DE60128104T2

DE60128104T2 - Ein putativer humaner zyklische-Nukleotid abhängiger Ionenkanal

Info

Publication number: DE60128104T2
Application number: DE60128104T
Authority: DE
Inventors: Christopher D. Garner CREECH; Timothy James Durham JEGLA
Original assignee: Icagen Inc
Current assignee: Icagen Inc
Priority date: 2000-08-17
Filing date: 2001-08-13
Publication date: 2008-01-03
Anticipated expiration: 2021-08-14
Also published as: US20060240465A1; US7514208B2; WO2002014467A8; US6933147B2; US20020182691A1; WO2002014467A9; EP1309626A2; WO2002014467A2; AU8488401A; US7053183B2; EP1309626B1; US20050233371A1; CA2418848C; US20080145943A1; WO2002014467A3; JP2004528004A; CA2418848A1; DE60128104D1; ATE360646T1

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung stellt isolierte Nukleinsäure- und Aminosäuresequenzen von CNG2B, Antikörper gegen CNG2B, Verfahren zum Detektieren von CNG2B und Verfahren zum Screenen von Modulatoren von durch zyklische Nukleotide gesteuerten Kationenkanälen unter Verwendung von biologisch aktivem CNG2B bereit. Die Erfindung stellt ferner, in einem Computersystem, ein Verfahren zum Screenen nach Mutationen von humanen CNG2B Genen bereit wie auch ein Verfahren zum Identifizieren einer dreidimensionalen Struktur von humanen CNG2B-Polypeptiden bereit.
Hintergrund der Erfindung
Durch zyklische Nukleotide gesteuerte Kanäle (CNG) sind eine Klasse von nicht selektiven Kationenkanälen, die durch direkte Bindung von zyklischen Nukleotiden, wie cGMP und cAMP, geöffnet werden. CNG-Kanäle sind für Na+ und Ca²⁺ hoch durchlässig und ihre Aktivierung führt zur Depolarisierung und zu Erhöhungen der internen Ca²⁺ Konzentrationen. Diese Kanäle können Änderungen der zytoplasmatischen zyklischen Nukleotid-Niveaus mit Änderungen der zellulären Erregbarkeit, der Sekretion von Neurotransmittern und der Stimulierung von Kalzium-abhängigen Wegen in Verbindung setzen.
Kanalproteine der CNG-Familie sind Multimere und können durch wenigstens zwei funktional unterschiedliche Klassen von Untereinheiten gebildet werden. Die zwei Klassen von Untereinheiten, Alpha und Beta, teilen ein gemeinsames Motiv aus 6 Transmembrandomänen, einem Porenmotiv und einer zytoplasmatischen zyklischen Nukleotid-Bindungsdomäne (Finn et al., Annu. Rev. Physiol. 58: 395-426: 1996). CNG Alpha-Untereinheiten können funktionale Kanäle als Homomultimere bilden, d.h. alle Untereinheiten, die zu der Kanalpore beitragen, sind identisch. Beta-Untereinheiten können im Gegensatz dazu nur funktionale Kanäle bilden, wenn sie mit einer Alpha-Untereinheit exprimiert werden. Diese heteromultimeren Kanäle zeigen funktionale Eigenschaften, die konsistent sind mit nativen CNG-Kanälen (Gerstner, et al., J Neurosci. 20 (4): 1324-1332, 2000; Finn, et al., Annu. Rev. Physio. 58: 395-426, 1996). Zum Beispiel tritt Koexpression von Alpha- und Beta-Untereinheiten in retinalen Stäbchenzellen auf, wobei die Alpha-Untereinheit CNGA1 einen Heteromultimer mit der Beta-Untereinheit CNGB1 (CNG4) bildet (Gerstner, et al., J Neurosci. 20 (4): 1324-1332, Feb. 15, 2000).
CNG-Kanäle sind für die sensorische Signaltransduktion in retinalen und Geruchs- und Geschmacksknospenzellen in Reaktion auf primäre sensorische Reize wie Licht und aerosolische oder aufgelöste Moleküle wichtig (Ding, C, et al., Am. J. Physiol. 272 (Cell Physiol. 41): C1335- C1344, 1997). In Photorezeptorzellen sind die CNG-Kanäle in Dunkelheit wegen der hohen Grundkonzentration von cGMP offen. Dies verursacht eine tonische Depolarisierung der Membran und eine konstitutive Neurotransmitterfreisetzung. Nach Stimulierung durch Licht fallen die cGMP-Niveaus, was die CNG-Kanäle schließt. Dies wiederum verursacht eine Hyperpolarisierung der Membran, einen Abfall der internen Ca²⁺ Konzentration, und eine Reduzierung der Freisetzung von Neurotransmittern (Finn, et al., Annu. Rev. Physiol. 58: 395-426, 1996).
CNG-Kanäle wurden in einer Anzahl von Geweben gefunden, was nahe legt, dass diese Kanäle eine Vielzahl von Reizen mit einer Änderung des Membranpotentials und des zytoplasmatischen Kalziumniveaus verbinden (Ding, et al., Am. J. Physiol. 272 (Cell Physiol. 41): C1335-C1344, 1997; Kingston P, Synapse 32: 1-12, 1999). Zum Beispiel werden retinale und Geruchs-CNG-Kanäle in zahlreichen Teilen des Gehirns exprimiert (Ding, et al., Am. J. Physio. 272 (Cell Physiol. 41): C1335-C1344, 1997; Kingston P, Synapse 32: 1-12, 1999). Da diese Kanäle für Ca²⁺ hoch durchlässig sind, können sie Ca²⁺ abhängige Wege stimulieren, die signifikante Effekte auf die neuronale Aktivität besitzen. Direkter, können sie zu der neuronalen Aktivität durch das Bereitstellen von exzitatorischen Depolarisierungen beitragen. CNG-Kanäle können auch mit anderen zweiten Botensystemen wie dem Stickoxidweg interagieren, um die länger anhaltenden Änderungen bereitzustellen, die bei dem Lernen und dem Gedächtnis wichtige Mechanismen sind (Kingston, Synapse 32: 1-12, 1999). CNG-Kanäle wurden in den Testis gefunden und können durch die Regulierung der internen Ca²⁺ Konzentration in der Chemotaxis des Spermiums involviert sein (Weyand, et al., Nature 368: 859-863, 1994). Expression von CNG-Kanälen wurde in auch im Herzen, der Aorta und Niere festgestellt, in denen sie eine Rolle in der Regulierung der Herzschlagzahl, des Blutdrucks bzw. des Elektrolytentransports spielen können (Finn et al., Ann. Rev. Physio. 1996,58: 395-426). Der volle Umfang der CNG-Kanalfunktion wird noch nicht vollständig verstanden, aber es ist klar, dass sie eine Schlüsselrolle in vielen physiologischen Prozessen spielen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt die erste Isolierung und Charakterisierung von humanem CNG2B bereit, einer neuen Untereinheit eines durch zyklische Nukleotide gesteuerten Kanals. Die vorliegende Erfindung stellt sowohl die Nukleotid- als auch die Aminosäuresequenz von CNG2B zur Verfügung, wie auch Verfahren zum Testen auf Modulatoren von CNG2B und Verfahren zum Detektieren von CNG2B Nukleinsäuren und Proteinen.
In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine isolierte Nukleinsäure, die für ein Polypeptid kodiert, bereit, das eine Untereinheit eines Kationenkanals umfasst, wobei das Polypeptid: (i) mit wenigstens einer CNG Alpha-Untereinheit einen Kationenkanal bildet, der die Eigenschaft des Steuerns durch zyklische Nukleotide oder Stickoxid besitzt; und (ii) eine Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1 umfasst.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine isolierte Nukleinsäure bereit, die für ein CNG26-Polypeptid kodiert, wobei die Nukleinsäure eine Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 3 umfasst.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine isolierte Nukleinsäure bereit, die für ein CNG2B-Polypeptid kodiert, wobei die Nukleinsäure eine Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 3 umfasst.
In einer Ausführungsform kodiert die Nukleinsäure für ein Polypeptid, das die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1 umfasst. In einer anderen Ausführungsform umfasst die Nukleinsäure ein Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 3.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren bereit zum Detektieren einer Nukleinsäure, wobei das Verfahren das in Kontakt bringen der Nukleinsäure mit einer isolierten Nukleinsäure, wie oben beschrieben, umfasst.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Expressionsvektoren bereit, die Nukleinsäuren der Erfindung umfassen, und Wirtszellen, die solche Expressionsvektoren umfassen.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein isoliertes Polypeptid bereit, das eine Untereinheit eines Kationenkanals umfasst, wobei das Polypeptid: (i) mit wenigstens einer CNG Alpha-Untereinheit einen Kationenkanal bildet, der die Eigenschaft besitzt, sich durch zyklische Nukleotide steuern zu lassen; und (ii) eine Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1 umfasst.
Das Polypeptid bindet spezifisch an Antikörper, die gegen ein Polypeptid erzeugt wurden, das eine Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1 umfasst. In einer anderen Ausführungsform umfasst das Polypeptid eine Alpha-Untereinheit eines homomeren, durch zyklische Nukleotide gesteuerten Kationenkanals. In einer anderen Ausführungsform umfasst das Polypeptid eine Alpha-Untereinheit eines heteromeren, durch zyklische Nukleotide gesteuerten Kationenkanals. In einer anderen Ausführungsform besitzt das Polypeptid ein Molekulargewicht von zwischen ungefähr 61 kD bis ungefähr 71 kD. In einer anderen Ausführungsform besitzt das Polypeptid eine Aminosäuresequenz von humanem CNG2B. In einer anderen Ausführungsform besitzt das Polypeptid eine Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren bereit zum Identifizieren einer Verbindung, die den Ionenfluss durch einen Kationenkanal steigert oder vermindert, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (i) In-Kontakt-Bringen der Verbindung mit dem CNG2B-Polypeptid, wobei das Polypeptid (a) mit wenigstens einer CNG Alpha-Untereinheit einen Kationenkanal bildet, der die Eigenschaft besitzt, sich durch zyklische Nukleotide steuern zu lassen und (b) eine Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1 umfasst; und (ii) Bestimmen der funktionellen Wirkung der Verbindung auf den Kationenkanal.
In einer Ausführungsform ist der funktionale Effekt ein physikalischer Effekt oder ein chemischer Effekt. In einer Ausführungsform ist das Polypeptid rekombinant. In einer anderen Ausführungsform wird die funktionelle Wirkung durch Messung der Ligandenbindung an den Kanal bestimmt. In einer anderen Ausführungsform ist der Kationenkanal homomultimer. In einer anderen Ausführungsform ist der Kationenkanal heteromultimer.
In einer Ausführungsform wird das Polypeptid in einer eukaryotischen Wirtszelle oder Zellmembran exprimiert. In einer anderen Ausführungsform wird der funktionale Effekt durch Messung des Ionenflusses, Veränderungen der Ionenkonzentrationen, Veränderungen des Stroms oder Veränderungen der Spannung bestimmt.
In einer Ausführungsform ist die Aminosäuresequenz von einem Volllängen-CNG2B-Polypeptid. In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Detektieren des Vorliegens von CNG2B in humanem Gewebe bereit, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (i) Isolieren einer biologischen Probe; (ii) in Kontakt bringen der biologischen Probe mit einem CNG2B spezifischem Reagenz, das selektiv mit CNG2B assoziiert; und (iii) Detektieren des Niveaus von CNG2B spezifischem Reagenz, das selektiv mit der Probe assoziiert.
In einer Ausführungsform wird das CNG2B spezifische Reagenz aus der Gruppe ausgewählt bestehend aus: CNG2B spezifischen Antikörpern, CNG2B spezifischen Oligonukleotidprimern und CNG2B-Nukleinsäuresonden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1. Aminosäure-Anlagerung von CNG2B (SEQ ID NO: 1) mit Ratten OCNC2 (SEQ ID NO: 16). Identische Reste sind schattiert und Zahlen an dem linken Rand zeigen die Aminosäureposition an.
2. Vollständige CNG2B Sequenz, die aus einer Zusammensetzung von PCR Fragmenten abgeleitet wurde (SEQ ID NO: 2).
3. Vollständige CNG2B kodierende Nukleotidsequenz (SEQ ID NO: 3).
4. Vollständige CNG2B Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 1).
Eingehende Beschreibung der Erfindung
I. Einführung
Die vorliegende Erfindung stellt zum ersten Mal Nukleinsäuren bereit, die CNG2B kodieren, ein Mitglied der CNG-Familie von durch zyklische Nukleotide gesteuerten Kationenkanälen. Mitglieder dieser Familie sind Polypeptiduntereinheiten von Kationenkanälen mit sechs Transmembranregionen, einem Porenmotiv und einer zytoplasmatischen Bindungsdomäne für zyklische Nukleotide. CNG2B ist dem Ratten OCNC2 am ähnlichsten, das, ohne an eine bestimmte Theorie gebunden zu sein, Eigenschaften sowohl von Alpha- als auch Beta-Untereinheiten besitzt. Da CNG2B in dem zentralen Nervensystem exprimiert wird, können Modulatoren der CNG2B identifiziert werden, die bei der Behandlung jeglicher einer großen Anzahl von neurologischen Störungen nützlich sein würden.
Die Erfindung stellt daher Verfahren zum Screenen nach Aktivatoren und Inhibitoren von Kationenkanälen bereit, die eine CNG2B-Untereinheit enthalten. Solche Modulatoren von Kationenkanalaktivität sind nützlich bei der Behandlung von Störungen einschließlich neurologischer Störungen.
Weiterhin stellt die Erfindung Assays für CNG Aktivität bereit, in denen CNG2B als ein direktes oder indirektes Reportermolekül funktioniert. Solche Verwendungen von CNG2B als ein Reportermolekül in Assay- und Detektionssystemen besitzen breite Anwendungen, z.B. kann CNG2B als ein Reportermolekül verwendet werden, um Änderungen der Kationenkonzentration, des Membranpotentials, Stromflusses, Ionenflusses, der Transkription, Signaltransduktion, von Rezeptor-Liganden-Interaktionen, Zweitbotenkonzentrationen, in vitro, in vivo und ex vivo zu messen. In einer Ausführungsform kann CNG2B als ein Indikator des Stromflusses in eine bestimmte Richtung (z.B nach außen oder innen gerichteter Kationenfluss) verwendet werden, und in einer anderen Ausführungsform kann CNG2B als ein indirekter Reporter über die Anheftung an ein zweites Reportermolekül, wie „green fluorescent protein", verwendet werden.
Die Erfindung stellt auch Verfahren zum Detektieren von CNG2B Nukleinsäure- und Proteinexpression bereit, die die Untersuchung der Kanaldiversität erlauben, die durch die CNG2B Familienmitglieder bereitgestellt wird, wie auch die Diagnose von Störungen einschließlich neurologischer Störungen.
Schließlich stellt die Erfindung ein Verfahren zum Screenen nach Mutationen von CNG2B Genen oder Proteinen bereit. Die Erfindung schließt ein, aber ist nicht eingegrenzt auf Verfahren zum Screenen nach Mutationen in CNG2B unter der Verwendung eines Computers. In ähnlicher Weise stellt die Erfindung Verfahren zum Identifizieren der dreidimensionalen Struktur von CNG2B-Polypeptiden bereit, wie auch die resultierenden Computer lesbaren Bilder oder Daten, die die dreidimensionale Struktur von CNG26-Polypeptiden umfassen. Andere Verfahren zum Screenen nach Mutationen von CNG2B Genen oder Proteinen schließen hochdichte Oligonukleotid-Arrays, PCR, Immunoassays und ähnliche ein.
Funktional sind CNG26-Polypeptide Untereinheiten, z.B. Alpha-Untereinheiten von durch zyklische Nukleotide gesteuerten Kationenkanälen. CNG2B enthaltende Kanäle sind entweder homomultimer oder heteromultimer. Heteromultimere CNG2B enthaltende Kanäle können zusätzlich zu den CNG2B Untereinheiten eine oder mehr CNG Alpha- oder Beta-Untereinheiten enthalten. Die Präsenz von CNG2B in einem Kationenkanal kann die Aktivität des heteromeren Kanals modulieren und somit die Kanaldiversität erhöhen. Die Kanaldiversität wird auch durch alternativ gespleißte Formen von CNG2B Genen erhöht. CNG2B Nukleinsäuren wurden aus cDNAs aus dem humanen Zentralnervensystem isoliert.
Strukturell kodiert die Nukleotidsequenz des humanen CNG2B (SEQ ID NOS: 2-3) für ein Polypeptidmonomer mit einem vorausgesagten Molekulargewicht von ungefähr 66 kD und einem vorausgesagten Molekulargewichtsbereich von 61-71 kD. CNG2B-Polypeptide enthalten typischerweise jedes der Motive, die für Alpha- und Beta-Untereinheiten üblich sind, einschließlich sechs Transmembrandomänen, einem Porenmotiv und einer zytoplasmatischen Bindungsdomäne für zyklische Nukleotide (Finn et al. Ann. Rev. Physio. 58: 395-426: 1996). Verwandte CNG2B Gene aus anderen Spezies besitzen wenigstens ungefähr 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% oder vorzugsweise 95% bis 100% Aminosäureidentität mit dem CNG2B, das als SEQ ID NO: 1 gezeigt wird.
Die vorliegende Erfindung stellt auch polymorphe Varianten des humanen CNG1B bereit, das in SEQ ID NO: 1 abgebildet ist: Variante #1, in der ein Isoleucinrest für den Valinrest an Aminosäureposition 110 ersetzt ist; Variante #2, in der ein Glycinrest für den Serinrest an Aminosäureposition 520 ersetzt ist; Variante #3, in der ein Lysinrest für den Argininrest an Aminosäureposition 537 ersetzt ist; und Variante #4, in der ein Glutaminsäurerest für den Asparaginsäurerest an Aminosäureposition 550 ersetzt ist.
Die CNG2B Nukleotid- und Aminosäuresequenz kann verwendet werden, um CNG2B polymorphe Varianten, Interspezies-Homologe und Allele zu identifizieren. Die Identifizierung kann in vitro gemacht werden, z.B. unter stringenten Hybridisierungsbedingunen und Sequenzierung oder durch Verwendung der Sequenzinformation in einem Computersystem zum Vergleich mit anderen Nukleotidsequenzen, oder unter Verwendung von Antikörpern, die gegen CNG2B entwickelt wurden. Typischerweise wird die Identifikation von CNG2B polymorphen Varianten, Orthologen und Allelen durch Vergleichen der Aminosäuresequenz (oder der Nukleinsäure, die die Aminosäuresequenz kodiert) SEQ ID NO:1 gemacht. Aminosäureidentität von ungefähr wenigstens 60% oder darüber, 70%, 65%, 75%, 80%, vorzugsweise 85%, am bevorzugtesten 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% demonstriert typischerweise, dass ein Protein eine CNG2B polymorphe Variante, ein Interspezies-Homolog oder Allel ist. Sequenzvergleich wird typischerweise mit dem BLAST oder BLAST 2.0 Algorithmus mit Standardparametern, die unten diskutiert werden, durchgeführt.
CNG26 polymorphe Varianten, Interspezies-Homologe und Allele können durch Exprimieren oder Co-Exprimieren des vermuteten CNG2B-Polypeptidmonomers bestätigt werden und durch Untersuchung, ob es einen Kationenkanal mit den funktionalen und biochemischen Eigenschaften der CNG Familien bildet. Dieser Assay wird verwendet, um zu demonstrieren, dass ein Protein mit ungefähr 60% oder darüber, 65%, 70%, 75%, 80%, vorzugsweise 85%, 90%, oder 95% oder größerer Aminosäureidentität mit CNG2B die gleichen funktionalen Eigenschaften wie CNG2B besitzt und daher eine Spezies von CNG2B ist. Typischerweise wird humanes CNG2B mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1 als eine positive Kontrolle gegenüber dem möglichen CNG2B Protein verwendet, um die Identifizierung einer CNG2B polymorphen Variante, Ortholog, konservativ modifizierten Variante, Mutante oder Allel zu belegen.
CNG2B-Nukleotid und Amionsäuresequenzinformation kann auch verwendet werden, um Modelle von durch zyklische Nukleotide gesteuerten Kationenkanälen in einem Computersystem zu konstruieren. Diese Modelle werden dann verwendet, um Verbindungen zu identifizieren, die durch zyklische Nukleotide gesteuerten Kationenkanälen, die CNG2B-Polypeptide umfassen, aktivieren oder inhibieren können. Solche Verbindungen, die die Aktivität von Kanälen, die CNG2B-Polypeptide umfassen, können verwendet werden, um die Rolle von CNG2B-Polypeptiden bei der Modulation von Kanalaktivität und bei der Kanaldiversität zu untersuchen.
Die Isolierung von biologisch aktivem CNG2B stellt zum ersten Mal ein Mittel bereit, um Tests auf Inhibitoren und Aktivatoren von durch zyklische Nukleotide gesteuerten Kationenkanälen durchzuführen, die CNG2B Untereinheiten umfassen. Biologisch aktive CNG26-Polypeptide sind nützlich für das Testen von Inhibitoren und Aktivatoren von durch zyklische Nukleotide gesteuerten Kationenkanälen, die CNG2B Untereinheiten umfassen, mit in vivo und in vitro Expression, die z.B. Änderungen der Spannung oder des Stroms messen. Solche Aktivatoren und Inhibitoren, die mit einem Kationenkanal identifiziert wurden, der wenigstens eine CNG2B Untereinheit, optional bis zu vier CNG2B Untereinheiten, umfasst, können verwendet werden, um weiter die Steuerung durch zyklische Nukleotide, Kanalkinetiken und Leitungseigenschaften von Kationenkanälen zu studieren. Solche Aktivatoren und Inhibitoren sind nützlich als pharmazeutische Agenzien zum Behandeln von Krankheiten, die abnormalen Ionenfluss involvieren, z.B. Störungen, einschließlich neurologischer Störungen, wie oben beschrieben.
Verfahren zum Detektieren von CNG2B Nukleinsäuren und Polypeptiden und von Expression der Kanäle, die CNG2B-Polypeptide umfassen, sind auch nützlich für diagnostische Anwendungen für Krankheiten, die abnormalen Ionenfluss, z.B. wie oben beschrieben, involvieren. Zum Beispiel kann die Chromosomenlokalisierung des Gens, das für humanes CNG2B kodiert, verwendet werden, um Krankheiten zu identifizieren, die durch CNG2B verursacht sind und mit CNG2B assoziiert sind. Verfahren zum Detektieren von CNG2B sind auch nützlich zur Untersuchung der Rolle von CNG2B bei der Kanaldiversität und Modulation der Kanalaktivität.
II. Definitionen
Wie hier verwendet, haben die folgenden Begriffe die Bedeutungen, die ihnen zugeordnet werden, falls nicht anders spezifiziert wurde.
"CNG2B" bezieht sich auf ein Polypeptid, das eine Untereinheit oder ein Monomer eines durch zyklische Nukleotide gesteuerten Kationenkanals und ein Mitglied der CNG-Familie ist. Wenn CNG2B Teil eines Kationenkanals ist, z.B. ein homomultimerer oder heteromultimerer Kationenkanal, besitzt der Kanal die Eigenschaften des Steuerns durch zyklische Nukleotide oder des Steuerns durch Stickoxid. Der Begriff CNG2B bezieht sich daher auf CNG2B polymorphe Varianten, Allele, Mutanten und Interspezieshomologe, die: (1) eine Aminosäuresubsequenz besitzen, die mehr als ungefähr 60% Aminosäuresequenzidentität, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, vorzugsweise 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% oder höhere Aminosäuresequenzidentität mit einer CNG2B Sequenz SEQ ID NO: 1 besitzen; (2) an Antikörper binden, z.B. polyklonale Antikörper, die gegen ein Immunogen erzeugt wurden, das eine Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1 oder ein Fragment oder konservativ modifizierte Varianten davon besitzt; (3) spezifisch unter stringenten Hybridisierungsbedingungen an eine Sequenz von SEQ ID NOS: 2-3 und Fragmenten oder konservativ modifizierte Varianten davon hybridisiert; (4) eine Nukleinsäuresubsequenz besitzt, die mehr als ungefähr 90%, vorzugsweise mehr als 96%, 97%, 98%, 99% oder höhere Nukleinsäuresequenzidentität mit SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 3 besitzt; oder (5) durch Primer amplifiziert werden, die spezifisch unter stringenten Hybridisierungsbedingungen an die gleiche Sequenz hybridisieren wie ein Primersatz, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOS: 4-13.
Der Begriff „durch zyklische Nukleotide gesteuerte" Aktivität oder „Steuern durch zyklische Nukleotide" bezieht sich auf eine Eigenschaft eines Kationenkanals, der zusammengesetzt ist aus individuellen Polypeptidmonomeren oder Untereinheiten. Im Allgemeinen sind durch zyklische Nukleotide gesteuerte Kationenkanäle eine Klasse von nicht-selektiven Kationenkanälen, die geöffnet werden durch direkte Bindung von zyklischen Nukleotiden, wie cGMP oder cAMP. CNG-Kanäle sind hoch permeabel für Na⁺ und Ca²⁺, und ihre Aktivierung führt zur Depolarisierung und Anstiegen der internen Ca²⁺-Konzentrationen. CNG-Kanäle können somit Änderungen der zytoplasmatischen zyklischen Nukleotid-Niveaus mit Änderungen der zellulären Anregbarkeit, Sekretion von Neurotransmittern und/oder Stimulierung von Kalzium-abhängigen Wegen in Verbindung setzen. CNG-Kanäle spielen eine wichtige Rolle bei der sensorischen Signaltransduktion in zahlreichen Zellen, z.B. Zellen im gesamten zentralen Nervensystem, in Reaktion auf primäre sensorische Reize, wie Licht und aerosoligen oder gelösten Molekülen. In Photorezeptorzellen sind CNG-Kanäle wegen einer hohen basalen Konzentration von cGMG in Dunkelheit offen, was eine tonische Depolarisierung der Membran und konstitutive Neurotransmitterfreisetzung verursacht. Nach Stimulierung durch Licht fallen die cGMP-Niveaus, was die CNG-Kanäle schließt und weiter eine Hyperpolarisierung der Membran, einen Abfall der internen Ca²⁺ Konzentration und einen Abfall der Neurotransmitterfreisetzung verursacht. CNG-Kanäle können auch mit Zweitbotensystemen wie dem Stickoxidweg interagieren. In einigen Fällen kann NO zyklische Nukleotide beim Steuern dieser Kanäle ersetzen (siehe z.B. Broillet, et al., Neuron 18: 951-958 (1997)).
„Homomerer Kanal" oder „homomultimerer Kanal" bezieht sich auf einen CNG-Kanal, der aus identischen Alpha-Untereinheiten zusammengesetzt ist, wobei „heteromerer Kanal" oder „heteromultimerer Kanal" sich auf einen CNG-Kanal bezieht, der aus wenigstens einer CNG-Alpha-Untereinheit, z.B. CNG2B, zusammengesetzt ist, plus wenigstens einem anderen Typ von Alpha- oder Beta-Untereinheit.
Eine "Alpha-Untereinheit" ist ein Polypeptidmonomer, der eine essentielle Untereinheit eines CNG-Kationenkanals ist, da wenigstens eine Alpha-Untereinheit benötigt wird, um einen funktionalen Kanal zu erzeugen. Alpha-Untereinheiten können einen homomultimeren Kationenkanal oder einen heteromultimeren Kanal bilden, der andere Beta-Untereinheiten oder andere heterologe Alpha-Untereinheiten umfasst. Jede bestimmte Alpha-Untereinheit kann an einer Vielzahl von Kanaltypen in einem Organismus oder in einer Zelle beteiligt sein, wobei sie, z.B., in einem Zelltyp homomultimere Kanäle bildet, in einem zweiten Zelltyp einen heteromultimeren Kanal mit einer Beta-Untereinheit bildet und in einem dritten Zelltyp einen dritten heteromultimeren Kanal mit einer heterologen Alpha-Untereinheit bildet.
Eine "Beta-Untereinheit" ist ein Polypeptid-Monomer, der eine Hilfsuntereinheit eines CNG-Kationenkanals ist, der aus Alpha-Untereinheiten zusammengesetzt ist; jedoch können Beta-Untereinheiten alleine keinen Kanal bilden (siehe z.B. U.S. Patent Nr. 5,776,734 ). Von Beta-Untereinheiten ist bekannt, dass sie, zum Beispiel, die Anzahl der Kanäle erhöhen, indem sie die Alpha-Untereinheiten dabei unterstützen, die Zelloberfläche zu erreichen, die Aktivierungskinetiken zu ändern und die Sensitivität natürlicher Liganden, die an die Kanäle binden, zu ändern. Beta-Untereinheiten können außerhalb der Porenregion sein und mit Alpha-Untereinheiten assoziiert sein, die die Porenregion umfassen. Sie können auch zu dem externen Schlund der Porenregion beitragen.
Der Begriff „funktionale Effekte" in dem Kontext von Assays zum Testen von Verbindungen, die einen Kanal beeinflussen, der ein CNG2B-Polypeptid umfasst, schließt die Bestimmung jedes Parameters ein, der indirekt oder direkt unter dem Einfluss des Kanals ist. Er schließt z.B. direkte physikalische Effekte ein, wie Ligandenbindung, und indirekte chemische oder phenotypische Effekt, z.B. Änderungen des Ionenflusses und Membranpotentials und andere physiologische Effekte, wie Anstiege oder Absenkungen der Transkription oder der Hormonfreisetzung. „Funktionale Effekte" schließen in vitro-(biochemische oder Ligandenbindungsassays mit, z.B. isoliertem Protein, Zelllysaten oder Zellmembranen ein), in vivo-(Zell- und Tierbasierte Assays) und ex vivo-Aktivitäten ein.
„Bestimmen des funktionalen Effekts" bezieht sich auf die Untersuchung des Effektes einer Verbindung, die einen direkten physikalischen Effekt auf eine CNG2B Untereinheit oder Kanal hat, der eine CNG2B Untereinheit umfasst, z.B. Ligandenbindung oder indirekte oder phenotypische Effekte auf einen Kanal, der eine CNG2B Untereinheit umfasst, z.B. Anstiege oder Absenkungen des Ionenflusses in einer Zelle oder Zellmembran. Der Ionenenfluss kann jedes Ion und Analoge davon sein, das durch einen Kanal tritt, z.B. Kalium, Rubidium. Vorzugsweise bezieht sich der Begriff auf den funktionalen Effekt der Verbindung auf die Kanäle, die CNG2B umfassen, z.B. Änderungen des Ionenflusses einschließlich Radioisotopen, Stromamplitude, Membranpotential, Stromfluss, Leitfähigkeit, Transkription, Proteinbindung, Phosphorylierung, Dephosphorylierung, Zweitbotenkonzentrationen (cAMP, cGMP, Ca²⁺, IP₃), Ligandenbindung, Änderungen der Ionenkonzentration und andere physiologische Effekte, wie Hormon- und Neurotransmitterfreisetzung, wie auch Änderungen der Spannung und Stromstärke. Solche funktionalen Effekte können durch jegliches Mittel, das den Fachleuten bekannt ist, gemessen werden, z. B. Patchclamping, spannungssensitive Farbstoffe, innensensitive Farbstoffe, Ganzzell-Stöme, Radioisotopenausfluss, induzierbare Marker und ähnliche.
„Inhibitoren", „Aktivatoren" oder „Modulatoren" von durch zyklische Nukleotide gesteuerten Kationenkanälen, die ein CNG2B-Polypeptid umfassen, beziehen sich auf inhibitorische oder aktivierende Moleküle, die mit in vitro und in vivo Assays für CNG2B Kanalfunktion identifiziert wurden. Inhibitoren sind Verbindungen, die die Aktivierung verringern, blocken, verhindern oder aufschieben, den Kanal inaktivieren, dessen Empfindlichkeit herabsetzen oder herunter regulieren. Aktivatoren sind Verbindungen, die die Aktivierung erhöhen, eröffnen, aktivieren, vereinfachen, verstärken, die Kanalaktivität in ihrer Empfindlichkeit erhöhen oder sie herauf regulieren. Solche Assays für Inhibitoren und Aktivatoren schließen ein, z.B. das Exprimieren eines CNG2B-Polypeptids in Zellen oder Zellmembranen und anschließendes Messen des Ionenflusses durch den Kanal und Bestimmen der Änderung der Polarisierung oder Ca²⁺ Konzentration (d.h. des elektrischen Potentials). Alternativ können Zellen, die endogene CNG2B Kanäle exprimieren, in solchen Assays verwendet werden. Um das Ausmaß der Inhibierung zu untersuchen wurden Proben oder Assays, die einen CNG2B Kanal umfassen, mit einem potentiellen Aktivator oder Inhibitor behandelt und mit Kontrollproben ohne den Inhibitor verglichen. Kontrollbeispiele (nicht mit Inhibitoren behandelt) wird ein relativer CNG2B Aktivitätswert von 100% zugeordnet. Inhibition von Kanälen, die CNG2B umfassen, wird erreicht, wenn der CNG2B Aktivitätswert relativ zu der Kontrolle ungefähr 90%, vorzugsweise 50%, noch bevorzugter 25-0% ist. Aktivierung von Kanälen, die CNG2B umfassen, wird erreicht, wenn der CNG2B Aktivitätswert relativ zu der Kontrolle ungefähr 110%, noch bevorzugter 150%, am meisten bevorzugt wenigstens 200-500% höher oder 1000% oder höher ist.
„Biologisch aktive" CNG2B-Polypeptide beziehen sich auf CNG2B-Polypeptide, die die Fähigkeit besitzen, einen Kationenkanal zu bilden, mit der Eigenschaft des Steuerns durch zyklische Nukleotide, der, wie hier beschrieben, getestet wurde.
Die Begriffe „isoliert", „aufgereinigt" oder „biologisch rein" beziehen sich auf Material, das im Wesentlichen oder essentiell frei von Verbindungen ist, die es normalerweise begleiten, wenn es in seinem natürlichen Zustand gefunden wird. Reinheit und Homogenität werden typischerweise mit Techniken der analytischen Chemie bestimmt, wie Polyacrylamid-Gelelektrophorese oder Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie. Ein Protein, das die vorherrschende Spezies in einer Zubereitung ist, ist im substantielle aufgereinigt. Insbesondere wird eine isolierte CNG2B Nukleinsäure von offenen Leserastern getrennt, die das CNG2B Gen flankieren und die Proteine, die nicht CNG2B sind, kodieren. Der Begriff „aufgereinigt" bedeutet, dass eine Nukleinsäure oder Protein essentiell nur eine Bande in einem elektrophoretischen Gel erzeugt. Insbesondere bedeutet es, dass die Nukleinsäure oder das Protein wenigstens 85% rein, bevorzugter wenigstens 95% rein und am bevorzugtesten wenigstens 99% rein ist.
Der Begriff „Testverbindung" oder „Wirkstoffkandidat" oder „Modulator" oder grammatikalische Äquivalente, wie hier verwendet, bezeichnet jedes Molekül, entweder natürlich vorkommend oder synthetisch, z.B. Protein, Oligopeptid (z.B. ungefähr 5 bis ungefähr 25 Aminosäuren lang), vorzugsweise ungefähr 10 bis 20 oder 12 bis 18 Aminosäuren lang, vorzugsweise 12, 15 oder 18 Aminosäuren lang, ein kleines organisches Molekül, Polysaccharid, Lipid (z.B. ein Sphingolipid), Fettsäure, Polynukleotid, Oligonukleotid, etc., das auf die Fähigkeit getestet wird, direkt oder indirekt Lymphozytenaktivierung zu modulieren. Die Testverbindung kann in der Form einer Bibliothek von Testverbindungen sein, wie einer kombinatorischen oder randomisierten Bibliothek, die einen ausreichenden Bereich an Diversität zur Verfügung stellt. Testverbindungen sind optional mit einem Fusionspartner verbunden, z.B. zielführenden Verbindungen, Rückgewinnungsverbindungen, Dimerisierungsverbindungen, stabilisierenden Verbindungen, adressierbaren Verbindungen und anderen funktionalen Einheiten. Konventionellerweise werden neue chemische Einheiten mit nützlichen Eigenschaften durch Identifizieren einer Testverbindung (genannt eine „Leit(„lead")verbindung") mit einer wünschenswerten Eigenschaft oder Aktivität, z.B. inhibierender Aktivität, durch Erzeugen von Varianten der Leitverbindung, und durch Evaluieren der Eigenschaft und Aktivität dieser Verbindungsvarianten erzeugt. Oft werden Hochdurchsatzscreeningverfahren (HTS) für solch eine Analyse verwendet.
Ein „kleines organisches Molekül" bezieht sich auf ein organisches Molekül, das entweder natürlich vorkommt oder synthetisch ist, das ein Molekulargewicht von mehr als ungefähr 50 Dalton und weniger als ungefähr 5000 Dalton, vorzugsweise weniger als ungefähr 2000 Dalton vorzugsweise zwischen ungefähr 100 bis ungefähr 1000 Dalton, noch bevorzugter zwischen ungefähr 200 bis ungefähr 500 Dalton besitzt.
„Nukleinsäure" bezieht sich auf Desoxyribonukleotide oder Ribonukleotide und Polymere davon in entweder einzel- oder doppelsträngiger Form. Der Begriff umfasst Nukleinsäuren, die bekannte Nukleotidanaloge, oder modifizierte Rückgratreste oder Verbindungen, die synthetisch sind, natürlich vorkommend und nicht natürlich vorkommend sind, enthalten, die ähnliche Bindungseigenschaften wie die Referenznukleinsäure besitzen, und die in einer Weise ähnlich der der Referenznukleotide metabolisiert werden. Beispiele solcher Analoge schließen ein, ohne Beschränkung, Phosphorothioate, Phosphoramidate, Methylphosphonate, Chiralmetyl-Phosphonate, 2-O-Methylribonukleotide, Peptidnukleinsäuren (PNAs).
Falls nicht anders angemerkt, umfasst eine bestimmte Nukleinsäuresequenz auch implizit konservativ modifizierte Varianten davon (z.B. degenierte Kodonersetzungen) und komplementäre Sequenzen, wie auch die explizit dargestellte Sequenz. Spezifisch können degenerierte Kondonersetzungen durch Erzeugen von Sequenzen erreicht werden, die in der dritten Position eines oder mehrerer ausgewählter (oder aller) Codons mit gemischten Basen und/oder Deoxyinosinresten substituiert sind (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19: 5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260: 2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8: 91-98 (1994)). Der Begriff Nukleinsäure wird austauschbar mit Gen, cDNA, mRNA, Oligonukleotid und Polynukleotid verwendet.
Eine bestimmte Nukleinsäuresequenz umfasst auch implizit „Spleißvarianten". In ähnlicher Weise umfasst ein bestimmtes Protein, das durch eine Nukleinsäure kodiert wird, implizit jedes Protein, das durch eine Spleißvariante dieser Nukleinsäure kodiert wird. „Spleißvarianten", wie der Name nahe legt, sind Produkte von alternativen Spleißungen eines Gens. Nach Transkription kann ein erstes Nukleinsäuretranskript so gespleißt werden, dass verschiedene (alternative) Nukleinsäure-Spleißprodukte verschiedene Polypeptide kodieren. Mechanismen für die Produktion von Spleißvarianten variieren, aber schließen das alternative Spleißen von Exons ein. Alternative Polypeptide, die von der der gleichen Nukleinsäure durch Durchlese-Transkription abgeleitet wurden, sind auch durch diese Erfindung umfasst. Alle Produkte einer Spleißreaktion, einschließlich der rekombinanten Formen der Spleißprodukte, sind in dieser Definition eingeschlossen.
Die Begriffe „Polypeptid", „Peptid" und „Protein" werden hier austauschbar verwendet, um sich auf einen Polymer von Aminosäureresten zu beziehen. Die Begriffe werden verwendet für Aminosäurepolymere, in denen ein oder mehr Aminosäurereste eine künstliche chemische Nachahmung einer entsprechenden natürlich vorkommenden Aminosäure sind, wie auch für natürlich vorkommende Aminosäurepolymere und nicht natürlich vorkommendes Aminosäurepolymer.
Der Begriff „Aminosäure" bezieht sich auf natürlich vorkommende und synthetische Aminosäuren, wie auch Aminosäureanaloge und Aminosäurenachahmer, die in einer Weise funktionieren, die ähnlich ist der von natürlich vorkommenden Aminosäuren. Natürlich vorkommende Aminosäuren sind diejenigen, die durch den genetischen Code kodiert werden, wie auch diejenigen Aminosäuren, die später modifiziert werden, z.B. Hydroxyprolin, γ-Carboxyglutamat und O-Phosphoserin. Aminosäureanaloge beziehen sich auf Verbindungen, die die gleiche chemische Basisstruktur haben wie eine natürlich vorkommende Aminosäure, d.h. einen Kohlenstoff, der an einen Wasserstoff, eine Carboxylgruppe, eine Aminogruppe und eine R-Gruppe gebunden ist, z.B. Homoserin, Norleucin, Methioninsulfoxid, Methioninmethylsulfonium. Solche Analoge besitzen modifizierte R-Gruppen (z.B. Norleucin) oder modifizierte Peptidrückgrate, behalten aber die gleiche chemische Basisstruktur wie eine natürlich vorkommende Aminosäure bei. Aminosäurenachahmer beziehen sich auf chemische Verbindungen, die eine Struktur besitzen, die verschieden ist von der allgemeinen chemischen Struktur einer Aminosäure, die aber in ähnlichen Weise wie eine natürliche vorkommende Aminosäure funktionierten.
Auf Aminosäuren wird hier Bezug genommen entweder durch ihre allgemein bekannten Dreibuchstabensymbole oder durch die Einbuchstabensymbole, die durch die IUPAC-IUB „Biochemical Nomenclature Commission” empfohlen werden. Nukleotide können in ähnlicher Weise mit ihren allgemein akzeptierten Einbuchstaben-Codes bezeichnet werden.
„Konservativ modifizierte Varianten" bezieht sich sowohl auf Aminosäure- als auch auf Nukleinsäuresequenzen. Bei Bezug auf bestimmte Nukleinsäuresequenzen bezeichnen konservativ modifizierte Varianten diejenigen Nukleinsäuren, die identische oder im Wesentlichen identische Aminosäuresequenzen kodieren, oder wo die Nukleinsäure nicht eine Aminosäuresequenz kodiert, im Wesentlichen identische Sequenzen. Wegen der Degeneration des genetischen Codes kodieren eine große Anzahl von funktional identischen Nukleinsäuren jedes gegebene Protein. Zum Beispiel kodieren die Codons GCA, GCC, GCG und GCU alle die Aminosäure Alanin. Somit kann an jeder Position, an der ein Alanin durch ein Codon spezifiziert wird, das Codon zu jedem der entsprechenden beschriebenen Codons geändert werden, ohne das kodierte Polypeptid zu ändern. Solche Nukleinsäurevariationen sind „stumme Variationen", die eine Spezies von konservativ modifizierten Variationen sind. Jede Nukleinsäuresequenz hierin, die ein Polypeptid kodiert, beschreibt entsprechend jede mögliche stumme Variation der Nukleinsäure. Ein Fachmann wird erkennen, dass jedes Codon in einer Nukleinsäure (außer AUG, das normalerweise das einzige Codon für Methionin ist, und TGG, das normalerweise das einzige Codon für Tryptophan ist) modifiziert werden kann, um ein funktional identisches Molekül zu ergeben. Entsprechend ist jede stumme Variation einer Nukleinsäure, die ein Polypeptid kodiert, in jeder beschriebenen Sequenz implizit enthalten.
In Hinblick auf Aminosäuresequenzen wird ein Fachmann erkennen, dass individuelle Substitutionen, Deletionen oder Additionen an einer Nukleinsäure, Peptid, Polypeptid oder Proteinsequenz, die eine einzelne Aminosäure oder einen kleinen Prozentsatz von Aminosäuren in der kodierten Sequenz ändern, hinzufügen oder deletieren, eine „konservativ modifizierte Variante" ist, in der die Änderung in der Substitution einer Aminosäure mit einer chemisch ähnlichen Aminosäure resultiert. Konservative Substitutionstabellen, die funktional ähnliche Aminosäuren bereitstellen, sind in der Technik wohl bekannt. Solche konservativ modifizierten Varianten sind zusätzlich und schließen polymorphe Varianten, Interspezieshomologe und Allele der Erfindung nicht aus.
Die folgenden acht Gruppen enthalten jede der Aminosäuren, die für einander konservative Substitutionen sind:

1) Alanin (A), Glycin (G);
2) Asparaginsäure (D), Glutaminsäure (E);
3) Asparagin (N), Glutamin (Q);
4) Arginin (R), Lysine (K);
5) Isoleucin (I), Leucin (L), Methionin (M), Valin (V);
6) Phenylalanin (F), Tyrosin (Y), Tryptophan (W);
7) Serine (S), Threonin (T); und
8) Cystein (C), Methionin (M) (siehe z.B., Creighton, Proteins (1984)).

Makromolekulare Strukturen, wie Polypeptidstrukturen, können in Begriffen für zahlreiche Organisationslevels beschrieben werden. Für eine allgemeine Diskussion dieser Organisation, siehe z.B. Alberts et al., Molecular Biology of the Cell (3te Ausgabe, 1994) und Cantor und Schimmel, Biophysical Chemistry Part I: The Conformation of Biological Macromolecules (1980). „Primärstruktur" bezeichnet die Aminosäuresequenz eines bestimmten Peptids. „Sekundärstruktur" bezeichnet lokal geordnete, dreidimensionale Strukturen innerhalb eines Polypeptids. Diese Strukturen sind gemeinhin als Domänen bekannt. Domänen sind Teile eines Polypeptids, die eine kompakte Einheit des Polypeptids bilden und sind typischerweise 15 bis 350 Aminosäuren lang. Typische Domänen werden hergestellt aus Sektionen mit geringerer Organization, wie Bereichen von β-Faltblattern und α-Helizes. „Tertiärstruktur" bezeichnet die vollständige dreidimensionale Struktur eines Polypeptidmonomers. „Quatärstruktur" bezeichnet die dreidimensionale Struktur, die durch die nicht kovalente Assoziierung von unabhängigen tertiären Einheiten gebildet wird. Anisotropische Begriffe sind auch als Energiebegriffe bekannt.
Eine „Markierung" ist eine durch spektroskopische, photochemische, biochemische, immunochemische oder chemische Mittel detektierbare Zusammensetzung. Zum Beispiel schließen nützliche Markierungen ³²P, fluoreszente Farbstoffe, elektronendichte Reagenzien, Enzyme (z.B. wie gemeinhin in einem ELISA verwendet), Biotin, Digoxigenin oder Haptene und Proteine, für die Antisera oder monoklonale Antikörper verfügbar sind (z.B. das Polypeptid SEQ ID NO: 1 kann detektierbar gemacht werden, z.B. durch Einbau einer radioaktiven Markierung in das Peptid, und verwendet werden, um Antikörper zu detektieren, die mit dem Peptid spezifisch reagieren).
Wie hier verwendet wird eine „Nukleinsäuresonde oder Oligonukleotid" als eine Nukleinsäure definiert, die in der Lage ist an eine Zielnukleinsäure mit komplementärer Sequenz durch einen oder mehrere Typen von chemischen Bindungen zu binden, gewöhnlich durch komplementäre Basenpaarung, gewöhnlich durch Wasserstoffbrückenbindungsbildung. Wie hier verwendet kann eine Sonde natürliche (d.h. A, G, C oder T) oder modifizierte Basen (7-Deazaguanosin, Inosin, etc.) einschließen. Zusätzlich können die Basen in einer Sonde durch eine Bindung verbunden werden, die nicht eine Phosphodiesterbindung ist, so lange, wie sie nicht mit der Hybridisierung interferiert. Somit können zum Beispiel Sonden Peptidnukleinsäuren sein, in der die konstituierenden Basen eher durch Peptidbindungen als durch Phosphodiesterbindungen verbunden sind. Ein Fachmann wird verstehen, dass Sonden Zielsequenzen binden können, denen eine vollständige Komplementarität in Abhängigkeit von den Hybridisierungsbedingungen mit der Sondensequenz fehlt. Die Sonden sind vorzugsweise direkt markiert, wie mit Isotopen, Chromophoren, Lumiphoren, Chromogenen oder indirekt markiert, so wie mit Biotin, an das ein Streptavidin-Komplex später binden kann. Durch Testen auf das Vorliegen oder Nicht-Vorliegen der Sonde kann man das Vorliegen oder Nicht-Vorliegen der gewählten Sequenz oder Subsequenz detektieren.
Eine „markierte Nukleinsäurensonde oder ein Oligonukleotid" ist eine solche, die entweder kovalent durch einen Linker oder eine chemische Bindung oder nicht kovalent durch ionische, van der Waals, elektrostatische oder Wasserstoffbrückenbindungen so an eine Markierung gebunden ist, dass das Vorliegen der Sonde durch Detektieren des Vorliegens der Markierung, die an die Sonde gebunden ist, detektiert werden kann.
Der Begriff „rekombinant", wenn er unter Bezug auf z.B. eine Zelle oder Nukleinsäure, ein Protein oder einen Vektor verwendet wird, zeigt an, dass die Zelle, Nukleinsäure, Protein oder Vektor durch das Einführen einer heterologen Nukleinsäure oder eines Proteins oder der Änderung einer nativen Nukleinsäure oder Protein modifiziert wurden oder dass die Zelle aus einer Zelle abgeleitet ist, die so modifiziert wurde. Somit exprimieren zum Beispiel rekombinante Zellen Gene, die nicht innerhalb der nativen (nicht rekombinanten) Form der Zelle gefunden werden oder exprimieren native Gene, die sonst abnormalerweise exprimiert, unterexprimiert oder überhaupt nicht exprimiert werden.
Ein „Promotor" wird als ein Array von Nukleinsäure-Kontrollsequenzen definiert, der die Transkription einer Nukleinsäure steuert. Wie hier verwendet, schließt ein Promotor notwendige Nukleinsäuresequenzen nahe der Startstelle der Transkription ein sowie, im Fall eines Polymerase II Typ Promotors, ein TATA Element. Ein Promotor schließt auch optional distale Enhancer- oder Repressorelemente ein, die bis zu viele tausend Basenpaare von der Startstelle des der Transkription lokalisiert sein können. Ein „konstitutiver" Promotor ist ein Promotor, der unter den meisten Umwelt- und Entwicklungsbedingungen aktiv ist. Ein „induzierbarer" Promotor ist ein Promotor, der unter Umwelt- und Entwicklungsregulierung aktiv ist. Der Begriff „funktional verbunden" bezeichnet eine funktionale Verbindung zwischen einer Nukleinsäure-Expressionskontrolsequenz (wie einem Promotor, oder einem Array von Transkriptionsfaktorbindungsstellen) und eine zweite Nukleinsäuresequenz, wobei die Expressionskontrollsequenz die Transkription der Nukleinsäure steuert, die zu der zweiten Sequenz korrespondiert.
Der Begriff „heterolog", wenn er unter Bezug auf Teile einer Nukleinsäure verwendet wird, zeigt an, dass die Nukleinsäure zwei oder mehr Subsequenzen umfasst, die nicht in der gleichen Beziehung zueinander in der Natur gefunden werden. Zum Beispiel wird die Nukleinsäure typischerweise rekombinant produziert, wobei zwei oder mehr Sequenzen von nicht verwandten Genen angeordnet sind, eine neue funktionale Nukleinsäure zu ergeben, z.B. einen Promotor aus einer Quelle und eine kodierende Region aus einer anderen Quelle. In ähnlicher Weise bedeutet ein heterologes Protein, dass das Protein zwei oder mehr Subsequenzen umfasst, die nicht in der gleichen Beziehung zu einander in der Natur gefunden werden (z.B. ein Fusionsprotein).
Ein „Expressionsvektor" ist ein Nukleinsäurekonstrukt, das rekombinant oder synthetisch erzeugt wird, mit einer Serie von spezifizierten Nukleinsäureelementen, die Transkription einer bestimmten Nukleinsäure in einer Wirtszelle erlauben. Der Expressionsvektor kann Teil eines Plasmids, Virus oder Nukleinsäurefragments sein. Typischerweise schließt der Expressionsvektor eine Nukleinsäure ein, die funktional mit einem Promotor verknüpft ist, um transkribiert zu werden. Die Begriffe „identisch" oder Prozent-„Identität" beziehen sich in dem Kontext von zwei oder mehr Nukleinsäuren oder Polypeptidsequenzen auf zwei oder mehr Sequenzen oder Subsequenzen, die die Gleichen sind oder einen bestimmten Prozentsatz von Aminosäureresten oder Nukleotiden besitzen, die die Gleichen sind (d.h. 60% Identität, 65%, 70%, 75%, 80% vorzugsweise 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder höhere Identität mit einer Aminosäuresequenz wie SEQ ID NO: 1 oder einer Nukleotidsequenz wie SEQ ID NO:2 oder SEQ ID NO: 3), wenn sie für maximale Entsprechung über ein Vergleichsfenster oder eine bestimmte Region, wie mit einem der folgenden Sequenzvergleichsalgorithmen oder durch manuelles Anlagerung und Untersuchung mit dem Auge verglichen und angelagert werden. Solche Sequenzen werden dann als „im Wesentlichen identisch" bezeichnet. Diese Definition bezieht sich auch auf das Komplement einer Testsequenz. Vorzugsweise existiert die Identität in einer Region, die wenigstens 25 Aminosäuren oder Nukleotide lang ist, oder noch bevorzugter in einer Region, die 50-100 Aminosäuren oder Nukleotide lang ist.
Für den Sequenzvergleich funktioniert typischerweise eine Sequenz als ein Referenzsequenz, mit der die Testsequenzen verglichen werden. Bei Verwendung eins Sequenzvergleichsalgorithmus werden Test- und Referenzsequenzen in einen Computer eingegeben, Subsequenzkoordinaten werden, wenn nötig, bestimmt und Sequenzalgorithmusprogramm-Parameter können bestimmt werden. Standardprogrammparameter können verwendet werden oder alternative Parameter können bestimmt werden. Der Sequenzvergleichsalgorithmus berechnet dann den Prozentsatz der Sequenzidentität der Testsequenzen bezogen auf die Referenzsequenz basierend auf den Programmparametern. Für den Sequenzvergleich von Nukleinsäuren und Proteinen mit CNG2B Nukleinsäuren und Proteinen werden die BLAST und BLAST 2.0 Algorithmen und die Standardparameter, die unten diskutiert werden, verwendet.
Ein „Vergleichsfenster", wie hier verwendet, schließt den Bezug auf ein Segment von jeder der Anzahl von zusammenhängenden Positionen ein, die aus der Gruppe bestehend aus 20 bis 600, gewöhnlich ungefähr 50 bis ungefähr 200, noch gewöhnlicher ungefähr 100 bis ungefähr 150 ausgewählt sind, in denen eine Sequenz mit einer Referenzsequenz der gleichen Anzahl von zusammenhängenden Positionen verglichen werden kann, nachdem die zwei Sequenzen optimal angelagert sind. Verfahren für das Anlagerung von Sequenzen für den Vergleich sind in der Technik gut bekannt. Optimales Anlagerung von Sequenzen für den Vergleich kann z.B. durch den lokalen Homologiealgorithmus von Smith & Watermann, Aa'v. Appl. Math. 2: 482 (1981), durch den HomologieAnlagerung-Algorithmus von Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), durch das Ähnlichkeitssucheverfahren von Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988), durch Computerimplementationen dieser Algorithmenten (GAP, BESTFIT, FASTA und TFASTA in dem Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), oder durch manuelles Anlagerung und Überprüfung mit dem Auge (siehe z.B. Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., Hrg. 1995 Annex)) durchgeführt werden. Ein bevorzugtes Beispiel eines Algorithmus, der geeignet ist zum Bestimmen des Prozentsatzes der Sequenzidentität und der Sequenzähnlichkeit sind die BLAST und BLAST 2.0 Algorithmen, die beschrieben sind in Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402 (1977) bzw. Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990). BLAST und BLAST 2.0 werden mit den hier beschriebenen Parametern verwendet, um den Prozentsatz der Sequenzidentität für die Nukleinsäuren und Proteine der Erfindung zu bestimmen. Software, um Blast Analysen durchzuführen, ist öffentlich über das „National Center for Biotechnology Information" verfügbar (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Dieser Algorithmus involviert zunächst das Identifizieren von Sequenzpaaren mit hoher Trefferquote („high scoring sequence pairs", HSPs) durch das Identifizieren von kurzen Worten der Länge W in der Suchsequenz, die entweder einen bestimmten positiven Mindestwert T treffen oder ihm genügen, wenn sie mit einem Wort der gleichen Länge in einer Datenbanksequenz angelagert sind. T wird als der Nachbarschaftswortmindestwert bezeichnet (Altschul et al., supra), Diese initialen Nachbarschaftswort-Treffer funktionieren als Ausgangspunkte für das Initiieren von Suchen, um längere HSPs, die diese enthalten, zu finden. Die Worttreffer werden in beide Richtungen entlang jeder Sequenz ausgedehnt, solange der kumulative Anlagerungstreffer erhöht werden kann. Kumulative Treffer werden für Nukleotidsequenzen mit den Parametern M (Ergebniswert für ein Paar von passenden Resten; immer >0) und N (Strafwert für ein Paar von nicht passenden Resten; immer >0) berechnet. Für Aminosäuresequenzen wird eine Treffermatrix verwendet, um den kumulativen Treffer zu berechnen. Verlängerung der Worttreffer in jede Richtung wird angehalten, wenn: der kumulative Anlagerungswert um die Menge X von seinem maximal erreichten Wert abfällt; der kumulative Wert wegen der Anhäufung eines oder mehrerer Resteanlagerung mit negativem Wert auf Null oder darunter geht; oder das Ende jeder Sequenz erreicht ist. Die BLAST Algorithmusparameter W, T und X bestimmen die Sensitivität und Geschwindigkeit der Anlagerung. Das BLASTN Programm (für Nukleotidsequenzen) verwendet als Standardwerte eine Wortlänge (W) von 11, eine Erwartung (E) von 10, M = 5, N = –4 und einen Vergleich beider Stränge. Für Aminosäuresequenzen verwendet das BLASTP Programm als Standardwerte eine Wortlänge (W) von 3, eine Erwartung (E) von 10, und die BLOSUM62 Treffermatrix (siehe Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1989)) Anlagerungen (B) von 50, eine Erwartung (E) von 10, M = 5, N = -4, und einen Vergleich beider Stränge.
Der BLAST Algorithmus führt auch eine statistische Analyse der Ähnlichkeit zwischen zwei Sequenzen durch (siehe auch Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787 (1993)).
Ein Maß für Ähnlichkeit, das durch den BLAST Algorithmus bereitgestellt wird, ist die kleinste Summenwahrscheinlichkeit (P(N)), das ein Maß für die Wahrscheinlichkeit ist, mit der ein Aufeinanderpassen zwischen zwei Nukleotid- oder Aminosäuresequenzen per Zufall sich ereignen würde. Zum Beispiel wird eine Nukleinsäure als mit einer Referenzsequenz als ähnlich angesehen, wenn der kleinste Summenwahrscheinlichkeit in einem Vergleich der Testnukleinsäure mit der Referenznukleinsäure weniger als ungefähr 0.2 ist, noch bevorzugter weniger als ungefähr 0.01, und am bevorzugtesten weniger als ungefähr 0.001.
Ein Anzeichen dafür, dass zwei Nukleinsäuresequenzen oder Polypeptide im Wesentlichen identisch sind, ist, dass das Polypeptid, das durch die erste Nukleinsäure kodiert wird, immunologisch kreuzreaktiv ist mit den Antikörpern, die gegen das Polypeptid erzeugt wurden, die durch die zweite Nukleinsäure kodiert werden, wie unten beschrieben wird. Somit ist ein Polypeptid typischerweise im Wesentlichen identisch mit einem zweiten Polypeptid, zum Beispiel wenn sich die zwei Peptide nur durch konservative Substitutionen unterscheiden. Ein anderes Anzeichen, dass zwei Nukleinsäuresequenzen im Wesentlichen identisch sind, ist dass die zwei Moleküle oder ihre Komplemente mit einander unter stringenten Bedingungen hybridisieren, wie unten beschrieben wird. Ein weiteres Anzeichen, dass zwei Nukleinsäuresequenzen im Wesentlichen identisch sind, ist dass die gleichen Primer verwendet werden können, um die Sequenz zu amplifizieren.
Der Begriff „hybridisiert selektiv (oder spezifisch) an" bezeichnet das Binden, Ausbilden einer Duplex oder Hybridisieren eines Moleküls nur an eine bestimmte Nukleinsäuresequenz unter stringenten Hybridisierungsbedingungen, wenn die Sequenz in einer komplexen Mischung vorliegt (z.B. vollständige Zell- oder Bibliotheks-DNA oder RNA).
Der Begriff „stringente Hybridisierungsbedingungen" bezeichnet die Bedingungen, unter denen eine Sonde an seine Zielsubsequenz, typischerweise in einer komplexen Mischung von Nukleinsäuren, aber nicht an andere Sequenzen hybridisieren wird. Stringenzbedingungen sind sequenzabhängig und unter verschiedenen Bedingungen verschieden sein. Längere Sequenzen hybridisieren spezifisch bei höheren Temperaturen. Eine ausführliche Anleitung für die Hybridisierung von Nukleinsäuren findet sich in Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993). Im Allgemeinen werden die stringenten Bedingungen gewählt, ungefähr 5-10°C niedriger zu sein als der thermale Schmelzpunkt (T_m) für die spezifische Sequenz an einem pH mit definierter Ionenstärke. Der T_m ist die Temperatur (bei definierter Ionenstärke, pH und Nukleinsäurekonzentration) bei dem 50% der Sonden, die mit dem Ziel komplementär sind, mit der Zielsequenz im Äqulibrium hybridisieren (wenn die Zielsequenzen im Überschuss vorhanden sind, sind am T_m 50% der Sonden im Äquilibrium besetzt). Stringente Bedingungen können auch mit der Zugabe von destabilisierenden Agenzien wie Formamid bewirkt werden. Bei selektiver oder spezifischer Hybridisierung entspricht ein positives Signal wenigstens zweimal dem Hintergrund, vorzugsweise zehnmal der Hintergrundhybridisierung. Exemplarische stringente Hybridisierungsbedingungen können wie folgt sein: 50% Formamid, 5x SSC und 1% SDS, inkubiert bei 42 °C, oder 5x SSC, 1% SDS, inkubiert bei 65 °C, mit Waschungen in 0.2x SSC, und 0.1% SDS bei 65 °C.
Nukleinsäuren, die nicht aneinander unter stringenten Bedingungen hybridisieren, sind immer noch im Wesentlichen identisch, wenn die Polypeptide, die sie kodieren im Wesentlichen identisch sind. Dies tritt auf, zum Beispiel, wenn eine Kopie einer Nukleinsäure mit der maximalen Codondegeneration erzeugt wird, die durch den genetischen Code erlaubt ist. In solchen Fällen hybridisieren die Nukleinsäuren typischerweise unter moderat stringenten Hybridisierungsbedingungen. Beispielhafte „moderat stringente Hybridisierungsbedingungen" schließen eine Hybridisierung in einem Puffer aus 40% Formamid, 1 M NaCl, 1% SDS bei 37 °C, und eine Waschung in 1X SSC bei 45 °C ein. Eine positive Hybridisierung ist wenigstens Faktor 2 über dem Hintergrund. Die Fachleute werden leicht erkennen, dass alternative Hybridisierungs- und Waschbedingungen verwendet werden können, um Bedinungen ähnlicher Stringenz bereitzustellen. Zusätzliche Leitfäden für die Bestimmung von Hybridisierungsparametern werden in zahlreichen Fundstellen bereitgestellt, z.B. in Current Protocols in Molecular Biology, Hrg. Ausubel, et al.
Für PCR ist eine Temperatur von ungefähr 36°C typisch für Niedrigstringenz-Amplifikation, obwohl die Annealingtemperaturen zwischen ungefähr 32°C und 48°C abhängig von der Primerlänge variieren können. Für Hochstringenz-PCR Amplifikationen ist eine Temperatur von ungefähr 62°C typisch, obwohl die Hochstringenz Annealingtemperaturen im Bereich zwischen ungefähr 50°C und 65°C abhängig von der Primerlänge und Spezifität sein können. Typische Zyklusbedingungen sowohl für Hoch- als auch Niedrigstringenz-Amplifikationen schließen eine Denaturierungsphase von 90°C-95°C für 30 Sek – 2 Min., eine Annealingphase, die 30 Sek. – 2 Min. dauert und eine Extensionsphase von ungefähr 72° für 1-2 Min ein. Protokolle und Leitfäden für Niedrig- und Hochstringenzamplifikationen werden z.B. bereitgestellt in Innis et al. (1990) PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc. N. Y.).
"Antikörper" bezieht sich auf ein Polypeptid, das eine Gerüstregion aus einem Immmunoglobulingen oder Fragmenten davon, die ein Antigen spezifisch binden und erkennen, umfasst. Die anerkannten Immunoglobulinregionen schließen die Kappa, Lambda, Alpha, Gamma, Delta, Epsilon und Mu konstanten Region Gene, wie auch die Myriaden von Immunoglobulin variable Region Genen ein. Leichte Ketten werden entweder als Kappa oder Lambda klassifiziert. Schwere Ketten werden als Gamma, Mu, Alpha, Gamma, Delta oder Epsilon klassifiziert, die wiederum die Immunglobulinklassen IgG, IgM, IgA, IgD bzw. IgE definieren.
Eine exemplarische strukturelle Immunglobulin (Antikörper) Einheit umfasst ein Tetramer. Jeder Tetramer ist aus zwei identischen Paaren von Polypeptidketten zusammengesetzt, jedes Paar mit einer „leichten" (ungefähr 25 kD) und einer „schweren" Kette (ungefähr 50-70 kD). Der N-Terminus jeder Kette definiert eine variable Region von ungefähr 100 bis 110 oder mehr Aminosäuren, die primär für die Antigenerkennung verantwortlich sind. Die Begriffe variable leichte Kette (V_L) und variable schwere Kette (V_H) bezieht sich auf diese leichten bzw. schweren Ketten. Es gibt Antikörper, z.B. als intakte Immunoglobuline oder als eine Vielzahl von gut charakterisierten Fragmenten, die durch Verdau mit zahlreichen Peptidasen produziert werden. Somit verdaut Pepsin zum Beispiel einen Antikörper unter den Disulfidbrücken in der Gelenkregion, um F(ab)'₂ zu produzieren, einen Dimer von Fab, der seinerseits eine leichte Kette ist, die mit V_H-C_H1 durch eine Disulfidbindung verbunden ist. Das F(ab)'₂ kann unter milden Bedingungen reduziert werden, um die Disufidbindung in der Gelenkregion zu brechen, wodurch der F(ab)'₂ Dimer in einen Fab' Monomer umgewandelt wird. Das Fab' Monomer ist im Wesentlichen Fab mit einem Teil der Gelenkregion (siehe Fundamental Immunology (Paul Hrg., 3d Ausgabe. 1993)). Während zahlreiche Antikörperfragmente durch Begriffe des Verdaus eines intakten Antikörpers definiert sind, wird ein Fachmann es zu schätzen wissen, dass solche Fragmente de novo entweder chemisch oder durch Verwendung der rekombinanten DNA Methodik synthetisiert werden können. Somit schließt der Begriff Antikörper, wie hier verwendet, auch Antikörperfragmente ein, die entweder durch die Modifikation ganzer Antikörper produziert werden, oder diejenigen ein, die de novo mit rekombinanter DNA Methodik (z.B. Einzelketten FV) synthetisiert werden oder diejenigen ein, die mit Phagendisplay Bibliotheken identifiziert werden (siehe z.B. McCafferty et al., Nature 348: 552-554 (1990)).
Zur Herstellung von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern kann jede in der Technik bekannte Technik verwendet werden (siehe, z. B., Kohler & Milstein, Nature 256: 495-497 (1975); Kozbor et al., Immunology Today 4: 72 (1983); Cole et al., S. 77-96 in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985)). Techniken für die Produktion von Einzelkettenantikörpern ( U.S. Patent 4,946,778 ) können adaptiert werden, um Antikörper gegen Polypeptide dieser Erfindung zu produzieren. Auch können transgene Mäuse oder andere Organismen, wie andere Säuger, verwendet werden, um humanisierte Antikörper zu exprimieren. Alternativ kann die Phagendisplaytechnologie verwendet werden, um Antikörper und heteromere Fab Fragmente zu identifizieren, die spezifisch an ausgewählte Antigene binden (siehe McCafferty et al., Nature 348: 552-554 (1990); Marks et al., Biotechnology 10: 779-783 (1992)). Ein „Anti-CNG2B" Antikörper ist ein Antikörper oder Antikörperfragment, der spezifisch an ein Polypeptid bindet, das durch ein CNG2B Gen, cDNA oder eine Subsequenz davon kodiert wird. Ein „chimärer Antikörper" ist ein Antikörpermolekül, in dem (a) die konstante Region, oder ein Teil davon, geändert, ersetzt oder ausgetauscht ist, so dass die Antigenbindungsstelle (variable Region) mit einer konstanten Region einer anderen oder veränderten Klasse, Effektorfunktion und/oder Spezies oder eines vollkommen verschiedenen Moleküls verbunden ist, das dem chimären Antikörper neue Eigenschaften verleiht, z.B. ein Enzym, Toxin, Hormon, Wachstumsfaktor, Wirkstoff etc.; oder (b) die variable Region oder ein Teil davon geändert, ersetzt oder durch eine variable Region ausgetauscht ist, die eine andere oder geänderte Antigenspezifität besitzt.
Der Begriff „Immunoassay" ist ein Assay, der einen Antikörper verwendet, um ein Antigen spezifisch zu binden. Der Immunoassay wird durch die Verwendung von spezifischen Bindungseigenschaften eines bestimmten Antikörpers gekennzeichnet, um das Antigen zu isolieren, anzuzielen und/oder zu quantifizieren.
Der Begriff „bindet spezifisch (oder selektiv)" an einen Antikörper oder „ist spezifisch (oder selektiv) immunoreaktiv mit", bezeichnet, wenn er sich auf ein Protein oder Peptid bezieht, eine Bindungsreaktion, die das Vorliegen des Proteins in einer heterogenen Population von Proteinen und anderen Biologica anzeigt. Somit binden unter angegebenen Immunoassay-Bedingungen die spezifischen Antikörper an ein bestimmtes Protein mit wenigstens dem zweifachen des Hintergrunds und binden nicht wesentlich in einer signifikanten Menge an andere in der Probe vorhandene Proteine. Spezifische Bindung an ein Protein unter solchen Bedingungen kann einen Antikörper notwendig machen, der für seine Spezifität für ein bestimmtes Protein selektiert ist. Zum Beispiel können polyklonale Antikörper, die gegen CNG2B erzeugt wurden, wie in SEQ ID NO: 1 gezeigt, oder Spleißvarianten oder Teile davon selektiert werden, um nur diejenigen polyklonalen Antikörper zu erhalten, die mit CNG2B und nicht anderen Proteinen spezifisch immunreaktiv sind. Diese Selektion kann durch Abziehen der Antikörper erreicht werden, die mit Molekülen kreuzreagieren, die nicht CNG Familienmitglieder sind. Zusätzlich können polyklonale Antikörper, die gegen CNG2B polymorphe Varianten, Allele, Orthologe und konservativ modifizierte Varianten erzeugt wurden, selektiert werden, um nur diejenigen Antikörper zu erhalten, die CNG2B erkennen, aber nicht andere CNG Familienmitglieder. Zusätzlich können Antikörper für humanes CNG2B, aber nicht andere CNG2B Orthologe in der gleichen Weise selektiert werden. Eine Vielzahl von Immunoassayformaten kann verwendet werden, um Antikörper zu selektieren, die mit einem bestimmten Protein spezifisch immunreaktiv sind. Zum Beispiel werden Festphasen ELISA Immunoassays routinemäßig verwendet, um Antikörper, die mit einem Protein spezifisch immunreaktiv sind zu selektieren (siehe z.B. Harlow & Lane, Antibodies, A Laborstory Manual (1988) für eine Beschreibung der Immunosassayformate und Bedingungen, die verwendet werden können, um die spezifische Immunreaktivität zu bestimmen). Typischerweise wird eine spezifische oder selektive Reaktion wenigsten zwei Mal dem Hintergrundsignal oder Rauschen entsprechen und noch typischer mehr als 10 bis 100 Mal dem Hintergrund entsprechen.
Der Begriff „selektiv assoziiert mit" bezeichnet die Fähigkeit einer Nukleinsäure mit einander „selektiv zu hybridisieren", wie oben definiert wurde, oder die Fähigkeit eines Antikörpers an ein Protein „selektiv (oder spezifisch) zu binden", wie oben definiert wurde.
Mit „Wirtszelle" wird eine Zelle gemeint, die einen Expressionsvektor enthält und die Replikation oder Expression des Expressionsvektors unterstützt. Wirtszellen können prokaryotische Zellen, wie E. coli, oder eukaryotische Zellen, wie Hefe, Insekten-, Amphibien oder Säugerzellen sein, wie CHO, HeLa und ähnliche, z.B. kultivierte Zellen, Explantate und Zellen in vivo.
„Biologische Probe", wie hierin verwendet, ist eine Probe eines biologischen Gewebes oder Flüssigkeit, die CNG2B-Polypeptide enthält oder Nukleinsäure, die ein CNG2B Protein kodiert. Solche Proben schließen Gewebe ein, das aus Menschen isoliert wurde, sind darauf aber nicht eingegrenzt. Biologische Proben können auch Schnitte aus Geweben, wie gefrorene Schnitte, die für histologische Zwecke verwendet werden, einschließen. Eine biologische Probe wird typischerweise aus einem eukaryotischen Organismus erhalten, vorzugsweise Eukaryoten wie Pilzen, Pflanzen, Insekten, Protozoen, Vögeln, Fischen, Reptilien und vorzugsweise einem Säuger, wie Ratte, Mäusen, Kuh, Hund, Meerschweinchen oder Kaninchen und am bevorzugtesten einem Primaten, wie Schimpanse oder Menschen.
III. Isolieren eines Gens, das ein CNG2B-Polypeptid kodiert
A. Allgemeine DNA Verfahren
Diese Erfindung beruht auf Routinetechniken in dem Gebiet der rekombinanten Genetik. Grundlegende Texte, die allgemeine Verfahren für die Verwendung in dieser Erfindung offenbaren, schließen Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laborstory Manual-(2te A. 1989); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laborstory Manual (1990); und Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., Hrg., 1994)) ein.
Für Nukleinsäuren sind die Größen entweder in Kilobasen (Kb) oder Rasenpaaren (bp) angegeben. Dies sind Schätzungen, die aus Agarose oder Acrylamid-Gelelektrophoresen, aus sequenzierten Nukleinsäuren oder aus veröffentlichten DNA Sequenzen abgeleitet wurden. Für Proteine sind die Größen in Kilodalton (kD) oder in der Anzahl der Aminosäurereste angegeben. Proteingrößen werden aus Gelelektropherese, aus sequenzierten Proteinen, aus abgeleiteten Aminosäuresequenzen oder aus veröffentlichten Proteinsequenzen abgeschätzt.
Oligonukleotide, die kommerziell nicht verfügbar sind, können gemäß dem Festphasen Phosphoramidit-Triester Verfahren synthetisiert werden, das zuerst beschrieben wurde von Beaucage & Caruthers, Tetrahedron Letts. 22: 1859-1862 (1981), mit einem automatisierten Synthesegerät, wie beschrieben in Van Devanter et al., Nucleic Acids Res. 12: 6159-6168 (1984). Reinigung der Oligonukleotide erfolgt entweder durch native Acrylamid-Gelelektrophorese oder durch Anionenaustauscher HPLC, wie beschrieben in Pearson & Reanier, J. Chrom. 255: 137-149 (1983).
Die Sequenz der klonierten Gene und synthetischen Oligonukleotide kann nach dem Klonieren mit z.B. dem Kettenterminationsverfahren zum Sequenzieren von doppelsträngigen Templates von Wallace et al., Gene 16: 21-26 (1981) verifiziert werden.
B. Klonierungsverfahren für die Isolierung von Nukleotidsequenzen, die CNG2B-Polypeptide kodieren
Im Allgemeinen werden die Nukleinsäuresequenzen, die CNG2B und verwandte Nukleinsäurehomologe kodieren, aus Bibliotheken mit cDNA und mit genomischer DNA kloniert oder mittels Amplifikationstechniken mit Oligonukleotidprimern isoliert. Zum Beispiel werden CNG2B Sequenzen typischerweise aus humanen Nukleinsäure (genomische oder cDNA) Bibliotheken durch Hybridisieren mit einer Nukleinsäuresonde oder einem Polynukleotid isoliert, dessen Sequenz aus SEQ ID NOS: 2-3 isoliert werden kann. Ein geeignetes Gewebe, aus dem CNG2B RNA und cDNA isoliert werden können, ist das zentrale Nervensystem (ZNS). Vorzugsweise ist das Template für die Amplifikation Erststrang-cDNA, die aus einem Teil des menschlichen ZNS hergestellt wurde.
Amplifikationstechniken mit Primern können auch verwendet werden, um CNG2B aus DNA oder RNA zu isolieren. Die folgenden Primer können auch verwendet werden, um eine Sequenz von humanem CNG2B zu amplifizieren:
Diese Primer können verwendet werden, z.B., um die Volllängensequenz oder eine Sonde von einem oder vielen hundert Nukleotiden zu amplifizieren, welche dann verwendet wird, um eine Bibliothek nach Volllängen CNG2B zu screenen. Zum Beispiel kann Oligo 1 (SEQ ID NO: 4) mit Oligo 2 (SEQ ID NO: 5) verwendet werden, um eine 657 bp Bande zu produzieren, und Oligo 9 (SEQ ID NO: 12) und Oligo 10 (SEQ ID NO: 13) können verwendet werden, um die gesamte kodierende Region zu amplifizieren. Weiterhin kann zusammen mit anderen Oligos, Oligo 9 mit Oligos 2, 6, 7 oder 8 (SEQ ID NOs: 5, 9, 10 oder 11) verwendet werden, um Banden von ungefähr 1.7 Kb, 1.28 Kb, 170 bp, oder bzw. 90 bp zu produzieren. In ähnlicher Weise kann Oligo 10 mit Oligos 1,3, oder 4 (SEQ ID NOs: 4,6 oder 7) verwendet werden, um Fragmente von ungefähr 715 bp, 455 bp, oder bzw. 240 bp zu produzieren. Nur die Nukleotide in Fettdruck in Oligos 9 und 10 werden für die CNG2B Amplifikation benötigt, und jede der obigen Produktgrößen ist eine ungefähre Angabe.
Nukleinsäuren, die CNG2B und andere CNG2B Familienmitglieder kodieren, können auch aus Expressionsbibliotheken mit Antikörpern als Sonden isoliert werden. Solche polyklonalen oder monoklonalen Antikörper können mit der Sequenz von SEQ ID NO: 1 oder jedem immunogenen Teil davon erzeugt werden.
CNG2B polymorphe Varianten, Orthologe und Allele, die im Wesentlichen mit der konservierten Region von CNG2B identisch sind, können mit CNG2B Nukleinsäuresonden und Oligonukleotiden unter stringenten Hybridisierungsbedingungen durch das Screenen von Bibliotheken isoliert werden. Alternativ können Expressionsbibliotheken verwendet werden, um CNG2B und CNG2B polymorphe Varianten, Orthologe und Allele durch das immunologische Detektieren von exprimierten Homologen mittels Antiseren oder gereinigten Antikörpern, die gegen humanes CNG2B oder Teile davon hergestellt wurden, die das CNG2B Homolog erkennen und selektiv daran binden, zu klonieren.
Um eine cDNA Bibliothek herzustellen, sollte man eine Quelle wählen, die reich an CNG2B mRNA ist, z.B. das zentrale Nervensystem. Die mRNA wird dann in cDNA mit reverser Transkriptase überführt, in einen rekombinanten Vektor ligiert und in einen rekombinanten Wirt für die Vermehrung, das Screenen und Klonieren transfiziert. Verfahren zum Herstellen und Screenen von cDNA Bibliotheken sind gut bekannt (siehe z.B. Gubler & Hoffman, Gene 25: 263-269 (1983); Sambrook et. al., supra; Ausubel et al., supra).
Für eine genomische Bibliothek wird die DNA aus dem Gewebe extrahiert und entweder mechanisch geschert oder enyzmatisch verdaut, um Fragmente von ungefähr 12-20 kb zu ergeben. Die Fragmente werden dann durch Gradientenzentrifugation von unerwünschten Größen getrennt und werden in Bakteriophage Lambda-Vektoren konstruiert. Diese Vektoren und Phagen werden in vitro verpackt. Rekombinante Phagen werden durch Plaque-Hybridisierung analysiert, wie in Genton & Davis, Science 196: 180-182 (1977) beschrieben wurde. Koloniehybridisierung wird durchgeführt, wie allgemein beschrieben in Grunstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 72: 3961-3965 (1975).
Ein alternatives Verfahren zum Isolieren von CNG2B Nukleinsäure und ihren Orthologen, Allelen, Mutanten, polymorphen Varianten und konservativ modifizierten Varianten kombiniert die Verwendung von synthetischen Oligonukleotidprimern und die Amplifikation eines RNA oder DNA Templats (siehe U. S. Patente 4,683,195 und 4,683,202; PCR Protocols: A Guide to Methods andApplications (Innis et al., Hrg., 1990)). Verfahren wie Polymerase Kettenreaktion (PCR) und Ligase Kettenreaktion (LCR) können verwendet werden, um Nukleinsäuresequenzen von humanem CNG26 direkt aus mRNA, aus cDNA, aus genomischen Bibliotheken oder cDNA Bibliotheken zu amplifizieren. Degenerierte Oligonukleotide können entworfen werden, um CNG2B Homologe mit den hierin bereit gestellten Sequenzen zu amplifizieren. Restriktionsendonuklease- Stellen können in die Primer eingebaut werden. Polymerase Kettenreaktion oder andere in vitro Amplifikationsverfahren können auch nützlich sein, zum Beispiel, um Nukleinsäuresequenzen zu klonieren, die für Proteine kodieren, die exprimiert werden sollen, um Nukleinsäuren herzustellen, um sie als Sonden zum Detektieren des Vorliegens von CNG2B kodierender mRNA in physiologischen Proben, zum Sequenzieren von Nukleinsäure oder für andere Zwecke zu verwenden. Durch die PCR Reaktion amplifizierte Gene können aus Agarosegelen aufgereinigt werden und in einen geeigneten Vektor kloniert werden.
Genexpression von CNG2B kann auch durch Techniken analysiert werden, die in der Technik bekannt sind, z.B. Reverse Transkription und Amplifikation von mRNA, Isolierung von Gesamt-RNA oder Poly-A⁺-RNA, Northernblotting, Dotblotting, in situ Hybridisierung, RNase Protektion, Hochdichte-Polynukleotidarraytechnologie und ähnliche.
Synthetische Oligonukleotide können verwendet werden, um rekombinante CNG2B Gene zur Verwendung als Sonden oder für die Expression von Protein zu konstruieren. Dieses Verfahren wird mit einer Reihe von überlappenden Oligonukleotiden, die gewöhnlicherweise 40-120 bp lang sind, durchgeführt, die sowohl die Sense als auch die nicht Sense (Antisense) Stränge des Gens darstellen. Diese DNA-Fragmente werden dann annealt, ligiert und kloniert. Alternativ können Amplifikationstechniken mit präzisen Primern verwendet werden, um eine spezifische Subsequenz des CNG2B-Gens zu amplifizieren. Die spezifische Subsequenz wird dann in einen Expressionsvektor ligiert.
Das Gen für CNG2B wird typischerweise in intermediäre Vektoren vor der Transformation in prokaryotische oder eukaryotische Zellen für die Replikation und/oder Expression kloniert. Diese intermediären Vektoren sind typischerweise prokaryotische Vektoren, z.B., Plasmide oder Shuttle-Vektoren.
C. Expression in Prokaryoten und Eukaryoten
Um ein hohes Niveau an Expression eines klonierten Gens zu erhalten, wie von denjenigen cDNAs, die für CNG2B kodieren, subkloniert man typischerweise das Gen in einen Expressionsvektor, der einen starken Promotor, um die Transkription zu steuern, einen Transkriptions-/Translationsterminator und, falls er für eine Nukleinsäure ist, die für ein Protein kodiert, ein Ribosomenbindungsstelle für die Translations-Initiierung enthält. Geeignete bakterielle Promotoren sind in der Technik wohl bekannt und werden beschrieben z.B. in Sambrook et al., und Ausubel et al., siehe oben. Bakterielle Expressionssysteme zur Expression des CNG2B Proteins sind verfügbar in z.B. E. coli, Bacillus sp., und Salmonella (Palva et al., Gene 22: 229-235 (1983); Mosbach et al., Nature 302: 543-545 (1983). Kits für solche Expressionssysteme sind kommerziell verfügbar. Eukaryotische Expressionssysteme für Säugerzellen, Hefe und Insektenzellen sind in der Technik wohl bekannt und sind auch kommerziell verfügbar.
Die Auswahl des Promotors, der verwendet wird, um die Expression einer heterologen Nukleinsäure zu steuern, hängt von der speziellen Anwendung ab. Der Promotor wird vorzugsweise ungefähr im gleichen Abstand von der heterologen Transkriptionsstartstelle positioniert, wie von der Transkriptionsstartstelle in seiner natürlichen Umgebung. Wie in der Technik bekannt ist, kann jedoch einige Variation dieses Abstands ohne Verlust der Promotorfunktion erreicht werden.
Zusätzlich zu dem Promotor enthält der Expressionsvektor typischerweise eine Transkriptionseinheit oder Expressionskassette, die all die zusätzlichen Elemente enthält, die für die Expression der CNG2B kodierenden Nukleinsäure in Wirtszellen benötigt werden. Eine typische Expressionskassette enthält somit einen Promoter, der funktional mit der Nukleinsäuresequenz verknüpft ist, die für CNG2B kodiert und Signale, die für die effiziente Polyadenylierung des Transkript benötigt werden, Ribosomenbindungsstellen und Translationstermination. Zusätzliche Elemente der Kassette können Enhancer einschließen und, falls genomische DNA als das strukturelle Gen verwendet wird, Introns mit funktionalen Spleißdonor- und Akzeptorstellen einschließen.
Zusätzlich zu einer Promotorsequenz sollte die Expressionskassette auch eine Transkriptionsterminationsregion stromab des strukturellen Gens enthalten, um effiziente Termination zu gewährleisten. Die Terminationsregion kann aus dem gleichen Gen wie die Promotorsequenz erhalten werden oder kann aus anderen Genen erhalten werden.
Der spezielle Expressionsvektor, der verwendet wird, um die genetische Information in die Zelle zu transportieren, ist nicht besonders kritisch. Jeder der konventionellen Vektoren, der für die Expression in eukaryotischen oder prokaryotischen Zellen verwendet wird, kann verwendet werden. Standard bakterielle Expressionsvektoren schließen Plasmide, wie pBR322 basierte Plasmide, pSKF, pEP23D und Fusionsexpressionssysteme, wie MBP, GST und LacZ ein. Epitop-Tags können auch zu den rekombinanten Proteinen hinzugefügt werden, um bequeme Isolierungsverfahren zu gewährleisten, z. B., c-myc.
Expressionsvektoren, die regulatorische Elemente aus eurkaryotischen Viren enthalten, werden typischerweise in eukaryotischen Expressionsvektoren verwendet, z.B. SV40 Vektoren, Papilloma-Virusvektoren und Vektoren, die von Epstein-Barr Virus abgeleitet sind. Andere exemplarische eukaryotische Vektoren schließen pMSG, pAV009/A⁺, pMTO10/A⁺, pMAMneo-5, Baculovirus pDSVE und jeden anderen Vektor ein, der die Expression von Proteinen unter der Steuerung des CMV Promotors, SV40 „Early Promotors", SV40 „Later Promotors", Metallothionein-Promotors, murinen „Mammary Tumor" Viruspromotors, Rous sarcoma Viruspromotors, Polyhedrin-Promotors oder anderen Promotoren erlaubt, die sich als für die Expression in eukaryotischen Zellen als effektiv zeigten.
Expression von Proteinen aus eukaryotischen Vektoren kann auch mit induzierbaren Promotoren reguliert werden. Bei induzierbaren Promotoren sind die Expressionsniveaus mit der Konzentration der induzierenden Agenzien, wie Tetracyclin oder Ecdyson, durch den Einbau von Reaktionselementen für diese Agenzien in den Promotor verknüpft. Im Allgmeinen wird die Expression auf hohem Niveau von induzierbaren Promotoren nur in der Gegenwart des induzierenden Agens erreicht; die basalen Expressionsniveaus sind minimal. Induzierbare Expressionsvektoren werden häufig gewählt, wenn die Expression des interessierenden Proteins für die eukaryotischen Zellen nachteilig ist.
Solche Expressionssysteme besitzen Marker, die Genamplifikation gewährleisten, wie Thymidinkinase und Dihydrofolat-Reductase. Alternativ sind Expressionssysteme mit hoher Ausbeute, die keine Genamplifikation involvieren, auch geeignet, wie die Verwendung eines Baculovirusvektors in Insektenzellen, mit einer für CNG2B kodierenden Sequenz unter der Steuerung des Polyhedrin-Promotors oder anderer starker Baculovirus-Promotoren. Die Elemente, die typischerweise in Expressionsvektoren enthalten sind, enthalten auch ein Replicon, das in E. coli funktioniert, ein Gen, das eine Antibiotikaresistenz kodiert, um die Selektion der Bakterien zu erlauben, die die rekombinanten Plasmide enthalten, und einzigartige Restriktionsstellen in nicht-essentiellen Regionen des Plasmids beinhalten, um Insertion von eukaryotischen Sequenzen zu erlauben. Das spezifisch gewählte Antibiotikaresistenzgen ist nicht kritisch – jedes der vielen in der Technik bekannten Resistenzgene ist geeignet. Die prokaryotischen Sequenzen werden vorzugsweise ausgewählt, so dass sie nicht mit der Replikation der DNA in eukaryotischen Zellen, falls notwendig, interferieren.
Standard Transfektionsverfahren werden verwendet, um bakterielle, Säuger-, Hefe- oder Insektenzellen zu produzieren, die große Mengen von CNG2B Protein exprimieren, die dann mit Standardtechniken aufgereinigt werden (siehe z.B. Colley et al., J. Biol. Chem. 264: 17619-17622 (1989); Guide to Protein Purification, in Methods in Enzymology, Vol. 182 (Deutscher, Hrg., 1990)). Transformation von eukaryotischen und prokaryotischen Zellen wird gemäß den Standardtechniken durchgeführt (siehe, z.B., Morrison, J. Bact. 132: 349-351 (1977); Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology 101: 347-362 (Wu et al., Hrg., 1983).
Jede der gut bekannten Prozeduren zum Einführen von fremden Nukleotidsequenzen in Wirtszellen kann verwendet werden. Diese schließen die Verwendung von Kalzium-Phosphat-Transfektion, Polybren, Protoplastenfusion, Elektroporation, Biolistics, Liposomen, Mikroinjektion, Plasmavektoren, viralen Vektoren und jedes der anderen gut bekannten Verfahren zum Einführen von klonierter genomischer DNA, cDNA, synthetischer DNA oder anderen fremden genetischen Materials in eine Wirtszelle ein (siehe z.B. Sambrook et al., siehe oben). Es ist nur notwendig, dass das spezifische genetische verwendete Konstruktionsverfahren in der Lage ist, erfolgreich wenigstens ein Gen in die Wirtszelle einzuführen, das in der Lage ist CNG2B zu exprimieren. Nachdem der Expressionsvektor in die Zellen eingeführt wurde, werden die transfizierten Zellen unter Bedingungen kultiviert, die die Expression von CNG2B begünstigen, das aus der Kultur mit Standardtechniken, die unten identifiziert werden, gewonnen wird.
IV. Aufreinigung von CNG2B-Polypeptiden
Zur Verwendung in funktionalen Assays kann entweder natürlich vorkommendes oder rekombinantes CNG2B aufgereinigt werden. Natürlich vorkommende CNG2B-Monomere können z.B. aus humanem Gewebe, wie dem zentralen Nervensystem oder jeder Quelle eines CNG2B Homologs aufgereinigt werden. Rekombinante CNG2B-Monomere können aus jeder geeigneten Expressionssystem aufgereinigt werden.
Die CNG2B-Monomere können zu substantieller Reinheit durch Standardtechniken aufgereinigt werden, einschließlich der selektiven Präzipitation mit solchen Substanzen wie Ammoniumsulfat, Säulenchromatographie, Immunoaufreinigungsverfahren und andere (siehe z.B. Scopes, Protein Purification: Principles and Practice (1982); U.S. Patent Nr. 4,673,641 ; Ausubel et al., siehe oben; und Sambrook et al., siehe oben).
Eine Anzahl von Prozeduren kann eingesetzt werden, wenn rekombinante CNG2B-Monomere aufgereinigt werden. Zum Beispiel können Proteine mit etablierten molekularen Adhäsionseigenschaften reversibel mit den CNG2B-Monomeren verbunden werden. Mit dem geeigneten Liganden können die CNG2B-Monomere selektiv an eine Aufreingungssäule adsorbiert werden und dann von der Säule in einer relativ reinen Form freigesetzt werden. Das verbundene Protein wird dann durch enzymatische Aktivität entfernt. Schließlich könnten die CNG2B-Monomere mit Immunaffinitätssäulen aufgereinigt werden.
A. Aufreinigung von CNG2B-Monomeren aus rekombinanten Bakterien
Rekombinante Proteine werden durch transformierte Bakterien in großen Mengen, typischerweise nach Promotorinduktion, exprimiert; Expression kann auch konstitutiv sein. Promotorinduktion mit IPTG ist ein Beispiel eines induzierbaren Promotorsystem. Bakterien werden gemäß den Standardverfahren in der Technik gezogen. Frische oder gefrorene Bakterienzellen werden für die Isolierung von Protein verwendet.
Proteine, die in Bakterien exprimiert werden, bilden unlösliche Aggregate („Inclusion Bodies"). Zahlreiche Protokolle sind für die Aufreinigung der CNG2B-Monomere von Inclusions Bodies geeignet. Zum Beispiel involviert die Aufreinigung von Inclusion Bodies typischerweise die Extraktion, Separation und/oder Aufreinigung von Inclusion Bodies durch Disruption der bakteriellen Zellen, z.B. durch Inkubation in einem Puffer mit 50 mM TRIS/HCL pH 7.5, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 0.1 mM ATP und 1 mM PMSF. Die Zellsuspension kann mit 2-3 Passagen durch eine French Press lysiert, mit einem Polytron (Brinkmann Instruments) homogenisiert oder auf Eis sonifiziert werden. Alternative Verfahren des Lysierens von Bakterien sind dem Fachmann offenkundig (siehe z.B. Sambrook et al., siehe oben; Ausubel et al., siehe oben).
Wenn notwendig, werden die Inclusion Bodies solubilisiert und die lysierte Zellsuspension wird typischerweise zentrifugiert, um ungewolltes unlösliches Material zu entfernen. Proteine, die die Inclusion Bodies gebildet haben, können durch Verdünnung oder Dialyse mit einem kompatiblen Puffer renaturiert werden. Geeignete Lösungen schließen, sind aber nicht beschränkt auf, Harnstoff (ungefähr 4 M bis ungefähr 8 M), Formamid (wenigstens ungefähr 80%, Volumen/Volumen-Basis) und Guanidinium Hydrochlorid (ungefähr 4 M bis ungefähr 8 M) ein. Einige Lösungsmittel, die in der Lage sind Aggregat bildende Proteine zu solubilisieren, zum Beispiel SDS (Natriumdodecylsulfat), 70% Ameisensäure sind nicht geeignet für die Verwendung in diesem Verfahren wegen der irreversiblen Denaturierung der Proteine, die mit einem Mangel an Immunogenität und/oder Aktivität einhergeht. Obwohl Guanidinium hydrochlorid und ähnliche Agenzien Denaturierungsmittel sind, ist diese Denaturierung nicht irreversibel und Renaturierung kann nach Entfernung (durch zum Beispiel Dialyse) oder Verdünnung des Denaturierungsmittels auftreten, was die erneute Bildung des immunologisch und/oder biologisch aktiven Proteins ermöglicht. Andere geeignete Puffer sind den Fachleuten bekannt, Humane CNG Monomere werden von anderen bakteriellen Proteinen durch Standardseparationtechniken abgetrennt, z.B. mit Ni-NTA Agarosematerial.
Alternativ ist es möglich die CNG2B-Monomere aus dem Bakterienperiplasma aufzureinigen. Nach Lyse der Bakterien, wenn die CNG2B-Monomere in das Periplasma der Bakterien exportiert werden, kann die periplasmatische Fraktion der Bakterien durch kalten osmotischen Schock zusätzlich zu anderen dem Fachmann bekannten Verfahren isoliert werden. Um rekombinante Proteine aus dem Periplasma zu isolieren, werden die bakteriellen Zellen zentrifugiert, um ein Pellet zu bilden. Das Pellet wird in einem Puffer, der 20% Saccharose enthält, resuspendiert. Um die Zellen zu lysieren, werden die Bakterien zentrifugiert und das Pellet in eiskaltem 5 mM MgSO₄ resuspendiert und in einem Eisbad für ungefähr 10 Minuten gehalten. Die Zellsuspension wird zentrifugiert und der Überstand dekantiert und aufbewahrt. Die rekombinanten Proteine, die in dem Überstand vorliegen, können von den Wirtsproteinen durch Standardauftrennungstechniken abgetrennt werden, die dem Fachmann gut bekannt sind.
B. Standardproteintrennungstechniken zum Aufreinigen von CNG2B-Monomeren
Solubilitätsfraktionierung
Eine anfängliche Salzfraktionierung kann, oft als ein anfänglicher Schritt, besonders dann, wenn die Proteinmischung komplex ist, viele der ungewollten Wirtszellproteine (oder Proteine, die aus dem Zellkulturmedium stammen) von den interessierenden rekombinanten Protein abtrennen. Das bevorzugte Salz ist Ammoniumsulfat. Ammoniumsulfat präzipitiert Proteine durch effektives Reduzieren der Wassermenge in der Proteinmischung. Proteine präzipitieren dann aufgrund ihrer Solubilität. Je hydrophober ein Protein ist, desto wahrscheinlicher ist, bei geringeren Ammoniumsulfat-Konzentrationen zu präzipitieren. Ein typisches Protokoll schließt das Hinzugeben von gesättigtem Ammoniumsulfat zu einer Proteinlösung ein, so dass die resultierende Ammoniumsulfat Konzentration zwischen 20-30% ist. Diese Konzentration wird die am meisten hydrophoben Proteine präzipitieren. Das Präzipitat wird dann verworfen (außer das interessierende Protein ist hydrophob) und Ammoniumsulfat wird zu dem Überstand bis zu einer Konzentration hinzugegeben, von der bekannt ist, dass dabei das interessierende Protein präzipitiert. Das Präzipitat wird dann in einem Puffer solubilisiert und das überschüssige Salz wird, falls notwendig entweder durch Dialyse und Membranfiltrierung, entfernt. Andere Verfahren, die auf der Löslichkeit von Proteinen basieren, wie kalte Ethanolfällung, sind den Fachleuten bekannt, und können verwendet werden, um komplexe Proteinmischungen fraktionieren.
Differentielle Größenfiltration
Das Molekulargewicht der CNG2B-Monomere (z.B. ungefähr 92 kD) kann verwendet werden, um sie von Proteinen mit größerer und geringerer Größe unter Verwendung von Ultrafiltration durch Membranen von verschiedenen Porengröße zu isolieren (zum Beispiel Amicon oder Millipore Membranen). Als ein erster Schritt wird die Proteinmischung durch eine Membran mit einer Porengröße ultrafiltriert, die eine geringere Molekulargewichtsausschlussgröße besitzt als das Molekulargewicht des interessierenden Proteins. Das Retentat der Ultrafiltration wird dann gegen eine Membran ultrafiltriert mit einer molekularen Ausschlussgröße, die größer ist als die des interessierenden Proteins. Das rekombinante Protein wird durch die Membran in das Filtrat hindurch treten. Das Filtrat kann dann, wie unten beschrieben, chromatographiert werden.
Säulenchromatoqraphie
Die CNG2B-Monomere können auch von anderen Proteinen auf der Basis von Größe, Nettooberflächenladung, Hydrophobizität und Affinität für Liganden separiert werden. Zusätzlich können Antikörper, die gegen Proteine erzeugt werden, mit den Säulenmatrizen konjugiert werden und die Proteine immuno-gereinigt werden. All diese Verfahren sind in der Technik wohl bekannt. Es wird auch für einen Fachmann offensichtlich sein, dass chromatographische Techniken in jedem Maßstab und unter Verwendung der Geräte von vielen verschiedenen Herstellern (z.B. Pharmacial Biotech) durchgeführt werden können.
V. Immunologische Detektion von CNG2B-Polypeptiden
Zusätzlich zu der Detektion von CNG2B Genen und Genexpression mit der Nukleinsäurehybridisierungstechnologie kann man auch Immunoassays verwenden, um die CNG2B-Monomere der Erfindung zu detektieren. Immunoassays können verwendet werden, um qualitativ oder quantitativ die CNG2B-Monomere zu analysieren. Einen allgemeinen Überblick über die geeignete Technologie kann in Harlow & Lane, Antibodies, A Laborstory Manual (1988) gefunden werden.
A. Antikörper gegen CNG2B-Monomere
Verfahren zum Produzieren von polyklonalen und monoklonalen Antikörpern, die mit CNG2B-Monomeren spezifisch reagieren, oder CNG2B-Monomeren aus spezifischen Spezies, wie humanem CNG2B, sind den Fachleuten bekannt (siehe, z.B., Coligan, Current Protocols in Immunology (1991); Harlow & Lane, siehe oben; Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2te A. 1986); und Kohler & Milstein, Nature 256: 495-497 (1975). Solche Techniken schließen die Antikörperpräparation durch Auswahl von Antikörpern aus Bibliotheken von rekombinanten Antikörpern in Phagen- oder ähnlichen Vektoren ein, wie auch die Präparation von polyklonalen und monoklonalen Antikörpern durch das Immunisieren von Ratten oder Mäusen ein (siehe, z.B., Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989); Ward et al., Nature 341: 544-546(1989)). Eine Vielzahl von Immunogenen, die Teile von CNG2B-Monomeren umfassen, können verwendet werden, um Antikörper zu produzieren, die mit CNG2B-Monomeren spezifisch reaktiv sind. Zum Beispiel können rekombinante CNG2B-Monomere oder ein antigenes Fragment davon, wie hier beschrieben, isoliert werden. Rekombinantes Protein kann in eukaryotischen oder prokaryotischen Zellen, wie oben beschrieben, exprimiert werden, und gereinigt werden, wie oben im Allgemeinen beschrieben wurde. Rekombinantes Protein ist das bevorzugte Immunogen für die Produktion von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern. Alternativ kann ein synthetisches Peptid, das von den hier offenbarten Sequenzen abgeleitet wurde, und mit einem Trägerprotein konjugiert wurde, als ein Immunogen verwendet werden. Natürlich vorkommendes Protein kann auch entweder in reiner oder unreiner Form verwendet werden. Das Produkt wird dann in ein Tier injiziert, das in der Lage ist Antikörper zu produzieren. Entweder monoklonale oder polyklonale Antikörper können für die nachfolgende Verwendung in Immunoassays erzeugt werden, um das Protein zu messen. Verfahren zur Produktion von polyklonalen Antikörpern sind den Fachleuten bekannt. Ein durch Inzucht erzeugter Mausstamm (z.B. BALB/C Mäuse) oder Ratten wird mit dem Protein mit einem Standardadjuvans, wie Freund's Adjuvans, und einem Standardimmunisierungprotokoll immunisiert. Die Immunantwort des Tieres auf die Immunogen-Präparation wird durch das Nehmen von Testblutungen und das Bestimmen des Reaktivitätstiters gegenüber Beta-Untereinheiten überwacht. Wenn geeignet hohe Antikörpertiter gegen das Immunogen erhalten wurden, wird Blut aus dem Tier gesammelt und Antisera werden hergestellt. Weitere Fraktionierung der Antiseren, um Antikörper anzureichern, die gegen das Protein reaktiv sind, kann unternommen werden, falls das gewünscht ist (siehe Harlow & Lane oben).
Monoklonale Antikörper können durch zahlreiche Techniken erhalten werden, die den Fachleuten vertraut sind. Kurz gesagt, werden Milzzellen aus einem Tier, das mit einem gewünschten Antigen immunisiert ist, gewöhnlich durch Fusion mit einer Myelomazelle immortalisiert (siehe Kohler & Milstein, Eur. J Immunol. 6: 511-519 (1976)). Alternative Verfahren der Immortalisierung schließen die Transformation mit Epstein Barr Virus, Oncogenen oder Retroviren oder andere in der Technik wohl bekannte Verfahren ein. Kolonien, die aus einzelnen immortalisierten Zellen hervorgehen, werden auf die Produktion von Antikörpern mit der gewünschten Spezifität und Affinität für das Antigen gescreent und die Produktionsmenge der monoklonalen Antikörper, die durch solche Zellen produziert werden, können durch zahlreiche Techniken erhöhst werden, einschließlich der Injektion in die peritonale Höhlung eines Wirbeltierwirts. Alternativ kann man DNA Sequenzen isolieren, die ein monoklonalen Antikörper oder ein Bindungsfragment davon durch Screenen einer DNA Bibliothek aus humanen B-Zellen gemäß dem allgemeinen Protokoll, das durch Huse, et al., Science 246: 1275-1281 (1989) umrissen wird, isolieren.
Monoklonale Antikörper und polyklonale Seren werden gesammelt und gegen das Immunogenprotein in einem Immunoassay, zum Beispiel einem Festphasen Immunoassay, titriert wobei das Immunogen auf einem festen Träger immobilisiert ist. Typischerweise werden polyklonale Antiseren mit einem Titer von 10⁴ oder größer selektiert und auf Kreuzreaktivität mit Nicht-CNG Familienproteinen und anderen CNG Familienproteinen mit einem kompetitiven Bindungsimmunoassay getestet. Spezifische polyklonale Antiseren und monoklonale Antikörper werden gewöhnlich mit einem K_d von wenigstens ungefähr 0.1 mM, noch gewöhnlicher von wenigstens ungefähr 1 M, bevorzugt wenigstens ungefähr 0.1 M oder besser, und am bevorzugtesten 0.01 M oder besser binden. Antikörper, die nur für ein CNG2B Ortholog spezifisch sind, wie humanem CNG2B, können auch hergestellt werden durch Hinausnehmen anderer kreuzreagierender Orthologen von einer Spezies, wie einem nicht humanem Säuger. Sobald die spezfischen Antikörper gegen ein CNG2B verfügbar sind, kann das CNG2B mit einer Vielzahl von Immunoassayverfahren detektiert werden. Für eine Übersicht über immunologische und Immunoassayprozeduren, siehe Basic and Clinical Immunology (Stites & Terr Hrg., 7te A. 1991). Darüber hinaus können die Immunoassays der vorliegenden Erfindung in jeder der zahlreichen Konfigurationen durchgeführt werden, die intensiv in Übersicht in Enzyme Immunoassay (Maggio, Hrg., 1980); und Harlow & Lane, siehe oben, dargestellt werden.
B. Immunologische Bindungsassays
Die CNG26-Polypeptide der Erfindung können mit jeder einer Anzahl von gut anerkannten immunologischen Bindungsassays detektiert und/oder quantifiziert werden (siehe, z.B. U.S. Patente 4,366,241 ; 4,376,110 ; 4,517,288 ; und 4,837,168 ). Für eine Übersicht über die allgemeinen Immunoassays siehe auch Methods in Cell Biology: Antibodies in Cell Biology, Band 37 (Asai, Hrg. 1993); Basic and Clinical Immunology (Stites & Terr, Hrgs., 7te A. 1991). Immunologische Bindungsassays (oder Immunoassays) verwenden typischerweise einen Antikörper, der spezifisch an ein Protein oder ein Antigen der Wahl bindet (in diesem Fall das CNG2B oder eine antigene Subsequenz davon). Der Antikörper (z.B. Anti-CNG2B) kann durch jede einer Anzahl von Mitteln hergestellt werden, die Fachleuten bekannt sind und wie sie oben beschrieben sind.
Immunoassays verwenden oft auch ein Markierungsagens, um spezifisch an den Komplex zu binden und ihn zu markieren, der durch den Antikörper und das Antigen gebildet wird. Das Markierungsagens kann selbst eine der Einheiten sein, die den Antikörper/das Antigen umfassen. Somit kann das Markierungsagens ein markiertes CNG2B-Polypeptid oder ein markierter Anti-CNG2B Antikörper sein. Alternativ kann das Markierungsagens eine dritte Einheit, wie ein sekundärer Antikörper sein, der spezifisch an den Antikörper/CNG2B Komplex bindet (ein sekundärer Antikörper ist typischerweise für Antikörper der Spezies spezifisch, aus der der erste Antikörper abgeleitet ist). Andere Proteine, die in der Lage sind, spezifisch konstante Immunoglobulin Regionen zu binden, wie Protein A oder Protein G können auch als das Markierungsagens verwendet werden. Diese Proteine weisen eine starke nicht immunogene Reaktivität mit den konstanten Immunoglobulinregionen aus einer Vielzahl von Spezies auf (siehe z.B. Kronval et al., J. Immunol. 111: 1401-1406 (1973); Akerstrom et al., J. Immunol. 135: 2589-2542 (1985)). Das Markierungsagens kann mit einer detektierbaren Einheit modifiziert werden, wie Biotin, an das ein anderes Molekül spezifisch binden kann, wie Straptavidin. Eine Vielzahl von detektierbaren Einheiten sind den Fachleuten wohl bekannt.
Überall in den Assays können Inkubations- und oder Waschschritte nach jeder Kombinierung von Reagenzien notwendig sein. Inkubationsschritte können von ungefähr 5 Sekunden bist zu zahlreichen Stunden variieren, vorzugsweise von ungefähr 5 Minuten bis ungefähr 24 Stunden. Jedoch wird die Inkubationszeit von dem Assayformat, Antigen, Lösungsvolumen, Konzentrationen und ähnlichem abhängen. Gewöhnlicherweise werden die Assays bei Raumtemperatur durchgeführt, obwohl sie über einen breiten Temperaturbereich, wie von 10°C bis 40°C, durchgeführt werden können.
Nicht kompetetive Assayformate
Immunoassays zum Detektieren des CNG2B in Proben können entweder kompetetiv oder nicht kompetetiv sein. Nicht kompetetive Immunoassays sind Assays, in denen die Menge des Antigens direkt gemessen wird. In einem bevorzugten "Sandwich"-Assay, zum Beispiel, können die Anti-CNG2B Untereinheitsantikörper direkt an ein festes Substrat, auf dem sie immobilisiert sind, gebunden werden. Diese immobilisierten Antikörper fangen dann CNG2B ein, das in der Testprobe vorliegt. Die CNG2B-Monomere werden somit immobilisiert und dann durch ein Markierungsreagens gebunden, wie einen zweiten CNG2B Antikörper, der eine Markierung trägt. Alternativ kann dem zweiten Antikörper eine Markierung fehlen, aber er kann selbst durch einen markierten dritten Antikörper gebunden werden, der wiederum für Antikörper der Spezies spezifisch ist, von der der zweite Antikörper abgeleitet ist. Der zweite oder dritte Antikörper wird typischerweise mit einer detektierbaren Einheit, wie Biotin, modifiziert, an den ein anderes Molekül spezifisch bindet, z.B., Streptavidin, um eine detektierbare Einheit bereit zu stellen.
Kompetitive Assayformate
In kompetitiven Assays wird die Menge des in der Probe vorliegenden CNG2B indirekt durch Messen der Menge von bekanntem (exogen) hinzu gefügten CNG2B gemessen, das von einem Anti-CNG2B Antikörper durch das unbekannte in einer Probe vorliegende CNG2B verdrängt (weg kompetiert) wird. In einem kompetitiven Assay wird eine bekannte Menge des CNG2B einer Probe hinzugefügt und die Probe wird dann mit einem Antikörper in Kontakt gebracht, der spezifisch an das CNG2B bindet. Die Menge von exogenem CNG2B, das an den Antikörper gebunden ist, ist invers proportional mit der Konzentration des in der Probe vorliegenden CNG2B. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird der Antikörper auf einem festen Substrat immobilisiert. Die Menge des an den Antikörper gebundenen CNG2B kann entweder durch Messen der in einem CNG2B/Antikörperkomplex vorliegendem CNG2B oder alternativ durch Messen der Menge des verbleibenden unkomplexierten Proteins bestimmt werden. Die Menge von CNG2B kann durch Bereitstellen eines markierten CNG2B Moleküls detektiert werden. Ein Hapten-Inhibierungsassay ist ein anderer bevorzugter kompetitiver Assay. In diesem Assay wird das bekannte CNG2B auf einem festen Substrat immobilisiert. Eine bekannte Menge von Anti-CNG2B Antikörper wird der Probe hinzugefügt, und die wird dann mit dem immobilisierten CNG2B in Kontakt gebracht. Die Menge des an das bekannte immobilisierte CNG2B gebundenen Anti-CNG2B Antikörpers ist invers proportional mit der Menge des in der Probe vorhandenen CNG2B. Wiederum kann die Menge des immobililisierten Antikörpers durch Detektieren entweder der immobilisierten Fraktion des Antikörpers oder der Fraktion des Antikörpers detektiert werden, die in Lösung bleibt. Detektion kann direkt sein, wenn der Antikörper markiert ist oder indirekt durch die nachfolgende Zugabe einer markierten Einheit, die spezifisch den Antikörper, wie oben beschrieben, bindet.
Kreuzreaktivitätsbestimmungen
Immunoassays in dem kompetitiven Bindungsformat können auch für Kreuzreaktivitätsbestimmungen von CNG2B verwendet werden. Zum Beispiel kann ein CNG2B Protein, das wenigstens teilweise mit einer Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1 oder einer immunogenen Region davon korrespondiert auf einem festen Träger immobilisiert werden. Andere Proteine wie andere CNG Familienmitglieder werden dem Assay hinzugefügt, um so um das Binden der Antisera an das immobilisierte Antigen zu kompetetieren. Die Fähigkeit des hinzugefügten Antikörpers um die Bindung der Antisera an das immobilisierte Protein zu kompetetieren, wird mit der Fähigkeit des CNG26 oder eines immunogenen Teils davon verglichen, mit sich selbst zu kompetetieren. Der Prozentsatz der Kreuzreaktivität mit den obigen Proteinen wird mit Standardberechnungen berechnet. Die Antisera mit weniger als 10% Kreuzreaktivität mit jedem der oben aufgeführten hinzugefügten Proteine werden ausgewählt und gepoolt. Die Kreuzreaktivitätsantikörper werden optional aus den gepoolten Antisera durch Immunoabsorption mit den hinzugefügten erwogenen Proteinen entfernt, z.B., entfernt verwandten Homologen. Antikörper, die spezifisch nur an die speziellen Orthologe von CNG2B binden, wie humanes CNG2B, können auch mit dieser Methodologie hergestellt werden.
Die immunoabsorbierten und gepoolten Antisera werden in einem kompetetiven Bindungsimmunassay, wie oben beschrieben, verwendet, um ein zweites Protein zu vergleichen, von dem gedacht wird, dass es vielleicht ein Allel, Ortholog oder polymorphe Variante von CNG2B zu dem immunogenen Protein sei. Um diesen Vergleich durchzuführen werden die zwei Proteine jeweils in einem breiten Konzentrationsbereich in Assays getestet und die Menge jedes Proteins, die benötigt wird, um 50% der Antiserabindung an das immobilisierte Protein zu inhibieren, bestimmt. Wenn die Menge des zweiten Proteins, die benötigt wird, um 50% Bindung zu inhibieren, geringer als das 10fache der Menge des Proteins ist, das durch CNG2B kodiert wird, die benötigt wird, um 50% Bindung zu inhibieren, dann soll das zweite Protein spezifisch an den polyklonalen Antikörper binden, die durch das jeweilige CNG2B Immunogen erzeugt wurde.
Andere Assayformate
Westernblot (Immunoblot) Analyse wird verwendet, um das CNG2B in der Probe zu detektieren und quantifizieren. Dies umfasst im Allgemeinen das Auftrennen der Probenproteine durch Gelelektrophorese auf der Basis des Molekulargewichts, das Transferieren der aufgetrennten Proteine auf einen geeigneten festen Träger (wie Nitrozellulosefilter, einen Nylonfilter oder derivatisierten Nylonfilter) und das Inkubieren der Probe mit Antikörpern, die spezifisch CNG2B binden. Die Anti-CNG2B Antikörper binden spezifisch an CNG2B auf dem festen Träger. Diese Antikörper können direkt markiert werden oder können alternativ dann mit markierten Antikörpern detektiert werden (z.B. markierten Schaf Anti-Maus Antikörpern), die spezifisch an die Anti-CNG2B Antikörper binden.
Andere Assayformate schließen Liposom-Immunoassays (LIA) ein, die Liposomen verwenden, um spezifische Moleküle (z.B. Antikörper) zu binden und eingekapselte Reagenzien oder Marker frei zusetzen. Die freigesetzten Chemikalien werden gemäß Standardtechniken detektiert (siehe Monroe et al., Amer. Clin. Prod. Rev. 5: 34-41 (1986)).
Reduktion von nicht spezifischer Bindung
Ein Fachmann wird zu schätzen wissen, dass es oft wünschenswert ist, nicht spezifische Bindung in Immunoassays zu minimieren. Besonders, wenn der Asssay ein Antigen oder Antikörper involviert, der auf einem festen Substrat immobilisiert ist, ist es wünschenswert, die Menge von nicht spezifischer Bindung an das Substrat zum minimieren. Mittel zum Reduzieren nicht spezifischer Bindung sind den Fachleuten wohl bekannt. Typischerweise involviert diese Technik das Beschichten des Substrats mit einer proteinhaltigen Zusammensetzung. Insbesondere Proteinzusammensetzungen wie bovinem Serumalbumin (BSA), nicht-fettiger Trockenmilch und Gelatine werden häufig verwendet, wobei Trockenmilch am bevorzugtesten ist.
Markierungen
Die genaue Markierung oder detektierbare Gruppe, die in dem Assay verwendet wird, ist nicht ein kritischer Aspekt der Erfindung, so lange wie sie nicht signifikant mit der spezifischen Bindung des Antikörpers, der in dem Assay verwendet wird, interferiert. Die detektierbare Gruppe kann jedes Material mit einer detektierbaren physikalischen oder chemischen Eigenschaft sein. Solche detektierbaren Markierungen sind in dem Gebiet der Immunoassays weit entwickelt worden und im Allgemeinen kann fast jede Markierung, die in solchen Verfahren nützlich ist, in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Daher ist eine Markierung jede Zusammensetzung, die durch spektroskopische, photochemische, biochemische, immunochemische, elektrische, optische oder chemische Mittel detektierbar ist. Nützliche Markierungen in der vorliegenden Erfindung schließen magnetische Kügelchen (z.B. DYNABEADS^TM) ein, fluoroeszente Farbstoffe (z.B. Fluoresceinisothiocyanat, Texas rot, Rhodamin, und ähnliche), radioaktive Markierungen (z.B. ³H, ¹²⁵I, ³⁵S oder ³²P), Enzyme (z.B. Pferderettich Peroxidase, Alkalische Phosphatase und andere, die in einem ELISA gemeinhin verwendet werden) und colometrische Markierungen wie kolloidales Gold oder gefärbtes Glas oder Plastikkügelchen (z.B. Polystyrol, Polypropylen, Latex, etc.).
Die Markierung kann direkt oder indirekt an die gewünschte Komponente des Assays gemäß den in der Technik bekannten Verfahren gekoppelt werden. Wie oben angezeigt, kann eine breite Vielzahl von Markierungen verwendet werden, wobei die Wahl der Markierung von der benötigten Sensitivität, der Einfachheit sie mit der Komponente zu konjugieren, Stabilitätsanforderungen, den verfügbaren Geräten und Entsorgungsvorschriften abhängt.
Nicht radioaktive Markierungen werden oft durch indirekte Mittel angebracht. Im Allgemeinen wird ein Ligandenmolekül (z.B. Biotin) kovalent mit dem Molekül verbunden. Der Ligand bindet dann an ein anderes Molekül (z.B. Streptavidin), das entweder inhärent detektierbar ist oder kovalent an ein Signalsystem gebunden ist, wie einem detektierbaren Enzym, einer fluoreszierenden Verbindung oder einer chemilumineszenten Verbindung. Die Liganden und ihre Ziels können in jeder geeigneten Kombination mit Antikörpern, die CNG2B erkennen, oder sekundären Antikörpern verwendet werden, die Anti-CNG2B Antikörper erkennen.
Die Moleküle können auch direkt mit Signal erzeugenden Verbindungen konjugiert werden, z.B. durch Konjugieren mit einem Enzym oder Fluorophor. Als Markierungen interessierende Enyzme werden primär Hydrolasen, insbesondere Phosphatasen, Esterasen und Glycosidasen oder Oxidasen, insbesondere Peroxidasen sein. Fluroszierende Verbindungen schließen Fluoreszin und seine Derivate, Rhodamin und seine Derivate, Dansyl, Umbelliferon etc. ein. Chemilumineszente Verbindungen schließen Luciferin und 2,3-Dihydrophthalazinedione, z.B. Luminol ein. Für eine Übersicht über die zahlreichen Markierungs- oder Signal produzierenden Systeme, die verwendet werden können, siehe U.S. Patent Nr. 4,391,904 .
Mittel zum Detektieren von Markierungen sind den Fachleuten wohl bekannt. Somit schließen, wenn zum Beispiel die Markierung eine radioaktive Markierung ist, die Detektionsmittel ein Szintellierungszähler oder photographischen Film ein, wie bei der Autoradiographie. Wenn die Markierung eine fluoreszente Markierung ist, kann sie durch Anregen des Fluorochroms mit der geeigneten Wellenlänge und Detektieren der resultierenden Fluoreszens detektiert werden. Die Fluoreszens kann visuell, durch Mittel des photographischen Films, durch die Verwendung von elektronischen Detektoren wie Geräten mit Ladungskopplung (CCD) oder Photomultiplizierern und ähnlichen detektiert werden. In ähnlicher Weise können enzymatische Markierungen durch das Bereitstellen der geeigneten Substrate für die Enzyme und das Detektieren des resultierenden Reaktionsprodukts detektiert werden. Schließlich können einfache kolometrische Markierungen durch Beobachten der Farbe, die mit dem Markierung assoziiert ist, detektiert werden. Somit erscheint in zahlreichen Eintauch-(„Dipstick") Assays konjugiertes Gold oft als rosa, während zahlreiche konjugierte Kügelchen als die Farbe des Kügelchens erscheinen.
Einige Assayformate benötigen nicht die Verwendung von markierten Komponenten. Zum Beispiel können Agglutinierungsassays verwendet werden, um das Vorliegen der Ziel-Antikörper zu detektieren. In diesem Fall werden Antigen beschichtete Partikel durch Proben agglutiniert, die die Ziel-Antikörper umfassen. In diesem Format bracht keine der Komponenten markiert zu sein und das Vorliegen des Ziel-Antikörpers wird durch einfache visuelle Beobachtung detektiert.
VI. Assays für Modulatoren von CNG2B
A. Assays
Einführung
Humanes CNG2B und CNG2B Allele, Orthologe und polymorphe Varianten sind Untereinheiten von Kationenkanälen. Die Aktivität eines Kationenkanals, der CNG2B umfasst, kann mit einer Vielzahl von in vitro und in vivo Assays bewertet werden, z.B. durch Messen des Stromes, durch Messen des Membranpotentials, durch Messen des Ionenflusses, z.B. Kationen wie Natrium oder Kalzium, durch Messen der Ionenkonzentration, durch Messen der Zweitbotenstoffe und Transkriptionsniveaus, durch Messen der Ligandenbindung und Verwendung, z.B., von spannungssensitiven Farbstoffen, ionensensitiven Farbstoffen, wie kationensensitiven (z.B. Natrium oder Kalzium) spezifischen Farbstoffen, radioaktiven Markierungen und „Patchclamp" Elektrophysiologie.
In bevorzugten Ausführungsformen wird die Aktivität eines CNG Kationenkanals durch Detektion des Kations, z.B. Kalzium oder Natrium, der Konzentration oder Flusses mit einem ionenspezifischen (z.B. Kalzium oder Natrium) Farbstoff, z.B. einem fluoreszenten Farbstoff detektiert werden. Jeder solche Farbstoff, von denen eine große Anzahl den Fachleuten wohl bekannt sind, kann verwendet werden. Zum Beispiel kann jede einer Anzahl von fluoreszenten Sonden, die eine spektrale Reaktion auf Ca²⁺ Bindung zeigen, die die Detektion von Änderungen der intrazellulären freien Ca²⁺ Konzentrationen mit Fluoreszenzmikroskopie, Durchflusscytometrie oder Fluoreszenspektroskopie erlauben, verwendet werden.
Weiterhin können solche Assays verwendet werden, um auf Inhibitoren und Aktivatoren der Kanäle, die CNG2B umfassen, zu testen. Solche Modulatoren eines Kationenkanals sind für die Behandlung von zahlreichen Störungen, die Kationenkanäle involvieren, nützlich, z.B. neurologischen Störungen, z.B. des zentralen Nervensystems. Solche Modulatoren sind auch nützlich zum Untersuchen der Kanalvielfalt, die durch die Mitglieder der CNG-Familie bereitgestellt wird, und der Regulation/Modulation der Kationenkanalaktivität, die durch Mitglieder der CNG Familie, wie CNG2B, bereitgestellt wird.
Modulatoren der CNG Kationenkanäle werden mit biologisch aktivem, entweder rekombinantem oder natürlich vorkommenden, vorzugsweise humanem CNG2B, getestet. CNG2B kann isoliert, in einer Zelle coexprimiert oder exprimiert werden oder in einer Membran, die aus einer Zelle abgeleitet wurde, exprimiert werden. In solchen Assays kann CNG2B alleine exprimiert werden, um einen homomultimeren Kationenkanal zu bilden, oder in Kombination mit anderen CNG Proteinen, einschließlich Alpha- und/oder Beta-Untereinheiten, um einen heteromultimeren Kationenkanal zu bilden. Vorzugsweise wird das CNG2B-Polypeptid, das ein Teil des Kationenkanals ist, der in dem Assay verwendet wird, die Sequenz haben, die in SEQ ID NO: 1 oder einer konservativ modifizierten Variante davon dargestellt ist. Im Allgemeinen wird die Aminosäuresequenzidentität des Polypeptids zu SEQ ID NO: 1 wenigstens 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, vorzugsweise 85% oder 90%, am bevorzugtesten wenigstens 95% oder höher sein. Modulation wird mit einem der in vitro oder in vivo Assays, die hierin beschrieben sind, getestet. Proben oder Assays, die mit einem potentiellen Kationenkanalinhibitor oder Aktivator behandelt werden, werden mit Kontrollbeispielen ohne die Testverbindung verglichen, um das Ausmaß der Modulation zu untersuchen. Oft werden solche Assays in der Gegenwart eines zyklischen Nukleotids, z.B., cAMP oder cGMP, durchgeführt und die Fähigkeit des Testagens die Wirkung des zyklischen Nukleotids zu modulieren wird detektiert.
Kontrollproben (die nicht mit Aktivatoren oder Inhibitoren behandelt werden) wird eine relative Kationenkanalaktivität von 100 zugewiesen. Inhibierung von Kanälen, die ein CNG2B-Polypeptid umfassen, wird erreicht, wenn der Wert der Kationenkanalaktivität relativ zu der Kontrolle ungefähr 90%, vorzugsweise 50%, noch bevorzugter 25% ist. Aktivierung von Kanälen, die ein CNG2B-Polypeptid umfassen, wird erreicht, wenn der Wert der Kationenkanalaktivität relativ zu der Kontrolle ungefähr 110%, vorzugsweise 150%, noch bevorzugter 200% höher ist. Verbindungen, die den Ionenfluss erhöhen, werden einen detektierbaren Anstieg der Ionenstromdichte durch Erhöhen der Wahrscheinlichkeit, dass ein Kanal, der ein CNG2B-Polypeptid umfasst, offen ist, durch Erniedrigen der Wahrscheinlichkeit, dass er geschlossen ist, durch Erhöhen der Leitfähigkeit durch den Kanal und/oder durch Erlauben des Durchtritts von Ionen verursachen.
In vitro Assays
Assays, um Verbindungen mit Kationenkanal modulierender Aktivität zu identifizieren, können in vitro durchgeführt werden, z.B. Bindungsassays und biochemische Assays. Aufgereinigtes rekombinantes oder natürlich vorkommendes CNG2B Protein oder ein Kanal, der CNG2B Protein umfasst, können in den in vitro Verfahren der Erfindung verwendet werden. Zusätzlich zu dem aufgereinigten CNG2B Protein oder Kanal, das selbige enthält, können das rekombinante oder natürlich vorkommende CNG2B Protein Teil eines Lysats oder einer Zellmembran sein. Wie unten beschrieben, kann der Assay entweder festphasig oder löslich sein. Vorzugsweise wird das Protein oder die Membran an einen festen Träger gebunden, entweder kovalent oder nicht kovalent. Oft sind die in vitro Assays der Erfindung Liganden oder Toxin bindende oder Ligandenaffinitätsassays, entweder nicht kompetetiv oder kompetetiv. Andere in vitro Assays schließen das Messen von Änderungen der spektroskopischen (z.B. Fluoreszenz, Absorption, Brechungsindex), hydrodynamischen (z.B. Form), chromatographischen oder Löslichkeitseigenschaften des Proteins oder Kanals ein. Zellmembranen oder Lysate können auch verwendet werden, um Änderungen der Polarisation (d.h. elektrischen Potentials) der Zelle oder Membran, die den Kationenkanal exprimiert, der ein CNG2B-Polypeptid umfasst, ein, wie unten beschrieben wird.
In vivo Zell oder Membran basierte Assays
Änderungen des Ionenflusses können durch Bestimmen der Änderungen der Polarisation (d.h. des elektrischen Potentials) der Zelle oder Membran, die den Kationenkanal exprimiert, der ein CNG26-Polypeptid umfasst, bestimmt werden. Ein bevorzugtes Mittel, um Änderungen der zellulären Polarisation zu bestimmen, ist durch Messen der Änderungen des Stromes (wodurch Änderung der Polarisation gemessen werden) mit Spannungs-Clamp und Patch-Clamp Techniken, z.B. dem „an der Zelle angebrachten" Modus, dem "drinnen-draußen" Modus und dem „Gesamtzell" Modus (siehe auch Ackerman et al., New Engl. J Med. 336: 1575-1595 (1997)). Gesamtzellströme werden mit Standardmethodologie bequem bestimmt (siehe z.B. Hamil et al., PFlugers. Archiv. 391: 85 (1981). Andere bekannte Assays schließen Fluoreszenzassays mit ionensensitiven Farbstoffen ein (siehe z.B. Vestergarrd-Bogind et al., J. Membrane Biol. 88: 67-75 (1988); Daniel et al., J. Pharmacol. Meth. 25: 185-193 (1991); Holevinsky et al., J. Membrane Biology 137: 59-70 (1994)).
Beispiele für solche Farbstoffe, die für die Detektion von Kalzium nützlich sind, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, Fura-2, Bis-fura 2, Indo-1, Quin-2, Quin-2 AM, Benzothiaza-1, Benzothiaza-2, Indo-5F, Fura-FF, BTC, Mag-Fura-2, Mag-Fura-5, Mag-indo-1, Fluo-3, Rhod-2, Fura-4F, Fura-5F, Fura-6F, Fluo-4, Fluo-5F, Fluo-5N, Oregon Green 488 BAPTA, Kalzium Grün, Calcein, Fura-C18, Kalzium Grün-C18, Kalzium Orange, Kalzium Crimson, Kalzium Grün-5N, Magnesium Grün, Oregon Grün 488 BAPTA-1, Oregon Grün 488 BAPTA-2, X-rhod-1, Fura Rot, Rhod-5F, Rhod-5N, X-Rhod-5N, Mag-Rhod2, Mag-X-Rhod-1, Fluo-5N, Fluo-5F, Fluo-4FF, Mag-Fluo-4, Aequorin, Dextrankonjugate oder andere Derivate dieser Farbstoffe und andere (siehe z.B. den Katalog oder die Internetseite (www.probes.com) von Molecular Probes, Eugene, OR; siehe auch Nuccitelli, Hrg., Methods in Cell Biology, Volume 40: A Practical Guide to the Study of Calcium in Living Cells, Academic Press (1994); Lambert, Hrg., Calcium Signaling Protocols (Methods in Molecular Biology Volume 114), Humana Press (1999); W. T. Mason, Hrg., Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activity. A Practical Guide to Technology for Quantitative Real-Time Analysis, Zweite A., Academic Press (1999)). Beispiele von Natriumindikatoren schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, SBFI und Natrium Grün (siehe z.B. Molecular Probes Katalog oder Internetseite; Mason, oben).
Assays für Verbindungen, die in der Lage sind den Kationenfluss durch die Kanalproteine, die ein CNG2B-Polypeptid umfassen, zu inhibieren oder zu erhöhen, können durch Zugabe der Verbindungen zu einer Badlösung durchgeführt werden, die in Kontakt ist mit den Zellen und die Zellen umfasst, die einen Kanal der vorliegenden Erfindung besitzen (siehe z.B. Blatz et al., Nature 323: 718-720 (1986); Park, J Physiol. 481: 555-570 (1994)). Im Allgemeinen sind die Verbindungen, die getestet werden sollen in dem Bereich von 1 pM bis 100 mM.
Die Effekte der Testverbindungen auf die Funktion der Kanäle können durch Änderungen der elektrischen Ströme oder des Ionenflusses oder durch die Folgen der Änderungen der Ströme und des Flusses gemessen werden. Änderungen des elektrischen Stromes oder des Ionenflusses werden entweder durch Erhöhung oder Verringerung des Flusses von Ionen wie Natrium- oder Kaliumionen gemessen. Die Ionen können auf eine Vielzahl von Standardwegen gemessen werden. Sie können direkt durch Konzentrationsänderungen der Ionen, z.B. Änderungen der intrazellulären Konzentrationen, z.B., mit jeder der oben aufgeführten Farbstoffe oder radioaktiv markierten Ionen oder indirekt durch das Membranpotential gemessen werden. Die Folgen der Testverbindung für den Ionenfluss können sehr variabel sein. Demzufolge kann jede geeignete physiologische Änderung verwendet werden, um den Einfluss einer Testverbindung auf die Kanäle der Erfindung zu bestimmen. Die Effekte einer Testverbindung können durch einen Toxinbindungsassay gemessen werden. Man kann auch eine Vielzahl von Effekten, wie Transmitterfreisetzung (z.B. Dopamin), intrazelluläre Kalziumänderungen, Hormonfreisetzung (z.B. Insulin), transkriptionale Änderungen sowohl von bekannten als auch uncharakterisierten genetischen Markern (z.B. Northern-Blots), Zellvolumenänderungen (z.B. von roten Blutzellen), Immunreaktionen (z.B. T-Zellaktivierung), Änderungen des Zellmetabolismus, wie Zellwachstum oder pH-Änderungen, Änderungen der intrazellulären Zweitbotenstoffe wie zyklischen Nukleotiden messen.
CNG2B Orthologe, Allele, polymorphen Varianten und konservativ modifizierte Varianten werden im Allgemeinen im Wesentlichen einem Kanal ähnliche Eigenschaften verleihen, der ein CNG2B-Polypeptid umfasst, wie oben beschrieben wurde. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Zelle, die in Kontakt mit einer Verbindung gebracht wurde, von der vermutet wird, dass sie ein CNG2B Homolog ist, auf das Erhöhen oder Erniedrigen des Ionenflusses in einer eukaryotischen Zelle getestet, z.B. eine Oozyte von Xenopus (z.B. Xenopus laevis) oder eine Säugerzelle, wie eine CHO oder HeLa Zelle. Kanäle, die durch Verbindungen auf Weisen, die denen von CNG2B ähnlich sind, beeinflusst werden, werden als Homologe oder Orthologe von CNG2B betrachtet.
Tiermodelle
Tiermodelle finden auch Anwendung beim Screenen auf Kationenkanalmodulatoren. Transgene Tiertechnologie, einschließlich der Gen-Knockout-Technologie als ein Ergebnis der homologen Rekombination mit einem geeigneten Gen-Zieling-Vektor, oder Genüberexpression, wird in der Abwesenheit oder verstärkten Expression des CNG2B Proteins resultieren. Wenn es gewünscht ist, kann gewebsspezifische Expression oder Knockout des CNG2B Proteins notwendig sein. Transgene Tiere, die durch solche Verfahren erzeugt wurden, finden Anwendung als Tiermodelle für abnormalen Ionenfluss und werden zusätzlich nützlich sein beim Screenen auf Modulatoren der Kationenkanäle.
B. Modulatoren
Die Verbindungen, die als Modulatoren der CNG-Kanäle getestet werden, die eine CNG2B Untereinheit umfassen, können jedes kleine organische Molekül oder eine biologische Einheit, wie ein Protein, Peptid, Zucker, Nukleinsäure, Oligonukleotid oder Lipid sein. Alternativ können Modulatoren genetisch geänderte Versionen einer CNG2B Untereinheit sein. Typischerweise werden Testverbindungen kleine chemische Moleküle und Peptide sein. Praktisch jede chemische Verbindung kann als ein potentieller Modulator oder Ligand in den Assays der Erfindung verwendet werden, obwohl Verbindungen, die in wässrigen oder organischen (insbesondere DMSO basierten) Lösungen gelöst werden können, verwendet werden. Die Assays sind entworfen, um große chemische Bibliotheken durch Automatisieren der Assayschritte und Bereitstellen von Verbindungen aus jeder zugänglichen Quelle für Assays zu screenen, die typischerweise parallel durchgeführt werden (z.B. in Microtiterformaten auf Microtiterplatten in robotischen Assays). Es wird gewürdigt werden, dass es viele Lieferanten für chemische Verbindungen gibt, einschließlich Sigma (St. Louis, MO), Aldrich (St. Louis, MO), Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), Fluka Chemika-Biochemika Analytika (Buchs Schweiz) und ähnliche.
In einer bevorzugten Ausführungsform involvieren Hochdurchsatz-Screeningverfahren das Bereitstellen einer kombinatorischen chemischen oder Peptid-Bibliothek, die eine große Anzahl von potentiellen therapeutischen Verbindungen (potentielle Modulator- oder Ligandenverbindungen) enthält. Solche „kombinatorischen chemischem Bibliotheken" oder „Ligandenbibliotheken" werden dann in einem oder mehr Assays, wie hier beschrieben, gescreent, um die Bibliotheksmitglieder zu identifizieren (bestimmte chemische Spezies oder Subklassen), die eine gewünschte charakteristische Aktivität aufweisen. Die somit identifizierten Verbindungen können als konventionelle „Leitverbindungen" dienen oder können selbst als potentielle oder tatsächliche Therapeutika verwendet werden.
Eine kombinatorische chemische Bibliothek ist eine Sammlung von diversen chemischen Verbindungen, die entweder durch chemische Synthese oder biologische Synthese durch Kombinieren einer Anzahl von chemischen „Baublöcken", wie Reagenzien, erzeugt wurden. Zum Beispiel wird eine lineare kombinatorische chemische Bibliothek, wie eine Polypeptidbibliothek, durch Kombinieren eines Satzes von chemischen Baublöcken (Aminosäuren) auf jede mögliche Weise für eine bestimmte Verbindungslänge gebildet (d.h. die Anzahl von Aminosäuren in einer Polypeptidverbindung). Millionen von chemischen Verbindungen können durch solches kombinatorisches Mischen von chemischen Baublöcken synthetisiert werden.
Präparation und Screenen von kombinatorischen chemischen Bibliotheken wird von den Fachleuten gut verstanden. Solche kombinatorischen Bibliotheken schließen ein, sind aber nicht eingegrenzt auf, Peptidbibliotheken (siehe, z.B., U.S. Patent 5,010,175 , Furka, Int. J. Pept. Prot. Res. 37: 487-493 (1991) und Houghton et al., Nature 354: 84-88 (1991)). Andere Chemien zum Erzeugen von chemischen Diversitätsbibliotheken können auch verwendet werden. Solche Chemien schließen ein, sind aber nicht eingegrenzt auf: Peptoide (z.B., PCT Veröffentlichungsnr. WO 91/19735 ), kodierte Peptide (z.B., PCT Veröffentlichungsnr. WO 93/20242 ), zufällige Bio-Oligomere (z.B., PCT Veröffentlichungsnr. WO 92/00091 ), Benzodiazepine (z.B., U.S. Pat. Nr. 5,288,514 ), Diversomere wie Hydantoine, Benzodiazepine und Dipeptide (Hobbs et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90: 6909-6913 (1993)), Vinyloge Polypeptide (Hagihara et al., J. Amer. Chem. Soc. 114: 6568 (1992)), nicht peptidale Peptidomimetica mit Glucosegerüst (Hirschmann et al., J. Amer. Chem. Soc. 114: 9217-9218 (1992)), analoge organische Synthese von kleinen Verbindungsbibliotheken (Chef et al., J. Amer. Chem. Soc. 116: 2661 (1994)), Oligocarbamate (Cho et al., Science 261: 1303 (1993)), und/oder Peptidylphosphonate (Campbell et al., J. Org. Chem. 59:658 (1994)), Nukleinsäurebibliotheken (siehe Ausubel, Berger und Sambrook, alle oben), Peptidnukleinsäure-Bibliotheken (siehe z.B., U.S. Patent 5,539,083 ), Antikörper-Bibliotheken (siehe z.B., Vaughn et al., Nature Biotechnology, 14 (3): 309-314 (1996) und PCT/US96/10287 ), Kohlenhydrat-Bibliotheken (siehe z.B., Lang et al., Science, 274: 1520-1522 (1996) und U.S. Patent 5,593,853 ), kleine organische Molekülbibliotheken (siehe z.B., Benzodiazepine, Baum C & EN, Jan 18, Seite 33 (1993); Isoprenoide, U.S. Patent 5,569,588 ; Thiazolidinone und Metathiazanone, U.S. Patent 5,549,974 ; Pyrrolidine, U.S. Patente 5,525,735 und 5,519,134 ; Morpholino-Verbindungen, U.S. Patent 5,506,337 ; Benzodiazepine, 5,288,514 , und ähnliche).
Geräte für die Präparation von kombinatorischen Bibliotheken sind kommerziell verfügbar (siehe z.B., 357 MPS, 390 MPS, Advanced Chem Tech, Louisville KY, Symphony, Rainin, Woburn, MA, 433A Applied Biosystems, Foster City, CA, 9050 Plus, Millipore, Redford, MA). Zusätzlich sind zahlreiche kombinatorische Bibliotheken selbst kommerziell verfügbar (siehe z.B., ComGenex, Princeton, N. J., Asinex, Moscow, Ru, Tripos, Inc., St. Louis, MO, ChemStar, Ltd, Moscow, RU, 3D Pharmaceuticals, Exton, PA, Martek Biosciences, Columbia, MD, etc.).
In einer Ausführungsform stellt die Erfindung auf Festphasen basierte in vitro Assays in einem Hochdurchsatz-Format zur Verfügung, in dem die Zelle oder das Gewebe, das einen CNG-Kanal exprimiert, der eine humane CNG2B-Untereinheit umfasst, an einem Festphasensubstrat angebracht ist. In den Hochdurchsatz-Assays der Erfindung ist es möglich, zahlreiche tausend verschiedene Modulatoren oder Liganden in einem einzelnen Tag zu screenen. Insbesondere kann jede Nocke einer Mikrotiterplatte verwendet werden, um einen separaten Assay gegen einen ausgewählten potentiellen Modulator laufen zu lassen, oder, falls Konzentrations- oder Inkubationszeiteffekte beobachtet werden sollen, könne alle 5-10 Nocken einen einzelnen Modulator testen. Somit kann eine einzelne Standard-Mikrotiterplatte ungefähr 96 Modulatoren testen. Wenn 1536 Nockenplatten verwendet werden, dann kann eine einzelne Platte leicht ungefähr 100- ungefähr 1500 verschiedene Verbindungen testen. Es ist möglich, viele Platten pro Tag zu testen; Assayscreens für bis zu ungefähr 6,000, 20,000, 50,000 oder 100,000 oder mehr verschiedene Verbindungen sind mit den integrierten Systemen der Erfindung möglich.
C. Festphasen und lösliche Hochdurchsatz-Assays
In einer Ausführungsform stellt die Erfindung Assays mit Kationenkanälen, die ein CNG2B-Polypeptid umfassen, eine Membran, die einen CNG2B Kationenkanal umfasst oder eine Zelle oder Gewebe, die Kationenkanäle exprimiert, die ein entweder natürlich vorkommendes oder rekombinantes CNG2B-Polypeptid umfassen, zur Verfügung. In einer Ausführungsform stellt die Erfindung auf Festphasen basierte in vitro Assays in einem Hochdurchsatz-Format zur Verfügung, in dem ein CNG2B Kationenkanal an einem Festphasen-Substrat angebracht ist. In den Hochdurchsatzassays der Erfindung ist es möglich bis zu viele tausend verschiedene Modulatoren oder Liganden in einem einzelnen Tag zu screenen. Insbesondere kann jede Nocke einer Mikrotiterplatte verwendet werden, um einen separaten Assay gegen einen ausgewählten potentiellen Modulator laufen zu lassen, oder, falls Konzentrations- oder Inkubationszeiteffekte beobachtet werden sollen, könne alle 5-10 Nocken einen einzelnen Modulator testen. Somit kann eine einzelne Standard-Mikrotiterplatte ungefähr 100 (z.B. 96) Modulatoren testen. Wenn 1536 Nockenplatten verwendet werden, dann kann eine einzelne Platte leicht ungefähr 100- ungefähr 1500 verschiedene Verbindungen testen. Es ist möglich viele Platten pro Tag zu testen; Assayscreens für bis zu ungefähr 6,000, 20,000, 50,000 oder 100,000 oder mehr verschiedene Verbindungen sind mit den integrierten Systemen der Erfindung möglich.
Der interessierende Kanal, oder eine Zelle oder Membran, die den interessierenden Kanal umfasst, kann an die Festphasenkomponente, direkt oder indirekt über kovalente oder nicht kovalente Bindung, z.B. über einen Tag gebunden sein. Der Tag kann jede einer Vielzahl von Komponenten sein. Im Allgemeinen wird ein Molekül, das den Tag bindet (ein Tag-Binder) an einen festen Träger fixiert, und das getaggte interessierende Molekül wird an den festen Träger durch Interaktion des Tags und des Tag-Binders angebracht.
Eine Anzahl von Tags und Tag-Bindern kann verwendet werden, basierend auf den bekannten molekularen Interaktionen, die in der Literatur gut beschrieben sind. Zum Beispiel kann dort, wo ein Tag einen natürlicher Binder, zum Beispiel Biotin, Protein A oder Protein G besitzt, es in Verbindung mit geeigneten Tag-Bindern verwendet werden (Avidin, Streptavidin, Neutravidin, die Fc Region eines Immunoglobins etc.). Antikörper für Moleküle mit natürlichen Bindern wie Biotin sind auch häufig verfügbare und geeignete Tag-Binder; siehe SIGMA Immunochemicals 1998 Katalog SIGMA, St. Louis MO).
In ähnlicher Weise kann jede haptenische oder antigene Verbindung in Kombination mit einem geeigneten Antikörper verwendet werden, um ein Tag/Tag-Binder Paar zu bilden. Tausende von spezifischen Antikörpern sind kommerziell verfügbar und viele zusätzliche Antikörper werden in der Literatur beschrieben. Zum Beispiel ist einer häufigen Konfiguration der Tag ein erster Antikörper und der Tag-Binder ist ein zweiter Antikörper, der den ersten Antikörper erkennt. Zusätzlich zu den Antikörper-Antigen Interaktionen sind Rezeptor-Liganden Interaktionen auch als Tag und Tag-Binder Paare geeignet. Zum Beispiel, Agonisten und Antagonisten von Zellmembranrezeptoren (z.B., Zell-Rezeptor-Ligand Interaktionen wie Transferrin, c-kit, virale Rezeptorliganden, Zytokinrezeptoren, Chemokinrezeptoren, Interleukinrezeptoren, Immunoglobulinrezeptoren und Antikörper, die Cadherin Familie, die Integrin Familie, die Selectin Familie und ähnliche; siehe z.B. Pigott & Power, The Adhesion Molecule Facts Books (1993)). In ähnlicher Weise können Toxine und Tiergifte, virale Epitope, Hormone (z.B. Opiate, Steroide, etc.), intrazelluläre Rezeptoren (z.B., die die Effekte von zahlreichen kleinen Liganden vermitteln, einschließlich Steroiden, Thyroid-Hormonen, Retinoiden und Vitamin D; Peptiden), Wirkstoffen, Lectinen, Zuckern, Nukleinsäuren (sowohl lineare als auch zyklische Polymerkonfigurationen), Oligosaccharide, Proteine, Phospholipide und Antikörper alle mit zahlreichen Zellrezeptoren interagieren.
Synthetische Polymere, wie Polyurethane, Polyester, Polycarbonate, Polyharnstoffe, Polyamide, Polyethylenimine, Polyarylensulfide, Polysiloxane, Polyimide und Polyacetate können auch einen geeigneten Tag oder Tag-Binder bilden. Viele andere Tag/Tag-Binderpaare sind auch in den hier beschriebenen Assaysystemen nützlich, wie einem Fachmann nach Durchsicht dieser Offenbarung klar sein würde.
Übliche Linker wie Peptide, Polyether und ähnliche können auch als Tags dienen und schließen Polypeptidsequenzen, wie Poly-Gly-Sequenzen von zwischen ungefähr 5 bis 200 Aminosäuren ein. Solche flexiblen Linker sind den Fachleuten bekannt. Zum Beispiel sind Poly(ethelynglykol)Linker von Shearwater Polymers, Inc. Huntsville, Alabama verfügbar. Diese Linker besitzen optional Amidbindungen, Sulfhydrylbindungen oder heterofunktionale Bindungen.
Tag-Binder sind auf festen Substraten mit jeder einer Vielzahl von Verfahren, die gegenwärtig verfügbar sind, fixiert. Feste Substrate werden üblicherweise derivatisiert und funktionalisiert durch das Exponieren des ganzen oder einen Teils des Substrats gegenüber einem chemischen Reagenz, das eine chemische Gruppe auf der Oberfläche fixiert, die mit einem Teil des Tag-Binders reaktiv ist. Zum Beispiel würden Gruppen, die für die Anbringung an einen länger kettigen Teil geeignet sind, Amine, Hydroxyl-, Thiol- und Carboxyl-Gruppen einschließen. Aminoalkylsilane und Hydroxyalkylsilane können verwendet werden, um eine Vielzahl von Oberflächen, wie Glasoberflächen zu funktionalisieren. Die Konstruktion von solchen Festphasen-Biopolymerarrays wird in der Literatur gut beschrieben. Siehe, z.B., Merrifield, J Am. Chem. Soc. 85: 2149-2154 (1963) (der die Festphasensynthese von z.B. Peptiden beschreibt); Geysen et al., J. Immun. Meth. 102: 259-274(1987) (der die Festphasensynthese von Komponenten auf Nadeln beschreibt); Frank & Doring, Tetrahedron 44: 60316040 (1988) (der die Synthese von zahlreichen Peptidsequenzen auf Zellulosescheiben beschreibt); Fodor et al., Science, 251: 767-777 (1991); Sheldon et al., Clinical Chemistry 39 (4): 718-719 (1993); und Kozal et al., Nature Medicine 2 (7): 753759 (1996) (die alle Biopolymer-Arrays beschreiben, die auf festen Substraten fixiert werden). Nicht chemische Ansätze zum Fixieren von Tag-Bindern auf Substraten schließen andere übliche Verfahren, wie Hitze, Vernetzung durch UV Strahlung und ähnliche, ein.
VII. Computerunterstütztes Wirkstoffdesign mit CNG2B
Ein weiterer Assay für Verbindungen, die die Aktivitäten eines CNG2B Kanals modulieren, involviert das durch Computer unterstützte Wirkstoffdesign, bei dem ein Computersystem verwendet wird, um eine dreidimensionale Struktur von CNG2B zu erzeugen, das auf der strukturellen Information, die durch die Aminosäuresequenz kodiert wird, basiert. Die eingegebene Aminosäuresequenz interagiert direkt und aktiv mit einem vorgelegtem Algorithmus in einem Computerprogramm, um sekundäre, tertiäre und quaternäre Strukturmodelle des Proteins zu ergeben. Die Modelle der Proteinstruktur werden dann untersucht, um Strukturregionen zu identifizieren, die die Fähigkeit besitzen, beispielsweise Liganden oder andere Kationenkanaluntereinheiten zu binden. Diese Regionen werden dann verwendet, um Liganden zu identifizieren, die an das Protein oder der Region binden, an der CNG2B mit anderen Kationenkanalunterheiten interagiert.
Das dreidimensionale Strukturmodell des Proteins wird durch Eingabe von Kanalprotein-Aminosäuresequenzen von wenigstens 25, 50, 75, 100, 150 oder 200 Aminosäureresten oder entsprechenden Nukleinsäuresequenzen in das Computersystem erzeugt, die für ein CNG2B Monomer kodieren. Die Aminosäuresequenz jedes der Monomere wird aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1, konservativ modifizierten Versionen davon, und immunogenen Teilen davon ausgewählt. Die Aminosäuresequenz stellt die Primärsequenz oder Subsequenz jedes der Proteine dar, die die strukturelle Information des Proteins kodieren. Wenigstens 25, 50, 75, 100 oder 200 Reste der Aminosäuresequenz (oder einer Nukleotidsequenz, die wenigstens ungefähr 25, 50, 75, 100, 150 oder 200 Aminosäuren kodiert) werden in das Computersystem von Computertastaturen, Computer lesbaren Substraten, die einschließen, aber nicht beschränkt sind auf elektronische Speichermedien (z.B. magnetische Disketten, Bänder, Gerätschaften und Chips), optische Medien (z.B. CD ROM), Information, die über Internetseiten verteilt wird, und durch RAM eingegeben. Das dreidimensionale strukturelle Modell des Kanalproteins wird dann durch Interaktion der Aminosäuresequenz und des Computersystems mit Software, die den Fachleuten bekannt ist, erzeugt. Das resultierende dreidimensionale Computermodell kann dann auf einem Computer lesbaren Substrat aufbewahrt werden.
Die Aminosäuresequenz stellt eine Primärstruktur dar, die die Information kodiert, die notwendig ist, um die sekundäre, tertiäre und quaternäre Struktur des Monomers zu bilden und das heteromere Kationenkanalprotein, das vier Monomere umfasst. Die Software betrachtet bestimmte Parameter, die durch die Primärsequenz kodiert werden, um das Strukturmodell zu erzeugen. Diese Parameter werden als „Energiewerte" oder anisotropische Werte bezeichnet und beinhalten primäre elektrostatische Potentiale, flüssigkeitszugängliche Oberflächen und Wasserstoffbrückenbindungen. Sekundäre Energiewerte beinhalten van der Waals Potentiale. Biologische Moleküle bilden die Strukturen, die den Energiewert in einer kumulativen Weise minimieren. Das Computerprogramm verwendet daher dieser Werte, die durch die Primärstruktur oder Aminosäuresequenz kodiert werden, um das Sekundärstrukturmodell zu erzeugen. Die Tertiärstruktur des Proteins, das durch die Sekundärstruktur erzeugt wird, wird dann auf der Basis der Energiewerte der Sekundärstruktur gebildet. Der Verwender kann an diesem Punkt zusätzliche Variablen, wie ob das Protein membrangebunden oder löslich ist, seine Lokalisierung in dem Körper und seine zelluläre Lokalisierung, z.B. zytoplasmatisch, an der Oberfläche oder nuklear, eingeben. Diese Variablen zusammen mit den Energiewerten der Sekundärstruktur werden verwendet, um das Modell der Tertiärstruktur zu bilden. Beim Modellieren der Tertiärstruktur fügt das Computerprogramm einander entsprechende hydrophobe Oberflächen der Sekundärstruktur, und einander entsprechende hydrophile Oberflächen der Sekundärstruktur zusammen.
Sobald die Struktur erzeugt wurde, werden potentielle Ligandenbindungsregionen durch das Computersystem identifiziert. Dreidimensionale Strukturen für potentielle Liganden werden durch Eingabe der Aminosäure- oder Nukleotidsequenzen oder chemischer Formeln von Verbindungen, wie oben beschrieben, erzeugt. Die dreidimensionale Struktur des potentiellen Liganden wird dann mit dem des CNG2B Proteins verglichen, um Liganden zu identifizieren, die an CNG2B binden. Bindungsaffinität zwischen dem Protein und den Liganden wird mit Energiewerten bestimmt, um zu bestimmen, welche Liganden eine erhöhte Wahrscheinlichkeit besitzen, an das Protein zu binden. Computersysteme werden auch verwendet, um nach Mutationen, polymorphen Varianten, Allelen und Interspezies-Homologen von CNG2B Genen zu screenen. Solchen Mutationen können mit Krankheitszuständen assoziiert sein. Sobald die Varianten identifiziert wurden, können diagnostische Assays verwendet werden, um Patienten mit solchen mutierten Genen, die mit Krankheitszuständen assoziiert sind, zu identifizieren. Identifikation der mutierten CNG2B Gene involviert das Erhalten einer Eingabe einer ersten Nukleinsäure, z.B. SEQ ID NOS: 2-3, oder einer Aminosäuresequenz, die für CNG2B kodiert, z.B. SEQ ID NO: 1 und konservativ modifizierte Versionen davon. Die Sequenz wird in das Computersystem, wie oben beschrieben, eingegeben. Die erste Nukleinsäure oder Aminosäuresequenz wird mit einer zweiten Nukleinsäure oder Aminosäuresequenz verglichen, die wesentliche Identität mit der ersten Sequenz besitzt. Die zweite Sequenz wird in das Computersystem in der oben beschriebenen Weise eingegeben. Sobald die ersten und zweiten Sequenzen verglichen sind, werden Nukleotid- oder Aminosäuredifferenzen zwischen den Sequenzen identifiziert. Solche Sequenzen können allelische Unterschiede der CNG2B Gene darstellen, vorzugsweise der humanen CNG2B Gene, und Mutationen, die mit Krankheitszuständen assoziiert sind. Die oben beschriebenen ersten und zweiten Sequenzen können auf einem Computer lesbaren Substrat aufbewahrt werden. Nukeinsäuren, die für CNG26-Monomere kodieren, können zusammen mit hoch dichter Oligonnukleotid-Arraytechnologie verwendet werden (z. B. GeneChip^TM), um CNG2B Homologe, Orthologe, Allele, konservativ modifizierte Varianten und polymorphe Varianten in dieser Erfindung zu identifizieren. In dem Fall, in dem die identifizierten Homologe mit einer bekannten Krankheit in Verbindung stehen, können sie mit GeneChip^TM als einem diagnostischen Werkzeug zur Detektion der Krankheit in einer biologischen Probe verwendet werden, siehe z.B. Gunthand et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 14: 869-876 (1998); Kozal et al., Nat. Med. 2: 753-759 (1996); Matson et al., Anal. Biochem. 224: 110106 (1995); Lockhart et al., Nat. Biotechnol. 14:1675-1680 (1996); Gingeras et al., Genome Res. 8: 435-448(1998); Hacia et al., Nucleic Acids Res. 26: 3865-3866 (1998).
VIII. Zelluläre Transfektions- und Gentherapie
Die vorliegende Erfindung stellt die CNG2B Gene für die Transfektion von Zellen in vitro und in vivo bereit. Diese Nukleinsäuren können in jeden einer Anzahl von gut bekannten Vektoren für die Transfektion von Ziel-Zellen und Organismen, wie oben beschrieben, eingefügt werden. Die Nukleinsäuren werden, ex vivo und in vivo, über die Interaktion des Vektors und der Ziel-Zelle in Zellen transfiziert. Die Nukleinsäure für CNG2B exprimiert dann unter der Kontrolle eines Promotors einen CNG2B Monomer der vorliegenden Erfindung, wodurch die Effekte von nicht vorhandener, partieller Inaktivierung oder abnormaler Expression des CNG2B Gens abgeschwächt werden. Die Zusammensetzungen werden an einen Patienten in einer Menge verabreicht, die ausreichend ist eine therapeutische Reaktion in dem Patienten hervorzurufen. Eine Menge, die angemessen ist, dies zu erreichen, wird als „therapeutisch effektive Dosis oder Menge" definiert.
Solche Gentherapieprozeduren wurden verwendet, um erworbene und vererbte genetische Effekte, Krebs und virale Infektion in einer Anzahl von Kontexten zu korrigieren. Die Fähigkeit künstliche Gene in Menschen zu exprimieren, erleichtert die Prävention und/oder Heilung von vielen wichtigen menschlichen Krankheiten, einschließlich vieler Krankheiten, die nicht durch andere Therapien behandelbar sind (für eine Übersicht über die Gentherapieprozeduren, siehe Anderson, Science 256: 808-813 (1992); Nabel & Felgner, TIBTECH 11: 211-217 (1993); Mitani & Caskey, TIBTECH 11: 162-166 (1993); Mulligan, Science 926-932 (1993); Dillon, TIBTECH 11: 167-175 (1993); Miller, Nature 357: 455-460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6 (10): 1149-1154 (1998); Vigne, Restorative Neurology and NeuroScience 8: 35-36 (1995); Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1): 31-44 (1995); Haddada et al., in Current Topics in Microbiology and Immunology (Doerfler & Bohr Hrg., 1995); und Yu et al., Gene Therapy 1: 13-26 (1994)). Lieferung des Gens oder des genetischen Materials in die Zelle ist der erste Schritt bei der Gentherapiebehandlung von Krankheit. Eine große Anzahl von Lieferungsverfahren sind den Fachleuten gut bekannt. Vorzugsweise werden die Nukleinsäuren für in vivo oder in vitro Gentherapieverwendungen verabreicht. Nicht virale Vektor-Lieferungssysteme mit nicht-viralem Vektor schließen DNA Plasmide, nackte Nukleinsäure und Nukleinsäure, die mit einem Liefervehikel wie einem Liposom komplexiert ist, ein. Liefersysteme mit viralem Vektor schließen DNA und RNA Viren ein, die entweder episomale oder integrierte Genome nach Lieferung an die Zelle besitzen.
Verfahren zur nicht viralen Lieferung der Nukleinsäuren schließen Lipofection, Microinjektion, Biolistics, Virosomen, Liposomen, immunoliposomen, Polykation oder Lipid:Nukleinsäure-Konjugate, nackte DNA, künstliche Virionen und durch Agens verstärkte Aufnahme von DNA ein. Lipofection wird beschrieben in z.B. US Pat. Nr. 5,049,386 , US Pat. Nr. 4,946,787 ; und US Pat. Nr. 4,897,355 und Lipofectionsreagenzien werden kommerziell vertrieben (z.B. Transfectam^TM und Lipofectin^TM). Kationische und neutrale Lipide, die für effiziente Rezeptorerkennungs-Lipofection von Polynukleotiden geeignet sind, schließen diejenigen von Felgner ein, WO 91/17424 , WO 91/16024 . Lieferung kann an Zellen (ex vivo Verabreichung) oder Ziel-Gewebe sein (in vivo Verabreichung).
Die Präparation von Lipid:Nukleinsäurekomplexen, einschließlich anvisierter Liposome wie Immunolipidkomplexe, ist dem Fachmann gut bekannt (siehe z.B. Crystal, Science 270: 404-410 (1995); Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2: 291-297 (1995); Behr et al., Bioconjugate Chem. 5: 382-389 (1994); Remy et al., Bioconjugate Chem. 5: 647-654 (1994); Gao et al., Gene Therapy 2: 710-722 (1995); Ahmad et al., Cancer Res. 52: 4817-4820 (1992); U.S. Pat. Nr. 4,186,183 , 4,217,344 , 4,235,871 , 4,261,975 , 4,485,054 , 4,501,728 , 4,774,085 , 4,837,028 und 4,946,787 ). Die Verwendung von RNA oder DNA auf Virus-basierten Systemen für die Lieferung von Nukleinsäuren profitieren von den hoch evolvierten Prozessen des Zielings eines Virus zu spezifischen Zellen in dem Körper und das Wandern der viralen Ladung zu dem Nukleus. Virale Vektoren können direkt an Patienten (in vivo) verabreicht werden oder sie können verwendet werden, um Zellen in vitro zu behandeln, und die modifizierten Zellen werden an Patienten verabreicht (ex vivo). Konventionelle auf Virus basierte Systeme für die Lieferung von Nukleinsäuren können Retrovirus, Lentivirus, Adenovirus, Adeno-assoziierte und Herpes-simplex-Virusvektoren für den Gentransfer einschließen. Virale Vektoren sind gegenwärtig die effizientesten und vielseitigsten Verfahren für Gentransfer in Ziel-Zellen und Gewebe. Integration in das Wirtsgenom ist mit den Retrovirus, Lentivirus und Adeno-assoziierten Virusgentransferverfahren möglich, was oft in lang andauernder Expression des eingefügten Transgens resultiert. Zusätzlich wurden hohe Transduktionseffizienzen in vielen verschiedenen Zelltypen und Zielgeweben beobachtet.
Der Tropismus eines Retrovirus kann durch Einbauen von fremden Hüllproteinen geändert werden, was die potentielle Ziel-Population der Ziel-Zellen erweitert. Lentivirus-Vektoren sind retrovirale Vektoren, die in der Lage sind, nicht teilende Zellen zu transduzieren oder zu infizieren, und produzieren typischerweise hohe Titer. Die Auswahl eines retroviralen Gentransfersystems würde daher von dem Ziel-Gewebe abhängen. Retrovirale Vektoren sind aus cis-wirkenden langen terminalen Wiederholsequenzen (LTRs) mit einer Packungskapazität für bis zu 6-10 kb der fremden Sequenz zusammengesetzt. Die Minimum cis-wirkenden LTRs sind ausreichend für die Replikation und das Verpacken der Vektoren, die dann verwendet werden, um das therapeutische Gen in die Ziel-Zelle zu integrieren, um permanente Transgenexpression bereitzustellen. Häufig verwendete retrovirale Vektoren schließen diejenigen ein, die auf Murine Leukemia Virus (MuLV), Gibbon Ape Leukemia Virus (GaLV), Simian Immunodeficiency Virus (SIV), Humanem Immundefizenz Virus (HIV), und Kombinationen davon basieren (siehe z.B. Buchscher et al., J Virol. 66: 2731-2739 (1992); Johann et al., J. Virol. 66: 1635-1640 (1992); Sommerfelt et al., Virol. 176: 58-59 (1990); Wilson et al., J. Virol. 63: 2374-2378 (1989); Miller et al., J. Virol. 65: 2220-2224 (1991); PCT/US94/05700 ).
In Anwendungen, in denen transiente Expression der Nukleinsäure bevorzugt ist, werden auf Adenovirus basierende Vektoren typischerweise verwendet. Auf Adenovirus basierende Systeme sind zu sehr hoher Transduktionseffizienz in vielen Zelltypen in der Lage und benötigen keine Zellteilung. Mit solchen Vektoren wurden hohe Titer und Expressionslevels erreicht. Dieser Vektor kann in großen Mengen in einem relativ einfachen System produziert werden. Adeno-assoziierte Virusvektoren („AAV") werden auch verwendet, um Zellen mit Ziel-Nukleinsäuren zu transduzieren, z.B. bei der in vitro Produktion von Nukleinsäuren und Peptiden, und für in vivo und ex vivo Gentherapieprozeduren (siehe z.B. West et al., Virology 160: 38-47 (1987); U.S. Patent Nr. 4,797,368 ; WO 93/24641 ; Kotin, Human Gene Therapy 5: 793-801 (1994); Muzyczka, J. Clin. Invest. 94: 1351 (1994)) verwendet werden. Die Konstruktion von rekombinanten AAV-Vektoren wurde in einer Anzahl von Publikationen beschrieben, einschließlich U.S. Pat. No. 5,173,414 ; Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5: 3251-3260 (1985); Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 4: 2072-2081 (1984); Hermonat & Muzyczka, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 81: 6466-6470 (1984); und Samulski et al., J. Virol. 63: 03822-3828 (1989).
Bei vielen Gentherapieanwendungen ist es wünschenswert, dass der Gentherapievektor mit einem hohen Grad an Spezifität an einen bestimmten Zelltyp geliefert wird. Ein Virusvektor wird typischerweise so modifiziert, dass er eine Spezifität für einen bestimmten Zelltyp durch Expression eines Liganden als ein Fusionsprotein mit einem viralen „Coat"-Protein auf den Viren der äußeren Oberfläche besitzt. Der Ligand wird so gewählt, dass er eine Affinität für einen Rezeptor besitzt, von dem man weiß, dass er auf dem interessierenden Zelltyp vorliegt. Zum Beispiel Han et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 92: 9747-9751 (1995), berichteten, dass "Moloney murine leukaemia virus" modifiziert werden kann, humanes Heregulin zu exprimieren, das mit gp70 fusioniert ist, und der rekombinante Virus infiziert bestimmte humane Brustkrebszellen, die „human epidermal growth factor receptor" exprimieren. Dieses Prinzip kann auf andere Paare von Virus, das ein Ligandenfusionsprotein exprimiert, und Zielzelle, die einen Rezeptor exprimiert, ausgedehnt werden. Zum Beispiel können filamentöse Phagen konstruiert werden, Antikörperfragmente (z.B. FAB oder Fv) mit spezifischer Bindungsaffinität für praktisch jeden gewählten zellulären Rezeptor darzubieten. Obwohl die obige Beschreibung primär auf virale Vektoren zutrifft, können die gleichen Prinzipien auch auf nicht virale Vektoren angewendet werden. Solche Vektoren könne so konstruiert werden, dass sie spezifische Aufnahmesequenzen enthalten, von denen man annimmt, dass sie die Aufnahme durch spezifische Ziel-Zellen befördern.
Gentherapievektoren können in vivo durch Verabreichung an einen individuellen Patienten verabreicht werden, typischerweise durch systemische Verabreichung (z.B. intravenöse, intraperitonael, intramuskuläre, subdermale oder intracraniale Infusion) oder topische Applikation, wie unten beschrieben wird. Alternativ können Vektoren an Zellen ex vivo geliefert werden, wie Zellen, die aus einem individuelle Patienten explantiert wurden (z.B. Lymphozyten, Knochenmarkaspirate, Gewebebiopsie) oder Universaldonor hämatopoetische Stammzellen, gefolgt von Reimplantation der Zellen in einen Patienten, gewöhnlich nach Selektion auf Zellen, die den Vektor inkorporiert haben.
Ex vivo Zelltransfektion für Diagnose, Forschung oder für Gentherapie (z.B. über Reinfusion der transfizierten Zellen in den Wirtsorganismus) ist den Fachleuten gut bekannt. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Zellen aus dem Subjekts-Organismus isoliert, mit einer Nukleinsäure (Gen oder cDNA) transfiziert, und in den Subjekts-Organismus zurück infundiert (z.B. einem Patienten). Zahlreiche Zelltypen, die für die die ex vivo Transfektion geeignet sind, sind den Fachleuten gut bekannt (siehe z.B. Freshney et al. Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique (3te A. 1994)) und die darin zitierten Fundstellen für eine Diskussion über das Wie des Isolierens und Kultivierens von Zellen aus Patienten).
Vektoren (z.B. Retroviren, Adenoviren, Liposomen etc.), die therapeutische Nukleinsäuren enthalten, können auch direkt an den Organismus zur Transduktion der Zellen in vivo verabreicht werden. Alternativ kann nackte DNA verabreicht werden. Verabreichung erfolgt über jede der Routen, die normalerweise für das letztliche In-Kontakt-Bringen eines Moleküls mit Blut oder Gewebezellen verwendet werden. Geeignete Verfahren zum Verabreichen solcher Nukleinsäuren sind verfügbar und den Fachleuten wohl bekannt und, obwohl mehr als eine Route verwendet werden kann, um eine bestimmte Zusammensetzung zu verabreichen, kann eine bestimmte Route oft eine unmittelbarere und effektivere Reaktion als eine andere Route bewirken.
Verabreichung erfolgt über jede der Routen, die normalerweise für das letztliche In-Kontakt-Bringen eines Moleküls mit Blut oder Gewebezellen verwendet werden. Die Nukleinsäuren werden auf jede geeignete Weise verabreicht, vorzugsweise zusammen mit pharmazeutisch verträglichen Trägern. Geeignete Verfahren zum Verabreichen solcher Nukleinsäuren sind verfügbar und den Fachleuten bekannt, und, obwohl mehr als eine Route verwendet werden kann, um eine bestimmte Zusammensetzung zu verabreichen, kann eine bestimmte Route oft eine unmittelbarere und effektivere Reaktion als eine andere Route bewirken.
IX. Pharmazeutische Zusammensetzungen und Verabreichung
Pharmazeutisch verträgliche Träger werden zum Teil durch die jeweilige Zusammensetzung, die verabreicht wird, bestimmt (z.B. Nukleinsäure, Protein, modulatorische Verbindungen oder transduzierte Zelle), wie auch durch das jeweilige Verfahren, das verwendet wird, um die Zusammensetzung zu verabreichen. Entsprechend gibt es eine breite Vielzahl von geeigneten Formulierungen von pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung (siehe z.B. Remington's Pharmaceutical Sciences, 17te A., 1989). Verabreichung kann auf jede annehmbare Weise vorgenommen werden, z.B. durch Injektion, orale Verabreichung, Inhalierung oder transdermale Anwendung.
Formulierungen, die für orale Verabreichung geeignet sind, können bestehen aus (a) flüssigen Lösungen, wie einer effizienten Menge der verpackten Nukleinsäure, die in Verdünnungsmitteln suspendiert ist, wie Wasser, Kochsalzlösung oder PEG 400; (b) Kapseln, Päckchen oder Tabletten, wobei jede eine vorbestimmte Menge des aktiven Inhaltsstoffes enthält, wie Flüssigkeiten, Feststoffen, Granulat oder Gelatine; (c) Suspensionen in einer geeigneten Flüssigkeit und (d) geeignete Emulsionen. Tablettenformen können eine oder mehrere von Lactose, Saccharose, Mannitol, Sorbitol, Kalziumphosphat, Maisstärke, Kartoffelstärke, mikrokristalline Zellulose, Gelatine, kolloidales Siliziumdioxid, Talk, Magnesiumstearat, Stearinsäure und andere Auszüge, Farbstoffe, Füllstoffe, Binder, Verdünnungsmittel, Pufferagenzien, Befeuchtungsagenzien, Präservative, Geschmacksstoffe, Farbstoffe, Zersetzungsagenzien und pharmazeutische verträgliche Träger enthalten. Rautenformen können den aktiven Inhaltsstoff in einem Geschmacksstoff, z.B. Saccharose umfassen, wie auch Pastillen den aktiven Inhaltsstoff in einer inerten Base, wie Gelatine und Glyzerin oder Saccharose und Akazienemulsionen, Gelen und ähnliche umfassen, die zusätzlich zu dem aktiven Inhaltsstoff in der Technik bekannte Träger enthalten.
Die Verbindung der Wahl kann alleine oder in Kombination mit anderen geeigneten Komponenten als Aerosol-Formulierungen hergestellt werden (d.h. sie können „vernebelt" werden), um über Inhalation verabreicht zu werden. Aerosol-Formulierungen können mit akzeptablen Treibmitteln verdichtet werden, wie Dichlorodifluoromethan, Propan, Stickstoff und ähnlichen.
Formulierungen, die für parenterale Verabreichung, wie zum Beispiel durch intraartikuläre (in die Gelenke), intravenöse, intramuskuläre, intradermale, intraperitonale und subkutane Routen geeignet sind, beinhalten wässrige und nicht wässrige, isotonische sterile Injektionslösungen, die Antioxidantien, Puffer, Bakteriostatika und gelöste Stoffe enthalten können, die die Formulierung mit dem Blut des beabsichtigten Rezipienten isotonisch machen, und wässrige und nicht wässrige Lösungen sterile Suspensionen, die Suspendierungsmittel, Lösungsmittel, Verdickungsmittel, Stabilisierungsmittel und Präservative beinhalten können. Bei der Ausübung dieser Erfindung können Zusammensetzungen verabreicht werden zum Beispiel durch intravenöse Infusion, oral, topisch, intraperitonal, intravesical oder intrathecal. Parenterale Verabreichung und intravenöse Verabreichung sind die bevorzugten Verfahren der Verabreichung. Die empfohlenen Formulierungen können als versiegelte Eindosis oder Mehrdosis-Behälter, wie Ampullen oder Röhrchen, präsentiert werden.
Injektionslösungen und Suspensionen können aus sterilen Pudern, Granulat und Tabletten der zuvor beschriebenen Art hergestellt werden. Durch Nukleinsäure für ex vivo Therapie transduzierte Zellen können auch intravenös oder parenteral verabreicht werden, wie zuvor beschrieben. Die an einen Patienten verabreichte Dosis sollte im Kontext der vorliegenden Erfindung ausreichend sein, um eine vorteilhafte therapeutische Reaktion in dem Patienten mit der Zeit zu bewirken. Die Dosis wird durch die Effizienz des jeweiligen eingesetzten Vektors und dem Zustand des Patienten bestimmt werden, wie auch durch das Körpergewicht oder die Oberflächenregion des zu behandelnden Patienten. Die Größe der Dosis wird auch das Vorhandensein, die Natur und das Ausmaß jeglicher nachteiliger Nebenwirkungen bestimmen, die mit der Verabreichung eines bestimmten Vektors oder transduzierten Zelltyps in einem bestimmten Patienten einhergehen. Bei der Bestimmung der wirksamen Menge des Vektors, der bei der Behandlung oder Prophylaxe von Zuständen verabreicht werden wird, die auf die verringerte oder falsche Expression der CNG-Kanäle zurückzuführen ist, die eine CNG2B Untereinheit umfassen, bewertet der Arzt die zirkulierenden Plasmamengen des Vektors, Vektortoxizitäten, Fortschritt der Krankheit und die Produktion von Anti-Vektor Antikörpern. Im Allgemeinen ist das Dosisäquivalent einer nackten Nukleinsäure eines Vektors ungefähr 1 μg bis 100 μg für einen typischen 70 Kilogramm schweren Patienten, und die Dosen von Vektoren, die einen Retrovirus-Partikel enthalten, werden so berechnet, dass sie eine äquivalente Menge von therapeutischer Nukleinsäure ergeben.
Für die Verabreichung können Verbindungen und transduzierte Zellen der vorliegenden Erfindung bei einer Rate verabreicht werden, die dem LD-50 des Inhibitors, Vektors oder transduzierten Zelltyps und der Nebenwirkungen des Inhibitors, Vektors, oder Zelltyps bei verschiedenen Konzentrationen, wie sie der Masse und dem Gesamtgesundheitszustand des Patienten angemessen sind. Verabreichung kann über einzelne oder aufgeteilte Dosen erreicht werden.
X. Kits
Humanes CNG2B und seine Homologe sind nützliche Werkzeuge zum Untersuchen der Expression und Regulation von Kationenkanälen. Humane CNG2B spezifische Reagenzien, die spezifisch an CNG2B Nukleinsäure hybridisieren, wie CNG2B Sonden und Primer, und CNG2B spezifische Reagenzien, die spezifisch an das CNG2B Protein binden, z.B., CNG2B Antikörper werden verwendet, um Expression und Regulation zu untersuchen.
Nukleinsäureassays für das Vorliegen von CNG2B DNA und RNA in einer Probe beinhalten zahlreiche Techniken, die den Fachleuten wohl bekannt sind, wie Southern-Analyse, Northern-Analyse, Dot-Blots, RNase Schutz, S1 Analyse, Amplifikationstechniken wie PCR und LCR und in situ Hybridisierung. Bei der in situ Hybridisierung wird zum Beispiel die Ziel-Nukleinsäure aus ihrer zellulären Umgebung freigesetzt, so dass sie für Hybridisierung innerhalb der Zelle verfügbar ist, während die zelluläre Morphologie für nachfolgende Interpretation und Analyse bewahrt wird. Die folgenden Artikel stellen einen Überblick über die Technik der in situ Hybridisierung zur Verfügung: Singer et al., Biotechniques 4: 230250 (1986); Haase et al., Methods in Virology, Vol. VII, S. 189-226 (1984); und Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach (Harnes et al., Hrg. 1987). Zusätzlich kann CNG2B Protein mit den zahlreichen oben beschriebenen immunoassay-Techniken detektiert werden. Die Testprobe wird typischerweise sowohl mit einer positiven Kontrolle (z.B. einer Probe, die rekombinanten CNG2B-Monomere exprimiert) als auch einer negativen Kontrolle verglichen.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Kits zur Verfügung zum Screenen nach Modulatoren der Kationenkanäle der Erfindung. Solche Kits können auch aus problemlos verfügbaren Materialien und Reagenzien hergestellt werden. Zum Beispiel können solche Kits jedes oder mehr der folgenden Materialien enthalten: CNG2B-Monomere, Reaktionsröhrchen und Instruktionen zum der Testen der Aktivitäten der Kationenkanäle, die CNG2B enthalten. Eine große Vielzahl von Kits und Komponenten können gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, abhängig von dem voraussichtlichen Verwender des Kits und den speziellen Anforderung des Verwenders. Zum Beispiel kann der Kit für in vitro oder in vivo Assays zum Messen der Aktivität eines Kationenkanals, der einen CNG2B Monomer enthält, ausgelegt werden.
Beispiele
Die folgenden Beispiele werden nur zum Zwecke der Illustration bereitgestellt und nicht zum Zwecke der Einschränkung. Die Fachleute werden leicht eine Vielzahl von nicht-kritischen Parametern erkennen, die geändert und modifiziert werden können, um im Wesentlichen ähnliche Ergebnisse zu ergeben.
A. Identifikation von humanem CNG2B
Multiple Exons von humanem CNG2B wurden aus öffentlichen genomischen Daten identifiziert (Zugangsnummern AC022762 und AC021935) mit den TBLASTN Recherchen mit Sequenzen für Kanalproteinen, die durch zyklische Nukleotide gesteuert werden. Die 5' und 3' Exons der CNG2B kodierenden Sequenz konnten durch diese Recherchen nicht identifiziert werden. Oligonukleotide, die auf den AC022762 und AC021935 Sequenzen basierten, wurden entworfen, um eine Vollängen-CNG2B cDNA zu klonieren.
Eine Bande von ungefähr 657 bp wurde aus Erststrang-cDNA amplifiziert, die aus humanem Gehirn präpariert worden war, was die Expression im zentralen Nervensystem belegte. Die Oligos, die verwendet wurden, um diese Bande zu amplifizieren waren (1) 5'-GCAGATCTTCCAGAACTGTAAGGCCA (SEQ ID NO: 14) (Sense) und (2) 5'-CCTGCCCTCTTCATCTTTGGAAGTTC (SEQ ID NO: 5) (Antisense). Das vollständige 3'-Ende von CNG26 wurde durch Standard 3' RACE PCR Techniken für humane Gehirn-cDNA in zwei aufeinander folgenden Runden amplifiziert. In der ersten Runde war der verwendete Gen spezifische Primer (3) 5'-GCCAACATCAAGAGCCTAGGTTATTC (SEQ ID NO: 6) (Sense). Diese Reaktion wurde dann mit einem verschachtelten Gen spezifischen Oligo (4) 5'-GGATGATCTACAGACCAAGTTTGCTCG (SEQ ID NO: 7) (Sense) reamplifiziert, um ein Fragment von ungefähr 765 bp Länge zu produzieren, bei dem nach Sequenzierung gefunden wurde, dass es das vollständige 3' Ende der humanen CNG2B mRNA einschließt. Die Sequenz dieses Fragments überlappte mit dem originalen 657 bp CNG2B Fragment, um eine zusammenhängende Sequenz zur Verfügung zu stellen. Der größte Teil des 5' Endes der CNG2B kodierenden Sequenz wurde aus humaner Gehirn-cDNA mit einem degenerierten Sense-Strang Oligo amplifiziert, der auf der N-terminalen Aminosäuresequenz von Ratten OCNC2 Protein basierte ((5) 5'-ATGAGCCAGGACGGNAARGTNAARAC (SEQ ID NO: 15)), und einem Antisense-Primer, der für humanes CNG2B spezifisch ist ((6) 5'-GTTGATGATGCTGATCTCCCCAAAG (SEQ ID NO: 9)). Diese Reaktion produzierte ein Fragment von ungefähr 1.2 Kb mit einer Sequenz, die der von Ratte OCNC2 hoch-homolog ist. Zwei Runden von Standard-5' RACE PCR wurden dann verwendet, um die 5'-kodierende Sequenz von humanem CNG2B zu vervollständigen und das Initiator Methionin-Codon zu identifizieren. Das CNG2B spezifische Oligo (7) 5'-GGATGATGAGGTTATACATGACTGGG (SEQ ID NO: 10) (Antisense) wurde in der ersten Runde von RACE PCR verwendet. Diese Reaktion wurde dann mit einem verschachtelten Gen spezifischen Oligo (8) 5'-AGGCTAGCAACTTCCTGGCCTTGGAT (SEQ ID NO: 11) (Antisense) reamplifiziert. Ein ungefähr 410 bp langes Fragment, das das vollständige 5' Ende von CNG2B enthielt, wurde isoliert. Dieses Fragment überlappte mit dem oben beschriebenen 1.2 Kb PCR-Fragment. Die gesamte zusammenhängende kodierende Region der CNG2B mRNA wurde durch Zusammenbau dieser zwei Fragmente mit dem originalen internen 657 bp Fragment und dem 765 bp 3' RACE Produkt bestimmt.
Die gesamte kodierende Region von humanem CNG26 wurde dann in einem einzelnen Fragment mit Oligonukleotiden isoliert, die mit den Enden der CNG2B kodierenden Sequenz überlappten. Die verwendeten Oligonukleotide waren (9) 5'-GCGAAAGCTTCCACCATGAGCCAGGACACCAAAGTG (SEQ ID NO: 12) (Sense) und (10) 5'-CATGTCTAGAATGGGGATGGGGTCACTCTGGACCT (SEQ ID NO: 13) (Antisense). Das erste Oligonukleotid beinhaltet das Initiator-Methionin und die ersten 21 kodierenden Nukleotide des CNG2B Gens. Stromaufwärts sind eine HindIII Restriktionsenzymstelle zum Subklonieren in Plasmidvektoren und eine Kozak „Consensus"-Sequenz, um die Translation zu verstärken. Alle Nukleotide, die CNG2B entsprechen, sind fett gedruckt. Das zweite Oligonukleotid ist von der 3'Sequenz von CNG2B und beinhaltet eine Xbal Restriktionsenyzmstelle zum Subklonieren. Alle Nukleotide in Fettdruck entsprechen der Sequenz des 3'-Endes von CNG2B. Das Stopcodon ist unterstrichen. Es wichtig zu bemerken, dass nur die Nukleotide, die in Fettdruck von den zwei obigen Oligos sind, notwendig für die Amplifikation von CNG2B sind. Das bevorzugte Template für die Amplifikation ist Erststrang-cDNA aus dem humanem Gehirn. Die verwendeten Amplikationsbedingungen waren wie folgt: 24 Zyklen von 95°C für 15 Sekunden, 72-60°C für 15 Sekunden (die Temperatur fiel um 0.5°C in jedem auf einander folgendem Zyklus), 72°C für 3 Minuten, gefolgt von 20 Zyklen von 95°C für 15 Sekunden, 60°C für 15 Sekunden und 72°C für 3 Minuten. Eine ungefähr 1.73 Kb Bande, die der gesamten kodierenden Region von CNG2B entsprach, wurde erhalten und durch Sequenzieren bestätigt.
Das vorausgesagte Molekulargewicht des humanen CNG2B Proteins ist ungefähr 66 KD, mit einem Bereich von ungefähr 60 Kd-80 Kd, vorzugsweise ungefähr 61-71 Kd.
A. Vergleich von humanem CNG2B mit anderen CNG-Genen
Ein Anlagerung der abgeleiteten Sequenz von CNG2B mit Ratten OCNC2 (Bradley, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91, 8890-8894, 1994) ist in 1 gezeigt. Die Aminosäuresequenzen von humanem CNG2B und Ratten OCNC2 sind zu 93% identisch, was anzeigt, dass sie wahrscheinlich orthologe Gene sind. Ein zusätzlicher Beleg, der diese Idee unterstützt, ist, dass humanes CNG26 viel homologer mit Ratten OCNC2 ist, als jeder der anderen klonierten CNG-Kanäle. Die meisten der Unterschiede zwischen den zwei Aminosäuresequenzen sind an den Amino- und Carboxyl-Termini geclustert. Humanes CNG2B und Ratten OCNC2 sind zu weniger als 90% auf dem Nukleinsäurelevel identisch.
Das humane CNG2B Gen scheint mit dem Ratten-OCNC2-Gen ortholog zu sein, was nahe legt, das es einer ähnlichen funktionalen Rolle dient. Ein Argument für diese Idee ist unser Beleg für Expression von humanem CNG2B in dem Gehirn, in dem es eine weit verbreitete Expression von Ratten-OCNC2 gibt (Kingston, et al., Synapse 32: 1-12 (1999)). Das Ratten-OCNC2-Gen wurde ursprünglich als eine Beta-Untereinheit klassifiziert, da es funktional gegenüber zyklischen Nukleotiden nicht sensitiv ist, wenn es als ein Homomultimer exprimiert wird (Bradley, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 91: 8890-8894 (1994)). Stattdessen wurde gezeigt, dass es funktionale heteromultimere Kanäle mit der Ratten OCNC1 Alpha-Untereinheit bildet, die an der olfaktorischen Transduktion teilnimmt (Bradley, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 91: 8890-8894 (1994)). Diese heteromultimeren Alpha- und Beta-Kanäle zeigten erhöhte Sensitivität gegenüber cAMP, was dem nativen CNG olfaktorischen Kanal sehr ähnlich ist (Linman, et al., Neuron 13: 611-621 (1994)). Jedoch haben andere Studien gezeigt, dass funktionale homomere Ratten-OCNC2-Kanäle in dem Gehirn existieren können und dass sie gegenüber Stickoxid sensitiv sind (Broillet, et al., Neuron 18: 951-958 (1997)). Dieser Befund, zusammen mit der weiten Verteilung von Ratten-OCNC2 über das Gehirn und seiner hohen Permeabilität für Ca²⁺ legen nahe, dass diese Kanäle ein Rolle bei der neuronalen Signalgebung und der synaptischen Plastizität spielen können (Bradley, et al., JNC 17: 1993-2005 (1997)). Die Fähigkeit von Ratten-OCNC2, funktionale homomultimere Kanäle zu bilden, ist konsistent mit der Tatsache, dass es eine größere Homologie mit CNG Alpha-Untereinheiten teilt als mit CNG Beta-Untereinheiten. Ratten-OCNC2 und humanes CNG2B sind somit wahrscheinlich sowohl als Heteromultimere als auch als Homomultimere funktional bedeutsam. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isolierte Nukleinsäure, die für ein eine Untereinheit eines Kationenkanals umfassendes Polypeptid kodiert, wobei das Polypeptid: (i) mit wenigstens einer Alpha-Untereinheit eines durch zyklische Nukleotide gesteuerten Kationenkanals (CNG) einen durch zyklische Nukleotide gesteuerten Kationenkanal bildet, und (ii) die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 umfasst.
Nukleinsäure nach Anspruch 1, wobei die Nukleinsäure die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 3 umfasst.
Isolierte Nukleinsäure, die für ein CNG2B-Polypeptid eines durch zyklische Nukleotide gesteuerten Kationenkanals kodiert, wobei die Nukleinsäure die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 3 umfasst oder für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 umfasst.
Expressionsvektor, der die Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 umfasst.
Wirtszelle, die mit dem Vektor gemäß Anspruch 4 transfiziert ist.
Isoliertes Polypeptid, das eine Untereinheit eines Kationenkanals umfasst, wobei das Polypeptid: (i) mit wenigstens einer Alpha-Untereinheit eines durch zyklische Nukleotide gesteuerten Kationenkanals (CNG) einen durch zyklische Nukleotide gesteuerten Kationenkanal bildet, und (ii) die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 umfasst.
Polypeptid nach Anspruch 6, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 besitzt.
Polypeptid nach Anspruch 6, das ein Molekulargewicht zwischen ungefähr 61 kD bis ungefähr 71 kD besitzt.
Polypeptid nach Anspruch 6, das eine Alpha-Untereinheit eines heteromeren, durch zyklische Nukleotide gesteuerten Kationenkanals umfasst.
In-vitro-Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, welche den Ionenfluss durch einen Kationenkanal steigert oder vermindert, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (i) In-Kontakt-Bringen der Verbindung mit dem Polypeptid gemäß Anspruch 6, und (ii) Bestimmen der funktionellen Wirkung der Verbindung auf den Kationenkanal.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Polypeptid rekombinant ist.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei der Kationenkanal homomultimer oder heteromultimer ist.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Polypeptid die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 besitzt.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Polypeptid in einer eukaryontischen Wirtszelle oder Zellmembran exprimiert wird.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die funktionelle Wirkung eine physikalische oder chemische Wirkung ist.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die funktionelle Wirkung durch Messung der Ligandenbindung an den Kationenkanal bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die funktionelle Wirkung durch Messung des Ionenflusses, Veränderungen der Ionenkonzentrationen, Veränderungen des Stroms oder Veränderungen der Spannung bestimmt wird.