zu Mehl von 10,1. Die Aufschlämmung wurde dann 5 Minuten unter Entfernen des verwendeten Mehls zentrifugiert. Das verwendete Mehl wurde ein zweites Mal mit 600 g Wasser bei 32ºC 5 Minuten lang extrahiert. Dieses lieferte ein Verhältnis von Extraktionsmittel zu Mehl von 6 : 1. Der zweite Extrakt wurde auch von dem verwendeten Mehl durch Zentrifugation 5 Minuten lang getrennt. Die ersten und zweiten wäßrigen Extrakte wurden kombiniert. Die kombinierten Extrakte wurden auf einen pH von 4,5 durch die Zugabe von HCl unter Fällen des Proteins von der Sojabohnenmolke eingestellt. Die Sojabohnenmolke wurde sprühgetrocknet und dann in Wasser auf einen 20% Feststoffspiegel resuspendiert. Der pH der Molkeaufschlämmung wurde auf 4,5 eingestellt, und die Temperatur bei 50ºC beibehalten. Ein Gewichtsprozent der Molkefeststoffe von Lactase F, ein Enzym mit beta-Glucosidaseaktivität, wurde hinzugegeben und ermöglicht, 20 Stunden lang bei 50ºC zu reagieren unter Gewährleisten vollständiger Umwandlung der Glucon Isoflavone zu der Agluconform. Im Anschluß an die Reaktion wurde die Molkeaufschlämmung auf 95ºC für eine Minute erhitzt, um die Molkeproteine unlöslich zu machen. Das unlösliche Molkeprotein, enthaltend die Aglucon Isoflavone, wurde durch Zentrifugation gewonnen. Die Menge von in dem Molkeprotein gewonnenem Genistein betrug 81% des Gesamten aller Formen von Genistin und Genistein in dem Ausgangssojabohnenmaterial (entfettetes Sojabohnenmehl). In ähnlicher Weise betrug die Menge von in dem Molkeprotein gewonnenem Daidzein 69%.
Der Isoflavongehalt wurde mengenmäßig wie folgt bestimmt. Die Isoflavone werden aus Sojabohnenprodukten durch Mischen von 0,75 g Probe (sprühgetrocknetes oder fein gemahlenes Pulver) mit 50 ml 80/20 Methanol/Wasser Lösungsmittel extrahiert. Die Mischung wird 2 Stunden bei Raumtemperatur mit einem Orbitalschüttler geschüttelt. Nach 2 Stunden werden die verbleibenden ungelösten Materialien mittels Filtration durch Whatman Nr. 42 Filterpapier entfernt. Fünf ml des Filtrats werden mit 4 ml Wasser und 1 ml Methanol verdünnt.
Die extrahierten Isoflavone werden mittels HPLC (Hochleistungsflüssigkeitschromatographie) unter Verwenden einer Beckman C18 Umkehrphasensäule getrennt. Die Isoflavone werden auf die Säule gespritzt und mit einem Lösungsmittelgradienten, beginnend mit 88% Methanol, 10% Wasser und 2% Eisessig und endend mit 98% Methanol und 2% Eisessig, eluiert. Bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,4 ml/Min. sind alle Isoflavone - Genistin, 6"-O-Acetylgenistin, 6"-O-Malonylgenistin, Genistein, Daidzin, 6"-O-Acetyldaidzin, 6"-O-Malonyldaidzin, Daidzin, Glycitin und dessen Derivate und Glycitein deutlich gelöst. Peak Nachweis ist durch UV Absorption bei 262 mm. Identifizierung der Peaks war mittels Massenspektrometer.
Mengenmäßige Bestimmung wird erzielt durch Verwenden reiner Standards (Genistin, Genistein, Daidzin und Daidzein), gekauft von Indofine Chemical Company, Sommerville, NJ. Reaktionsfaktoren (Integrierter Bereich/Konzentration) werden berechnet für jede der zuvor angegebenen Verbindungen und werden zum mengenmäßigen Bestimmen unbekannter Proben verwendet. Für die konjugierten Formen, für die keine reinen Standards erhältlich sind, wird angenommen, daß Reaktionsfaktoren diejenigen des Elternmolkeüls sind, aber korrigiert in bezug auf Molekulargewichtsunterschied. Der Reaktionsfaktor für Glycitin wird angenommen, derjenige für Genistin, korrigiert in bezug auf Molekulargewichtsunterschied, zu sein.
Dieses Verfahren liefert die Mengen jedes individuellen Isoflavons. Passenderweise können gesamtes Genistin, gesamtes Daidzein und gesamtes Glycitein berechnet werden und stellen das Aggregatgewicht dieser Verbindungen dar, wenn alle die konjugierten Formen in ihre entsprechenden unkonjugierten Formen umgewandelt sind. Diese Gesamtheiten können auch direkt durch ein Verfahren unter Verwenden von Säurehydrolyse unter Umwandeln der konjugierten Formen gemessen werden.

Claims

1. Verfahren zum Herstellen einer Aglucon Isoflavon angereicherten Pflanzenproteinmolke, umfassend:

(a) Erhalten einer Pflanzenproteinmolke, umfassend Glucon Isoflavone, und

(b) Umsetzen der Glucon Isoflavone mit einer ausreichenden Menge mindestens eines von beta-Glucosidase und Esterase für eine Zeitdauer, Temperatur und pH, ausreichend, mindestens eine Mehrheit der Glucon Isoflavone in der Molke zu Aglucon Isoflavonen umzuwandeln, wodurch eine Aglucon Isoflavon angereicherte Molke hergestellt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zeitdauer von 2 Stunden bis 48 Stunden beträgt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Zeitdauer 24 Stunden beträgt.

4. Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die Temperatur 40ºC bis 60ºC beträgt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Temperatur 60ºC beträgt.

6. Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei der pH von 4 bis 8 beträgt.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei der pH 4,5 beträgt.

8. Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, ferner umfassend:

(c) Gewinnen eines Proteinmaterials aus der Molke unter zur Verfügung stellen eines Aglucon Isoflavon angereicherten Molkeproteins.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Molkeprotein Sojabohnenmolke umfaßt.

10. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Molkeprotein durch Ultrafiltration und/oder Hitzekoagulation und/oder Entwässern gewonnen wird.

11. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Molkeprotein durch ein Verfahren gewonnen wird, das umfaßt Erhitzen der Molke bei einem pH, Zeit und Temperatur, ausreichend, das Protein unlöslich zu machen, danach Abtrennen des unlöslich gemachten Proteins von der Molke.

12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei der pH 1 bis 2 beträgt.

13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, wobei die Temperatur mindestens 80ºC für 30 Minuten ist.

14. Verfahren nach einem von Ansprüchen 11 bis 13, wobei das unlöslich gemachte Protein von der Molke durch Zentrifugation abgetrennt wird.

15. Verfahren nach einem von Ansprüchen 11 bis 14, wobei das unlöslich gemachte Protein entwässert wird.

16. Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei mindestens 80% der Glucon Isoflavone zu Aglucon Isoflavonen umgewandelt werden.

17. Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei das Enzym residuales Enzym ist.

18. Verfahren nach einem von Ansprüchen 1 bis 12, wobei das Enzym ergänzendes Enzym ist.

19. Verfahren nach einem von Ansprüchen 1 bis 12, wobei das Enzym aus sowohl ergänzendem wie residualem Enzym besteht.

20. Verfahren nach Anspruch 17, 18 oder 19, wobei das Molkeprotein durch Ultrafiltration gewonnen wird.

21. Verfahren zum Herstellen einer Aglucon Isoflavon angereicherten Pflanzenproteinmolke, umfassend:

(a) Erhalten einer Pflanzenproteinmolke, umfassend Glucon Isoflavone, und

(b) Umsetzen der Glucon Isoflavone mit einer ausreichenden Menge von Säure bei einem pH, Zeit und Temperatur, ausreichend, eine Mehrheit der Glucon Isoflavone in der Molke zu Aglucon Isoflavonen umzuwandeln und dadurch eine Aglucon Isoflavon angereicherte Molke herzustellen.

22. Verfahren nach Anspruch 21, wobei der pH von 1 bis 2 beträgt.

23. Verfahren nach Anspruch 22, wobei die Temperatur von 80ºC bis 90ºC beträgt.

24. Verfahren nach Anspruch 21, 22 oder 23, wobei die Zeit von 30 Minuten bis 180 Minuten beträgt.

25. Verfahren nach Anspruch 21, wobei der pH 4,5 beträgt.

26. Verfahren nach Anspruch 25, wobei die Temperatur 50ºC beträgt, insbesondere wobei die Zeit 24 Stunden beträgt.

27. Verfahren nach einem von Ansprüchen 1 bis 20, wobei der pH bei einem Wert ist, bei dem das Enzym äußerst aktiv vor Reaktion mit den Glucon Isoflavonen ist.

28. Verfahren zum Gewinnen in einem Molkeprotein mindestens 50% eines Isoflavons von einem Pflanzenproteinmaterial, umfassend:

(a) Erhalten einer Pflanzenproteinmolke, umfassend Isoflavone,

(b) Umsetzen der Isoflavone mit einer ausreichenden Menge mindestens eines von beta- Glucosidase und Esterase für eine Zeitdauer, Temperatur und pH, ausreichend, eine Mehrheit der Isoflavone in der Molke zu weniger löslichen Isoflavonen umzuwandeln und dadurch eine Isoflavon angereicherte Molke herzustellen, und

(c) Gewinnen eines Proteinmaterials aus der Molke unter zur Verfügung stellen eines Molkeproteins, enthaltend mindestens 50% der in dem Pflanzenproteinmaterial enthaltenen Isoflavone.

29. Verfahren nach Anspruch 28, wobei das Molkeprotein mindestens 65% der in dem Pflanzenproteinmaterial enthaltenen Isoflavone enthält.

30. Verfahren nach Anspruch 29, wobei das Molkeprotein mindestens 80% der in dem Pflanzenproteinmaterial enthaltenen Isoflavone enthält.

31. Verfahren nach einem von Ansprüchen 28 bis 30, durchgeführt in Übereinstimmung mit einem von Ansprüchen 1 bis 20.

32. Aglucon Isoflavon angereichertes Molkeprotein, hergestellt durch das Verfahren nach einem von Ansprüchen 28 bis 31.

33. Aglucon Isoflavon angereicherte Molke, hergestellt aus einem Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch.

34. Aglucon Isoflavon angereichertes Pflanzenmolkeprotein mit einem Trockenbasisgenisteingehalt von 2,6 bis 8,7 mg/g und einem Trockenbasisdaidzeingehalt von 2,5 bis 6,0 mg/g.