DE60113660T2

DE60113660T2 - G-protein gekoppelter rezeptor

Info

Publication number: DE60113660T2
Application number: DE60113660T
Authority: DE
Inventors: Scott Powers; Jianxin Yang; Gene Cutler
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 2000-03-14
Filing date: 2001-03-13
Publication date: 2006-07-06
Anticipated expiration: 2021-03-14
Also published as: AU4567501A; AU2001245675B2; DE60113660D1; IL151687A0; WO2001068704A2; DK1263787T3; EP1263787A2; CN1422281A; EP1263787B1; WO2001068704A3; US7084259B2; ATE305480T1; US20040029232A1; ES2250369T3; CA2402940A1; NZ521946A; JP2003528599A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung stellt isolierte Nukleinsäure- und Aminosäuresequenzen von vier neuen G-Protein-gekoppelten Rezeptoren, die in Brustkrebszellen amplifiziert sind, Antikörper für solche Rezeptoren, Verfahren zum Nachweisen solcher Nukleinsäuren und Rezeptoren und Verfahren zum Screenen auf Modulatoren von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren bereit.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
G-Protein-gekoppelte Rezeptoren sind Zellenoberflächenrezeptoren, die extrazelluläre Signale indirekt zu stromabwärts liegenden Effektoren transduzieren, die intrazelluläre Signalisierungsproteine, -enzyme oder -kanäle sein können, und Änderungen in der Aktivität dieser Effektoren dann anschließende Zellenereignisse vermitteln. Die Wechselwirkung zwischen dem Rezeptor und dem stromabwärts liegenden Effektor wird durch ein G-Protein, ein heterotrimeres Protein, das GTP bindet, vermittelt. G-Protein-gekoppelte Rezeptoren ("GPCRs") weisen typischerweise sieben Transmembranbereiche zusammen mit einer extrazellulären Domäne und einem zytoplasmatischen Ende am C-Ende auf. Diese Rezeptoren bilden eine große Superfamilie von verwandten Rezeptormolekülen, die bei vielen Signalisierungsprozessen eine Schlüsselrolle spielen, wie z.B. sensorische und Hormonsignaltransduktion. Eine große Familie von olfaktorischen GPCRs wurde beispielsweise identifiziert (siehe z.B. Buck & Axel, Cell 65:175–187 (1991)). Die weitere Identifikation von GPCRs ist zum Verstehen des normalen Prozesses der Signaltransduktion und ebenso seiner Beteiligung an pathologischen Prozessen wichtig. GPCRs können beispielsweise für die Krankheitsdiagnose sowie für die Arzneimittelentdeckung verwendet werden. Die weitere Identifikation von neuen GPCRs ist daher von großem Interesse.
Eine Veröffentlichung von Carmeci et al. offenbart Details eines Gens für GPR30, ein solches Gen weist eine Homologie zur G-Protein-gekoppelten Rezeptorsuperfamilie auf, die der Östrogenrezeptorexpression in Brustkrebs zugeordnet ist. Der darin offenbarte G-Protein-gekoppelte Rezeptor ist jedoch von dem verschieden, der in der vorliegenden Anmeldung identifiziert wird.
Alle Bezugnahmen auf SEQ ID NRN. 1, 2, 3, 4, 7 und 8 innerhalb der Beschreibung werden nur für Informationszwecke gemacht und sollen nicht in den Schutzbereich der beanspruchten Erfindung fallen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt somit zum ersten Mal vier neue Nukleinsäuren bereit, die G-Protein-gekoppelte Rezeptoren codieren, die in Brustkrebszellen amplifiziert und/oder überexprimiert sind. Diese Nukleinsäuren und die Polypeptide, die sie codieren, werden als "in Brustkrebs amplifizierte G-Proteingekoppelte Rezeptoren" oder "BCA-GPCRs", d.h. "BGA-GPCR-1 ", "BCA-GPCR-2", "BCA-GPCR-3" und "BCA-GPCR-4", bezeichnet. Diese BCA-GPCRs sind Komponenten von Signaltransduktionswegen in Zellen und können zur Diagnose von Krebs, insbesondere Brustkrebsen, sowie in Screeningtests für therapeutische Verbindungen, z.B. für die Behandlung von Krebs, verwendet werden. Antikörper für und Antagonisten von BCA-GPCR-3 können beispielsweise als Krebstherapeutika verwendet werden.
In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine isolierte Nukleinsäure bereit, die ein Polypeptid codiert, wobei das durch die Nukleinsäure codierte Polypeptid mehr als 70% Aminosäureidentität mit einer Aminosäuresequenz von SEQ ID NR.: 6 umfaßt.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine isolierte Nukleinsäure bereit, die ein Polypeptid codiert, wobei die Nukleinsäure unter stringenten Hybridisierungsbedingungen spezifisch mit einer Nukleinsäure mit einer Nukleotidsequenz von SEQ ID NR.: 5 hybridisiert.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine isolierte Nukleinsäure bereit, die ein Polypeptid codiert, wobei das durch die Nukleinsäure codierte Polypeptid mehr als etwa 70% Aminosäureidentität mit einem Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz von SEQ ID NR.: 6 umfaßt, wobei die Nukleinsäure selektiv unter mäßig stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer Nukleotidsequenz von SEQ ID NR.: 5 hybridisiert.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen Expressionsvektor mit einer isolierten Nukleinsäure, die ein Polypeptid der Erfindung codiert, und eine Wirtszelle mit dem Expressionsvektor bereit.
In einem Ausführungsbeispiel umfaßt die Nukleinsäure eine Nukleotidsequenz von SEQ ID NR.: 5. In einem weiteren Ausführungsbeispiel stammt die Nukleinsäure von einem Menschen, einer Maus oder einer Ratte. In einem weiteren Ausführungsbeispiel ist die Nukleinsäure durch Primer amplifiziert, die unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit derselben Sequenz wie Primersätze spezifisch hybridisieren, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus folgendem besteht:
ATGTTGGGGAACGTCGCCATC (SEQ ID NR.: 9) und
TCATCCACAGAGCCTCCAGAT (SEQ ID NR.: 10);
ATGGGAAAGGACAATCCAGTT (SEQ ID NR.: 11) und
CTAAGAGAGTAACTCCAGCAA (SEQ ID NR.: 12);
ATGGAAATAGCCAATGTGAGTTC (SEQ ID NR.: 13) und
TAAATTTGCGCCAGCTTGCCTG (SEQ ID NR.: 14); und
ATGGTGAGACATACCAATGAGAG (SEQ ID NR.: 15) und
CATAAAATATTTACTCCCAGAGCC (SEQ ID NR.: 16).
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein isoliertes Polypeptid bereit, wobei das Polypeptid mehr als etwa 70% Aminosäuresequenzidentität mit einer Aminosäuresequenz von SEQ ID NR.: 6 umfaßt.
In einem Ausführungsbeispiel bindet das Polypeptid spezifisch an polyklonale Antikörper, die gegen SEQ ID NR.: 6 erzeugt werden, oder an einen immunogenen Teil davon. In einem weiteren Ausführungsbeispiel stammt das Polypeptid von einem Menschen, einer Ratte oder einer Maus. In einem weiteren Ausführungsbeispiel weist das Polypeptid eine Aminosäuresequenz von SEQ ID NR.: 6 oder einen immunogenen Teil davon auf.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung einen Antikörper bereit, der an ein isoliertes Polypeptid bindet, wobei das Polypeptid mehr als etwa 70% Aminosäuresequenzidentität mit einer Aminosäuresequenz von SEQ ID NR.: 6 umfaßt.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung bereit, die die Signaltransduktion von BCA-PCR moduliert, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt: (i) in Kontakt bringen der Verbindung mit einem Polypeptid mit mehr als 70% Aminosäuresequenzidentität mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NR.: 6, und (ii) Bestimmen des funktionalen Effekts der Verbindung auf das Polypeptid.
In einem Ausführungsbeispiel ist das Polypeptid an eine feste Phase gebunden. In einem weiteren Ausführungsbeispiel ist das Polypeptid an eine feste Phase kovalent gebunden.
In einem Ausführungsbeispiel wird der funktionale Effekt durch Messen von Änderungen der intrazellulären cAMP, IP3 oder Ca²⁺ bestimmt. In einem weiteren Ausführungsbeispiel ist der funktionale Effekt ein chemischer Effekt oder ein physikalischer Effekt. In einem weiteren Ausführungsbeispiel wird der funktionale Effekt durch Messen der Bindung der Verbindung an das Polypeptid gemessen.
In einem Ausführungsbeispiel ist das Polypeptid rekombinant. In einem weiteren Ausführungsbeispiel wird das Polypeptid in einer Zelle oder Zellenmembran exprimiert, z.B. einer eukaryotischen Zelle oder Zellenmembran.
In einem Ausführungsbeispiel ist der Krebs Brustkrebs.
In einem weiteren Ausführungsbeispiel ist die Verbindung ein Antagonist eines Polypeptids, wobei das Polypeptid mehr als 70% Aminosäureidentität zur Aminosäuresequenz von SEQ ID NR.: 6 umfaßt.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Behandeln von Krebs bereit, wobei das Verfahren die Schritte des Kontaktierens einer Krebszelle mit einer therapeutisch wirksamen Menge eines Antikörpers umfaßt, wobei der Antikörper spezifisch an ein Polypeptid mit mehr als 70% Aminosäureidentität mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NR.: 6 bindet.
In einem Ausführungsbeispiel bindet der Antikörper spezifisch an ein Polypeptid mit mehr als 70% Aminosäureidentität mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NR.: 6.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweisen der Anwesenheit einer BCA-GPCR-Nukleinsäure oder eines BCA-GPCR-Polypeptids in menschlichem Gewebe bereit, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt: (i) Isolieren einer biologischen Probe; (ii) Kontaktieren der biologischen Probe mit einem BCA-GPCR-spezifischen Reagenz, das selektiv mit einer BCA-GPCR-Nukleinsäure oder einem BCA-GPCR-Polypeptid verbindet; und (iii) Erfassen des Anteils an BCA-GPCR-spezifischem Reagenz, das selektiv mit der Probe verbindet.
In einem Ausführungsbeispiel ist das BCA-GPCR-spezifische Reagenz aus der Gruppe ausgewählt, die aus: BCA-GPCR-spezifischen Antikörpern, BCA-GPCR- spezifischen Oligonukleotidprimern und BCA-GPCR-spezifischen Nukleinsäuresonden besteht.
In einem weiteren Ausführungsbeispiel ist das Gewebe Brustkrebsgewebe.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines G-Protein-gekoppelten Rezeptorpolypeptids bereit, wobei das Verfahren den Schritt des Exprimierens des Polypeptids aus einem rekombinanten Expressionsvektor mit einer Nukleinsäure, die das Polypeptid codiert, umfaßt, wobei die Aminosäuresequenz des Polypeptids mehr als etwa 70% Aminosäureidentität mit einem Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz von SEQ ID NR.: 6 umfaßt.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer rekombinanten Zelle mit einem Polypeptid bereit, wobei das Verfahren den Schritt der Transduktion der Zelle mit einem Expressionsvektor mit einer Nukleinsäure, die das Polypeptid codiert, umfaßt, wobei die Aminosäuresequenz des Polypeptids mehr als etwa 70% Aminosäureidentität mit einem Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz von SEQ ID NR.: 6 umfaßt.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1: Brustkrebstumore und Zellinien mit amplifizierten Kopien des BCA-GPCR-3-Gens.
2: BCA-GPCR-3-mRNA-Überexpression in Brustkrebszellinien.
3: Quantitative Daten von BCA-GPCR-3-mRNA-Überexpression in Brustkrebszellinien.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Einleitung
Die vorliegende Erfindung stellt zum ersten Mal Nukleinsäuren bereit, die vier neue G-Protein-gekoppelte Rezeptoren codieren. Auf diese Nukleinsäuren und die Rezeptoren, die sie codieren, wird einzeln als BCA-GPCR-1, 2, 3 und 4 bezeichnet Bezug genommen. Diese BCA-GPCRs sind Komponenten von Signaltransduktionswegen und sind einem genomischen Bereich zugeordnet, der in Brustkrebszellen amplifiziert ist. Diese Nukleinsäuren stellen wertvolle Sonden für die Identifikation von Brustkrebszellen bereit, da die Nukleinsäuren in bestimmten Brustkrebszellen spezifisch amplifiziert sind oder sehr nahe (innerhalb 100 kb) liegen oder Bereiche sind, die in Brustkrebszellen spezifisch amplifiziert und/oder überexprimiert sind. Nukleinsäuren, die die BCA-GPCRs der Erfindung codieren, können unter Verwendung von Verfahren wie z.B. Umkehrtranskription und Amplifikation von mRNA, Isolation von gesamter RNA oder Poly-A⁺-RNA, Northern-Blotting, Dot-Blotting, In-Situ-Hybridisierung, RNase-Schutz, S1-Abbau, Prüfen von DNA-Mikrochipanordnungen und dergleichen identifiziert werden.
Die Chromosomlokalisierung der Gene wurde bestimmt und alle vier der Gene befinden sich am Chromosom 1q44 in der folgenden Orientierung, ausgehend vom Centromerende, 5' zu 3'-Strang: BCA-GPCR-1 (3'-5'-Orientierung); ungefähr 40 kb; BCA-GPCR-2 (5'-3'-Orientierung); ungefähr 40 kb; BCA-GPCR-3 (3'-5'-Orientierung); ungefähr 60 kb; BCA-GPCR-4 (5'-3'-Orientierung), mit dem Telomerende endend. Diese Gene, die menschliche BCA-GPCRs codieren, können verwendet werden, um Krankheiten, Mutationen und Anlagen zu identifizieren, die durch BCA-GPCRs verursacht werden und mit diesen verbunden sind, wie z.B. Krebs, z.B. Brustkrebs. Die BCA-GPCRs der Erfindung sind auch für die Krebsdiagnose, insbesondere Brustkrebs, nützlich.
Die Isolation von neuen BCA-GPCRs stellt ein Mittel zum Testen auf und zum Identifizieren von Modulatoren der Signaltransduktion von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren, z.B. Aktivatoren, Inhibitoren, Stimulatoren, Verstärkern, Agonisten und Antagonisten, bereit. Solche Modulatoren der Signaltransduktion sind für die pharmakologische Modulation von Signalisierungswegen, z.B. in Krebszellen wie z.B. Brustkrebs, nützlich. Solche Aktivatoren und Inhibitoren, die unter Verwendung von BCA-GPCRs identifiziert werden, können auch für eine weitere Untersuchung der Signaltransduktion verwendet werden. Folglich stellt die Erfindung Tests für die Signaltransduktionsmodulation bereit, wobei die BCA-GPCRs als direkte oder indirekte Reportermoleküle für den Effekt von Modulatoren auf die Signaltransduktion wirken. BCA-GPCRs können in Tests in vitro, ex vivo und in vivo verwendet werden, z.B. um Änderungen der Transkriptionsaktivierung von GPCRs; Ligandenbindung; Phosphorylierung und Dephosphorylierung; GPCR-Bindung an G-Proteine; G-Proteinaktivierung, regulierende Molekülbindung; Spannungs-, Membranpotential- und Leitungsänderungen; Ionenfluß, Änderungen in intrazellulären zweiten Botenstoffen wie z.B. cAMP und Inositoltriphosphat; Änderungen der intrazellulären Kalziumspiegel; und Neurotransmitterfreisetzung zu messen.
Verfahren zum Testen auf Modulatoren der Signaltransduktion umfassen In-Vitro-Ligandenbindungstests unter Verwendung der BCA-GPCRs, Teilen davon, wie z.B. der extrazellulären Domäne, oder chimäre Proteine mit einer oder mehreren Domänen eines GPCR, Oozyten-GPCR-Expression oder Gewebekulturzellen-GPCR-Expression, die entweder natürlich vorkommt oder rekombinant ist; Membranexpression eines GPCR, die entweder natürlich vorkommt oder rekombinant ist; Gewebeexpression eines GPCR; Expression eines GPCR in einem transgenen Tier usw.
Funktional stellen die BCA-GPCRs einen Sieben-Transmembran-G-Proteingekoppelten Rezeptor der G-Protein-gekoppelten Rezeptorfamilie dar, die mit einem G-Protein in Wechselwirkung treten, um die Signaltransduktion zu vermitteln (siehe z.B. Fong, Cell Signal 8:217 (1996); Baldwin, Curr. Opin. Cell Biol. 6:180 (1994)). Die Gene, die die BCA-GPCRs codieren, befinden sich am Chromosom 1q44 und gehören zu einem Bereich, der in Brustkrebszellen amplifiziert ist.
Strukturell codiert die Nukleotidsequenz von menschlichem BCA-GPCR-1 (siehe z.B. SEQ ID NR.: 1) ein Polypeptid mit einem vorhergesagten Molekulargewicht von ungefähr 31 kDa und einem vorhergesagten Bereich von 26–36 kDa (siehe z.B. SEQ ID NR.: 2). Verwandte BCA-GPCR-1-Gene von anderen Spezies sollten sich mindestens etwa 70% Aminosäureidentität über einen Aminosäurebereich von mindestens etwa 25 Aminosäuren in der Länge, wahlweise 50 bis 100 Aminosäuren in der Länge, teilen.
Die vorliegende Erfindung stellt auch polymorphe Varianten des BCA-GPCR-1 bereit, der in SEQ ID NR.: 1 dargestellt ist: Variante #1, in der ein Isoleucinsäurerest gegen einen Leucinrest in der Aminosäureposition 7 vom Methionin ausgetauscht ist; Variante #2, in der ein Glutaminsäurerest gegen einen Aspartamsäurerest in der Aminosäureposition 142 vom Methionin ausgetauscht ist; und Variante #3, in der ein Alaninrest gegen einen Glycinrest in der Aminosäureposition 6 vom Methionin ausgetauscht ist.
Strukturell codiert die Nukleotidsequenz von menschlichem BCA-GPCR-2 (siehe z.B. SEQ ID NR.: 3) ein Polypeptid mit einem vorhergesagten Molekulargewicht von ungefähr 37 kDa und einem vorhergesagten Bereich von 32–42 kDa (siehe z.B. SEQ ID NR.: 4). Verwandte BCA-GPCR-2-Gene von anderen Spezies sollten sich mindestens etwa 70% Aminosäureidentität über einen Aminosäurebereich mit mindestens etwa 25 Aminosäuren in der Länge, wahlweise 50 bis 100 Aminosäuren in der Länge, teilen. BCA-GPCR-2 ist zumindest etwa 2–3-fach in 15% von primären Brusttumoren und -tumorzellinien amplifiziert.
Die vorliegende Erfindung stellt auch polymorphe Varianten des in SEQ ID NR.: 4 dargestellten BCA-GPCR-2 bereit: Variante #1, in der ein Leucinsäurerest gegen einen Isoleucinrest in der Aminosäureposition 9 ausgetauscht ist; Variante #2, in der ein Asparaginsäurerest gegen einen Glutaminsäurerest in der Aminosäureposition 19 ausgetauscht ist; und Variante #3, in der ein Alaninrest gegen einen Glycinrest in der Aminosäureposition 6 ausgetauscht ist.
Strukturell codiert die Nukleotidsequenz von menschlichem BCA-GPCR-3 (siehe z.B. SEQ ID NR.: 5, exprimiert in Plazenta und Hoden) ein Polypeptid mit einem vorhergesagten Molekulargewicht von ungefähr 37 kDa und einem vorhergesagten Bereich von 32–42 kDa (siehe z.B. SEQ ID NR.: 6). Verwandte BCA-GPCR-3-Gene von anderen Spezies sollten sich mindestens etwa 70% Aminosäureidentität über einen Aminosäurebereich von mindestens etwa 25 Aminosäuren in der Länge, wahlweise 50 bis 100 Aminosäuren in der Länge, teilen. BCA-GPCR-3 ist mindestens etwa 3–7-fach in etwa 15% von primären Brusttumoren und -tumorzelllinien amplifiziert (siehe 1). Außerdem sind die BCA-GPCR-3-mRNA-Spiegel in Brustkrebszellinien von sowohl amplifizierten als auch nicht-amplifizierten Tumoren erhöht (siehe 2–3).
Die vorliegende Erfindung stellt auch polymorphe Varianten des BCA-GPCR-3, der in SEQ ID NR.: 6 dargestellt ist, bereit: Variante #1, in der ein Leucinsäurerest gegen einen Isoleucinrest in der Aminosäureposition 8 ausgetauscht ist; Variante #2, in der ein Asparaginsäurerest gegen einen Glutaminsäurerest in der Aminosäureposition 73 ausgetauscht ist; und Variante #3, in der ein Alaninrest gegen einen Glycinrest in der Aminosäureposition 7 ausgetauscht ist.
Strukturell codiert die Nukleotidsequenz von menschlichem BCA-GPCR-4 (siehe SEQ ID NR.: 7) ein Polypeptid mit einem vorhergesagten Molekulargewicht von ungefähr 37 kDa und einem vorhergesagten Bereich von 32–42 kDa (siehe z.B. SEQ ID NR.: 8). Verwandte BCA-GPCR-4-Gene von anderen Spezies sollten sich mindestens etwa 70% Aminosäureidentität über einen Aminosäurebereich von mindestens etwa 25 Aminosäuren in der Länge, wahlweise 50 bis 100 Aminosäuren in der Länge, teilen. BCA-GPCR-4 ist mindestens etwa 2–3-fach in 15% der primären Brusttumore und -tumorzellinien amplifiziert.
Die vorliegende Erfindung stellt auch polymorphe Varianten des BCA-GPCR-4, der in SEQ ID NR.: 8 dargestellt ist, bereit: Variante #1, in der ein Leucinsäurerest gegen einen Isoleucinrest in der Aminosäureposition 7 ausgetauscht ist; Variante #2, in der ein Glutaminsäurerest gegen einen Asparaginsäurerest in der Aminosäureposition 13 ausgetauscht ist; und Variante #3, in der ein Serinrest gegen einen Glycinrest in der Aminosäureposition 10 ausgetauscht ist.
Spezifische Bereiche des BCA-GPCR-Nukleotids und der Aminosäuresequenzen können verwendet werden, um polymorphe Varianten, Interspezies-Homologe und Allele von BCA-GPCRs zu identifizieren. Diese Identifikation kann in vitro, z.B. unter stringenten Hybridisierungsbedingungen, oder PCR (unter Verwendung von Primern, die mit SEQ ID NRN.: 1, 3, 5 und 7, z.B. SEQ ID NRN.: 9–16, hybridisieren), und Sequenzanalyse oder unter Verwendung der Sequenzinformation in einem Computersystem zum Vergleich mit anderen Nukleotidsequenzen durchgeführt werden. Typischerweise wird die Identifikation von polymorphen Varianten und Allelen eines BCA-GPCR durch Vergleichen einer Aminosäuresequenz von etwa 25 Aminosäuren oder mehr, z.B. 50–100 Aminosäuren, durchgeführt. Die Aminosäureidentität von ungefähr mindestens 70% oder darüber, wahlweise 75%, 80%, 85% oder 90–95% oder darüber, demonstriert typischerweise, daß ein Protein eine polymorphe Variante, ein Interspezies-Homolog oder ein Allel eines BCA-GPCR ist. Der Sequenzvergleich wird unter Verwendung der BLAST und BLAST 2.0 Sequenzvergleichsalgorithmen mit Standardparametern durchgeführt, die nachstehend erörtert werden. Antikörper, die spezifisch an einen BCA-GPCR oder einen bewahrten Bereich davon binden, können auch verwendet werden, um Allele, Interspezies-Homologe und polymorphe Varianten zu identifizieren. Es wird erwartet, daß die polymorphen Varianten, Allele und Interspezies-Homologe die Sieben-Transmembran-Struktur eines G-Protein-gekoppelten Rezeptors beibehalten.
BCA-GPCR-Nukleotid- und Aminosäuresequenzinformationen können auch verwendet werden, um Modelle von BCA-GPCRs in einem Computersystem zu konstruieren. Diese Modelle werden anschließend verwendet, um Verbindungen zu identifizieren, die BCA-GPCRs aktivieren oder inhibieren können. Solche Verbindungen, die die Aktivität eines BCA-GPCR modulieren, können verwendet werden, um die Rolle von BCA-GPCRs bei der Signaltransduktion zu untersuchen.
Definitionen
"BCA-GPCR" und "BCA-GPCR-1, 2, 3 oder 4" beziehen sich auf neue G-Proteingekoppelte Rezeptoren, für welche die Gene am Chromosom 1q44 liegen und zu einem Bereich des Chromosoms gehören, der in Brustkrebszellen amplifiziert ist. Die BCA-GPCRs der Erfindung weisen sieben Transmembranbereiche auf und weisen eine "Aktivität eines G-Protein-gekoppelten Rezeptors" auf, z.B. binden sie an G-Proteine als Reaktion auf extrazelluläre Reize und fördern die Produktion von zweiten Botenstoffen wie z.B. IP3, cAMP und Ca²⁺ über die Stimulation von stromabwärts liegenden Effektoren wie z.B. Phospholipase C und Adenylatcyclase (für eine Beschreibung der Struktur und Funktion von GPCRs siehe z.B. Fong, oben, und Baldwin, oben).
Topologisch weisen BCA-GPCRs eine N-endständige "extrazelluläre Domäne", eine "Transmembran-Domäne" mit siebten Transmembranbereichen und entsprechenden zytoplasmatischen und extrazellulären Schleifen und eine C-endständige "zytoplasmatische Domäne" auf (siehe z.B. Buck & Axel, Cell 65:175–187 (1991)). Diese Domänen können unter Verwendung von Verfahren, die Fachleuten bekannt sind, wie z.B. Sequenzanalyseprogramme, die hydrophobe und hydrophile Domänen identifizieren, strukturell identifiziert werden (siehe z.B. Kyte & Doolittle, J. Mol. Biol. 157:105–132 (1982)). Solche Domänen sind zur Herstellung von chimären Proteinen und für In-Vitro-Tests der Erfindung nützlich.
"Extrazelluläre Domäne" bezieht sich daher auf die Domäne eines BCA-GPCR, die von der Zellmembran hervorragt und häufig an einen extrazellulären Liganden bindet. Diese Domäne ist häufig für In-Vitro-Ligandenbindungstests, sowohl in der löslichen als auch festen Phase, nützlich.
"Transmembran-Domäne" umfaßt sieben Transmembranbereiche plus die entsprechenden zytoplasmatischen und extrazellulären Schleifen. Bestimmte Bereiche der Transmembran-Domäne können auch an der Ligandenbindung beteiligt sein.
"Zytoplasmatische Domäne" bezieht sich auf die Domäne eines BCA-GPCR, die nach dem siebten Transmembranbereich in das Zytoplasma ragt und sich zum C-Ende des Polypeptids fortsetzt.
"GPCR-Aktivität" bezieht sich auf die Fähigkeit, eines GPCR, ein Signal zu transduzieren. Eine solche Aktivität kann z.B. in einer heterologen Zelle durch Koppeln eines GPCR (oder eines chimären GPCR) mit einem G-Protein und einem stromabwärts liegenden Effektor wie z.B. PLC und Messen der Zunahmen im intrazellulären Kalzium gemessen werden (siehe z.B. Offermans & Simon, J. Biol. Chem. 270:15175–15180 (1995)). Die Rezeptoraktivität kann durch Aufzeichnen von durch Liganden induzierten Änderungen in [Ca²⁺]_i unter Verwendung von fluoreszierenden Ca²⁺-Indikatorfarbstoffen und fluorometrischer Abbildung wirksam gemessen werden.
Die Begriffe "BCA-GPCR" und "BCA-GPCR-1, 2, 3 oder 4" beziehen sich daher auf polymorphe Varianten, Allele, Mutanten und Interspezies-Homologe und BCA-GPCR-Domänen davon, die: (1) etwa 70% Aminosäuresequenzidentität, vorzugsweise etwa 75, 80, 85, 90 oder 95% oder einer höhere Aminosäuresequenzidentität mit SEQ ID NR.: 2, 4, 6 oder 8 über ein Fenster von etwa 25 Aminosäuren, vorzugsweise 50–100 Aminosäuren, aufweisen; oder (3) (mit einer Größe von mindestens etwa 100, vorzugsweise mindestens etwa 500 oder 1000 Nukleotiden) unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer Sequenz SEQ ID NR.: 1, 3, 5 oder 7 und konservativ modifizierten Varianten davon spezifisch hybridisieren. Dieser Begriff bezieht sich auch auf eine Domäne eines BCA-GPCR, wie vorstehend beschrieben, oder eines Fusionsproteins mit einer Domäne eines BCA-GPCR, die mit einem heterologen Protein verbunden ist.
Eine "Wirtszelle" ist eine natürlich vorkommende Zelle oder eine transformierte Zelle, die einen Expressionsvektor enthält und die Replikation oder Expression des Expressionsvektors unterstützt. Wirtszellen können kultivierte Zellen, Explantate, Zellen in vivo und dergleichen sein. Wirtszellen können prokaryotische Zellen, wie z.B. E. coli oder eukaryotische Zellen wie z.B. Hefe-, Insekten-, Amphibien- oder Säugerzellen wie z.B. CHO, HeLa und dergleichen sein.
"Biologische Probe", wie hierin verwendet, ist eine Probe von biologischem Gewebe oder Fluid, die/das Nukleinsäuren oder Polypeptide von neuen BCA-GPCRs enthält. Solche Proben umfassen, sind jedoch nicht begrenzt auf Gewebe, das von Menschen, Mäusen und Ratten isoliert ist. Biologische Proben können auch Gewebesektionen wie z.B. gefrorene Sektionen, die für histologische Zwecke entnommen werden, umfassen. Eine biologische Probe wird typischerweise aus einem eukaryotischen Organismus wie z.B. Insekten, Protozoen, Vögeln, Fischen, Reptilien und vorzugsweise einem Säuger wie z.B. einer Ratte, einer Maus, einer Kuh, einem Hund, einem Meerschweinchen oder einem Kaninchen und am meisten bevorzugt einem Primaten wie z.B. Schimpansen oder Menschen, erhalten. Bevorzugte Gewebe umfassen z.B. normales Prostata-Epithelialgewebe, Plazenta- und Hodengewebe.
Der Ausdruck "funktionale Effekte" im Zusammenhang mit Tests zum Testen von Verbindungen, die die durch BCA-GPCR vermittelte Signaltransduktion modulieren, umfaßt die Bestimmung irgendeines Parameters, der indirekt oder direkt unter dem Einfluß eines BCA-GPCR steht, z.B. ein funktionaler, physikalischer oder chemischer Effekt. Er umfaßt Ligandenbindung, Änderung des Ionenflusses, Membranpotential, Stromfluß, Transkription, G-Protein-Bindung, Genamplifikation, Expression in Krebszellen, GPCR-Phosphorylierung oder -Dephosphorylierung, Signaltransduktion, Rezeptor-Liganden-Wechselwirkungen, Konzentrationen von zweiten Botenstoffen (z.B. cAmp, cGMP, IP₃ oder intrazelluläres Ca²⁺), in vitro, in vivo und ex vivo und umfaßt auch andere physiologische Effekte wie z.B. Zunahmen oder Abnahmen der Neurotransmitter- oder Hormonfreisetzung.
Mit "Bestimmen des funktionalen Effekts" sind Tests für eine Verbindung gemeint, die einen Parameter erhöht oder verringert, der indirekt oder direkt unter dem Einfluß eines BCA-GPCR steht, z.B. funktionale, physikalische und chemische Effekte. Solche funktionalen Effekte können durch ein beliebiges Mittel, das Fachleuten bekannt ist, gemessen werden, z.B. Änderungen der spektroskopischen Eigenschaften (z.B. Fluoreszenz, Absorptionsvermögen, Brechungsindex), hydrodynamische (z.B. Form), chromatographische oder Löslichkeitseigenschaften, Patch-Clamping, gegen Spannung empfindliche Farbstoffe, ganze Zellenströme, Radioisotopausfluß, induzierbare Marker, Transkriptionsaktivierung von BCA-GPCRs; Ligandenbindungstests; Spannungs-, Membranpotential- und Leitungsänderungen; Ionenflußtests; Änderungen der intrazellulären zweiten Botenstoffe wie z.B. cAMP und Inositoltriphosphat (IP3); Änderungen der intrazellulären Kalziumspiegel; Neurotransmitterfreisetzung und dergleichen.
"Inhibitoren", "Aktivatoren", und "Modulatoren" von BCA-GPCRs werden austauschbar verwendet, um auf inhibierende, aktivierende oder modulierende Moleküle Bezug zu nehmen, die unter Verwendung von In-Vitro- und In-Vivo-Tests auf die Signaltransduktion identifiziert werden, z.B. Liganden, Agonisten, Antagonisten und ihre Homologen und Nachahmer. Inhibitoren sind Verbindungen, die z.B. an teilweise binden an, teilweise oder vollständig die Stimulation der Signaltransduktion blockieren, diese senken, verhindern, deren Aktivierung verzögern, diese inaktivieren, unempfindlich machen oder abwärtsregulieren, z.B. Antagonisten. Aktivatoren sind Verbindungen, die z.B. binden an, die Signaltransduktion stimulieren, erhöhen, öffnen, aktivieren, erleichtern, deren Aktivierung verstärken, diese empfindlich machen oder aufwärtsregulieren, z.B. Agonisten. Modulatoren umfassen Verbindungen, die z.B. die Wechselwirkung eines Polypeptids mit: extrazellulären Proteinen, die Aktivatoren oder einen Inhibitor binden; G-Proteinen, G-Protein-Alpha-, -Beta- und -Gamma-Untereinheiten; und Kinasen ändern. Modulatoren umfassen auch genetisch modifizierte Versionen von BCA-GPCRs, z.B. mit geänderter Aktivität, sowie natürlich vorkommende und synthetische Liganden, Antagonisten, Agonisten, Antikörper, kleine chemische Moleküle und dergleichen. Solche Tests auf Inhibitoren und Aktivatoren umfassen z.B. die Expression von BCA-GPCRs in vitro, in Zellen oder Zellmembranen, das Anwenden von vermutlichen Modulatorverbindungen und dann das Bestimmen der funktionalen Effekte auf die Signaltransduktion, wie vorstehend beschrieben.
Proben oder Tests, die BCA-GPCRs umfassen, die mit einem potentiellen Aktivator, Inhibitor oder Modulator behandelt werden, werden mit Kontrollproben ohne den Inhibitor, Aktivator oder Modulator verglichen, um das Ausmaß der Inhibierung zu untersuchen. Den Kontrollproben (unbehandelt mit Inhibitoren) wird ein relativer BCA-GPCR-Aktivitätswert von 100% zugewiesen. Die Inhibierung eines BCA-GPCR ist erreicht, wenn der BCA-GPCR-Aktivitätswert relativ zur Kontrolle etwa 80%, vorzugsweise 50%, bevorzugter 25–0% ist. Die Aktivierung eines BCA-GPCR ist erreicht, wenn der BCA-GPCR-Aktivitätswert relativ zur Kontrolle (unbehandelt mit Aktivatoren) 110%, bevorzugter 150%, bevorzugter 200–500% (d.h. zwei bis fünfmal höher relativ zur Kontrolle), bevorzugter 1000–3000% höher ist.
Die Begriffe "isoliert", "gereinigt" oder "biologisch rein" beziehen sich auf Material, das im wesentlichen oder wesentlich frei von Komponenten ist, die es normalerweise begleiten, wie in seinem natürlichen Zustand zu finden. Reinheit und Homogenität werden typischerweise unter Verwendung von analytischen Chemieverfahren wie z.B. Polyacrylamid-Gelelektrophorese oder Hochleistungs-Flüssigchromatographie bestimmt. Ein Protein, das die vorherrschende Spezies ist, die in einer Zubereitung vorhanden ist, ist im wesentlichen gereinigt. insbesondere wird eine isolierte BCA-GPCR-Nukleinsäure von offenen Leserahmen getrennt, die das BCA-GPCR-Gen flankieren und andere Proteine als den BCA-GPCR codieren. Der Begriff "gereinigt" bedeutet, daß eine Nukleinsäure oder ein Protein im wesentlichen ein Band in einem Elektrophoresegel verursacht. Insbesondere bedeutet es, daß die Nukleinsäure oder das Protein zumindest zu 85% rein, bevorzugter zu mindestens 95% rein und am meisten bevorzugt zu mindestens 99% rein ist.
"Biologisch aktiver" BCA-GPCR bezieht sich auf einen BCA-GPCR mit einer Signaltransduktionsaktivität und einer Aktivität eines G-Protein-gekoppelten Rezeptors, wie vorstehend beschrieben.
"Nukleinsäure" bezieht sich auf Desoxyribonukleotide oder Ribonukleotide und Polymere davon entweder in ein- oder doppelsträngiger Form. Der Begriff umfaßt Nukleinsäuren, die bekannte Nukleotidanaloge oder modifizierte Gerüstreste oder Bindungen enthalten, die synthetisch sind, natürlich vorkommen und nicht-natürlich vorkommen, die ähnliche Bindungseigenschaften aufweisen wie die Bezugsnukleinsäure und die in einer Weise ähnlich zu den Bezugsnukleotiden metabolisiert werden. Beispiele von solchen Analogen umfassen ohne Begrenzung Phosphorthioate, Phosphoramidate, Methylphosphonate, Chiralmethylphosphonate, 2-O-Methylribonukleotide, Peptid-Nukleinsäuren (PNAs).
Wenn nicht anders angegeben, umfaßt eine spezielle Nukleinsäuresequenz auch implizit konservativ modifizierte Varianten davon (z.B. degenerierte Codon-Substitutionen) und komplementäre Sequenzen sowie die explizit angegebene Sequenz. Insbesondere können degenerierte Codon-Substitutionen durch Erzeugen von Sequenzen, in denen die dritte Position von einem oder mehreren ausgewählten (oder allen) Codons mit Mischbasen- und/oder Desoxyinosinresten ersetzt ist, erreicht werden (Bather et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al. J. Biol. Chem. 260:2605–2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91–98 (1994)). Der Begriff Nukleinsäure wird austauschbar mit Gen, cDNA, mRNA, Oligonukleotid und Polynukleotid verwendet.
Die Begriffe "Polypeptid", "Peptid" und "Protein" werden hierin austauschbar verwendet, um sich auf ein Polymer von Aminosäureresten zu beziehen. Die Begriffe gelten für Aminosäurepolymere, in denen ein oder mehrere Aminosäurereste ein künstlicher chemischer Nachahmer einer entsprechenden natürlich vorkommenden Aminosäure ist, sowie für natürlich vorkommende Aminosäurepolymere und ein nicht-natürlich vorkommendes Aminosäurepolymer.
Der Begriff "Aminosäure" bezieht sich auf natürlich vorkommende und synthetische Aminosäuren sowie Aminosäureanaloge und Aminosäurenachahmer, die in einer Weise ähnlich zu den natürlich vorkommenden Aminosäuren funktionieren. Natürlich vorkommende Aminosäuren sind diejenigen, die durch den genetischen Code codiert werden, sowie diejenigen Aminosäuren, die später modifiziert werden, z.B. Hydroxyprolin, γ-Carboxyglutamat und O-Phosphoserin. Aminosäureanaloge bezieht sich auf Verbindungen, die dieselbe grundlegende chemische Struktur wie natürlich vorkommende Aminosäuren aufweisen, d.h. ein α-Kohlenstoff, der an einen Wasserstoff, eine Carboxylgruppe, eine Aminogruppe und eine R-Gruppe gebunden ist, z.B. Homoserin, Norleucin, Methioninsulfoxid, Methioninmethylsulfonium. Solche Analoge weisen modifizierte R-Gruppen (z.B. Norleucin) oder modifizierte Peptidgerüste auf, behalten jedoch dieselbe grundlegende chemische Struktur bei wie eine natürlich vorkommende Aminosäure. Aminosäurenachahmer bezieht sich auf chemische Verbindungen, die eine Struktur aufweisen, die von der allgemeinen chemischen Struktur einer Aminosäure verschieden ist, die jedoch in einer Weise ähnlich zu einer natürlich vorkommenden Aminosäure funktioniert.
Aminosäuren können hierin entweder mit ihren üblicherweise bekannten Drei-Buchstaben-Symbolen oder mit den Ein-Buchstaben-Symbolen, die von der IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission empfohlen werden, bezeichnet werden. Nukleotide können ebenso mit ihren üblicherweise akzeptierten Ein-Buchstaben-Codes bezeichnet werden.
"Konservativ modifizierte Varianten" gilt sowohl für Aminosäure- als auch Nukleinsäuresequenzen. Bezüglich spezieller Nukleinsäuresequenzen bezieht sich konservativ modifizierte Varianten auf diejenigen Nukleinsäuren, die identische oder im wesentlichen identische Aminosäuresequenzen codieren, oder wenn die Nukleinsäure keine Aminosäuresequenz codiert, auf im Wesentlichen identische Sequenzen. Aufgrund der Degeneration des genetischen Codes codieren eine große Anzahl von funktional identischen Nukleinsäuren irgendein gegebenes Protein. Die Codone GCA, GCC, GCG und GCU codieren beispielsweise alle die Aminosäure Alanin. In jeder Position, in der ein Alanin durch ein Codon festgelegt wird, kann das Codon folglich in irgendeines der entsprechenden beschriebenen Codons geändert werden, ohne das codierte Polypeptid zu ändern. Solche Nukleinsäurevariationen sind "stille Variationen", die eine Spezies von konservativ modifizierten Variationen sind. Jede Nukleinsäuresequenz hierin, die ein Polypeptid codiert, beschreibt auch jede mögliche stille Variation der Nukleinsäure. Ein Fachmann wird erkennen, daß jedes Codon in einer Nukleinsäure (außer AUG, das gewöhnlich das einzige Codon für Methionin ist, und TGG, das gewöhnlich das einzige Codon für Tryptophan ist) modifiziert werden kann, um ein funktional identisches Molekül zu ergeben. Folglich ist jede stille Variation einer Nukleinsäure, die ein Polypeptid codiert, in jeder beschriebenen Sequenz impliziert.
Ein Fachmann wird erkennen, daß hinsichtlich Aminosäuresequenzen einzelne Substitutionen, Deletionen oder Additionen an einer Nukleinsäure, einem Polypeptid, einem Polypeptid oder einer Proteinsequenz, die eine einzelne Aminosäure oder einen kleinen Prozentsatz von Aminosäuren in der codierten Sequenz ändert, addiert oder deletiert, eine "konservativ modifizierte Variante" ist, wobei die Änderung zur Substitution einer Aminosäure mit einer chemisch ähnlichen Aminosäure führt. Tabellen der konservativen Substitution, die funktional ähnliche Aminosäuren bereitstellen, sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Solche konservativ modifizierten Varianten sind zusätzlich zu polymorphen Varianten, Interspezies-Homologen und Allelen der Erfindung und schließen diese nicht aus.
Die folgenden acht Gruppen enthalten jeweils Aminosäuren, die konservative Substitutionen zueinander sind:

1) Alanin (A), Glycin (G);
2) Asparaginsäure (D), Glutaminsäure (E);
3) Asparagin (N), Glutamin (Q);
4) Arginin (R), Lysin (K);
5) Isoleucin (I); Leucin (L), Methionin (M), Valin (V);
6) Phenylalanin (F), Tyrosin (Y), Tryptophan (W);
7) Serin (S), Threonin (T); und
8) Cystein (C), Methionin (M).

Makromolekulare Strukturen wie z.B. Polypeptidstrukturen können hinsichtlich verschiedener Organisationsniveaus beschrieben werden. Für eine allgemeine Erörterung dieser Organisation siehe z.B. Alberts et al., Molecular Biology of the Cell (3. Ausg., 1994), und Cantor und Schimmel, Biophysical Chemistry Teil 1: The Conformation of Biological Macromolecules (1980). "Primäre Struktur" bezieht sich auf die Aminosäuresequenz eines speziellen Peptids. "Sekundäre Struktur" bezieht sich auf lokal geordnete, dreidimensionale Strukturen innerhalb eines Polypeptids. Diese Strukturen sind im allgemeinen als Domänen bekannt. Domänen sind Teile eines Polypeptids, die eine kompakte Einheit des Polypeptids bilden und typischerweise 25 bis ungefähr 500 Aminosäuren lang sind. Typische Domänen bestehen aus Abschnitten mit geringerer Organisation wie z.B. Ausdehnungen von β-Faltblatt und α-Helizes. "Tertiäre Struktur" bezieht sich auf die vollständige dreidimensionale Struktur eines Polypeptidmonomers. "Quaternäre Struktur" bezieht sich auf die dreidimensionale Struktur, die durch die nicht-kovalente Verbindung von unabhängigen tertiären Einheiten gebildet wird. Anisotrope Terme sind auch als Energieterme bekannt.
Ein "Marker" oder ein "nachweisbarer Anteil" ist eine Zusammensetzung, die durch spektroskopische, photochemische, biochemische, immunchemische oder chemische Mittel nachweisbar ist. Nützliche Marker umfassen beispielsweise ³²P, Fluoreszenzfarbstoffe, elektronendichte Reagenzien, Enzyme (z.B. wie üblicherweise in einem ELISA verwendet), Biotin, Digoxigenin oder Haptene und Proteine, für die Ant oder 7 nachweisbar gemacht werden kann, z.B. durch Integrieren eines Radiomarkers in das Peptid, und die verwendet werden, um Antikörper nachzuweisen, die spezifisch mit dem Peptid reaktiv sind).
Eine "markierte Nukleinsäuresonde oder ein markiertes Oligonukleotid" ist eines, das entweder kovalent, durch ein Verbindungsstück oder eine chemische Bindung oder nicht-kovalent, durch ionische, Van-der-Waals-, elektrostatische oder Wasserstoffbindungen an einen Marker gebunden ist, so daß die Anwesenheit der Sonde durch Nachweisen der Anwesenheit des an die Sonde gebundenen Markers nachgewiesen werden kann.
Wie hierin verwendet, ist eine "Nukleinsäuresonde oder ein Oligonukleotid" als Nukleinsäure definiert, die in der Lage ist, an eine Zielnukleinsäure einer komplementären Sequenz durch eine oder mehrere Arten von chemischen Bindungen, gewöhnlich durch komplementäre Basenpaarung, gewöhnlich durch Wasserstoffbindungsbildung, zu binden. Wie hierin verwendet, kann eine Sonde natürliche (d.h. A, G, C oder T) oder modifizierte Basen (7-Deazaguanosin, Inosin usw.) umfassen. Außerdem können die Basen in einer Sonde mit einer anderen Verbindung als einer Phosphodiesterbindung verbunden sein, so lange sie die Hybridisierung nicht stören. Sonden können folglich beispielsweise Peptidnukleinsäuren sein, in denen die Bestandteilsbasen vielmehr durch Peptidbindungen als Phosphodiesterbindungen verbunden sind. Es ist für einen Fachmann verständlich, daß Sonden Zielsequenzen, denen vollständige Komplementarität mit der Sondensequenz fehlt, in Abhängigkeit von der Stringenz der Hybridisierungsbedingungen binden können. Die Sonden werden vorzugsweise direkt mit Isotopen, Chromophoren, Lumiphoren, Chromogenen markiert oder indirekt markiert, wie z.B. mit Biotin, an das ein Streptavidinkomplex später binden kann. Durch Testen auf die Anwesenheit oder Abwesenheit der Sonde kann man die Anwesenheit oder Abwesenheit der ausgewählten Sequenz oder Teilsequenz nachweisen.
Der Begriff "rekombinant" gibt an, wenn er mit Bezug z.B. auf eine Zelle oder eine Nukleinsäure, ein Protein oder einen Vektor verwendet wird, daß die Zelle, die Nukleinsäure, das Protein oder der Vektor durch die Einführung einer heterologen Nukleinsäure oder eines heterologen Proteins oder die Änderung einer natürlichen Nukleinsäure oder eines natürlichen Proteins modifiziert wurde oder daß die Zelle von einer so modifizierten Zelle abgeleitet ist. Rekombinante Zellen exprimieren folglich beispielsweise Gene, die innerhalb der natürlichen (nicht-rekombinanten) Form der Zelle nicht zu finden sind, oder exprimieren natürliche Gene, die ansonsten anomal exprimiert, unterexprimiert oder überhaupt nicht exprimiert sind.
Der Begriff "heterolog" gibt an, wenn er mit Bezug auf Teile einer Nukleinsäure verwendet wird, daß die Nukleinsäure zwei oder mehr Teilsequenzen umfaßt, die in derselben Beziehung zueinander in der Natur nicht zu finden. Sind. Die Nukleinsäure wird beispielsweise typischerweise rekombinant erzeugt, wobei sie zwei oder mehr Sequenzen von nicht verwandten Genen aufweist, die angeordnet sind, um eine neue funktionale Nukleinsäure herzustellen, z.B. einen Promoter von einer Quelle und einen Codierbereich von einer anderen Quelle. Ebenso gibt ein heterologes Protein an, daß das Protein zwei oder mehr Teilsequenzen umfaßt, die in derselben Beziehung zueinander in der Natur nicht zu finden sind (z.B. ein Fusionsprotein).
Ein "Promotor" ist als Anordnung von Nukleinsäure-Steuersequenzen definiert, die die Transkription einer Nukleinsäure lenken. Wie hierin verwendet, umfaßt ein Promotor erforderliche Nukleinsäuresequenzen nahe der Startstelle der Transkription, wie z.B. im Fall eines Promotors des Typs Polymerase II ein TATA-Element. Ein Promotor umfaßt auch wahlweise distale Verstärker- oder Repressorelemente, die nicht weniger als mehrere tausend Basenpaare von der Startstelle der Transkription angeordnet sein können. Ein "konstitutiver" Promotor ist ein Promotor, der unter den meisten Umgebungs- und Entwicklungsbedingungen aktiv ist. Ein "induzierbarer" Promotor ist ein Promotor, der unter Umgebungs- oder Entwicklungsregulierung aktiv ist. Der Begriff "wirksam verbunden" bezieht sich auf eine funktionale Verbindung zwischen einer Nukleinsäure-Expressionssteuersequenz (wie z.B. einem Promotor oder einer Anordnung von Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen) und einer zweiten Nukleinsäuresequenz, wobei die Expressionssteuersequenz die Transkription der Nukleinsäure entsprechend der zweiten Sequenz lenkt.
Ein "Expressionsvektor" ist ein Nukleinsäuregebilde, das rekombinant oder synthetisch erzeugt wird, mit einer Reihe von festgelegten Nukleinsäureelementen, die die Transkription einer speziellen Nukleinsäure in einer Wirtszellen ermöglichen. Der Expressionsvektor kann ein Teil eines Plasmids, eines Virus oder eines Nukleinsäurefragments sein. Typischerweise umfaßt der Expressionsvektor eine zu transkribierende Nukleinsäure, die wirksam mit einem Promotor verbunden ist.
Die Begriffe "identisch" oder Prozent "Identität" im Zusammenhang mit zwei oder mehr Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenzen beziehen sich auf zwei oder mehr Sequenzen oder Teilsequenzen, die gleich sind oder einen festgelegten Prozentsatz von Aminosäureresten oder Nukleotiden aufweisen, die gleich sind (d.h. etwa 70% Identität, vorzugsweise 75%, 80%, 85%, 90% oder 95% Identität über einen festgelegten Bereich im Vergleich zu und ausgerichtet auf maximale Übereinstimmung über ein Vergleichsfenster, oder einen festgelegten Bereich, wie unter Verwendung von BLAST oder BLAST 2.0 Sequenzvergleichsalgorithmen mit nachstehend beschriebenen Standardparametern oder durch manuelle Ausrichtung und visuelle Untersuchung gemessen. Solche Sequenzen werden dann als "im Wesentlichen identisch" bezeichnet. Diese Definition bezieht sich auch auf das Komplement einer Testsequenz. Vorzugsweise existiert die Identität über einen Bereich, der mindestens etwa 25 Aminosäuren oder Nukleotide lang ist, oder bevorzugter über einen Bereich, der 50–100 Aminosäuren oder Nukleotide lang ist.
Zum Sequenzvergleich wirkt typischerweise eine Sequenz als Bezugssequenz, mit der Testsequenzen verglichen werden. Wenn ein Sequenzvergleichsalgorithmus verwendet wird, werden die Test- und Bezugssequenzen in einen Computer eingegeben, Teilsequenzkoordinaten werden festgelegt, falls erforderlich, und Sequenzalgorithmus-Programmparameter werden festgelegt. Standardprogrammparameter können verwendet werden oder alternative Parameter können festgelegt werden. Der Sequenzvergleichsalgorithmus berechnet dann den Prozentsatz der Sequenzidentitäten für die Testsequenzen relativ zur Bezugssequenz auf der Basis der Programmparameter.
Ein "Vergleichsfenster", wie hierin verwendet, umfaßt einen Bezug auf ein Segment von irgendeiner der Anzahl von benachbarten Positionen, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus 20 bis 600, gewöhnlich etwa 50 bis etwa 200, gewöhnlicher etwa 100 bis etwa 150 besteht, in denen eine Sequenz mit einer Bezugssequenz mit derselben Anzahl von benachbarten Positionen verglichen werden kann, nachdem die zwei Sequenzen optimal ausgerichtet sind. Verfahren zur Ausrichtung von Sequenzen zum Vergleich sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Die optimale Ausrichtung von Sequenzen zum Vergleich kann z.B. durch den Algorithmus lokaler Homologie von Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), durch den Homologieausrichtungsalgorithmus von Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), durch das Verfahren der Suche nach Ähnlichkeit von Pearson & Lipman, Proc. Nat'I., Adad. Sci. USA 85:2444 (1988), durch computerisierte Implementierungen dieser Algorithmen (GAP, BESTFIT, FASTA und TFASTA im Wisconsin Genetics Softwarepaket, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) oder durch manuelle Ausrichtung und visuelle Untersuchung (siehe z.B. Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., Hrsg. 1995 Ergänzung)) durchgeführt werden.
Ein bevorzugtes Beispiel eines Algorithmus, der zum Bestimmen des Prozentsatzes der Sequenzidentität und der Sequenzähnlichkeit geeignet ist, sind die BLAST und BLAST 2.0 Algorithmen, die in Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389–3402 (1977) bzw. Altschul et al. J. Mol. Biol. 215:403–410 (1990), beschrieben sind. BLAST und BLAST 2.0 werden mit den hierin beschriebenen Parametern verwendet, um den Prozentsatz der Sequenzidentität für die Nukleinsäuren und Proteine der Erfindung zu bestimmen. Eine Software zum Durchführen von BLAST-Analysen ist durch das National Center for Biotechnology Information (http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/) öffentlich erhältlich. Dieser Algorithmus beinhaltet zuerst das Identifizieren von Sequenzpaaren mit hoher Bewertung (HSPs) durch Identifizieren von kurzen Worten mit der Länge W in der Abfragesequenz, die mit einer gewissen Schwellenbewertung T mit positivem Wert übereinstimmen oder diese erfüllen, wenn sie auf ein Wort mit der gleichen Länge in einer Datenbanksequenz ausgerichtet sind. T wird als Umgebungswort-Bewertungsschwelle (Altschul et al., oben) bezeichnet. Diese anfänglichen Umgebungsworttreffer wirken als Keime für die Einleitung von Suchen, um längere HSPs zu finden, die sie enthalten. Die Worttreffer werden in beiden Richtungen entlang jeder Sequenz so weit, wie die kumulative Ausrichtungsbewertung erhöht werden kann, erweitert. Kumulative Bewertungen werden für Nukleotidsequenzen unter Verwendung der Parameter M (Rückwärtsbewertung für ein Paar von übereinstimmenden Resten; immer > 0) und N (Strafbewertung für nicht übereinstimmende Reste; immer < 0) berechnet. Für Aminosäuresequenzen wird eine Bewertungsmatrix verwendet, um die kumulative Bewertung zu berechnen. Die Erweiterung der Worttreffer in jeder Richtung wird angehalten, wenn: die kumulative Ausrichtungsbewertung um die Größe X von ihrem maximalen erzielten Wert abfällt; die kumulative Bewertung auf Null oder darunter geht aufgrund der Ansammlung von einer oder mehreren Restausrichtungen mit negativer Bewertung; oder das Ende von einer Sequenz erreicht ist. Die BLAST-Algorithmusparameter W, T und X bestimmen die Empfindlichkeit und Geschwindigkeit der Ausrichtung. Das BLASTN-Programm (für Nukleotidsequenzen) verwendet als Vorgaben eine Wortlänge (W) von 11, eine Erwartung (E) von 10, M = 5, N = 4 und einen Vergleich beider Stränge. Für Aminosäuresequenzen verwendet das BLASTP-Programm als Vorgaben eine Wortlänge von 3 und eine Erwartung (e) von 10 und die BLOSUM62-Bewertungsmatrix (siehe Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)) Ausrichtungen (B) von 50, Erwartung (E) von 10, M = 5, N = 4 und einen Vergleich beider Stränge.
Der BLAST-Algorithmus führt auch eine statistische Analyse der Ähnlichkeit zwischen zwei Sequenzen durch (siehe z.B. Karlin & Altschul, Proc. Nat'I. Acad. Sci. USA 90:5873–5787 (1993)). Ein Maß der Ähnlichkeit, das vom BLAST-Algorithmus bereitgestellt wird, ist die kleinste Summenwahrscheinlichkeit (P(N)), die eine Angabe der Wahrscheinlichkeit bereitstellt, mit der eine Übereinstimmung zwischen zwei Nukleotid- oder Aminosäuresequenzen zufällig auftreten würde. Eine Nukleinsäure wird beispielsweise als einer Bezugssequenz ähnlich betrachtet, wenn die kleinste Summenwahrscheinlichkeit in einem Vergleich der Testnukleinsäure mit der Bezugsnukleinsäure geringer als 0,2, bevorzugter geringer als etwa 0,01 und am meisten bevorzugt geringer als etwa 0,001 ist.
Ein weiteres Beispiel eines nützlichen Algorithmus ist PILEUP. PILEUP erzeugt eine Mehrfach-Sequenzausrichtung von einer Gruppe von verwandten Sequenzen unter Verwendung von fortschreitenden, paarweisen Ausrichtungen, um die Beziehung und den Prozentsatz der Sequenzidentität zu zeigen. Es trägt auch einen Baum oder ein Dendogramm auf, das die Clusterbeziehungen zeigt, die verwendet werden, um die Ausrichtung zu erzeugen. PILEUP verwendet eine Vereinfachung des fortschreitenden Ausrichtungsverfahrens von Feng & Doolittle, J. Mol. Evol. 35:351–360 (1987). Das verwendete Verfahren ist ähnlich zu dem Verfahren, das von Higgins & Sharp, CABIOS 5:151–153 (1989) beschrieben ist. Das Programm kann bis zu 300 Sequenzen jeweils mit einer maximalen Länge von 5000 Nukleotiden oder Aminosäuren ausrichten. Die Mehrfachausrichtungsprozedur beginnt mit der paarweisen Ausrichtung der zwei ähnlichsten Sequenzen, wobei ein Cluster von zwei ausgerichteten Sequenzen erzeugt wird. Dieser Cluster wird dann auf die nächste am besten verwandte Sequenz oder Cluster von ausgerichteten Sequenzen ausgerichtet. Zwei Anhäufungen von Seguenzen werden durch eine einfache Erweiterung der paarweisen Ausrichtung von zwei einzelnen Sequenzen ausgerichtet. Die Endausrichtung wird durch eine Reihe von fortschreitenden, paarweisen Ausrichtungen erreicht. Das Programm wird durch Festlegen von speziellen Sequenzen und ihrer Aminosäure- oder Nukleotidkoordinaten für Bereiche des Sequenzvergleichs und durch Festlegen der Programmparameter durchgeführt. Unter Verwendung von PILEUP wird eine Bezugssequenz mit anderen Testsequenzen verglichen, um den Prozentsatz der Sequenzidentitätsbeziehung unter Verwendung der folgenden Parameter zu bestimmen. Standardspaltgewicht (3,00), Standardspaltlängengewicht (0,10) und gewichtete Endspalte. PILEUP kann aus dem GCG-Sequenzanalyse-Softwarepaket, z.B. Version 7.0 (Devereaux et al., Nuc. Acids Res. 12:387–395 (1984)), erhalten werden.
Eine Angabe, daß zwei Nukleinsäuresequenzen oder Polypeptide im Wesentlichen identisch sind, besteht darin, daß das durch die erste Nukleinsäure codierte Polypeptid mit den Antikörpern, die gegen das von der zweiten Nukleinsäure codierte Polypeptid angehoben sind, immunologisch kreuzreaktiv ist, wie nachstehend beschrieben. Folglich ist ein Polypeptid typischerweise im Wesentlichen zu einem zweiten Polypeptid beispielsweise identisch, wenn sich die zwei Peptide nur durch konservative Substitutionen unterscheiden. Eine andere Angabe, daß zwei Nukleinsäuresequenzen im Wesentlichen identisch sind, besteht darin, daß die zwei Moleküle oder ihre Komplemente unter stringenten Bedingungen miteinander hybridisieren, wie nachstehend beschrieben. Noch eine weitere Angabe, daß zwei Nukleinsäuresequenzen im Wesentlichen identisch sind, besteht darin, daß dieselben Primer verwendet werden können, um die Sequenz zu amplifizieren.
Der Ausdruck "hybridisiert selektiv (oder spezifisch) mit" bezieht sich auf die Bindung, Verdoppelung oder Hybridisierung eines Moleküls nur mit einer speziellen Nukleotidsequenz unter stringenten Hybridisierungsbedingungen, wenn diese Sequenz in einem komplexen Gemisch (z.B. gesamte zelluläre oder Bibliotheken-DNA oder RNA) vorliegt.
Der Ausdruck "stringente Hybridisierungsbedingungen" bezieht sich auf Bedingungen, unter denen eine Sonde mit ihrer Zielteilsequenz, typischerweise in einem komplexen Nukleinsäuregemisch, aber nicht mit anderen Sequenzen hybridisiert. Stringente Bedingungen sind sequenzabhängig und sind unter verschiedenen Umständen unterschiedlich. Längere Sequenzen hybridisieren spezifisch bei höheren Temperaturen. Eine umfangreiche Führung zur Hybridisierung von Nukleinsäuren ist in Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology – Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993), zu finden. Im Allgemeinen werden stringente Bedingungen als etwa 5–10°C niedriger als der thermische Schmelzpunkt (T_m) für die spezifische Sequenz bei einer definierten Ionenstärke pH ausgewählt. Die T_m ist die Temperatur (unter definierter Ionenstärke, pH, und Nukleinsäurekonzentration), bei der 50% der Sonden komplementär zum Ziel mit der Zielsequenz bei Gleichgewicht hybridisieren (wenn die Zielsequenzen im Überschuß vorliegen, werden bei T_m 50% der Sonden im Gleichgewicht belegt). Stringente Bedingungen sind diejenigen, unter denen die Salzkonzentration geringer ist als etwa 1,0 M Natriumion, typischerweise etwa 0,01 bis 1,0 M Natriumionenkonzentration (oder andere Salze) bei pH 7,0 bis 8,3 und die Temperatur zumindest etwa 30°C für kurze Sonden (z.B. 10 bis 50 Nukleotide) und mindestens etwa 60°C für lange Sonden (z.B. mehr als 50 Nukleotide) ist. Stringente Bedingungen können auch mit der Zugabe von Destabilisierungsmitteln wie z.B. Formamid erreicht werden. Für selektive oder spezifische Hybridisierung ist ein positives Signal mindestens zweimal der Hintergrund, vorzugsweise 10-mal die Hintergrundhybridisierung. Beispielhafte stringente Hybridisierungsbedingungen können folgende sein: 50% Formamid, 5 × SSC und 1 % SDS, Inkubieren bei 42°C, oder 5 × SSC, 1 % SDS, Inkubieren bei 65°C, mit Waschen in 0,2 × SSC und 0,1% SDS bei 65°C.
Nukleinsäuren, die unter stringenten Bedingungen nicht miteinander hybridisieren, sind dennoch im Wesentlichen identisch, wenn die Polypeptide, die sie codieren, im Wesentlichen identisch sind. Dies geschieht beispielsweise, wenn eine Kopie einer Nukleinsäure unter Verwendung der maximalen Codondegeneration, die durch den genetischen Code zugelassen wird, erzeugt wird. In solchen Fällen hybridisieren die Nukleinsäuren typischerweise unter mäßig stringenten Hybridisierungsbedingungen. Beispielhafte "mäßig stringente Hybridisierungsbedingungen" umfassen eine Hybridisierung in einem Puffer von 40% Formamid, 1M NaCl, 1% SDS bei 37°C und Waschen in 1 × SCC bei 45°C. Eine positive Hybridisierung ist mindestens zweimal der Hintergrund. Fachleute werden leicht erkennen, daß alternative Hybridisierungs- und Waschbedingungen verwendet werden können, um Bedingungen ähnlicher Stringenz vorzusehen.
"Antikörper" bezieht sich auf ein Polypeptid mit einem Gerüstbereich von einem Immunoglobulingen oder Fragmenten davon, das spezifisch an ein Antigen bindet und dieses erkennt. Die erkannten Immunoglobulingene umfassen die Kappa-, Lambda-, Alpha-, Gamma-, Delta-, Epsilon- und Mu-Gene des konstanten Bereichs sowie die Myriad-Immunoglobulingene des variablen Bereichs. Leichte Ketten werden entweder als Kappa oder Lambda klassifiziert. Schwere Ketten werden als Gamma, Mu, Alpha, Delta oder Epsilon klassifiziert, die wiederum die Immunoglobulinklassen IgG, IgM, IgA, IgD bzw. IgE definieren.
Eine beispielhafte Immunoglobulin- (Antikörper) Struktureinheit umfaßt ein Tetramer. Jedes Tetramer besteht aus zwei identischen Paaren von Polypeptidketten, wobei jedes Paar eine "leichte" (etwa 25 kDa) und eine "schwere" Kette (etwa 50–70 kDa) aufweist. Das N-Ende jeder Kette definiert einen variablen Bereich von etwa 100 bis 110 oder mehr Aminosäuren, die hauptsächlich für die Antigenerkennung verantwortlich sind. Die Begriffe variable leichte Kette (V_L) und variable schwere Kette (V_H) beziehen sich auf diese leichten bzw. schweren Ketten.
Antikörper existieren z.B. als intakte Immunoglobuline oder als Anzahl von gut gekennzeichneten Fragmenten, die durch Abbau mit verschiedenen Peptidasen hergestellt werden. Pepsin baut somit beispielsweise einen Antikörper unter den Disulfidbindungen im Gelenkbereich ab, um F(ab)'₂, ein Dimer von Fab, zu erzeugen, das selbst eine leichte Kette aufweist, die mit V_H-C_H1 durch eine Disulfidbindung verbunden ist. Das F(ab)'₂ kann unter milden Bedingungen reduziert werden, um die Disulfidbindung im Gelenkbereich aufzubrechen, wodurch das F(ab)'₂-Dimer in ein Fab'-Monomer umgewandelt wird. Das Fab'-Monomer ist im Wesentlichen Fab mit einem Teil des Gelenkbereichs (siehe Fundamental Immunology (Paul Hrsg., 3. Ausg. 1993)). Obwohl verschiedene Antikörperfragmente hinsichtlich des Abbaus eines intakten Antikörpers definiert sind, wird ein Fachmann erkennen, daß solche Fragmente entweder chemisch oder unter Verwendung von rekombinanter DNA-Methodologie neu synthetisiert werden können. Folglich umfaßt der Begriff Antikörper, wie hierin verwendet, auch Antikörperfragmente, die entweder durch die Modifikation von ganzen Antikörpern hergestellt werden, oder diejenigen, die neu unter Verwendung von rekombinanten DNA-Methodologien (z.B. Ein-Ketten-Fv) synthetisiert werden, oder diejenigen, die unter Verwendung von Phagen-Display-Bibliotheken identifiziert werden (siehe z.B. McCafferty et al., Nature 348:552–554 (1990)).
Zur Herstellung von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern kann ein beliebiges auf dem Fachgebiet bekanntes Verfahren verwendet werden (siehe z.B. Kohler & Milstein, Nature 256:495–497 (1975); Kozbor et al., Immunology Today 4: 72 (1983); Cole et al., S. 77–96 in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (1985)). Verfahren für die Herstellung von Ein-Ketten-Antikörpern (US-Patent 4 946 778) können dazu ausgelegt werden, Antikörper für Polypeptide dieser Erfindung herzustellen. Transgene Mäuse oder andere Organismen wie z.B. andere Säuger können auch verwendet werden, um humanisierte Antikörper zu exprimieren. Alternativ kann die Phagen-Display-Technologie verwendet werden, um Antikörper und heteromere Fab-Fragmente zu identifizieren, die spezifisch an ausgewählte Antigene binden (siehe z.B. McCafferty et al., Nature 348:552–554 (1990); Marks et al., Biotechnology 10:779–783 (1992)).
Ein "chimärer Antikörper" ist ein Antikörpermolekül, in dem (a) der konstante Bereich oder ein Teil davon geändert, ersetzt oder ausgetauscht ist, so daß die Antigenbindungsstelle (variabler Bereich) mit einem konstanten Bereich einer anderen oder geänderten Klasse, einer Effektorfunktion und/oder Spezies oder einem vollständig anderen Molekül, das dem chimären Antikörper neue Eigenschaften verleiht, z.B. einem Enzym, Toxin, Hormon, Wachstumsfaktor, Arzneimittel usw., verbunden ist; oder (b) der variable Bereich oder ein Teil davon geändert, ersetzt oder gegen einen variablen Bereich mit einer anderen oder geänderten Antigenspezifität ausgetauscht ist.
Ein "Anti-BCA-GPCR"-Antikörper ist ein Antikörper oder ein Antikörperfragment, der/das spezifisch an ein Polypeptid bindet, das durch ein BCA-GPCR-Gen, cDNA oder eine Teilsequenz davon codiert wird.
Der Begriff "Immuntest" ist ein Test, der einen Antikörper verwendet, um ein Antigen spezifisch zu binden. Der Immuntest ist durch die Verwendung von spezifischen Bindungseigenschaften eines speziellen Antikörpers gekennzeichnet, um das Antigen zu isolieren, auf dieses abzuzielen und/oder dieses zu quantifizieren.
Der Ausdruck "bindet spezifisch (oder selektiv)" an einen Antikörper oder "ist spezifisch (oder selektiv) immunreaktiv mit", wenn auf ein Protein oder Peptid Bezug genommen wird, bezieht sich auf eine Bindungsreaktion, die die Anwesenheit des Proteins in einer heterogenen Population von Proteinen oder anderer Biologie bestimmt. Unter festgelegten Immuntestbedingungen binden die festgelegten Antikörper folglich an ein spezielles Protein mindestens zweimal den Hintergrund und binden im Wesentlichen nicht in einer signifikanten Menge an andere Proteine, die in der Probe vorliegen. Die spezifische Bindung an einen Antikörper unter solchen Bedingungen kann einen Antikörper erfordern, der wegen seiner Spezifität für ein spezielles Protein ausgewählt wird. Polyklonale Antikörper, die gegen einen speziellen BCA-GPCR erhöht sind, können beispielsweise ausgewählt werden, um nur diejenigen polyklonalen Antikörper zu erhalten, die mit dem BCA-GPCR spezifisch immunreaktiv sind, und nicht mit anderen Proteinen, abgesehen von polymorphen Varianten, Orthologen und Allelen des BCA-GPCR. Diese Auswahl kann durch Subtrahieren von Antikörpern, die mit BCA-GPCR-Molekülen kreuzreagieren, erreicht werden. Eine Vielfalt von Immuntestformaten kann verwendet werden, um Antikörper auszuwählen, die spezifisch mit einem speziellen Protein immunreaktiv sind. Festphasen-ELISA-Immuntests werden beispielsweise routinemäßig verwendet, um Antikörper auszuwählen, die mit einem Protein spezifisch immunreaktiv sind (siehe z.B. Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988) für eine Beschreibung von Immuntestformaten und Bedingungen, die verwendet werden können, um die spezifische Immunreaktivität zu bestimmen). Typischerweise ist eine spezifische oder selektive Immunreaktion mindestens zweimal das Hintergrundsignal oder Rauschen und typischerweise mehr als 10 bis 100-mal der Hintergrund. Antikörper, die nur mit einem speziellen BCA-GPCR-Orthologen, z.B. von spezifischen Spezies wie z.B. einer Ratte, einer Maus oder einem Menschen, reagieren, können auch hergestellt werden, wie vorstehend beschrieben, indem Antikörper subtrahiert werden, die an denselben BCA-GPCR von anderen Spezies binden.
Der Ausdruck "verbindet selektiv mit" bezieht sich auf die Fähigkeit einer Nukleinsäure, mit einer anderen "selektiv zu hybridisieren", wie vorstehend definiert, oder die Fähigkeit eines Antikörpers, an ein Protein "selektiv (oder spezifisch) zu binden", wie vorstehend definiert.
Isolation von Nukleinsäuren, die BCA-GPCRs codieren.
A. Allgemeine rekombinante DNA-Verfahren
Diese Erfindung beruht auf Routineverfahren auf dem Gebiet der rekombinanten Genetik. Basistexte, die die allgemeinen Verfahren zur Verwendung in dieser Erfindung offenbaren, umfassen Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2. Ausg. 1989); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); und Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., Hrsg., 1994).
Für Nukleinsäuren werden die Größen entweder Kilobasen (kb) oder Basenpaaren (bp) gegeben. Diese sind Abschätzungen, die von Agarose- oder Acrylamid-Gelelektrophorese, von sequenzierten Nukleinsäuren oder von veröffentlichten DNA-Sequenzen abgeleitet sind. Für Proteine werden die Größen in Kilodalton (kDa) oder Aminosäurerestnummern gegeben. Proteingrößen sind aus Gelelektrophorese, aus sequenzierten Proteinen, aus abgeleiteten Aminosäuresequenzen oder aus veröffentlichten Proteinsequenzen abgeschätzt.
Oligonukleotide, die nicht kommerziell erhältlich sind, können gemäß dem Festphasen-Phosphoramidittriester-Verfahren, das zuerst von Beaucage & Caruthers, Tetrahedron Letts. 22:1859–1862 (1981), beschrieben wurde, unter Verwendung eines automatisierten Synthesizers, wie in Van Devanter et al., Nucleic Acids Res. 12:6159–6168 (1984) beschrieben, chemisch synthetisiert werden. Die Reinigung von Oligonukleotiden geschieht entweder durch natürliche Acrylamid-Gelelektrophorese oder durch Anionenaustausch-HPLC, wie in Pearson & Reanier, J. Chrom. 255:137–149 (1983), beschrieben.
Die Sequenz der klonierten Gene und synthetischen Oligonukleotide kann nach dem Klonieren z.B. unter Verwendung des Kettenabbruchverfahrens zum Sequenzieren von doppelsträngigen Schablonen von Wallace et al., Gene 16:21–26 (1981), überprüft werden.
B. Klonierungsverfahren für die Isolation von Nukleotidsequenzen, die BCA-GPCRs codieren
Im Allgemeinen werden die Nukleinsäuresequenzen, die BCA-GPCRs codieren, und verwandte Nukleinsäuresequenzhomologe aus cDNA und genomischen DNA-Bibliotheken durch Hybridisierung mit einer Sonde kloniert oder unter Verwendung von Amplifikationsverfahren mit Oligonukleotidprimern isoliert. BCA-GPCR-Sequenzen werden beispielsweise typischerweise aus Säugernukleinsäure- (genomisch oder cDNA) Bibliotheken durch Hybridisieren mit einer Nukleinsäuresonde, deren Sequenz aus SEQ ID NRN.: 1, 3, 5 oder 7 abgeleitet werden kann, isoliert. Geeignete Gewebe, aus denen BCA-GPCR-RNA und -cDNA isoliert werden können, umfassen z.B. Brustkrebszellen, normale Prostata-Epithelialzellen, Plazenta oder Hoden.
Amplifikationsverfahren unter Verwendung von Primern können auch verwendet werden, um BCA-GPCR-Nukleinsäuren aus DNA oder RNA zu amplifizieren und isolieren. Die degenerierten Primer, die die folgenden Aminosäuresequenzen codieren, können auch verwendet werden, um eine Sequenz eines BCA-GPCR zu amplifizieren: SEQ ID NRN.: 9–16 (siehe z.B. Dieffenfach & Dveksler, PCR Primer: A Laboratory Manual (1995)). Diese Primer können z.B. verwendet werden, um entweder die Sequenz voller Länge oder eine Sonde von einem bis mehreren hundert Nukleotiden zu amplifizieren, die dann verwendet wird, um eine Säugerbibliothek nach BCA-GPCRs voller Länge zu screenen.
Nukleinsäuren, die BCA-GPCRs codieren, können auch aus Expressionsbibliotheken unter Verwendung von Antikörpern als Sonden isoliert werden. Solche polyklonalen oder monoklonalen Antikörper können unter Verwendung der Sequenz von SEQ ID NRN.: 2, 4, 6 oder 8 angehoben werden.
Polymorphe BCA-GPCR-Varianten, Allele und Interspezies-Homologe, die zu einem BCA-GPCR im Wesentlichen identisch sind, können unter Verwendung von BCA-GPCR-Nukleinsäuresonden und Oligonukleotiden unter stringenten Hybridisierungsbedingungen durch Screeningbibliotheken isoliert werden. Alternativ können Expressionsbibliotheken verwendet werden, um BCA-GPCRs und polymorphe BCA-GPCR-Varianten, Allele und Interspezies-Homologe durch immunologisches Nachweisen von exprimierten Homologen mit Antisera oder gereinigten Antikörpern, die gegen BCA-GPCRs hergestellt sind, die auch das BCA-GPCR-Homolog erkennen und selektiv an dieses binden, zu klonieren.
Um eine cDNA-Bibliothek herzustellen, sollte man eine Quelle wählen, die reich an BCA-GPCR-mRNA ist. Die mRNA wird dann unter Verwendung von Umkehrtranskriptase zu cDNA gemacht, zu einem rekombinanten Vektor ligiert und in einen rekombinanten Wirt zur Ausbreitung, zum Screenen und zum Klonieren transfiziert. Verfahren zur Herstellung und zum Screenen von cDNA-Bibliotheken sind gut bekannt (siehe z.B. Gubler & Hoffman, Gene 25:263–269 (1983); Sambrook et al., oben; Ausubel et al., oben).
Für eine genomische Bibliothek wird die DNA aus dem Gewebe extrahiert und entweder mechanisch geschert oder enzymatisch abgebaut, um Fragmente von etwa 12–20 kb zu ergeben. Die Fragmente werden dann durch Gradientenzentrifugation von unerwünschten Größen getrennt und werden in Bakteriophagen-Lambdavektoren konstruiert. Diese Vektoren und Phagen werden in vitro verpackt. Rekombinante Phagen werden durch Plaquehybridisierung analysiert, wie in Benton & Davis, Science 1964180–182 (1977) beschrieben. Eine Koloniehybridisierung wird ausgeführt, wie im Allgemeinen in Grunstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72:3961–3965 (1975), beschrieben.
Ein alternatives Verfahren zum Isolieren von BCA-GPCR-Nukleinsäuren und ihrer Homologe kombiniert die Verwendung von synthetischen Oligonukleotidprimern und die Amplifikation einer RNA- oder DNA-Schablone (siehe US-Patente 4 683 195 und 4 683 202; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis et al., Hrsg., 1990)). Verfahren wie z.B. Polymerasekettenreaktion (PCR) und Ligasekettenreaktion (LCR) können verwendet werden, um Nukleinsäuresequenzen von BCA-GPCRs direkt aus mRNA, aus cDNA, aus genomischen Bibliotheken oder cDNA-Bibliotheken zu amplifizieren. Degenerierte Oligonukleotide können festgelegt werden, um BCA-GPCR-Homologe unter Verwendung der hierin bereitgestellten Sequenzen zu amplifizieren. Restriktions-Endonukleasestellen können in die Primer integriert werden. Polymerasekettenreaktion oder andere In-Vitro-Amplifikationsverfahren können auch nützlich sein, beispielsweise um Nukleinsäuresequenzen zu klonieren, die zu exprimierende Proteine codieren, um Nukleinsäuren zur Verwendung als Sonden zum Nachweisen der Anwesenheit von BCA-GPCR codierender mRNA in physiologischen Proben, für Nukleinsäuresequenzierung oder für andere Zwecke herzustellen. Gene, die durch die PCR-Reaktion amplifiziert werden, können aus Agarosegelen gereinigt und zu einem geeigneten Vektor kloniert werden.
Die Genexpression von BCA-GPCRs kann auch durch auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren analysiert werden, z.B. Umkehrtranskription und Amplifikation von mRNA, Isolation von gesamter RNA oder Poly-A⁺-RNA, Northern-Blotting, Dot-Blotting, In-Situ-Hybridisierung, RNase-Schutz, Prüfen von DNA-Mikrochipanordnungen und dergleichen. In einem Ausführungsbeispiel wird die hochdichte Oligonukleotid-Analysetechnologie (z.B. GeneChip^TM) verwendet, um homologe und polymorphe Varianten der GPCRs der Erfindung zu identifizieren. In dem Fall, in dem die identifizierten Homologen mit einer bekannten Krankheit verbunden sind, können sie mit GeneChip^TM als Diagnosewerkzeug beim Nachweis der Krankheit in einer biologischen Probe verwendet werden, siehe z.B. Gunthand et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 14: 869–876 (1998); Kozal et al., Nat. Med. 2:753–759 (1996); Matson et al., Anal. Biochem. 224:110–106 (1995); Lockhart et al., Nat. Biotechnol. 14:1675–1680 (1996); Gingeras et al., Genome Res. 8:435–448 (1998); Hacia et al., Nucleic Acids Res. 26:3865–3866 (1998).
Synthetische Oligonukleotide können verwendet werden, um rekombinante BCA-GPCR-Gene zur Verwendung als Sonden oder zur Expression von Protein zu konstruieren. Dieses Verfahren wird unter Verwendung einer Reihe von überlappenden Oligonukleotiden, die gewöhnlich 40 – 120 bp lang sind, die sowohl die Sinn- als auch Nicht-Sinn-Stränge des Gens darstellen, durchgeführt. Diese DNA-Fragmente werden dann Doppelstrangbildung unterzogen, ligiert und kloniert. Alternativ können Amplifikationsverfahren mit präzisen Primern verwendet werden, um eine spezifische Teilsequenz der BCA-GPCR-Nukleinsäure zu amplifizieren. Die spezifische Teilsequenz wird dann zu einem Expressionsvektor ligiert.
Die Nukleinsäure, die einen BCA-GPCR codiert, wird typischerweise vor der Transformation in prokaryotische oder eukaryotische Zellen zur Replikation und/oder Expression in Zwischenvektoren kloniert. Diese Zwischenvektoren sind typischerweise Prokaryotenvektoren, z.B. Plasmide, oder Pendelvektoren.
Wahlweise können Nukleinsäuren, die chimäre Proteine mit BCA-GPCRs oder Domänen davon codieren, gemäß Standardverfahren hergestellt werden. Eine Domäne wie z.B. eine Ligandenbindungsdomäne, eine extrazelluläre Domäne, eine Transmembrandomäne (z.B. eine mit sieben Transmembranbereichen und entsprechenden extrazellulären und cytosolischen Schleifen), die Transmembrandomäne und eine zytoplasmatische Domäne, eine aktive Stelle, ein Untereinheitsverbindungsbereich usw. können beispielsweise kovalent mit einem heterologen Protein verbunden werden. Eine extrazelluläre Domäne kann beispielsweise mit einer heterologen GPCR-Transmembrandomäne verbunden werden oder eine heterologe extrazelluläre GPCR-Domäne kann mit einer Transmembrandomäne verbunden werden. Andere heterologe Proteine der Wahl umfassen z.B. grünes fluoreszentes Protein, Luciferase oder β-Gal.
C. Expression in Prokaryoten und Eukaryoten
Um eine Expression mit hohem Niveau eines klonierten Gens oder einer klonierten Nukleinsäure wie z.B. jener cDNAs, die BCA-GPCRs codieren, zu erhalten, subkloniert man typischerweise einen BCA-GPCR zu einem Expressionsvektor, der einen starken Promotor für die direkte Transkription, einen Transkriptions/Translations-Terminator, und wenn für eine Nukleinsäure, die ein Protein codiert, eine Ribosombindungsstelle für die Translationseinleitung enthält. Geeignete bakterielle Promotoren sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und z.B. in Sambrook et al. und Ausubel et al. beschrieben. Bakterielle Expressionssysteme zum Exprimieren des BCA-GPCR-Proteins sind z.B. in E. coli, Bacillus sp. und Salmonella (Palva et al., Gene 22:229–235 (1983); Mosbach et al., Nature 302:543–545 (1983), beschrieben. Ausrüstungen für solche Expressionssysteme sind kommerziell erhältlich. Eukaryotische Systeme für Säugerzellen, Hefe und Insektenzellen sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und sind auch kommerziell erhältlich. In einem Ausführungsbeispiel ist der eukaryotische Expressionsvektor ein Adenovirusvektor, ein Adeno-zugehöriger Vektor oder ein retroviraler Vektor.
Der Promotor, der verwendet wird, um die Expression einer heterologen Nukleinsäure zu lenken, hängt von der speziellen Anwendung ab. Der Promotor ist wahlweise etwa im gleichen Abstand von der heterologen Transkriptionsstartstelle angeordnet wie von der Transkriptionsstartstelle in seiner natürlichen Festlegung. Wie auf dem Fachgebiet bekannt ist, kann jedoch einer gewissen Variation in diesem Abstand ohne Verlust der Promotorfunktion Rechnung getragen werden.
Zusätzlich zum Promotor enthält der Expressionsvektor typischerweise eine Transkriptionseinheit oder eine Expressionskassette, die alle zusätzlichen Elemente enthält, die für die Expression der BCA-GPCR codierenden Nukleinsäure in Wirtszellen erforderlich sind. Eine typische Expressionskassette enthält somit einen Promotor, der wirksam mit der Nukleinsäuresequenz verbunden ist, die einen BCA-GPCR codiert, und Signale, die für eine effiziente Polyadenlyierung des Transkripts, der Ribosombindungsstellen und der Translationsbeendung erforderlich sind. Die Nukleinsäuresequenz, die einen BCA-GPCR codiert, kann typischerweise mit einer spaltbaren Signalpeptidsequenz verbunden sein, um die Sekretion des codierten Proteins durch die transformierte Zelle zu fördern. Solche Signalpeptide würden unter anderem die Signalpeptide von Gewebeplasminogenaktivator, Insulin und Neuronenwachstumsfaktor und Juvenilhormonesterase von Heliothis virescens umfassen. Zusätzliche Elemente der Kassette können Verstärker, und wenn genomische DNA als Strukturgen verwendet wird, Introne mit funktionalen Spleißdonor- und -akzeptorstellen umfassen.
Zusätzlich zu einer Promotorsequenz sollte die Expressionskassette auch einen Transkriptionsendbereich stromabwärts vom Strukturgen enthalten, um für eine effiziente Beendung zu sorgen. Der Endbereich kann aus demselben Gen wie der Promotorsequenz erhalten werden oder kann aus verschiedenen Genen erhalten werden.
Der spezielle Expressionsvektor, der verwendet wird, um die genetische Information in die Zelle zu transportieren, ist nicht besonders kritisch. Ein beliebiger der herkömmlichen Vektoren, die zur Expression in eukaryotischen oder prokaryotischen Zellen verwendet werden, kann verwendet werden. Bakterielle Standard-Expressionsvektoren umfassen Plasmide wie z.B. auf pBR322 basierende Plasmide, pSKF, pET23D und Fusionsexpressionssysteme wie z.B. GST und LacZ. Epitopmarker können auch zu rekombinanten Proteinen hinzugefügt werden, um zweckmäßige Isolationsverfahren bereitzustellen, z.B. c-myc.
Expressionsvektoren, die regulierende Elemente von eukaryotischen Viren enthalten, werden typischerweise in eukaryotischen Expressionsvektoren verwendet, z.B. SV40-Vektoren, Papilloma-Virus-Vektoren und Vektoren, die vom Epstein-Barr-Virus abgeleitet sind. Andere beispielhafte eukaryotische Vektoren umfassen pMSG, pAV009/A⁺, pMTO10/A⁺, pMAMneo-5, Baculovirus pDSVE, und einen beliebigen anderen Vektor, der die Expression von Proteinen unter der Leitung des frühen SV40-Promotors, späteren SV40-Promotors, Metallothionein-Promotors, Mäusesäugertumorvirus-Promotors, Rous-Sarcoma-Virus-Promotors, Polyhedrin-Promotors oder anderer Promotoren, die als für die Expression in eukaryotischen Zellen wirksam gezeigt wurden, ermöglicht.
Einige Expressionssysteme haben Marker, die eine Genamplifikation bereitstellen, wie z.B. Thymidinkinase, Hygromycin B Phosphotransferase und Dihydrofolatreduktase. Alternativ sind Expressionssysteme mit hoher Ausbeute, die keine Genamplifikation beinhalten, auch geeignet, wie z.B. unter Verwendung eines Baculovirus-Vektors in Insektenzellen, mit einer BCA-GPCR codierenden Sequenz unter der Leitung des Polyhedrin-Promotors oder anderen starken Baculovirus-Promotoren.
Die Elemente, die typischerweise in Expressionsvektoren eingeschlossen sind, umfassen auch ein Replikon, das in E. coli funktioniert, ein Gen, das Antibiotikaresistenz codiert, um die Auswahl von Bakterien, die rekombinante Plasmide beherbergen, und eindeutige Restriktionsstellen in nicht-wesentlichen Bereichen des Plasmids zu ermöglichen, um die Insertion von eukaryotischen Sequenzen zu ermöglichen. Das gewählte spezielle Antibiotikaresistenzgen ist nicht kritisch, irgendeines der vielen auf dem Fachgebiet bekannten Resistenzgene ist geeignet. Die prokaryotischen Sequenzen werden optimal gewählt, so daß sie die Replikation der DNA in eukaryotischen Zellen nicht stören, falls erforderlich.
Standard-Transfektionsverfahren werden verwendet, um bakterielle, Säuger-, Hefe- oder Insektenzellinien zu erzeugen, die große Mengen von BCA-GPCR-Protein exprimieren, die dann unter Verwendung von Standardverfahren gereinigt werden (siehe z.B. Colley et al., J. Biol. Chem. 264:17619–17622 (1989); Guide to Protein Purification, in Methods in Enzymology, Band 182 (Deutscher, Hrsg., 1990)). Die Transformation von eukaryotischen und prokaryotischen Zellen wird gemäß Standardverfahren durchgeführt (siehe z.B. Morrison, J. Bact. 132:349–351 (1977); Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology 101:347–362 (Wu et al., Hrsg., 1983).
Beliebige der gut bekannten Verfahren zum Einführen von fremden Nukleotidsequenzen in Wirtszellen können verwendet werden. Diese umfassen die Verwendung von Kalziumphosphat-Transfektion, Polybren, Protoplastfusion, Elektroporation, Liposomen, Mikroinjektion, Plasmavektoren, Virusvektoren und beliebiger der anderen gut bekannten Verfahren zur Einführung von klonierter genomischer DNA, cDNA, synthetischer DNA oder anderem fremden genetischen Material in eine Wirtszelle (siehe z.B. Sambrook et al., oben). Es ist nur erforderlich, daß die spezielle Gentechnikprozedur, die verwendet wird, in der Lage ist, mindestens ein Gen erfolgreich in die Wirtszelle einzuführen, die in der Lage ist, einen BCA-GPCR zu exprimieren.
Nachdem der Expressionsvektor in die Zellen eingeführt ist, werden die transfizierten Zellen unter Bedingungen kultiviert, die die Expression eines BCA-GPCR begünstigen, welcher aus der Kultur unter Verwendung von nachstehend identifizierten Standardverfahren zurückgewonnen wird.
Reinigung von BCA-GPCRs
Entweder natürlich vorkommende oder rekombinante BCA-GPCRs können zur Verwendung in funktionalen Tests gereinigt werden. Wahlweise werden rekombinante BCA-GPCRs gereinigt. Natürlich vorkommende BCA-GPCRs werden z.B. aus einem beliebigen geeigneten Gewebe oder einer beliebigen geeigneten Zelle, die natürlich vorkommende BCA-GPCRs exprimiert, gereinigt. Rekombinante BCA-GPCRs werden aus einem beliebigen geeigneten bakteriellen oder eukaryotischen Expressionssystem, z.B. CHO-Zellen oder Insektenzellen, gereinigt.
Ein BCA-GPCR kann durch Standardverfahren auf beträchtliche Reinheit gereinigt werden, einschließlich selektives Ausfällen mit solchen Substanzen wie Ammoniumsulfat; Säulenchromatographie, Immunreinigungsverfahren und andere (siehe z.B. Scopes, Protein Purification: Principles and Practice (1982); US-Patent Nr. 4 673 641; Ausubel et al., oben; und Sambrook et al., oben).
Eine Anzahl von Verfahren kann verwendet werden, wenn ein rekombinanter BCA-GPCR gereinigt wird. Proteine mit festgelegten molekularen Haftungseigenschaften können beispielsweise reversibel mit einem BCA-GPCR fusioniert werden. Mit dem geeigneten Liganden kann ein BCA-GPCR selektiv an einer Reinigungssäule adsorbiert werden und dann von der Säule in einer relativ reinen Form befreit werden. Das fusionierte Protein wird dann durch enzymatische Aktivität entfernt. Schließlich könnte ein BCA-GPCR unter Verwendung von Immunaffinitätssäulen gereinigt werden.
A. Reinigung von BCA-GPCRs aus rekombinanten Zellen
Rekombinante Proteine werden durch transformierte Bakterien oder eukaryotische Zellen wie z.B. CHO-Zellen oder Insektenzellen in großen Mengen, typischerweise nach Promotorinduktion, exprimiert; die Expression kann jedoch konstitutiv sein. Die Promotorinduktion mit IPTG ist ein Beispiel eines induzierbaren Promotorsystems. Zellen werden gemäß Standardverfahren auf dem Fachgebiet gezüchtet. Frische oder gefrorene Zellen werden zur Isolation von Protein verwendet.
Proteine, die in Bakterien exprimiert werden, können unlösliche Aggregate bilden ("Einschlußkörper"). Verschiedene Protokolle sind für die Reinigung von BCA-GPCR-Einschlußkörpern geeignet. Die Reinigung von Einschlußkörpern beinhaltet beispielsweise typischerweise die Extraktion, Trennung und/oder Reinigung von Einschlußkörpern durch Aufbrechen von Bakterienzellen, z.B. durch Inkubation in einem Puffer mit 50 mM TRIS/HCL, pH 7,5, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 0,1 mM ATP und 1 mM PMSF. Die Zellsuspension kann unter Verwendung von 2–3 Durchgängen durch eine French-Press lysiert werden, unter Verwendung eines Polytron (Brinkman Instruments) homogenisiert werden oder auf Eis beschallt werden. Alternative Verfahren zum Lysieren sind für Fachleute ersichtlich (siehe z.B. Sambrook et al., oben; Ausubel et al., oben).
Falls erforderlich, werden die Einschlußkörper solubilisiert und die lysierte Zellsuspension wird typischerweise zentrifugiert, um ungewollten unlöslichen Stoff zu entfernen. Proteine, die die Einschlußkörper gebildet haben, können durch Verdünnung oder Dialyse mit einem kompatiblen Puffer renaturiert werden. Geeignete Lösungsmittel umfassen, sind jedoch nicht begrenzt auf Harnstoff (von etwa 4 M bis etwa 8 M), Formamid (mindestens etwa 80%, Volumen/Volumen-Basis) und Guanidinhydrochlorid (von etwa 4 M bis etwa 8 M). Einige Lösungsmittel, die in der Lage sind, Aggregat bildende Proteine zu solubilisieren, beispielsweise SDS (Natriumdodecylsulfat), 70% Ameisensäure, sind zur Verwendung in diesem Verfahren aufgrund der Möglichkeit der irreversiblen Denaturierung der Proteine, die von einem Mangel an Immunogenität und/oder Aktivität begleitet wird, ungeeignet. Obwohl Guanidinhydrochlorid und ähnliche Mittel Denaturierungsmittel sind, ist diese Denaturierung nicht irreversibel und die Renaturierung kann bei der Entfernung (beispielsweise durch Dialyse) oder Verdünnung des Denaturierungsmittels auftreten, was die Rückbildung des immunologisch und/oder biologisch aktiven Proteins ermöglicht. Andere geeignete Puffer sind Fachleuten bekannt. Der BCA-GPCR wird aus anderen bakteriellen Proteinen durch Standard-Trennverfahren, z.B. mit Ni-NTA-Agaroseharz, getrennt.
Alternativ ist es möglich, den BCA-GPCR aus Bakterienperiplasma zu reinigen. Nach der Lyse der Bakterien, wenn der BCA-GPCR in das Periplasma der Bakterien exportiert wird, kann der Periplasmaanteil der Bakterien durch kalten osmotischen Schock zusätzlich zu anderen Fachleuten bekannten Verfahren isoliert werden. Um rekombinante Proteine aus dem Periplasma zu isolieren, werden die Bakterienzellen zentrifugiert, um ein Pellet zu bilden. Das Pellet wird in einem Puffer, der 20% Saccharose enthält, resuspendiert. Um die Zellen zu lysieren, werden die Bakterien zentrifugiert und das Pellet wird in eiskaltem 5 mM MgSO₄ resuspendiert und für ungefähr 10 Minuten in einem Eisbad gehalten. Die Zellsuspension wird zentrifugiert und der Überstand dekantiert und aufbewahrt. Die rekombinanten Proteine, die im Überstand vorliegen, können von den Wirtsproteinen durch Standard-Trennverfahren, die Fachleuten gut bekannt sind, getrennt werden.
B. Standard-Proteintrennverfahren zum Reinigen von BCA-GPCRs
Löslichkeitsfraktionierung
Häufig kann als Anfangsschritt, insbesondere wenn das Proteingemisch komplex ist, eine anfängliche Salzfraktionierung viele der ungewollten Wirtszellenproteine (oder Proteine, die von den Zellkulturmedien abgeleitet sind) von den rekombinanten interessierenden Proteinen trennen. Das bevorzugte Salz ist Ammoniumsulfat. Ammoniumsulfat fällt Proteine durch effektives Verringern der Menge an Wasser im Proteingemisch aus. Die Proteine fällen dann auf der Basis ihrer Löslichkeit aus. Je hydrophober ein Protein ist, desto wahrscheinlicher fällt es bei niedrigeren Ammoniumsulfatkonzentrationen aus. Ein typisches Protokoll umfaßt das Zugeben von gesättigtem Ammoniumsulfat zu einer Proteinlösung, so daß die resultierende Ammoniumsulfatkonzentration zwischen 20 und 30% liegt. Diese Konzentration fällt die meisten hydrophoben Proteine aus. Der Niederschlag wird dann weggeworfen (wenn nicht das interessierende Protein hydrophob ist) und Ammoniumsulfat wird zum Überstand in einer bekannten Konzentration zugegeben, um das interessierende Protein auszufällen. Der Niederschlag wird dann in Puffer solubilisiert und das überschüssige Salz entweder durch Dialyse oder Diafiltration entfernt, falls erforderlich. Andere Verfahren, die auf der Löslichkeit von Proteinen beruhen, wie z.B. kalte Ethanolausfällung, sind Fachleuten gut bekannt und können verwendet werden, um komplexe Proteingemische zu fraktionieren.
Größendifferenzfiltration
Das Molekulargewicht eines BCA-GPCR kann verwendet werden, um ihn von Proteinen mit größerer und kleinerer Größe unter Verwendung von Ultrafiltration durch Membranen mit unterschiedlicher Porengröße (beispielsweise Amicon- oder Millipore-Membranen) zu isolieren. Als ersten Schritt wird das Proteingemisch durch eine Membran mit einer Porengröße ultrafiltriert, die eine niedrigere Molekulargewichtsgrenze aufweist als das Molekulargewicht des interessierenden Proteins. Der Filterrückstand der Ultrafiltration wird dann an einer Membran mit einer Molekulargrenze ultrafiltriert, die größer ist als das Molekulargewicht des interessierenden Proteins. Das rekombinante Protein geht durch die Membran in das Filtrat. Das Filtrat kann dann Chromatographie unterzogen werden, wie nachstehend beschrieben.
Säulenchromatoaraphie
BCA-GPCRs können auch von anderen Proteinen auf der Basis ihrer Größe, ihrer Nettooberflächenladung, Hydrophobizität und Affinität für Liganden getrennt werden. Außerdem können Antikörper, die gegen Proteine angehoben sind, mit Säulenmatrizes konjugiert werden und die Proteine immungereinigt werden. Alle diese Verfahren sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Für einen Fachmann ist ersichtlich, daß Chromatographieverfahren in einem beliebigen Maßstab und unter Verwendung einer Ausrüstung von vielen verschiedenen Herstellern (z.B. Pharmacia Biotech) durchgeführt werden können.
Immunologischer Nachweis von BCA-GPCRs
Zusätzlich zum Nachweis von BCA-GPCR-Genen und der Genexpression unter Verwendung der Nukleinsäure-Hybridisierungstechnologie kann man auch Immuntests verwenden, um BCA-GPCRs nachzuweisen, z.B. um Zellen wie z.B. Krebszellen, insbesondere Brustkrebszellen, und Varianten von BCA-GPCRs zu identifizieren. Immuntests können verwendet werden, um BCA-GPCRs qualitativ oder quantitativ zu analysieren. Ein allgemeiner Überblick über die anwendbare Technologie ist in Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (1988), zu finden.
A. Antikörper für BCA-GPCRs
Verfahren zum Erzeugen von polyklonalen und monoklonalen Antikörpern, die spezifisch mit BCA-GPCRs reagieren, sind Fachleuten bekannt (siehe z.B. Coligan, Current Protocols in Immunology (1991); Harlow & Lane, oben; Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2. Ausg. 1986); und Kohler & Milstein, Nature 256:495–497 (1975). Solche Verfahren umfassen die Antikörperherstellung durch Auswahl von Antikörpern aus Bibliotheken von rekombinanten Antikörpern in Phagen- oder ähnlichen Vektoren sowie die Herstellung von polyklonalen und monoklonalen Antikörpern durch Immunisieren von Kaninchen oder Mäusen (siehe z.B. Huse et al., Science 246:1275–1281 (1989); Ward et al., Nature 341:544–546 (1989)). Solche Antikörper können für therapeutische und diagnostische Anwendungen verwendet werden, z.B. bei der Behandlung und/oder Erkennung von Brustkrebs.
Eine Anzahl von BCA-GPCRs mit Immunogenen können verwendet werden, um Antikörper herzustellen, die mit BCA-GPCRs spezifisch reaktiv sind. Ein rekombinanter BCA-GPCR oder ein Antigenfragment davon wird beispielsweise isoliert, wie hierin beschrieben. Ein rekombinantes Protein kann in eukaryotischen oder prokaryotischen Zellen exprimiert werden, wie vorstehend beschrieben, und gereinigt werden, wie im Allgemeinen vorstehend beschrieben. Ein rekombinantes Protein ist das bevorzugte Immunogen für die Herstellung von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern. Alternativ kann ein synthetisches Peptid, das von den hierin offenbarten Sequenzen abgeleitet ist und mit einem Trägerprotein konjugiert ist, als Immunogen verwendet werden. Ein natürlich vorkommendes Protein kann auch entweder in reiner oder unreiner Form verwendet werden. Das Produkt wird dann in ein Tier injiziert, das in der Lage ist, Antikörper zu erzeugen. Entweder monoklonale oder polyklonale Antikörper können zur anschließenden Verwendung in Immuntests zum Messen des Proteins erzeugt werden.
Verfahren zur Herstellung von polyklonalen Antikörpern sind Fachleuten bekannt. Ein Inzuchtstamm von Mäusen (z.B. BALB/C-Mäusen) oder Kaninchen wird mit dem Protein unter Verwendung eines Standardhilfsmittels wie z.B. Freund's Hilfsmittels und eines Standard-Immunisierungsprotokolls immunisiert. Die Immunreaktion des Tiers auf die Immunogenzubereitung wird überwacht, indem Testblutentnahmen genommen werden und der Titer der Reaktivität auf den BCA-GPCR bestimmt wird. Wenn geeignet hohe Titer von Antikörper des Immunogens erhalten werden, wird Blut vom Tier gesammelt und Antisera werden hergestellt. Die weitere Fraktionierung der Antisera zum Anreichern von Antikörpern, die gegen das Protein reaktiv sind, kann durchgeführt werden, falls erwünscht (siehe Harlow & Lane, oben).
Monoklonale Antikörper können durch verschiedene Verfahren erhalten werden, die Fachleuten vertraut sind. Kurz gesagt werden Milzzellen von einem Tier, die mit einem gewünschten Antigen immunisiert sind, üblicherweise durch Fusion mit einer Myelomzelle immortalisiert werden (siehe Kohler & Milstein, Eur. J. Immunol. 6:511–519 (1976)). Alternative Verfahren zur Immortalisierung umfassen die Transformation mit Epstein-Barr-Virus, Oncogenen oder Retroviren oder andere auf dem Fachgebiet gut bekannte Verfahren. Kolonien, die aus einzelnen immortalisierten Zellen entstehen, werden auf die Erzeugung von Antikörpern mit der gewünschten Spezifität und Affinität für das Antigen gescreent und die Ausbeute der monoklonalen Antikörper, die durch solche Zellen erzeugt werden, kann durch verschiedene Verfahren verbessert werden, einschließlich Injektion in die Bauchfellhöhle eines Wirbeltierwirts. Alternativ kann man DNA-Sequenzen, die einen monoklonalen Antikörper oder ein bindendes Fragment davon codieren, durch Screenen einer DNA-Bibliothek von menschlichen B-Zellen gemäß dem allgemeinen Protokoll, das von Huse et al., Science 246:1275–1281 (1989), umrissen ist, isolieren.
Monoklonale Antikörper und polyklonale Sera werden gesammelt und gegen das Immunogenprotein in einem Immuntest, beispielsweise einem Festphasen-Immuntest, wobei das Immunogen an einem festen Träger fixiert ist, titriert. Typischerweise werden polyklonale Antisera mit einem Titer von 10⁴ oder größer ausgewählt und auf ihre Kreuzreaktivität gegen Nicht-BCA-GPCR-Proteine oder sogar andere verwandte Proteine von anderen Organismen unter Verwendung eines Konkurrenz-Bindungsimmuntests getestet. Spezifische polyklonale Antisera und monoklonale Antikörper binden gewöhnlich mit einem Ka von mindestens etwa 0,1 mM, gewöhnlicher mindestens etwa 1 μM, wahlweise mindestens etwa 0,1 μM oder besser und wahlweise 0,01 μM oder besser.
Sobald BCA-GPCR-spezifische Antikörper zur Verfügung stehen, können BCA-GPCRs durch eine Vielzahl von Immuntestverfahren nachgewiesen werden. Für eine Überprüfung von immunologischen und Immuntestverfahren siehe Basic and Clinical Immunology (Stites & Terr Hrsg. 7. Ausg. 1991). Überdies können die Immuntests der vorliegenden Erfindung in einer beliebigen von mehreren Konfigurationen durchgeführt werden, die in Enzyme Immunoassay (Maggio, Hrsg., 1980); und Harlow & Lane, oben, umfangreich überprüft sind.
B. Immunologische Bindungstests
BCA-GPCRs können unter Verwendung eines beliebigen von einer Anzahl von gut erkannten immunologischen Bindungstests nachgewiesen und/oder quantifiziert werden (siehe z.B. US-Patente 4 366 241; 4 376 110; 4 517 288; und 4 837 168). Für eine Überprüfung der allgemeinen Immuntests siehe auch Methods in Cell Biology: Antibodies in Cell Biology, Band 37 (Asai, Hrsg., 1993); Basic and Clinical Immunology (Stites & Terr, Hrsg., 7. Ausg. 1991). Immunologische Bindungstests (oder Immuntests) verwenden typischerweise einen Antikörper, der spezifisch an ein Protein oder Antigen der Wahl (in diesem Fall den BCA-GPCR oder eine Antigenteilsequenz davon) bindet. Der Antikörper (z.B. Anti-BCA-GPCR) kann durch ein beliebiges einer Anzahl von Mitteln, die Fachleuten gut bekannt sind und wie vorstehend beschrieben, hergestellt werden.
Immuntests verwenden auch häufig ein Markierungsmittel, um spezifisch an den durch den Antikörper und das Antigen gebildeten Komplex zu binden und diesen zu markieren. Das Markierungsmittel kann selbst einer der Anteile sein, die den Antikörper/Antigen-Komplex umfassen. Folglich kann das Markierungsmittel ein markiertes BCA-GPCR-Polypeptid oder ein markierter Anti-BCA-GPCR-Antikörper sein. Alternativ kann das Markierungsmittel ein dritter Anteil wie z.B. ein sekundärer Antikörper sein, der spezifisch an den Antikörper/BCA-GPCR-Komplex bindet (ein sekundärer Antikörper ist typischerweise für Antikörper der Spezies, aus der der erste Antikörper abgeleitet ist, spezifisch). Andere Proteine, die in der Lage sind, konstante Immunoglobulinbereiche spezifisch zu binden, wie z.B. Protein A oder Protein G, können auch als Markierungsmittel verwendet werden. Diese Proteine weisen eine starke nicht-immunogene Reaktivität mit konstanten Immunoglobulinbereichen von einer Vielzahl von Spezies auf (siehe z.B. Kronval et al., J. Immunol. 111:1401–140.6 (1973); Akerstrom et al., J. Immunol. 135:2589–2542 (1985)). Das Markierungsmittel kann mit einem nachweisbaren Anteil wie z.B. einem Biotin modifiziert werden, an das ein anderes Molekül spezifisch binden kann, wie z.B. Streptavidin. Eine Vielzahl von nachweisbaren Anteilen sind Fachleuten gut bekannt.
In den ganzen Tests können die Inkubations- und/oder Waschschritte nach jeder Kombination von Reagenzien erforderlich sein. Inkubationsschritte können von etwa 5 Sekunden bis mehreren Stunden, wahlweise von etwa 5 Minuten bis etwa 24 Stunden, variieren. Die Inkubationszeit hängt jedoch vom Testformat, vom Antigen, vom Lösungsvolumen, von den Konzentrationen und dergleichen ab. Gewöhnlich werden die Tests bei Umgebungstemperatur ausgeführt, obwohl sie über einen Bereich von Temperaturen, wie z.B. 10°C bis 40°C, durchgeführt werden können.
Nicht-kompetitive Testformate
Immuntests zum Nachweis von BCA-GPCRs in Proben können entweder kompetitiv oder nicht-kompetitiv sein. Nicht-kompetitive Immuntests sind Tests, in denen die Menge an Antigen direkt gemessen wird. In einem bevorzugten "Sandwich"-Test können beispielsweise die Anti-BCA-GPCR-Antikörper direkt an ein festes Substrat gebunden werden, auf dem sie fixiert sind. Diese fixierten Antikörper erfassen dann BCA-GPCRs, die in der Testprobe vorhanden sind. Der so fixierte BCA-GPCR wird dann durch ein Markierungsmittel wie z.B. einen zweiten BCA-GPCR-Antikörper, der einen Marker trägt, gebunden. Alternativ kann dem zweiten Antikörper ein Marker fehlen, aber er kann wiederum durch einen markierten dritten Antikörper gebunden werden, der für Antikörper der Spezies spezifisch ist, von der der zweite Antikörper abgeleitet ist. Der zweite oder dritte Antikörper wird typischerweise mit einem nachweisbaren Anteil wie z.B. Biotin modifiziert, an den ein anderes Molekül spezifisch bindet, z.B. Streptavidin, um einen nachweisbaren Anteil bereitzustellen.
Komgetitive Testformate
In kompetitiven Tests wird die Menge an BCA-GPCR, die in der Probe vorhanden ist, durch Messen der Menge eines bekannten, zugegebenen (exogenen) BCA-GPCR, der vom Anti-BCA-GPCR-Antikörper durch den unbekannten BCA-GPCR, der in einer Probe vorliegt, verdrängt (durch Konkurrenz) wird, indirekt gemessen. In einem kompetitiven Test wird eine bekannte Menge an BCA-GPCR zu einer Probe zugegeben und die Probe wird dann mit einem Antikörper in Kontakt gebracht, der spezifisch an den BCA-GPCR bindet. Die Menge an exogenem BCA-GPCR, der an den Antikörper gebunden ist, ist umgekehrt proportional zur Konzentration an BCA-GPCR, der in der Probe vorliegt. In einem besonders bevorzugten Ausführungsbeispiel wird der Antikörper auf einem festen Substrat fixiert. Die Menge an BCA-GPCR, der an den Antikörper gebunden ist, kann entweder durch Messen der Menge an BCA-GPCR, der in einem BCA-GPCR/Antikörper-Komplex vorliegt, oder alternativ durch Messen der Menge an restlichem unkomplexiertem Protein bestimmt werden. Die Menge an BCA-GPCR kann durch Bereitstellen eines markierten BCA-GPCR-Moleküls erfaßt werden.
Ein Hapten-Inhibierungstest ist ein weiterer bevorzugter kompetitiver Test. In diesem Test wird der bekannte BCA-GPCR an einem festen Substrat fixiert. Eine bekannte Menge an Anti-BCA-GPCR-Antikörper wird zur Probe zugegeben und die Probe wird dann mit dem fixierten BCA-GPCR in Kontakt gebracht. Die Menge an Anti-BCA-GPCR-Antikörper, der an den bekannten fixierten BCA-GPCR gebunden ist, ist zur Menge an BCA-GPCR, der in der Probe vorliegt, umgekehrt proportional. Wiederum kann die Menge an fixiertem Antikörper durch Erfassen entweder der fixierten Fraktion des Antikörpers oder der Fraktion des Antikörpers, die in Lösung bleibt, erfaßt werden. Die Erfassung kann direkt sein, wenn der Antikörper markiert ist, oder indirekt sein durch die anschließende Zugabe eines markierten Anteils, der spezifisch an den Antikörper bindet, wie vorstehend beschrieben.
Kreuzreaktivitätsbestimmungen
Immuntests in kompetitiven Bindungsformat können auch für Kreuzreaktivitätsbestimmungen verwendet werden. Ein Protein, das zumindest teilweise durch SEQ ID NRN.: 2, 4, 5 und 8 codiert wird, kann beispielsweise an einem festen Träger fixiert werden. Proteine (z.B. BCA-GPCR-Proteine und Homologe) werden zum Test zugegeben, die um die Bindung der Antisera an das fixierte Antigen konkurrieren. Die Fähigkeit der zugegebenen Proteine, um die Bindung der Antisera an das fixierte Protein zu konkurrieren, wird mit der Fähigkeit von BCA-GPCRs, die durch SEQ ID NR.: 2, 4, 6 oder 8 codiert werden, mit sich zu konkurrieren, verglichen. Der Prozentsatz der Kreuzreaktivität für die obigen Proteine wird unter Verwendung von Standardberechnungen berechnet. Diejenigen Antisera mit weniger als 10% Kreuzreaktivität mit jedem der vorstehend aufgelisteten zugegebenen Proteine werden ausgewählt und gesammelt. Die kreuzreagierenden Antikörper werden wahlweise aus den gesammelten Antisera durch Immunabsorption mit den zugegebenen betrachteten Proteinen, z.B. entfernt verwandten Homologen, entfernt.
Die immunabsorbierten und gesammelten Antisera werden dann in einem kompetitiven Bindungsimmuntest verwendet, wie vorstehend beschrieben, um ein zweites Protein, von dem angenommen wird, daß es vielleicht ein Allel oder eine polymorphe Variante eines BCA-GPCR ist, mit dem Immunogenprotein (d.h. dem BCA-GPCR von SEQ ID NRN.: 2, 4, 6 oder 8) zu vergleichen. Um diesen Vergleich durchzuführen, werden die zwei Proteine jeweils in einem breiten Bereich von Konzentrationen getestet und die Menge von jedem Protein, die erforderlich ist, um 50% der Bindung der Antisera an das fixierte Protein zu inhibieren, wird bestimmt. Wenn die Menge des zweiten Proteins, die erforderlich ist, um 50% der Bindung zu inhibieren, geringer ist als 10mal die Menge des Proteins, das durch SEQ ID NRN.: 2, 4, 6 oder 8 codiert wird, das erforderlich ist, um 50% der Bindung zu inhibieren, dann wird vom zweiten Protein behauptet, daß es spezifisch an die polyklonalen Antikörper bindet, die für ein BCA-GPCR-Immunogen erzeugt werden.
Andere Testformate
Western-Blot- (Immunoblot) Analyse wird verwendet, um die Anwesenheit von BCA-GPCR in der Probe nachzuweisen und zu quantifizieren. Das Verfahren umfaßt im Allgemeinen das Trennen von Probenproteinen durch Gelelektrophorese auf der Basis des Molekulargewichts, das Übertragen der getrennten Proteine auf einen geeigneten festen Träger (wie z.B. einen Nitrocellulosefilter, einen Nylonfilter oder einen derivatisierten Nylonfilter), und das Inkubieren der Probe mit den Antikörpern, die spezifisch BCA-GPCR binden. Die Anti-BCA-GPCR-Antikörper binden spezifisch an den BCA-GPCR auf dem festen Träger. Diese Antikörper können direkt markiert werden oder können alternativ anschließend unter Verwendung von markierten Antikörpern (z.B. markierten Schaf-Anti-Maus-Antikörpern), die spezifisch an die Anti-BCA-GPCR-Antikörper binden, nachgewiesen werden.
Andere Testformate umfassen Liposom-Immuntests (LIA), die Liposomen verwenden, die dazu ausgelegt sind, spezifische Moleküle (z.B. Antikörper) zu binden und eingekapselte Reagenzien oder Marker freizusetzen. Die freigesetzten Chemikalien werden dann gemäß Standardverfahren erfaßt (siehe Monroe et al., Amer. Clin. Prod. Rev. 5:34–41 (1986)).
Reduktion von nicht-spezifischer Bindung
Ein Fachmann wird erkennen, daß es häufig erwünscht ist, die nicht-spezifische Bindung in Immuntests zu minimieren. Insbesondere wenn der Test ein Antigen oder einen Antikörper beinhaltet, das/der an einem festen Substrat fixiert ist, ist es erwünscht, das Ausmaß an nicht-spezifischer Bindung an das Substrat zu minimieren. Mittel zum Reduzieren solcher nicht-spezifischer Bindung sind Fachleuten gut bekannt. Typischerweise beinhaltet dieses Verfahren das Beschichten des Substrats mit einer proteinischen Zusammensetzung. Insbesondere werden Proteinzusammensetzungen wie z.B. Rinderserumalbumin (BSA), nicht-fettes Milchpulver und Gelatine umfangreich verwendet, wobei Milchpulver am meisten bevorzugt ist.
Marker
Der spezielle Marker oder die nachweisbare Gruppe, die im Test verwendet wird, ist kein kritischer Aspekt der Erfindung, solange sie die spezifische Bindung des im Test verwendeten Antikörpers nicht signifikant stört. Die nachweisbare Gruppe kann ein beliebiges Material mit einer nachweisbaren physikalischen oder chemischen Eigenschaft sein. Solche nachweisbaren Marker wurden auf dem Gebiet der Immuntests gut entwickelt und im Allgemeinen kann fast jeglicher Marker, der bei solchen Verfahren nützlich ist, auf die vorliegende Erfindung angewendet werden. Folglich ist ein Marker eine beliebige Zusammensetzung, die durch spektroskopische, photochemische, biochemische, immunchemische, elektrische, optische oder chemische Mittel nachweisbar ist. Nützliche Marker in der vorliegenden Erfindung umfassen Magnetkügelchen (z.B. DYNABEADS^TM), Fluoreszenzfarbstoffe (z.B. Fluoresceinisothiocyanat, Texas-Rot, Rhodamin und dergleichen), Radiomarker (z.B. ³H, ¹²⁵I, ³⁵S, ¹⁴C oder ³²P), Enzyme (z.B. Meerrettichperoxidase, alkalische Phosphatase und andere, die übliche in einem ELISA verwendet werden) und colorimetrische Marker wie z.B. kolloidales Gold oder gefärbte Glas- oder Kunststoffkügelchen (z.B. Polystyrol, Polypropylen, Latex usw.).
Der Marker kann direkt oder indirekt mit der gewünschten Komponente des Tests gemäß Verfahren, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, gekoppelt werden. Wie vorstehend angegeben, kann eine breite Vielfalt von Markern verwendet werden, wobei die Wahl des Markers von der erforderlichen Empfindlichkeit, der leichten Konjugation mit der Verbindung, Stabilitätsanforderungen, der verfügbaren Instrumentenausrüstung und Entsorgungsvorkehrungen abhängt.
Nicht-radioaktive Marker werden häufig durch indirekte Mittel angehängt: Im Allgemeinen wird ein Ligandenmolekül (z.B. Biotin) kovalent an das Molekül gebunden. Der Ligand bindet dann an andere Moleküle (z.B. Streptavidin) Molekül, das entweder von Natur aus nachweisbar ist oder kovalent an ein Signalsystem wie z.B. ein nachweisbares Enzym, eine fluoreszierende Verbindung oder eine chemilumineszierende Verbindung gebunden ist. Die Liganden und ihre Ziele können in einer beliebigen geeigneten Kombination mit Antikörpern, die BCA-GPCRs erkennen, oder sekundären Antikörpern, die Anti-BCA-GPCR erkennen, verwendet werden.
Die Moleküle können auch direkt mit Signalerzeugungsverbindungen konjugiert werden, z.B. durch Konjugation mit einem Enzym oder Fluorophor. Als Marker interessierende Enzyme sind hauptsächlich Hydrolasen, insbesondere Phosphatasen, Esterasen und Glycosidasen, oder Oxidotasen, insbesondere Peroxidasen. Fluoreszente Verbindungen umfassen Fluorescein und seine Derivate, Rhodamin und seine Derivate, Dansyl, Umbelliferon usw. Chemilumineszente Verbindungen umfassen Luciferin und 2,3-Dihydrophthalazindione, z.B. Luminol. Für eine Überprüfung verschiedener Markierungs- oder Signalerzeugungssysteme, die verwendet werden können, siehe US-Patent Nr. 4 391 904.
Mittel zum Nachweisen von Markern sind Fachleuten gut bekannt. Wenn der Marker beispielsweise ein radioaktiver Marker ist, umfassen die Mittel zum Nachweis folglich einen Szintillationszähler oder einen photographischen Film wie bei der Autoradiographie. Wenn der Marker ein fluoreszenter Marker ist, kann er durch Anregen des Fluorochroms mit der geeigneten Wellenlänge von Licht und Erfassen der resultierenden Fluoreszenz erfaßt werden. Die Fluoreszenz kann visuell mittels eines photographischen Films, durch die Verwendung von elektrischen Detektoren wie z.B. ladungsgekoppelten Bauelementen (CCDs) oder Photovervielfachern und dergleichen erfaßt werden. Ebenso können enzymatische Marker durch Vorsehen der geeigneten Substrate für das Enzym und Erfassen des resultierenden Reaktionsprodukts erfaßt werden. Schließlich können einfache colorimetrische Marker einfach durch Beobachten der dem Marker zugeordneten Farbe erfaßt werden. In verschiedenen Tauchstabtests erscheint konjugiertes Gold somit häufig rosa, während verschiedene konjugierte Kügelchen in der Farbe des Kügelchens erscheinen.
Einige Testformate erfordern nicht die Verwendung von markierten Verbindungen. Agglutinierungstests können beispielsweise verwendet werden, um die Anwesenheit der Zielantikörper nachzuweisen. In diesem Fall werden mit Antigen beschichtete Teilchen durch Proben mit den Zielantikörpern agglutiniert. In diesem Format muß keine der Komponenten markiert werden und die Anwesenheit des Zielantikörpers wird durch einfache visuelle Untersuchung nachgewiesen.
Tests für Modulatoren von BCA-GPCRs
A. Tests für die BCA-GPCR-Aktivität
BCA-GPCRs und ihre Allele und polymorphen Varianten sind G-Proteingekoppelte Rezeptoren, die an der Signaltransduktion teilnehmen und einem Bereich zugeordnet sind, der in Brustkrebszellen amplifiziert ist. Die Aktivität von BCA-GPCR-Polypeptiden kann unter Verwendung einer Vielzahl von In-Vitro- und In-Vivo-Tests festgestellt werden, um funktionale, chemische und physikalische Effekte zu bestimmen, z.B. Messen der Ligandenbindung (z.B. Bindung radioaktiver Liganden), von zweiten Botenstoffen (z.B. cAMP, cGMP, IP₃, DAG oder Ca²⁺), des Ionenflusses, der Phosphorylierungspegel, der Transkriptionspegel, der Neurotransmitterpegel und dergleichen. Ferner können solche Tests verwendet werden, um auf Inhibitoren und Aktivatoren von BCA-GPCR zu testen. Modulatoren können auch genetisch veränderte Versionen eines BCA-GPCR sein. Screeningtests der Erfindung werden verwendet, um Modulatoren zu identifizieren, die als Therapeutikum von z.B. Antikörpern gegen BCA-GPCRs und Antagonisten der BCA-GPCR-Aktivität verwendet werden können.
Der BCA-GPCR des Tests wird aus einem Polypeptid mit einer Sequenz von SEQ ID NRN.: 2, 4, 6 oder 8 oder einer konservativ modifizierten Variante davon ausgewählt. Alternativ wird der BCA-GPCR des Tests von einem Eukaryoten abgeleitet und umfaßt eine Aminosäureteilsequenz mit Aminosäuresequenzidentität SEQ ID NRN.: 1–2 oder 7. Im Allgemeinen ist die Aminosäuresequenzidentität mindestens 70%, wahlweise mindestens 85%, wahlweise mindestens 90–95%. Wahlweise umfaßt das Polypeptid der Tests eine Domäne eines BCA-GPCR wie z.B. eine extrazelluläre Domäne, eine Transmembrandomäne, eine zytoplasmatische Domäne, eine Ligandenbindungsdomäne, eine Untereinheitsverbindungsdomäne, eine aktive Stelle und dergleichen. Entweder ein BCA-GPCR oder eine Domäne davon kann mit einem heterologen Protein kovalent verbunden sein, um ein chimäres Protein zu erzeugen, das in den hierin beschriebenen Tests verwendet wird.
Modulatoren der BCA-GPCR-Aktivität werden unter Verwendung von BCA-GPCR-Polypeptiden getestet, wie vorstehend beschrieben, die entweder rekombinant sind oder natürlich vorkommen. Das Protein kann isoliert, in einer Zelle exprimiert, in einer von einer Zelle abgeleiteten Membran exprimiert, in Gewebe oder in einem Tier exprimiert werden, entweder rekombinant sein oder natürlich vorkommen. Brustkrebszellen, normale Prostata-Epithelialzellen, Plazenta, Hodengewebe, transformierte Zellen oder Membranen können beispielsweise verwendet werden. Die Modulation wird unter Verwendung von einem der hierin beschriebenen In-Vitro- oder In-Vivo-Tests getestet. Die Signaltransduktion kann auch in vitro mit Reaktionen im löslichen oder festen Zustand unter Verwendung eines chimären Moleküls wie z.B. einer extrazellulären Domäne eines Rezeptors, die mit einer heterologen Signaltransduktionsdomäne kovalent verbunden ist, oder einer heterologen extrazellulären Domäne, die kovalent an die Transmembran und/oder zytoplasmatische Domäne eines Rezeptors gebunden ist, untersucht werden. Die Genamplifikation kann auch untersucht werden. Ferner können Ligandenbindungsdomänen des interessierenden Proteins in vitro in Reaktionen im löslichen oder festen Zustand verwendet werden, um auf Ligandenbindung zu testen.
Die Ligandenbindung an BCA-GPCR, eine Domäne oder ein chimäres Protein kann in Lösung, in einer zweilagigen Membran, die an einer festen Phase befestigt ist, in einer Lipideinschicht oder in Vesikeln getestet werden. Die Bindung eines Modulators kann unter Verwendung von z.B. Änderungen der spektroskopischen Eigenschaften (z.B. Fluoreszenz, Absorptionsvermögen, Brechungsindex), hydrodynamischen (z.B. Form), chromatographischen oder Löslichkeitseigenschaften getestet werden.
Rezeptor-G-Protein-Wechselwirkungen können auch untersucht werden. Die Bindung des G-Proteins an den Rezeptor oder seine Freisetzung aus dem Rezeptor kann beispielsweise untersucht werden. Bei Abwesenheit von GTP führt beispielsweise ein Aktivator zur Bildung eines engen Komplexes eines G-Proteins (alle drei Untereinheiten) mit dem Rezeptor. Dieser Komplex kann in einer Vielzahl von Weisen nachgewiesen werden, wie vorstehend angegeben. Ein solcher Test kann modifiziert werden, um nach Inhibitoren zu suchen. Zugeben eines Aktivators zum Rezeptor und G-Protein bei Abwesenheit von GTP, Bilden eines engen Komplexes und dann Screenen auf Inhibitoren durch Betrachten der Dissoziation des Rezeptor-G-Protein-Komplexes. In Gegenwart von GTP dient die Freisetzung der Alpha-Untereinheit des G-Proteins aus den anderen zwei G-Proteinuntereinheiten als Kriterium für die Aktivierung.
Ein aktiviertes oder inhibiertes G-Protein ändert wiederum die Eigenschaften der stromabwärts liegenden Effektoren wie z.B. Proteine, Enzyme und Kanäle. Die klassischen Beispiele sind die Aktivierung von cGMP-Phosphodiesterase durch Transducin im visuellen System, Adenylatcyclase durch das stimulierende G-Protein, Phospholipase C durch Gq und andere Cognat-G-Proteine und die Modulation von verschiedenen Kanälen durch Gi und andere G-Proteine. Stromabwärts liegende Konsequenzen können auch untersucht werden, wie z.B. Erzeugung von Diacylglycerol und IP3 durch Phospholipase C und wiederum für Kalziummobilisierung durch IP3.
Aktivierte GPCR-Rezeptoren werden zu Substraten für Kinasen, die das C-Abschlußende des Rezeptors (und möglicherweise ebenso andere Stellen) phosphorylieren. Somit fördern Aktivatoren die Übertragung von ³²P von gammamarkiertem GTP zum Rezeptor, was mit einem Szintillationszähler getestet werden kann. Die Phosphorylierung des C-Abschlußendes fördert die Bindung von arrestinartigen Proteinen und stört die Bindung von G-Proteinen. Der Kinase/Arrestin-Weg spielt eine Schlüsselrolle bei der Desensibilisierung von vielen GPCR-Rezeptoren. Für eine allgemeine Überprüfung der GPCR-Signaltransduktion und Verfahren zum Testen der Signaltransduktion siehe z.B. Methods in Enzymology, Bände 237 und 238 (1994) und Band 96 (1983); Bourne et al., Nature 10:349:117–27 (1991); Bourne et al., Nature 348:125–32 (1990); Pitcher et al., Annu. Rev. Biochem. 67:653–92 (1998).
Proben oder Assays, die mit einem potentiellen BCA-GPCR-Inhibitor oder -Aktivator behandelt werden, werden mit Kontrollproben ohne die Testverbindung verglichen, um das Ausmaß der Modulation zu untersuchen. Kontrollproben (unbehandelt mit Aktivatoren oder Inhibitoren) wird ein relativer BCA-GPCR-Aktivitätswert von 100 zugewiesen. Die Inhibierung eines BCA-GPCR ist erreicht, wenn der BCA-GPCR-Aktivitätswert relativ zur Kontrolle etwa 90%, wahlweise 50%, wahlweise 25–0% ist. Die Aktivierung eines BCA-GPCR ist erreicht, wenn der BCA-GPCR-Aktivitätswert relativ zur Kontrolle 110%, wahlweise 150%, 200–500% oder 1000–2000% ist.
Änderungen des Ionenflusses können durch Bestimmen von Änderungen der Polarisation (d.h. elektrisches Potential) der Zelle oder Membran, die einen BCA-GPCR exprimiert, festgestellt werden. Ein Mittel zum Bestimmen von Änderungen in der zellulären Polarisation liegt im Messen von Änderungen des Stroms (wodurch Änderungen der Polarisation gemessen werden) mit Spannungsbegrenzungs- und Patch-Clamp-Verfahren, z.B. "an der Zelle angebrachter" Modus, "Innen-Außen"-Modus, und Modus der "ganzen Zelle" (siehe z.B. Ackerman et al., New Engl. J. Med. 336:1575–1595 (1997)). Ganze Zellenströme werden zweckmäßigerweise unter Verwendung der Standardmethodologie bestimmt (siehe z.B. Hamil et al., PFlugers. Archiv. 391:85 (1981). Andre bekannte Tests umfassen: radiomarkierte Ionenflußtests und Fluoreszenztests unter Verwendung von spannungsempfindlichen Farbstoffen (siehe z.B. Vestergarrd-Bogind et al., J. Membrane Biol. 88:67–75 (1988); Gonzales & Tsien, Chem. Biol. 4:269–277 (1997); Daniel et al., J. Pharmacol. Meth. 25:185–193 (1991); Holevinsky et al., J. Membrane Biology 137:59–70 (1994)). Im Allgemeinen liegen die zu testenden Verbindungen im Bereich von 1 pM bis 100 mM vor.
Die Effekte der Testverbindungen auf die Funktion der Polypeptide können durch Untersuchen von irgendeinem der vorstehend beschriebenen Parameter gemessen werden. Irgendeine geeignete physiologische Änderung, die sich auf die GPCR-Aktivität auswirkt, kann verwendet werden, um den Einfluß einer Testverbindung auf die Polypeptide dieser Erfindung zu bewerten. Wenn die funktionalen Konsequenzen unter Verwendung von intakten Zellen oder Tieren bestimmt werden, kann man auch eine Vielzahl von Effekte messen, wie z.B. Transmitterfreisetzung, Hormonfreisetzung, Transkriptionsänderungen sowohl an bekannten als auch uncharakterisierten genetischen Markern (z.B. Northern-Blots), Änderungen im Zellenmetabolismus wie z.B. Zellenwachstum oder pH-Änderungen, und Änderungen in den intrazellulären zweiten Botenstoffen wie z.B. Ca²⁺, IP3 oder cAMP.
Bevorzugte Tests für G-Protein-gekoppelte Rezeptoren umfassen Zellen, die mit ionen- oder spannungsempfindlichen Farbstoffen beladen sind, um die Rezeptoraktivität zu melden. Tests zum Bestimmen der Aktivität solcher Rezeptoren können auch bekannte Agonisten und Antagonisten für andere G-Protein-gekoppelte Rezeptoren als negative oder positive Kontrollen verwenden, um die Aktivität von getesteten Verbindungen zu bewerten. In Tests für die Identifikation von modulierenden Verbindungen (z.B. Agonisten, Antagonisten) werden Änderungen des Pegels der Ionen im Zytoplasma oder der Membranspannung unter Verwendung eines ionenempfindlichen bzw. Membranspannungs-Fluoreszenzindikators überwacht. Unter den ionenempfindlichen Indikatoren und Spannungssonden, die verwendet werden können, befinden sich jene, die im Katalog Molecular Probes 1997 offenbart sind. Für G-Protein-gekoppelte Rezeptoren können promiskuitive G-Proteine wie z.B. Gα15 und Gα16 im Test der Wahl verwendet werden (Wilkie et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 88:10049–10053 (1991)). Solche promiskuitiven G-Proteine ermöglichen die Kopplung eines breiten Bereichs von Rezeptoren mit Signaltransduktionswegen in heterologen Zellen.
Die Rezeptoraktivierung leitet typischerweise anschließende intrazelluläre Ereignisse ein, z.B. erhöht in zweiten Botenstoffen wie z.B. IP3, das intrazelluläre Speicher von Kalziumionen freisetzt. Die Aktivierung von einigen G-Proteingekoppelten Rezeptoren stimuliert die Bildung von Inositoltriphosphat (IP3) durch durch Phospholipase C vermittelte Hydrolyse von Phosphatidylinositol (Berridge & Irvine, Nature 312:315–21 (1984)). IP3 stimuliert wiederum die Freisetzung von intrazellulären Kalziumionenspeichern. Somit kann eine Änderung der zytoplasmatischen Kalziumionenspiegel oder eine Änderung der Spiegel der zweiten Botenstoffe wie z.B. IP3 verwendet werden, um die Funktion des G-Protein-gekoppelten Rezeptors zu bewerten. Zellen, die solche G-Proteingekoppelten Rezeptoren exprimieren, können erhöhte zytoplasmatische Kalziumspiegel infolge des Beitrags von sowohl intrazellulären Speichern als auch über Aktivierung von Ionenkanälen aufweisen, in welchem Fall es erwünscht, wenn auch nicht erforderlich sein kann, solche Tests in kalziumfreiem Puffer, der wahlweise mit einem Chelatisierungsmittel wie z.B. EGTA ergänzt ist, durchzuführen, um die Fluoreszenzreaktion, die sich aus der Kalziumfreisetzung von internen Speichern ergibt, zu unterscheiden.
Andere Tests können das Bestimmen der Aktivität von Rezeptoren beinhalten, die, wenn sie aktiviert werden, zu einer Änderung des Spiegels der intrazellulären cyclischen Nukleotide, z.B. cAMP oder cGMP, durch Aktivieren der Inhibieren von stromabwärts liegenden Effektoren wie z.B. Adenylatcyclase führen. Es gibt cyclische durch Nukleotid gattergesteuerte Ionenkanäle, z.B. Stab-Photorezeptorzellenkanäle und olfaktorische Neuronenkanäle, die für Kationen bei der Aktivierung durch Bindung von cAMP oder cGMP durchlässig sind (siehe z.B. Altenhofe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9868–9872 (1991) und Dhallan et al., Nature 347:184–187 (1990)). In Fällen, in denen die Aktivierung des Rezeptors zu einer Senkung der Spiegel der cyclischen Nukleotide führt, kann es bevorzugt sein, die Zellen Mitteln auszusetzen, die die intrazellulären Spiegel von cyclischen Nukleotiden erhöhen, z.B. Forskolin, bevor eine Rezeptoraktivierungsverbindung in dem Test zu den Zellen zugegeben wird. Zellen für diese Art von Test können durch Cotransfektion einer Wirtszelle mit DNA, die einen durch ein cyclisches Nukleotid gattergesteuerten Ionenkanal codiert, GPCR-Phosphatase und DNA, die einen Rezeptor codiert (z.B. bestimmte Glutamatrezeptoren, Muskarin-Acetylcholin-Rezeptoren, Dopaminrezeptoren, Serotoninrezeptoren und dergleichen), die, wenn sie aktiviert werden, eine Änderung in den Spiegel von cyclischen Nukleotiden im Zytoplasma verursachen, hergestellt werden.
In einem Ausführungsbeispiel können Änderungen des intrazellulären CAMP oder cGMP unter Verwendung von Immuntests gemessen werden. Das in Offermanns & Simon, J. Biol. Chem. 270:15175–15180 (1995) beschriebene Verfahren kann verwendet werden, um den Spiegel von cAMP zu bestimmen. Das in Felley-Bosco et al., Am. J. Resp. Cell and Mol. Biol. 11:159–164 (1994) beschriebene Verfahren kann auch verwendet werden, um den Spiegel von cGMP zu bestimmen. Ferner ist eine Testausrüstung zum Messen von cAMP und/oder cGMP im US-Patent 4 115 538, das durch den Hinweis hierin aufgenommen wird, beschrieben.
In einem weiteren Ausführungsbeispiel kann eine Phosphatidylinositol- (PI) Hydrolyse gemäß dem US-Patent 5 436 128, das durch den Hinweis hierin aufgenommen wird, analysiert werden. Kurz gesagt, der Test beinhaltet das Markieren von Zellen mit ³H-Myoinositol für 48 oder mehr h. Die markierten Zellen werden mit einer Testverbindung für eine Stunde behandelt. Die behandelten Zellen werden lysiert und in Chloroform-Methanol-Wasser extrahiert, wonach die Inositolphosphate durch Ionenaustauschchromatographie getrennt und durch Szintillationszählung quantifiziert wurden. Die mehrfache Stimulation wird durch Berechnen des Verhältnisses von cpm in Gegenwart von Agonist zu cpm in Gegenwart von Pufferkontrolle bestimmt. Ebenso wird die mehrfache Inhibierung durch Berechnen des Verhältnisses von cpm in Gegenwart von Antagonist zu cpm in Gegenwart von Pufferkontrolle (die einen Agonisten enthalten kann oder nicht) bestimmt.
In einem weiteren Ausführungsbeispiel können Transkriptionspegel gemessen werden, um die Effekte einer Testverbindung auf die Signaltransduktion zu bewerten. Eine Wirtszelle, die das interessierende Protein enthält, wird mit einer Testverbindung für eine ausreichende Zeit in Kontakt gebracht, um irgendwelche Wechselwirkungen zu bewirken, und dann wird der Pegel der Genexpression gemessen. Die Menge an Zeit zum Bewirken von solchen Wechselwirkungen kann empirisch bestimmt werden, wie z.B. durch Ablauf eines Zeitverlaufs und Messen des Pegels der Transkription als Funktion der Zeit. Die Menge an Transkription kann unter Verwendung eines beliebigen Verfahrens, das Fachleuten als geeignet bekannt ist, gemessen werden. Die mRNA-Expression des interessierenden Proteins kann beispielsweise unter Verwendung von Northern-Blots erfaßt werden oder ihre Polypeptidprodukte können unter Verwendung von Immuntests identifiziert werden. Alternativ können auf Transkription basierende Tests unter Verwendung eines Reportergens verwendet werden, wie im US-Patent 5 436 128 beschrieben, das durch den Hinweis hierin aufgenommen wird. Die Reportergene können z.B. Chloramphenicolacetyltransferase, Fire-Fly-Luciferase, bakterielle Luciferase, β-Galactosidase und alkalische Phosphatase sein. Ferner kann das interessierende Protein als indirekter Reporter über Befestigung an einem zweiten Reporter wie z.B. einem grünen fluoreszierenden Protein verwendet werden (siehe z.B. Mistili & Spector, nature Biotechnology 15:961–964 (1997)).
Die Menge an Transkription wird dann mit der Menge an Transkription entweder in derselben Zelle bei Abwesenheit der Testverbindung verglichen oder sie kann mit der Menge an Transkription in einer im Wesentlichen identischen Zelle, der das interessierende Protein fehlt, verglichen werden. Eine im Wesentlichen identische Zelle kann von denselben Zellen, aus denen die rekombinante Zelle hergestellt wurde, die jedoch nicht durch Einführen von heterologer DNA modifiziert wurden, abgeleitet sein. Irgendein Unterschied in der Menge an Transkription weist darauf hin, daß die Testverbindung in gewisser Weise die Aktivität des interessierenden Proteins geändert hat.
B. Modulatoren
Die als Modulatoren von BCA-GPCRs getesteten Verbindungen können eine beliebige kleine chemische Verbindung oder eine biologische Einheit, z.B. ein Makromolekül wie z.B. ein Protein, ein Zucker, eine Nukleinsäure oder ein Lipid sein. Alternativ können Modulatoren genetisch geänderte Versionen eines BCA-GPCR sein. Typischerweise sind Testverbindungen kleine chemische Moleküle und Peptide. Im Wesentlichen kann eine beliebige chemische Verbindung als potentieller Modulator oder Ligand in den Tests der Erfindung verwendet werden, obwohl am häufigsten Verbindungen, die in wässerigen oder organischen (insbesondere auf DMSO basierenden) Lösungen gelöst werden können, verwendet werden. Die Tests sind dazu ausgelegt, große chemische Bibliotheken durch Automatisieren der Testschritte und Bereitstellen von Verbindungen von irgendeiner Zweckmäßigen Quelle für die Tests, die typischerweise parallel ablaufen (z.B. in Mikrotiterformaten oder Mikrotiterplatten in Robotertests), zu screenen. Es ist zu erkennen, daß es viele Lieferanten von chemischen Verbindungen gibt, einschließlich Sigma (St. Louis, MO), Aldrich (St. Louis, MO), Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), Fluka Chemika-Biochemica Analytika (Buchs Schweiz) und dergleichen.
In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel beinhalten Screeningverfahren mit hohem Durchsatz die Bereitstellung einer kombinatorischen chemischen oder Peptidbibliothek, die eine große Anzahl von potentiellen therapeutischen Verbindungen (potentiellen Modulator- oder Ligandenverbindungen) enthält. Solche "kombinatorischen chemischen Bibliotheken" oder "Ligandenbibliotheken" werden dann in einem oder mehreren Tests gescreent, wie hierin beschrieben, um diejenigen Bibliothekenmitglieder zu identifizieren (insbesondere chemische Spezies oder Unterklassen), die eine gewünschte charakteristische Aktivität zeigen. Die so identifizierten Verbindungen können als herkömmliche "Leitverbindungen" dienen oder können selbst als potentielle oder tatsächliche Therapeutika verwendet werden.
Eine kombinatorische chemische Bibliothek ist eine Sammlung von verschiedenen chemischen Verbindungen, die entweder durch chemische Synthese oder biologische Synthese, durch Kombinieren einer Anzahl von chemischen "Konstruktionsblöcken" wie z.B. Reagenzien erzeugt werden. Eine lineare kombinatorische chemische Bibliothek wie z.B. eine Polypeptidbibliothek wird beispielsweise durch Kombinieren eines Satzes von chemischen Konstruktionsblöcken (Aminosäuren) in jeder möglichen Weise für eine gegebene Verbindungslänge (d.h. die Anzahl von Aminosäuren in einer Polypeptidverbindung) gebildet. Millionen von chemischen Verbindungen können durch solches kombinatorisches Mischen von chemischen Konstruktionsblöcken synthetisiert werden.
Die Herstellung und das Screenen von kombinatorischen chemischen Bibliotheken ist Fachleuten gut bekannt. Solche kombinatorischen chemischen Bibliotheken umfassen, sind jedoch nicht begrenzt auf Peptidbibliotheken (siehe z.B. US-Patent 5 010 175, Furka, Int. J. Pept. Prot. Res. 37:487–493 (1991) und Houghton et al., Nature 354:84–88 (1991)). Andere Chemien zum Erzeugen von Bibliotheken mit chemischer Verschiedenheit können auch verwendet werden. Solche Chemien umfassen, sind jedoch nicht begrenzt auf: Peptoide (z.B. PCT-Veröffentlichung Nr. WO 91/19735), codierte Peptide (z.B. PCT-Veröffentlichung WO 93/20242), zufällige Biooligomere (z.B. PCT-Veröffentlichung Nr. WO 92/00091), Benzodiazepine (z.B. US-Pat. Nr. 5 288 514), Diversomere wie z.B. Hydantoine, Benzodiazepine und Dipeptide (Hobbs et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90:6909–6913 (1993)), vinylartige Polypeptide (Hagihara et al., J. Amer. Chem. Soc. 114:6568 (1992)), nicht-peptidale Peptidnachahmer mit Glucosegerüst (Hirschmann et al., J. Amer. Chem. Soc. 114:9217–9218 (1992)), analoge organische Synthesen von Bibliotheken von kleinen Verbindungen (Chen et al., J. Amer. Chem. Soc. 116:2661 (1994)), Oligocarbamate (Cho et al., Science 261:1303 (1993)) und/oder Peptidylphosphonate (Campbell et al., J. Org. Chem. 59:658 (1994)), Nukleinsäurebibliotheken (siehe Ausubel, Berger und Sambrook, alle oben), Peptidnukleinsäurebibliotheken (siehe z.B. US-Patent 5 539 083), Antikörperbibliotheken (siehe z.B. Vaughn et al., Nature Biotechnology, 14(3):309–314 (1996) und PCT/US96/10287), Kohlenhydratbibliotheken (siehe z.B. Liang et al., Science, 274:1520–1522 (1996) und US-Patent 5 593 853), Bibliotheken für kleine organische Moleküle (siehe z.B. Benzodiazepine, Baum C&EN, 18. Jan. Seite 33 (1993); Isoprenoide, US-Patent 5 569 588; Thiazolidinone und Metathiazanone, US-Patent 5 549 974; Pyrrolidine, US-Patente 5 525 735 und 5 519 134; Morpholinverbindungen, US-Patent 5 506 337; Benzodiazoepine 5 288 514, und dergleichen).
Vorrichtungen für die Herstellung von kombinatorischen Bibliotheken sind kommerziell erhältlich (siehe z.B. 357 MPS, 390 MPS, Advanced Chem Tech, Louisville KY, Symphony, Rainin, Woburn, MA, 433A Applied Biosystems, Foster City, CA, 9050 Plus, Millipore, Bedford, MA). Außerdem sind zahlreiche kombinatorische Bibliotheken selbst kommerziell erhältlich (siehe z.B. ComGenex, Princeton, N.J., Tripos, Inc., St. Louis, MO, 3D Pharmaceuticals, Exton, PA, Martek Biosciences, Columbia, MD, usw.).
C. Tests mit hohem Durchsatz im festen Zustand und löslich
In einem Ausführungsbeispiel stellt die Erfindung lösliche Tests unter Verwendung von Molekülen wie z.B. einer Domäne wie z.B. einer Ligandenbindungsdomäne, einer extrazellulären Domäne, einer Transmembrandomäne (z.B. einer mit sieben Transmembranbereichen und cytosolischen Schleifen), der Transmembrandomäne und einer zytoplasmatischen Domäne, einer aktiven Stelle, einem Untereinheitsverbindungsbereich usw.; einer Domäne, die mit einem heterologen Protein kovalent verbunden ist, um ein chimäres Molekül zu erzeugen; einem BCA-GPCR; oder einer Zelle oder Gewebe, die/das einen BCA-GPCR exprimiert, der entweder natürlich vorkommt oder rekombinant ist, bereit. In einem anderen Ausführungsbeispiel stellt die Erfindung In-Vitro-Tests auf Festphasenbasis in einem Format mit hohem Durchsatz bereit, wobei die Domäne, das chimäre Molekül, der BCA-GPCR oder die Zelle oder das Gewebe, die/das einen BCA-GPCR exprimiert, an einem Festphasensubstrat befestigt ist.
In den Tests mit hohem Durchsatz der Erfindung ist es möglich, bis zu mehrere tausend verschiedene Modulatoren oder Liganden an einem einzigen Tag zu screenen. Insbesondere kann jede Mulde einer Mikrotiterplatte verwendet werden, um einen separaten Test gegen einen ausgewählten potentiellen Modulator durchzuführen, oder wenn Konzentrations- oder Inkubationszeiteffekte beobachtet werden sollen, können jeweils 5–10 Mulden einen einzelnen Modulator testen. Somit kann eine einzelne Standard-Mikrotiterplatte etwa 100 (z.B. 96) Modulatoren testen. Wenn Platten mit 1536 Mulden verwendet werden, dann kann eine einzige Platte leicht etwa 100 bis etwa 1500 verschiedene Verbindungen testen. Es ist möglich, mehrere verschiedene Platten pro Tag zu testen; Testscreens für bis zu etwa 6000–20000 verschiedene Verbindungen ist unter Verwendung der integrierten Systeme der Erfindung möglich.
Das interessierende Molekül kann an die Komponente im festen Zustand direkt oder indirekt über eine kovalente oder nicht-kovalente Bindung, z.B. über einen Marker, gebunden werden. Der Marker kann ein beliebiger einer Vielzahl von Komponenten sein. Im Allgemeinen wird ein Molekül, das den Marker bindet (ein Markerbinder) an einem festen Träger fixiert und das interessierende markierte Molekül (z.B. das interessierende Signaltransduktionsmolekül) wird am festen Träger durch Wechselwirkung des Markers und des Markerbinders befestigt.
Eine Anzahl von Markern und Markerbindern kann auf der Basis bekannter Molekülwechselwirkungen, die in der Literatur gut beschrieben sind, verwendet werden. Wenn beispielsweise ein Marker einen natürlichen Binder aufweist, beispielsweise Biotin, Protein A oder Protein G, kann er in Verbindung mit geeigneten Markerbindern (Avidin, Streptavidin, Neutravidin, dem Fc-Bereich eines Immunoglobulins usw.) verwendet werden. Antikörper für Moleküle mit natürlichen Bindern wie z.B. Biotin sind auch umfangreich erhältlich und geeignete Markerbinder; siehe SIGMA Immunochemicals 1998 Katalog SIGMA, St. Louis MO).
Ebenso kann eine beliebige haptene oder antigene Verbindung in Kombination mit einem geeigneten Antikörper verwendet werden, um ein Marker/Markerbinder-Paar zu erzeugen. Tausende von spezifischen Antikörpern sind kommerziell erhältlich und viele zusätzliche Antikörper sind in der Literatur beschrieben. In einer üblichen Konfiguration ist der Marker beispielsweise ein erster Antikörper und der Markerbinder ist ein zweiter Antikörper, der den ersten Antikörper erkennt. Zusätzlich zu Antikörper-Antigen-Wechselwirkungen sind auch Rezeptor-Liganden-Wechselwirkungen als Marker- und Markerbinder-Paare geeignet. Agonisten und Antagonisten von Zellmembranrezeptoren (z.B. Zellenrezeptor-Liganden-Wechselwirkungen wie z.B. Transferrin, c-kit, virale Rezeptorliganden, Cytokinrezeptoren, Chemokinrezeptoren, Interleukinrezeptoren, Immunoglobulinrezeptoren und Antikörper, die Cadhereinfamilie, die Integrinfamilie, die Selectinfamilie und dergleichen; siehe z.B. Pigott & Power, The Adhesion Molecule Facts Book I (1993). Ebenso können Toxine und Venome, viarle Epitope, Hormone (z.B. Opiate, Steroide usw.), intrazelluläre Rezeptoren (die z.B. die Effekte von verschiedenen kleinen Liganden, einschließlich Steroiden, Schilddrüsenhormon, Retinoiden und Vitamin D; Peptiden), Arzneimittel, Lectine, Zucker, Nukleinsäuren (sowohl lineare als auch cyclische Polymerkonfigurationen), Oligosaccharide, Proteine, Phospholipide und Antikörper alle mit verschiedenen Zellenrezeptoren in Wechselwirkung treten.
Synthetische Polymere wie, z.B. Polyurethane, Polyester, Polycarbonate, Polyharnstoffe, Polyamide, Polyethylenimine, Polyarylensulfide, Polysiloxane, Polyimide und Polyacetate, können auch einen geeigneten Marker oder Markerbinder bilden. Viele weitere Marker/Markerbinder-Paare sind auch in den hierin beschriebenen Testsystemen nützlich, wie für einen Fachmann bei der Durchsicht dieser Offenbarung ersichtlich wäre.
Übliche Binder wie z.B. Peptide, Polyether und dergleichen können auch als Marker dienen und umfassen Polypeptidsequenzen wie z.B. Polyglysequenzen zwischen etwa 5 und 200 Aminosäuren. Solche flexiblen Binder sind Fachleuten bekannt. Poly(ethylenglycol)-Binder sind beispielsweise von Shearwater Polymers, Inc., Huntsville, Alabama, erhältlich. Diese Binder weisen wahlweise Amidbindungen, Sulfhydrylbindungen oder heterofunktionale Bindungen auf.
Markerbinder werden an festen Substraten unter Verwendung eines beliebigen einer Vielzahl von derzeit zur Verfügung stehenden Verfahren fixiert. Feste Substrate werden üblicherweise derivatisiert oder funktionalisiert, indem alles oder ein Teil des Substrats einem chemischen Reagenz ausgesetzt wird, das eine chemische Gruppe an der Oberfläche fixiert, die mit einem Teil des Markerbinders reaktiv ist. Gruppen, die zur Befestigung an einem längeren Kettenteil geeignet sind, würden beispielsweise Amine, Hydroxyl, Thiol und Carboxylgruppen umfassen. Aminoalkylsilane und Hydroxyalkylsilane können verwendet werden, um eine Vielzahl von Oberflächen wie z.B. Glasoberflächen zu funktionalisieren. Die Konstruktion von solchen Festphasen-Biopolymeranordnungen ist in der Literatur gut beschrieben. Siehe z.B. Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149–2154 (1963) (die die Festphasensynthese von z.B. Peptiden beschreibt); Geysen et al., J. Immun. Meth. 102:259–274 (1987) (die die Synthese von Festphasenkomponenten an Stiften beschreibt); Frank & Doring, Tetrahedron 44:60316040 (1988) (die die Synthese von verschiedenen Peptidsequenzen an Cellulosescheiben beschreibt); Folder et al., Science, 251:767–777 (1991); Sheldon et al., Clinical Chemistry 39(4):718–719 (1993); und Kozal et al., Nature Medicine 2(7):753759 (1996) (die alle Anordnungen von Biopolymeren, die an festen Substraten fixiert sind, beschreiben). Nicht-chemische Methoden zum Fixieren von Markerbindern an Substraten umfassen andere übliche Verfahren wie z.B. Wärme, Vernetzung durch UV-Strahlung und dergleichen.
D. Tests auf Computerbasis
Noch ein weiterer Test für Verbindungen, die die BCA-GPCR-Aktivität modulieren, beinhaltet die computergestützte Arzneimittelkonstruktion, bei der ein Computersystem verwendet wird, um eine dreidimensionale Struktur von BCA-GPCR auf der Basis der Strukturinformation, die durch die Aminosäuresequenz codiert wird, zu erzeugen. Die eingegebene Aminosäuresequenz steht direkt und aktiv mit einem vorher festgelegten Algorithmus in einem Computerprogramm in Wechselwirkung, um sekundäre, tertiäre und quaternäre Strukturmodelle des Proteins zu ergeben. Die Modelle der Proteinstruktur werden dann untersucht, um Bereiche der Struktur zu identifizieren, die die Fähigkeit haben, z.B. Liganden zu binden. Diese Bereiche werden dann verwendet, um Liganden zu identifizieren, die an das Protein binden.
Das dreidimensionale Strukturmodell des Proteins wird durch Eingeben von Protein-Aminosäuresequenzen von mindestens 10 Aminosäureresten oder entsprechenden Nukleinsäuresequenzen, die ein BCA-GPCR-Polypeptid codieren, in das Computersystem erzeugt. Die Aminosäuresequertz des Polypeptids oder der das Polypeptid codierenden Nukleinsäure wird aus der Gruppe ausgewählt, die aus SEQ ID NRN: 1–8 und konservativ modifizierten Versionen davon besteht. Die Aminosäuresequenz stellt die primäre Sequenz oder Teilsequenz des Proteins dar, die die Strukturinformation des Proteins codiert. Mindestens 10 Reste der Aminosäuresequenz (oder einer Nukleotidsequenz, die 10 Aminosäuren codiert) werden in das Computersystem von Computertastaturen, maschinenlesbaren Trägern, die elektronische Speichermedien (z.B. Magnetdisketten, Bänder, Kassetten und Chips), optische Medien (z.B. CD-ROM), Informationen, die durch Internetseiten verteilt werden, und durch einen RAM eingegeben. Das dreidimensionale Strukturmodell des Proteins wird dann durch die Wechselwirkung der Aminosäuresequenz und des Computersystems unter Verwendung einer Fachleuten bekannten Software erzeugt.
Die Aminosäuresequenz stellt eine primäre Struktur dar, die die Information codiert, die zum Bilden der sekundären, tertiären und quaternären Struktur des interessierenden Proteins erforderlich ist. Die Software betrachtet bestimmte Parameter, die durch die primäre Sequenz codiert werden, um das Strukturmodell zu erzeugen. Diese Parameter werden als "Energieterme" bezeichnet und umfassen hauptsächlich elektrostatische Potentiale, hydrophobe Potentiale, für Lösungsmittel zugängliche Oberflächen und Wasserstoffbindung. Sekundäre Energieterme umfassen Van-der-Waals-Potentiale. Biologische Moleküle bilden die Struktur, die die Energieterme in einer kumulativen Weise minimieren. Das Computerprogramm verwendet daher diese Terme, die von der primären Struktur oder Aminosäuresequenz codiert werden, um das sekundäre Strukturmodell zu erzeugen.
Die tertiäre Struktur des Proteins, das durch die sekundäre Struktur codiert wird, wird dann auf der Basis der Energieterme der sekundären Struktur gebildet. Der Benutzer kann an diesem Punkt zusätzliche Variablen eingeben, wie z.B., ob das Protein an die Membran gebunden oder löslich ist, seine Stelle im Körper und seine zelluläre Stelle, z.B. zytoplasmatisch, Oberfläche oder nuklear. Diese Variablen zusammen mit den Energietermen der sekundären Struktur werden verwendet, um das Modell der tertiären Struktur zu bilden. Beim Modellieren der tertiären Struktur vergleicht das Computerprogramm hydrophobe Flächen der sekundären Struktur mit gleichen und hydrophile Flächen der sekundären Struktur mit gleichen.
Sobald die Struktur erzeugt wurde, werden potentielle Ligandenbindungsbereiche durch das Computersystem identifiziert. Dreidimensionale Strukturen für potentielle Liganden werden durch Eingeben von Aminosäure- oder Nukleotidsequenzen oder chemischen Formen von Verbindungen erzeugt, wie vorstehend beschrieben. Die dreidimensionale Struktur des potentiellen Liganden wird dann mit jener des BCA-GPCR-Proteins verglichen, um Liganden zu identifizieren, die an BCA-GPCR binden. Die Bindungsaffinität zwischen dem Protein und den Liganden wird unter Verwendung von Energietermen bestimmt, um festzustellen, welche Liganden eine verstärkte Wahrscheinlichkeit für die Bindung an das Protein haben.
Computersysteme werden auch verwendet, um auf Mutationen, polymorphe Varianten, Allele und Interspezies-Homologe von BCA-GPCR-Genen zu screenen. Solche Mutationen können mit Krankheitszuständen oder genetischen Anlagen verbunden sein. Wie vorstehend beschrieben, kann GeneChip^TM und die verwandte Technologie auch verwendet werden, um auf Mutationen, polymorphe Varianten, Allele und Interspezies-Homologe zu screenen. Sobald die Varianten identifiziert sind, können Diagnosetests verwendet werden, um Patienten mit solchen mutierten Genen zu identifizieren. Die Identifikation der mutierten BCA-GPCR-Gene beinhaltet das Empfangen einer Eingabe einer ersten Nukleinsäure oder Aminosäuresequenz, die einen BCA-GPCR codiert und die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID NRN.: 1–8 besteht, und von konservativ modifizierten Versionen davon. Die Sequenz wird in das Computersystem eingegeben, wie vorstehend beschrieben. Die erste Nukleinsäure oder Aminosäuresequenz wird dann mit einer zweiten Nukleinsäure oder Aminosäuresequenz verglichen, die eine beträchtliche Identität zur ersten Sequenz aufweist. Die zweite Sequenz wird in das Computersystem in der vorstehend beschriebenen Weise eingegeben. Sobald die erste und die zweite Sequenz verglichen werden, werden Nukleotid- oder Aminosäureunterschiede zwischen den Sequenzen identifiziert. Solche Sequenzen können Allelunterschiede in BCA-GPCR-Genen und Mutationen, die mit Krankheitszuständen und genetischen Anlagen verbunden sind, darstellen.
Ausrüstungen
BCA-GPCRs und ihre Homologe sind ein nützliches Werkzeug zum Identifizieren von Zellen wie z.B. Krebszellen für die Gerichtsmedizin und Vaterschaftsbestimmungen, für die Diagnose von Krankheiten wie z.B. Krebs, z.B. Brustkrebs, und für die Untersuchung der Signaltransduktion. BCA-GPCR-spezifische Reagenzien, die spezifisch mit BCA-GPCR-Nukleinsäuren hybridisieren, wie z.B. BCA-GPCR-Sonden und -Primer, und BCA-GPCR-spezifische Reagenzien, die spezifisch an ein BCA-GPCR-Protein binden, z.B. BCA-GPCR-Antikörper, werden verwendet, um die Signaltransduktionsregulierung zu untersuchen.
Nukleinsäuretests auf die Anwesenheit von BCA-GPCR-DNA und -RNA in einer Probe umfassen zahlreiche Verfahren, die Fachleuten bekannt sind, wie z.B. Southern-Analyse, Northern-Analyse, Dot-Blots, RNase-Schutz, S1-Analyse, Amplifikationsverfahren wie z.B. PCR und LCR und In-Situ-Hybridisierung. Bei der In-Situ-Hybridisierung wird beispielsweise die Zielnukleinsäure von ihren zellulären Umgebungen insofern befreit, als sie zur Hybridisierung innerhalb der Zelle zur Verfügung steht, während die zelluläre Morphologie für die anschließende Interpretation und Analyse bewahrt wird (siehe Beispiel I). Die folgenden Artikel stellen einen Überblick über das Fachgebiet der In-Situ-Hybridisierung bereit: Singer et al., Biotechniques 4:230–250 (1986); Haase et al., Methods in Virology, Band VII, S. 189–226 (1984), und Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach (Hames et al., Hrsg. 1987). Außerdem kann ein BCA-GPCR-Protein mit den verschiedenen vorstehend beschriebenen Immuntestverfahren nachgewiesen werden. Die Testprobe wird typischerweise sowohl mit einer positiven Kontrolle (z.B. einer Probe, die einen rekombinanten BCA-GPCR exprimiert) als auch einer negativen Kontrolle verglichen.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Ausrüstungen zum Screenen auf Modulatoren von BCA-GPCRs bereit. Solche Ausrüstungen können aus leicht erhältlichen Materialien und Reagenzien hergestellt werden. Solche Ausrüstungen können beispielsweise irgendeines oder mehrere der folgenden Materialien umfassen: einen BCA-GPCR, Reaktionsröhrchen und Anweisungen zum Testen der BCA-GPCR-Aktivität. Wahlweise enthält die Ausrüstung biologisch aktiven BCA-GPCR. Eine breite Vielfalt von Ausrüstungen und Komponenten können gemäß der vorliegenden Erfindung in Abhängigkeit von dem beabsichtigten Verwender der Ausrüstung und den speziellen Bedürfnissen des Verwenders hergestellt werden.
Verabreichung und pharmazeutische Zusammensetzungen
BCA-GPCR-Modulatoren können direkt an den Säugerprobanden zur Modulation der Signaltransduktion in vivo, z.B. für die Behandlung eines Krebses wie z.B. Brustkrebs, verabreicht werden. Die Verabreichung geschieht durch irgendeinen der Wege, die normalerweise zur Einführung einer Modulatorverbindung in letztlichen Kontakt mit dem zu behandelnden Gewebe verwendet werden. Die BCA-GPCR-Modulatoren werden in einer beliebigen geeigneten Weise verabreicht, wahlweise mit pharmazeutisch verträglichen Trägern. Geeignete Verfahren zur Verabreichung solcher Modulatoren stehen zur Verfügung und sind Fachleuten gut bekannt und, obwohl mehr als ein Weg verwendet werden kann, um eine spezielle Zusammensetzung zu verabreichen, kann ein spezieller Weg häufig eine unmittelbarere und wirksamere Reaktion vorsehen als ein anderer Weg.
Pharmazeutisch verträgliche Träger werden teilweise durch die verabreichte spezielle Zusammensetzung sowie durch das spezielle Verfahren, das zur Verabreichung der Zusammensetzung verwendet wird, bestimmt. Folglich besteht eine breite Vielfalt von geeigneten Formulierungen von pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung (siehe z.B. Remington's Pharmaceutical Sciences, 17. Ausg. 1985)).
Die BCA-GPCR-Modulatoren allein oder in Kombination mit anderen geeigneten Komponenten können zu Aerosolformulierungen hergestellt werden (d.h. sie können "zerstäubt" werden), um über Inhalation verabreicht zu werden. Aerosolformulierungen können in unter Druck gesetzte annehmbare Treibmittel wie z.B. Dichlordifluormethan, Propan, Stickstoff und dergleichen gegeben werden.
Formulierungen, die zur Verabreichung geeignet sind, umfassen wässerige und nicht-wässerige Lösungen, isotonische sterile Lösungen, die Antioxidantien, Puffer, Bakteriostatika und gelöste Stoffe, die die Formulierung isotonisch machen, enthalten können, und wässerige und nicht-wässerige sterile Suspensionen, die Suspensionsmittel, Solubilisatoren, Verdichtungsmittel, Stabilisatoren und Konservierungsmittel umfassen können. In der Praxis dieser Erfindung können die Zusammensetzungen beispielsweise oral, örtlich, intravenös, intraperitoneal, intravesikal oder intrathekal verabreicht werden. Wahlweise werden die Zusammensetzungen oral oder nasal verabreicht. Die Formulierungen von Verbindungen können in abgedichteten Einheitsdosis- oder Mehrfachdosis-Behältern wie z.B. Ampullen und Fläschchen dargeboten werden. Lösungen und Suspension Ethanol können aus sterilen Pulvern, Körnchen und Tabletten der vorher beschriebenen art zubereitet werden. Die Modulatoren können auch als Teil eines zubereiteten Nahrungsmittels oder Arzneimittels verabreicht werden.
Die an einen Patienten verabreichte Dosis im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung sollte ausreichen, um eine günstige Reaktion im Probanden über die Zeit zu bewirken. Solche Dosen werden prophylaktisch oder an eine Person, die bereits an der Krankheit leidet, verabreicht. Die Zusammensetzungen werden an einen Patienten in einer Menge verabreicht, die ausreicht, um eine wirksame Schutz- oder therapeutische Reaktion im Patienten hervorzurufen. Eine Menge, die angemessen ist, um dies zu bewerkstelligen, ist als "therapeutisch wirksame Dosis" definiert. Die Dosis wird durch die Wirksamkeit der speziellen BCA-GPCR-Modulatoren (z.B. GPCR-Antagonisten und Anti-GPCR-Antikörper), die verwendet werden, und den Zustand der Person sowie das Körpergewicht oder die Oberfläche der behandelnden Fläche bestimmt. Die Größe der Dosis wird auch durch die Existenz, die Art und das Ausmaß von irgendwelchen nachteiligen Nebenwirkungen bestimmt, die die Verabreichung einer speziellen Verbindung oder eines Vektors in einer speziellen Person begleiten.
Bei der Festlegung der wirksamen Menge des zu verabreichenden Modulators kann ein Arzt zirkulierende Plasmaspiegel des Modulators, Modulatortoxizitäten und die Erzeugung von Anti-Modulator-Antikörpern auswerten. Im Allgemeinen liegt das Dosisäquivalent eines Modulators von etwa 1 ng/kg bis 10 mg/kg für eine typische Person.
Zur Verabreichung können die BCA-GPCR-Modulatoren der vorliegenden Erfindung mit einer Rate verabreicht werden, die durch den LD-50 des Modulators und die Nebenwirkungen des Inhibitors bei verschiedenen Konzentrationen, wie auf die Masse und Gesamtgesundheit des Patienten angewendet, bestimmt wird. Die Verabreichung kann über einzelne oder verteilte Dosen durchgeführt werden.
BEISPIELE
Die folgenden Beispiele werden nur zur Erläuterung und nicht zur Begrenzung bereitgestellt. Fachleute werden leicht eine Vielzahl von nicht-kritischen Parametern erkennen, die geändert oder modifiziert werden könnten, um im Wesentlichen ähnliche Ergebnisse zu ergeben.
Beispiel I: Identifikation und Klonieren von neuen BCA-GPCRs
Vier menschliche BCA-GPCRs wurde kloniert und ihre Nukleinsäuresequenzen sind in SEQ ID NR.: 1, 3, 5 und 7 bereitgestellt. Die abgeleiteten Aminosäuresequenzen sind in SEQ ID NR.: 2, 4, 6 und 8 bereitgestellt. Die neuen BCA-GPCRs wurden als BCA-GPCR-1, -2, -3 bzw. -4 bezeichnet.
Diese Sequenzen können aus cDNA oder genomischer DNA mit Standard-PCR-Bedingungen unter Verwendung der folgenden PCR-Primer amplifiziert werden:
ATGTTGGGGAACGTCGCCATC (SEQ ID NR.: 9) und
TCATCCACAGAGCCTCCAGAT (SEQ ID NR.: 10) (BCA-GPCR-1)
ATGGGAAAGGACAATCCAGTT (SEQ ID NR.: 11) und
CTAAGAGAGTAACTCCAGCAA (SEQ ID NR.: 12); (BCA-GPCR-2)
ATGGAAATAGCCAATGTGAGTTC (SEQ ID NR.: 13) und
TAAATTTGCGCCAGCTTGCCTG (SEQ ID NR.: 14); (BCA-GPCR-3)
und
ATGGTGAGACATACCAATGAGAG (SEQ ID NR.: 15) und
CATAAAATATTTACTCCCAGAGCC (SEQ ID NR.: 16) (BCA-GPCR-4).
Beispiel II: mRNA-Expression und Genamplifikation von BCA-GPCR-3 in Brustkrebszellen und -tumoren
Die Genamplifikation von BCA-GPCR-3 in Brustkrebszellinien und -tumoren wurde gemäß der Standardmethodologie gemessen (siehe 1).
Die BCA-GPCR-3-mRNA-Expression in Brustkrebszellinien wurde unter Verwendung von PT-PCR gemäß der Standardmethodologie untersucht (siehe 2 und 3). BCA-GPCR-3-mRNA-Spiegel waren in Krebszellinien sowohl von amplifizierten als auch nicht-amplifizierten Tumoren erhöht, ein Kennzeichen von Onkogenen.
BCA-GPCR-1-Nukleinsäuresequenz: SEQ ID NR.: 1
BCA-GPCR-1-Aminosäuresequenz: SEQ ID NR.: 2
BCA-GPCR-2-Nukleinsäuresequenz: SEQ ID NR.: 3
BCA-GPCR-2-Aminosäuresequenz: SEQ ID NR.: 4
BCA-GPCR-3-Nukleinsäuresequenz: SEQ ID NR.: 5
BCA-GPCR-3-Aminosäuresequenz: SEQ ID NR.: 6
BCA-GPCR-4-Nukleinsäuresequenz: SEQ ID NR.: 7
BCA-GPCR-4-Aminosäuresequenz: SEQ ID NR.: 8

Claims

Isolierte Nukleinsäure, die ein Polypeptid codiert, wobei das durch die Nukleinsäure codierte Polypeptid mehr als 70% Aminosäureidentität mit einer Aminosäuresequenz von SEQ ID NR.: 6 umfaßt, wobei die Expression des Polypeptids in Brustkrebszellen und Tumoren im Vergleich zu normalen Säugerepithelzellen differentiell reguliert wird.
Isolierte Nukleinsäure, die ein Polypeptid codiert, wobei das durch die Nukleinsäure codierte Polypeptid 90% oder mehr Aminosäureidentität mit einer Aminosäuresequenz von SEQ ID NR.: 6 umfaßt, wobei die Expression des Polypeptids in Brustkrebszellen und Tumoren im Vergleich zu normalen Säugerepithelzellen differentiell reguliert wird.
Isolierte Nukleinsäure nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Nukleinsäure selektiv mit einer Nukleotidsequenz von SEQ ID NR.: 5 unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit 50% Formamid, 5 × SSC und 1% SDS bei 42°C und Waschbedingungen mit 0,2 × SSC und 0,1% SDS bei 65°C hybridisiert.
Isolierte Nukleinsäure, die ein Polypeptid codiert, mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NR.: 6.
Isolierte Nukleinsäure mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NR.: 5.
Isolierte Nukleinsäure nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Nukleinsäure von einem Menschen, einer Maus oder einer Ratte stammt.
Isolierte Nukleinsäure nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Nukleinsäure durch Primer amplifiziert ist, die unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit der gleichen Sequenz wie ein Primersatz von ATGGAAATAGCCAATGTGAGTTC (SEQ ID NR.: 13) und TAAATTTGCGCCAGCTTGCCTG (SEQ ID NR.: 14) spezifisch hybridisieren.
Isoliertes Polypeptid, wobei das Polypeptid mehr als 70% Aminosäuresequenzidentität mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NR.: 6 umfaßt, wobei die Expression des Polypeptids in Brustkrebszellen und Tumoren im Vergleich zu normalen Säugerepithelzellen differentiell reguliert wird.
Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 8 mit 90% oder mehr Aminosäuresequenzidentität mit einer Aminosäuresequenz von SEQ ID NR.: 6.
Isoliertes Polypeptid, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NR.: 6 aufweist.
Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 8, 9 oder 10, wobei das Polypeptid von einem Menschen, einer Ratte oder einer Maus stammt.
Antikörper, der selektiv an das Polypeptid nach einem der Ansprüche 8 bis 11 bindet.
Expressionsvektor mit der Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 7.
Wirtszelle, die mit dem Vektor nach Anspruch 13 transfiziert ist.
Verfahren zum Nachweisen der Anwesenheit einer GPCR3-Nukleinsäure oder eines Polypeptids in einer biologischen Probe von einem menschlichen Gewebe, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt: (i) Isolieren der biologischen Probe, (ii) Kontaktieren der biologischen Probe mit einem spezifischen Reagenz, das sich mit einer Nukleinsäure nach Anspruch 5; oder einem Polypeptid nach Anspruch 10 selektiv verbindet; und (iii) Nachweisen des Anteils an spezifischem Reagenz, das sich mit der Probe selektiv verbindet.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei das spezifische Reagenz aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus folgendem besteht: spezifischen Antikörpern, spezifischen Oligonukleotidprimern und spezifischen Nukleinsäuresonden.
Verfahren nach Anspruch 15 oder Anspruch 16, wobei das Gewebe Brustkrebsgewebe ist.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, wobei das Verfahren den Schritt des Exprimierens des Polypeptids aus einem rekombinanten Expressionsvektor nach Anspruch 13 umfaßt.
Verfahren zur Herstellung einer rekombinanten Zelle mit einem Polypeptid, wobei das Verfahren den Schritt der Transduktion der Zelle mit einem Expressionsvektor umfaßt, der eine Nukleinsäure, die ein Polypeptid, nach einem der Ansprüche 8 bis 11 codiert, umfaßt.
Isolierte Nukleinsäure, die mindestens 100 benachbarte Nukleotide von SEQ ID NR.: 5 oder des Komplements von SEQ ID NR.: 5 umfaßt.
Isolierte Nukleinsäure nach Anspruch 20, wobei die Nukleinsäure mindestens 100 benachbarte Nukleotide von SEQ ID NR.: 5 umfaßt und durch einen Primersatz von SEQ ID NR.: 13 und SEQ ID NR.: 14 amplifiziert ist.
Isolierte Nukleinsäure, die ein Polypeptid codiert, mit der Aminosäureteilsequenz von SEQ ID NR.: 6, die durch eine Nukleinsäure codiert wird, die durch den Primersatz von SEQ ID NR.: 13 und SEQ ID NR.: 14 amplifiziert ist.
Vektor mit der Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 20–22.
Isolierte Wirtszelle mit dem Vektor nach Anspruch 23.
Isoliertes Polypeptid mit mindestens 200 benachbarten Aminosäuren von SEQ ID NR.: 6.
Isoliertes Polypeptid mit dem Aminosäurebereich von SEQ ID NR.: 6 von dem Methioninrest in der Position 22 bis zum Isoleucinrest in der Position 340.
Antikörper, der selektiv an ein Polypeptid nach Anspruch 25 oder 26 bindet.