DE60017133T2

DE60017133T2 - Naphthochinonderivate und ihre verwendung zur behandlung und kontrolle von tuberkulose

Info

Publication number: DE60017133T2
Application number: DE60017133T
Authority: DE
Inventors: Jacobus Johannes Marion Meyer; Namrita Lall
Original assignee: South African Medical Research Council; University of Pretoria; Medical Research Council of South Africa
Current assignee: South African Medical Research Council; University of Pretoria; Medical Research Council of South Africa
Priority date: 1999-06-24
Filing date: 2000-06-22
Publication date: 2005-06-16
Anticipated expiration: 2020-06-23
Also published as: AP2002002393A0; AP1377A; EP1194137A2; WO2001000554A2; US6835755B1; DE60017133D1; CN1192768C; CN1372464A; AU5240700A; RU2246299C2; WO2001000554A3; JP2003531813A; EP1194137B1

Description

Hintergrund der Erfindung
Diese Erfindung betrifft die Verwendung von Naphtochinon-Derivaten der Formel 1a oder 1b, wie in Anspruch 1 definiert, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und Kontrolle von Tuberkulose, verursacht durch Mycobacterium tuberculosis.
Tuberkulose (TB) bleibt ein schwerwiegendes Gesundheitsproblem in vielen Regionen der Welt, insbesondere in Entwicklungsländern. Sie ist eine infektiöse Krankheit und wird in einigen Teilen der Welt epidemisch. Es wird geschätzt, dass 30–60% der Erwachsenen in Entwicklungsländern mit Mycobacterium tuberculosis infiziert sind. Etwa 8–10 Millionen Individuen entwickeln klinische TB und 3 Millionen sterben jedes Jahr an TB (WHO/IUATLD, 1989).
In Südafrika sterben mehr als 3 von Tausend Leuten an TB, die höchste Quote in der Welt, während einer von 200 Leuten an aktiver Tuberkulose leidet. Tuberkulose ist die am häufigsten gemeldete Krankheit in Südafrika und die fünftgrößte Todesursache unter der schwarzen Bevölkerung (South African Tuberculosis Association, 1998).
In den Vereinigten Staaten nahm die Anzahl der TB-Fälle bis 1986, als ein Anstieg bemerkt wurde, stetig ab. Seitdem sind die TB-Fälle kontinuierlich angestiegen. Zehn Millionen Individuen sind in den U.S.A. infiziert, mit etwa 26.000 neuen Fällen aktiver Krankheit jedes Jahr (National Jewish Medical and Research Center, 1994).
Mit humanem Immunschwächevirus (HIV) infizierte Individuen sind sehr empfänglich für Tuberkulose und entwickeln diese Krankheit oft bevor andere Anzeichen von AIDS sichtbar werden (Grange und Davey, 1990). Die Kontrolle der mit HIV-Infektion verbundenen TB-Epidemie wird größtenteils von der angemessenen Behandlung von TB abhängen, und möglicherweise von wirksamer Chemoprophylaxe, nicht nur für HIV-infizierte Personen sondern auch für Gemeinschaften (WHO/IUATLD, 1989).
Die TB-Therapie wurde revolutioniert und die gegenwärtigen Behandlungsweisen für TB basieren auf einer Arzneimittelcocktailtherapie mit gewöhnlich 3 oder 4 anti-Tuberkulose-Arzneimitteln. Jedoch tritt das Problem von gegen Arzneimittel multi-resistenten Tuberkelbazillen für verschiedene Arzneimittel auf, wie z.B. Isoniazid, Ethambutol, Rifampicin und Streptomycin (Girling, 1989; Grange und Davey, 1990).
Arzneimittel-restitentes TB ist sehr schwer zu behandeln und erfordert größere Zahlen und Vielfältigkeit der Medikationen für eine längere Zeitspanne der Behandlung. Das Bedürfnis für neue anti-Tuberkulosemittel ist aufgrund der zunehmenden Resistenz der Mykobakterien gegen diese klassischen anti-Tuberkulose-Arzneimittel dringend. Ein neuer WHO-Bericht stellt fest, dass weltweit 2% aller Fälle von Tuberkulose multirestitent gegen Arzneimittel sind – per Definition, Resistenz gegen Rifampicin und Isoniazid (plus/minus andere Resistenzen). Solche Fälle können in den U.S.A. und anderen hoch entwickelten Regionen behandelt werden, aber mit hohen Kosten (> US$ 250.000 pro Fall!) und unter Verwendung von ziemlich toxischen Arzneimitteln für sehr lange Zyklen, wodurch ernste Probleme der Einwilligung aufkommen (WHO, 1997). Südafrika erlebt eine Explosion der Anzahl von Fällen von Arzneimittel-resistenter Tuberkulose. In einigen Teilen von Südafrika ist 1 von 10 TB-Fällen resistent gegen Behandlung (New Scientist, März 1997). Es ist wesentlich, neue anti-Tuberkulosemittel zu haben, bevorzugt solche, die leicht und einfach aus einer lokalen Quelle produziert werden können.
Verschiedene Petrol-Ether und dann Chloroformextrakte von Euclea natalensis Wurzelrinde sind früher untersucht worden und zeigten, dass sie eine deutliche antibiotische Aktivität gegen Staphylococcus aureus haben. 7-Methyljuglon, Mamegakinon und Diospyrin wurden isoliert und als wirksam gegen eine Reihe von pathogenen Organismen, einschließlich Neisseria gonorrhoeae und Shigella Spp., erkannt, obwohl ein aus E. natalensis isoliertes Triterpenoid Lupeol als unwirksam gegen Staphylococcus aureus befunden wurde. (KHAN, M.R. et al: "Antibiotic action of constituents of root bark of Euclea-Natalensis", Pak J Sci Ind Res, (1978 (recd 1979)) 21 (5–6), 197–199., XP000978450).
Eine Untersuchung der antibakteriellen Aktivität von D.maritima und D.novoguinensis bestätigte, dass es auf das Vorhandensein von 7-Methyljuglon und Plumbagin zurückzuführen sei. (KHAN, M. R. et al: "Constituents of Diospyros Iolin, D.maritima und D.novoguinensis", Fitoterapia, (April, 1999), Bd. 70, Nr. 2, S. 194–196, XP000978591).
Eine Untersuchung der antimikrobiellen Aktivität von 191 Präparationen aus 70 Pflanzenspezies und der antiviralen Aktivität von 22 Chinonen zeigte, dass Plumbagin aus Phumbago europea und Ceratostigma plumbaginsides wirksam gegen grampositive und gramnegative Bakterien, Mycobacterium tuberculosis, Microsporum lanesum, Candida albicans, Entamoebo histolytica und Trichomonas vaginalis war. (VICHKANOVA, S.A. et al: "Search for antimicrobial drugs among quinones of plant origin" bezogen von STN Datenbankzugang Nr. 91:83030 XP002157353 & Rastit. Resur. (1979), 15(2), 167–77).
Die potentiellen antiplasmodialen Effekte eines aus Pflanzen stammenden Bis-naphtochinoids, Diospyrin (aus Diospyros Montana Roxb.) und einige semisynthetische Derivate desselben sind früher auch untersucht worden. (HAZRA, Banasri et al: "In vitro antiplasmodial effects of Diospyrin, a plant-derived naphtoquinoid, and a novel series of derivatives", Phytother. Res. (1995), 9(1), 72–4, XP000978372).
Die in vitro Aktivität von Diospyrin und Derivaten desselben gegen Leishmania donovani, Trypanosoma cruzi und Trypanosoma brucei brucei, zeigten auch Potenzial bei der Behandlung der parasitären Protozoenkrankheit Leishmaniose und Trypanosomiasis. (YARDLEY, Vanessa et al: "In vitro activity of diospyrin and derivatives against Leishmania donovani, Trypanosoma cruzi und Trypanosoma brucei brucei, Phytother. Res. (1996), 10(7), 559– 562, XP000978369).
Diospyrin wurde aus der Rinde von Diospyros Montana Roxb., isoliert, gereinigt und in vitro und in vivo Experimente durchgeführt, um dessen biologische Aktivität gegen Ehrlich Aszites Karzinom in Swiss A Mäusen zu untersuchen. Die Untersuchungen ließen erkennen, dass eine weitere Untersuchung sinnvoll erschien, um ihr Potential als Antitumormittel zu erkunden. (HAZRA, Banasri et al: "Biological activity of Diospyrin towards Ehrlich ascites carcinoma in Swiss A mice", Plant Med. (1984), 50(4), 295–7, XP000978377).
In Anbetracht der bekannten Tumorinhibierungswirkung von Diospyrin gegen Ehrlich Aszites Karzinom, wurden auch Derivate von Diospyrin hergestellt und mit Blick auf die Verringerung seiner ausgeprägten cytotoxischen Wirkungen auf den Tierwirt getestet. (HAZRA, Banasri et al: "New diospyrin derivatives with improved tumour inhibitory activity towards Ehrlich ascites carcinoma", Med. Sci. Res (1994), 22(5), 351–3, XP000978374).
Die frühere Isolierung von Phthiocol (3-Hydroxy-2-methyl-1,4-naphtochinon) aus der Aceton-löslichen Fettfraktion der Tuberkelbazillen und die Bestätigung, dass es in vitro gegen Stamm H-37 R.V. und in Mäusen eine antituberkulöse Aktivität hatte veranlaßte auch die Synthese von einigen 2-Alkyl-3-hydroxy-1,4-naphthochinon-4-aryl(aroyl)hydrazonen als mögliche tuberkulostatische Mittel. (ROUSHDI, I.M. et al: "Synthesis of 1,4-naphthoquinones-4-aryl(aroyl)hydrazones of potential antimicrobial activity", Pharmazie, (1976) 31(12)856–9, XP000971908).
2- und 3-substituierte α-Naphtochinone sind auch synthetisiert worden und für eine Anzahl von diesen ist gezeigt worden, dass sie antibakteriostatische Aktivität gegen Mycobacterium tuberculosis haben. (OERIU, I: "Relation between the chemical structure and the antitubercular effect of alpha-naphthoquinone derivatives substituted in 2 and 3 positions", Pharmazie, (1961 Mai) 16 266–72, XP000971910; und OERIU I: "Zusammenhänge zwischen der chemischen Struktur und der antituberkulösen Wirkung der in Stellung 2 und 3 substituierten Derivate des alpha-Naphthochinons", Pharmazie, Nr. 16, 1961, S. 320–327, XP002078405 ISSN: 0031–7144).
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Die vorliegende Erfindung ist gerichtet auf die Verwendung von Naphthochinonderivaten der Formel 1a und 1b:
Formel 1a
Formel 1b wobei R eine OH-Gruppe repräsentiert und R₁ eine Methylgruppe repräsentiert, oder pharmazeutisch verträgliche Salze derselben, bei der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Behandlung und/oder Kontrolle der durch Mycobacterium tuberculosis hervorgerufenen Tuberkulose.
Für Diospyrin und Methyljuglon bzw. Naphthochinonderivate der Formel 1a und Formel 1b, in welchen R OH ist und R1 eine Methylgruppe ist, wurde festgestellt, dass sie mehrere Antibiotika-resistente sowie für Antibiotika empfängliche Mycobacterium tuberculosis-Stämme inhibieren.
Ein umfassendes Forschungsprogramm wurde unternommen, um antituberkulöse Mittel zu identifizieren, die leicht und einfach aus lokalen Quellen produziert werden können.
Zwanzig südafrikanische Medizinpflanzen, die verwendet werden, um Lungenkrankheiten zu behandeln, wurden auf Aktivität gegen Wirkstoff-resistente und empfindliche M. tuberculosis-Stämme gescreent. Ein vorläufiges Screening der Aceton- und Wasserpflanzenextrakte gegen einen Wirkstoff-empfindlichen M. tuberculosis-Stamm, H37Rv, wurde mit dem Agarplattenverfahren ausgeführt. Vierzehn der 20 Acetonextrakte zeigten bei einer Konzentration von 0,5 mg/ml inhibitorische Aktivität gegen diesen Stamm. Aceton- sowie Wasserextrakte von Cryptocarya latifolia, Euclea natalensis, Helichrysum melanacme, Nidorella anomala und Thymus vulgaris inhibierten das Wachstum von M. tuberculosis. Die Aktivität von 14 Acetonextrakten bei 0,5 mg/ml gegen den Wirkstoff-empfindlichen Stamm bei dem Agarplattenverfahren gegeben, wurde eine weitere Untersuchung, verwendend das schnelle radiometrische Verfahren, ausgeführt, um die Inhibitoraktivität zu bestätigen. Diese aktiven Acetonextrakte wurden gegen den Stamm H37Rv sowie einen gegen die Wirkstoffe Isoniazid und Rifampicin resistenten Stamm gescreent. Die minimale Inhibitorkonzentration von Croton pseudopulchellus, Ekebergia capensis, Euclea natalensis, Nidorella anomala und Polygala myrtifolia war 0,1 mg/ml gegen den Stamm H37Rv bei dem radiometrischen Verfahren. Extrakte von Chenopodium ambrosioides, Ekebergia capensis, Euclea natalensis, Helichrysum melanacme, Nidorella anomala und Polygala myrtifolia waren wirksam gegen den resistenten Stamm bei 0,1 mg/ml. Acht Pflanzen zeigten Aktivität gegen beide Stämme bei einer Konzentration von 1,0 mg/ml.
Das folgende Verfahren wurde durch den Anmelder für die Isolierung von Diospyrin und Mehtyljuglon aus E. natalensis und anderen Spezies dieser Gattung sowie jeglichen anderen Pflanzen, die Diospyrin oder Methyljuglon oder andere Chinonderivate synthetisieren könnten, entwickelt.
1. Identifizierung der Pflanzenspezies
Wurzeln und die aerialen Pflanzenteile von E. natalensis wurden nahe Durban gesammelt und am HGWJ Schweickerdt Herbarium der Universität von Pretoria identifiziert und auch am Herbarium des Nationalen Botanischen Instituts, Pretoria.
2. Extraktion
Getrocknete Wurzeln von E. natalensis wurden mit einer Trockenmühle zu einem Pulver zerrieben und 48 Stunden lang mit Aceton extrahiert. Der Extrakt wurde filtriert und bei reduziertem Druck an einem Rotationsverdampfer bis zur Trockenheit konzentriert.
3. Dünnschichtchromatographie
Ein direkter antibakterieller Bioassay (Dilika & Meyer 1996) auf DC-Platten wurde angewandt, um die aktivitätsgeführte Isolierung der antituberkulösen Verbindungen zu beschleunigen. M. tuberculosis kann wegen seiner sehr langsamen Wachstumsrate nicht auf diese Weise getestet werden. Die direkten antibakteriellen Bioassays des Acetonextrakts wurden auf DC-Platten (Merck), entwickelt mit Chloroform-Hexan (1:1), durchgeführt. Nach der Entwicklung wurden die DC-Platten getrocknet und mit einer 24 h-alten Staphylococcus aureus Kultur in Nährlösung besprüht. Nach 24 h Inkubation wurden die Platten mit einer 2 mg/ml wässrigen Lösung von p-Iodonitrotetrazolviolett besprüht, um die bakteriellen Zellen sichtbar zu machen. Die Platten wurden dann bei 37° C für 2–3 Stunden reinkubiert.
Zwei Zonen der Inhibition des bakteriellen Wachstums konnten auf mit S. aureus besprühten DC-Platten beobachtet werden. Die Aktivität war ausgeprägter in der R_f 0,30-Zone (Chloroform-Hexan (1:1)) als in der R_f 0,54-Zone.
4. Säulenchromatographie
Der Rohextrakt der Pflanze wurde getrocknet, seine Masse bestimmt und in Chloroform resuspendiert. Säulenchromatographie wurde auf Silika-Gel 60 unter Verwendung von Chloroform als Elutionsmittel durchgeführt. Die gesammelten antibakteriellen Fraktionen wurden dann einer Sephadex LH-20 Säulenchromatographie unter Verwendung von Ethanol als Elutionsmittel unterzogen. Die gesammelten Fraktionen wurden erneut auf antibakterielle Aktivität auf DC getestet, um die Fraktionen zu detektieren, die die aktiven Verbindungen von R_f 0,30 und R_f 0,54 enthalten.
5. Hochleistungsflüssigchromatographie
Die Verbindungen wurden durch HPLC unter Verwendung einer 250 × 4,60 mm analytischen Phenomenexsäule mit reverser Phase bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 1,0 ml/min, einer Ofentemperatur von 40°C und einer Wellenlänge von 206 nm weiter gereinigt. Eine Ethanol-Wasser- (50:50) Lösung wurde als mobile Phase verwendet. Die reinen Verbindungen wurden noch einmal einer Sephadex LH-20 Säulenchromatographie unterzogen und als rein bestätigt.
Die chemischen Strukturen wurden durch ¹H und ¹³C NMR und MS bestätigt zu sein:
Diospyrin (5,5'-Dihydroxy-7,7'-binaphthochinon); C₂₂H₁₄O₆.
Molekulargewicht: 374,35
7-Methyljuglon(5-Hydroxy-7-methyl-1,4-naphtochinon); C₁₁H₈O₃ Molekulargewicht: 188,19.
Die Wirkung von Diospyrin und Methyljuglon auf das Wachstum des empfindlichen Stamms (H37Rv) und der resistenten Mycobacterium tuberculosis-Stämme, wie bestimmt durch das radiometrische Verfahren, sind in Tabelle 1 und Tabelle 2 angegeben.
Tabelle 1 Wirkung von Diospyrin auf das Wachstum des empfindlichen Stamms (H37Rv) und der resistenten Mycobacterium tuberculosis Stämme, wie durch das radiometrische Verfahren bestimmt.
Tabelle 2 Wirkung von 7-Methyljuglon als ein Einzelmittel und in Kombination mit Diospyrin auf das Wachstum des empfindlichen Stamms (H37Rv) und resistente Mycobacterium tuberculosis Stämme, wie bestimmt durch das radiometrische Verfahren.
Die Ergebnisse zeigen, daß Diospyrin und Methyljuglon das Mycobacterium tuberculosis Bakterium wirksam kontrollieren. Die orale Verabreichung von Diospyrin oder Methyljuglon in einer geeigneten pharmazeutischen Zusammensetzung mit passenden Verdünnungsmitteln und Trägern, werden üblicherweise verwendet werden, um Tuberkulose zu behandeln oder zu kontrollieren. Dies wird durch eine Tablette, Flüssigkeit oder eine ähnliche orale Dosierungsform geschehen, da Diospyrin und Methyljuglon leicht vom Darm absorbiert werden.
Jedoch wird angenommen, daß intravenös oder intramuskulär verabreichtes Diospyrin oder Methyljuglon auch wirksam durch Blutgefäße und den Blutstrom eines Patienten absorbiert werden wird. Die transdermale Verabreichung über ein Pflaster oder ein ähnliches transdermales Verabreichungsvehikel ist auch eine Möglichkeit.
Eine Kombinationsbehandlung mit Diospyrin und Methyljuglon, die wirksamer sein könnte als Einzelbehandlungen mit den zwei Naphtochinonen, ist auch ins Auge gefaßt.
Der Anmelder nimmt an, daß es möglich sein könnte, die Konzentration an Diospyrin, Methyljuglon und anderen Chinonen in E. natalensis oder ähnlichen Spezies durch phytoalexische Stimulation oder durch die biotechnologische Manipulation der Gewebekulturen und/oder vollständigen Pflanzen zu erhöhen.
Chinone werden im Allgemeinen aus Catechol (1,2-Chinonen) oder Hydrochinon (1,4-Chinonen) durch milde Oxidation synthetisiert.
Soweit der Anmelder feststellen konnte, ist Diospyrin einmal in einem Labor sythetisiert worden (Yoshida, M. und Mori, K. 2000. European Journal of Organic Chemistry, Seiten 1313–1317). Jedoch können ähnliche Binaphtochinone auch durch die Umsetzung von Plumbagin (94mg in Methanol, 10ml) und dessen Hydrochinon (190mg in Methanol, 14ml), gepuffert in Phosphat auf pH 6,8 bei 30°C, synthetisiert werden (Sankaram et al. 1975; Kumari et al. 1982).
Plumbagin
Es wird angenommen, daß Diospyrin, Methyljuglon und verwandte Naphthochinonderivate brauchbare Alternativen zu herkömmlichen Wirkstoffen bei der Behandlung und Kontrolle von Tuberkulose bei Menschen sind.

Claims

Verwendung eines Naphthochinon-Derivats der Formel 1a oder Formel 1b:
Formel 1a
Formel 1b worin R eine OH-Gruppe und R1 eine Methylgruppe ist, oder von pharmazeutisch annehmbaren Salzen davon, bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung und/oder Kontrolle von Tuberkulose in einem Patienten, hervorgerufen durch Mycobacterium tuberculosis.
Verwendung nach Anspruch 1, worin das Naphthochinon-Derivat ein 5,5'-Dihydroxy-7,7'-binaphthochinon (Diospyrin) oder 5-Hydroxy-7-methyl-1,4-naphthochinon (Methyljuglon) oder einer Mischung davon ist.