DE69430644T2

DE69430644T2 - Markierter Komplex und ihn verwendendes analytisches Verfahren

Info

Publication number: DE69430644T2
Application number: DE69430644T
Authority: DE
Inventors: Tetsuro Fukui; Takeshi Miyazaki; Tadashi Okamoto; Toshikazu Onishi; Kazumi Tanaka; Nobuko Yamamoto
Original assignee: Canon Inc
Current assignee: Canon Inc
Priority date: 1993-02-05
Filing date: 1994-02-04
Publication date: 2002-10-24
Anticipated expiration: 2014-02-05
Also published as: EP0609894A2; JPH06230007A; DE69430644D1; JP3260884B2; EP0609894B1; EP0609894A3; US5719027A

Description

Technisches Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen markierten Komplex zur Mikroanalyse mit Rotlicht oder Licht des nahen Infrarotbereichs. Die vorliegende Erfindung bezieht sich ebenso auf ein Verfahren zur Analyse unter Anwendung des obigen, markierten Komplexes.

Verwandter Stand der Technik

Eine Spurenmenge einer Substanz, die mit einem Farbstoff oder dergleichen markiert worden ist, bringt nach Bestrahlung mit Laserlicht Informationen wie Lichtstreuung, Lichtabsorption, Fluoreszenz oder einem photoakustischem Effekt. Exakte und schnelle Mikroanalysen durch Nachweis von solchen Informationen sind auf dem Gebiet der Analyse unter Verwendung von Laserlicht gut bekannt.
Die Laserlichtquellen sind herkömmlich auf Gaslaser wie Argonlaser und Helium-Neon-Laser beschränkt gewesen. In den vergangenen Jahren sind jedoch Halbleiterlaser entwickelt worden, die als Laserlichtquelle vielversprechend sind aufgrund der niedrigen Kosten, der geringen Größe und der Einfachheit ihrer Outputsteuerung.
Bei der herkömmlichen, quantitativen Bestimmung einer Spurenmenge einer biologischen Substanz durch Anwenden von Ultraviolettlicht oder unsichtbarem Licht steigt leicht der Hintergrund (oder der Nullwert) der Analyse an, was durch die inhärente Fluoreszenz (300 bis 500 nm) einer natürlichen Substanz wie Flavin, Pyridin-Koenzym und Serumprotein, die gewöhnlich in Untersuchungsproben enthalten sind, verursacht wird. Wenn rotes oder infrarotnahes Licht als Lichtquelle verwendbar ist, kann ein solcher Hintergrund, der durch die natürliche Substanz vorgesorgt wird, ausgeschlossen werden, wodurch die Messempfindlichkeit gegenüber der zu detektierenden Substanz verstärkt wird.
Das aus einem Halbleiterlaser emittierte Licht liegt im allgemeinen im Wellenlängenbereich des roten bis infrarotnahen Lichts (600 bis 830 nm). Jedoch emittieren nicht viele Farbstoffe Fluoreszenzlicht durch Lichtabsorption oder -excitation in einem solchen Wellenlängenbereich. Die typischen Farbstoffe dafür sind binukleare Cyaninfarbstoffe. Ein Beispiel davon ist ein binuklearer Cyaninfarbstoff mit einer Sulfonatgruppe (z. B. Indocyanin-Grün), welcher zum Markieren eines Plasmaproteins für die Hochleistungs- Flüssigkeitschromatographie verwendet wurde, was durch K. Sauda und T. Imasaka (Anal. Chem. (1986) 58, 2649-2653) berichtet wurde.
Die Japanische Patentanmeldungs-Offenlegungsschrift Nr. 2- 191674 offenbart den Nachweis von biologischen Substanzen mittels Fluoreszenz, die mit unterschiedlichen binuklearen Farbstoffen markiert sind, die Sulfonsäuregruppen oder Sulfonatgruppen aufweisen.
Bei der Detektion der Fluoreszenz muss das Fluoreszenzlicht spektroskopisch von dem gegenüber dem Farbstoff abgegebenen Anregungslicht getrennt werden und als Signal abgenommen werden. Deshalb ist die spektrale Trennung umso leichter und das Signal/Rausch- (S/N-) Verhältnis umso größer, je größer der Unterschied zwischen der Anregungswellenlänge und der Fluoreszenzwellenlänge ist.
Herkömmlich markierte Komplexe, die Licht des roten bis zum nahen Infrarot-Bereich absorbieren, wie durch die herkömmlichen, binuklearen Cyanfarbstoffe beispielhaft wiedergegeben, zeigen einen Unterschied zwischen der maximalen Peakwellenlänge des Absorptionsspektrums und der maximalen Peakwellenlänge des Fluoreszenzspektrums (Stoke'sche Verschiebung) von etwa 20 nm bis etwa 40 nm, was unerwünscht unzureichend ist.
Ein Komplex, der durch die Kombination des oben bezeichneten Farbstoffs als dem Markierungsmittel mit einer biologischen Substanz, etwa einem Antikörper, gebildet ist, neigt zur Denaturierung durch Oxidation oder Vernetzung unter der Wirkung eines Umgebungsfaktors wie Licht, Hitze, Luftfeuchtigkeit und Sauerstoff in der Luft. Insbesondere in Wasser wird die Denaturierung nachteilhafterweise durch eine solche Hydrolyse beschleunigt. Folglich ist der Komplex nicht immer als Detektionsreagenz in der Mikroanalyse einer Verbindung eines Organismuses aufgrund seiner schlechten Lagerungsstabilität nützlich.
Die DE-A-39 12 046 offenbart ein Verfahren zum Markieren eines Moleküls in wässriger Lösung unter Verwendung eines Fluoreszenzfarbstoffs als Markierungsmittel, welcher aus der Gruppe von Cyanin-, Merocyanin- und Styrol-Farbstoffen ausgewählt ist, sowie ein Verfahren zum Detektieren unterschiedlicher biologischer Komponenten oder Moleküle unter Verwendung der Markierungsmittel. Die markierenden Farbstoffe können eine maximale Anregungswellenlänge von etwa 560 nm und eine Fluoreszenzemissionswellenlänge von im allgemeinen 15 bis 100 nm oberhalb der maximalen Anregungswellenlänge aufweisen.
Nach einem umfassenden Studium fanden die Erfinder, dass ein Farbstoff mit einer speziellen Struktur, als Markierungsmittel mit einer biologischen Substanz kombiniert, einen relativ großen Unterschied von 50 nm bis 100 nm zwischen der maximalen Peakwellenlänge des Absorptionsspektrums und der maximalen Peakwellenlänge des Fluoreszenzspektrums zeigte, und dass der markierte Komplex extrem stabil war. Auf der Grundlage dieser Erkenntnisse ist die vorliegende Erfindung erarbeitet worden.

Zusammenfassung der Erfindung

Eine Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zum Detektieren einer biologischen Zielsubstanz in einer Probe unter Verwendung eines markierten Komplexes bereitzustellen, welcher eine große Stoke'sche Verschiebung zeigt, eine leichte Spektralmessung mit verbessertem S/N-Verhältnis gewährleistet und hinsichtlich der Lagerungsstabilität ausgezeichnet ist. Das Verfahren umfasst die im Anspruch 1 definierten Schritte.
Der in dem Verfahren verwendete, markierte Komplex der vorliegenden Erfindung wird gebildet, indem ein Markierungsmittel mit einer biologischen Substanz kombiniert wird, und wird zum optischen Detektieren einer markierten, biologischen Zielsubstanz verwendet, nachdem der markierte Komplex selektiv mit der biologischen Zielsubstanz kombiniert wurde, wobei das Markierungsmittel ein Dreikernfarbstoff ist, der durch die allgemeine Formel (I) oder (II) dargestellt ist:
worin die Ringe mit durchbrochenen Linien mit Xa, Xb oder Xc unabhängig voneinander einen substituierten oder nichtsubstituierten heterozyklischen Ring bilden, der ein bis drei Heteroatome aus Sauerstoff, Schwefel, Stickstoff oder Selen bildet, wobei der heterozyklische Ring nicht substituiert oder durch eine substituierte oder nicht-substituierte Alkylgruppe, eine substituierte oder nicht-substituierte- Arylgruppe und/oder eine substituierte oder nichtsubstituierte Aralkylgruppe substituiert ist; La und Lb unabhängig voneinander eine Methinkette darstellen, die aus einer substituierten oder nicht-substituierten Methinverknüpfung aufgebaut ist, und wobei eines von La und Lb zum direkten Verbinden mit den aromatischen, heterozyklischen Ringen weggelassen werden kann; und Y&supmin; ein Anion darstellt.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 veranschaulicht schematisch das Prinzip des Detektierens einer biologischen Zielverbindung durch ein Sandwichassay-Verfahren unter Einsatz einer Sonde, die ein Markierungsmittel trägt, welches im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird.
Fig. 2 zeigt ein Absorptionsspektrum des im Beispiel 1 der vorliegenden Erfindung erhaltenen Komplexes aus Markierungsmittel und Antigen.
Fig. 3 zeigt ein Fluoreszenzspektrum des im Beispiel 1 der vorliegenden Erfindung erhaltenen Komplexes aus Markierungsmittel und Antigen.
Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen In den allgemeinen Formeln (I) oder (II) sind die durchbrochenen Ringlinien mit Xa, Xb oder Xc unabhängig voneinander ein substituierter oder nicht-substituierter fünf- oder sechs-gliedriger heterozyklischer Ring mit einem oder zwei Stickstoffatomen, oder ein kondensierter Ring davon im Hinblick auf die Größe der Stoke'schen Verschiebung und der Leichtigkeit der spektralen Trennung.
Speziell ist der Dreikernfarbstoff eine Verbindung, die durch die nachstehende allgemeine Formel (III) oder ein Isomer davon, bei welchem das Stickstoffatom im mittleren Teil der Formel anstelle an der 4-Position an der 5-Position ist, wiedergegeben ist:
worin r&sup8;, r&sup9;, r¹&sup0; und r¹¹ unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, ein Halogenatom, eine substituierte oder nicht-substituierte Alkylgruppe, eine Alkoxygruppe, eine substituierte oder nicht-substituierte Arylgruppe oder eine substituierte oder nicht-substituierte Aminogruppe sind und r&sup8; und r&sup9; miteinander verbunden sein können zur Bildung eines substituierten oder nicht-substituierten, aromatischen Rings; r&sup6; unabhängig in Bezug auf die jeweiligen Wiederholungseinheiten nicht vorliegt oder eine alkyl-substituierte Ethylengruppe ist und mit r&sup8; oder r&sup9; zum Bilden einer zyklischen Struktur verbunden ist; r¹ und 2 unabhängig voneinander eine substituierte oder nicht-substituierte Arylgruppe sind, oder r¹ und r² zum Bilden eines substituierten oder nichtsubstituierten, kondensierten Rings miteinander verbunden sind; r³, r&sup4; und r&sup5; unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, eine substituierte oder nicht-substituierte Alkylgruppe, eine Alkylsulfonatgruppe, eine substituierte oder nicht-substituierte Alkenylgruppe, eine substituierte oder nicht-substituierte Arylgruppe oder eine substituierte oder nicht-substituierte Aralkylgruppe sind; X¹ ein Sauerstoffatom, ein Schwefelatom, ein Kohlenstoffatom, ein Stickstoffatom oder ein Selenatom ist und, wenn X¹ ein Kohlenstoffatom oder ein Stickstoffatom ist, X¹ an Wasserstoffatome, substituierte oder nicht-substituierte Alkylgruppen, eine substituierte oder nicht-substituierte Arylgruppe und/oder eine substituierte oder nicht-substituierte Aralkylgruppe gebunden ist; X² ein Sauerstoffatom, ein Schwefelatom oder ein Stickstoffatom ist und, wenn X² ein Stickstoffatom ist, X² an ein Wasserstoffatom, eine substituierte oder nichtsubstituierte Alkylgruppe, eine substituierte oder nichtsubstituierte Arylgruppe und/oder eine substituierte oder nicht-substituierte Aralkylgruppe gebunden ist; X³ ein Sauerstoffatom oder ein Schwefelatom ist; und m und 1 unabhängig voneinander eine ganze Zahl von 0 bis 3, jedoch nicht gleichzeitig 0 sind.
Der Dreikernfarbstoff ist andererseits vorzugsweise eine Verbindung, die durch die allgemeine Formel (IV) unten, oder ein Isomer davon, bei dem das Stickstoffatom im mittleren Bereich der Formel anstelle der 4-Position bei der 5-Position ist, wiedergegeben ist:
worin r¹&sup9;, r²&sup0; und r²¹ unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, ein Halogenatom, eine substituierte oder nicht-substituierte Alkylgruppe, eine Alkoxygruppe, eine substituierte oder nicht-substituierte Arylgruppe oder eine substituierte oder nicht-substituierte Aminogruppe sind und r¹&sup9; und r²&sup0; zum Bilden eines substituierten oder nichtsubstituierten, kondensierten Rings miteinander verbunden sein können; r¹², r¹³, r¹&sup4; und r¹&sup5; unabhängig voneinander eine substituierte oder nicht-substituierte Arylgruppe sind, oder r¹² und r¹³ oder r¹&sup4; und r¹&sup5; zum Bilden eines substituierten oder nicht-substituierten, kondensierten Rings miteinander verbunden sind; r¹&sup6;, r¹&sup7; und r¹&sup8; unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, eine substituierte oder nicht-substituierte Alkylgruppe, eine Alkylsulfonatgruppe, eine substituierte oder nicht-substituierte Alkenylgruppe, eine substituierte oder nicht-substituierte Arylgruppe oder eine substituierte oder nicht-substituierte Aralkylgruppe sind; X&sup4; und X&sup6; unabhängig voneinander ein Sauerstoffatom, ein Schwefelatom, ein Kohlenstoffatom, ein Stickstoffatom oder ein Selenatom sind und, wenn X&sup4; oder X&sup6; ein Kohlenstoffatom oder ein Stickstoffatom ist, X&sup4; oder X&sup6; an Wasserstoffatome, eine substituierte oder nicht-substituierte Alkylgruppe, eine substituierte oder nicht-substituierte Arylgruppe und/oder eine substituierte oder nicht-substituierte Aralkylgruppe gebunden ist; X&sup5; ein Sauerstoffatom, ein Schwefelatom oder ein Stickstoffatom ist und, wenn X&sup5; ein Stickstoffatom ist, X&sup5; an ein Wasserstoffatom, eine substituierte oder nichtsubstituierte Alkylgruppe, eine substituierte oder nichtsubstituierte Arylgruppe und/oder eine substituierte oder nicht-substituierte Aralkylgruppe gebunden ist; Z&supmin; ein Anion darstellt; und y eine ganze Zahl von 0, 1 oder 2 ist.
Die biologische Substanz kann ein Antikörper, ein Antigen oder eine Nukleinsäure sein.
Der markierte Komplex der vorliegenden Erfindung ergibt eine große Stoke'sche Verschiebung von so hoch wie 50 bis 100 nm bei der optischen Analyse einer Zielsubstanz mit einem Halbleiterlaser, wodurch die Detektion der Zielsubstanz mit einem hohen S/N-Verhältnis gestattet wird. Dieser markierte Komplex weist eine ausgezeichnete Lagerstabilität auf und ist deshalb als Analysereagenz sehr nützlich.
Die vorliegende Erfindung wird untenstehend spezieller beschrieben.
Beim Verfahren der vorliegenden Erfindung wird ein Dreikernfarbstoff als Markierungsmittel verwendet. Die Dreikernfarbstoffe sind als photoempfindliche Verbindungen für photoempfindliche Materialien bekannt und in der Literatur z. B. beschrieben in der Japanischen Patentanmeldungs-Offenlegungsschrift Nr. 48-52222, der Japanischen Patentveröffentlichung Nr. 49-18808, "The Cyanine Dyes and Related Compounds", geschrieben durch Frences M. Hamer, S. 612-684 (1964), der EP-A-0 047917 etc. Die Dreikernfarbstoffe, die bei der Silbersalzphotographie nützlich sind, sind überhaupt nicht dafür bekannt, als ein Markierungsmittel zum Verleihen einer biologischen Substanz mit Fluoreszenz nützlich zu sein. Es wurde durch die Erfinder der vorliegenden Erfinder gefunden, dass ein Dreikernfarbstoff mit einer speziellen Struktur für optische Analysen mit einem Halbleiterlaser extrem nützlich ist, und die vorliegende Erfindung wurde auf der Grundlage dieser Erkenntnis abgeschlossen.
Der in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendete, bevorzugte Dreikernfarbstoff besitzt eine Struktur, die drei heterozyklische Ringe umfasst, die durch mindestens eine Methin- oder Polymethin-Kette (wie durch die allgemeine Formel (I) dargestellt) verbunden sind, oder eine Struktur einer ionisierten Salzform davon (wie durch die allgemeine Formel (II) dargestellt).
Xa, Xb und Xc bauen unabhängig voneinander eine zyklische Kernstruktur (einen heterozyklischen Ring) auf. Die zyklische Struktur ist ein heterozyklischer Ring mit einem Heteroatom, vorzugsweise ein fünf- oder sechs-gliedriger Ring mit einem Stickstoffatom.
Der heterozyklische Ring schließt keine zyklische Struktur ein, die durch bloses Überbrücken von zwei oder mehr Kohlenstoffatomen in der Polymethinkette gebildet wird, weil die mit der Methinkette verbrückte zyklische Struktur im allgemeinen ein Kohlenstoffring ist, und eine solche Struktur trägt nicht zur Erhöhung der Stoke'schen Verschiebung bei.
Die drei heterozyklischen Ringe des Dreikernfarbstoffs sind über durch La und Lb ausgedrückte Methinketten verbunden, die aus einer bis sechs substituierten oder nicht-substituierten Methineinheit(en) aufgebaut sind (eine Methineinheit ist der Einfachheit halber ebenso in der Methinkette inbegriffen, obgleich eine Methineinheit keine Kette macht), wodurch der heterozyklische Dreiring ein Resonanzsystem bildet. In dem Dreikernfarbstoff kann eines der Elemente La und Lb weggelassen werden, damit die zwei aromatischen heterozyklischen Ringe direkt miteinander verbunden sind. Die Anzahl der Methineinheiten in der Methinkette kann gerade oder ungerade sein. Wenn die Anzahl gerade ist, sind die heterozyklischen Ringe mit der Methinkette bei jeweils beiden Kettenenden über eine Einfachbindung oder über eine Doppelbindung verbunden, wohingegen im Fall der ungeraden Anzahl die aromatischen Ringe mit der Methinkette über eine Einfachbindung an einem Ende der Kette und über eine Doppelbindung am anderen Ende der Kette verbunden sind. Die Methinkette setzt sich vorzugsweise aus zwei Methineinheiten zusammen, die eine Doppelbindung am jeweiligen Ende aufweisen. Die Anzahl der Wiederholungseinheiten in der Methinkette liegt vorzugsweise bei nicht mehr als drei, das heißt nicht mehr als sechs Methineinheiten. Mit längeren Methinketten als sechs Einheiten wird die Absorptionswellenlänge nachteilig zu 900 nm oder länger, und gleichzeitig wird die Verbindung selbst instabil. Wenn die Methinketten La und Lb beide nicht vorliegen, sind die aromatischen heterozyklischen Ringe direkt miteinander verbunden. In diesem Fall wird die Absorptionswellenlänge unerwünscht kürzer als 600 nm.
Die durch die allgemeine Formel (I) wiedergegebene Verbindung kann eine ionisierte Salzstruktur annehmen, wie durch die allgemeine Formel (II) gezeigt. Die Salzform der Verbindung wird gewählt, wenn eine ionische Verbindungswechselwirkung zwischen der Verbindung und der biologischen Substanz erwünscht ist. In der allgemeinen Formel (II) stellt Y&supmin; ein Anion dar, welches dasselbe ist wie das in der später beschriebenen, allgemeinen Formel (IV).
Beispiele der heterozyklischen Ringe sind nachstehend gezeigt:
In obigen Formeln sind Ra, Rb, Rc und Rd unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder Substituenten. Die Substituenten schließen Alkylgruppen, Halogenatome wie I, Br und Cl, Alkoxygruppen, Alkylsulfonatgruppen und Alkenylgruppen ein.
Beispiele von La und Lb sind unten gezeigt:
In diesen Formeln schließen Re und Rf die obigen, für Ra, Rb, Rc und Rd bezeichneten Gruppen und zusätzlich Arylgruppen und Aralkylgruppen ein; und p ist eine ganze Zahl von 0, 1, 2 und 3.
Typische Verbindungen mit dem obigen Aufbau schließen Cyaninfarbstoffe, Merocyaninfarbstoffe, Rhodacyaninfarbstoffe, Oxonolfarbstoffe, Styrolfarbstoffe und Styrolbasisfarbstoffe ein.
Bevorzugte Strukturen der Farbstoffe schließen die durch die allgemeinen Formeln (III) und (IV) wiedergegebenen Strukturen ein, von denen solche, die durch die allgemeine Formel (III) wiedergegeben sind, weiter bevorzugt sind.
Die Alkylgruppe der vorliegenden Erfindung ist vorzugsweise eine solche mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen wie Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, sec-Butyl, Isobutyl, t-Butyl, n-Amyl, t-Amyl, n-Hexyl, n-Octyl, t-Octyl usw., von denen lineare oder verzweigte Alkylgruppen mit einem bis vier Kohlenstoffatomen weiter bevorzugt sind.
Die substituierte Alkylgruppe schließt 2-Hydroxyethyl, 2- Methoxyethyl, 2-Ethoxyethyl, Methoxymethyl, 3-Hydroxypropyl, 3-Methoxypropyl, 3-Ethoxypropyl, 3-Chloropropyl, 3- Bromopropyl, 3-Carboxypropyl etc. ein. Die Alkoxygruppe ist hinsichtlich der Kohlenstoffanzahl und der Struktur dieselbe wie in der obigen Alkylgruppe, einschließlich Methoxy, Ethoxy, Propoxy, etc.
Die substituierte oder nicht-substituierte Arylgruppe schließt Phenyl, Toluyl, Xylyl, Biphenyl, Aminophenyl, α- Naphthyl, β-Naphthyl, Anthranyl, Pyrenyl, Methoxyphenyl, Dimethoxyphenyl, Trimethoxyphenyl, Ethoxyphenyl, Diethoxyphenyl, Chlorophenyl, Dichlorophenyl, Trichlorophenyl, Bromophenyl, Dibromophenyl, Tribromophenyl, Ethylphenyl, Diethylphenyl, Nitrophenyl, Aminophenyl, Dimethylaminophenyl, Diethylaminophenyl, Dibenzylaminophenyl, Dipropylaminophenyl, Morpholinophenyl, Piperidinylphenyl, Piperazinophenyl, Diphenylaminophenyl, Acetylaminophenyl, Benzoylaminophenyl, Acetylphenyl, Benzoylphenyl, Cyanophenyl, Sulfonatophenyl, Carboxylatphenyl etc. ein.
Die Alkenylgruppe in der vorliegenden Erfindung besitzt vorzugsweise 1 bis 10 Kohlenstoffatome, weiter bevorzugt 1 bis 6 Kohlenstoffatome, beispielhaft wiedergegeben durch Vinyl, Propenyl, Butenyl, Pentenyl, Hexenyl, Heptenyl, Octenyl und Dodecenyl.
Die substituierte oder nicht-substituierte Arakylgruppe besitzt vorzugsweise 7 bis 19 Kohlenstoffatome, weiter bevorzugt 7 bis 15 Kohlenstoffatome, beispielhaft wiedergegeben durch Benzyl, Phenethyl, Toluylmethyl, Hydroxybenzyl, 2-Hydroxy-3-methylbenzyl und 2-Hydroxy-3-t- butylbenzyl.
Die durch die allgemeine Formel (III) oder (IV) wiedergegebenen Verbindungen (Markierungsmittel) sind im allgemeinen in Wasser schwach löslich. Deshalb ist es, um diesen Verbindungen Wasserlöslichkeit zu verleihen, nötig, dass eine oder mehrere der Gruppen r¹ bis r²¹ eine polare Gruppe enthält (enthalten), wie etwa Hydroxyl, Alkylhydroxyl, Sulfonat, Alkylsulfonat, Carboxylat, Alkylcarboxylat, Tetra- Ammoniumsalz und andere bekannte Gruppen. In dem Fall jedoch, bei dem die biologische Substanz als Träger des Farbstoffs eine wasserlösliche, hochmolekulare Substanz ist, ist der markierte Komplex als ganzes wasserlöslich, selbst wenn das damit zu kombinierende Markierungsmittel kaum in Wasser löslich ist, so dass die zuvor bezeichnete, polare Gruppe nicht immer notwendig ist. Eine solche biologische Substanz wird beispielhaft wiedergegeben durch Nukleinsäuren, Antikörper, Glykoproteine und dergleichen, was später beschrieben wird.
Die Gruppen r¹ bis r&sup5; oder die Gruppen r¹² bis r¹&sup5; besitzen vorzugsweise mindestens eine reaktive Gruppe, um die Bildung einer kovalenten Bindung zwischen der Verbindung der allgemeinen Formel (III) oder (IV) und der biologischen Substanz als dem Träger zu gestatten. Wenn die Markierungsverbindung jedoch in eine biologische Substanz interkaliert bzw. eingeschlossen wird oder damit über ionische Bindung kombiniert wird, ist die reaktive Gruppe nicht notwendiger Weise erforderlich.
Die reaktive Gruppe besitzt die reaktive Stelle, einschließlich Isocyanat, Isothiocyanat, Succinimidester, Sulfosuccinimidester, Imidester, Hydrazin, Nitroarylhalogenid, Bipyridindisulfid, Maleimid, Thiophthalimid, Säurehalogenid, Sulfonylhalogenid, Aziridin, Azidonitrophenyl, Azidoamino, 3-(2-Pyridyldithio)propionamid sowie andere bekannte reaktive Gruppen. Um sterische Behinderung zwischen dem Markierungsmittel und der biologischen Substanz auszuschließen, können die reaktiven Gruppen einen Abstandhalterbereich aufweisen, z. B.
worin q eine ganze Zahl von 0 bis 6 ist.
Von den obigen reaktiven Gruppen sind besonders bevorzugt Isocyanat, Sulfosuccinimidester, Succinimidester, Maleimid etc.
In der allgemeinen Formel (IV) ist Z&supmin; ein Anion, einschließlich Chlorid-Ion, Bromid-Ion, Iodid-Ion, Perchlorat-Ion, Benzolsulfonat-Ion, p-Toluol-Sulfonat-Ion, Methylsulfat-Ion, Ethylsulfat-Ion, Propylsulfat-Ion, Tetrafluoroborat-Ion, Tetraphenylborat-Ion, Hexafluorophosphat-Ion, Benzolsulfinat-Ion, Acetat-Ion, Trifluoracetat-Ion, Propionat-Ion, Benzoat-Ion, Oxalat-Ion, Succinat-Ion, MaIonat-Ion, Oleat-Ion, Stearat-Ion, Citrat- Ion, Hydrogendiphosphat-Ion, Dihydrogenphosphat-Ion, Pentachlorostannat-Ion, Chlorosulfonat-Ion, Fluorosulfonat- Ion, Trifluoromethansulfonat-Ion, Hexafluoroantimonat-Ion, Molybdat-Ion, Wolframat-Ion, Titanat-Ion, Zirkonat-Ion etc.
Spezielle Beispiele der allgemeinen Formel (III) und (IV) sind unten gezeigt (Verbindungsnummern 1 bis 12), jedoch ist das Markierungsmittel nicht darauf beschränkt.
Tabelle 1 zeigt maximale Absorptionswellenlängen (nm) und maximale Fluoreszenzwellenlängen (nm) (in Methanol) der obigen Farbstoffbeispiele. Tabelle 1
Das Markierungsmittel der vorliegenden Erfindung absorbiert Licht im roten bis infrarotnahen Bereich (600 bis 900 nm), und der molare Absorptionskoeffizient &epsi; liegt im Bereich von 20 000 bis 100 000 l/Mol·cm. Das Markierungsmittel emittiert Fluoreszenzlicht mit einer maximalen Fluoreszenzwellenlänge, die zur Seite der längeren Wellenlänge um etwa 50 bis 100 nm gegenüber der maximalen Absorptionswellenlänge verschoben ist.
Der Dreikernfarbstoff, welcher das Grundgerüst des oben bezeichneten Markierungsmittels ausmacht, ist in der Literatur beschrieben, z. B. "The Cyanine Dyes and Related Compounds", geschrieben durch Frences M. Hame, S. 612-684 (1964), etc., und kann durch jegliche geeignete Verfahren hergestellt werden. Die funktionelle Gruppe zum Bilden einer kovalenten Bindung mit der biologischen Substanz kann in die Verbindung eingeführt werden zum Beispiel durch Umsetzen eines Succinimid einbringenden Mittels (z. B. Natrium-N- Hydroxysulfosuccinimid) mit dem Dreikern-Cyancarboxylatsalz durch Verwendung eines Kondensationsmittel (z. B. N,N'- Dicyclohexyl-Carbodiimid).
Das im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendete Markierungsmittel wird mit einer biologischen Substanz kombiniert. Die biologische Substanz als Träger wird im Hinblick auf eine individuelle, zu analysierende oder nachzuweisende biologische Zielsubstanz ausgewählt. Das selektive Detektieren einer Substanz kann ausgeführt werden, indem eine biologische Substanz verwendet wird, die gegenüber der nachzuweisenden Substanz eine biologische Spezifität aufweist. Die biologische Substanz schließt hierbei natürliche oder synthetische Peptide, Proteine, Enzyme, Zucker, Lektine, Viren, Bakterien, Nukleinsäuren, DNAs, RNAs, Antigene (einschließlich rekombinante Antigene), Antikörper usw. ein. Besonders nützliche, medizinisch-pathologische Substanzen als Träger sind ferner folgende: Immunoglobuline, z. B. IgG, IgM, IgE, etc.; Serumproteine, z. B. Substanzen des Komplementsystems, CRP, Ferritin, α&sub1;- Mikroglobulin, β&sub2;-Mikroglobulin etc. sowie Antikörper gegen diese; Tumormarker, z. B. α-Fetoprotein, carcinoembryonales Antigen (CEA), Saure Prostata-Phosphatase (PAP), CA19-9, CA125 etc., sowie Antigene davon; Hormone, z. B. luteinisierendes Hormon (LH), follikel-stimulierendes Hormon (FSH), humanes choriones Gonadotropin (hCG), Östrogen, Insulin, etc., sowie Antikörper gegen diese; virusinfektionsverwandte Substanzen, z. B. HBV-bezogene Antigene (HBs, HBe, HBc), HIV, ATL, etc., sowie Antikörper gegen diese; Bakterien, z. B. Corynebacterium diphtheriae, Clostridium botulinum, Mycoplasma, Treponema pallidum, etc., sowie Antikörper gegen diese; Protozoen, z. B. Toxoplasma, Trichomonas, Leishmania, Tripanosoma, Plasmodium etc. sowie Antigene davon; Anti-Epileptika, z. B. Phenytoin, Phenobarbital etc.; cardiovaskulare Mittel, z. B. Chinidin, Digoxinin etc.; Anti-Asthmatika, z. B. Theophyllin etc.; Medikamente wie Antibiotika, z. B. Chloramphenicol, Gentamycin etc. sowie Antigene davon; Enzyme und Exotoxine (z. B. Streptolysin O) sowie Antikörper gegen diese. Die biologische Substanz als Träger wird geeigneter Weise so ausgewählt, dass eine Reaktion wie eine Antigen/Antikörper-Reaktion mit der in der Probe nachzuweisenden Substanz durchlaufen wird.
Das in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendete Markierungsmittel kann mit einer biologischen Substanz wie der oben bezeichneten, physiologisch wirksamen Substanz durch ein bekanntes Verfahren kombiniert (oder darauf immobilisiert) sein, einschließlich wie nachstehend durch (i) ionische Verbindung, (ii) physikalische Absorption und (iii) kovalente Verbindung.
Bei der ionischen Bindung wird ein positiv geladenes Markierungsmittel an eine biologische Substanz wie einem Protein, einer DNA, einer RNA und dergleichen gebunden.
Bei der physikalischen Absorption wird der lipophile Anteil der Markierungssubstanz an den lipophilen Anteil eines Proteins über eine hydrophobe Verbindung gebunden.
Die ionische Bindung und die physikalische Absorption zeigt eine niedrige Bindungsfestigkeit zwischen dem Markierungsmittel und der biologischen Substanz, obgleich die Bindung über eine einfache Prozedur der Verbindungsreaktion leicht gebildet werden kann.
Bei der kovalenten Bindung weist andererseits mindestens das Markierungmittel oder die biologische Substanz eine hochreaktive, funktionelle Gruppe auf, über die beide Substanzen durch eine kovalente Verbindung oder Bildung einer starken Bindung verbunden sind. Die funktionelle Gruppe, die zum Bilden der kovalenten Bindung der biologischen Substanz fähig ist, schließen freie Aminogruppen, eine Hydroxylgruppe, eine Phosphorsäuregruppe, eine Carboxylgruppe, eine Schwefelwasserstoffgruppe des Cysteins, eine Imidazolgruppe des Histidins, eine Phenolgruppe des Tyrosins, eine Hydroxylgruppe des Serins und Threonins und so weiter ein.
Diese funktionellen Gruppen reagieren mit einem Diazoniumsalz, einem Säureamid, einem Isocyanat, einem aktiven Alkylhalogenid, einer wirksamen Estergruppe. Durch das Einführen einer solchen Gruppe in das Markierungsmittel kann der Farbstoff mit der biologischen Substanz in einem geeigneten Verfahren kombiniert werden. Andererseits wird die Konformation der biologischen Substanz, insbesondere einer Substanz vom Ursprung eines Organismuses, durch relativ schwache Bindungen wie Wasserstoffbindungen, hydrophoben Bindungen und ionischen Bindungen gehalten, die dazu neigen, zerstört zu werden. Die Immobilisierung des Markierungsmittels wird deshalb wünschenswerter Weise unter milden Bedingungen, ohne Behandlung bei einer hohen Temperatur und ohne Verwendung einer starken Säure oder einer starken Lauge, durchgeführt.
Bei einer Methode der Immobilisierungsreaktion unter milden Bedingungen ist ein bifunktionelles Vernetzungsmittel nützlich, welches mit dem Markierungsmittel und mit der biologischen Substanz reagiert. Das bifunktionelle Vernetzungsmittel schließt durch die allgemeine Formel R- N=C=N-R' ausgedrückte Carbodiimide, durch die allgemeine Formel CHO-R-CHO ausgedrückte Dialdehyde, durch die allgemeine Formel O=C=N-R-N=C=O ausgedrückte Diisocyanate und dergleichen ein (worin R und R' unabhängig voneinander eine Alkylgruppe, eine Arylgruppe, eine Alkylarylgruppe oder eine Arylalkylgruppe, die substituiert sein können, sind).
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung wird nachstehend beschrieben, bei dem eine spezifische biologische Zielsubstanz durch Verwendung eines markierten Komplexes detektiert wird, welcher aus dem obigen speziellen Markierungsmittel und einer biologischen Substanz gebildet ist.
Eine biologische Zielsubstanz (oder ein nachzuweisendes Objekt), die eine Zellart oder ein Mikroorganismus darstellt, kann wie folgt nachgewiesen werden. Der markierte Komplex wird mit einer Zelle oder einer speziellen Substanz auf der Oberfläche des Mikroorganismus kombinieren gelassen, die zu der biologischen Substanz des markierten Komplexes komplementär ist, wobei die Bindung spezifisch über eine spezielle Bindung wie einer Antigen/Antikörper-Bindung, einer Wasserstoffbrückenbindung zwischen Nukleinsäuren und dergleichen gebildet wird. Dann wird die Menge des Antigens, des Antikörpers, der Nukleinsäure etc. durch die Fluoreszenzintensität des Systems gemessen.
Die Fluoreszenzintensität kann durch ein Fluorophotometer oder ein Fluoreszenzmikroskop gemessen werden. Andererseits werden einzelne Zellen oder Mikororganismen durch einen Anregungslicht-Bestrahlungsbereich in einem Durchflusssystem bei hoher Geschwindigkeit durchlaufen gelassen, wobei das Fluoreszenzlicht gemessen wird und die Daten statistisch gemäß der Durchfluss-Cytometry bearbeitet werden.
Als Anregungslichtquelle sind Halbleiterlaser nützlich, die eine Emissionswellenlänge im roten bis infrarotnahen Bereich besitzen, da der im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendete, markierte Komplex mittels Licht des roten bis Nahinfrarotbereichs (600 bis 900 nm) angeregt wird.
Da der im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendete, markierte Komplex eine große Stoke'sche Verschiebung zeigt, können zwei oder mehrere Fluoreszenzsubstanzen, die unterschiedliche Fluoreszenzwellenlängen emittieren, jeweils mit Hilfe der Bestrahlung einer Laserwellenlänge derart gemessen werden, dass eine Zielsubstanz mit einem markierten Komplex, der im Verfahren der Erfindung verwendet wird, markiert ist, und die andere Zielsubstanz mit einem herkömmlichen Zweikern-Markierungsmittel wie Zweikern- Cyanfarbstoffen und Zweikern-Rhodaminfarbstoffen, die eine geringere Stoke'sche Verschiebung zeigen, markiert wird.
Ferner kann eine aufgelöste Komponente, wie eine Komponente, die in einer Körperflüssigkeit wie Serum enthalten ist, mit einem solchen markierten Komplex detektiert werden, beispielsweise wie folgt.
Im Fall, bei dem die Ananlyse durch das Ausnutzen einer Antigen/Antikörper-Reaktion durchgeführt wird, wird ein markierter Komplex, der durch die Reaktion des Markierungsmittels mit einem Antigen (oder einem Antikörper) gebildet wurde, einer Antigen/Antikörper-Reaktion mit einem Zielantikörper (oder -antigen, wenn das Markierungsmittel an einen Antikörper gebunden ist) unterzogen, und der Komplex aus der Antigen/Antikörper-Reaktion (B = verbundene Form) wird getrennt (B/F-Trennung) von dem Komplex, der nicht an den Antikörper (oder das Antigen) gebunden ist (F = freie Form), und danach wird die verbundene Form (B) mittels der Intensität der emittierten Fluoreszenz bestimmt. Diese Technik, die die Antigen/Antikörper-Reaktion ausnützt, ist im Detail in der Veröffentlichung "Kensa to Gijutsu (Inspection and Technique)", Vol. 16, Nr. 7 (1988) beschrieben.
Die B/F-Trennung bei der Detektion kann durch eine Sandwichassaymethode erleichtert werden, indem Feinteilchen als einem Immobilisierungsträger angewandt werden. Das Prinzip davon ist in Fig. 1 schematisch veranschaulicht. Eine erste Probe 1 (z. B. Nukleinsäure, Antigen, Antikörper etc.), welche zur spezifischen Bindung an die biologische Zielsubstanz 5 in der Lage ist, und eine zweite Sonde 3 werden ausgewählt. Die erste Sonde ist an einem Immobilisierungsträger 2 immobilisiert, und die zweite Sonde ist mit dem Markierungsmittel 4 zum Bilden eines markierten Komplexes gebunden. Die Zielsubstanz in einer Messprobe durchläuft eine Reaktion zum Binden der ersten Sonde und der zweiten Sonde mit der Zwischenlagerung der biologischen Zielsubstanz, wodurch der markierte Komplex an den Immobilisierungsträger gebunden wird. Nach der Reaktion wird ungebundener, markierter Komplex (F) der B/F-Trennung unterzogen, und die Menge an markiertem Komplex auf dem Träger wird mittels der Fluorometrie bestimmt.
Unter Betrachtung der Empfindlichkeit der Detektion ist es erwünscht, das der markierte Komplex zwei oder mehr Mole des Markierungsmittels an ein Mol der biologischen Substanz (Sonde) gebunden hat. Deshalb ist in einem gemischten System, bei dem der markierte Komplex mit zwei oder mehr Molen des Markierungsmittels und der markierte Komplex mit einem Mol des Markierungsmittels gemischt sind, das molare Verhältnis des Markierungsmittels zu der biologischen Substanz vorzugsweise nicht weniger als 1,5 : 1, weiter bevorzugt nicht weniger als 2 : 1. Wenn die biologische Substanz ein Antigen oder dergleichen ist, kann mehr als ein Molekül des Markierungsmittels leicht daran gebunden werden. Wenn die biologische Substanz eine Nukleinsäure ist, wird mehr als eine primäre Aminogruppe in ein Molekül der Nukleinsäure eingeführt, und dann wird das Markierungsmittel daran gebunden, so dass die Messempfindlichkeit entsprechend der Anzahl der eingeführten Aminogruppen (das heißt der Anzahl des eingeführten Markierungsmittels) angehoben wird.
Bei der obigen Fluoreszenzdetektion kann die Detektionsempfindlichkeit durch die Zugabe eines oberflächenaktiven Mittels zur Erhöhung der Fluoreszenzintensität angehoben werden. Das oberflächenaktive Mittel schließt anionische oberflächenaktive Mittel, nichtionische oberflächenaktive Mittel, kationische oberflächenaktive Mittel und amphotere oberflächenaktive Mittel ein. Das oberflächenaktive Mittel wird vorzugsweise in einer Menge von etwa 0,01 bis etwa 1,0 Gew.-%, bezogen auf die Messlösung, zugegeben. Die Zugabe von Tween 20, einem nichtionischen oberflächenaktiven Mittel, in einer Menge von 0,1% erhöht zum Beispiel die Fluoreszenzintensität um einen Faktor von etwa 5.
Die vorliegende Erfindung wird nachstehend spezieller beschrieben.

(Stoke'sche Verschiebung des markierten Komplexes)

Beispiel 1

Anti-Mensch-CRP-Schafserum (IgG-Fraktion) (hergestellt durch Cooper Biomedical Inc.) wurde mit einer Phosphatpufferlösung (pH = 8,0) zum Herstellen einer Antikörperlösung auf eine Konzentration von 0,5 mg/ml verdünnt. Zu 7 ml dieser Antikörperlösung wurden 0,3 mg des oben bezeichneten Markierungsmittels Nr. 4 und 0,08 g 1-Ethyl-3-(3- dimethylaminopropyl)-carbodiimid-Hydrochlorid (hergestellt durch Dojin Kagaku K. K., nachfolgend als "WSC" bezeichnet) zugegeben. Die Mischung wurde drei Stunden lang bei Raumtemperatur reagieren gelassen, um einen Markierungsmittel-Antigen-Komplex zu bilden. Der resultierende Markierungsmittel-Antigen-Komplex wurde mittels Gelfiltrationschromatographie mit einer Sepharose-6B-Säule von nichtreagiertem Material abgetrennt und gereinigt.
Fig. 2 zeigt das Absorptionsspektrum des erhaltenen Markierungsmittel-Antikörper-Komplexes, und Fig. 3 zeigt das Fluoreszenzspektrum davon. Die maximale Absorptionswellenlänge (λmax) betrug 641 nm, und die maximale Fluoreszenzwellenlänge (λem) betrug 730 nm, wobei die Differenz der Wellenlängen (Stoke'sche Verschiebung) 89 nm beträgt. Einige Diskrepanzen wurden gefunden zwischen dem Markierungsmittel selbst und dem markierten Komplex im Hinblick auf die maximale Absorptionswellenlänge und die maximale Fluoreszenzwellenlänge. Es wird angenommen, dass dies hauptsächlich auf die Wirkung des Messlösungsmittels zurückzuführen ist (dasselbe gilt für die nachfolgenden Beispiele).
Bei diesem Markierungsmittel-Antikörper-Komplex wurde aus den Absorptionswerten bei den Wellenlängen λ = 641 nm und λ = 280 nm das Verhältnis des gebundenen Markierungsmittels zu dem gebundenen Antikörper (in Mol) auf 1,9 : 1 geschätzt.

Beispiel 2

MonokIonaler Anti-Mensch HCG-Antikörper (hergestellt durch ZyMED Lab. Inc.) wurde auf eine Konzentration von 0,25 mg/ml mit phosphatgepuffertem Kochsalz (PBS, pH = 7,2) zur Herstellung einer monokIonalen Antikörperlösung verdünnt. Zu 7 ml dieser Antikörperlösung wurden 0,2 mg des oben bezeichneten Markierungsmittels Nr. 2 zugegeben. Die Mischung wurde 6 Stunden lang unter Rühren bei 20ºC reagieren gelassen, um einen Markierungsmittel-Antigen-Komplex zu bilden. Der resultierende Markierungsmittel-Antigen-Komplex wurde mittels Gelfiltrationschromatographie mit einer Sepharose-6B-Säule von nichtreagiertem Material abgetrennt und gereinigt.
Der resultierende Markierungsmittel-Antikörper-Komplex besaß eine maximale Absorptionswellenlänge (λmax) von 674 nm und eine maximale Fluoreszenzwellenlänge (λem) von 755 nm, wobei die Differenz der Wellenlängen (Stoke'sche Verschiebung) 81 nm betrug.
Bei diesem MArkierungsmittel-Antikörper-Komplex wurde aus den Absorptionswerten bei den Wellenlängen λ = 674 nm und λ = 280 nm, gemessen durch Spektroskopie im UV und sichtbaren Bereich, das Verhältnis des gebundenen Markierungsmittels zu dem gebundenen Antikörper (in Mol) auf 2, 2. 1 geschätzt.

Beispiel 3

Eine Lektinlösung wurde durch Auflösen von Lektin- Concanavalin A (hergestellt durch E. Y. Laboratories Co.) auf eine Konzentration von 0,2 mg/ml mit einer Phosphatpufferlösung (pH = 8,2) hergestellt. Zu 10 ml dieser Lectinlösung wurden 0,2 mg des oben bezeichneten Markierungsmittels Nr. 3 zugegeben. Die Mischung wurde 3 Stunden lang bei Raumtemperatur reagieren gelassen. Der resultierende Markierungsmittel-Lektin-Komplex wurde mittels Gelfiltrationschromatographie mit einer Sepharose-6B-Säule von nichtreagiertem Material abgetrennt und gereinigt.
Der resultierende Markierungsmittel-Lektin-Komplex besaß eine maximale Absorptionswellenlänge von 625 nm und eine maximale Fluoreszenzwellenlänge von 720 nm, wobei die Differenz der Wellenlängen (Stoke'sche Verschiebung) 95 nm betrug.
Bei diesem MArkierungsmittel-Lectin-Komplex wurde aus den Absorptionswerten bei Wellenlängen λ = 625 nm und λ = 280 nm, gemessen durch Spetroskopie im UV und sichtbaren Bereich, das Verhältnis des gebundenen Markierungsmittels zu dem gebundenen Lectin (in Mol) auf 3,7 : 1 geschätzt.

Beispiel 4

Eine DNA-Lösung wurde durch Auflösen von 0,1 mg einzelsträngiger DNA, M13mp18 (7249 Basen)(hergestellt durch Takara Shuzo Co., Ltd.) in 5 ml einer 5 mMol Phosphatpufferlösung (pH = 6) hergestellt. Getrennt davon wurde eine Farbstofflösung durch Auflösen von 0,1 mg des oben bezeichneten Markierungsmittels Nr. 2 in 5 ml destilliertem Wasser hergestellt. Zu dieser Farbstofflösung wurde die obige DNA-Lösung (5 ml) langsam tropfenweise unter Rühren zugegeben, und die Mischung wurde 2 Stunden lang bei Raumtemperatur weiter gerührt, um einen DNA- Markierungsmittel-Komplex zu bilden.
Zu der obigen Lösung des DNA-Markierungsmittel-Komplexes wurden 40 ml Ethanol zum Präzipitieren des DNA- Markierungsmittel-Komplexes zugegeben. Das Präzipitat wurde durch Filtration gewonnen und mehrere Male mit Ethanol gewaschen. Der gewaschene DNA-Markierungskomplex wurde erneut in 2 ml der obigen Phosphatpufferlösung (pH = 6) aufgelöst. Die Menge des an die DNA gebundenen Markierungsmittels wurde aus Absorptionswerten bei Wellenlängen von λ = 668 nm und λ = 260 nm auf 0,5 ug, bezogen auf 1 ug DNA, geschätzt.
Der resultierende DNA-Markierungsmittel-Komplex besaß eine maximale Absorptionswellenlänge von 668 nm und eine maximale Fluoreszenzwellenlänge von 755 nm, wobei die Differenz der Wellenlängen (Stoke'sche Verschiebung) 87 nm betrug.

Beispiel 5

Ein 20-mer-Oligonukleotid wurde mittels eines automatischen DNA-Synthesegeräts (Model 381A, hergestellt durch ABI Co.) synthetisiert, welches eine Basensequenz aufwies, die teilweise gegenüber der Basensequenz einer Modell- Zielnukleinsäure, M13mp18ss DNA, komplementär war. An den 5'- Terminus des obigen Oligonukleotids wurde eine primäre Aminogruppe durch Verwendung eines N-MMT-Hexanol-Aminlinkers (hergestellt durch Milligene Co.) anstelle eines gewöhnlichen Amidid-Reagenzes eingeführt. Das Abtrennen vom CPG-Träger, die Entfernung von den Schutzgruppen (einschließlich der Monomethoxytritylgruppe als der Schutzgruppe für eine primäre Aminogruppe) und die Reinigung mittels Hochauflösungsflüssigkeitschromatographie wurden gemäß dem herkömmlichen Protokoll ausgeführt.
200 ug des obigen Nukleotids, 100 ul 1M Natriumcarbonat- Pufferlösung (pH = 9,0) und 700 ul Wasser wurden zum Bilden einer Lösung gemischt. Hierzu wurde schrittweise unter Rühren eine zuvor präparierte Lösung von 2 mg des oben bezeichneten Markierungsmittels Nr. 3 in 200 ul Dimethylformamid zugegeben. Die Mischung wurde 24 Stunden lang bei Raumtemperatur reagieren gelassen, wodurch der Peak der Nukleinsäure bei der Hochauflösungsflüssigkeitschromatographie abnahm und ein neuer Peak, der sowohl die Absorption der Nukleinsäure als auch die Absorption des Markierungsmittels besaß, auftrat. Die Reaktionsmischung wurde mit einer Gelfiltrationssäule (NAP-50, hergestellt durch Pharmacia Co.) grob gereinigt und durch die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie weiter gereinigt. Dadurch wurde ein Nukleinsäure-Markierungsmittel-Komplex mit einer Ausbeute von 175 ug erhalten. Das molare Verhältnis der Nukleinsäure gegenüber dem Markierungsmittel in dem erhaltenen markierten Komplex betrug 1 : 1, da eine Aminogruppe in ein Molekül der Nukleinsäure eingeführt wurde.
Die maximale Absorptionswellenlänge des resultierenden DNA- Markierungsmittel-Komplexes betrug 625 nm, und die maximale Fluoreszenzwellenlänge davon betrug 720 nm, wobei die Differenz der Wellenlängen (Stoke'sche Verschiebung) 95 nm betrug.

Beispiel 6

Ein 20-mer-Olgionukleotid wurde mittels eines automatischen DNA-Synthesegeräts (Model 381A, hergestellt durch ABI Co.) synthetisiert, welcher eine Basensequenz aufwies, die teilweise komplementär war zur Basensequenz einer Modell- Zielnukleinsäure. An den 5'-Terminus des obigen 20-mer- Oligonukleotids wurden 10 Monomereinheiten eines Deoxyuridylsäure-Derivats mit einer primären Aminogruppe unter Verwendung eines Deoxyuridylsäurederivat-Monomers mit der nachfolgenden Formel anstelle eines gewöhnlichen Amididreagenzes, auf ähnliche Weise mittels des automatischen DNA-Synthesegeräts, eingeführt:
Das Abtrennen vom CPG-Träger, die Entfernung der Schutzgruppen (einschließlich der Trifluoroacetylgruppe als Schutzgruppe für eine primäre Aminogruppe) sowie die Reinigung mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie wurden gemäß einem herkömmlichen Protokoll ausgeführt.
200 ug des obigen Nukleotids mit primären Aminogruppen, 100 ul 1M Natriumkarbonat-Pufferlösung (pH = 9,0) und 700 ul Wasser wurden zum Bilden einer Lösung gemischt. Hierzu wurden schrittweise unter Rühren eine zuvor präparierte Lösung von 2 mg des oben bezeichneten Markierungsmittels Nr. 3 in 200 ul Dimethylformamid zugegeben. Die Mischung wurde 24 Stunden lang bei 40ºC reagieren gelassen, wodurch der Peak der Nukleinsäure bei der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie abnahm und ein neuer Peak, der sowohl die Absorption der Nukleinsäure als auch die Absorption des Markierungsmittels besaß, auftrat. Die Reaktionsmischung wurde mit einer Gelfiltrationssäule (NAP-50, hergestellt durch Pharmacia Co.) grob gereinigt und mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie weiter gereinigt. Dadurch wurde ein Nukleinsäure-Markierungsmittel-Komplex bei einer Ausbeute von 350 ug erhalten. Die Absorption des Nukleinsäure- Markierungsmittel-Komplexes bei 628 nm war etwa 10 mal so groß wie die des Nukleinsäure-Markierungsmittel-Komplexes des Beispiels 5. Dies wird dem molaren Verhältnis der Nukleinsäure zu dem Markierungsmittel von 1. 10 zugeschrieben, der aus dem Einführen von 10 primären Aminogruppen pro Mol der Nukleinsäure in diesem Beispiel im Vergleich zum Verhältnis von 1 : 1 des Beispiels 5 resultierte.
Der resultierende DNA-Markierungsmittel-Komplex besaß eine maximale Absorptionswellenlänge von 628 nm und eine maximale Fluoreszenzwellenlänge von 720 nm, wobei die Differenz der Wellenlängen (Stoke'sche Verschiebung) 92 nm betrug.

Beispiel 7

Zu 7 ml der im Beispiel 1 hergestellten Antikörperlösung wurden 0,3 mg des zuvor angegebenen Farbstoffs Nr. 12 und 0,08 g WSC zugegeben. Die Mischung wurde 3 Stunden lang bei Raumtemperatur reagieren gelassen, um einen Markierungsmittel-Antikörper-Komplex zu bilden. Der resultierende Komplex wurde mittels Gelfiltrationschromatographie mit einer Sepharose-6B-Säule getrennt und gereinigt.
Der resultierende Markierungsmittel-Antikörper-Komplex besaß eine maximale Absorptionswellenlänge (λmax) von 780 nm und eine maximale Fluoreszenzwellenlänge (λem) von 835 nm, wobei die Differenz der Wellenlängen (Stoke'sche Verschiebung) 55 nm betrug.
Das molare Verhältnis des gebundenen Markierungsmittels zu dem gebundenen Antikörper des Markierungsmittel-Antikörper- Komplexes wurde aus Absorptionswerten bei Wellenlängen von λ = 780 nm und λ = 280 nm, gemessen durch Spektroskopie im UV und sichtbaren Bereich, auf 1,9 : 1 geschätzt.

Vergleichsbeispiel 1

Es wurde ein bekannter, typischer Zweikernfarbstoff (Zweikern-Cyanfarbstoff) verwendet, welcher die unten gezeigte, chemische Struktur besaß:
Zu 7 ml der im Beispiel 1 hergestellten Antikörperlösung wurden 0,3 mg des obigen Farbstoffs und 0,08 g WSC zugegeben. Die Mischung wurde 3 Stunden lang bei Raumtemperatur reagieren gelassen, um einen Markierungsmittel-Antikörper- Komplex zu bilden. Der resultierende Markierungsmittel- Antikörper-Komplex wurde mittels Gelfiltrationschromatographie einer Sepharose-6B-Säule getrennt und gereinigt.
Der erhaltene Markierungsmittel-Antikörper-Komplex besaß eine maximale Absorptionswellenlänge (λmax) von 785 nm und eine maximale Fluoreszenzwellenlänge (λem) von 815 nm, wobei die Differenz der Wellenlängen (Stoke'sche Verschiebung) so gering wie 30 nm war.
Das molare Verhältnis des gebundenen Markierungsmittels zu dem gebundenen Antikörper wurde aus den Absorptionswerten bei Wellenlängen von λ = 785 nm und λ = 280 nm, gemessen durch Spektroskopie im UV und sichtbaren Bereich, auf 1,5 : 1 geschätzt.

Vergleichsbeispiel 2

Es wurde ein bekannter, typischer Zweikern-Cyanfarbstoff verwendet, welcher die unten gezeigte chemische Struktur mit einer Brücke einer Polymethin-Kette besaß:
Zu 7 ml der im Beispiel 1 hergestellten Antikörperlösung wurden 0,3 mg des obigen Farbstoffs und 0,08 g WSC zugegeben. Die Mischung wurde 3 Stunden lang bei Raumtemperatur reagieren gelassen, um einen Markierungsmittel-Antikörper-Komplex zu bilden. Der resultierende Markierungsmittel-Antikörper-Komplex wurde mittels Gelfiltrationschromatographie mit einer Sepharose-6B- Säule getrennt und gereinigt.
Der erhaltene Markierungsmittel-Antikörper-Komplex besaß eine maximale Absorptionswellenlänge (λmax) von 782 nm und eine maximale Fluoreszenzwellenlänge (λem) von 810 nm, wobei die Differenz der Wellenlängen (Stoketsche Verschiebung) so gering wie 28 nm war.
Das molare Verhältnis des gebundenen Markierungsmittels zu dem gebundenen Antikörper wurde aus den Absorptionswerten bei Wellenlängen von λ = 782 nm und λ = 280 nm, gemessen durch Spetroskopie im UV-sichtbaren Bereich, auf 1,7 : 1 geschätzt.
Wie in den Beispielen 1 bis 7 gezeigt, zeigt der markierte Komplex mit dem Dreikernfarbstoff, der in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, eine Stoke'sche Verschiebung (Differenz zwischen der maximalen Absorptionswellenlänge und der maximalen Fluoreszenzwellenlänge) von nicht weniger als 50 nm, wohingegen der markierte Komplex, der aus dem Farbstoff mit einer Absorption im roten bis infrarotnahen Bereich, veranschaulicht durch den in den Vergleichbeispielen 1 und 2 angewandten, Zweikern-Cyanfarbstoffen und dem speziellen Rhodaminfarbstoff, stammte, eine Stoke'sche Verschiebung von so wenig wie 20 bis 40 nm zeigt. Der im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendete markierte Komplex kann ohne weiteres mittels Spektroskopie detektiert werden und erlaubt den Nachweis einer Zielsubstanz mit einem hohen S/N- Verhältnis.

(Lagerungsstabilität des markierten Komplexes)

Die Lagerungsstabilität der markierten Komplexe wurden wie nachstehend getestet.
Jeder der in den Beispielen 1 bis 7 und Vergleichsbeispielen 1 und 2 hergestellten, markierten Komplexe wurde jeweils in 10 mMol Phosphatpufferlösung (pH = 7,2) bei einer vorbestimmten Konzentration aufgelöst. Die markierte Komplexlösung wurde bei 10ºC für 3 Tage im Dunkeln gelagert.
Die Lichtabsorption und die Fluoreszenzintensität von jeder Lösung wurde zu Beginn und am Ende des Lagerungstests gemessen. Die relativen Werte der Absorption und der Fluoreszenzintensität zum Ende des Lagerungstests wurden durch deren Verhältnisse zu jenen zu Beginn des Lagerungstests dargestellt (wobei die Werte zu Beginn als 100 angesetzt wurden). Tabelle 2: Lagerungsstabilität des markierten Komplexes
Wie in der Tabelle 2 gezeigt, verändert sich die Absorption und die Fluoreszenzintensität der in der vorliegenden Erfindung verwendeten markierten Komplexe in Wasser weniger als die der Vergleichsbeispiele, was die ausgezeichnete Lagerungsstabilität der markierten Komplexe der vorliegenden Erfindung zeigt. Die im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten markierten Komplexe zeigten Stoke'sche Verschiebungen (Differenz zwischen der maximalen Absorptionswellenlänge und der maximalen Fluoreszenzwellenlänge) von nicht weniger als 50 nm, wie in den Beispielen 1 bis 7 gezeigt. Auf der anderen Seite zeigten die markierten Komplexe, die aus dem Farbstoff mit einer Absorption im roten bis Nahinfrarotbereich, veranschaulicht durch die in Vergleichsbeispielen 1 und 2 verwendeten Zweikern- Cyanfarbstoffen sowie dem speziellen Rhodaminfarbstoff, stammten, eine Stoke'sche Verschiebung von so wenig wie 20 bis 40 nm.
Wie oben beschrieben zeigt der im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendete markierte Komplex eine größere Stoke'sche Verschiebung, und deshalb wird die Fluoreszenz mit einem höheren S/N-Verhältnis leicht vom Anregungslicht bei der Detektion der markierten Substanz getrennt. Folglich erhöht sich die Nachweisempfindlichkeit selbst dann, wenn die Spezifität der biologischen Substanz des markierten Komplexes gegenüber der biologischen Zielsubstanz dieselbe ist. Ferner können, falls ein markierter Komplex mit einer geringeren Stoke'schen Verschiebung (z.B ein Cyankomplex) mit einem der vorliegenden Erfindung kombiniert wird, zwei Arten von Fluoreszenzsignalen mit einer Wellenlänge des Anregungslichts, etwa einem Laser, detektiert werden. Zusätzlich ist der im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendete markierte Komplex stabil und zerstört nicht die Fluoreszenzemissionseigenschaften, selbst wenn er in einer wässrigen Lösung gelagert wird, so dass der Komplex Reagenzien mit ausgezeichneter Stabilität in der Lagerung zur Anwendung auf Mikroanalysen liefert.

Claims

1. Verfahren zum Detektieren einer biologischen Zielsubstanz von Interesse in einer Probe, umfassend die Schritte:

(i) Bereitstellen eines markierten Komplexes, welcher an die biologische Zielsubstanz von Interesse spezifisch bindet, wobei der markierte Komplex durch das Kombinieren eines Markierungsmittels mit einer biologischen Substanz gebildet wird;

(ii) Komplexieren des markierten Komplexes mit der Probe, die die biologische Zielsubstanz von Interesse enthält, zum Bilden einer markierten, biologischen Zielsubstanz;

(iii) Abtrennen des ungebundenen, markierten Komplexes von der im Schritt (ii) gebildeten, markierten biologischen Zielsubstanz; und

(iv) Bestrahlen der markierten biologischen Zielsubstanz mit einem Halbleiterlaser, der eine Emissionswellenlänge im Bereich von 600 bis 900 nm aufweist, um die Stärke des von der Markierung emittierten Fluoreszenzlichts zu messen, wodurch die Gegenwart und/oder die Menge der biologischen Zielsubstanz von Interesse in der Probe gemessen wird;

wobei das in dem markierten Komplex enthaltene Markierungsmittel ein Dreikernfarbstoff ist, der durch die nachfolgende allgemeine Formel (I) oder (II) dargestellt ist:

worin die durchbrochenen Ringlinien Xa, Xb oder Xc unabhängig von einander einen heterozyklischen Ring darstellen mit einem bis drei Heteroatomen Sauerstoff, Schwefel, Stickstoff oder Selen, wobei der heterozyklische Ring nicht substituiert oder durch irgendeine substituierte oder nicht-substituierte Alkylgruppe, substituierte oder nicht-substituierte Arylgruppe oder substituierte oder nicht-substituierte Aralkylgruppe substituiert ist; La und Lb unabhängig voneinander eine Methinkette darstellen, die sich aus einem bis sechs substituierten oder nicht-substituierten Methin- Verknüpfungen zusammensetzen, wobei ein Bestandteil von La und Lb zur unmittelbaren Verbindung an die heterozyklischen Ringe weggelassen werden kann; und Y ein Anion darstellt.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die durchbrochenen Ringlinien mit Xa, Xb oder Xc unabhängig voneinander ein substituierter oder nicht-substituierter fünf- oder sechsgliedriger heterozyklischer Ring mit einem oder zwei Stickstoffatomen, oder ein kondensierter Ring davon sind.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Dreikernfarbstoff eine Verbindung, die durch die nachstehende allgemeine Formel (III) oder ein Isomer davon, bei welchem das Stickstoffatom im mittleren Teil der Formel anstelle an der 4-Position an der 5-Position ist, wiedergegeben ist:

worin r&sup8;, r&sup9;, r¹&sup0; und r¹¹ unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, ein Halogenatom, eine substituierte oder nicht-substituierte Alkylgruppe, eine Alkoxygruppe, eine substituierte oder nicht-substituierte Arylgruppe oder eine substituierte oder nicht-substituierte Aminogruppe sind und r&sup8; und r&sup9; miteinander verbunden sein können zur Bildung eines substituierten oder nicht-substituierten, aromatischen Rings; r&sup6; unabhängig in Bezug auf die jeweiligen Wiederholungseinheiten nicht vorliegt oder eine alkyl-substituierte Ethylengruppe ist und mit r&sup8; oder r&sup9; zum Bilden einer zyklischen Struktur verbunden ist; r¹ und ² unabhängig voneinander eine substituierte oder nicht-substituierte Arylgruppe sind, oder r¹ und r² zum Bilden eines substituierten oder nichtsubstituierten, kondensierten Rings miteinander verbunden sind; r³, r&sup4; und r&sup5; unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, eine substituierte oder nicht-substituierte Alkylgruppe, eine Alkylsulfonatgruppe, eine substituierte oder nicht-substituierte Alkenylgruppe, eine substituierte oder nicht-substituierte Arylgruppe oder eine substituierte oder nicht-substituierte Aralkylgruppe sind; X¹ ein Sauerstoffatom, ein Schwefelatom, ein Kohlenstoffatom, ein Stickstoffatom oder ein Selenatom ist und, wenn X¹ ein Kohlenstoffatom oder ein Stickstoffatom ist, X¹ an Wasserstoffatome, substituierte oder nicht-substituierte Alkylgruppen, eine substituierte oder nicht-substituierte Arylgruppe und/oder eine substituierte oder nicht-substituierte Aralkylgruppe gebunden ist; X² ein Sauerstoffatom, ein Schwefelatom oder ein Stickstoffatom ist und, wenn X² ein Stickstoffatom ist, X² an ein Wasserstoffatom, eine substituierte oder nichtsubstituierte Alkylgruppe, eine substituierte oder nichtsubstituierte Arylgruppe und/oder eine substituierte oder nicht-substituierte Aralkylgruppe gebunden ist; X³ ein Sauerstoffatom oder ein Schwefelatom ist; und m und 1 unabhängig voneinander eine ganze Zahl von 0 bis 3, jedoch nicht gleichzeitig 0 sind.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Dreikernfarbstoff eine Verbindung ist, die durch die allgemeine Formel (IV) unten, oder ein Isomer davon, bei dem das Stickstoffatom im mittleren Bereich der Formel anstelle der 4-Position bei der 5-Position ist, wiedergegeben ist:

worin r¹&sup9;, r²&sup0; und r²¹ unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, ein Halogenatom, eine substituierte oder nicht-substituierte Alkylgruppe, eine Alkoxygruppe, eine substituierte oder nicht-substituierte Arylgruppe oder eine substituierte oder nicht-substituierte Aminogruppe sind und r¹&sup9; und r²&sup0; zum Bilden eines substituierten oder nichtsubstituierten, kondensierten Rings miteinander verbunden sein können; r¹², r¹³, r¹&sup4; und r¹&sup5; unabhängig voneinander eine substituierte oder nicht-substituierte Arylgruppe sind, oder r¹² und r¹³ oder r¹&sup4; und r¹&sup5; zum Bilden eines substituierten oder nicht-substituierten, kondensierten Rings miteinander verbunden sind; r¹&sup6;, r¹&sup7; und r¹&sup8; unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, eine substituierte oder nicht-substituierte Alkylgruppe, eine Alkylsulfonatgruppe, eine substituierte oder nicht-substituierte Alkenylgruppe, eine substituierte oder nicht-substituierte Arylgruppe oder eine substituierte oder nicht-substituierte Aralkylgruppe sind; X&sup4; und X&sup6; unabhängig voneinander ein Sauerstoffatom, ein Schwefelatom, ein Kohlenstoffatom, ein Stickstoffatom oder ein Selenatom sind und, wenn X&sup4; oder X&sup6; ein Kohlenstoffatom oder ein Stickstoffatom ist, X&sup4; oder X&sup6; an Wasserstoffatome, eine substituierte oder nicht-substituierte Alkylgruppe, eine substituierte oder nicht-substituierte Arylgruppe und/oder eine substituierte oder nicht-substituierte Aralkylgruppe gebunden ist; X&sup5; ein Sauerstoffatom, ein Schwefelatom oder ein Stickstoffatom ist und, wenn X&sup5; ein Stickstoffatom ist, X&sup5; an ein Wasserstoffatom, eine substituierte oder nichtsubstituierte Alkylgruppe, eine substituierte oder nichtsubstituierte Arylgruppe und/oder eine substituierte oder nicht-substituierte Aralkylgruppe gebunden ist; Z&supmin; ein Anion darstellt; und y eine ganze Zahl von 0, 1 oder 2 ist.

5. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Dreikernfarbstoff ausgewählt wird aus der Strukturformel (1), der Strukturformel (2), der Strukturformel (3), der Strukturformel (4), der Strukturformel (5), der Strukturformel (6), der Strukturformel (7), der Strukturformel (8), der Strukturformel (9), der Strukturformel (10), der Strukturformel (11) oder der Strukturformel (12):

6. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die biologische Zielsubstanz von Interesse ein Antikörper oder ein Antigen ist.

7. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die biologische Zielsubstanz von Interesse eine Nukleinsäure ist.