DE60213113T2

DE60213113T2 - 7-TERT-BUTYL-3-(2-FLUOROPHENYL)-6-(2H-i1,2,4öTRIAZOL-3-YLMETHOXY)-i1,2,4öTRIAZOLOi4,3-BöPYRIDAZIN FÜR DIE BEHANDLUNG VON ANGSTZUSTÄNDEN UND KRÄMPFEN

Info

Publication number: DE60213113T2
Application number: DE60213113T
Authority: DE
Inventors: Robert William Harlow CARLING; William Kevin Harlow MOORE; Joseph Leslie Harlow STREET
Original assignee: Merck Sharp and Dohme Ltd
Current assignee: Organon Pharma UK Ltd
Priority date: 2001-09-20
Filing date: 2002-09-13
Publication date: 2007-02-01
Anticipated expiration: 2022-09-14
Also published as: JP2005507391A; DE60213113D1; US20040242586A1; CA2460445A1; ES2268083T3; AU2002331942B2; GB0122696D0; EP1430055A1; ATE332899T1; US7015224B2; EP1430055B1; WO2003024968A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein substituiertes Triazolopyridazin-Derivat und dessen Verwendung bei der Therapie. Insbesondere betrifft diese Erfindung ein spezielles substituiertes [1,2,4]-Triazolo[4,3-b]pyridazin-Derivat, das ein GABA_A-Rezeptorligand ist und sich deshalb bei der Therapie von gestörten Geisteszuständen eignet.
Rezeptoren für den bedeutendsten inhibierenden Neurotransmitter, Gamma-Aminobuttersäure (GABA), werden in zwei Hauptklassen unterteilt: (1) GABA_A-Rezeptoren, die Mitglieder der Oberfamilie der ligandengesteuerten Ionenkanäle sind, und (2) GABA_B-Rezeptoren, die Mitglieder der Oberfamilie der G-Protein-verknüpften Rezeptoren sein können. Seit dem Klonen der ersten cDNAs codierenden einzelnen GABA_A-Rezeptor-Untereinheiten ist die Anzahl der bekannten Mitglieder der Säugerfamilie angewachsen und umfasst wenigstens sechs α-Untereinheiten, vier β-Untereinheiten, drei γ-Untereinheiten, eine δ-Untereinheit, eine ε-Untereinheit und zwei ρ-Untereinheiten.
Obwohl das Wissen über die Vielseitigkeit der GABA_A-Rezeptor-Genfamilie für unser Verständnis dieses ligandengesteuerten Ionenkanals einen gewaltigen Schritt vorwärts bedeutet, befindet sich die Kenntnis über das Ausmaß der Unterart-Vielseitigkeit noch in einem Anfangsstadium. Es ist gezeigt worden, dass eine α-Untereinheit, eine β-Untereinheit und eine γ-Untereinheit die Minimalanforderung für die Bildung eines vollfunktionellen GABA_A-Rezeptors, der durch transiente Transfektion von cDNAs in Zellen exprimiert wird, darstellen. Wie oben angegeben, existieren auch δ, ε und ρ-Untereinheit, diese sind jedoch in GABA_A-Rezeptorpopulationen nur in geringem Maße vorhanden.
Die Untersuchungen der Rezeptorgröße und die Sichtbarmachung durch Elektronenmikroskopie lassen schließen, dass, wie andere Mitglieder der Familie der ligandengesteuerten Ionenkanäle, der natürlische GABA_A-Rezeptor in pentamerer Form existiert. Die Auswahl von wenigstens einer α-, einer β- und einer γ-Untereinheit aus einem Repertoire von siebzehn lässt die mögliche Existenz von mehr als 10000 pentameren Untereinheitenkombinationen zu. Darüber hinaus berücksichtigt diese Berechnung nicht die zusätzlichen Permutationen, die möglich wären, wenn die Anordnung von Untereinheiten um den Ionenkanal herum keinen Beschränkungen unterliegt (d.h., es könnten für einen Rezeptor, der aus fünf verschiedenen Untereinheiten besteht, 120 mögliche Varianten existieren).
Rezeptor-Unterart-Zusammenstellungen, die existieren, sind u.v.a. α1β2γ2, α2β2/3γ2, α3βγ2/3, α2βγ1, α5β3γ2/3, α6βγ2, α6βδ und α4βδ. Unterart-Zusammenstellungen, die eine α1-Untereinheit enthalten, sind in den meisten Bereichen des Hirns vorhanden, und man nimmt an, dass sie über 40% der GABA_A-Rezeptoren in der Ratte ausmachen. Man nimmt an, dass Unterart-Zusammenstellungen, die α2- bzw. α3-Untereinheiten enthalten, etwa 25% und 17% der GABA_A-Rezeptoren in der Ratte ausmachen. Unterart-Zusammenstellungen, die eine α5-Untereinheit enthalten, sind überwiegend im Hippocampus und in der Hirnrinde exprimiert, und man nimmt an, dass sie etwa 4% der GABA_A-Rezeptoren in der Ratte ausmachen.
Eine charakteristische Eigenschaft aller bekannten GABA_A-Rezeptoren ist die Gegenwart einer Reihe von Modulatorstellen, eine davon ist die Benzodiazepin(BZ)-Bindungsstelle. Die BZ-Bindungsstelle ist die am meisten untersuchte GABA_a-Rezeptormodulatorstelle und ist die Stelle, durch die Anxiolytika, wie z.B. Diazepam und Temazepam, ihre Wirkung entfalten. Vor dem Klonen der GABA_A-Rezeptor-Genfamilie war die Benzodiazepin-Bindungsstelle historisch in zwei Unterarten, BZ1 und BZ2, unterteilt, basierend auf Radioligandenbindungsuntersuchungen. Es ist gezeigt worden, dass die BZ1-Unterart mit einem GABA_A-Rezeptor, der die α1-Untereinheit in Kombination mit einer β-Untereinheit und γ2 enthält, pharmakologisch äquivalent ist. Diese ist die am weitesten verbreitete GABA_A-Rezeptor-Unterart, und man nimmt an, dass sie nahezu die Hälfte aller GABA_A-Rezeptoren im Hirn darstellt.
Zwei andere bedeutende Populationen sind die α2βγ2- und α3βγ2/3-Unterarten. Zusammen machen sie etwa weitere 35% des gesamten GABA_A-Rezeptor-Repertoires aus. Pharmakologisch scheint diese Kombination mit der zuvor durch Radioligandenbindung definierten BZ2-Unterart äquivalent zu sein, obwohl die BZ2-Unterart auch bestimmte α5-haltige Unterart-Zusammenstellungen umfassen kann. Die physiologische Rolle dieser Unterarten war bisher unklar, da keine ausreichend selektiven Agonisten oder Antagonisten bekannt waren.
Es wird jetzt angenommen, dass Mittel, die als BZ-Agonisten an α1βγ2-, α2βγ2- oder α3βγ2-Unterarten wirken, wünschenswerte anxiolytische Eigenschaften besitzen werden. Verbindungen, die durch Wirkung als BZ-Agonisten Modulatoren der Benzodiazepin-Bindungsstelle des GABA_A-Rezeptors sind, werden hierin nachfolgend als "GABA_A-Rezeptoragonisten" bezeichnet. Die α1-selektiven GABA_A-Rezeptoragonisten Alpidem und Zolpidem werden klinisch als Hypnotika verschrieben, was nahelegt, dass wenigstens ein Teil der Sedation, die mit bekannten Anxiolytika, die an der BZ1-Bindungsstelle wirken, assoziiert ist, durch GABA_A-Rezeptoren vermittelt wird, welche die α1-Untereinheit enthalten. Demgemäß geht man davon aus, dass GABA_A-Rezeptoragonisten, die wirkungsvoller an die α2- und/oder α3-Untereinheit binden als an α1, bei der Behandlung von Angst wirksam sein werden, bei verringerter Neigung zur Herbeiführung von Sedation. Auch können Mittel, die Antagonisten oder inverse Agonisten an α1 sind, eingesetzt werden, um eine von α1-Agonisten verursachte Sedation oder Hypnose umzukehren.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind selektive Liganden für GABA_A-Rezeptoren und daher bei der Behandlung und/oder Prävention von einer Reihe von Störungen des Zentralnervensystems geeignet. Solche Störungen sind u.a. Angststörungen, wie z.B. Panik mit oder ohne Agoraphobie, Agoraphobie ohne Panik-Vorgeschichte, Tier- und anderen Phobien, einschließlich sozialer Phobien, Zwangsstörung, Stressstörungen, einschließlich posttraumatischer und akuter Stressstörung, und generalisierte oder substanzinduzierte Angststörung; Neurosen; Konvulsionen; Migräne; depressive oder bipolare Störungen, zum Beispiel einmalige oder rezidivierende schwere depressive Störung, dysthymische Störung, manische Bipolar-I- und Bipolar-II-Störungen und zyklothyme Störung; psychotische Störungen, einschließlich Schizophrenie; Neurodegeneration, die durch zerebrale Ischämie entsteht; Aufmerksamkeitsdefizit-Hyperaktivitätsstörung; Tourette-Syndrom; Sprachstörungen, einschließlich Stottern; und Störungen des zirkadianen Rhythmus, z.B. bei Subjekten, die an den Auswirkungen des Jetlags oder der Schichtarbeit leiden.
Weitere Störungen, gegen die selektive Liganden für GABA_A-Rezeptoren von Nutzen sein können, sind u.a. Schmerz und Nozizeption; Erbrechen, einschließlich akutem, verzögertem und erwartetem Erbrechen, insbesondere durch Chemotherapie oder Bestrahlung hervorgerufenes Erbrechen sowie Bewegungsschwindel, postoperativer Übelkeit und postoperativem Erbrechen; Essstörungen, einschließlich Anorexia nervosa und Bulimia nervosa; prämenstruelles Syndrom; Muskelkrämpfe oder Spastizität, z.B. bei paraplegischen Patienten; Gehörschädigungen, einschließlich Tinnitus und altersbezogener Höhrschwäche; Harninkontinenz und die Auswirkungen von Drogenmissbrauch und -abhängigkeit, einschließlich Alkoholentzug. Selektive Liganden für GABA_A-Rezeptoren können auch als Prämedikation vor der Anästhesie oder kleineren Eingriffen, wie z.B. der Endoskopie, einschließlich der Magen-Endoskopie, wirksam sein.
Darüber hinaus können die Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung als Radioliganden bei Assays zum Nachweis von Verbindungen, die in der Lage sind, an den menschlichen GABA_A-Rezeptor zu binden, geeignet sein.
Die WO 98/04559 beschreibt eine Klasse von substituierten und 7,8-ringkondensierten [1,2,4]Triazolo[4,3-b]pyridazin-Derivaten, die angeblich selektive Liganden für GABA_A-Rezeptoren und bei der Behandlung und/oder Prävention von neurologischen Störungen, einschließlich Angst und Konvulsionen, von Nutzen sind.
Die vorliegende Erfindung stellt ein spezielles Triazolopyridazinderivat und pharmazeutisch annehmbare Salze davon zur Verfügung, die an verschiedenen GABA_A-Rezeptor-Unterarten wünschenswerte Bindungseigenschaften besitzen. Die Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung besitzen eine gute Affinität als Liganden für die α2- und/oder α3-Untereinheit des menschlichen GABA_A-Rezeptors. Die Verbindungen dieser Erfindung können vorteilhafter mit der α2- und/oder α3-Untereinheit wechselwirken als mit der α1-Untereinheit. Tatsächlich weisen die Verbindungen der Erfindung eine funktionelle Selektivität in Bezug auf eine selektive Wirksamkeit für die α2- und/oder α3-Untereinheit, relativ zur α1-Untereinheit, auf.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind GABA_A-Rezeptorunterartliganden mit einer Bindungsaffinität (K_i) für die α2- und/oder α3-Untereinheit, gemessen in dem hier nachstehend beschriebenen Assay, von weniger als 1 nM. Ferner weisen die Verbindungen gemäß dieser Erfindung eine funktionelle Selektivität in Bezug auf eine selektive Wirksamkeit für die α2- und/oder α3-Untereinheit, relativ zur α1-Untereinheit, auf. Darüber hinaus besitzen die Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung interessante pharmakokinetische Eigenschaften, insbesondere in Bezug auf eine erhöhte orale Bioverfügbarkeit.
Die vorliegende Erfindung stellt 7-tert.-Butyl-3-(2-fluorphenyl)-6-(2H-[1,2,4]-triazol-3-ylmethoxy)-[1,2,4]triazolo[4,3-b]pyridazin der Formel I:
oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon zur Verfügung
Die vorliegende Erfindung stellt auch 7-tert.-Butyl-3-(2-fluorphenyl)-6-(2H-[1,2,4]-triazol-3-ylmethoxy)-[1,2,4]triazolo[4,3-b]pyridazin der oben gezeigten Formel oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon in isolierter Form zur Verfügung.
Die Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung sind vom allgemeinen Umfang der WO 98/04559 umfasst. Darin findet sich jedoch keine spezielle Offenbarung der Verbindung der Formel I, wie sie oben gezeigt ist, oder von pharmazeutisch annehmbaren Salzen davon.
Zur medizinischen Verwendung werden die Salze der Verbindung der obigen Formel I pharmazeutisch annehmbare Salze sein. Andere Salze können jedoch zur Herstellung der Verbindung der Formel I oder ihrer pharmazeutisch annehmbaren Salze geeignet sein. Geeignete pharmazeutisch annehmbare Salze der Verbindung der Formel I sind u.a. Säureadditionssalze, die beispielsweise durch Mischen einer Lösung der Verbindung der Formel I mit einer Lösung einer pharmazeutisch annehmbaren Säure, wie z.B. Salzsäure, Schwefelsäure, Methansulfonsäure, Fumarsäure, Maleinsäure, Succinsäure, Essigsäure, Benzoesäure, Oxasäure, Citronensäure, Weinsäure, Kohlensäure oder Phosphorsäure, gebildet werden können.
Ebenfalls von der vorliegenden Erfindung zur Verfügung gestellt wird ein Verfahren zur Behandlung und/oder Prävention von Angst, welches die Verabreichung einer wirksamen Menge der Verbindung der oben gezeigten Formel I oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon an einen Patienten, der eine solche Behandlung benötigt, umfasst.
Ferner von der vorliegenden Erfindung zur Verfügung gestellt wird ein Verfahren zur Behandlung und/oder Prävention von Konvulsionen (z.B. bei einem Patienten, der an Epilepsie oder einer verwandten Störung leidet), welches die Verabreichung einer wirksamen Menge der Verbindung der oben gezeigten Formel I oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon an einen Patienten, der eine solche Behandlung benötigt, umfasst.
Die Bindungsaffinität (K_i) der Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung für die α3-Untereinheit des menschlichen GABA_A-Rezeptors wird zweckmäßigerweise in dem hierin nachstehend beschriebenen Assay gemessen. Die α3-Untereinheit-Bindungsaffinität (K_i) der Verbindungen der Erfindung beträgt weniger als 1 nM.
Die Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung rufen eine selektive Potenzierung der GABA-EC₂₀-Reaktion in stabil transfektierten rekombinanten Zelllinien, welche die α3-Untereinheit des menschlichen GABA_A-Rezeptors exprimieren, hervor, relativ zur Potenzierung der GABA-EC₂₀-Reaktion, die in stabil transfektierten rekombinanten Zelllinien, welche die α1-Untereinheit des menschlichen GABA_A-Rezeptors exprimieren, hervorgerufen wird.
Die Potenzierung der GABA-EC₂₀-Reaktion in stabil transfektierten Zelllinien, welche die α3- und α1-Untereinheiten des menschlichen GABA Rezeptors exprimieren, kann zweckmäßigerweise durch Verfahren gemessen werden, die analog sind zu der in Wafford et al., Mol. Pharmacol., 1996, 50, 670–678, beschriebenen Vorschrift. Das Verfahren wird geeigneterweise unter Verwendung von Kulturen aus stabil transfektierten eukaryotischen Zellen, typischerweise stabil transfektierten Maus-Ltk^–-Fibroblastenzellen, durchgeführt.
Die Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung können eine anxiolytische Wirkung aufweisen, wie es durch eine positive Reaktion im Elevated-Plus-Maze-Test und im Test mit konditionierter Trinkunterdrückung gezeigt wird (vgl. Dawson et al., Psychopharmacology, 1995, 121, 109–117). Darüber hinaus sind die Verbindungen der Erfindung wahrscheinlich im wesentlichen nichtsedatierend, wie es durch ein entsprechendes Ergebnis, das aus dem Reaktionssensitivitäts(Kettenzieh)-Test (vgl. Bayley et al., Psychopharmacol., 1996, 10, 206–213) erhalten wird, bestätigt werden kann.
Die Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung können auch eine antikonvulsive Wirkung aufweisen. Dies kann durch ihre Fähigkeit, durch Pentylentetrazol hervorgerufene Anfälle bei Ratten und Mäusen zu blockieren, gezeigt werden, wobei eine Vorschrift analog zu der von Bristow et al. in J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 279, 492–501, beschriebenen Vorschrift befolgt wird.
Vorteilhafterweise werden die Verbindungen der Erfindung ihre nützliche therapeutische Wirkung durch Verabreichung auf oralem Wege entfalten können.
Die Erfindung stellt auch pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verfügung, die eine oder mehrere Verbindungen dieser Erfindung in Verbindung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger enthalten. Vorzugsweise liegen diese Zusammensetzungen in Einheitsdosisformen, wie z.B. Tabletten, Pillen, Kapseln, Pulvern, Granulaten, sterilen parenteralen Lösungen oder Suspensionen, dosierten Aerosol- oder Flüssigsprays, Tropfen, Ampullen, Autoinjektionsvorrichtungen oder Zäpfchen, zur oralen, parenteralen, intranasalen, sublingualen oder rektalen Verabreichung oder zur Verabreichung durch Inhalation oder Insufflation vor. Zur Herstellung fester Zusammensetzungen, wie z.B. Tabletten, wird der Hauptwirkstoff mit einem pharmazeutischen Träger, z.B. herkömmlichen Tablettierungsbestandteilen wie Maisstärke, Lactose, Saccharose, Sorbit, Talk, Stearinsäure, Magnesiumstearat, Dicalciumphosphat oder Gummen, und anderen pharmazeutischen Verdünnungsmitteln, z.B. Wasser, zu einer festen Vorformulierungszusammensetzung vermischt, die eine homogene Mischung einer Verbindung der vorliegenden Erfindung oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon enthält. Wenn diese Vorformulierungszusammensetzungen als homogen bezeichnet werden, bedeutet dies, dass der Wirkstoff gleichmäßig in der Zusammensetzung dispergiert ist, so dass die Zusammensetzung leicht in gleichwirksame Einheitsdosisformen, wie z.B. Tabletten, Pillen und Kapseln, unterteilt werden kann. Diese feste Vorformulierungszusammensetzung wird dann in Einheitsdosisformen des oben beschriebenen Typs unterteilt, wobei diese 0,1 mg bis etwa 500 mg des Wirkstoffes der vorliegenden Erfindung enthalten. Typische Einheitsdosisformen enthalten 1 bis 100 mg, zum Beispiel 1, 2, 5, 10, 25, 50 oder 100 mg, des Wirkstoffes. Die Tabletten oder Pillen der neuen Zusammensetzung können überzogen oder auf andere Weise compoundiert werden, um eine Dosierungsform zu ergeben, die den Vorteil einer verlängerten Wirkung besitzt. Zum Beispiel kann die Tablette oder Pille eine innere Dosierungs- und eine äußere Dosierungskomponente enthalten, wobei letztere in Form einer Hülle über der ersteren liegt. Die zwei Komponenten können durch eine magensaftresistente Schicht getrennt sein, die die Auflösung im Magen verhindert und die es der inneren Komponente ermöglicht, intakt in den Zwölffingerdarm zu gelangen oder deren Freisetzung zu verzögern. Verschiedene Materialien können für solche magensaftresistente Schichten oder Überzüge verwendet werden, wobei solche Materialien eine Reihe von Polymersäuren und Mischungen von Polymersäuren mit Materialien, wie z.B. Schellack, Cetylalkohol und Celluloseacetat, einschließen.
Die flüssigen Formen, in welche die neuen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung zur oralen Verabreichung oder Verabreichung durch Injektion eingebracht werden können, sind u.a. wässrige Lösungen, geeignet aromatisierte Sirupe, wässrige oder Ölsuspensionen und aromatisierte Emulsionen mit essbaren Ölen wie Baumwollsamenöl, Sesamöl, Kokosnussöl oder Erdnussöl, wie auch Elixiere und ähnliche pharmazeutische Vehikel. Geeignete Dispersions- oder Suspensionsmittel für wässrige Suspensionen sind u.a. synthetische und natürliche Gummen wie Tragantgummi, Akaziengummi, Alginat, Dextran, Natriumcarboxymethylcellulose, Methylcellulose, Polyvinylpyrrolidon oder Gelatine.
Bei der Behandlung von Angst beträgt eine geeignete Dosismenge etwa 0,01 bis 250 mg/kg pro Tag, vorzugsweise etwa 0,05 bis 100 mg/kg pro Tag und insbesondere etwa 0,05 bis 5 mg/kg pro Tag. Die Verbindungen können auch in einem Regime 1 bis 4 Mal pro Tag verabreicht werden.
Die Verbindung der oben gezeigten Formel I kann durch ein Verfahren hergestellt werden, das die Umsetzung einer Verbindung der Formel III mit einer Verbindung der Formel IV umfasst:
wobei L¹ eine geeignete Abgangsgruppe bedeutet und R^p eine Aminoschutzgruppe bedeutet, gefolgt von der Entfernung der Aminoschutzgruppe R^p.
Die Abgangsgruppe L¹ ist typischerweise ein Halogenatom, insbesondere Chlor.
Die Aminoschutzgruppe R^p umfasst geeigneterweise 2-(Trimethylsilanyl)ethoxymethyl, wobei in diesem Falle die Entfernung der Aminoschutzgruppe R^p zweckmäßigerweise durch Behandeln mit einer Mineralsäure, wie z.B. Salzsäure, in einem Niederalkohol, wie z.B. Ethanol, erfolgen kann.
Die Reaktion zwischen den Verbindungen III und IV wird zweckmäßigerweise durch Rühren der Reaktanden in einem geeigneten Lösungsmittel in Gegenwart einer Base bewirkt. Typischerweise ist das Lösungsmittel N,N-Dimethylformamid, und die Base ist eine starke Base, wie z.B. Lithiumhexamethyldisilazid.
Bei einem weiteren Verfahren kann die Verbindung der oben gezeigten Formel I durch ein Verfahren hergestellt werden, das die Umsetzung der Verbindung der Formel V (oder ihres [1,2,4]-Triazolo[4,3-b]pyridazin-6-on-Tautomers) mit einer Verbindung der Formel VI umfasst:
wobei R^p wie oben definiert ist und L² eine geeignete Schutzgruppe bedeutet, gefolgt von der Entfernung der Aminoschutzgruppe R^p.
Die Abgangsgruppe L² ist geeigneterweise ein Halogenatom, typischerweise Chlor oder Brom.
Die Reaktion zwischen den Verbindungen V und VI wird zweckmäßigerweise durch Rühren der Reaktanden in einem geeigneten Lösungsmittel, typischerweise N,N-Dimethylformamid, in Gegenwart einer starken Base, wie z.B. Natriumhydrid, bewirkt.
Das Zwischenprodukt der obigen Formel V kann zweckmäßigerweise durch Umsetzung einer Verbindung der wie oben definierten Formel III mit einem Alkalimetallhydroxid, z.B. Natriumhydroxid, hergestellt werden. Die Reaktion erfolgt zweckmäßigerweise in einem inerten Lösungsmittel, wie z.B. wässrigem 1,4-Dioxan, idealerweise bei der Rückflusstemperatur des Lösungsmittels.
Bei einem weiteren Verfahren kann die Verbindung der oben gezeigten Formel I durch ein Verfahren hergestellt werden, das die Umsetzung von Trimethylessigsäure mit einer Verbindung der Formel VII umfasst:
wobei R^p wie oben definiert ist, in Gegenwart von Silbernitrat und Ammoniumpersulfat, gefolgt von der Entfernung der Aminoschutzgruppe R^p.
Die Reaktion wird zweckmäßigerweise in einem geeigneten Lösungsmittel, zum Beispiel in Wasser oder wässrigem Acetonitril, gegebenenfalls unter sauren Bedingungen, z.B. unter Verwendung von Trifluoressigsäure oder Schwefelsäure, typischerweise bei einer erhöhten Temperatur durchgeführt.
Bei noch einem weiteren Verfahren kann die Verbindung der oben gezeigten Formel I durch ein Verfahren hergestellt werden, das die Umsetzung einer Verbindung der Formel VIII mit einer Verbindung der Formel IX umfasst:
wobei R^p wie oben definiert ist, M -B(OH)₂ oder -Sn(Alk)₃ bedeutet, wobei Alk eine C_1-6-Alkylgruppe bedeutet, typischerweise n-Butyl, und L³ eine geeignete Abgangsgruppe ist, in Gegenwart eines Übergangsmetallkatalysators, gefolgt von der Entfernung der Aminoschutzgruppe R^p.
Die Abgangsgruppe L³ ist geeigneterweise ein Halogenatom, z.B. Brom.
Ein geeigneter Übergangsmetallkatalysator zur Verwendung bei der Reaktion zwischen den Verbindungen VIII und IX umfasst Dichlorbis(triphenylphosphin)palladium(II) oder Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0).
Die Reaktion zwischen den Verbindungen VIII und IX erfolgt zweckmäßigerweise in einem inerten Lösungsmittel, wie z.B. N,N-Dimethylformamid, typischerweise bei einer erhöhten Temperatur.
Das Zwischenprodukt der Formel VIII kann durch Umsetzung einer Verbindung der wie oben definierten Formel IV mit einer Verbindung der Formel X:
wobei L¹ und L³ wie oben definiert sind, unter Bedingungen, die analog zu den oben für die Reaktion zwischen den Verbindungen III und IV beschriebenen Bedingungen sind.
Die Zwischenprodukte der obigen Formel III können durch die in WO 98/04559 und WO 00/47582 beschriebenen Verfahren oder durch Verfahren analog dazu hergestellt werden.
Typische Zwischenprodukte der obigen Formeln IV, VI, VII und X können wie in WO 98/04559 oder durch Verfahren analog dazu hergestellt werden.
Wenn sie nicht im Handel erhältlich sind, können die Ausgangsmaterialien der Formel IX durch im Stand der Technik gut bekannte Standardverfahren hergestellt werden.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Herstellung von Verbindungen gemäß der Erfindung.
Die Verbindungen gemäß dieser Erfindung inhibieren wirksam die Bindung von [³H]-Flumazenil an die Benzodiazepin-Bindungsstelle von menschlichen GABA_A-Rezeptoren, die die α2- oder α3-Untereinheit enthalten, die stabil in LtK^–-Zellen exprimiert ist.
Reagenzien

• Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS).
• Assay-Puffer: 10 mM KH₂PO₄, 100 mM KCl, pH 7,4 bei Raumtemperatur.
• [³H]-Flumazenil (18 nM für α1β3γ2-Zellen; 18 nM für α2β3γ2-Zellen; 10 nM für α3β3γ2-Zellen) in Assay-Puffer.
• Flunitrazepam 100 μM in Assay-Puffer.
• Zellen, die in Assay-Puffer resuspendiert sind (1 Schale auf 10 ml).

Ernten von Zellen
Der Überstand wird von den Zellen entfernt. PBS (etwa 20 ml) wird zugegeben. Die Zellen werden abgeschabt und in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen gegeben. Der Vorgang wird mit weiteren 10 ml PBS wiederholt, um sicherzustellen, dass der Großteil der Zeilen entfernt wurde. Die Zellen werden durch 20minütiges Zentrifugieren bei 3000 U/Minute in einer Labor-Zentrifuge pelletiert und, falls erwünscht, anschließend eingefroren. Die Pellets werden in 10 ml Puffer pro Schale (25 cm × 25 cm) Zellen resuspendiert.
Assay
Kann in Platten mit 96 Vertiefungen oder in Röhrchen durchgeführt werden.
Jedes Röhrchen enthält:

• 300 μl Assay-Puffer.
• 50 μl [³H]-Flumazenil (Endkonzentration für α1β3γ2: 1,8 nM; für α2β3γ2: 1,8 nM; für α3β3γ2: 1,0 nM).
• 50 μl Puffer oder Lösungsmittelträger (z.B. 10% DMSO), wenn die Verbindungen in 10% DMSO (gesamt) gelöst werden; Testverbindung oder Flunitrazepam (um die nichtspezifische Bindung zu ermitteln), 10 μM Endkonzentration.
• 100 μl Zellen.

Die Assays werden 1 Stunde bei 40°C inkubiert, dann auf GF/B-Filtern filtriert, wobei entweder ein Tomtec- oder ein Brandel-Zellernter verwendet wird, gefolgt von Waschen mit 3 × 3 ml eiskaltem Assay-Puffer. Die Filter werden getrocknet und durch Flüssigszintillationszählung gezählt. Die erwarteten Werte für die Gesamtbindung sind 3000–4000 dpm für alle Zählungen und weniger als 200 dpm für die nichtspezifische Bindung, wenn die Flüssigszintillationszählung verwendet wird, oder 1500–2000 dpm für alle Zählungen und weniger als 200 dpm für die nichtspezifische Bindung, wenn mit einem Meltilex-Festszintillationszähler gezählt wird. Die Bindungsparameter werden durch nichtlineare Kleinste-Quadrate-Regressionsanalyse ermittelt, woraus die Inhibierungskonstante K_i für jede Testverbindung berechnet werden kann.
Die Verbindung der begleitenden Beispiele wurden in dem obigen Assay getestet, und es wurde gefunden, dass sie einen K_i-Wert für die Verdrängung von [³H]-Flumazenil aus der α2- und/oder α3-Untereinheit des menschlichen GABA_A-Rezeptors von weniger als 1 nM besitzt.
BEISPIEL 1
7-tert.-Butyl-3-(2-fluorphenyl)-6-(2H-[1,2,4]triazol-3-ylmethoxy)-[1,2,4]triazolo[4,3-b]pyridazin
a) 7-tert.-Butyl-3-(2-fluorphenyl)-6-[2-(2-(trimethylsilanyl)ethoxymethyl)-2H-[1,2,4]triazol-3-ylmethoxy]-[1,2,4]triazol[4,3-b]pyridazin
Zu einer Lösung von [2-(2-(Trimethylsilanyl)ethoxymethyl)-2H-[1,2,4]triazol-3-yl]methanol (180 mg, 0,79 mM, WO 98/04559) und 7-tert.-Butyl-6-chlor-3-(2-fluorphenyl)-[1,2,4]triazolo[4,3-b]pyridazin (200 mg, 0,66 mM, WO 00/47582) in N,N-Dimethylformamid (15 ml) wurde eine Lösung von Lithiumhexamethyldisilazid (0,72 ml einer 1 mM Lösung in Tetrahydrofuran) zugegeben und die Reaktionsmischung 1 Stunde gerührt. Wasser wurde zugegeben, bis die Lösung trüb wurde, und nach 30 Minuten wurde ein Feststoff durch Filtration gesammelt. Der Feststoff wurde mit Wasser gewaschen, in Dichlormethan gelöst und getrocknet (MgSO₄), filtriert und eingedampft, um das erwünschte Produkt zu ergeben (250 mg). ¹H-NMR (360 MHz, CDCl₃) δ 0,01 (9H, s), 0,86 (2H, t, J 7,3 Hz), 1,47 (9H, s), 3,57 (2H, t, J 7,3 Hz), 5,43 (2H, s), 5,61 (2H, s), 7,29–7,41 (2H, m), 7,61 (1H, m), 7,86 (1H, t, J 1,8 Hz), 7,96 (1H, s), 8,02 (1H, s); MS (ES⁺) m/e 498 [MH]⁺. Anal. Gefunden C, 57,80; H, 6,49; N, 19,49. C₂₄H₃₂FN₇O₂Si erfordert C, 57,92; H, 6,48; N, 19,70%.
b) 7-tert.-Butyl-3-(2-fluorphenyl)-6-(2H-[1,2,4]triazol-3-ylmethoxy)-[1,2,4]triazolo[4,3-b]pyridazin
Zu einer Lösung von 7-tert.-Butyl-3-(2-fluorphenyl)-6-[2-(2-(trimethylsilanyl)ethoxymethyl)-2H-[1,2,4]triazol-3-ylmethoxy]-[1,2,4]triazolo[4,3-b]pyridazin (200 mg, 0,40 mM) in Ethanol (5 ml) wurde Salzsäure (1 ml, 2 mM) zugegeben und die Reaktionsmischung 5 Stunden auf 60°C erwärmt. Nach dem Abkühlen wurde langsam festes Kaliumcarbonat zugegeben, bis der pH-Wert der Lösung 10 betrug. Man ließ die Lösung 18 Stunden stehen und sammelte das Produkt durch Filtration. Das Produkt wurde mit Wasser gewaschen und aus einer Mischung aus Dichlormethan und Ethylacetat umkristallisiert, um das erwünschte Produkt zu ergeben (82 mg). ¹H-NMR (360 MHz, DMSO) δ 1,39 (9H, s), 5,42 (2H, s), 7,41–7,50 (2H, m), 7,63–7,67 (1H, m), 7,98 (1H, m), 8,10 (1H, s), 8,60 (1H, s), 14,05 (1H, br. s); MS (ES⁺) m/e 368 [MH]⁺. Anal. Gefunden C, 57,74; H, 4,97; N, 26,03. C₁₈H₁₈FN₇O·0,5H₂O erfordert C, 57,44; H, 5,09; N, 26,05%.

Claims

Die Verbindung 7-tert.-Butyl-3-(2-fluorphenyl)-6-(2H-[1,2,4)triazol-3-yl-methoxy)-[1,2,4]triazolo[4,3-b]pyridazin der Formel I:
oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
Eine Verbindung gemäß Anspruch 1 in isolierter Form.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Verbindung gemäß Anspruch 1 in Verbindung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger enthält.
Eine Verbindung gemäß Anspruch 1 zur Verwendung in der Medizin.
Die Verwendung einer Verbindung gemäß Anspruch 1 bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Prävention von Angst.
Die Verwendung einer Verbindung gemäß Anspruch 1 bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Prävention von Konvulsionen.
Ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung gemäß Anspruch 1, das die Umsetzung einer Verbindung der Formel III mit einer Verbindung der Formel IV:
wobei L¹ eine geeignete Abgangsgruppe bedeutet und R^p eine Aminoschutzgruppe bedeutet, gefolgt von der Entfernung der Aminoschutzgruppe R^p, umfaßt.