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DE60012688T2 - Immunoassays zum nachweis von krankheiten oder krankheitsanfälligkeitsmerkmalen - Google Patents

Immunoassays zum nachweis von krankheiten oder krankheitsanfälligkeitsmerkmalen Download PDF

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DE60012688T2
DE60012688T2 DE60012688T DE60012688T DE60012688T2 DE 60012688 T2 DE60012688 T2 DE 60012688T2 DE 60012688 T DE60012688 T DE 60012688T DE 60012688 T DE60012688 T DE 60012688T DE 60012688 T2 DE60012688 T2 DE 60012688T2
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gene
subject
protein
disease
mutations
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M. Bruce BOMAN
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BOMAN BRUCE M
CA*TX Inc
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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die hierin offenbarte Erfindung betrifft das Gebiet der medizinischen Genetik, betrifft die Diagnose und Prognose einer Erkrankung oder Anfälligkeit für eine Erkrankung, insbesondere auf dem Gebiet der Onkologie. Insbesondere betrifft die Erfindung Immunassays, die zelluläre Konzentrationen an als Ziel definierten Proteinen in voller Länge nachweisen, wobei eine abnormal geringe Konzentration eines als Ziel definierten Proteins in voller Länge, oder wobei das Fehlen eines solchen als Ziel definierten Proteins in voller Länge eine Mutation oder Mutationen in einem Subjektgen wieder spiegelt. Die Genmutationen von Interesse sind solche, die mit einer Erkrankung bzw. Krankheit oder einer Anfälligkeit für eine Krankheit assoziiert sind, beispielsweise Krebs oder einer Prädisposition gegenüber Krebs.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Der Nachweis von Trägern zahlreicher mutierter Allele ist medizinisch von großem Nutzen, um die klinische Behandlung des Patienten zu leiten. Das heißt, es ist wertvoll zu wissen, ob eine Person eine Keimbahn- oder eine erworbene Mutation aufweist, die mit einer Krankheit oder der Anfälligkeit gegenüber einer Krankheit in Verbindung steht.
  • Besipielsweise gibt das prä-operative Identifizieren eines Darmkrebspatienten, der eine Keimbahnmutation in einem Reparaturgen mit mangelnder Übereinstimmung (Mismatch Repair-Gen) trägt, die mit einem vererbbaren Nicht-Polyposis-Darmkrebs (Hereditary non-polyposis colon cancer (HNPCC)) in Verbindung steht, einem Chirurgen eine Anleitung dabei zu entscheiden, ob eine totale Kolektomie oder eine Teilkolektomie durchgeführt werden muss oder nicht. Wenn der Patient eine Keimbahnmutation aufweist, dann ist die Chance für einen zweiten Primärdarmkrebs extrem hoch (vielleicht 70%). In diesem Falle wird eine totale Kolektomie üblicherweise als anfängliche chirurgische Behandlung empfohlen. Die Ziele des chirurgischen Eingriffs beständen darin, den Darmkrebs zu behandeln, der bereits existiert und die Entwicklung neuer darmbezogener Malignitäten zu vermeiden. Das Vorhandensein einer Keimbahnmutation in einem Krebspatienten führt nicht nur zu Unterschieden in der chirurgischen Behandlung des Krebses, sondern auch zu möglichen Unterschieden bezüglich des Bedarfs nach einer adjuvanten Chemotherapie nach der Kolektomie.
  • Das Vermögen, das Vorhandensein einer Keimbahnmutation in Patienten zu identifizieren, wird ebenfalls zu effektiveren Ansätzen gegenüber der Krebsprävention und Früherkennung anderer Krebstypen führen (beispielsweise außer Darmkrebs), dessen Entwicklung solche Patienten als Risiko ausgesetzt sind.
  • Mit anderen Worten, die Information aus einem Test, der von HNPCC-befallenen Darmkrebspatienten identifiziert, sollte ein zweites klinisches Screening solcher Patienten für andere Krebsarten als Darmkrebs auslösen, die ebenfalls lebensbedrohlich sein könnten.
  • Zusätzlich wird die positive Diagnose von Keimbahnmutationen in Krebspatienten das Testen zum Nachweisen von Keimbahnmutationsträgern bei ihren Familienmitgliedern erleichtern. Solche Tests werden zu effektiveren Krebsvorbeugestrategien und zu einer besseren klinischen Behandlung für Krebsarten führen, die in Familienmitgliedern nachgewiesen werden. Somit wird die durch diese Erfindung bereitgestellte Information ebenfalls für den Arzt bei einer Empfehlung des Screenings anderer Familienmitglieder des Patienten von Nutzen sein, weil das Herausfinden einer Keimbahnmutation solche Individuen einem hohen Risiko für Darmkrebs und andere Krebsarten aussetzt.
  • Ein Hauptproblem bei der Diagnose/Prognose von Erbkrankheiten besteht in dem enormen Arbeitsanfall und Kosten, die in die Durchführung üblicher Molekül-basierter Assays involviert sind, um die Erbmerkmale zu identifizieren, die mit einer Krankheit, wie beispielsweise HNPCC, oder einer Anfälligkeit gegenüber einer Krankheit verbunden sind. Die vorliegende Erfindung stellt leichter durchführbare Verfahren, Immunoassays, zum Nachweis solcher Erbmerkmale bereit. Die Assays dieser Erfindung sind relativ einfach, rasch (24 h), weisen einen hohen Durchsatz auf (high throughput) und sind preiswert. Die Assays dieser Erfindung machen das Screening vollständiger Populationen möglich, die einem Risiko solcher Erbkrankheiten ausgesetzt sind. Ebenfalls können die Assays dieser Erfindung Träger von Krankheits- assoziierten Erbmerkmalen identifizieren, bevor diese eine Krankheit, wie beispielsweise Krebs, entwickeln.
  • Die Assays dieser Erfindung basieren auf der Annahme, dass die Genexpression direkt mit der Gendosis in Verbindung steht, das heißt das Vorhandensein von zwei Wildtyp-Allelen hat die Expression der zweifachen Menge des Wildtypproteins in voller Länge zur Folge als sie auftreten würde, wenn nur ein Wildtyp-Allel vorliegen würde. Gemäß dieser Erfindung werden Immunoassays zur Messung der Reduktion der Menge von Proteinen in voller Länge, die durch ein Subjektgen exprimiert wird, gegenüber der normalen Expression, verwendet. Im Gegensatz hierzu werden Mutationen in Genen, beispielsweise in Mismatch Repair (MMR) Genen klassischerweise durch eine DNA-Sequenzanalyse und/oder in vitro Translationstyp-Assays nachgewiesen [Giardiello, F.M., „Genetic Testing in Hereditary Colon Cancer", JAMA, 278: 1278–1281 (1997)], Tests die kostenintensiv sind, Zeit verbrauchen und nur in ausgewählten akademischen und kommerziellen Referenzlaboratorien angeboten werden.
  • Repräsentative Immunoassays sind offenbart, die zum Screenen in erster Linie für bestimmte Typen von erblich bedingtem kolorektalem Krebs (colorectal cancer (CRC)) oder einer Prädisposition gegenüber erblichem CRC verwendet werden. Solche repräsentativen Immunoassayverfahren zum Screenen nach erblichem CRC oder nach einer Prädisposition hierfür basieren auf dem Nachweis der Veränderungen der Konzentration an zellulärem Protein in voller Länge, die entweder (1) auf Mutationen des adenomatösen Polyposisgens (adenomatous polyposis gene (APC)), einer Mutation, die mit einer familiären adenomatösen Polyposis (familial adenomatous polyposis (FAP)) in Verbindung steht, oder auf (2) Mutationen von Mismatch Repair (MMR) Genen zurückzuführen sind, insbesondere MLH1, MSH2, PMS1, PMS2 und MSH6, Mutationen, die mit erblichem Nicht-Polyposisdarmkrebs (HNPCC) in Verbindung stehen.
  • Molekulargenetische Verfahren, beispielsweise solche auf Grundlage des Nachweises von Mutationen in der DNA-Sequenz eines Allels eines Gens von Interesse, wurden dazu verwendet, Individuen zu diagnostizieren, die erbliche Darmkrebsmerkmale tragen, beispielsweise HNPCC und FAP. Obwohl solche Tests hoch spezifisch sein können und ziemlich einfach durchzuführen sind, wenn die präzise Zielmutation bekannt ist, beispielsweise wenn HNPCC-Verwandte gescreent werden, sind solche Tests schwierig durchzuführen, wenn die präzise Zielmutation nicht bekannt ist. Im letzteren Fall wird das Herausfinden einer kleinen DNA-Mutation und einer Viel zahl großer MMR-Gene eine gewaltige Herausforderung, ähnlich wie dem Suchen einer Nadel in einem Heuhaufen. Gerade in dieser Situation werden Immunoassays dieser Erfindung so praktisch, weil sie rasch und relativ preiswert durchzuführen sind.
  • Weiterhin kann eine positive Erkenntnis im Immunoassaytest dieser Erfindung durch DNA-Sequenzieren in einem kleinen Bruchteil der Zeit bestätigt werden, der notwendig wäre, wenn DNA-Tests alleine verwendet werden würden. Somit können die Immunoassays dieser Erfindung als ergänzender „Prätest" bzw. „Vorlest" nützlich werden. Diese Erfindung kann ebenfalls molekulargenetische Tests in der Diagnose befallener Mitglieder bekannter Verwandter unterstützen, bei denen die Mutation bereits identifiziert wurde.
  • Wie oben angezeigt, sind unbekannte Mutationen sehr schwer durch molekulargenetische Tests nachzuweisen. Unbekannte Mutationen sind solche, die in Probanden, isolierten Fällen und Verwandten, die noch nicht untersucht wurden, zu finden sind. Die Keimbahnmutationen in solchen Populationen, die hauptsächlich Einbasenpaarveränderungen, kleine Insertionen und kleine Deletionen einschließen, können über einen langen Anteil eines Gens verteilt werden und können irgendeinen von mehreren möglichen Loci bzw. Orten einschließen. Überdies macht die umfangreiche Größe der codierenden Region eine Identifizierung von Mutationen durch Gensequenzierung sehr schwierig, arbeitsintensiv und kostenintensiv. Deswegen wurden andere Techniken entwickelt und werden zum Nachweis des Vorhandenseins von DNA-Variationen und Mutationen verwendet. Solche Techniken schließen eine Denaturierungsgradientengelelektrophorese (denaturation gradient gel electrophoresis (DGGE)), Einstrangkonformationspolymorphismus (single strand conformation polymorphism (SSCP)) Analyse und RNAse-Schutzanalyse ein. Jedoch weist jeder dieser Ansätze ebenfalls Nachteile und/oder Beschränkungen auf, insbesondere bei der Sensitivität bzw. Empfindlichkeit. Beispielsweise ist die Sensitivität solcher Techniken zum Nachweis von APC-Mutationen in FAP-Patienten lediglich 30 bis 70%, abhängig vom verwendeten Verfahren. Neuere Techniken wurden entwickelt, um Mutationen durch Untersuchen von Translationsprodukten nachzuweisen, die in vitro synthetisiert wurden, weisen jedoch nur eine geringfügig bessere Sensitivität auf.
  • Die meisten molekulargenetischen Ansätze, die oben diskutiert wurden, wurden entwickelt, um Einbasenpaarveränderungen, kleine Insertionen und kleine Deletionen und/oder Mutationen nachzuweisen, die zum Abbruch bzw. zur Termination der Translation führen. Jedoch kann in einigen Fällen die Deletion des gesamten Gens in der Keimbahn von Patienten eintreten. Dies ist ein noch weiterer Nachteil früherer Verfahren, weil Deletionen des gesamten Gens von molekulargenetischen Ansätzen verfehlt werden. Darüber hinaus können einige Patienten Promotor- oder Spleißmutationen aufweisen, die zu reduzierten Konzentrationen normaler Transkripte führen, das heißt Mutationen, die sich außerhalb der codierenden Region befinden, die durch die meisten Molekularverfahren analysiert werden. Im Gegensatz hierzu können die Immunoassayverfahren dieser Erfindung durch Nachweis der Konzentration an Wildtypprotein eine größere Sensitivität als die molekulargenetischen Ansätze aufweisen, weil sie dazu in der Lage sind, zusätzlich zu Standardmutationen die Mutationen nachzuweisen, die einen Allelverlust einschließen und Mutationen in den Promotor-, Enhancer- und Spleißortregionen.
  • Ein weiterer Nachteil gegenwärtiger molekulargenetischer Techniken besteht darin, dass die Technologie der Molekulargenetik in den meisten Pathologielaboratorien nicht etabliert ist. Ebenfalls können die Ergebnisse molekulargenetischer Assays oftmals nicht schnell, beispielsweise vor einem chirurgischen Eingriff, gewonnen werden. Obwohl molekulargenetische Tests mit Krebsgewebeproben durchgeführt werden können, kann die Frage, ob die Mutation in den Krebszellen erworben oder Keimbahn-bezogen ist, nicht beantwortet werden.
  • Beispielsweise besteht ein Ansatz, der gegenwärtig untersucht wird, im Nachweis einer Mikrosatelliteninstabilität (das heißt Mutationen in repetitiven bzw. sich wiederholenden DNA-Sequenzen) in Tumorproben, eher im Nachweis spezieller MMR-Mutationen [Dietmaier et al., "Diagnostic microsatellite instability: Definition and correlation with mismatch repair protein expression", Cancer Res., 57: 4749–4756 (1997)]. Der Mikrosatellitenansatz schließt molekularbiologische Techniken (PCR- oder Southern Blot-Analyse) ein, um nach genetischen Veränderungen in einer Reihe unterschiedlicher genetischer Orte (üblicherweise fünf oder mehr Gene werden gleichzeitig bezüglich einer Mikrosatelliteninstabilität untersucht) zu screenen. Der Mikrosatellitenansatz wird ziemlich leicht durch einen Molekulargenetiker durchgeführt und das Ziel besteht darin, zu identifizieren, welche Polypen sich aus einer MMR-Mutation ergaben. Jedoch unterscheidet dieser Ansatz nicht zwischen erworbenen und Keimbahn-MMR-Mutationen und stellt keine Information bereit, die nachweist, welches der fünf bekannten MMR-Gene mutiert ist.
  • Das vorliegende Immunoassayverfahren kann im Gegensatz hierzu in jedem Pathologielabor durchgeführt werden und kann so entwickelt werden, dass es kosteneffektiv ist, um große Mengen an Individuen in einer kurzen Zeitspanne zu screenen. Die Assays können rasch durchgeführt werden und die Ergebnisse sind sofort erzielbar. Wenn einmal eine Veränderung im Produkt eines speziellen Gens durch die Immunoassayverfahren der Erfindung identifiziert ist, können molekulargenetische Tests darauf verwendet werden, den präzisen Ort der Mutation zu bestimmen.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Immunoassayverfahren dieser Erfindung können so eingerichtet werden, dass eine Krankheit oder Krankheitsanfälligkeitsmerkmale in Pflanzen, Viren, Tieren, Pilzen und Mitglieder des Reichs der Prokaryonten und Protoctista, beispielsweise Bakterien und Protozoen, nachgewiesen werden. Vorzugsweise werden die Immunoassayverfahren dieser Erfindung zum Nachweis einer Krankheit oder einer Krankheitsanfälligkeit bei Vertebraten bzw. Wirbeltieren angewendet, besonders bevorzugt bei Säugetieren und noch mehr bevorzugt bei Menschen.
  • Die Immunoassayverfahren dieser Erfindung basieren auf der Theorie, dass normale Individuen, das heißt solche ohne Mutation in einem Subjektgen, eine 100%ige Expression dieses Wildtypsubjektgenproduktes aufweisen und ebenfalls 100% Expression eines Wildtypreferenzgenproduktes. Im Gegensatz hierzu weist ein Individuum mit einer Mutation in einem Allel des selben Genes theoretisch eine nur 50%ige Expression des Wildtypsubjektgenprodukts auf, während eine 100%ige Expression des Referenzwildtypgenproduktes aufrecht erhalten wird.
  • Gemäß einem Aspekt weisen die Immunoassayverfahren dieser Erfindung eine Krankheit oder eine Krankheitsanfälligkeit nach, die mit einer Keimbahnmutation in einem oder beiden Allelen eines Subjektgenes in Verbindung steht. Die Immunoassayverfahren dieser Erfindung beruhen ebenfalls in diesem Aspekt auf der Annahme, dass die Keimbahnmutationen in zwei unterschiedlichen Genen eines Individuums sehr selten sind.
  • Repräsentative Immunoassays dieser Erfindung sind solche zum Nachweis der Anfälligkeit gegenüber HNPCC und FAP in Menschen. Im Falle des Screenings nach dem HNPCC-Anfälligkeitsmerkmal werden die Mengen an MLH1 und MSH2 Wildtyproteinen (die Expressi onsprodukte der beiden Haupt-MMR-Gene) aus einer Probe eines Individuums gemessen, beispielsweise aus frisch präparierten Lymphozyten. Beinahe alle Individuen mit einer Keimbahn-MMR-Mutation weisen 100% eines dieser beiden MMR-Proteine in voller Länge auf, jedoch nur 50% des anderen Proteins in voller Länge.
  • Nach Anwendung dieser Verfahren auf (a) eine normale Population und (b) eine Population verifizierter HNPCC-Fälle ermöglichen die Immunoassayverfahren dieser Erfindung die Einstellung von Kriterien, die es ermöglichen, zwischen normalen und abnormalen Konzentrationen bzw. Niveaus der Expression bzw. Expressionsstärken von MMR-Proteinen in voller Länge zu unterscheiden. Diese Verfahren beruhen auf dem Verhältnis der Expressionsstärke des Wildtypsubjektgenprodukts von Interesse und derjenigen eines Referenzgenprodukts und der Berechnung eines Verhältnisses von einem zum anderen. Beispielsweise kann im Falle von MMR-Mutationen das Verhältnis der Menge an MSH2-Protein zur Menge an MLH1-Protein verwendet werden. Es wird dann bestimmt, ob der numerische Wert des Verhältnisses in klarer Weise in einem normalen Bereich oder in klarer Weise in einen Bereich fällt, der für einen 50%igen Verlust der Expression des Subjektgenprodukts vorausgesagt wurde, beispielsweise einen 50%igen Expressionsverlust entweder des MSH2- oder MLH1-Proteins, wenn HNPCC gescreent wird.
  • Eine weitere empfohlene Zielpopulation für die Immunoassayverfahren dieser Erfindung sind Patienten, bei denen erkannt wurde, dass sie CRC aufweisen (10% der CRC-Patienten tragen per Vorhersage MMR-Mutationen). Wenn es sich herausgestellt hat, dass ein CRC-Patient Träger einer MMR-Mutation ist, wäre es empfehlenswert, Blutsverwandte des Patienten (beispielsweise des Probanden) zu ermutigen, ein Screening nach Polypen und/oder CRC-verwandten Krebsarten durchzuführen, weil solche Verwandten einem höheren Risiko für CRC unterliegen (ein Proband ist das erste Mitglied der Familie, das beweiskräftig als Träger eines genetischen Merkmals identifiziert wurde, wie beispielsweise des HNPCC-Merkmals).
  • Gemäß einem Aspekt sind die Immunoassays dieser Erfindung so entwickelt, dass Träger von erblichen Merkmalen identifiziert werden, die mit einer Krankheit verbunden sind, wie beispielsweise die erblichen HNPCC- und FAP-Merkmale. Die Ablesung des Assays, das heißt die Konzentrationen an Wildtypprotein, korrelieren mit dem Genotyp. Auf diese Weise unterscheiden die Assays zwischen Zellen, die für ein Wildtyp-Allel homozygot sind und solche, die für ein Wildtyp-Allel heterozygot sind, und unterscheiden somit zwischen Individuen mit und ohne einem erblichen Merkmal. Diese Erfindung geht auf eines der Probleme der nicht adäquaten Behandlung von CRC ein, in dem eine verbesserte und frühere Diagnose der üblichsten Form von erblichem Darmkrebs, nämlich HNPCC, bereitgestellt wird, eine Störung, die 10% der Patienten betrifft, bei denen CRC diagnostiziert wurde.
  • Die Immunoassays dieser Erfindung können zur Messung von (Wildtyp)Proteinen in voller Länge eingestellt werden, die mit vielen anderen erblichen und genetischen Störungen (Krebs und Nicht-Krebs) verbunden sind, die auf Mutationen zurückzuführen sind, die auf eine Proteintrunkierung bzw. -verkürzung (Keimbahn und erworben) zurückzuführen sind oder die Abwesenheit einer Allelproteinexpression verursachen. Repräsentative Gene, die Gegenstand von Trunkierung-verursachenden Mutationen und/oder Allelverlust sind und die mit Mutationen in solchen Genen assoziierten Krankheiten, sind wie folgt aufgelistet:
    APC – CRC- und GI-Krebsarten
    ATM – Ataxie-Telangiektasie; Hämangioblastom; Nierenzellcarcinom; Phäochromocytom
    BRCA1 – Brustkrebs
    BRCA2 – Brustkrebs
    CFTR – zystische Fibrose
    c-myb – hämatologische Malignitäten
    Dystrophin – Duchenne-Muskeldystrophie (DMD)
    E-Cadherin (HSECAD) – Brustkrebs und Darmkrebs
    EMD – Emery-Dreifuss-Muskeldystrophie
    FAA – Fanconi-Anämie
    IDS – Hunter-Syndrom
    MLH1 – CRC-, GI-, GU- und GYN-Krebsarten
    MSH2 – CRC-, GI-, GU- und GYN-Krebsarten
    NF1 – Neurofibromatose Typ 1
    NF2 – Neurofibromatose Typ 2
    p16 (CDKN2A und MTS1) – familiäres Melanom
    PKD1 und PKD2 – polyzystische Nierenerkrankung
    PTCH – Nävoidbasalzell-Carcinom
    VHL – von Hippel-Lindau-Krankheit
  • Hierin sind repräsentative Assays zum Nachweis von Mutationen im APC-Gen und in den MMR-Genen beschrieben. Jedoch kann der Fachmann auf dem Gebiet solche Assays leicht einstellen, um analoge Mutationen in anderen Genen nachzuweisen, wie oben aufgelistet, wobei solche Mutationen bekannterweise mit einer Krankheit oder einer Krankheitsanfälligkeit in Verbindung stehen (siehe „Immunoassays für andere Proteine in voller Länge", unten).
  • In einem Sinne können die Verfahren dieser Erfindung dazu verwendet werden, nach einer abnormal niedrigen Konzentration eines als Ziel definierten Wildtypproteins oder auf das Fehlen eines als Ziel definierten Wildtypproteins in einer biologischen Probe, verwendet werden. Die Konzentration des als Ziel definierten Wildtypproteins kann durch Berechnen des Verhältnisses der Menge des Wildtypproteins zur Menge eines Referenzproteins in einer biologischen Probe bestimmt werden und durch Bestimmen, ob dieses Verhältnis normal oder im Vergleich zu analogen normalen Verhältnissen, die in Populationsstudien von nicht befallenen Individuen berechnet wurden, abnormal ist. Das Referenzprotein kann mit der Krankheit oder dem Krankheitsanfälligkeitsmerkmal, auf das der Assay gerichtet ist, nicht verwandt sein oder es kann das Expressionsprodukt eines anderen Subjektgens sein, das ebenfalls mit der Krankheit oder der Krankheitsanfälligkeit in Verbindung steht, auf das der Assay gerichtet ist. In der letzteren Ausführungsform könnte der Assay als Form einer differentiellen Diagnose/Prognose charakterisiert sein, wodurch in einem Assay bestimmt wird, welche von mehreren Genen durch eine Krankheits-assoziierte Mutation betroffen ist. Beispielhaft hierfür ist das Assayverfahren, das hierin speziell beschrieben ist, worin MLH1 und MSH2 die Subjektgene sind und die Anfälligkeit gegenüber HNPCC das Merkmal ist, auf das der Assay gerichtet ist.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform sind die Immunassayverfahren dieser Erfindung zum Nachweis einer Krankheit oder eines Krankheitsanfälligkeitsmerkmals in einem Organismus vorgesehen, wobei die Krankheit oder das Krankheitsanfälligkeitsmerkmal mit einer Mutation oder Mutationen in einem Subjektgen in Verbindung steht und die folgendes umfassen:
    • (a) Isolieren einer biologischen Probe aus dem Subjektorganismus;
    • (b) immunologisches Quantifizieren der Menge an Wildtypprotein, das durch das Subjektgen in der Probe exprimiert wird und der Menge eines Referenzproteins, das durch ein zweites Gen der Probe exprimiert wird;
    • (c) Berechnen des Verhältnisses der Menge des Wildtypproteins, das durch das Subjektgen in der Probe exprimiert wird, zur Menge des durch das zweite Gen in der Probe exprimierten Referenzproteins;
    • (d) Bestimmen, ob oder ob nicht von dem Subjektgen exprimiertes Wildtypprotein in der Probe vorliegt oder ob das berechnete Verhältnis eine abnormal niedrige Konzentration des Wildtypproteins, exprimiert durch das Subjektgen in der Probe, widerspiegelt; und
    • (e) Folgern, dass, wenn kein Wildtypprotein in der Probe vorliegt, das Subjektgen eine Mutation in jedem seiner Allele enthält oder dass, wenn das Verhältnis, das in Schritt (c) berechnet wurde, anzeigt, dass eine abnormal niedrige Konzentration an Wildtypprotein in dieser Probe vorliegt, dieses Subjektgen eine Mutation in einem seiner Allele enthält und dass, wenn beides der Fall ist, der Subjektorganismus von der Krankheit oder dem Krankheitsanfälligkeitsmerkmal befallen ist, das mit der Mutation oder den Mutationen in Verbindung steht. Ein bevorzugtes beispielhaftes Referenzprotein in einer solchen Ausführungsform ist Actin, Tubulin oder Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase.
  • Schritt (d) dieser Ausführungsform des Immunassayverfahrens dieser Erfindung kann einen Vergleich des Verhältnisses umfassen, der in Schritt (c) berechnet wurde, mit einem Durchschnittswert von Verhältnissen von Mengen des Wildtypproteins, das aus dem Subjektgen exprimiert wurde, mit Mengen des Referenzproteins in vergleichbaren biologischen Proben aus Organismen der selben taxonomischen Klassifikation, wie dem Subjektorganismus, die von dieser Krankheit oder von diesem Krankheitsanfälligkeitsmerkmal nicht betroffen sind.
  • Wie oben angezeigt, würde die erwartete Reduktion der zellulären Konzentrationen Protein in voller Länge im Falle einer Trunkierung-verursachenden Mutation oder einer Mutation, die einen Allelverlust verursacht, eine 50%ige Reduktion in der Menge des Proteins in voller Länge sein, das als ein Subjektgen exprimiert wird. Wenn beide Allele von einer solchen Mutation beeinträchtigt sind, würde man eine 100%ige Reduktion vom Normalen bezüglich der Expression des Proteins in voller Länge erwarten. Jedoch könnten aufgrund der biologischen Variabilität eine Reduktion des Expression der Proteins in voller Länge von Normal (von einer einzelnen Allelmutation) als positives Resultat betrachtet werden, gemäß einer Schwellenkonzentration, die statistisch aus dem Bereich normaler Werte in krankheitsfreien Individuen aus der allgemeinen Population bestimmt wird. Wenn das verbleibende Allel eines Subjekts ebenfalls mutiert wird, wie es im Falle von Krebs oftmals der Fall ist, fällt die erwartete Ablesung der Erfindung von 50% auf 0%. Die Variabilität solcher theoretischer Basislinien für positive Resultate könnte ±20% sein, vorzugsweise ±15%, besonders bevorzugt ±10%.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform können die Immunoassayverfahren dieser Erfindung eine Krankheit oder ein Krankheitsanfälligkeitsmerkmal in einem Organismus nachweisen, wobei die Krankheit oder das Krankheitsanfälligkeitsmerkmal mit einer Mutation oder Mutationen eines oder zweier von mehreren Subjektgenen in Verbindung steht, und umfasst folgendes:
    • (a) Isolieren einer biologischen Probe aus dem Organismus;
    • (b) immunologisches Quantifizieren der Menge an Wildtypprotein in der Probe, die von jedem der Subjektgene exprimiert wird;
    • (c) Berechnen des Verhältnisses der Menge des Wildtypproteins, das durch das Subjektgen in der Probe exprimiert wird, zur Menge an Wildtypprotein, die von dem anderen Subjektgen in der Probe exprimiert wurde oder zu jeder der Mengen an Wildtypprotein, die von jedem der anderen Subjektgene in der Probe exprimiert wird;
    • (d) Bestimmen, ob ein von jedem der Subjektgene oder von irgendeinem der Subjektgene exprimiertes Wildtypprotein in der Probe nicht vorliegt, oder ob das Verhältnis oder die Verhältnisse, die in Schritt (c) berechnet wurden, eine abnormal niedrige Konzentration an Wildtypprotein widerspiegelt, das von jedem der Subjektgene oder von irgendeinem der Subjektgene in der Probe exprimiert wird;
    • (e) Folgern, dass, wenn das Wildtypprotein bekanntermaßen von einem der Subjektgene normal exprimiert wird, nicht in der Probe vorhanden ist, das Subjektgen eine Mutation in jedem seiner Allele enthält oder dass, wenn das Verhältnis oder die Verhältnisse, die in Schritt (c) berechnet wurden, anzeigt, eine abnormal niedrige Konzentration eines Wildtypproteins vorliegt, das von einem der Subjektgene in der Probe exprimiert wird, Folgern, dass das Subjektgen eine Mutation in einem seiner Allele enthält; und, in jedem von beiden Fällen, Bestimmen, dass der Subjektorganismus von der Krankheit oder dem Krankheitsanfälligkeitsmerkmal beeinträchtigt ist, das mit der Mutation oder den Mutationen in Verbindung seht.
  • Schritt (d) dieser Ausführungsform kann einen Vergleich des Verhältnisses oder von Verhältnissen umfassen, die in Schritt (c) zum vergleichbaren Durchschnitt oder Mittelwerten von Verhältnissen berechnet wurde, die aus den Mengen von Wildtypproteinen berechnet wurden, exprimiert durch die Subjektgene in vergleichbaren biologischen Proben aus Organismen der selben taxonomischen Klassifikation, wie der Subjektorganismus, die von dieser Krankheit oder von diesem Krankheitsanfälligkeitsmerkmal nicht beeinträchtigt sind.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung Immunoassayverfahren zum Nachweis einer Krankheit oder eines Krankheitsanfälligkeitsmerkmals in einem Organismus, wobei die Krankheit oder das Krankheitsanfälligkeitsmerkmal mit einer Mutation oder Mutationen in einem Subjektgen in Verbindung steht, das folgendes umfasst:
    • (a) Isolieren einer Probe aus normalen Zellen aus dem Organismus;
    • (b) immunologisches Quantifizieren der Menge an Wildtypprotein, exprimiert durch das Subjektgen in der Probe;
    • (c) Bestimmen, ob irgendwelches Wildtypprotein in der Probe vorliegt, und wenn dies der Fall ist, ob die Menge des in der Probe vorliegenden Wildtypproteins im Vergleich zur Menge des Wildtypproteins, das durch das Subjektgen in einer Kontrollprobe exprimiert wird, abnormal niedrig ist; und
    • (d) falls das Wildtypprotein in der Probe nicht vorliegt, Folgern, dass das Subjektgen eine Mutation in jedem seiner Allele aufweist; oder, wenn die Menge des Wildtypproteins in der Probe als im Vergleich zur Menge des Wildtypproteins in der Kontrollprobe abnormal niedrig bestimmt wird, Folgern, dass das Subjektgen eine Mutation in einem Allel aufweist; und in jedem Fall von beiden bzw. in einem Fall von beiden, Korrelieren der Folgerung mit dem Subjektorganismus, der die Krankheit oder das Krankheitsanfälligkeitsmerkmal aufweist, das mit der Mutation oder den Mutationen in Verbindung steht. Die normalen Zellen sind vorzugsweise normale periphere Blutlymphozyten. Wenn die Assayergebnisse anzeigen, dass das Subjektgen eine Mutation in einem Allel aufweist, ist die abnormal niedrige Menge an Wildtypprotein im allgemeinen ungefähr 50% der Kontrollmenge, wobei die oben erwähnte Variabilität wirksam ist.
  • Die mit einer Krankheit oder einem Krankheitsanfälligkeitsmerkmal assoziierten Mutationen, die durch die Immunoassayverfahren dieser Erfindung nachgewiesen werden, können Keimbahn- oder somatische Mutationen sein, vorzugsweise Keimbahnmutationen. Solche Mutationen sind entweder Trunkierung-verursachende Mutationen oder solche, die einen Allelverlust verursachen. Beispielhafte Mutationen sind aus der Gruppe ausgewählt, die aus Non-Sense-Mutationen, Frameshift-Mutationen, Promotor-Mutationen, Enhancer-Mutationen, Spleißstellen-Mutationen, Null-Mutationen und Poly-A-Schwanz-Mutationen besteht.
  • Die Organismen, aus denen die biologischen Proben isoliert werden, können Viren, Pflanzen, Pilze, Tiere sein oder können aus anderen Mitgliedern des Reichs der Prokaryoten und der Protoktista stammen. Vorzugsweise sind diese Organismen Wirbeltiere, besonders bevorzugt Säugetiere und noch mehr bevorzugt Menschen.
  • Die durch die Immunoassayverfahren dieser Erfindung getesteten biologischen Proben schließen Gewebeproben, Körperflüssigkeiten (beispielsweise Blut, Serum, Plasma), Gewebeextrakte, Zellen, Zelllysate, Zellextrakte, Überstände aus normalen Zelllysaten, Überstände aus präneoplastischen Zelllysaten und Überstände aus neoplastischen Zelllysaten ein.
  • Bevorzugte biologische Proben sind Zellproben, Zellextrakte, Zelllysate, Überstände aus Zelllysaten, Gewebeproben und Gewebeextrakte. Weiterhin bevorzugt sind normale Zellproben, normale Zellextrakte, Lysate von normalen Zellen und Überstände aus normalen Zelllysaten. Besonders bevorzugt sind Proben aus peripheren Blutlymphozyten (PBLs), Lysaten aus PBLs, Überständen aus Lysaten von PBLs und Extrakten von PBLs.
  • Beispielhafte Proben von Körperflüssigkeiten können unter anderem folgende Flüssigkeiten einschließen: Blut, Serum, Plasma, Samen, Brustexudat, Magensekrete, fäkale Suspensionen, Galle, Speichel, Tränen, Sputum, Schleim, Urin, Lymphflüssigkeit, Cytosol, Aszites, Pleuraleffusionen, Amnionflüssigkeit, Blasenwaschungen, bronchoalveolare Spülungen und zerebrospinale Flüssigkeit. Wenn eine Körperflüssigkeit die durch ein Verfahren dieser Erfindung getestete Probe ist, wird bevorzugt, dass das eine oder die mehreren als Ziel definierten Wildtypgenprodukte in voller Länge und, falls relevant, das Referenzprotein, aus einem größeren Volumen einer Körperflüssigkeit konzentriert werden, bevor sie durch immunologische Mittel quantifiziert werden, wie beispielsweise durch Western Blot, Durchflusszytometrie oder Sandwich-Immunoassay.
  • Die Verfahren dieser Erfindung sind zur Automatisierung geeignet. Die oben ausgeführten Assays können in automatisierten Formaten ausgeführt werden. Bevorzugte automatisierte Immunoassaysysteme, an die die Verfahren dieser Erfindung angepasst werden können, sind solche unter Verwendung einer Chemilumineszenz und magnetischen Auftrennung.
  • Abkürzungen
  • Die folgenden Abkürzungen werden hierin verwendet:
    AFAP – attenuierte familiäre adenomatöse Polyposis
    APC – adenomatöse Polyposis coli
    ATCC – American Type Culture Collection
    ATM – Ataxie-Telangiektasie
    BL – Biolumineszenz
    CL – Chemilumineszenz
    CRC – kolorektaler Krebs
    DGGE – Denaturierungsgradientengelelektrophorese
    DMEM – Dulbecco's modified Eagle medium
    DTT – Dithiothreitol
    EDTA – Ethylendiamintetraessigsäure
    EGTA – [Ethylenbis(oxyethylennitrilo)]tetraessigsäure
    EIA – Enzymimmunassay
    ELISA – Enzym-gebundener Immunsorbentassay
    FAP – familiäre adenomatöse Polyposis
    FBS – fötales Rinderserum
    FITC – Fluoreszeinisothiocyanat
    GAPDH – Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase
    GI – gastrointestinal
    GU – genitourinal
    GYN – gynäkologisch
    HNPCC – erblicher Nicht-Polyposisdarmkrebs
    kDA – Kilodalton
    MAb – monoklonaler Antikörper
    MCR – Mutationsclusterregion
    MMR – Mismatch-Repair
    MW – Molekulargewicht bzw. Molekülmasse
    PBL – peripherer Blutlymphozyt
    PBS – Phosphat-gepufferte Salzlösung
    PCR – Polymerasekettenreaktion
    PE – Phycoerythrin
    PMP – paramagnetisches Partikel
    PMSF – Phenylmethylsulfonylfluorid
    PPV – positiv prädiktiver Wert
    PTT – Proteintrunkierungstest
    Rb – Retinoblastom
    RBC – rote Blutzelle
    RIA – Radioimmunassay
    RIPA – Radioimmunpräzipitationsassay
    RT – Raumtemperatur
    SDS – Natriumdodecylsulfat
    SDS-PAGE – Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese
    SSCP – einsträngige Konformationspolymorphismusanalyse
    TGFBR2 – transformierender Wachstumsfaktor, beta-Rezeptor 2
    WBC – weiße Blutzelle
    w/v – Gewicht pro Volumen
  • Ausführliche Beschreibung
  • Die Assays dieser Erfindung sind hoch empfindlich, spezifisch, leicht, schnell (24 h pro Umsatz), preiswert und an automatisierte Technologien anpassbar. Diese Erfindung stellt Assays bereit, die für Erbkrankheiten diagnostisch/prognostisch sind, die mit einer Mutation eines Subjektgens in Verbindung stehen, die letztendlich eine Abnahme der zellulären Konzentration eines Wildtypproduktes dieses Gens zur Folge hat. Die Immunassayverfahren stellen einen Assay nach Proteinen in voller Länge bereit, die durch Gene von Interesse codiert sind. Beispielhaft sind die Immunassays der Erfindung, die dazu verwendet werden, Veränderungen in der zellulären Kon zentration des Proteinprodukts des APC-Gens nachzuweisen, das mit FAP in Verbindung steht, und des MMR-Gens, das mit HNPCC in Verbindung steht.
  • Individuen, die eine erbliche Mutation tragen, die mit einem Merkmal in Verbindung steht, weisen erwarteterweise eine reduzierte Gendosis des Wildtyp-Allels für dieses prädisponierende Merkmal auf. Die unten dargestellten Beispiele zeigen, dass die Assays dieser Erfindung Variationen bzw. Schwankungen in der Genproduktexpression nachweisen können, die mit der Gendosis korrelieren. Die Experimente, die hierin beschrieben sind, etablieren das Vermögen von Immunassays, beispielsweise eine Western Blot-Analyse, die zellulären Expressionsstärken bzw. -konzentrationen von Zielgenproteinen nachzuweisen und zu quantifizieren, wie beispielsweise der MMR- und APC-Proteine, und zu zeigen, dass solch eine Konzentration mit der Wildtypgendosis des Subjektgens korreliert.
  • Der Begriff „Gen", wie hierin definiert, soll eine Nukleotidsequenz bedeuten, die eine vollständig codierende Sequenz für ein Proteinprodukt enthält. Allgemein schließt ein „Gen" Nukleotidsequenzen ein, die stromaufwärts (beispielsweise Promotorsequenzen, Enhancer, etc.) oder stromabwärts (beispielsweise Transkriptionsterminationssignale, Polyadenylierungsstellen, etc.) der codierenden Sequenzen einschließen, die die Expression des codierten Proteins beeinflussen. Der Begriff „Allel" ist eine Kurzform von Allelomorph, einer Reihe möglicher alternativer Formen eines gegebenen Gens, die sich in ihrer DNA-Sequenz unterscheiden und die Funktion eines einzelnen Produktes beeinflussen (RNA und/oder Protein).
  • Die Assays dieser Erfindung sind diagnostisch und/oder prognostisch (vorhersagend), das heißt diagnostisch/prognostisch. Der Begriff „diagnostisch/prognostisch" ist hierin definiert, so dass er die folgenden Verfahren entweder individuell oder kumulativ umfasst, abhängig vom klinischen Kontext: Die Bestimmung der Prädisposition gegenüber einer Krankheit, die Bestimmung der Art einer Erkrankung, die Unterscheidung einer Krankheit von einer anderen, die Vorhersage bezüglich des vermeintlichen Outcomes eines Krankheitszustands, der Bestimmung der Erwartung der Genesung von einer Krankheit, wie sie durch die Art und Symptome eines Falles angezeigt werden, die Überwachung des Krankheitsstatus eines Patienten, die Überwachung eines Patienten bezüglich des Wiederauftretens einer Krankheit und/oder der Bestimmung des bevorzugten therapeutischen Plans für einen Patienten. Die diagnostischen/prognostischen Verfahren dieser Erfindung sind beispielsweise zum Screenen von Populationen auf das Vorhandensein einer neoplastischen oder präneoplastischen Krankheit von Nutzen, bei der Bestimmung des Risikos der Entwicklung einer neoplastischen Krankheit, bei der Diagnose des Vorhandenseins einer neoplastischen und/oder präneoplastischen Krankheit, bei der Überwachung des Krankheitszustands von Patienten, die eine neoplastische Krankheit aufweisen, und/oder bei der Bestimmung der Prognose für den Verlauf einer neoplastischen Krankheit.
  • Irgendwelche konventionellen Immunassayformate können so angepasst werden, dass das Zielgenprotein oder Proteine oder das Zielgenprotein und ein oder mehrere Referenzproteine gemäß dieser Erfindung nachgewiesen und quantifiziert werden (zumindest halbquantitativ). Solche Formate schließen Western Blots, vorzugsweise immunpräzipitierte Proteine, ELISAs, RIAs, kompetetive EIAs und duale Antkörper-Sandwichassays ein, unter anderen Assays, die üblicherweise in der diagnostischen Industrie verwendet werden. Western Blots von immunpräzipitierten Proteinen und Sandwichimmunassays sind bevorzugt und Sandwichimmunassays sind besonders bevorzugt.
  • Besonders bevorzugte Sandwichimmunassays sind solche, die entweder Fluoreszenz-markiert, Enzym-gebunden oder Chemilumineszenz-gebunden sind. Automatisierte Immunassays, wie hierin beschrieben, sind ebenfalls bevorzugt.
  • Repräsentativ für einen Typ eines ELISA-Tests ist ein Format, bei dem eine Mikrotiterplatte mit Antikörpern beschichtet wird, die gegen ein Protein in voller Länge hergestellt wurde, exprimiert durch ein Subjektgen oder gegen den Amino- oder Carboxylterminus hiervon. Hierzu wird eine Patientenprobe, beispielsweise ein Gewebe- oder Zellextrakt oder Zelllysat zugesetzt. Nach einer Inkubationsperiode, die eine Proteinbindung an die Antikörper ermöglicht, wird die Platte gewaschen und ein weiterer Satz relevanter Antikörper, die markiert sind, beispielsweise gebunden an ein Enzym, wird zugesetzt, inkubiert, um eine Reaktion stattfinden zu lassen und die Platte wird dann erneut gewaschen. Danach wird beispielsweise ein Enzymsubstrat der Mikrotiterplatte zugesetzt und für eine Zeitspanne inkubiert, die es dem Enzym ermöglicht, am Substrat zu arbeiten und die Extinktion bzw. Absorption des Endpräparats wird gemessen. Die Veränderung der Extinktion ist zur Menge des gegenständlichen Proteins in voller Länge in der Probe proportional.
  • Ein beispielhaftes Immunassayverfahren dieser Erfindung zum Nachweisen und Quantifizieren eines Wildtyptargetgenprodukts und eines Referenzproteins in einer Wirbeltierprobe umfasst die folgenden Schritte:
    • (a) Inkubieren der Wirbeltierprobe mit zwei Reihen von Antkörpern, einer Reihe, die an das Wildtyptargetgenprodukt bindet und die andere Reihe, die an das Referenzprotein bindet, wobei jede Reihe von Antkörpern markiert ist oder in anderer Weise von der anderen Reihe unterscheidbar nachweisbar ist;
    • (b) Überprüfen der inkubierten Probe zur Bestimmung der Menge an Immunkomplexen, die das Wildtyptargetgenprodukt umfasst und die Menge an Immunkomplexen, die das Referenzprotein umfassen und Berechnen des Verhältnisses dieser beiden Mengen.
  • Ein weiteres beispielhaftes Immunassayverfahren gemäß der Erfindung ist dasjenige, bei dem ein Konkurrenzimmunassay zum Nachweisen und Quantifizieren eines Wildtypzielgenprodukts und eines Referenzproteins in einer Wirbeltierprobe verwendet wird, um zu bestimmen, ob eine Mutation im Zielgen vorliegt, umfassend die Schritte:
    • a) Inkubieren einer Wirbeltierprobe mit zwei Reihen von Antikörpern, wobei jede Reihe gegenüber einem Wildtypzielgenprodukt oder gegenüber einem Referenzprotein spezifisch ist, und einer bestimmten Menge eines markierten (einschließlich anderer Visualisierungsmittel) Wildtypzielgenproduktes und einer bestimmten Menge des markierten Referenzproteins, wobei das markierte Genprodukt und das markierte Referenzprotein unterschiedlich markiert sind und um die Bindung an den jeweiligen Antikörper mit dem Wildtypzielgenprodukt und einem Referenzprotein, die in der Probe vorliegen, konkurrieren;
    • b) Überprüfen der inkubierten Probe, um die Menge an markiertem Wildtypgenprodukt oder Referenzprotein, das an die Antikörper gebunden ist, zu bestimmen; und
    • c) Bestimmen aus den Ergebnissen der Überprüfung in Schritt b) der Menge an Zielgenprodukt und Referenzprotein, die in der Probe vorliegt, Berechnen des Verhältnisses hiervon und Bestimmen, ob eine reduzierte Menge des Zielproteins in voller Länge der Probe vorliegt, dass eine Mutation im Zielgen vorliegt.
  • Wenn einmal Antikörper (einschließlich biologisch aktiver Antikörperfragmente) mit einer geeigneten Spezifität erzeugt wurden, ist eine breite Vielzahl immunologischer Assayverfahren zur Bestimmung der Bildung spezifischer Antikörper-Antigenkomplexe verfügbar. Zahlreiche kompetitive und nicht-kompetitive Proteinbindungsassays wurden in der wissenschaftlichen Literatur und in der Patentliteratur beschrieben und eine große Anzahl solcher Assays sind im Handel erhältlich. Beispielhafte Immunassays, die zum Nachweisen eines Antigens geeignet sind, schließen solche ein, die in den US-Patenten Nr. 5,686,258; 5,695,928; 5,770,457; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074 und 4,098,876 beschrieben sind.
  • Antikörper, die in Assays verwendet werden, können markiert oder unmarkiert sein. Unmarkierte Antikörper können in der Agglutination verwendet werden; markierte Antikörper können in einer breiten Vielzahl von Assays verwendet werden, die eine breite Vielzahl von Markierungen verwenden.
  • Geeignete Nachweismittel schließen die Verwendung von Markierungen ein, beispielsweise von Radionukliden, Enzymen, Coenzymen, Fluoreszern bzw. fluoreszierenden Stoffen, Chemilumineszern bzw. chemilumineszierenden Stoffen, Chromogenen, Enzymsubstraten oder Cofaktoren, Enzymhemmern, freien Radikalen, Teilchen, Farbstoffen und dergleichen. Solche markierten Reagenzien können in einer Vielzahl von wohlbekannten Assays, beispielsweise Radioimmunassays, Enzymimmunassays, beispielsweise ELISA, Fluoreszenzimmunassays und dergleichen verwendet werden. Siehe beispielsweise US-Patent Nr. 3,766,162; 3,791,932; 3,817,837 und 4,233,402.
  • Immunassaytestkits
  • Die oben dargestellten Assays können in Testkits zum Nachweisen und Quantifizieren eines Wildtypzielgenprodukts oder von Produkten verkörpert sein oder eines Zielgenprodukts und eines Referenzproteins. Solche Kits zum Nachweisen und Quantifizieren relevanter Wildtypgenprodukte und/oder Referenzproteine können das Genprodukt (die Genprodukte) oder Referenzprotein(e) von Interesse und Antikörper umfassen, die polyklonal und/oder monoklonal sind und gegenüber solchen Wildtypgenprodukten oder Referenzproteinen spezifisch sind. Solche diagnostischen/prognostischen Testkits können ein oder mehrere Sets bzw. Reihen von Antikörpern, polyklonal und/oder monoklonal, für ein Sandwichformat umfassen, wobei die Antikörper Epitope auf den Proteinen in voller Länge erkennen und eine Reihe geeigneterweise markiert oder in anderer Weise nachweisbar ist für jedes Genprodukt oder Referenzprotein von Interesse.
  • Ein Kit zur Verwendung in einem Enzymimmunassay schließt typischerweise einen Enzymgebundenen Antikörper und ein Substrat für das Enzym ein. Das Enzym kann beispielsweise an entweder einen Antikörper gebunden sein, das für ein Protein von Interesse spezifisch ist, oder an einen Antikörper gegen einen solchen spezifischen Antikörper.
  • Assays für kolorektalen Krebs
  • Verbesserte und Frühdiagnose von kolorektalem Krebs (CRC) ist von Nöten. Es existieren ungefähr 140.000 neue Fälle von Darmkrebs, die jedes Jahr in den USA diagnostiziert werden und noch viel mehr in anderen Ländern der Welt. Eine beträchtliche Anzahl dieser Fälle (ungefähr 10%) weist einen erblichen Typ von Darmkrebs auf, wie beispielsweise erbliche Non-Polyposisdarmkrebs (HNPCC) oder familiäre adenomatöse Polyposis (FAP). Die Diagnose solcher erblichen Formen von Darmkrebs würde in vielen Fällen dem Arzt nahelegen, einen umfassenderen chirurgischen Eingriff durchzuführen und/oder dass eine Indikation für eine chirurgische adjuvante Chemotherapie unterschiedlich sein kann und/oder dass Mitglieder der Familie des Patienten gescreent werden sollten. Bis jetzt ist dem Erfinder jedoch kein praktischer Test zur Identifizierung solche Individuen mit einer erblichen Form von Darmkrebs bekannt. Somit sollte die Entwicklung eines Tests für erblichen Darmkrebs, der einfach ist, weithin verfügbar ist, schnell ist und preiswert ist, für den behandelnden Arzt klinisch wertvoll sein.
  • Eine Betonung des Werts der frühen Diagnose prämaligner darmbezogener Läsionen bzw. Erkrankungen ist eine kürzlich Studie, die zeigte, dass eine beträchtliche und signifikante Reduktion der Morbidität und Mortalität durch Identifizieren von HNPCC in einem Individuum und in Familien erreicht werden kann und dann rigorose klinische Follow-Ups durchgeführt werden (beispielsweise regelmäßige Darmspiegelungsüberprüfungen für adenomatöse Polypen). [Jarvinen, H. J., Mecklin, J. P., Sistonen, P., Screening reduces colorectal cancer rate in families with hereditary nonpolyposis colorectal cancer", Gasterontology, 108: 1405–1411 (1995)].
  • Häufigkeit
  • Die Häufigkeit von Keimbahnmutationen, die ein Mismatch-Reparaturgen (verantwortlich für HNPCC) einschließt, ist ungefähr 1 in allen 200 bis 300 Individuen in einer westlichen Population. Weil eine zumindest 90%ige Penetranz bzw. Durchdringung mit Keimbahn-MMR-Mutationen (das heißt HNPCC-Patienten) in Verbindung steht, werden beinahe alle Träger während ihrer Lebenszeit Krebs entwickeln. Weil in der westlichen Welt über 1 Milliarde Menschen (USA und Europa) leben, werden über 5 Millionen nach Vorhersage Keimbahn-MMR-Mutationen aufweisen. Es ist wichtig, solche MMR-Mutationen zu identifizieren, bevor die Träger Krebs entwickeln.
  • Von den mehr als 1 Milliarde Menschen, die in der westlichen Welt leben, werden ungefähr 50% (1 von 2) kolorektale adenomatöse Polypen entwickeln (hierin zur Vereinfachung als „Polypen" bezeichnet), bis sie das Alter von 70 Jahren erreichen [Ransohoff and Lang, N. Engl. J. Med., 325: 37 (1991)]. Die Lebenszeitwahrscheinlichkeit zur Entwicklung von CRC in der westlichen Welt ist ungefähr 10fach kleiner oder 1 pro 20.
  • Die American Cancer Society empfiehlt, dass alle Individuen über 50 nach Polypen gescreent werden. Die Ziele eines solchen Screenings sind (1) die Früherkennung von CRC in einem behandelbaren Stadium (im Allgemeinen durch chirurgischen Eingriff); und (2) die Krebsprävention durch Identifizierung und Entfernung von Polypen, bevor sie sich zu Krebs weiter entwickeln.
  • Ungefähr 10% aller CRC-Fälle sind angenommenermaßen erblicher Krebs. Von diesen ist nur eine kleine Fraktion auf eine Keimbahnmutation im APC-Gen zurückzuführen. Der häufigste erbliche Darmkrebs ist mit Keimbahn-MMR-Mutationen verbunden. Adenome schreiten bekannterweise rascher zu Karzinomen in Patienten mit MMR-Mutationen als in Patienten fort, die sporadische, nicht erbliche Formen von CRC entwickeln. Wenn das Outcome eines flexiblen Sigmoidoskopieverfahrens (das anfängliche klinische Screening nach Polypen oder CRC) positiv ist, wird der Gastroenterologe typischerweise mit einer Überprüfung des gesamten Darms (vollständige Darmspiegelung) zum Nachweis zusätzlicher Polypen oder von kolorektalen Tumoren fortschreiten. Es ist zu diesem Zeitpunkt zu raten, dass ein Gastoenterologe die Immunassays dieser Erfindung zum Nachweis von MMR-Mutationen verwendet.
  • MMR-Immunassays
  • Die Immunassayverfahren dieser Erfindung zum Nachweis von Mutationen, die mit HNPCC in Verbindung stehen, basieren auf zwei Annahmen, die MMR-Mutationen betreffen: (1) Dass HNPCC-Träger eine einzige Keimbahnmutation in einem der vorliegenden vier DNA-Mismatch-Repair (MMR) Gene aufweisen – hMLH1, hMSH2, hPMS2 und hPMS1; und (2) dass eine solche Mutation zu einer reduzierten zellulären Konzentration des Wildtypproteins in voller Länge führt, das durch das Gen codiert ist (wobei das Genprodukt theoretisch als die Gendosis proportional angesehen wird). Wenn eines der beiden Allele eines MMR-Gens mutiert ist, wird gemäß dieser Erfindung angenommen, dass eine 50%ige Reduktion der Menge an Protein voller Länge existiert, das in einem solchen individuellen Körpergewebe synthetisiert wird. Ein solches Immunassayverfahren wäre insbesondere nach positiven Funden von Polypen während einer Endoskopie von Nutzen.
  • Die Schemata 1 und 2 nachstehend veranschaulichen die klinischen Verwendungen von Assays zum Nachweis von Mutationen in den MMR-Genen – MSH2 und MLH1.
  • SCHEMA 1 Zielpopulation: Darmkrebs und andere Arten von Krebspatienten
    Figure 00230001
  • SCHEMA 2 Zielpopulation: Patienten mit prämalignen Darmläsionen
    Figure 00240001
  • Die nachstehenden Beispiele veranschaulichen die Immunassayverfahren, die zur Entwicklung dieser Erfindung verwendet wurden, um MMR-Mutationen nachzuweisen, die mit HNPCC und anderen Krebsarten in Verbindung stehen. Der Fokus auf die HNPCC-Assays dieser Erfindung liegt in erster Linie auf zwei der MMR-Gene (MLH1 und MSH2), weil gezeigt wurde, dass Mutationen in diesen beiden Genen für die Mehrzahl (ungefähr 90%) der identifizierbaren Mutationen in HNPCC-Fällen verantwortlich sind [Peltomäki und de la Chapelle, "Mutations Predisposing to Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer". Adv. Cancer Rev. 71: 93–119 (1997)]. Viele der bekannten Mutationen in MMR-Proteinen haben trunkierte Proteine zur Folge (siehe oben).
  • Patienten mit einem genetischen Mismatch-Repair-Defekt in ihrer Keimbahn sind nicht nur gegenüber der Entwicklung von Darmkrebs prädisponiert, sondern unterliegen auch einem signifikant höherem Risiko gegenüber der Entwicklung von Krebs des Endometriums, der Eierstöcke, der Prostata, des Magens, des Dünndarms, des Pankreas und des Gallentraktes. Auf Grundlage der Penetranzrate und der Häufigkeit isolierter Fälle wird angenommen, dass über 40% der Patienten mit Keimbahn Mismatch-Repair-Mutationen Krebs entwickeln werden und keine Familiengeschichte von Krebs aufweisen (über 400.000 erbliche Krebsfälle weisen eine negative Familiengeschichte auf).
  • Eine potentielle Einschränkung der Assays dieser Erfindung besteht darin, dass sie keine Mutationen, wie beispielsweise Missense-Mutationen nachweisen, die ein Genprodukt in voller Länge zur Folge haben. Eine Einschätzung dieser Einschränkung für MMR-Mutationen kann aus der folgenden Information bestimmt werden [Peltomäki und de la Chapelle, siehe oben]: (1) Der Anteil von HNPCC-Fällen, der unterschiedlichen Mutationen zuzuschreiben ist -MSH2 und MLH1 – machen 90% aus; den Rest (MSH6; PMS2; PMS1; TGFBR2) machen die übrigen 10% aus; (2) die relativen Häufigkeiten bzw. Verteilungen der Trunkierungs- und Nicht-Trunkierungsmutationen in MSH2- und MLH1-Genen sind – MSH2 (nicht-trunkierend (missense) = 7% und trunkierend (Frameshift, Non-Sense- und In-Frame-Deletion) = 93%) und MLH1 (nicht-trunkierend (missense) = 31% und trunkierend (Frameshift, Non-Sense- und In-Frame-Deletion) = 69%). Auf Grundlage dieser Informationen besteht die Vorhersage, dass das Verhältnis aller MMR-Mutationen, die ein Assay dieser Erfindung erfolgreich unter Verwendung von Anti-MLH1 und Anti-MSH2 nachweisen könnte, zumindest 70% beträgt.
  • Das Unvermögen, ungefähr 30% der HNPCC-Fälle nachzuweisen, entspricht ungefähr der selben Größenordnung, wie sie für andere molekulare genetische Tests berichtet wurde [Peltomäki und de la Chapelle, siehe oben; Giardiello, F.M., siehe oben]. Jedoch mag der Anteil an Hemizygotenfällen, die nicht-trunkierende Mutationen einschließen, überschätzt sein, weil andere Mutationen, beispielsweise Allelverlust und Promotormutationen (die durch andere molekulargenetische Tests nicht einfach nachgewiesen werden können) durch die Assays dieser Erfindung nachgewiesen werden sollten, wenn solche Mutationen, beispielsweise solche, die einen Allelverlust oder Promotorregionen einschließen, die Expression aus einem Allel eines MMR-Gens eliminieren oder reduzieren. Darüber hinaus würden Immunassays dieser Erfindung, um PMS1- und PMS2-Protein in voller Länge in Verbindung mit den MLH1- und MSH2-Assays nachzuweisen, die Anzahl von MMR-Mutationen, die nicht identifiziert wurden, signifikant reduzieren.
  • Weiterhin kann bei nicht-trunkierenden Missense-Mutationen, die eine Substitution einer Aminosäure einschließen, eine Veränderung, die die Gesamtlänge des Polypeptidgerüsts des Proteins nicht verändern sollte, unterschiedliche Ansätze dazu verwendet werden, solche Mutationen nachzuweisen, wenn ein Immunassay zur Diagnose verwendet wird. Beispielsweise ist eine bedeutende potentielle Konsequenz eine Aminosäuresubstitution (im Hinblick auf die Fähigkeit, diese nachzuweisen), dass eine solche Substitution die dreidimensionale native Proteinstruktur in einem ausreichenden Umfang verändern kann, dass sie die Epitop-Exposition in nativen NMR-Proteinen verändert, und dies kann durch einen Immunassay unter Verwendung von Antikörpern gegenüber spezifischen Epitopen nachweisbar sein.
  • Somit kann das Durchfluss-cytometrische Immunassay dazu in der Lage sein, einige Arten von Proteinveränderungen nachzuweisen, die auf Missense-Mutationen zurückzuführen sind, weil die Durchflusscytometrie eine Analyse permeabilisierbarer Zellen einschließt, eine Situation, in der die nativen 3-D Strukturen des MSH2- und MLH1-Proteins konserviert werden sollte. Solche Mutationen können durch alternative Strategien nachgewiesen werden, weil Assays für MMR-Mutationen in anderen Laboratorien entwickelt werden, die auf dem Nachweis funktioneller Veränderungen der enzymatischen Aktivität nach zellulären Mismatch-Reparaturen basieren [Bennett et al., Cancer Res., 57: 2956 (1997]. Eine weitere Möglichkeit schließt das Nachweisen von Veränderungen der Proteinmobilität unter Verwendung von 2-D Gelelektrophoresesystemen oder Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) ein, analog zu Assays zur Diagnose von Hämoglobinopathien [ESA, Inc., Chelmsford, MA, USA)].
  • Antikörper gegen MMR-Proteine
  • Antihumanes MLH1, antihumanes MSH2 und Antimaus PMS2 sind im Handel von PharMingen (San Diego, CA) erhältlich. Antihumanes MLH1 und antihumanes MSH2 sind ebenfalls von Oncogene Research Products (Cambridge, MA) im Handel erhältlich. Tabelle 1 charakterisiert solche kommerziell erhältlichen Antikörper.
  • Tabelle 1 Kommerziell erhältliche Antikörper gegen Mismatch-Repair-Proteine
    Figure 00270001
  • APC-Immunassay
  • Das unten gezeigte Beispiel stellt die Basis für ein Immunassayverfahren bereit, um erblichen Darmkrebs des FAP-Typs zu identifizieren. FAP ist wesentlich weniger häufig als HNPCC, stellt jedoch ein Modellsystem zur Auswertung der Fähigkeit der Immunassays dieser Erfindung bereit, um erbliche Merkmale nachzuweisen.
  • FAP ist eine autosomal-dominant vererbte Krankheit, die ungefähr 1 von 5.000 Personen in den Vereinigten Staaten betrifft (das heißt ungefähr 50.000). Sie ist durch die Entwicklung hunderter bis tausender adenomatöser Polypen im Darm und Rektum gekennzeichnet [Boman, B.M. und Levin, B., „Familial polyposis", Hosp. Prac., 21: 155–1170 (1986)]. Diese Polypen können sich tatsächlich zu Krebs entwickeln, wenn eine prophylaktische Kolektomie nicht durchgeführt wird [Lynch H.T. et al., Boman, B.M. Fitzgibbons, R.J., „Familial polyposis coli: genetics, surveillance and treatment", Nebr. Med. J., 73: 329–334 (1988)]. Tatsächlich weisen unbehandelte FAP-Patienten eine beinahe 100%ige Wahrscheinlichkeit zur Entwicklung von Darmkrebs während ihres Lebens auf.
  • Keimbahnmutationen des adenomatösen Polyposis coli (APC) Gens treten in familiärer adenomatöser Polyposis (FAP) auf. APC-Mutationen sind für erblichen Darmkrebs in FAP-Patienten verantwortlich und scheinen ein entscheidender Ausgangsfaktor in der Entwicklung auch von sporadischen kolorektalem Krebs zu sein. Die Immunassays dieser Erfindung könnten bei der Diagnose von Patienten mit vorher unbekannten APC-Mutationen bei FAP-Probanden, isolierten Fällen und Verwandten von Nutzen sein, die bisher noch nicht untersucht wurden, weil sie die Nachteile anderer molekulargenetischer Verfahren umgehen. Eine Diagnose von Patienten, die Keimbahn-APC-Mutationen tragen, einschließlich FAP, führen zu effektiven, lebensrettenden Krebspräventionsmaßnahmen.
  • Die meisten Keimbahn-APC-Mutationen (>90%) erzeugen neue Stoppkodons und weitere genetische Veränderungen, die einen Abbruch der Translation verursachen, ein Mechanismus, der ein trunkiertes APC-Protein erzeugt, mit Deletionen variabler Größe in seinem Carboxylanteil [Miyoshi et al., „Germline mutations of the APC gene in 53 familial adenomatous polyposis patients", Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89: 4452–4456 (1992); Spirio et al., Cell, 75: 951–957 (1993); Groden et al., Cell, 66: 589 (1991)]. Während alle Keimbahnmutationen bei FAP-Patienten Darmkrebs zur Folge haben, scheint die Variation der Länge trunkierter APC-Proteine mit anderen phenotypischen Manifestationen bei FAP-Patienten zu korrelieren. Beispielsweise sind Keimbahnmutationen, die in der Region zwischen den Kodonen 1250 und 1464 auftreten, mit dem klinischen Auftreten von zahlreichen Polypen assoziiert (mehr als 10/cm2), wohingegen Mutationen, die außerhalb dieses Bereichs auftreten, mit der Beobachtung von wenigen Polypen (weniger als 10/cm2) assoziiert sind [Nagase et al., Cancer Res., 52: 4055 (1992)]. Zusätzlich sind die Läsionen des Augenhintergrunds, die mit FAP verbunden sind, beinahe immer abwesend, wenn die Mutation 5' bis Exon 9 auftritt [Olschwang et al., Cell, 75: 959 (1993)]. Letztendlich führen APC-Mutationen, die vor dem 5. Exon auftreten, sowohl zu milderen Formen der Polyposis als auch dem späteren Ausbruch der Tumorbildung. Eine weitere Einsicht in den Mechanismus, wobei eine APC-Mutation zytologische Veränderungen und phenotypische Unterschiede verursacht, erfordert die Bestimmung der tatsächlichen Rolle, die APC in Darmepithelzellen und anderen Zelltypen spielt.
  • Weil die meisten Mutationen des APC-Gens in FAP neue Stoppkodone verursachen, die in Zellen zu trunkierten APC-Proteinen führen, wurde die Hypothese aufgestellt, dass die Menge an exprimierten APC-Proteinen voller Länge gesenkt wird. Somit basiert der Ansatz zum Nachweis einer APC-Mutation auf einem einfachen Immunassay, der eine um 50% reduzierte Konzentration an Genprodukt in voller Länge nachweist. Deswegen sagte die Hypothese voraus, dass in Zellen, die unterschiedliche Allele am APC-Ort besitzen, die ein mutiertes Allel zusammen mit einem Wildtyp-Allel einschließen, solche Heterozygoten eine nur 50%ige Konzentration des APC-Proteins in voller Länge aufweisen würden.
  • Um diese Hypothese zu testen, wurden Zellen von FAF-Patienten als „Modell"-System in Verbindung mit Anti-APC-Antikörpern verwendet [Borman et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 206: 909 (1995), Chop et al., Anticancer Res., 15: 991 (1995)] unter Verwendung einer quantitativen Immunpräzipitationsanalyse. Beispiel 1 nachstehend verifiziert diese Hypothese und stellt einen Beweis bereit, dass es möglich ist, einen klinisch nützlichen Assay zur Diagnose von Individuen zu entwickeln, die APC-Mutationen in ihrer Keimbahn tragen.
  • Die Immunassayverfahren dieser Erfindung weisen die Konzentration an APC-Protein in voller Länge nach. Weitere haben den Ansatz genommen, trunkierte APC-Proteine zu identifizieren, wie es durch ihre Wanderung hin zu einer niederen Molekulargewichtsposition auf Western Blots bestimmt wird [Smith et al., „The APC gen product in normal and tumor cells", Proc. Natl. Acad. Sci., 90: 2846–2850 (1993)]. Obwohl das Molekulargewicht des trunkierten APC-Proteins eine Information bereitstellt, die bei der Lokalisierung der Mutationsstelle von Nutzen ist, sind viele verkürzte APC-Proteine instabil, was ihren Nachweis auf Western Blots ausschließt [ebd.]. Beispielsweise konnte eine Western Blot-Analyse niedere Molekulargewichtsbanden nicht nachweisen, die trunkierten APC-Proteinen entsprachen, bei 3 von 7 FAP-Lymphoblastoidzelllinien, von denen früher festgestellt wurde, dass sie APC-Mutationen enthalten, die zu einer Proteintrunkierung führen [ebd.]. Die Assays dieser Erfindung weisen kein trunkiertes APC-Protein nach, sondern vielmehr das Vorliegen und die Menge des verbleibenden APC-Proteins in voller Länge.
  • Man könnte nun fragen, wie der Immunassay sich mit anderen molekulargenetischen Tests zum Nachweisen einer Keimbahn-Mutation vergleichen lässt. Bei FAP-Verwandten, bei denen APC-Mutationen bereits charakterisiert wurden, können diese Mutationen leicht nachgewiesen und bei befallenen Mitgliedern einfach und genau unter Verwendung molekulargenetischer Methoden nachgewiesen und identifiziert werden, die direkt bezüglich der relevanten Mutation testen. Deswegen können unter Verwendung molekulargenetischer Tests Mitglieder solcher Familien, die einem Risiko unterliegen, in genauer Weise diagnostiziert werden, insofern sie die Keimbahn-APC-Mutation aufweisen oder nicht aufweisen. Nichtsdestotrotz kann, weil der Immunassay so praktisch ist, er als zusätzlicher Test bei der Diagnose betroffener Mitglieder bekannter FAP-Verwandter von Nutzen sein, bei denen die APC-Mutation bereits identifiziert wurde.
  • Im Gegensatz hierzu sind unbekannte APC-Mutationen bei FAP-Probanden, isolierten Fällen und Verwandten viel schwerer nachzuweisen, die bis jetzt noch nicht untersucht wurden, weil verschiedene Keimbahn-APC-Mutationen, die in erster Linie einzelne Basenpaarveränderungen, kleine Insertionen und kleine Deletionen einschließen, bekannterweise über einen großen Anteil des APC-Gens verteilt sind [Miyoshi et al., siehe oben]. Weiterhin macht die Größe des codierenden Bereichs von APC (8535 Basenpaare) die Identifizierung von Mutationen durch Gensequenzierung sehr schwer, arbeitsintensiv und kostenintensiv. Deswegen wurden andere Techniken entwickelt und zum Nachweisen und zum Identifizieren des Orts von Mutationen innerhalb des APC-Gens entwickelt und verwendet.
  • Solche Techniken schließen eine Denaturierungsgradientengelelektrophorese (DGGE), Einstrangkonformationspolymorphismus (SSCP) Analyse und RNAse-Schutzanalyse ein. Die Empfindlichkeit solcher Techniken zum Nachweisen von APC-Mutationen in FAP-Patienten beträgt nur 30 bis 70%, abhängig vom verwendeten Verfahren, wie es diskutiert wurde in Powell et al., „Molecular diagnosis of familial adenomatous polyposis", N. Engl. J. Med., 329: 1982-1987 (1993). Neuere Techniken, die zum Nachweis von APC-Mutationen entwickelt wurden, schließen die Analyse von APC-Translationsprodukten ein, die in vitro synthetisiert wurden und eine geringfügig bessere Empfindlichkeit bzw. Sensitivität aufweisen [ebd.; van der Luijt et al., „Rapid detection of translation-terminating mutations at the adenomatous polyposis coli (APC) gene by direct protein truncation test", Genomics, 20: 1–4 (1994)]. Ein weiterer neuer Assay schließt ein rasches kolorimetrisches Verfahren unter Verwendung einer β-Galactosidase codierenden Sequenz ein, die in Frame mit klonierten APC-Gensegmenten eingeführt wurde [Varesco et al., „A rapid screening method to detect nonsense and frameshift mutations: identification of disease-causing APC alleles", Cancer Res., 53: 5581–5584 (1993)]. Jedoch wurde die Sensitivität dieser letzteren Technik in klinischen Einstellungen bisher nicht bestimmt.
  • Der größte Teil der molekulargenetischen Ansätze, die oben diskutiert wurden, wurden entwickelt, um Einbasenpaarveränderungen, kleine Insertionen und kleine Deletionen und/oder Mutationen nachzuweisen, die zum Abbruch der Translation führen. Jedoch tritt in einigen Fällen eine Deletion des gesamten APC-Gens in der Keimbahn von FAP-Patienten auf [Herrera et al., „Gardner Syndrome in a man with interstitial deletion of 5q", Am. J. Med. Genetics, 25: 473–476 1986); Joslyn et al., „Identification of deletion mutations and three new genes at the familial polyposis locus", Cell, 66: 601–613 (1991); Groden et al., "Mutational Analysis of Patients with Adenomatuous Polyposis: Identical Inactivating Mutations in Unrelated Individuals", Am. J. Hum. Genet., 52: 263–272 (1993)], ein Ereignis, das durch molekulargenetische Ansätze verfehlt würde. Darüber hinaus weisen einige FAP-Patienten Promotor- oder Spleißmutationen auf, die zu reduzierten Konzentrationen normaler APC-Transkripte führen [Powell et al (1993), siehe oben]. Deswegen kombinierte ein früherer molekulargenetischer Ansatz den molekularen Nachweis von APC-Trunkierung-verursachenden Mutationen durch Analyse von APC-Translationsprodukten, die in vitro mit einem Allel-spezifischen Expressionsassay synthetisiert wurden, die zusammen eine verbesserte Sensitivität von 89% im Nachweis von Keimbahn-APC-Mutationen aufweisen [Powell et al. (1993), siehe oben].
  • Die vorhergesagte Sensitivität der Immunassays dieser Erfindung basierte auf der Fähigkeit, die Konzentration eines Genprodukts in voller Länge zu bestimmen, beispielsweise von APC, und wird beim Nachweis des Vorhandenseins von Keimbahnmutationen, beispielsweise APC-Keimbahnmutationen, nahezu 100% betragen. Dieser Ansatz sollte beim Nachweis von Mutationen wertvoll sein, die eine Proteintrunkierung ebenso wie den Verlust einer Allelexpression einschließen.
  • Insgesamt sollte die Immunpräzipiationsanalyse zur Bestimmung der Menge an APC-Protein in voller Länge in Zellen beim Nachweis von Keimbahn-APC-Mutationen besonders nützlich sein, die in FAP-Patienten im heterozygoten Zustand existieren. Obwohl andere molekulare Tests verfügbar sind, können die Immunassays dieser Erfindung mehrere Vorteile haben, weil sie relativ einfach, zuverlässig und preiswert sind, und weil der Nachweis von Genprodukt in voller Länge viele Nachteile anderer Assays umgeht. Die Immunassays sollten relativ einfach in den meisten Krankenhäusern oder Pathologielaboratorien durchzuführen sein. Darüber hinaus sind zahlreiche Anti-APC-Antikörper, die von APC-1 und APC-2 verschieden sind, verfügbar. Weil die vorhergesagte Sensitivität der Immunassays dieser Erfindung sehr hoch ist, sollten die Assays bei der Förderung anderer Verfahren von Nutzen sein, die auf der Molekulargenetik basieren, bei denen es die Aufgabe ist, kürzlich charakterisierte APC-Mutationen in gegebenen FAP-Verwandten nachzuweisen, so dass betroffene Mitglieder in solchen Familien ausgewertet werden können.
  • Darüber hinaus können die Immunassays nach APC-Protein in voller Länge insbesondere beim Nachweisen bisher unbekannter APC-Mutationen in FAP-Probanden, isolierten Fällen und Verwandten, die bisher noch nicht untersucht wurden, von Nutzen sein, Individuen, bei denen es ansonsten schwierig ist, zu diagnostizieren. Der ultimative Wert der vorliegenden Erkenntnisse für FAP-Patienten wird realisiert werden, wenn ein Immunassay von APC-Konzentrationen in voller Länge eine nützliche Rolle in klinischen Einstellungen findet. Wenn dem so ist, können prophylaktische Maßnahmen (beispielsweise Kolektomie) institutionalisiert werden, um die Entwicklung von kolorektalem Krebs bei solchen Individuen zu verhindern, von denen identifiziert wurde, dass sie ein in schädlicher Weise mutiertes APC-Allel in ihren Keimbahnen tragen [Boman und Levin, „Familial polyposis", Hosp. Pract., 21: 155–170 (1986); und Lynch et al., "Familial polyposis coli: genetics, surveillance and treatment", Nebr. Med. J., 73: 329–334 (1988)].
  • Technologie zur Untersuchung von Proteinkonzentrationen in PBL's
  • Aufreinigung von Lymphozyten auf einer SmaII-Probe von humanem Blut (20 ml)
  • Ein kommerziell verfügbares Verfahren zum Isolieren von Lymphozyten ist das des VACU-TAINER® CPTTM Mononuclear Cell Preparation Tubes (Beckton Dickinson; Franklin Lakes, NJ). Das Blut wird in ein VACUTAINER®-Röhrchen eingezogen, das selbst geschleudert wird. Eine Gelbarriere im Röhrchen trennt abgeschleuderte RBCs und Neutrophile am Boden von Lymphozyten und Monozyten am Oberteil.
  • Proteinextraktion
  • Verfahren zum Extrahieren von Protein aus den gereinigten Lymphozyten so entwickelt, dass sie quantitativ und reproduzierbar waren, was zur Folge hatte, dass Protein durch immunologische Techniken untersucht werden kann. Ein beispielhaftes Proteinextraktionsverfahren folgt. Die Proben wurden ein- bis zweimal mit 5 ml Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen und bei 2.000 U/min für 10 min bei 4°C geschleudert. Um die Zellen zu lysieren, wurde 1X Stärke SDS-Gel Beladungspuffer (50 mM Tris-Cl [pH 6,8], 100 mM Dithiothreitol [DTT; frisch hergestellt], 2% SDS, 0,1% Bromphenol blau, 10% Glycerol) jedem der gewaschenen Pellets zugesetzt (1 ml für kultivierte Darmkrebszellen, 200 μl für Lymphozyten und Lymphoblastoidzellen). Die Zellen wurden sorgfältig vermischt (vortex) und in siedendem Wasser (10 min) angeordnet. Die Zellen wurden dann für 10 min in einer Mikrofuge geschleudert (Beckman Instruments Inc.; Fullterton, CA), um das unlösliche Material auszufällen, das verworfen wurde.
  • Immunassays für andere Proteine in voller Länge
  • Die Immunassayverfahren dieser Erfindung können angewendet werden, um Proteine in voller Länge (Wildtyp) zu messen, die mit vielen anderen erblichen und genetischen Störungen bzw. Krankheiten (Krebs und Nicht-Krebs) verbunden sind, die auf Mutationen zurückzuführen sind, die auf eine Proteintrunkierung (Keimbahn und erworben) zurückzuführen sind oder das Fehlen einer Allelproteinexpression verursachen. Beispielhaft sind die nachfolgenden Gene, die Mutationen durchmachen, die trunkierte Proteine oder Allelverlust zur Folge haben.
  • Assays dieser Erfindung zum Nachweisen oder Quantifizieren von Wildtyptarget bzw. Zielproteinen können unter Verwendung kommerziell erhältlicher Antikörper entwickelt werden, wenn solche Antikörper für ein Zielprotein verfügbar sind. Wenn keine solchen Antikörper gegen ein Zielprotein kommerziell erhältlich sind oder wenn kommerziell erhältliche Antikörper gegenüber einem Targetprotein als nicht geeignet festgestellt werden, können geeignete Antikörper gegen ein Zielprotein durch herkömmliche Verfahren hergestellt werden [siehe unten unter der Überschrift „Antikörper"]. Ein bevorzugtes repräsentatives Immunassayformat dieser Erfindung ist ein Sandwichtyp, Bead- bzw. Kügelchen-gebundener Immunassay.
    • 1. Mutationen im BRCA1-Gen sind für einige erbliche Formen von Brustkrebs verantwortlich [Hogervorst F.B.L., Cornelis R.S., Bout M., van Vliet M. Oosterwijk J.C., Olmer Renske et al., „Rapid detection of BRCA1 mutations by the protein truncation test", Nature Genetics 10: 208-212 (1995); Genbank Database, http://www.ncbi.nlm.nih.goy/irx/cgi-bin/birx-doc?genbank.]. Die mRNA ist 5711 Basenpaare lang und befindet sich auf Chromosom 17q21. Der Prozentsatz von Fällen mit einer Proteintrunkierung, die Mutationen verursacht, beträgt 90% (Hogervorst et al. (1995), siehe oben]. Monoklonale Antikörper gegen das BRCA1-Protein sind kommerziell von Upstate Biotechnology Inc. [Waltham, MA (USA)] und von Oncogene Research Products [Cambridge, MA (USA)] erhältlich.
    • 2. Mutationen im BRCA2-Gen sind für einige erbliche Formen von Brustkrebs verantwortlich [Lancaster, J.M., Wooster, R., Mangion, J., Phelan, C.M., Cochran, C., Gumbs, C. et al., „BRCA2 mutations in primary breast and ovarian cancers", Nature Genetics, 13: 238–240 (1996); Genbank Database, siehe oben]. Die mRNA ist 10.987 Basenpaare lang und befindet sich auf Chromosom 13q12-q13. Der Prozentsatz von Fällen mit Proteintrunkierungverursachenden Mutationen beträgt 90% [Lancaster et al., siehe oben]. Polyklonale Antikörper gegen das BRCA2-Protein sind kommerziell von Lab Vision Corp. [Fremont, CA (USA)], von Oncogene Research Products [Cambridge, MA (USA)] und von Santa Cruz Biotechnology [Santa Cruz, CA, (USA)] erhältlich.
    • 3. Mutationen des ATM-Gens sind für Ataxie-Telangiektasie verantwortlich [Fitzgerald, M.G., Bean, J.M., Hedge, S.R., Unsal, H., MacDonald, D.J., Hankin, D.P. et al., „Heterozygous ATM mutations do not contribute to early onset of breast cancer", Nature Genetics, 15: 307–310 (1997); Genbank Database, siehe oben]. Die mRNA ist 9385 Basenpaare lang und befindet sich auf Chromosom 11q22-23. Der Prozentsatz von Fällen mit Proteintrunkierung-verursachenden Mutationen beträgt 90% [Fitzgerald et al., siehe oben]. Antikörper gegen das ATM-Protein sind im Handel von Serotec Ltd. erhältlich [Kidlington, Oxford (UK)].
    • 4. Mutationen im CFTR-Gen sind für die zystische Fibrose verantwortlich [Romey et al., „Transcript analysis of CFTR frameshift mutations in lymphocytes using the reverse transcription-polymerase chain reaction technique and the protein truncation test", Hum. Genet., 98: 328-332 (1996); Genbank Database, siehe oben]. Die mRNA ist 6129 Basenpaare lang und befindet sich auf Chromosom 7q31.3. Der Prozentsatz von Fällen mit Proteintrunkierung-verursachenden Mutationen beträgt 15% [Romey et al., siehe oben]. Im Handel erhältliche Antikörper gegen das CFTR-Protein sind in Linscott's Index nicht aufgelistet.
    • 5. Mutationen im DMD-Gen sind für Duchenne Muskeldystrophie verantwortlich [Roest et al., "Protein truncation test (PTT) for rapid detection of translation-terminating mutations", Hum. Mol. Genet., 2: 1719–1721 (1993); Gardner et al., "The identification of point mutations in Duchenne Muscular Dystrophy patients by using reverse-transcription PCR and the protein truncation test", Am. J. Hum. Genet., 57: 311 (1995); Genbank Database, siehe oben]. Die mRNA ist 2110 Basenpaare lang und befindet sich auf Chromosom xp21.3-p21.1. Der Prozentsatz von Fällen mit Proteintrunkierung verursachenden Mutationen beträgt 95% [Roest et al., siehe oben; Gardner et al., siehe oben]. Antikörper gegen den Carboxy-terminalen Anteil des DMD-Proteins sind kommerziell von Biomedia Corp. [Foster City, CA (USA)], von Biogenesis Ltd. [Sandown, NH (USA)] und von Biogenix Labs [San Ramon, CA (USA)] erhältlich. Antikörper gegen den N-terminalen Anteil des DMD-Proteins sind ebenfalls von solchen Unternehmen kommerziell erhältlich.
    • 6. Mutationen im EMD-Gen sind für die Emery-Dreifuss Muskeldystrophie verantwortlich [Leiden, unveröffentlicht, wie erwähnt in Hvervorst, F.B.L., "The Protein Truncation Test", Promega Notes Magazine, 62 : 7–14 (1997)]. Die mRNA ist 503 Basenpaare lang und befindet sich auf Chromosom Xq28. Der Prozentsatz von Fällen mit Proteintrunkierung-verursachenden Mutationen beträgt 80% [Leiden, siehe oben]. Antikörper gegen das EMD-Protein sind in Linscott's Index nicht als kommerziell erhältlich aufgelistet.
    • 7. Mutationen im FAA-Gen sind für die Fanconi-Anämie [Lo Ten Foe et al., "Expression cloning of a cDNA for the major Fanconi anaemia gene, FAA", Nat. Genet., 14: 320–323 (1996); Genbank Database, siehe oben]. Die mRNA ist 5503 Basenpaare lang und befindet sich auf Chromosom 16q24.3. Der Prozentsatz von Fällen mit Proteintrunkierung-verursachenden Mutationen beträgt 80% [Lo Ten Foe et al., siehe oben]. Antikörper gegen das FAA-Protein sind in Linscott's Index nicht als kommerziell erhältlich aufgelistet.
    • 8. Mutationen im IDS-Gen sind für das Hunter-Syndrom verantwortlich [Hogervorst et al., Am. J. Hum. Genet., 55: A223 (1994); Genbank Database, siehe oben]. Die mRNA ist 36.845 Basenpaare lang und befindet sich auf Chromosom xq27.3-q28. Der Prozentsatz von Fällen mit Prote intrunkierung-verursachenden Mutationen beträgt ungefähr 50% [Hogervorst et al. (1994), siehe oben]. Antikörper gegen das IDS-Protein sind in Linscott's Index nicht als kommerziell erhältlich aufgelistet.
    • 9. Mutationen im NF1-Gen sind für Neurofibromatose Typ 1 verantwortlich [Heim et al., "Screening for truncated NF1 proteins", Nat. Genet. 8: 218–219 (1994); Genbank Database, siehe oben]. Die mRNA ist 9.026 Basenpaare lang und befindet sich auf Chromosom 17q11.2. Der Prozentsatz von Fällen mit Proteintrunkierung-verursachenden Mutationen ist 50% [Hein et al., siehe oben]. Antikörper gegen das NF1-Protein sind in Linscott's Index nicht als kommerziell erhältlich aufgelistet.
    • 10. Mutationen im NF2-Gen sind für Neurofibromatose Typ 2 verantwortlich [MacCollin et al., "Mutational analysis of patients with neurofibromatosis 2", Am. J. Hum. Genet. 55: 314 (1994); Genbank Database, siehe oben]. Die mRNA ist 339 Basenpaare lang und befindet sich auf Chromosom 22q11-q13.1. Der Prozentsatz von Fällen mit Proteintrunkierung-verursachenden Mutationen beträgt 65% [MacCollin et al., siehe oben]. Antikörper gegen das NF2-Protein sind im Handel von Transduction Labs erhältlich [(Lexington, KY (USA)].
    • 11. Mutationen im PKD1-Gen sind für polyzystische Nierenkrankheit verantwortlich [Ward et al., "The polycystic kidney disease 1 gene encodes a 14 kb transcript and lies within a duplicated region on chromosome 16", Cell, 77: 881–894 (1994); Roelfsema und Breuning (Abstract), Am. Soc. Hum. Genet.: A240 (1994); Genbank Database, siehe oben]. Die mRNA ist 53.522 Basenpaare lang und befindet sich auf Chromosom 16p13.3. Der Prozentsatz von Fällen mit Proteintrunkierung verursachenden Mutationen beträgt 95% [Roelfsema und Breunig, siehe oben]. Antikörper gegen das PKD1-Protein sind in Linscott's Index nicht als kommerziell erhältlich aufgelistet.
    • 12. Mutationen im PTCH-Gen sind für das nävoide Basalzellkarzinom verantwortlich [Johnson et al., "Human homolog of patched, a candidate gene for the basal cell nevus syndrome", Science, 272, 1668–1671 (1996); Genbank Database, siehe oben]. Die mRNA ist 6.568 Basenpaare lang und befindet sich auf Chromosom 9q22/3. Es ist bekannt, dass Mutationen im PTCH-Gen ein trunkiertes Protein zur Folgen haben können [Johnson et al., siehe oben; Hahn et al., Cell 85: 841–851 (1996); Gailani et al., Nature Gen. 14: 78–81 (1996); Unden et al., Cancer Res., 56: 4562–4565 (1996); und Wicking et al., Am. J. Hum. Genet., 60: 21–26 (1997)]. Antikörper gegen das PTCH-Protein sind in Linscott's Index nicht als kommerziell erhältlich aufgelistet.
    • 13. Mutationen im c-myb-Gen sind für hämatologische Malignitäten verantwortlich [Badiani et al., Genes Dev. 8 (7): 770–782 (1994); Schaefer et al., J. Biol. Chem. 271 (23): 13.484–13.496 (1996); Genbank Database, siehe oben]. Die mRNA ist 40.433 Basenpaare lang und befindet sich auf Chromosom 6q22. Es ist bekannt, dass Mutationen in diesem Gen eine Proteintrunkierung verursachen können [Tomita et al., "Truncated c-myb expression in the human leukemic cell line TK-6", Leukemia, 12: 1422–1499 (1998); Jiang et al., "Minimal truncation of the c-myb gene product in rapid-onset B-cell lymphoma", J. Virol., 71: 6526–6533 (1997)]. Die Antikörper gegen das c-myb-Protein können von Upstate Biotechnology Inc. kommerziell bezogen werden [Waltham, MA (USA)].
    • 14. Mutationen im VHL-Gen sind für die von Hippel-Lindau Krankheit verantwortlich [Latif et al., "Identification of the von Hippel-Lindau disease tumor suppressor gene", Science 260: 1317-1320 (1993); Genbank Database, siehe oben]. Die mRNA ist 14.543 Basenpaare lang und befindet sich auf Chromosom 3p25. Es ist bekannt, dass Mutationen in diesem Gen eine Proteintrunkierung verursachen können [Olschwang et al., "Germline mutation profile of the VHL gene in von Hippel Lindau disease and in sporadic hemangioblastoma", Human Mutation, 12: 424–430 (1998); Ye et al., "Subcellular localization of the von Hippel Lindau disease gene product is cell-cycle dependent", International Journal of Cancer, 78: 62–69 (1998); Maher et al., "Phenotypic expression in von Hippel Lindau disease – Correlations with germline VHL gene mutations", Journal of Medical Genetics, 33: 328–332 (1996); Crossey et al., "Identification of intragenic mutations in the von Hippel Lindau disease tumor suppressor gene and correlation with disease phenotype", Human Molecular Genetics, 3: 1303–1308 (1994); Shuin et al., "Frequent somatic mutations and loss of heterozygosity of the von Hippel Lindau tumor suppressor gene in primary human renal cell carcinomas", Cancer Research, 54: 2852–2855 (1994).] Die von Hippel-Lindau (VHL) Krankheit ist ein dominant vererbtes familiäres Krebssyndrom, das eine Prädisposition gegenüber retinalem, zerebellarem und spinalem Hämangioblastom, Nierenzellkarzinom, Pheochromozytom und Pankreastumoren zeigt [Glavavc et al., "Mutations in the VHL tumor suppressor gene and associated lesions in families with von Hippel-Lindau disease from central Europe", Hum. Genet., 98 (3): 271–280 (1996)]. Allelverluste und Mutationen des VHL-Gens erwiesen sich als in die Tumorentwicklung, wie im sporadischen Nierenkarzinom [Brauch et al., "Hippel-Lindau syndrome and sporadic renal cell carcinomas", Pathologe, 16 (5): 321–327 (1995)], und in zererbellarem Hämangioblastom [Lee et al., "Loss of heterozygosity and mutations of von Hippel-Lindau gene on sporadic cerebellar hemangioblastoma", Proc. Annu. Meet. Am. Assoc. Cancer Res., 38: A3600 (1997)] involviert. Antikörper gegen das Protein sind kommerziell von Oncogene Research Products (Cambridge, MA) und PharMingen [San Diego, CA (USA)] erhältlich.
    • 15. Mutationen im E-Cadherin (HSECAD) Gen sind für Brustkrebs und Kolonkrebs verantwortlich [Bussemakers et al., "Molecular cloning and characterization of the human E-cadherin cDNA", Mol. Biol. Rep. 17: 123–128 (1993); Genbank Database, siehe oben]. Die mRNA ist 248 Basenpaare lang und befindet sich auf Chromosom 16q22.1. Es ist bekannt, dass Mutationen in diesem Gen eine Proteintrunkierung verursachen können [Guilford et al., "E-cadherin germline mutations in familial gastric cancer", Nature, 392: 402–405 (1998); Vos et al., "E-cadherin inactivation in lobular carcinoma in situ of the breast: an early event in tumorigenesis". British Journal of Cancer 76: 1131–1133 (1997); Berx et al., "E-cadherein is inactiviated in a majority of invasive human lobular breast cancers by truncation mutations throughout its extracellular domain", Oncogene, 13: 1919–1925 (1996); Berx et al., "E-cadherin is a tumor invasion suppressor gene mutated in human lobular breast cancers", EMBO Journal) 14: 6107–6115 (1995).] Antikörper gegen das E-Cadherin-Protein sind kommerziell von ICN Biomedicals [Costa Mesa, CA, USA)], von Biogenex Labs [San Ramon, CA (USA)], von Zymed Labs [South San Francisco, CA (USA)], von American Research Products [Belmont, MA] und von Immunotech SA [Marseilles, Frankreich] erhältlich.
    • 16. Mutationen im p16-Gen (ebenfalls bekannt als das CDKN2A Tumorsuppressorgen und MTS1-Gen) sind für das familiäre Melanom verantwortlich [Hussussian et al., "Germline p16 mutations in familial melanoma", Nature Genetics 8: 15 (1994); Genbank Database, siehe oben] Die mRNA ist 422 Basenpaare lang und befindet sich auf Chromosom 9p21. Es ist bekannt, dass Mutationen in diesem Gen eine Proteintrunkierung verursachen können. [Monzon et al., "CDKN2A Mutations in Multiple Primary Melanomas"; N. Engl. Med., 338 (13): 879–887 (1998)]. Antikörper gegen das p16-Protein sind kommerziell von Alexis Corp. [San Diego, CA (USA)], PharMingen [San Diego, CA (USA)] und Oncogene Research Products [Cambridge, MA (USA)] erhältlich.
  • Automatisiertes Immunassaysystem
  • Die Verfahren dieser Erfindung können einfach an automatisierte Immunchemieanalysegeräte angepasst werden. Um die Automatisierung der Verfahren dieser Erfindung zu vereinfachen und um die Umsatzzeit zu reduzieren, kann ein Einfangantikörper in einem Immunassay dieser Erfindung an magnetische Partikel gekoppelt werden.
  • Ein Antikörper kann an solche magnetischen Kügelchen durch Verwendung kommerziell verfügbarer Technologie, wie M-280 Schaf-anti-Kaninchen IgG beschichtete DynabeadsTM von Dynal, Inc. [Lake Success, NY (USA)] und Kaninchenantikörper gegen ein Zielprotein oder durch Verwendung von M-450 Tosyl-aktivierten Dynabeads von Dynal, Inc. und kovalentes Koppeln eines relevanten Antikörpers hieran, gekoppelt werden. Alternativ kann ein Mittel, wie beispielsweise Glutaraldehyd für das kovalente Binden eines gegenständlichen Antikörpers an einen festen Träger, vorzugsweise magnetische Kügelchen, verwendet werden. Repräsentative Kopplungsmittel können organische Verbindungen, wie beispielsweise Thioester, Carbodiimide, Succinimidester, Diisocyanate, Glutaraldehyde, Diazobenzole und Hexamethylendiamine einschließen.
  • Wildtyp-Zielgenprodukte und Bezugs- bzw. Referenzproteine können beispielsweise mit einem quantitativen Magnetkügelchen-basierten Immunassay vom Sandwich-Typ quantifiziert werden. Ein solches Assay kann in im Handel erhältliche automatisierte Immunassaysysteme integriert werden.
  • Ein bevorzugtes automatisiertes/Immunassaysystem ist das automatisiertes ACS:180® Chemilumineszenzsystem [Bayer Corporation; Tarrytown, NY und Medfield, MA (USA) einschließlich ACS: 180 PLUS System; ACS: 180 SE System; und ACS: CENTAUR® System]. Das automatisierte ACS:180® Immunassaysystem ist in Dudley, B.S., J. Clin. Immunassay, 14 (2): 77 (Sommer 1991) beschrieben. Das System verwendet chemilumineszierende Marker als Tracer und paramagnetische Teilchen (PMP) als Festphasenreagentien. Das ACS:180-System umfasst sowohl kompetitive Bindung als auch Sandwichassays, wobei jeder der Schritte automatisiert ist. Das ACS:180 verwendet paramagnetische Teilchen von Mikrometergröße, die die verfügbare Oberfläche maximieren und stellt ein Mittel zur raschen magnetischen Auftrennung von gebundenem Tracer von ungebundenem Tracer ohne Zentrifugierung bereit. Reagenzien können si multan oder sequentiell zugesetzt werden. Andere Markierungen, beispielsweise eine enzymatische Markierung, könnte anstelle einer chemilumineszierenden Markierung, beispielsweise eines Acridiniumesters, verwendet werden. Lumineszierende Signale würden vorzugsweise durch ein Luminometer nachgewiesen werden. Ebenfalls bevorzugt ist das Bayer Immuno 1TM Immunassaysystem.
  • Kontrollen für ein solches automatisiertes Immunassaysystem wären wie solche, die für eine Western Blot-Analyse von MMR-Proteinen beispielhaft beschrieben wurden, wie sie hierin beschrieben sind. Positive Kontrollen könnten Zelllinien von gesunden, normalen Freiwilligen sein. Negative Kontrollen könnten Zelllinien sein, von denen bekannt ist, dass sie für ein mutiertes Genprodukt homozygot sind, beispielsweise HCT116-Zellen (homozygot für ein mutiertes MLH1-Protein) und LoVo-Zellen (homozygot für ein mutiertes MSH2-Protein.
  • Ein beispielhaftes automatisiertes Immunassayformat zum Nachweisen und Quantifizieren eines Genprodukts in voller Länge, beispielsweise MLH1 und/oder MSH2, würde folgendes umfassen: (1) einen ersten primären Antikörper, der gegen das Genprodukt spezifisch ist, der beispielsweise für das Aminoende des Genprodukts spezifisch ist, gekoppelt an Magnetkügelchen; (2) Inkubieren der Zelllysate mit Magnetkügelchen, die mit dem ersten primären Antikörper beschichtet sind; (3) Waschen zum Reduzieren einer unspezifischen Bindung; (4) Inkubieren mit einem zweiten primären Antikörper, der für das Carboxylende des Genprodukts in voller Länge spezifisch ist und der direkt markiert ist, vorzugsweise chemilumineszent markiert ist; und (5) Nachweisen und Quantifizieren eines Signals von dieser Markierung, wobei das Signalniveau der Menge des Genprodukts in dem Zelllysat proportional ist. Ein Reportersystem, das mit einem Antikörper verbunden ist, der für das Carboxylende des Genprodukts spezifisch ist, wird bevorzugt, weil das Protein in voller Länge dasjenige ist, das quantifiziert werden soll.
  • Verschiedene Modifikationen im Hinblick auf das automatisierte Immunassaybasisformat können vom Fachmann auf dem Gebiet in einfacher Weise ins Auge gefasst werden. Beispielsweise könnte ein solches Assayformat derart variiert werden, dass zwei Genprodukte, beispielsweise MLH1 und MSH2, oder ein Genprodukt und ein Referenzprotein, beispielsweise APC und Tubulin, β-Actin oder GAPH nachgewiesen und in derselben Zelllysatprobe, vorzugsweise simultan, quantifiziert werden könnte. Im beispielhaft dargelegten Format werden zwei Sätze bzw.
  • Reihen von Antikörpern verwendet, wobei jeder Satz zwei primäre Antikörper umfasst, von denen jeder ein unterschiedliches Epitop auf dem Zielprotein erkennt.
  • Repräsentativer MSH2/MLH1 automatisierter Immunassay
  • Zum Nachweis und zur Quantifizierung eines MSH2-Proteins in voller Länge könnte ein Maus-Anti-MSH2-MAb (monoclonal antibody = monoklonaler Antikörper) beispielsweise gegen das Aminoende von MSH2 kovalent an Kügelchen gebunden werden, beispielsweise an Dynabeads® (M-450 Tosyl-activiert; Dynal Inc.). Die an den monoklonalen Antikörper gekoppelten Kügelchen werden mit Zelllysaten, gefolgt von einem Waschschritt, inkubiert. Darauf werden die gewaschenen Kügelchen mit einem Maus-Anti-MSH2, AB1, beispielsweise ein Maus-MAb, gegen das Carboxylende von MSH2 als zweitem primären Antikörper inkubiert.
  • Analog könnte ein Anti-MLH1-Antikörper, beispielsweise ein polyklonaler Kaninchenantikörper, gegen MLH1 (beispielsweise AB2 von Oncogene Research Products) an M-280 Schaf Anti-Kaninchen IgG beschichtete Dynabeads® gekoppelt werden. Der zweite primäre Antikörper könnte ein Maus Anti-MLH1-MAb sein [beispielsweise Klon G168–728; PharMingen (San Diego, CA)), der an das volle Länge, jedoch nicht an das mutierte MLH1 bindet [Thibodeau et al., Cancer Res., 56: 4836 (1996)].
  • Das Outcome des MLH1/MSH2-Assays wäre die Erfassung des Verhältnisses der Proteinkonzentrationen von MLH1 zu MSH2 in voller Länge oder des Verhältnisses entweder der Wildtypproteinkonzentration gegenüber einem Referenzprotein in einer einzigen Probe, vorzugsweise einer Zelllysatprobe, besonders bevorzugt einem Lysat aus PBLs, eines Subjekts mit Darmtumoren (Adenomen, Krebs) oder von einem Familienmitglied eines Subjekts mit Darmtumoren und eines Kontrollsubjekts. Abnormale MLH1/MSH2-Verhältnisse würden eine Mutation oder Mutationen im Gen widerspiegeln, von denen dadurch gezeigt wird, dass eine reduzierte Menge an Wildtypgenprodukt in voller Länge exprimiert.
  • Antikörper
  • Der Begriff „Antikörper" ist hierin so definiert, dass er nicht nur ganze Antikörper, sondern auch biologisch aktive Bruchstücke bzw. Fragmente von Antikörpern, vorzugsweise Fragmente, die Antigen-bindende Regionen enthalten, einschließt. Weiter in die Definition von Antikörpern sind bispezifische Antikörper mit eingeschlossen.
  • Die Antikörper der Erfindung können durch herkömmliche Verfahren und/oder durch gentechnische Verfahren hergestellt werden. Antikörperfragmente können gentechnisch hergestellt werden, vorzugsweise aus den variablen Regionen der leichten und/oder schweren Ketten (VH und VL), einschließlich der hypervariablen Regionen und noch mehr bevorzugt sowohl aus den VH- und VL-Regionen. Beispielsweise schließt der Begriff „Antikörper", wie hierin verwendet, polyklonale und monoklonale Antikörper und biologisch aktive Fragmente hiervon ein, einschließlich unter anderen Möglichkeiten „univalente" Antikörper [Glennie et al., Nature 295: 712 (1982)]; FAB-Proteine, die Fab'- und F(ab')2-Fragmente einschließen, gleichgültig ob kovalent oder nicht-kovalent aggregiert; leichte oder schwere Ketten alleine, vorzugsweise variable schwere und leichte Kettenregionen (VH- und VL-Regionen) und besonders bevorzugt die hypervariablen Regionen (in anderer Weise bekannt als die Komplementarität-bestimmenden Regionen (complementarity determining regions = CDRs) dieser VH- und VL-Regionen]; FC-Proteine; „Hybrid"-Antikörper, die zur Bindung von mehr als einem Antigen in der Lage sind; Chimären aus konstanten und variablen Regionen; „zusammengesetzte" Immunglobuline mit schweren und leichten Ketten unterschiedlichen Ursprungs; „veränderte" Antikörper mit verbesserter Spezifizität und anderen Eigenschaften, wie durch Standardrekombinationstechniken hergestellt, und ebenfalls durch Oligonukleotid-gelenkte Mutagenesetechniken [Dalbadie-McFarland et al., PNAS (USA), 79: 6409 (1982)].
  • Bispezifische Antikörper können durch chemisches Koppeln durch zwei Antikörpern der erwünschten Spezifitäten hergestellt werden. Bispezifische monoklonale Antikörper können vorzugsweise durch somatische Hybridisierung von zwei Hybridomas entwickelt werden. Bispezifische monoklonale Antikörper zum Targeting zweier Zielproteine können durch Fusionieren einer Hybridoma, die einen Ziel-spezifischen MAb produziert mit einer Hybridoma, die monoklonale Antikörper erzeugt, die gegen eine anderes Zielprotein spezifisch sind, hergestellt werden. Die sich ergebenden Quadromas können gescreent werden, um eine Quadroma auszuwählen, die einen Hybridantikörper mit der Spezifität der Eltern-mAbs erzeugt.
  • Es existieren konventionelle Techniken zur Herstellung monoklonaler und polyklonaler Antikörper, die in der Immunassaytechnik wohl bekannt sind [beispielsweise Galfre und Milstein, "Pre paration of Monoclonal Antibodies: Strategies and Procedures", in Methods in Enzymology: Immunochemical Techniques, 73: 1–46 (Langone und Vanatis (Hrsg.); Academic Press; 1981); und in der klassischen Literatur, Kohler und Milstein, Nature, 256: 495–497 (1975)]. Monoklonale Antikörper, die für diese Erfindung spezifisch sind, können durch Immunisierung geeigneter Säugetiere hergestellt werden, vorzugsweise von Nagetieren, besonders bevorzugt von Kaninchen, Ratten oder Mäusen, mit einem geeigneten Immunogen, das an ein Trägerprotein, falls notwendig, gebunden ist. Speziell bevorzugte Antikörper die in den Assays dieser Erfindung von Nutzen sind, sind murine, monoklonale Antikörper, die gegen Epitope auf entweder dem Aminoende oder dem Carboxylende eines gegenständlichen Wildtypproteins gerichtet sind.
  • Repräsentative Hybridomas dieser Erfindung können durch Fusion muriner Zelllinien gebildet werden, Human/Human Hybridomas [Olsson et al., PNAS (USA), 77: 5429 (1980)] und Human/Murin Hybridomas [Schlom et al., PNAS (USA), 77: 6841 (1980); Shearman et al. J. Immunol. 146 928–935 (1991); und Gorman et al., PNAS (USA), 88: 4181–4185 (1991)] können ebenfalls durch andere Möglichkeiten hergestellt werden.
  • Antipeptidantikörper werden ebenfalls durch konventionelle Verfahren in der Technik hergestellt, wie in der europäischen Patentveröffentlichung Nr. 0 044 710 (veröffentlicht am 27. Januar 1982) beschrieben ist. Kurz gesagt, solche Antipeptidantikörper können durch Selektieren eines Peptids aus einer Zielaminosäuresequenz, dessen chemische Synthese, dessen Bindung an ein geeignetes immunogenes Protein und dessen Injizierung in ein geeignetes Tier, üblicherweise ein Kaninchen oder eine Maus, hergestellt werden; darauf werden entweder polyklonale oder monoklonale Antikörper hergestellt, die letzteren durch ein Kohler-Milstein-Verfahren als Beispiel.
  • Abgesehen von der konventionellen Hybidomatechnik können neuere Technologien zur Erzeugung von Antikörpern gemäß der Erfindung verwendet werden. Beispielsweise resultierte die Verwendung der PCR zum Klonieren und Exprimieren von Antikörper-V-Genen und die Verwendung der Phage-Display-Technologie zur Auswahl von Antikörpergenen, die Fragmente mit Bindungsaktivitäten codieren, zur Isolierung von Antikörperfragmenten aus Repertoires von PCR-amplifizierter V-Genen unter Verwendung immunisierter Mäuse oder Menschen [Marks et al., BioTechnology, 10: 779 (July 1992); Chiang et al., BioTechniques, 7 (4): 360 (1989); Ward et al., Nature, 341 : 544 (Oktober 12, 1989); Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581 (1991); Clack son et al., Nature 352: (15. August 1991); und Mullinax et al., PNAS (USA), 87: 8095 (Oktober 1990).
  • Beschreibungen von Verfahren zur Herstellung von Antikörpern, wobei der Begriff hierin so definiert ist, dass er biologisch aktive Antikörperfragmente einschließt, durch Rekombinationstechniken im US-Patent Nr. 4,816,567 (erteilt am 28. März 1989) zu finden; in der europäischen Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer (EP) 0 338 745 (veröffentlicht am 25. Oktober 1989); EP 0 368 684 (veröffentlicht am 16. Juni 1990); EP 0 239 400 (veröffentlicht am 30. September 1987); WO 90/14424 (veröffentlicht am 29. November 1990); WO 90/14430 (veröffentlicht am 16. Mai 1990); Huse et al., Science, 246: 1275 (08. Dezember 1989); Marks et al., BioTechnology, 10: 779 (Juli 1992); La Sastry et al., PNAS (USA), 86: 5728 (August 1989); Chiang et al., BioTechniques, 7 (40): 360 (1989); Orlandi et al., PNAS (USA), 86: 3833 (Mai 1989); Ward et al. Nature, 341: 544 (12. Oktober 1989); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581 (1991); und Hoogenboom et al., Nucleic Acids Res., 19 (15): 4133 (1991).
  • Eine Festphase, die in den Assays dieser Erfindung verwendet werden kann, kann jede Oberfläche sein, die üblicherweise in Immunassays verwendet wird. Beispielsweise kann die Festphase teilchenförmig sein; sie kann die Oberfläche von Kügelchen, beispielsweise Glas- oder Polystyrolkügelchen sein; oder sie kann die feste Wandoberfläche irgendeiner in einer Vielzahl von Behältern sein, beispielsweise Zentrifugenröhrchen, Säulen, Mikrotiterplattenwells, Filter, Membranen und Röhrchen unter anderen Behältern.
  • Wenn Teilchen als feste Phase verwendet werden, liegen sie vorzugsweise in einer Größe im Bereich von ungefähr 0,4 bis 200 μm, üblicherweise von ungefähr 0,8 bis 4,0 μm, vor. Magnetische oder magnetisierbare Teilchen sind eine bevorzugte teilchenförmige feste Phase und Mikrotiterplattenwells sind eine bevorzugte feste Wandoberfläche. Magnetische oder magnetisierbare Teilchen sind besonders bevorzugt, wenn die Schritte der Verfahren dieser Erfindung in einem automatisierten Immunassaysystem durchgeführt werden.
  • Marker
  • Wie geeignet, können Antikörper, die in den Immunassays dieser Erfindung verwendet werden, die als Tracer verwendet werden, in einer Art und Weise markiert werden, direkt oder indirekt, die ein Signal zur Folge hat, das sichtbar ist oder sichtbar gemacht werden kann. Nachweisbare Markersubstanzen schließen Radionuklide, wie beispielsweise 3H, 125I und 131I; fluoreszierende Stoffe, beispielsweise Fluoreszeinisothiocyanat und andere Fluorchrome, Phycobiliproteine, Phycoerythin, Seltenerdmetallchelate, Texas-Rot, Dansyl und Rhodamin; kolorimetrische Reagentien (Chromogene); elektronen-opaque Materialien, beispielsweise kolloidales Gold; biolumineszente Stoffe; chemilumineszente Stoffe, Farbstoffe, Enzyme, beispielsweise Meerrettichperoxidase, alkalische Phosphatase, Glucoseoxidase, Glucose-6-phosphatdehydrogenase, Acetylcholinesterase, α-, β-Galactosidase, unter anderen, Coenzyme; Enzymsubstrate; Enzymcofaktoren und Enzyminhibitoren; Enzymuntereinheiten; Metallionen; freie Radikale; oder irgendeine andere immunologisch aktive oder inerte Substanz sein, die ein Mittel zum Nachweisen oder Messen der Gegenwart oder Menge eines gebildeten Immunkomplexes bereitstellt. Beispielhaft für Enzymsubstratkombinationen sind Meerrettichperoxidase und Tetramethylbenzidin (TMB) und alkalische Phosphatasen und Paranitrophenylphosphat (pNPP).
  • Bevorzugte Nachweis- oder Nachweis- und Quantifizierungssysteme gemäß der Erfindung erzeugen ein lumineszierendes Signal, biolumineszent (BL) oder chemilumineszent (CL). Im chemilumineszenten (CL) oder biolumineszenten (BL) Assay wird die Intensität oder die gesamte Lichtemission gemessen und mit der Konzentration des unbekannten Analyten in Beziehung gesetzt. Das Licht kann quantitativ unter Verwendung eines Luminometers (Photomultiplier Röhrchen als Detektor) oder ein Ladung-gekoppelter Speicher bzw. Baustein oder qualitativ mittels eines photographischen oder Röntgenfilms. Die Hauptvorteile der Verwendung solcher Assays ist ihre Einfachheit und analytische Empfindlichkeit, die den Nachweis und/oder die Quantifizierung sehr kleiner Mengen des Analyten ermöglicht.
  • Beispielhafte lumineszierende Marker sind Acridiniumester, Acridiuniumsulfonylcarboxamide, Luminol, Umbelliferon, Isoluminolderivate, Photoproteine, beispielsweise Aequorin, und Luciferasen vom Glühwürmchen, Meeresbakterien, Vargulla und Renilla. Luminol kann wahlweise mit einem Enhancermolekül verwendet werden, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe, die aus 4-Iodphenol oder 4-Hydroxyzimtsäure besteht. Acridiniumester gehören zu den bevorzugten Typen von CL-Markern gemäß dieser Erfindung. Typischerweise wird ein CL-Signal durch Behandlung mit einem Oxidans unter basischen Bedingungen erzeugt.
  • Auch sind bevorzugte lumineszierende Nachweissysteme solche, bei denen das Signal (nachweisbarer Marker) durch eine enzymatische Reaktion an einem Substrat erzeugt wird. CL- und BL-Nachweisschemata wurden zur Untersuchung von alkalischen Phosphatasen (AP), Glucoseoxidase, Glucose-6-phosphatdehydogenase, Meerrettichperoxidase (HRP) und Xanthinoxidasemarker, unter anderen, entwickelt. AP und HRP sind zwei bevorzugte Enzymmarker, die durch einen Bereich an CL- und BL-Reaktionen quantifiziert werden können. Beispielsweise kann ein AP mit einem Substrat verwendet werden, beispielsweise einem Adamantyl-1,2-dioxethanarylphosphat (beispielsweise AMPPD oder CSPD; [Kricka, L.J., „Chemiluminescence and Bioluminescence, Analysis by", auf S. 167, Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference (Hrsg. R. A. Meyers) (VCH Publishers; N.Y., N.Y.; 1995)]; vorzugsweise ein Dinatriumsalz von 4-Methoxy-4-(3-phosphatphenyl)spiro[1,2-dioxethan-3,2'-adamantan], mit oder ohne einem Enhancermolekül, vorzugsweise 1-(Trioctylphosphoniummethyl)-4-(tributylphosphoniummethyl)benzoldichlorid. HRP wird vorzugsweise mit Substraten, beispielsweise 2',3',6'-Trifluorphenyl-3-methoxy-10-methylacridan-9-carboxylat verwendet.
  • CL- und BL-Reaktionen können zur Analyse nicht nur von Enzymen, sondern auch anderen Substraten, Cofaktoren; Inhibitoren, Metallionen und dergleichen, angepasst werden. Beispielsweise sind Luminol, Glühwürmchenluciferase und Meeresbakterienluciferasereaktionen Indikatorreaktionen für die Produktion oder den Verbrauch von Peroxid, ATP bzw. NADPH. Sie können an andere Reaktionen gekoppelt werden, einschließlich Oxidasen, Kinasen und Dehydrogenasen, und können dazu verwendet werden, irgendeinen Bestandteil der gekoppelten Reaktion zu messen (Enzym, Substrat, Cofaktor).
  • Der nachweisbare Marker kann direkt oder indirekt an einen Antikörper gebunden werden, der in einem Assay dieser Erfindung verwendet wird. Beispielhaft für eine indirekte Bindung des nachweisbaren Markers ist die Verwendung eines Bindungspaares zwischen einem Antikörper und einem Marker oder die Verwendung eines Signalverstärkungs- bzw. Amplifikationssystems.
  • Beispielhaft für Bindungspaare, die dazu verwendet werden können, Antikörper der Assays dieser Erfindung an nachweisbare Marker zu binden, sind Biotin/Avidin, Streptavidin oder Anti-Biotin; Avidin/anti-Avidin; Thyroxin/Thyroxin-bindendes Globulin; Antigen/Antikörper; Antikörper/anti-Antikörper; Kohlenhydrat/Lectine; Hapten/anti-Hapten-Antikörper; Farbstoffe und hydrophobe Moleküle/hydrophobe Proteinbindungsstellen; Enzyminhibitor, Coenzym oder Cofaktor/Enzym; Polynukleinsäuren/homologe Polynukleinsäuresequenz; Fluoreszein/anti-Fluoreszein; Dinitrophenol/anti-Dinitrophenol; Vitamin B12/intrinsischer Faktor, Cortison, Cortisol/Cortisolbindungsprotein; und Liganden für ein spezifisches Rezeptorprotein/Membranverbundene spezifische Rezeptorproteine. Bevorzugte Bindungspaare gemäß dieser Erfindung sind Biotin/Avidin oder Streptavidin, besonders bevorzugt Biotin/Streptavidin.
  • Verschiedene Mittel zum Binden von Markern direkt oder indirekt an Antikörper sind in der Technik bekannt. Beispielsweise können Marker entweder kovalent oder nicht-kovalent gebunden sein. Beispielhafte Antikörperkonjugationsverfahren sind in: Avarmeas et al., Scan. J. Immunol., 8 (Suppl. 7): 7 (1978); Bayer et al., Meth. Enzymol., 62: 308 (1979); Chandler et al., J. Immunol. Meth. 53: 187 (1982); Ekeke und Abuknesha, J. Steroid Biochem., 11: 1579 (1979); Engvall und Perlmann, J. Immunol., 109: 129 (1972); Geoghegan et al., Immunol. Comm., 7: 1 (1978); und Wilson und Nakane, Immunofluorescence and Related Techniques, S. 215 [E1-sevier/North Holland Biomedical Press; Amsterdam (1978)] zu finden.
  • Abhängig von der Art des Markers können verschiedene Techniken zum Nachweisen und Quantifizieren des Markers verwendet werden. Für fluoreszente Stoffe ist eine große Vielzahl von Fluorometern verfügbar. Für chemilunimeszente sind Luminometer oder Filme verfügbar. Mit Enzymen kann eine fluoreszierendes, chemilumineszierendes oder farbiges Produkt fluorometrisch, luminometrisch, spektrophotometrisch oder visuell bestimmt oder gemessen werden.
  • Verschiedene Typen von chemilumineszierenden Verbindungen, die ein Acridinium-, Benzacridinium- oder Acridantyp eines heterocyclischen Ringsystems aufweisen, sind bevorzugte Marker. Acridinium- und Benzacridiniumester sind gegenwärtig die am meisten bevorzugten chemilumineszierenden Verbindungen, wobei bevorzugte Acridiniumester solche Verbindungen einschließen, die heterocyclische Ringe oder Ringsysteme einschließen, die das Heteroatom in einem positiven Oxidationszustand enthalten, einschließlich solcher Ringsysteme, wie Acridinium, Benz[a]acridinium, Benz[b]acridinium, Benz[c]acridinium, einem Benzimidazolkation, Chinolinium, Isochinolinium, Chinolizinium, einem cyclischen substituierten Chinolinium, Phenanthridinium und Chinoxalinium, wie sie in der Technik wohl bekannt sind.
  • Die Tracer können durch Binden des ausgewählten Antikörpers entweder direkt oder indirekt an eine reaktive funktionelle Gruppe, die auf dem Acridinium- oder Benzacridiniumester vorliegt, hergestellt werden, wie es dem Fachmann auf dem Gebiet wohl bekannt ist, beispielsweise siehe Weeks et al., Clinical Chemistry, 29 (8), 1474–1479, (1983). Besonders bevorzugte Verbindungen sind Acridinium- und Benzacridiniumester mit einer Arylringaustrittsgruppe, wobei die reaktive funktionelle Gruppe entweder in der Para- oder der Metaposition des Arylrings vorliegt [siehe US-Patent Nr. 4,745,181 und WO 94/21823.]
  • Die folgenden Beispiele sind nur für Veranschaulichungszwecke dargelegt und sollen die Erfindung keinesfalls einschränken.
  • Beispiel 1
  • (a) Immunpräzipitation eines APC-Genprodukts in voller Länge
  • Anti-APC-Antikörper wurden in dieser Studie dazu verwendet, APC in voller Länge aus den Lymphozyten von FAP-Patienten immun zu präzipitieren, von denen bekannt ist, dass sie eine mutante und ein verbleibendes Wildtyp-APC-Allel in ihrer Keimbahn aufweisen. Diese Studie unterstützt die Theorie, die den Immunassays dieser Erfindung zugrunde liegt, dahingehend, als die Lymphoblastoidzellen von den FAP-Patienten ungefähr 50% weniger (50,1 % ± 5,1 %) immunpräzipitierbare APC-Proteine in voller Länge im Vergleich zu Kontrollen aufwiesen, denen Keimbahn-APC-Mutationen fehlten. Die Ergebnisse korrelieren mit dem heterozygoten genotypischen APC-Status in FAP-Zellen.
  • Materialien und Methoden
  • Anti-APC-Antikörper. Polyklonaler anti-APC-Kaninchenantikörper (APC-2) erzeugt im Laboratorium des Erfinders, wie an anderer Stelle beschrieben [Bomann et al., „Radioimmunassay of the APC gene product using antibodies against its middle and carboxyl regions", Biochem. Biophys. Res. Commun., 206: 909–915 (1995); Chop et al., "Immunodetection of the presence or absence of full-length APC gene product in human colonic tissues", Anticancer Res., 15: 991–998 (1995)], wurden dazu verwendet, Immunpräzipitationsanalysen dur chzuführen. Der APC-2-Antikörper zielt auf ein definiertes Epitop ab, das sich in der Mittelregion des APC-Proteins befindet (Aminosäuren 1336–1350). Dieser Antikörper ist gegen das APC-Protein in voller Länge aktiv, jedoch nicht gegen die trunkierten APC-Proteine (denen APC-2-Epitope fehlen), verursacht durch Keimbahm-APC-Mutationen in den meisten FAP-Individuen.
  • Zelllinien. Die humane Darmkrebszelllinie HCT116, von der bekannt ist, dass sie APC in voller Länge enthält, wurde von der American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, (USA)) bezogen. HCT116-Zellen wurden in DMEM-Medium gezüchtet, das 10% fötales Rinderserum [Sigma Chemical Co., St Louis, MO (USA)] enthielt, und eine angefeuchtete bzw. befeuchtete Atmosphäre von 95% Luft/5% CO2 bei 37°C enthielt. Kulturen von HCT116-Zellen bei ungefähr 60–80% Konfluenz (ungefähr 3 × 106 Zellen) in 25 cm2 Kunststoffgewebskulturkolben [Corning Glass, Corning, NY (USA)] wurden dreimal mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS, Sigma) gewaschen, mechanisch vom Boden des Kolbens abgekratzt, durch Zentrifugation pelletiert und darauf zur Immunpräzipitation lysiert.
  • Fünf Lymphoblastoidzelllinien wurden untersucht, die vier Zelllinien einschlossen, gewonnen von einem "eingeheirateten" Individuum. Die Etablierung dieser Zelllinien durch Epstein-Barr-Virustransformation peripherer Lymphozyten in Kulturen ist an anderer Stelle beschrieben [Spirio et al., "Alleles of the APC genes An attenuated form of familial polyposis", Cell, 75: 951–957 (1993)]. Solche Zellen wurden in Suspensionskultur mit RPMI 1640 gezüchtet, das 10% FBS enthielt. Lymphoblastoidsuspensionskulturen wurden in ähnlicher Weise wie HCT116-Zellen prozessiert, außer dass sie durch Zentrifugation eher als durch Abschaben aus dem Kolben pelletiert wurden.
  • Diese FAP-Lymphoblastoidzelllinien stammten aus betroffenen Mitgliedern dreier nichtverwandter FAB-Familien mit bekannten APC-Mutationen [Lynch et al., "Flat adenomas in a colon-prone kindred", J. Natl. Cancer Inst., 80: 278–282 (1988); Lynch et al., "Hereditary colorectal cancer", Semin. Oncol. 18: 337–366 (1991]. Diese Familien entsprachen den Kriterien für FAP auf Grundlage einer ausführlichen Familiengeschichte und genetischer Verbindungsstudien [Lynch et al. (1991), siehe oben; Spirio et al., "Linkage of a variant or attenuated form of adenomatous polyposis coli to the adenomatous polyposis coli (APC) locus," Am. J. Hum. Genet. 51: 92–100 (1992)].
  • Die Lymphoblastoidzelllinien, die als FAP #1 (vom Individuum V-27 in der Verwandtschaft 2764), FAP #2 (vom Individuum IV-17 in Familie 2764), FAP #3 (vom Individuum IV-26 in der Verwandtschaft 3101) und FAP #4 (vom Individuum V-15 in der Verwandtschaft 6). Die APC-Keimbahnmutationen wurden in diesen Familien [Spirio (1993), siehe oben] wie folgt identifiziert. Zwei nicht-verwandte Familien 2764 und 3101 wiesen eine identische APC-Mutation in Exon 4 auf (Nukleotidaustausch: TCATTG → TCTG), die ein trunkiertes APC-Peptid von 145 Aminosäuren verursacht. Verwandtschaft 6 schließt eine APC-Mutation in Exon 3 ein (TAGA-TAGC → TAGC), die ein trunkiertes APC-Peptid einer Länge von 83 Aminosäuren zur Folge hat.
  • Immunpräzipitation von APC. Semikonfluente HCT116 (ungefähr 3 × 106 Zellen in 25 cm2 Kunststoffgewebekulturkolben) ebenso wie Suspension-kultivierte Lymphoblastoidzellen (107 normal- oder FAP-immortalisierte WBCs) wurden mit 3 ml RIPA-Puffer lysiert (0,1% SDS, 0,5% Desoxycholat, 1% Nonidet P-40, 100 mM NaCl, 10 mM Tris [pH 7,4]), der Protease- und Phosphataseinhibitoren enthielt (1 mM EGTA, 12 mM EDTA, 4,3 mM Na2MoO4, 1 mM Na3VO4, 50 mM Phosphat [Na+-Salz], 0,5 mM Dithiothreitol (DTT) und 0,5 mM Phenylmethylsulfonylfluorid [PMSF]). Das Zelllysat wurde gevortext, in einer Mikrofuge (Eppendorf) bei 13.000 U/min für 10 min bei 4°C zentrifugiert und der Überstand wurde gesammelt. Die Proteinkonzentration in jedem Überstand wurde unter Verwendung des Bio-Rad-Proteinassaykits (Hercules, CA) bestimmt und die Proteinkonzentration dieses Überstands wurde darauf auf gleich 4,35 mg/ml eingestellt.
  • Um die unspezifische Bindung zu entfernen, wurden die Überstände (200 μl Teilmengen) mit Präimmun-Kaninchenserum (25 μl/ml) und einer 50%igen Aufschlämmung von Protein A-Sepharose CL 4B Kügelchen (15 μl/ml, Sigma) bei 4°C für 1 h inkubiert. Die Proben wurden wie oben für 15 min zentrifugiert und der Überstand wurde zur Immunpräzipitation zurückgehalten. Anti-APC-Seren (APC-2) wurden darauf den Lysaten zugesetzt. Die Proben wurden über Nacht bei 4°C inkubiert. Darauf wurden Protein A-Sepharose 4B CL Kügelchen (15 μl/ml einer 50%igen Aufschlämmung) zugesetzt und die Proben auf einer Schaukelplattform bei 4°C für 1 h inkubiert. Das Protein A-Sepharose 4B CL Gemisch wurde durch Zentrifugation wie oben für 3 min pelletiert und einmal mit RIPA-Lyse-Puffer gewaschen, der 10 mM NaCl enthielt, sechsmal mit Puffer, der 0,5 M NaCl enthielt und einmal mehr mit 100 mM NaCl-Puffer. Das Protein A-Sepharose 4B CL-Pellet wurde in Gelbeladungspuffer (50 mM Tris-HCl [pH 6,8], 100 mM DTT, 2% SDS, 0,2% Bromphenol Blau, 20% Glycerin) resuspendiert, für 3 min gesiedet und zentrifugiert. Die immunpräzipitierten Proteine, die in den Überständen enthalten waren, wurden elektrophoretisch unter Verwendung von 2,8% Agarosegelen aufgetrennt.
  • Proteine, die auf Agarosegelen fraktioniert wurden, wurden durch konventionelles vertikales Kapillarwirkungsblotting auf eine Nitrocellulosemembran (0,45 μm, MSI) über Nacht übertragen. Die Membran wurde mit 10% fettfreier Trockenmilch (in PBS) behandelt, um eine unspezifische Anlagerung von Antikörpern daran zu blockieren und wurden dann mit polyklonalen anti-APC-Antikörpern (APC-2 in 1:7500 Verdünnung) über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Proteinbanden am Blot wurden unter Verwendung des Amplified Alkaline Phosphates Goat Anti-Rabbit Immunoblot Systems (Bio-Rad Laboratories) gemäß den Anweisungen des Herstellers nachgewiesen. Die Menge an APC-Protein am Immunpräzipitations-Blot wurde quantitativ unter Verwendung von Densitometrie bestimmt [Speedmaster Duo-Densitometer, Electronic Systems Engineering Co., Cushing, OK (USA)].
  • Ergebnisse
  • Die Immunpräzipitationsanalyse wies das Vorhandensein von APC in voller Länge in HCT116-Zellen, in Lymphoblastoidzellen eines gesunden Subjekts und in FAP-Lymphoblastoidzelllinien nach, die von betroffenen Mitgliedern in drei nicht-verwandten FAP-Familien abgeleitet wurden. Diese Analyse zeigt, dass die HCT116-Referenzzelllinie (die bekannterweise APC-Protein in voller Länge enthält) in klarer Weise 300 kDa Bande exprimiert, die einem Wildtyp-APC-Protein entspricht. Die Analyse zeigt ebenfalls, dass im Vergleich zur HCT116 Zelllinie die Lymphoblastoidzellen von einem gesunden Subjekt eine äquivalente Menge von volle Länge APC-Protein aufweisen, und die Lymphoblastoidzellen von FAP-Subjekten weniger Wildtyp-APC-Protein aufweisen.
  • Tabelle 2 zeigt die relative Konzentration an immunpräzipitiertem APC in voller Länge in Lymphoblastoidzelllinien von den unterschiedlichen Subjekten, wie es durch die densitometrische Auswertung von Immunpräzipitations-Blots bestimmt wurde. HCT116 kultivierte Carcinomzellen dienten dazu, das Basislinienniveau (100%) zu definieren. Die Lymphoblastoidzellen, die von den gesunden Individuen abgeleitet wurden, wiesen eine relativ ähnliche Menge an Wildtyp-APC-Protein (110%) im Vergleich zu derjenigen von HCT116 auf. Im Gegensatz hierzu wiesen die FAP-Zelllinien APC-Konzentrationen auf, die sich von 39 bis 60% der Kontrolle bewegten (Durchschnitt = 50,5%, Standardabweichung des Mittelwertes = 5,1%).
  • Tabelle 2 APC-Proteinkonzentrationen in voller Länge in WBCs mit Keimbahn-APC-Mutationen
    Figure 00520001
  • In diesem Beispiel ist die erste Studie (zum gegenwärtigen Wissensstand der Erfinder) beschrieben, die zeigt, dass APC-Mutationen zu einer Abnahme der Expression von APC-Protein in voller Länge führen. Dies hat wahrscheinlich deswegen eine biologische Relevanz, weil die Menge an APC-Protein in voller Länge in Darmzellen vielleicht ein entscheidender Faktor in Mechanismen ist, die der Darmtumorigenese zugrunde liegen. Es wurde beispielsweise früher die Hypothese aufgestellt [Boman, B. M., "Biomolecular genetics of cancer", in: Lynch, H., (Hrsg.), Genetic Epidemiology of Cancer, Seiten 343–347, Boca Raton, FL CRC Press (1989)], dass eine APC-Mutation, die ein APC-Allel einschließt, die Zellen gegenüber den schädlichen Wirkungen auf das Zellwachstum gegenüber empfindlicher machen könnten, die durch andere erworbene genetische Veränderungen oder durch karzinogene Substanzen induziert werden. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass eine reduzierte Konzentration an APC-Protein in voller Länge tatsächlich als Folge einer APC-Mutation auftritt, die ein APC-Allel einschließt.
  • Quantitativ zeigen die Ergebnisse, dass die Konzentration an mit anti-APC-Antikörper immunpräzipitierbarem Protein in den FAP-Lymphoblastoidzelllinien ungefähr 50% der normalen Kontrollen betrug. Diese Konzentration an Immunreaktivität stimmt mit der Tatsache überein, dass FAP-Patienten nur ein Wildtyp-APC-Allel zusammen mit einem mutierten Allel tragen und unter der Annahme, dass die Genproduktexpression zur Gendosierung proportional ist.
  • Dieses Beispiel unter Verwendung von FAP-Zellen als Modellsystem zeigt, dass die Immunassays dieser Erfindung dazu brauchbar sind, Keimbahnmuationen nachzuweisen, die die Konzentrationen des Zielproteins in voller Länge reduzieren. Dieses Beispiel stützt solche Assays als einen einfachen, zuverlässigen und kostengünstigen Weg, Individuen zu diagnostizieren, die ein schädliches, mutiertes Allel tragen. Immunassays bezüglich der Konzentrationen von APC-Konzentrationen in voller Länge sollten als praktischer diagnostischer Test zum Nachweisen von Individuen von Nutzen sein, die von FAP betroffen sind.
  • (b) Repräsentativer automatisierter APC-Immunassay
  • Zum Nachweis und zur Quantifizierung von MSH2-Protein in voller Länge konnte ein Maus anti-APC MAb, beispielsweise AB1, gegen das Aminoende von APC (Oncogene Research Products) kovalent an Kügelchen, beispielsweise Dynabeads® (M-450 Tosyl-aktiviert; Dynal Inc.) gekoppelt werden. Die Kügelchen, die an den monoklonalen Antikörper gekoppelt wurden, werden mit Zelllysaten, gefolgt von einem Waschschritt, inkubiert. Darauf werden die gewaschenen Kügelchen beispielsweise mit einem Maus Anti-APD AB2 (Oncogene Research Products) inkubiert, einem Maus MAb gegen das Carboxylende von APC, als zweitem primärem Antikörper.
  • Beispiel 2
  • Western Blot Immunassay für MLH1- und MSH2-Proteine
  • Dieses Beispiel beschreibt die Messung von MLH1- und MSH2-Proteinen (die Expressionsprodukte von 2 Haupt-MMR-Genen) in frisch zubereiteten Lymphozyten und in unsterblich gemachten Lymphozyten. Der Assay, der eine Western Blot-Analyse einschließt, evaluiert die Expressionsstärken beider Proteine in voller Länge gleichzeitig in einer einzigen Lymphozytenprobe. Eine semiquantitative Analyse von Konzentrationen von MLH1 und MSH2 durch Western Blot ermöglicht eine einfache und direkte Bestimmung des MLH1/volle Länge MSH2-Proteinverhältnisses für die selbe Probe.
  • Aufgrund der Variabilität der Probenbeladung und anderer verwirrender Faktoren bestimmte der verwendete Ansatz die individuelle Expressionsstärke von jedem der beiden Proteine und darauf wurde das Verhältnis von einem zum anderen berechnet. Darauf wird bestimmt, ob der numerische Wert des Verhältnisses in klarer Weise in den normalen Bereich fällt oder in klarer Weise in den Bereich, der vorausgesagt wurde, wenn ein 50%iger Verlust der Expression einer der beiden Proteine vorlag.
  • Verfahren
  • Probenpräparation
  • Die Proben wurden aus Kulturen immortalisierter Lymphozyten hergestellt. Isolierte periphere Lymphozyten von gesunden Individuen wurden durch Epstein-Barr-Virus-Transformation immortalisiert, um Lymphoblastoidzelllinien, wie in Spiro et al., Cell, 75: 951 (1993) beschrieben, herzustellen. Immortalisierte Lymphozyten, enthalten in einer Suspensionskultur (15 ml) von Lymphoblastoid-Lymphozyten (60 bis 120 × 106 Zellen), gewonnen nach 7 Tagen in Kultur, wurden verwendet.
  • Jede Probe wurde ein- bis zweimal mit 5 ml Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen und bei 2.000 U/min für 10 min bei 4°C geschleudert. Um die Zellen zu lysieren, wurde 1X Stärke SDS-Gelbeladungspuffer (50 mM Tris-Cl [pH 6,8], 100 mM Dithiothreitol [DTT; frisch hergestellt], 2% SDS, 0,1% Bromphenol Blau, 10% Glycerol) jedem der gewaschenen Pellets zugesetzt (1 ml für kultivierte Darmcarzinomzellen und Darmepithel, 200 μl für Lymphozyten und Lymphoblastoidzellen). Die Zellen wurden sorgfältig unter Verwendung eines Vortex vermischt und darauf in einem siedenden Wasserbad für 10 min angeordnet. Die Zellen wurden dann für 10 min in einer Mikrozentrifuge (Beckman) geschleudert, um unlösliches Material auszufällen, das verworfen wurde.
  • Western Blots
  • Überstände (20 μl von jedem gegebenen Zelllysat) aus dem obigen Zelllyseverfahren wurden in eine der Wells des präparierten Gels [8% SDS-PAGE, hergestellt gemäß Sambrook et al. (Hrsg.) A Laboratory Manual: 18.49–18.54 [Cold Spring Harbor, NY (USA); 1995)] aufgebracht. Positi ve Kontrollen, negative Kontrollen und Proteinmarker (Bio-Rad, Katalog-Nr. 1610309) wurden immer mit eingeschlossen. Positive Kontrollen schlossen normale Schleimhaut, SW480 and Di-Fi-Zellen [humane rektale Adenocarcinomzelllinie; Novotny-Smith et al., J. Cell Physiol., 157: 253–262 (1993)] ein, die sowohl MLH1- als auch MSH2-Proteine aufwiesen. Kontrollen für mutierte Mismach Repair Proteine schlossen HCT116-Zellen (MSH2 positiv; MLH1 negativ) und LoVo-Zellen (MLH1 positiv; MSH2 negativ) ein (ATCC CCL-229; humane Adenocarcinomzelllinie). Eine negative Kontrolle, die jedes Mal laufengelassen wurde, war Lysatpuffer, der 2% fötales Rinderserum aufwies (FBS; IIrvine Scientific, CA; Katalog-Nr. 3000). Die Gele wurden auf einem Bio-Rad Protean II Gelelektrophoresegerät (60 bis 70 Volt, über Nacht ) laufen gelassen [Biorad; Hercules, CA (USA)] bis der Aufspürfarbstoff aus dem Bodenteil des Gels herauslief. Die Proteine im Gel wurden auf eine Nitrocellulosemembran übertragen [NF; MSI, Westboro, MA (USA)] unter Verwendung eines Bio-Rad Trans-Blot Semi-Dry Apparatus (gemäß den Instruktionen von Bio-Rad).
  • Eine Western Blot-Hybridisierung wurde darauf durch Vorhybridisieren des NF im Blockierungspuffer (50 ml, 5% [w/v] fettfreier Trockenmild [Carnation] in PBS) und darauf Inkubieren mit zwei primären Antikörpern (Maus monoklonale Anti-MSH2 [Katalog Nr. NA27; Titer = 1:500; Oncogene Research Products] und monoklonaler Maus MLH 1 [Katalog Nr. 13291A; Titer = 1:500; PharMingen]) in 5 ml Blockierungspuffer für 2 h bei Raumtemperatur auf einer schwenkbaren Plattform, durchgeführt.
  • Der Filter wurde dann dreimal mit 200 ml PBS- und einmal mit TTBS-Puffer (20 mM Tris-Cl, pH 7.5, 500 mM NaCl, 0.05% Tween-20) gewaschen und darauf mit sekundärem Antikörper (Bio-Rad Ziegen Anti-Maus Antikörper [GAM) [Katalog Nr. 1706461; Titer = 1: 1000]) in 5% Trockenmilch für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert.
  • Das NF wurde dreimal mit 200 ml TTBS-Puffer gewaschen und darauf in Bio-Rad Farbentwicklungslösung (Katalog Nr. 1706461) gemäß den Vorschriften des Herstellers inkubiert. Die Banden wurden quantitativ nach MSH2- oder MLH1-Proteinen unter Verwendung eines Gateway 2000 Computers (G6-200 XL), eines Hewlett Packard Scanjet 5P Scanners und einer UN SCAN-ITTM Scanning Software [Automatisiertes Digitisierungssystem, Silk Scientific Corp.; Orem, UT 84059 (USA)] analysiert.
  • Ergebnisse
  • Nachweis der Konzentrationen an MMR-Proteinen in peripheren Lymphozyten. Die vorläufigen Daten zeigen, dass MMR-Proteine unter Verwendung einer Western Blot-Analyse nachgewiesen werden können. Unter Verwendung der speziellen Antikörper, die aus kommerziellen Quellen (Tabelle 1) erhältlich sind, wurde eine Bande für ein Protein in voller Länge für jedes der beiden MMR-Genproteine, für die Antikörper verfügbar sind, nachgewiesen. Eine Western Blot-Analyse verwendete eine Hybridisierung mit beiden Antikörpern, nämlich Anti-MLH1 und Anti-MSH2, um simultan Banden für jedes Protein, nämlich 100 kDa für MSH2 und 80 kDa für MLH1 zu zeigen. Dies ermöglichte eine Semiquantifizierung der Konzentrationen von MLH1 und MSH2 (unter Verwendung einer densitometrischen Messung auf Gelbanden) und eine direkte Bestimmung des Verhältnisses von volle Länge MLH1-Protein zu volle Länge MSH2 für die selbe Probe. Wie vorhergesagt, war das Molekulargewicht (MW) der Banden innerhalb des experimentellen Fehlers, das selbe wie das bekannte Molekulargewicht für das zu untersuchende Protein. Darüber hinaus, wenn unterschiedliche kommerzielle Antikörperzubereitungen (Tabelle 1) für das MSH2- und MLH1-Protein verwendet wurden, identische Ergebnisse (verwendet individuell oder simultan) die Folge, was tatsächlich die Möglichkeit von falsch positiven Ergebnissen ausschließt, die aufgrund eines unspezifischen Kreuz-reagierenden Proteins auftreten.
  • Schlussfolgerungen aus den vorläufigen Daten aus der Western Blot-Analyse. [1] Zuverlässige Quellen von Antikörpern gegen MMR-Proteine existieren und scheinen in den für ein repräsentatives Immunassay dieser Erfindung verwendeten Vorschriften erfolgreich und preiswert zu arbeiten. [2] MMR-Proteine werden in ausreichenden Konzentrationen in humane Lymphozyten exprimiert, um durch einen Immunassay nachgewiesen zu werden. Dies basierte auf der Fähigkeit, ein wesentliches Signal (Bande auf Western Blot-Gel) für jedes der getesteten MMR-Proteine nachzuweisen und auf die Erkenntnis, dass diese Banden sich im korrekten Molekulargewichtsbereich befanden. [3] Eine Semiquantifizierung der Konzentrationen an MLH1 und MSH2 durch Western Blot-Analyse ermöglicht die einfache und direkte Bestimmung der Verhältnisse von MLH1/MSH2-Protein in voller Länge für die selbe Probe.
  • Tabelle 3 veranschaulicht die vorhergesagte Bedeutung der Ergebnisse des MLH1- und MSH2-Assays dieser Erfindung, wobei eine „Promotormutation" diejenige ist, die eine Transkription von einem Allel des MSH2- oder MLH1-Gens eliminiert.
  • Figure 00570001
  • Die in Beispiel 2 eingeschlossenen Studien zeigen, dass reduzierte Mengen des jeweiligen MMR-Proteins in voller Länge in den Zelllinien vorlagen, die entweder MLH1 oder MSH2 defizient waren, Zelllinien, die als negative Kontrollen verwendet wurden [HC116 (MSH2+; MLH1–); und LoVo (MLH1+; MSH2–)] im Vergleich zu den Zelllinien, die ein volles Komplement von MMR-Proteinen [DiFi und SW480] exprimierten, die als normale Kontrollen verwendet wurden.
  • Die Konzentrationen an MMR-Protein in normalen PBLs erwiesen sich als ungefähr denen, die nahe den Zelllinien zu finden waren, die als positive Kontrollen dienten.
  • Beispiel 3
  • Nachweis von MMR-Protein in voller Länge in intakten Lymphozyten durch Durchflusszytometrie
  • Dieses Beispiel zeigt, dass MMR-Proteine in voller Länge erfolgreich in intakten Lymphozyten durch Durchflusszytometrie nachgewiesen werden können. Die MMR-Proteinkonzentrationen in voller Länge in Zellen können in geeigneter Weise durch Durchflusszytometrie gemessen werden. Es wird vorhergesagt, dass die Durchflusszytometrie vollständig quantitative Daten erzeugen wird.
  • Vorläufige Daten zeigen, dass die Durchflusszytometrie dazu verwendet werden kann, das MSH2-Protein nachzuweisen. Eine Lymphoblastoidlinie wurde dazu verwendet, Bedingungen zum Nachweis von intrazellulärem MSH2-Protein unter Verwendung zweier unterschiedlicher anti-MSH2-Antikörper zu etablieren. Die Zellen wurden fixiert und permeabilisiert (unter Verwendung eines Fix & PermTM Zellpermeabilisationskits; Caltag Burlingame, CA). Die Zellen wurden mit einem von beiden primären Antikörpern inkubiert. Einer ist Anti-MSH2 AB1 (Oncogene Research Products) – der mit einer fluoreszierenden Sonde (Phycoerythrin [PE] vormarkiert wurde. Dieser Antikörper ist für den Aminoterminus von MSH2 spezifisch. Der andere Antikörper ist Anti-MSH2 AB2 (Oncogene Research Product), der mit Fluoreszeinisothiocyanat [FITC] vormarkiert wurde. Dieser Antikörper ist für den Carboxylterminus von MSH2 spezifisch. Der Antikörpertiter, der ein vernünftiges Signal zu Hintergrundstörungsverhältnisse jeden Antikörper ergab, wurde bestimmt. Die Menge an Antikörperbindung an intrazelluläres MSH2 wurde unter Verwendung eines FACStarPLUS Flow Cytometer SystemTM (Becton Dickinson; San Jose, CA) quantifiziert. Die Instrumenteinstellung (Fluoreszenzkanalnummer oder Photomultiplierrohrvolt) wurde so eingestellt, dass die relative Fluoreszenzintensität nachgewiesen wurde.
  • Ergebnisse
  • Beide Antikörper (AB1-PE und AB2-FITC) wiesen reproduzierbare intrazelluläre MSH2-Konzentrationen in einer kultivierten Lymphoblastoidzelllinie nach, von der bekannt ist, dass sie nur MSH2-Protein in voller Länge aufwiesen. Die durchflusszytometrische Analyse unter Verwendung der Antikörper Ab1-PE (gegen MSH2-Amionoende) und Ab2-FITC (gegen das MSH2-Carboxylende) zeigte das Vorliegen von intrazellulärem MSH2-Protein in den Lymphoblastoidzelllinien.
  • Schlussfolgerungen aus Durchflusszytometriedaten: [1] Unter Verwendung von Durchflusszytometrie-Assays kann MSH2-Protein qualitativ in einer immortalisierten Lymphozytenzelllinie nachgewiesen werden. [2] Der durchflusszytometrische Nachweis von MSH2-Protein in voller Länge ist beinahe sicher spezifisch, weil nachweisbare Signale unter Verwendung zweier unterschiedlicher Anti-MSH2-Antikörper – AB1-PE und AB2-FITC – gewonnen wurden. Tatsächlich wurde das Kernanfärben durch Immunfluoreszenz bestätigt. [3] Darüber hinaus wurde die durchflusscytrometrische Analyse unter Verwendung einer Lymphoblastoidzelllinie durchgeführt, der Typ von Zelllinie, der für eine Analyse durch einen bevorzugten automatisierten Immunassay dieser Erfindung bevorzugt ist.
  • Beispiel 4
  • Kügelchen-gebundener Sandwich-Immunassay
  • (1) Kügelchen-gebundener Sandwich-Immunassay für MMR-Proteine
  • Kürzliche Experimente haben die Durchführbarkeit eines bevorzugten automatisierten, Kügelchen-gebundenen Sandwichtyp-Assaysystems dieser Erfindung etabliert. Anti-MSH2-Antikörper wurden an Kügelchen unter Verwendung dreier unterschiedlicher Techniken gebunden: 1) Ab1-Antikörper (gegen MSH2-Aminoende) wurden an Dynal Tosyl-aktivierte Magnetkügelchen gekoppelt; 2) polyklonale Kaninchen anti-MSH2-Antikörper wurden an Streptavidin-beschichtete Kügelchen gekoppelt; und 3) Ab1 wurde an Magnetkügelchen unter Verwendung von Glutaraldehyd zum Vernetzen gekoppelt. Reportermoleküle wurden ebenfalls mit einem zweiten primären Antikörper (Ab2) konjugiert, der in dem Sandwich-basierten Assay durch zwei Techniken verwendet wurde: a) Ab2-Antikörper (gegen MSH2-Carboxylende) wurden mit FITC (zur Fluoreszent) konjugiert; b) die selben Antikörper wurden an Acridiniumester (zur Chemilumines zenz) konjugiert. In signifikanter Weise wurden ähnliche MMR-Assayergebnisse unter Verwendung von zwei Typen beschichteter Kügelchen (Tosyl-aktivierte Kügelchen und Streptavidinbeschichtete Kügelchen) und unter Verwendung des Sandwich-basierten Assays mit einem FITC-gekoppelten zweiten primären Antikörper erhalten. Beispielsweise zeigte die Durchflusszytometrie, dass Lysate von DiFi-Zellen und HCT116-Zellen, von denen jede nur MSH2-Protein in voller Länge enthält, wie vorhergesagt, ein messbares Signal (55% positive Kügelchen) aufwiesen, wohingegen eine negative Kontrollzelllinie (LoVo), von der bekannt ist, dass sie nur mutiertes, trunkiertes MSH2-Protein aufwies, wie vorhergesagt, ein vernachlässigbares Signal aufwies.
  • Schlussfolgerungen aus den auf magnetischen Kügelchen-basierten Immunassays. 1) Dieses Beispiel zeigt, dass Kügelchen-basierte Sandwich-Assays für MSH2 unter Verwendung einer Durchflusszytometrie zum Nachweis fluoreszierender Signale aus dem Kügelchen-gebundenen Assaysystem funktionieren und quantitativ sind. 2) Diese Kügelchen-basierte Technologie ist leicht an automatisierte Sandwichtyp-Immunassayformate anpassbar.
  • (2) HNPCC-Nachweis in einer klinischen/Gemeinschaftsstudie
  • Die Verfahren von Abschnitt 1, oben, können zum Testen von Kohorten von CRC-Patienten verwendet werden. Eine reduzierte Konzentration von MMR-Proteinen tritt vorhergesagterweise in ungefähr 10% der CRC-Patienten auf. Ein positiver Test wird eine vorläufige Diagnose von HNPCC anzeigen. Anschließend können die vorläufige Diagnose durch molekulargenetische Tests bestätigt werden, die ein Genotyp zeigen, das mit der Expression eines trunkierten Proteins konsistent ist.
  • Weiterhin kann ein dualer Antikörperassay verwendet werden, insbesondere, um Protein aus (1) HNPCC-Lymphozyten unter Verwendung von immortalisierten Lymphozyten zu testen, für die das HNPCC-Genotyp bekannt ist; (2) aus frischen Lymphozyten aus Mitgliedern von HNPCC-Familien; und (3) aus frischen oder gefrorenen Lymphozyten von CRC-Patienten.
  • (2a) Testen des Assays an HNPCC-Lymphozyten
  • 2a.i. Testen der MMR-Konzentrationen in immortalisierten Lymphozyten, wenn das HNPCC-Genotyp bekannt ist
  • Es ist möglich, die Konzentrationen von MMR-Protein in voller Länge unter Verwendung von Lymphozyten von HNPCC-Patienten zu bestimmen, für die das Genotyp als Folge von molekulargenetischen Tests bekannt ist. Eine entscheidende Kontrolle sind immortalisierte WBCs von Familienmitgliedern, die beim Genotyp-Testen für HNPCC negativ sind und die erwarteterweise normale (100%ige) Konzentrationen von MMR-Proteinen aufweisen.
  • Das Testen nach hMLH1 wird durch ein „Sandwich"-Typ-Immunassay durchgeführt, wobei ein Kügelchen-gebundener Typ von Assay durchgeführt wird. Ein solcher „Sandwich"-Typ-Immunassay wird die Spezifität des Immunassays erhöhen.
  • Es wird vorhergesagt, dass Zellen aus HNPCC-positiven Patienten innerhalb eines ziemlich engen Bereichs einer statistischen Varianz eine 50%ige Abnahme der Konzentrationen an präzise einem MMR-Protein zeigen werden. Die Vergleichsgruppen werden folgende sein: (a) frisch isolierte Lymphozyten aus normalen menschlichen Freiwilligen; und (b) WBCs aus Familienmitgliedern, die für HNPCC nach Genotyptest negativ sind. Ebenfalls werden immortalisierte WBCs von normalen, menschlichen Freiwilligen getestet werden, um die Möglichkeit zu testen, dass das Immortalisierungsverfahren selbst die Konzentrationen an MMR-Proteinen verändert. Die Studie wird bestätigen, dass ein niedriger Wert, eine 50%ige Reduktion im Verhältnis des Target-MMR-Proteins gegenüber einem Referenzprotein im MMR-Proteinassay mit der Vorhersage der HNPCC-Form von erblichem korreliert und zu der Vorhersage in der Lage ist.
  • 2a.ii. Testen der MMR-Konzentrationen in voller Länge in frischen Lymphozyten aus Mitgliedern von HNPCC-Familien, wenn die HNPCC-Diagnose vorgenommen wurde
  • Ein Test wird unter Verwendung von WBC-Proben aus solchen CRC-Patienten durchgeführt, die eine positive Familiengeschichte für HNPCC aufweisen (nicht immortalisiert; kein Genotyp verfügbar). Die Verwendung der Amsterdam-Kriterien und genetischer Tests legen nahe, dass 70 bis 80% der CRC-Patienten in solchen Familien einen positiven Genotyp aufweisen würden (aus molekulargenetischen Tests) für HNPCC (Mutation in einem von 4 Mismatch Repair Genen).
  • Es wird vorhergesagt, dass (a) unter den Mitgliedern von HNPCC-Familien, die einem 50% igen Risiko unterliegen, ein erblich mutiertes MMR-Gen aufzuweisen (weil dies ein autosomaldominantes Gen ist), 50% signifikant reduzierte Konzentrationen an MMR-Protein zeigen werden; (b) eine ungefähr 50%ige Reduktion der Konzentrationen eines MMR-Proteins vorliegen wird, das durch die Zelle, die das mutierte Gen enthält, exprimiert wird (aufgrund des Verlusts einer der beiden Wildtyp-Allele); (c) molekulargenetische Test können verwendet werden, um sowohl positive als auch negative Diagnosen von HNPCC zu bestätigen, die durch die Immunassays dieser Erfindung bestimmt werden. Das in diesem Unterabschnitt beschriebene Testen sollte den prädiktiven Wert der Assays in dieser Erfindung zur Diagnose von HNPCC unter Mitgliedern von HNPCC-Familien unter Feldbedingungen bestätigen.
  • 2a.iii. Testen der allgemeinen Patientenpopulation mit kolorektalem Krebs (CRC)
  • Dieses Experiment ist dem Vorhergehenden (2a.ii) ähnlich, außer dass eine andere Population von Patienten untersucht wird, nämlich all solche mit CRC. Es wird vorhergesagt, dass (1) 10% aller CRC-Patienten bewiesenermaßen HNPCC durch das Kriterium eines positiven Auffindens im Assay aufweisen werden (basiert auf veröffentlichten Studien); (2) molekulargenetische Tests werden bestätigen, dass Individuen, die im Assay positiv sind, tatsächlich HNPCC positiv sind.
  • Die in diesem Unterabschnitt beschriebenen Tests sollten den prädiktiven Wert der Assays dieser Erfindung zur Diagnose von HNPCC unter Mitgliedern von CRC-Patienten unter Feldbedingungen bestätigen. Eine Variation des Tests wird darin bestehen, Patienten mit Krebs zu untersuchen, der von CRC verschieden ist, von dem jedoch bekannt ist, dass er mit HNPCC in Verbindung steht, beispielsweise Endometriumkrebs. Ob ein signifikanter Anteil solcher Patienten bezüglich MMR-Mutationen positiv ist, wird zu bestimmen sein.
  • 2a.iv. Etablieren einer Datenbasis von MMR-Werten bei Krebs- und Nicht-Krebspatienten
  • Eine Datenbank mit MMR-Werten in „voller Länge" sowohl für normale menschliche Freiwillige als auch HNPCC-Patienten wird so etabliert werden, dass der „normale" Bereich für MMR-Proteinkonzentrationen in voller Länge bestimmt werden kann. Weil HNPCC gegenwärtig angenommenerweise an die 10% aller Fälle von CRC und einen noch kleineren Bruchteil aller Krebsarten darstellt wird vorhergesagt, dass die überwältigende Mehrheit von CRC-Patienten und Patienten mit anderen Formen von Krebs MMR-Werte mit voller Länge im „normalen" Bereich aufweisen werden. Diese Datenbank wird tatsächlich Ergebnisse aus molekulargenetischen Tests einschließen, die die Genauigkeit des MMR-Proteintests bei der Diagnose von HNPCC bestätigen sollten.
  • (2b) Testen eines Varianten-Immunassays – einer, der zwei Antikörper und eine „Sandwich"-Technik verwendet und an die Automatisierung anpassbar ist
  • In diesem Assay wird ein Antikörper, der eines der MMR-Protein erkennt, immobilisiert (beispielsweise in den Wells einer 96-Well Mikrotiterplatte). Ein Lysat einer Probe aus peripheren Lymphozyten aus einem Patienten wird zugesetzt, um es dem speziellen MMR-Protein zu ermöglichen, sich an die Platte zu binden. Das Lysat wird durch Waschen entfernt und ein zweiter Antikörper wird zugesetzt, der ein anderes Epitop am MMR-Protein erkennt und der ein Reportermolekül einschließt, zur Quantifizierung der Menge an Protein in voller Länge in der Probe. Der Sandwichassay wird an ein automatisiertes ELISA-basiertes System angepasst werden.

Claims (22)

  1. Verfahren zum Nachweisen einer Krankheit oder eines Krankheitsanfälligkeitsmerkmals in einem Organismus, wobei die Krankheit oder das Krankheitsanfälligkeitsmerkmal mit einer Keimbahnmutation in einem Subjektgen in Verbindung steht, das folgendes umfasst: (a) immunologisches Quantifizieren der Menge an Wildtyp-Protein, das durch das Subjektgen in einer normalen biologischen Probe exprimiert wurde, die aus diesem Organismus isoliert wurde und der Menge eines Referenzproteins, exprimiert durch ein zweites Gen in dieser Probe; (b) Berechnen des Verhältnisses der Menge des durch das Subjektgen in der Probe exprimierten Wildtyp-Proteins gegenüber der Probe des Referenzproteins, das durch das zweite Gen in der Probe exprimiert wurde; (c) Bestimmen, ob das berechnete Verhältnis das Vorhandensein des Wildtyp-Proteins, exprimieirt durch das Subjektgen in der Probe in einer abnormal niedrigen Konzentration widerspiegelt oder nicht; und (d) Folgern, dass, wenn das in Schritt (b) berechnete Verhältnis anzeigt, dass das Wildtyp-Protein in einer abnormal niedrigen Konzentration in der Probe vorliegt, das Subjektgen eine Keimbahnmutation in einer ihrer Allele enthält und das der Subjektorganismus durch die Krankheit oder das Krankheitsanfälligkeitsmerkmal betroffen ist, das (die) mit der Keimbahnmutation in Verbindung steht.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei Schritt (c) einen Vergleich des in Schritt (b) berechneten Verhältnisses mit einem Durchschnitt von Mengenverhältnissen des aus dem Subjektgen exprimierten Wildtyp-Proteins mit Mengen des Referenzproteins in vergleichbaren biologischen Proben aus Organismen derselben taxonomischen Klassifikation wie der Subjektorganismus umfasst, die von der Krankheit oder dem Krankheitsanfälligkeitsmerkmal nicht betroffen sind.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Krankheit oder das Krankheitsanfälligkeitsmerkmal mit einer Keimbahnmutation in einem von zwei oder mehreren Subjektgenen in Verbindung steht, und folgendes umfasst: (a) immunologisches Quantifizieren der Menge an Wildtyp-Protein in einer normalen biologischen Probe, die aus diesem Organismus isoliert wurde, das durch jedes der Subjektgene exprimiert wird; (b) Berechnen des Mengenverhältnisses des von einem dieser Subjektgene in der Probe exprimierten Wildtyp-Proteins mit der Menge an Wildtyp-Protein, die durch das andere Subjektgen in der Probe exprimiert wurde oder mit jeder der Mengen an Wildtyp-Protein, die von jedem der anderen Subjektgene in der Probe exprimiert wird; (c) Bestimmen, ob das oder die in Schritt (b) berechneten Verhältnisse das Vorhandensein des Wildtyp-Proteins widerspiegelt, das durch jedes der Subjektgene oder durch irgendeines der Subjektgene in der Probe in einer abnormal niedrigen Stärke exprimiert wurde; und (d) Folgern, dass, wenn das Verhältnis oder die Verhältnisse, die in Schritt (b) berechnet wurden anzeigt, dass das Wildtyp-Protein, das von einem der Subjektgene exprimiert wird, in der Probe in einer abnormal niedrigen Konzentration vorliegt, das Subjektgen eine Keimbahnmutation in einem seiner Allele enthält und dass der Subjektorganismus durch die Krankheit oder das Krankheitsanfälligkeitsmerkmal befallen ist, das mit der Keimbahnmutation in Verbindung steht.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei Schritt (c) einen Vergleich des (der) in Schritt (b) berechneten Verhältnisse mit dem vergleichbaren Durchschnitt von Verhältnissen umfasst, die aus den Mengen an durch die Subjektgene in vergleichbaren biologischen Proben aus Organismen derselben taxonomischen Klassifikation wie dem Subjektorganismus exprimierten Wildtyp-Proteinen berechnet werden, die von dieser Krankheit oder von diesem Krankheitsanfälligkeitsmerkmal nicht betroffen sind.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die normale biologische Probe aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Körperflüssigkeiten, Gewebsproben, Gewebsextrakten, normalen Zellen, Lysaten von normalen Zellen, normalen Zellextrakten, und Überständen aus Lysaten von normalen Zellen besteht.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Körperflüssigkeiten aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Blut, Serum, Plasma, Samen, Brustexsudat, Magensekreten, fäkalen Suspensionen, Galle, Speichel, Tränen, Sputum, Schleim, Urih, Lymphflüssigkeit, Cytosol, Ascites, Pleuraleffusionen, Amnionflüssigkeit, Blasenwaschungen, Bronchoalveolarspülungen und cerebrospinaler Flüssigkeit besteht.
  7. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Zellen periphere Blutlymphozyten sind; die Zelllysate Lysate von peripheren Blutlymphozyten sind; die Zellextrakte aus peripheren Blutlymphozyten stammen; und die Überstände aus Lysaten peripherer Blutlymphozyten stammen.
  8. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die normalen Zellen periphere Blutlymphozyten sind und wobei der Organismus ein Mensch ist.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der Organismus ein Wirbeltier ist.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Wirbeltier ein Säugetier ist.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Säugetier ein Mensch ist.
  12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei das Verfahren für Krebs oder für die Anfälligkeit gegenüber Krebs diagnostisch oder diagnostisch/prognostisch ist.
  13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die Keimbahnmutation aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Trunkierungen verursachenden Mutationen und Mutationen, die einen Allel-Verlust verursachen, besteht.
  14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei das Subjektgen oder die Subjektgene aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Ataxie-Telangiektasie, adenomatöser Polyposis coli, BRCA1, BRCA2, zystischer Fibrose, c-myb, Dystrophin, Ecadherin, Emery-Dreifuss Muskeldystrophie, Fanconi-Anämie, IDS, Reparatur einer Fehlpaarung, Neurofibromatose Typ 1, Neurofibromatose Typ 2, p16, polyzystischer Nierenkrankheit Typ 1, polyzystischer Nierenkrankheit Typ 2, PTCH, transformierendem Wachstumsfaktor Beta-Rezeptor 2 und von Hippel-Lindau Krankheits-Genen besteht.
  15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die Krankheit oder das Krankheitsanfälligkeitsmerkmal für eine Krankheit aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Ataxie-Telangiektasie, Hämangioblastom, Nierenzellkarzinom, Phäochromozytom, Darmkrebs, kolorektalem Krebs, Gastrointestinalkrebs, Brustkrebs, Ovarialkrebs, Endometriumkrebs, Prostatakrebs, Pankreaskrebs, Gallentraktkrebs, zystischer Fibrose, hämatologischen Malignitäten, Duchenne Muskeldystrophie, Genitourinalkrebs, gynäkologischen Krebsarten, Emery-Dreifuss Muskeldystrophie, Faconi-Anämie, Hunter Syndrom, Neurofibromatose Typ 1, Neurofibromatose Typ 2, familiärem Melanom, polyzystischer Nierenkrankheit, Basalzellkarzinom und von Hippel-Lindau Krankheit besteht.
  16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei das Subjektgen oder eines der Subjektgene das adenomatöse-Polyposis-coli-Gen ist und die Krankheit oder das Krankheitsanfälligkeitsmerkmal eines für familiäre adenomatöse Polyposis ist.
  17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei das Subjektgen oder eines der Subjektgene ein Reparaturgen für Fehlpaarungen ist, oder wobei beide Subjektgene Gene zur Reparatur von Fehlpaarungen sind.
  18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei das Subjektgen oder eines der Subjektgene oder beide Subjektgene aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus den MLH1, MSH2, MSH6, PMS1 und PMS2-Genen besteht; und die Krankheit oder das Krankheitsanfälligkeitsmerkmal eines für erblichen nicht-Polyposis-Darmkrebs ist.
  19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei das Subjektgen oder eines der Subjektgene entweder das MLH1 Gen oder das MSH2 Gen ist.
  20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, wobei die von jedem der Subjektgene exprimierte Menge an Wildtyp-Protein und/oder die Menge an Referenzprotein durch Western Blot Analyse, durch Immunpräzipitation und darauf durch Western Blot Analyse, durch Durchflusszytometrie, durch Enzymimmunassay, durch Enzym-gebundenen Immunsorptionsassay, durch Radioimmunassay, durch Verdrängungsimmunassay, durch dualen Antikörpersandwichassay, durch Chemilumineszenzassay, durch Biolumineszenzassay, durch Fluoreszenzassay oder durch Agglutinationsassay bestimmt wird.
  21. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20, das automatisiert ist.
  22. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21, wobei die abnormal niedrige Konzentration des Wildtyp-Proteins 50% ± 20% der Konzentration des Proteins in vergleichbaren Proben aus Organismen beträgt, die von der Krankheit oder dem Krankheitsanfälligkeitsmerkmal nicht betroffen sind, das mit der Keimbahnmutation in Verbindung steht, wobei die nicht betroffenen Organismen zur selben taxonomischen Klassifikation wie der Subjektorganismus gehören.
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